2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética

A Genética Molecular em Análises Clínicas

Cuidados Básicos no Laboratório

PROTEGER A AMOSTRAPROTEGER A AMOSTRA

DNAses/RNAsesDNAses/RNAses LuvasLuvas Cobertas de bancaCobertas de banca Materiais M.B. GradeMateriais M.B. Grade Descontaminar Descontaminar

bancas...bancas...

EVITAR CONTAMINAÇÕESEVITAR CONTAMINAÇÕES

Pontas de filtroPontas de filtro LuvasLuvas 3 Zonas Distintas3 Zonas Distintas Descontaminar bancas...Descontaminar bancas...

PRECISÃO MÁXIMA

• Confirmar volumes• Tempos e Temperaturas exactos

PREPARAÇÃO DE DNA E RNA

DNAses e RNAsesDNAses e RNAses Omnipresentes em todo o material biológico:Omnipresentes em todo o material biológico:

Função biológica essencialFunção biológica essencial Presentes em todo o material de vidro e de Presentes em todo o material de vidro e de

plástico não tratado convenientementeplástico não tratado convenientemente Presentes em químicos não “Mol.Biol.Grade”Presentes em químicos não “Mol.Biol.Grade” Presentes nas mãos de todo o pessoal de Presentes nas mãos de todo o pessoal de

laboratóriolaboratório

Descontaminar bancas e equipamento

Pontas para múltiplos volumes

Pontas com marcas de volume

Pontas para tubos longos

Pontas para Geis

Pontas para DNA Genómico

Os tubos eppendorf:

2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda Genética

A Genética Molecular em Análises Clínicas

Preparação de Ácidos NucleicosPreparação de Ácidos Nucleicos

Preparação das células:pulverização pós congelação

Preparação das células:homogeneização

Preparação das células do sangue:Centrifugação em gradiente

descontínuo de densidade (Ficoll)

Preparação das células do sangue:Lise dos eritrócitos

PREPARAÇÃO DE DNA E RNA DNA e RNA de mamiferos:DNA e RNA de mamiferos:

Lise suave e solubilização do DNA/RNALise suave e solubilização do DNA/RNA Destruição enzimática das proteínas (proteases)Destruição enzimática das proteínas (proteases) Destrição e precipitação quimica das proteínas Destrição e precipitação quimica das proteínas

(fenol/clorofómio/ácido isoamilico)(fenol/clorofómio/ácido isoamilico) Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de

amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio)amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio) Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia

remoção de sais)remoção de sais)

Método do fenol/ clorofórmio

Método do salting-out

PREPARAÇÃO DE DNA E RNA

DNA e RNA bacterianoDNA e RNA bacteriano Como a dos mamíferos, mas é necessário ser Como a dos mamíferos, mas é necessário ser

eficaz na separação de polissacáridos, muito eficaz na separação de polissacáridos, muito abundantes em algumas bactérias: abundantes em algumas bactérias:

CsClCsClEnzimas:Enzimas:

• LisozimaLisozima• LisostafinaLisostafina• etcetc

Ultracentrifugação em gradiente de densidade (CsCl)

Separação de ácidos nucleicos por cromatografia de troca iónica

Eluição dos vários ácidos nucleicos em função do pH

Colunas de sílica (ex. Qiagen)

Formato de 96 poços

DNA Genómico

Vacuo Versus Centrifugação

Qiagen Biorobot 9600

Qiagen Biorobot 9604

Sample + Lysis buffer GuSCN

Nucleic acid

Proteins and Lipids

Silica

Elution buffer

Centrifugation

Purified Nucleic acid

Wash

processing time10 samples/1.5h

Método de Boom

Full BloodFull Blood Serum/plasmaSerum/plasma PBMC/PBLPBMC/PBL SputumSputum UrineUrine Brain tissueBrain tissue Spleen tissueSpleen tissue Liver tissueLiver tissue

FaecesFaeces Throat swabsThroat swabs Dermal lesions Dermal lesions

swabsswabs Cerebro spinal Cerebro spinal

fluidsfluids Cervical smearsCervical smears Pus samplesPus samples FoodmatricesFoodmatrices

Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), 495-503, 1990

“Boom” compatible Sample Types

NuclisensExtractor

Unidade Principal

Baía dos reagentes

Cartridge modules

As cartridges

MagnaPure (Roche)

MagnaLyser

Outros sistemas automáticos