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1. Introduo

Biolmes microbianos tm sido estudados nos mais

diferentes segmentos industriais, onde so os principais

causadores de contaminaes de difcil controle.

O histrico de problemas com biolmes est invaria-

velmente presente em todos os segmentos industriais

que possuem gua em seu sistema, tais como: torres deresfriamento, sistemas de tratamento de gua (resinas

de troca inica, osmose reversa) e em todos os demais

sistemas que tenham quaisquer uidos em circulao.

Biolmes microbianos so denidos como associa-

es de clulas bacterianas e de fungos [1], inclusas em

uma complexa matriz polimrica extracelular (MPE). A

MPE possui variada composio qumica, e no somen-

te prov a estrutura orgnica do biolme, como tambm

facilita o arranjo espacial das diferentes espcies que o

compem. Dentre os principais componentes da MPE

Eliane Gama LucchesiSlvia Yuko Eguchi

ngela Maria Moraes

Autores: Eliane Gama Lucchesi1, Slvia Yuko Eguchi2

e ngela Maria Moraes1

1Departamento de Processos Biotecnolgicos,

Faculdade de Engenharia Qumica,

Universidade Estadual de Campinas2Dosage Pesquisas Laboratoriais, Investiga Institutos

de Pesquisa

Contato:ammoraes@feq.unicamp.br

podem-se citar polissacardeos, protenas, cidos nu-

clicos e fosfolipdios [2]. Assim, esta matriz extracelular

formada em parte pelas prprias clulas, podendo tam-

bm incluir componentes do ambiente, como detritos,

materiais inorgnicos e at mesmo outros organismos.

Os biolmes asssociados a doenas tm sido deta-

lhadamente estudados nas reas de medicina e odonto-

logia, nas quais os problemas gerados so mais crticos

por envolver diretamente vidas humanas. Nestes casos,ocorrem principalmente porque os uidos corpreos so

excelentes meios de cultivos, provendo nutrientes varia-

dos para os micro-organismos. Estima-se que os biol-

mes estejam envolvidos em 65% dos casos de infeces

humanas de origem bacteriana [3]. Dispositivos mdicos

propcios colonizao por biolmes, como catteres,

so responsveis diretos pelo fracasso de muitos trata-

mentos tradicionais [4], pois permitem a instalao de

micro-organismos de difcil controle e que apresentam

maior resistncia erradicao por agentes antimicro-

Eficcia de agentes

antimicrobianos embiofilmes para o controle decontaminao na indstriade domissanitrios

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ARTIGO TCNICO

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bianos como antibiticos, biocidas e desinfetantes [5] do

que as clulas planctnicas, pioneiras na formao de

biolmes.

Supe-se que menos de 10% dos micro-organismos

presentes num sistema sejam, de fato, clulas planct-

nicas, estando mais de 90% na forma de biolmes [6].

Nas comunidades microbianas possvel observar in-

teraes de mutualismo, comensalismo, antagonismo e

saprosmo, responsveis pela estabilizao do sistema,

podendo ocorrer entre micro-organismomicro-organis-

mo ou micro-organismoorganismo multicelular [2].

A formao do biolme est diretamente relacionada

adeso celular. Dentre os fatores que do incio ao pro-

cesso de adeso esto as cargas superciais da parede

celular das bactrias. A presena de fmbrias e pilis efatores genticos inerentes possibilitam sua interao

com variados tipos de superfcies [7], [8].

Segundo a American Society for Microbiology[9], a

formao do biolme divide-se em cinco etapas conse-

cutivas. A etapa inicial, de adsoro reversvel, ocorre

em segundos, e nela predominam as foras fracas de

atrao. Em seguida, ocorre uma etapa de adeso ir-

reversvel, na qual predominam foras fsicas e qumi -

cas, que duram de segundos a horas. Aps esta etapa,

por perodos de horas a dias, ocorrem o crescimento e

a diviso celular, seguidos da formao da MPE [10].

Finalmente, na quinta e ltima etapa, ocorre a adeso

de outros organismos e a liberao de micro-colnias

microbianas, que prolongam por perodos de dias as

meses [10].

Durante a adeso, as clulas modicam seu fenti-

po em funo da proximidade do suporte, respondendo

s condies ambientais com padres de crescimento

diferentes dos observados em clulas livres [8]. Alm

da maior resistncia a agentes antimicrobianos, outros

problemas esto associados presena dos biolmes,dentre estes, maior populao em comparao de

clulas planctnicas (podendo chegar a valores de at

1011a 1012UCF/mL), maior diculdade de remoo das

clulas do sistema, limpeza, manuteno de equipamen-

tos, chegando at os efeitos deletrios sobre o produto

nal [10].

A anlise da concentrao inibitria mnima (CIM) e

da concentrao de morte mnima (CMM) muito utiliza-

da na rea mdica e veterinria com intuito de se veri-

car a dosagem mnima de antimicrobianos necessrios

para inibir ou erradicar cepas causadoras de infeces.

Os testes da CIM e da CMM so ensaios padres para

vericar a susceptibilidade de clulas planctnicas a an-

tibiticos. Devido reprodutibilidade, os testes de CIM

e CMM passaram a ser utilizados para auxiliar na de -

nio de dosagem mnima de outros antimicrobianos,

tais como conservantes necessrios para preservao

de produtos com gua em sua composio.

Entretanto, em se tratando de biolmes, este mtodo

no deve ser aplicado, pois os ensaios de susceptibilida-

de mostram que a concentrao de agente ativo para a

erradicao do biolme de 100 a 1.000 vezes maior do

que a determinada para clulas planctnicas [6]. Esta re-

sistncia d-se principalmente pela MPE e pela compo-

sio da membrana externa e da parede celular, e ocor-

re predominantemente com bactrias Gram-negativas

[10]. Degradao e inativao dos biocidas por enzimas

e metablitos das clulas do biolme podem ocorrer [11],

diminuindo drasticamente a sua eccia na erradicao

das clulas.

Variados sistemas vm sendo utilizados para o de-

senvolvimento controlado de biolmes in vitropara que

se possa testar, de forma mais precisa e reprodutvel,

sua susceptibilidade aos antimicrobianos, determinando

a concentrao inibitria mnima para clulas ssseis

e da concentrao inibitria mnima de erradicao de

biolmes (CIMEB) [12]. Sistemas como a imobilizao

de clulas em hidrogis, o cultivo celular em quimios-

tatos, o uso de fermentador de lme com espessura

constante, reatores de uxo simples, o dispositivo de

Robbin modicado e o cultivo de clulas em placas

com micro-poos como o dispositivo MBEC podem

ser empregados [1]. Entretanto, questes frequentes

como a diculdade de operao e os custos elevados

limitam seu emprego como mtodos de uso rpido para

o diagnstico de problemas e a proposio de possveissolues.

Como alternativa aos sistemas citados anteriormen-

te, foi desenvolvida uma estratgia baseada no uso

de esferas de vidro como suporte para a formao de

biolmes sob condies cisalhantes e em sua utilizao

para a determinao da CIM e da CIMEB em processos

contaminados com micro-organismos ssseis [13]. Tal

estratgia permite gerar biolmes in vitrode foram rpi-

da e simultnea, de forma a possibilitar a realizao de

testes com variados tipos de agentes antimicrobianos,

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de forma simples, rpida, verstil, reprodutiva e menos

dispendiosa em comparao aos dispositivos encon-

trados no mercado. Esta abordagem j foi testada com

sucesso na determinao da CIM e da CIMEB em amos-

tras de uido de corte provenientes de processos de usi-

nagem de metais contaminados por micro-organismos

formadores de biolmes [13]. Alm do vidro, outros tipos

de materiais podem ser utilizados como suporte para

o desenvolvimento de biolmes, como ao inoxidvel e

PVC, de uso comum em processos industriais.

Um dos setores industriais que apresenta proble-

mas com contaminao microbiana disseminada por

biolmes o da produo de domissanitrios. Este seg-

mento passou por grandes mudanas em 2009, quando

a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA),atravs da RDC 035/2008, proibiu a utilizao de formal-

dedo como conservante nestas formulaes.

Devido ao microbicida e microbiosttica do for-

maldedo, a maior parte das ocorrncias de contamina-

o no processo fabril de domissanitrios era, de certa

forma, corrigida com suplementao do conservante,

uma vez que o baixo custo do formaldedo permitia o

aumento na dosagem usada. Com a proibio do uso

de formol, buscar alternativas de preservao passou a

ser premente.

Devido intensa contaminao por biolmes nos

processos de fabricao, proveniente de vrios fatores,

a simples troca do formaldedo por outros agentes anti-

microbianos foi, num primeiro momento inecaz, criando

a necessidade de repensar todos os conceitos no que

se refere contaminao microbiana neste segmento.

No presente estudo, o uso da tcnica de esferas de

vidro foi avaliada para o estabelecimento da dosagem

de erradicao de biolmes e da estratgia de tratamen-

to para o controle da contaminao em duas indstrias

do setor domissanitrio, que apresentavam gravesproblemas de contaminao microbiana. A eccia dos

antimicrobianos em clulas ssseis, pela abordagem de

desenvolvimento dos biolmes em de esferas de vidro,

foi comparada com a erradicao das clulas planctni -

cas pela anlise da CIM tanto em detergentes quanto em

amaciantes de roupas, que apresentaram problemas de

contaminao. Testes comparativos, empregando a me-

todologia j estabelecida baseada no sistema MBEC,

foram realizados, assim como ensaios empregando es-

feras de ao inoxidvel em substituio s de vidro.

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2. Material e mtodos

2.1. Material

No caso de detergentes, para efetuar os ensaios de

formao de biolme e anlise de sua susceptibilidade

a biocidas foi utilizado como inculo uma alquota de

detergente contaminado misturada a micro-organismos

coletados na superfcie dos tanques, na forma de pool,

tendo-se por objetivo obter um consrcio microbiano em

que foram preservadas as interaes entre os micro-

-organismos e o meio ao qual estavam adaptados. Os

micro-organismos foram coletados, com o auxlio de uma

haste exvel com ponta de algodo estril (Swab), nassuperfcies dos tanques de ao inoxidvel utilizados na

fabricao de detergente e transferidos para meio de cul-

tura para crescimento de bactrias. Aps a proliferao

celular, a cultura foi dividida em cinco partes iguais, em

frascos de vidro para reagentes (tipo Schott) contendo

meio de cultura lquido e estril. Este inculo foi mantido

refrigerado. Nos estudos enfocando o amaciante, o incu-

lo consistiu do prprio amaciante de roupas contaminado.

No foi possvel efetuar a proliferao e a manuteno do

inculo em meios de cultura, pois os micro-organismos

contaminantes deste produto no se multiplicavam na au-

sncia do amaciante. Foram estudadas duas empresas

situadas no Estado de So Paulo (Brasil).

Para a propagao celular, a anlise de bactrias

heterotrcas totais, a formao de biolmes e para os

ensaios de susceptibilidade microbiana aos biocidas

foram utilizados os meios de cultivos Tryptic Soy Agar

(TSA) eTryptic Soy Broth (TSB), ambos da Difco. Para

o desenvolvimento dos biolmes foram utilizados tubos

de ensaio com tampa de rosquevel de 16mm x 100mm

contendo esferas de vidro de 0,85mm de dimetro m-dio (modelo U 20, S Esferas, So Paulo, SP, Brasil) ou

esferas de ao inoxidvel de 1,0mm de dimetro mdio

(AISI 304L - Nacional Esferas Ltda.).

Para o estudo foram utilizados biocidas comercial-

mente disponveis: BHD-208 (soluo aquosa de 2-bro-

mo-2nitropropano-1,3-diol, 5-cloro-2-metil-4isotiazolin-

-3ona e 2-metil-4-isotiazolin-3-ona), BP-600 (soluo

aquosa de 1,5-pentanodial), BP-610 (soluo aquosa

de cloreto de alquildimetil benzil amnio, polihexameti-

lenoguanidina hidroclorada e 1,5-pentanodial) e BHD-

235 (soluo aquosa de cloreto de alquil dimetil benzil

amnio), gentilmente cedidos pela empresa IPEL Itibanyl

Produtos Especiais Ltda. (Jarinu, SP, Brasil). O produto

BHD-208 empregado como agente preservante de

formulaes, enquanto o BP-600 e o BP-610 so utili-

zados como sanitizantes industriais e o BHD-235, como

desinfetante domstico.

Como diluente e soluo de lavagem foram utilizadas

gua destilada estril e/ou soluo de NaCl a 0,9% (m/v),

conforme sugerido por Capelletti et al. (2005)[14].

2.2. Determinao da concentrao inibitria

mnima (CIM) e da concentrao mnima de morte

(CMM) para clulas planctnicas

Todos os ensaios de anlise de eccia de agentespara o controle de biolmes e clulas planctnicas con-

taminantes foram realizados nos Laboratrios da IPEL

Itibanyl Produtos Especiais Ltda. Os testes foram exe-

cutados em cabine de segurana biolgica (VLFS-12,

Veco), em sala controlada com presso positiva.

Para a determinao da CIM, foi utilizado como in-

culo, em ambos os casos, suspenses microbianas com

concentraes ajustadas em 1,0x108 UFC/mL com TSB.

Foram preparadas, isoladamente, solues dos qua-

tro antimicrobianos com concentraes iniciais ao dobro

das concentraes normalmente utilizadas. Estas solu-

es foram diludas de forma seriada, na proporo de

1:1 (v/v), com meio TSB previamente contaminado com

1% (v/v) de cada inculo, at que se atingisse 1,56%

da concentrao inicial de cada biocida. Para tal, foram

empregados 3mL de soluo de biocida e 3mL do meio

de cultura TSB em cada etapa da diluio, totalizando

sete transferncias. Os tubos controle continham: meio

de cultura TSB como controle negativo, meio de cultura

com o inculo como controle positivo, e meio de cultura

contendo biocida para o controle da turbidez. O cresci-mento bacteriano foi evidenciado pela turbidez do meio

de cultura. A menor concentrao na qual no houve

crescimento foi assumida como a concentrao inibit-

ria mnima.

Aps a leitura dos resultados da CIM, de cada um

dos tubos que no apresentaram crescimento microbia-

no visvel a olho nu, foi retirada uma alquota de 10L

com uma ala de inoculao calibrada, que foi estriada

na superfcie do meio de cultivo TSA solidicado em pla-

cas de Petri, para a vericao de crescimento celular. A

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menor concentrao de cada agente antimicrobiano na

qual no se vericou crescimento celular foi assumida

como a CMM.

2.3. Formao de biolme na superfcie de

esferas de vidro ou ao inoxidvel e anlise de sua

susceptibilidade aos antimicrobianos

Os ensaios foram realizados com base na metodolo-

gia descrita por Lucchesi [15]. Para cada tipo de contami-

nante os ensaios foram efetuados em triplicata, empre-

gando os quatro biocidas em diferentes concentraes.

Alquotas de 0,3g de esferas de vidro ou ao inoxidvel

previamente lavadas foram acondicionadas em tubos de

ensaio com tampa de rosca (16mm x 100mm) e a cada

um dos tubos foram adicionados 4,5mL de cada suspen-

so microbiana contaminante (contendo 1,0 x 108UFC/

mL), alm de 0,5mL de meio de cultivo TSB. Os tubos fo-

ram colocados em um homogeneizador (modelo AP-22,

Phoenix) e foram agitados por movimentos rotacionais

(4 a 5 rpm) em estufa (modelo 320 L, Tecnal) ajustada

temperatura de 361C por 48 horas para a gerao dos

biolmes em condies cisalhantes.

Aps a incubao, as esferas de vidro ou ao ino-

xidvel foram removidas com o auxlio de uma cureta,

transferidas para novos tubos de ensaios estreis, e la -

vadas por duas vezes com gua destilada estril para a

remoo das clulas no aderidas e dos nutrientes em

contato com as partculas. Aps a lavagem foram adicio-

nados 2,5mL do meio de cultura TSB e 2,5mL de soluo

aquosa dos quatro biocidas testados nas concentraes

de 1%, 5%, 10%, 15% e 20% (em massa) de cada produ-

to. Os tubos foram ento incubados em estufa a 361C

por mais 24 horas, no caso das amostras provenientes

do processo de produo de detergente, e por 3 horas

no caso da amostra de amaciante contaminado. Aps

o perodo de incubao, as solues de biocidas foramdrenadas e as esferas lavadas com gua destilada estril

por duas vezes. Em cada tubo foi adicionado 5mL de meio

de cultivo TSB, que foram sonicados (modelo USC1450,

25 khz, Thornton) por 30 minutos para a desagregao

dos biolmes e, aps 24 horas de incubao, a turvao

ou no dos meios de cultivo foi analisada visando deter-

minar a menor concentrao de cada microbicida capaz

de inibir o crescimento das clulas ssseis, ou seja, a

concentrao inibitria mnima de biolme (CIMB). Para

os tubos sem turvao, as suspenses celulares resul-

tantes foram semeadas (por estrias) em meio de cultivo

TSA devidamente distribudo e solidicado em placas

de Petri. A menor concentrao na qual no se vericou

crescimento de clulas foi denominada concentrao

mnima de erradicao de biolme (CMEB).

2.4. Formao de biolmes no dispositivo

MBECHTP e anlise de sua susceptibilidade aos

antimicrobianos

Assim como no procedimento envolvendo esferas de

vidro, o ensaio com o dispositivo MBEC-HTP, produzido

em poliestireno, foi realizado em duas etapas, onde numa

se inocula o contaminante formador de biolme e nou-

tra onde se avalia seu comportamento frente a agentes

antimicrobianos. A primeira etapa envolve um dispositivoformado por uma base retangular escavada provida de

8 canais, onde colocada a populao contaminante, e

uma tampa com 96 pinos onde as clulas se xam, for-

mando o biolme. Na segunda etapa, a tampa contendo

os pinos transferida para uma nova base onde se en-

contram 96 poos preenchidos com solues de biocidas

e de amostras para a realizao de ensaios controle.

Assim, para a primeira etapa, em bases distintas

foram adicionados 22 mL de cada um dos inculos pa-

dronizados (1,0x108UFC/mL), e 2 mL de meio de cultura

TSB. Os dispositivos foram tampados e transferidos para

uma mesa agitadora com movimentos oscilatrios (4 a 5

oscilaes por minuto e inclinao de 5), posicionando-

-os de forma que o uxo do meio de cultura na base do

dispositivo casse direcionado no sentido dos canais. O

crescimento microbiano foi efetuado em estufa (modelo

320 L, Tecnal) a 361C, por 48 horas para permitir a for-

mao dos lmes em cada um dos pinos com populao

microbiana superior a 1,0x106UFC/pino.

Aps a incubao, a tampa do dispositivo MBEC

foi retirada e lavada por duas vezes com soluo salina,para remoo das clulas planctnicas. Esta lavagem foi

efetuada colocando-se a tampa do dispositivo em uma

placa do tipo ELISA com 96 poos, contendo 0,2mL de

soluo salina estril por poo. Aps a lavagem, a tampa

do dispositivo foi encaixada em outra microplaca do tipo

ELISA com 96 orifcios, cada um contendo 0,1mL das di-

ferentes concentraes dos biocidas e 0,1mL do meio de

cultura TSB, de modo a encaixar um pino em cada poo.

As placas foram incubadas a 361C por 24 horas. Aps

o perodo de incubao, a tampa foi novamente lavada

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com soluo salina e colocada em uma nova microplaca

contendo 200L de meio TSB fresco por poo. Aps 30

minutos de sonicao, a placa foi incubada por mais 24

horas, quando, ento, foi analisado o crescimento celu-

lar por turbidez ou por estrias em meio TSA. A menor

concentrao na qual no foi vericado o crescimento de

clulas foi denominada concentrao mnima de erradi-

cao do biolme (CMEB).

2.5. Caracterizao das clulas contaminantes do

amaciante

A identicao dos micro-organismos contaminan-

tes do amaciante foi efetuada pela equipe do Prof. Dr.

Welington Luiz de Arajo, da Universidade de Mogi das

Cruzes (So Paulo). Uma amostra representativa doamaciante contaminado foi inoculada em meio de cultura

TSB a 10% e aps 72 h, foi realizada a extrao de DNA

total. O gene 16S rRNA foi parcialmente amplicado por

PCR e os fragmentos amplicados foram clonados em

E.coli. A biblioteca de clones resultante foi caracteriza-

da por ARDRA, utilizando-se as enzimas de restrio

HaeIII e HhaI. Clones divergentes foram identicados

por sequenciamento. A anlise fentica foi realizada

com o programa MEGA 4.0 e a rvore de similaridade foi

construda pelo mtodo de neighbour-joining.

3. Resultados e discusso

Agentes microbicidas com ao preservante (ou

conservante) so aqueles que impedem ou retardam a

deteriorao de um produto acabado [16], normalmente

possuindo como caractersticas a dupla ao de redu-

zir a contaminao inicial e de preservar o material de

interesse por longos perodos. Os agentes sanitizantes,

por outro lado, reduzem o nmero de contaminantesbacterianos a nveis relativamente seguros [17], geral-

mente apresentando ao de morte microbiana rpida

(da ordem de horas). A clara diferenciao entre estes

dois tipos de produtos de relevncia na discusso de

resultados como os apresentados a seguir.

3.1. Formao e teste de susceptibilidade do

biolme desenvolvido na superfcie das esferas de

vidro a partir de detergente contaminado

No caso dos produtos testados, as concentraes

recomendadas pelo fabricante [18] (estabelecidas com

base em valores superiores CIM e CMM, na tentativa

de antever e prevenir contaminaes em produtos aca-

bados e que variam de acordo com o tipo de aplicao)

so de 1.000 a 2.000 ppm para o produto BHD-208, de

10.000 a 50.000 ppm para o BP-600 e o BP-610, e de

5.000 a 10.500 ppm para o BHD-235.

Os resultados apresentados nas Tabelas 1 e 2 cor-

roboram as armaes anteriores para as amostras de

detergente contaminado tratadas com os antimicrobia-

nos testados. Enquanto os dados coletados para micro-

-organismos planctnicos (Tabela 1) apontam eccia

dos quatro microbicidas utilizados em concentraes

muito abaixo das indicadas pelo fabricante, os resulta-

dos obtidos para clulas em biolmes mostram que asconcentraes requeridas para o controle da contamina-

o so, de fato, muito superiores.

Quando comparados os resultados das duas tabelas

pode-se vericar o aumento signicativo das dosagens

para erradicao dos biolmes formados em relao aos

Tabela 2

Agente antimicrobiano CIMB (ppm deagente ativo) CMEB (ppm deagente ativo)

BHD-208 16.200 40.250

BP-600 10.005 10.005

BP-610 10.000 10.000

BHD-235 10.800 10.800

Tabela 1

Agente antimicrobianoCIM (ppm deagente ativo)

CMM (ppm deagente ativo)

BHD-208 13,5 13,5

BP-600 10,5 10,5

BP-610 10,0 10,0

BHD-235 9,0 9,0

Resistncia dos micro-organismos oriundos doprocesso de produo de detergente aos agentesantimicrobianos testados, para clulas planctnicas,em termos de concentrao inibitria mnima (CIM)e concentrao mnima de morte (CMM).

Resistncia de biofilmes formados na superfcie deesferas de vidro a partir de micro-organismos oriundosdo processo de produo de detergente aos agentesantimicrobianos em termos de concentrao inibitriamnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnimade erradicao de biofilmes (CMEB).

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resultados obtidos para as clulas planctnicas. Varia-

es de 953 a 1200 vezes foram notadas na CIMB em

relao CIM, e de 953 a 2981 para a CMEB em com -

parao CMM para os variados agentes microbicidas

avaliados. As menores concentraes requeridas para

o controle dos biolmes foram obtidas com os produtos

BP-600 e BP-610. A maior discrepncia foi observada

para o microbicida BHD-208, que atua como um exce-

lente preservante, porm apresentou-se pouco ecaz

como agente sanitizante.

A Tabela 3 mostra os resultados do teste de erra-

dicao de biolmes efetuados empregando o sistema

MBEC. A total correlao nos dados obtidos no sistema

MBECem relao aos biolmes produzidos na super-

fcie das esferas de vidro conrma e valida de uso datcnica de esferas para este tipo de aplicao.

3.2. Formao e susceptibilidade do biolme

desenvolvido na superfcie das esferas de

vidro ou ao de inoxidvel a partir de amaciante

contaminado

Os resultados da CIM e da CMM obtidos para as

amostras de amaciante contaminado esto apresenta-

dos na Tabela 4, enquanto que o comportamento quanto

CIMB e CMEB vericado em esferas de vidro e de

ao inoxidvel apresentados na Tabela 5.

Assim como vericado para as amostras de deter-

gente, os testes da CIM e da CMM com o amaciante

de roupas contaminado mostraram a eccia dos an-

timicrobianos para o controle dos micro-organismos

planctnicos, foram em concentraes muito inferio-

res s indicadas pelo fabricante.

No foram observadas diferenas quanto s concen-

traes necessrias para a erradicao dos biolmes

formados nos dois tipos de materiais (Tabela 5). Pos -

sivelmente, os biolmes formados em vidro e em ao

inoxidvel possuem caractersticas similares.

Variaes idnticas, de 1009 a 1020 para a CIMB em

relao CIM, e de 1009 a 2032 para a CMEB em com-

parao CMM foram obtidos tanto para o vidro quanto

para o ao inoxidvel. Para todos os agentes microbicidas

Tabela 4

Agente antimicrobianoCIM (ppm deagente ativo)

CMM (ppm deagente ativo)

BHD-208 25,8 51,6

BP-600 12,2 24,4

BP-610 10,05 10,05

BHD-235 12,2 12,2

Resistncia dos micro-organismos oriundos doprocesso de produo de amaciante aos agentesantimicrobianos testados, para clulas planctnicas,em termos de concentrao inibitria mnima (CIM)e concentrao mnima de morte (CMM).

Resistncia de biofilmes formados, no dispositivoMBEC, a partir de micro-organismos oriundos doprocesso de produo de detergente aos agentesantimicrobianos em termos de concentrao inibitriamnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnimade erradicao de biofilmes (CMEB).

Tabela 3

Agente antimicrobianoCIMB (ppm deagente ativo)

CMEB (ppm deagente ativo)

BHD-208 13,5 13,5

BP-600 10,5 10,5

BP-610 10,0 10,0

BHD-235 9,0 9,0

Resistncia de biofilmes formados na superfcie de esferas de vidro e de ao inoxidvel a partir de micro-organismosoriundos do processo de produo de amaciante aos agentes antimicrobianos em termos de concentrao inibitriamnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima de erradicao de biofilmes (CMEB).

Tabela 5

Agente antimicrobianoCIMB (ppm de agente ativo) CMEB (ppm de agente ativo)

Vidro Ao Inoxidvel Vidro Ao Inoxidvel

BHD-208 26.300 26.300 52.600 52.600

BP-600 12.322 12.322 24.644 24.644

BP-610 10.150 10.150 10.150 10.150

BHD-235 12.440 12.440 24.800 24.800

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ARTIGO TCNICO

SBCC - Set/Out - 2012

plexo Burkholderia cepacia, Buttiauxella sp., Acidobac-

teriaceae e Gemmatimonadaceae, sendo que nestes

dois ltimos no foi possvel avanar na identicao,

o que sugere que estas possam ser espcies ainda no

descritas na literatura.

4. Concluses

Os resultados deste estudo mostram que caso o

tratamento para eliminar a contaminao dos sistemas

de fabricao do detergente e do amaciante de roupas

fosse baseado somente nos testes de CIM utilizando

clulas planctnicas, a ecincia seria comprometida

necessitando rever toda a sistemtica de sanitizao epreservao.

Na prtica, denir o preservante mais ecaz, recupe -

rar os produtos devolvidos e aumentar a dosagem de mi-

crobicida no foram aes que solucionaram o problema

de contaminao. Foi necessrio, concomitantemente,

efetuar um procedimento de limpeza mecnica com pos-

terior sanitizao, para que as empresas erradicassem

a contaminao.

O sistema de esferas mostrou-se simples, eciente,

com a vantagem de permitir a medida CIMB, alm de

representar um custo 40% inferior ao MBEC.

observa-se que as concentraes requeridas para o con-

trole dos biolmes foram maiores no caso das amostras

de amaciante que das de detergente contaminado, o que

indica que a microbiota do amaciante contaminado mais

resistente, possivelmente por resultar de uma populao

pr-existente que j havia sido exposta, por prolongado

perodo, a microbicidas com baixa ao residual, como

o formol.

Durante os testes com amaciante de roupas

contaminado, verificou-se que os micro-organismos

possuam um comportamento peculiar. Mesmo utili -

zando-se diversas tcnicas de manuteno e recupe-

rao de micro-organismos, no foi possvel efetuar

a propagao deste consrcio microbiano em meios

de cultivo tradicionais. Observou-se que estes micro-

-organismos somente se multiplicavam na presena

do amaciante de roupas, e que quando se retirava o

produto, no havia crescimento de colnias em meio

slido distribudo nas placas de Petri ou no meio de

cultivo lquido. Este compor tamento levou ao inte-

resse de identificar a populao microbiana presente

nesta amostra, atravs da caracterizao molecular

destes contaminantes. Os resultados obtidos so

apresentados na Figura 1.

A comunidade bacteriana encontrada neste ama-

ciante de roupas foi composta por organismos do com-

Figura 1 Padro de bandas dos isolados da amostra de amaciante, obtida por meio da tcnica de ARDRA. A:resultados obtidos com a enzima HaeIII; B: resultados obtidos com a enzima Enzima HhaI; M: marcador molecular de100pb; A01 a A18: isolados.

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