1. Mad I Aula:17/08 Diagnostico laboratorial A importncia do diagnostico atravs de teste de laboratrio:Existem doenas virais que so clinicamente semelhantes, como por exemplo, as hepatites viral. Essas doenas s podem ser diagnosticadas por exames laboratoriais, pois suas complicaes clinicas so muito semelhantes. Ainda sim as Hepatites B e C, importante o acompanhamento do paciente, e esse monitoramento e feito em exames laboratoriais. O diagnostico para determinar a conduta de um paciente, como por exemplo, a diferenciao de meningites virais e bacterianas. Filhos de me portadores de hepatite B, todas mulheres q no pr-natal as portadoras de hepatite B, e isso e conhecido por exames laboratoriais quando grvida essa mulheres tem todo procedimento partcula, como por exemplo a utilizao de parto cessaria, e a vacinao dos bebes, e ate a soro converso do bebe essa me n pode amamentar. Um co com suspeita de raiva, o diagnostico feito em laboratrios. Diagnostico de rubola congnita, mulheres q durante a gravidez q tiveram suspeita de rubola na gravidez e assim coleta-se soro do cordo umbilical e pesquisa-se IgM nesse soro de cordo.Mtodos laboratorias: O que coletar para diagnosticar uma infeco: Os vrus so muitos diversos e cada doena tem um a forma de entrada e tem uma forma de ser eliminado e isso vai depender da infeco que o paciente esta tendo. Em linhas gerais, as doenas so divididas por sndromes respiratrias, genitais, entricas, oculares, do sistema nervoso central ou de pele e isso vai determinar a forma de coleta e transporte do espcime. Na duvida do que coletar, coletas matria na porta de entrada do vrus. No caso das infeces respiratrias, em geral, existem alguns espcimes que voc pode coletar secreo nasal ou de garganta, aspirado naso-faringeano. Esse muco coletado por intermdio de uma bomba de suco. Outro espcime o suab, que faz raspagem do local a ser pesquisado e a partir da voc faz o diagnostico laboratorial. No caso de infeco entrica a espcime clinica as fezes. No de infeces de mucosas com porta de entrada ocular e genital utiliza-se o suab. Vrus que causa leses de pele, que se apresentam como vesculas voc tambm utiliza suab ou coleta do tecido ao redor da leso. No caso de infeces do SNC, utiliza-se o liquor. Em outras situaes coleta-se o sangue, onde ser importante a pesquisa de vrus e anticorpos. No caso de necropsia a coleta de tecido para pesquisa vai diagnosticar a causa mortes do individuo. Na coleta de tecido, utiliza-se s fixao e desidratao das clulas.

2. O transporte da espcime clinica tambm importante que de uma forma adequada. No caso dos suabs eles so transportados dentro de um tubo de ensaio com uma soluo de sais, com um pH controlado e antivirais e antibiticos para proteger aquele espcime clinica de outro agente patolgicos. No caso de que voc retira com fezes e urina voc transporta na forma de resfriado, nesses casos a temperatura depende do tempo de transporte. O sistema mais utilizado o gelo seco, que mantm a temperatura estvel.Existem trs formas principais de se diagnosticar as infeces virais: 1- Aumento clssico de diagnostico, isto isolamento do vrus numsistema hospedeiro. Ou seja, com um agente infeccioso, inoculando essaespcime clinica suspeita numa clula susceptvel e vai observar apropagao desse vrus no sistema hospedeiro. Os mtodos mais empregados na rotina, que consiste na deteco direta pela observao da partcula viral e a pesquisa de antgenos virais que so os mtodos imunolgicos, Elisa aglutinao, imunofluorescncia e a pesquisa de genoma viral, por mtodos moleculares como o PCR, esses so os mtodos rpidos com resultados em media em 1 hora. A pesquisa da sorologia, ou seja, a pesquisa de anticorpos especficos para esse vrus. Figura:Aqui mostra o perfil de uma infeco viral. No ponto 0 (zero) mostra o momento da infeco. A partir da, o paciente esta na fase de incubao que varia de tempo dependendo do vrus e do organismo infectado, este perodo. Esse perodo corresponde ao tempo que o vrus leva para chegar ao rgo alvo e causar nesse uma leso. Esse perodo o que antecede o perodo da fase aguda. A presena de vrus pode ser detectada desde o perodo de incubao, ento na verdade a parir do inicio da fase aguda voc tem o Maximo de vrus no organismo, a partir dai a quantidade de vrus vai diminuindo pela ao do sistema imunolgico. A pesquisa de anticorpos esta relacionado a IgM, na fase aguda e IgG que esta relacionado ao perodo de convalescena. Assim, percebe-se a escolha do mtodo depende da fase em que a infeco viral esta nesse organismo. O mtodo clssico de diagnostico o isolamento, que consiste na inoculao em sistema hospedeiro (culturas celulares steres), a espcime clinica numa clula susceptvel. Mas para isso voc utiliza mtodos de tratamento, retirando tudo que no seja vrus dessa amostra. Esse mtodo depende de uma nica partcula viral infecciosa (virion), teoricamente, que dar origem a milhares de vrus o que faz dessa partcula, uma partcula infecciosa. Mas nem todos os vrus se propagam en vitro. 3. Mtodos Imunolgicos: mtodos que detectam antgenos virais, todos esse tambm detectam anticorpos. Esses mtodos para deteco de antgenos so divididos em 2 grupos. Os primeiros utilizavam reagentes no marcados, como imunodifuso. Esse mtodo utiliza uma lamina de agarose, faz dois orifcios e em um coloca-se anticorpo e no outro o antgeno correspondente, antgeno anticorpo se difunde, assim forma um complexo imune q precipita, formando uma linha que visvel a olho nu. A eletroforese aumenta a velocidade desse processo. Essas tcnicas so poucos visveis porque se necessita de muito antgeno ou muito anticorpo para ocorrer deteco, essas foram substitudas por reaes que utilizam reagentes marcadas, como a floresceina, os istopos radioativos, essas reaes so mais sensveis do que as primeiras. Assim, diminui a chance de dar um falso negativo. A Hemoaglutinao, que embora seja uma tcnica de baixa (.....), muito utilizada na praticas laboratoriais com anticorpos hemoaglutinantes. Existem stios que apresentam na sua superfcie uma protena chamada de hemaglutinina, essa protena fica na superfcie dos envelopes de vrus como o vrus influenza, o vrus da dengue, o vrus do sarampo. A simbologia dessa protena H, e tem a propriedade de aglutinar hemcias. Assim, desenvolveram se uma reao pra deteco de vrus hemaglutinantes baseados nessa propriedade, Exemplo se voc tem um paciente com suspeita de influenza, voc inocula no ovo embrionrio. A partir dai, com a replicao viral, voc colhe a suspenso viral e faz reagir com uma soluo de hemcias. Essa hemcia tem estar tratada. Ento ocorre uma interao da hemcia com o vrus, essa reao ento processada uma microplaca, como por exemplo, de Elisa. Assim se houve vrus a hemcia permanece em suspenso, caso no tenha vrus, as hemcias aglutinam e precipitam.A outra metodologia chamada de inibio de hemaglutinao se presta a dois propsitos ou o 1 que mais utilizado na deteco de anticorpos destinados contra essa hemaglutinina, ou para confirmar o resultado acima. Os primeiros testes para dengue partiam desse principio, assim coletavam-se o soro (sangue) do paciente e nesse soro o objetivo saber se tm anticorpos direcionados por vrus da dengue. Esses anticorpos vo reagir com o vrus da dengue, no laboratrio para revelar essa reao, voc joga hemcia, assim vai pode-se observar dois processo. Ou vai ocorre a reao do vrus com a hemcia, quando no houver anticorpo, levando a hemaglutinao. Mas quando houver anticorpo, esse vo se ligar nos stios dos vrus, logo, impossibilitaram a ligao das hemcias com o vrus, e com isso, provocam aglutinao das hemcias no recipiente.Mtodos que empregam reagentes marcados: Imunoflorescncia e Elisa. 4. Imunoflorescncia: utilizado na pesquisa de antgenos virais em clulas. Por exemplo, o diagnostico de raiva, que a pesquisa do antgeno rabico. coletados o tecido nervoso de ces com suspeita de raiva. As clulas so depositadas em laminas de microscpios ticos. Assim, essas lminas so desenhadas pela imunofluorescencia em locais onde voc pode detectar amostras pareadas especificamente. Depois se adiciona laminas anticorpos especficos marcados com corantes, como a fluoresceina. Assim caso essas clulas tenham antgenos especficos para raiva, quando esses anticorpos forem adicionados, eles vo reagir com os antgenos e a partir da, voc lava a lmina, logo, esses anticorpos ficam ali grudados, e depois se coloca no microscpio de fluorescncia. Logo ao ser excitado por uma luz fluorescente esse corante emite uma luz verde, por exemplo, o que permite a leitura visual nesse microscpio. Esse mtodo pode confirmar, aps um exame positivo de Elisa, a suspeita de HIV positivo. E.L.I.S.A (ensaio imunoenzimtico): o mtodo mais utilizado em laboratrios. Na pesquisa de antgenos, como por exemplo, o HGsAg. Assim em cada cavidade da microplaca de Elisa, voc adiciona anticorpo contra o antgeno q voc quer pesquisar. Esses anticorpos esto revestindo totalmente a cavidade das microplaca. Assim se nesse soro houver HGsAg, ele vai se ligar nos anticorpos. A pos esse evento, voc adiciona mais anticorpos anti HBsAg liga a uma enzima, por exemplo a peroxidase. Logo pra voc enxergar a reao voc adiciona perxido de hidrognio ligado ao cromgeno, esse Dara a cor da reao. Ele normalmente incolor, que quando a enzima oxida esse cromgeno ele vai colorir o ambiente da microplaca. A intensidade da cor vai variar diretamente proporcional a quantidade de antgeno na amostra. Tcnica de Westn Blot: utiliza como mtodo complementar de deteco de algumas infeces, como HIV e hepatite C. Quando voc tem um resultado mais para essas infeco, voc pode utiliza essa tcnica. Ela conjuga duas metodologias, a primeira a separao eletrofortica das ptn e a outra o Elisa. Assim uma suspenso viral submetida a esse processo, colocado num gel, e submetendo corrente eltrica, promovendo movimentao. Essa movimentao vai ser diretamente proporcional a peso molecular. Assim no final, voc vai ter banda vista no gel, onde voc vai ter todas ptns viral separadas. Logo voc transfere esse gel a uma membrana de nitrocelulose. Esse papel recortado em laminas, separando todas as ptns do vrus por peso molecular. Assim quando voc adicionar o soro do paciente, os anticorpos vo se ligar nas ptn especificas ento voc tem uma discriminao contra que anticorpos apresenta. 5. Essa pesquisa de antgenos pode ser realiza para detectar antgenos em tecidos, ou seja, faz uma biopsia, voc pode detectar antgenos virais na clula daquele tecido. Assim voc pode utiliza o Elisa ou a imunoflorescncia. Hibridizao: o resultado positivo mostra a forma de um hbrido, onde numa cadeia a seqncia nucleotdica do genoma do vrus pareada a outra que complementar a formao de hbrido e a sua sombra, marcada para poder enxergar-se. O exemplo e o diagnostico de HPV, em biopsia de amostras retiradas de leses sexuais. Digamos que uma pessoa est com suspeita de infeco de HPV, o diagnostico feito com a coleta das clulas das leses essas clulas so depositadas em laminas de microscpios, e o objetivo do exame pesquisar o genoma viral naquela amostra. Mas o genoma no esta disponvel para deteco. Pois o DNA esta em dupla fita pareada e fechada. Para que voc possa rastrear esse genoma e assim detect-los, antes de tudo voc precisa desnatura essa dupla fita, ou seja, abrir a dupla fita do DNA. Esse processo e conseguido com a elevao de temperatura, e assim fica passvel de ser detectada. Essa deteco ocorre adicionando-se sonda, sonda q nada mais do que uma seqncia nucleotdeos complementar marcada, com, por exemplo, uma enzima, assim essa sonda se for complementar ela se liga a fita alvo a ser pesquisada e ocorre a formao do hbrido, se a sonda n for complementar aps a lavagem ela retirada, e no ocorre visualizao. A revelao feita com a adio do substrato da enzima com um cromgeno. Ai o resultado o desenvolvimento de cor, logo se houver clulas infectadas por HPV, vai aparecer cor do cromgeno, se na houver no aparecera a cor. DA mesma maneira essa sonda pode ser marcada com o istopo radioativo, mas nesse caso a revelao diferente, pois se utiliza um filme de raios-X, obtendo-se a impresso da radioatividade mediante aquela sonda que esta ligada ao genoma do vrus HPV. Atualmente os laboratrios trabalho com enzima, pois a utilizao de istopos radioativos necessita de um serie de prejuzo no s em relao sade porque um a substancia cancergena, como ele tem uma meia vida curta, embora ele tenha uma tima sensibilidade, os laboratrios essencialmente trabalham com substancias no radioativas. A reao de hibridizao uma reao bastante sensvel, agora ela no amplifica, voc vai detectar o q tiver de genoma ali na amostra, j o PCR como reao molecular ele tem a grande vantagem de amplificar o que voc possa ter no amostra, logo a aplicabilidade tem suas as vantagens no caso. O PCR figurinha fcil nos laboratrios de pesquisa e utiliza fundamentos de sntese, uma tcnica que permite que voc sintetize em vitro uma determinada seqncia alvo, na verdade voc faz artificialmente o q ocorre naturalmente no corpo, ou seja, sintetizar uma seqncia de DNA. Os princpios so a reao da polimerase em cadeia, que permite a amplificao 6. de uma seqncia especifica de DNA, mas para tanto voc precisa conhecer a parte dessa seqncia, a fim de selecionar os primeres ou oligonucleotdeos, que so pequenas seqncias de nucleotdeos que vo delimitar a poro do que voc que amplificar no DNA. Eles vo atuar como iniciadores para que a tac polimerase, que s se liga se tiver o primer liga a fita de nucleotdeos. Essa reao ocorre num aparelho chamado termoficador, de controla a temperatura em questo de segundos, eleva e abaixa a temperatura para que voc possa ter esse processo de sntese. A cada ciclo do PCR eh feito com trs etapas, desnaturao; hibridizao dos oligonucleotideos; polimerizao. A partir de um DNA alvo, que voc quer amplificar. Assim voc desnatura essa dupla fita, com um processo de elevao da temperatura em torna de 90 graus, a fim de abrir a dupla fita de DNA, feito pelo termoficador, e todos os dna que estiverem na amostra vo abrir suas cadeias. Em seguida essa temperatura abaixa para em torno de 50 grua, a fim de promover a ligao dos primeres dupla fita, assim cada oligonucleotideos vai se ligar na sua fita complementar, ou se liga numa fita e outro na outra fita, isso acontece em torno de 50 graus, nessa temperatura os primeres so capazes de ligar-se a fita, essa parte chamada de hibridizao. Em seguida n terceira etapa, a temperatura eleva-se um pouco, e fica em torno de 70 grau, essa temperatura tima para o funcionamento da tac polimerase. Essa enzima foi o grande achado para a reao do PCR, ela foi descoberta em bactrias de guas termais e no sofre desnaturao em temperaturas elevadas, ate 90 graus, o q imprescindvel, porque qualquer outra ptn seria desnaturada a essas temperaturas. Na terceira etapa do ciclo corresponde a polimerizao da cadeia complementar, ento a tac vai se ligar aos primeres e construir a cadeia complementar, logo a partir de uma voc forma duas novas. Isso um ciclo do PCR, esse ciclo se processa n vezes, de 20 a 30 vezes, o resultado disso, no final do processo voc vai ter 2 elevado a n copias , onde n o numero de ciclo, ento esse processo uma projeo geomtrica de produo de DNA. Logicamente a reao de PCR antecedida de uma etapa de extrao. Digamos q voc esta com um aspirado naso-faringeano, amostra fecal, ou com sangue, voc precisa extrair o dna para fazer a reao, separando do espcime clinica o dna alvo, e ai voc vai identificar se tem o genoma do vrus em questo est presente. No final a reao vai apresentar vrios pedaos de DNA, e voc prova se o dna viral em questo do vrus correspondente, a forma mais simples de leitura voc corre num gel de eletroforese, voc vai faze o gel, numa bacia voc adiciona agarose, no momento q solidifica, voc abre as canaletas, onde voc vai colocar suas amostra, logicamente voc vai ter sempre um padro de peso molecular para a corrida. Quando voc seleciona os primeres, voc sabe 7. exatamente o tamanho dos fragmentos esperados, voc sabe quantos pares de bases vo ter no fragmento em teste na reao, quando voc seleciona a regio de interesse voc quantos nucleotdeos ali tem. preciso voc saber isso para a escolha exata dos primeres. Isso o q se faz em laboratrios para exame do vrus da hepatite C, ento a gente espera que a amostra positiva do meu fragmento de PCR (amplicon), tenha 280 pares de bases de acordo com os primeres de bases que eu uso. Na corrida eletrofortica, a minha amostra vai ser positiva caso meu fragmento faa banda em 280 pares de bases de acordo com meu padro de peso molecular, caso no de nada ou de uma banda fora desse lugar meu exame d negativo. A reao de PCR teoricamente, sabendo que existe muitos processo de contaminao, voc s amplifica se seu primer sofrer hibridizao, se isso no ocorrer o resultado negativo. Os mtodos de diagnsticos virolgicos se dividem em dois tipos diretos, que significa a deteco do vrus, de antgenos, do genoma e indiretos, que significa a pesquisa de anticorpos, ambos so extremamente aplicados. Sem duvida nenhuma grande parte das infeces virais so diagnosticas indiretamente, pela pesquisa de anticorpos. Existem duas formas de pesquisar anticorpos. Voc pode pesquisar da classe IgM e classe IgG, e a interpretao desses casos vai ser diferente. Os mtodos atualmente se baseam na pesquisa de classe IgM, ou seja, se eu tenho uma mulher grvida com suspeita de rubola, para voc saber se elas esta com rubola, pesquisar se ela esta com IgM para o vrus da rubola, pq se der positivo, com certeza ela esta tendo uma infeco aguda de rubola naquele momento. No existe a necessita de pesquisar o vrus. O IgM VC PRECISA DE APENAS UMA AMOSTRA coleta naquela fase aguda que sela o diagnostico. E se voc identificar IgG, dando IgG positivo e IgM negativo, ela esta infectada? No. A no ser que voc faa a chamada converso sorolgica, antigamente no existia a tcnica para deteco de IgM, o q se fazia era a pesquisa pareada de IgG, como assim, coleta-se uma amostra na fase aguda(1) e outra na fase convalescente(2), e essas amostras era simultaneamente observadas, e ai voc poderia afirmar que aquela pessoa estava doente naquele momento, caso a o titulo da amostra 2 fosse pelo menos 4 vezes maior do que o titulo a amostra 1, porque isso significa converso sorolgica, que o aumento de pelo menos 4 vezes no titulo de anticorpos entre amostras coletados na fase aguda e na fase convalescente, se voc identificar esse aumento no titulo voc pode afirmar que embora seja da classe IgG aquela pessoa teve a infeco no passado recente. Mas se o titulo for igual entre as amostras, significa que essa pessoa teve uma infeco passada. O que vocs tm que entender que a pesquisa de anticorpos vai depender da classe, se for IgM, basta a coleta de uma amostra na fase aguda da infeco, se for IgG precisa da coleta de duas amostras uma 8. na fase aguda e outra na fase convalescente, e voc precisa verificar esse aumento no titulo de anticorpos, o problema que na fase convalescente o individuo est quase curado e por isso que o teste de IgM mais correto.