UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

JOSÉ AIRTON JORGE ALVES

“A COPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL

DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM

ADULTOS”

TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE

JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À OBTENÇÃO DO TÍTULO DE

DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

RIO DE JANEIRO FEVEREIRO

2009

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i

JOSÉ AIRTON JORGE ALVES

ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL

DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM

ADULTOS

TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

Orientadores: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Profª. Maira Monteiro Fróes

Rio de Janeiro Fevereiro

2009

ii

FICHA CATALOGRÁFICA ALVES, José A. J.

ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O

DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS / JOSÉ AIRTON JORGE ALVES, RIO DE JANEIRO, 2009. xii, 114 f

Orientador: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Orientadora: Profª. Maira Monteiro Fróes Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – UFRJ – Instituto de Ciências Biomédicas – Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, 2009.

1. Junções comunicantes. 2. Medula espinhal. 3. Desenvolvimento. 4. Adultos. I. Menezes, JR. II. Fróes, MM. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-graduação em ciências morfológicas. IV. Título .

iii

JOSÉ AIRTON JORGE ALVES “ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E

EM ADULTOS”

TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS

Aprovada por: Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto

Presidente da Banca Prof. Dr. João Ricardo Lacerda de Menezes Membro Profa. Drª. Tatiana Lobo Coelho de Sampaio

Membro Profa. Drª. Claudia Vargas

Membro

Prof. Dr. Luis Anastácio Alves - Fiocruz Prof. Drª. Patríca Franca Gardino Membro e Revisora

Prof. Dr. Jean Christophe-Houzel Membro

iv

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agredecer especialmente ao meu orientador JOÃO RICARDO,

sem você esta tese nunca seria possível. Excelente orientador, sempre foi um amigo

e ainda torna qualquer momento divertido. Minha co-orientadora, MAIRA FRÓES,

obrigado por ceder sua casa e seu tempo para me ajudar durante a construção da

tese. CECÍLIA HEDIN, Obrigado pelas idéias e ajuda, principalmente durante o

projeto de tese.

Gostaria de agradecer também de forma especial à minha esposa SIMONE

ALENCASTRE, obrigado pela paciência de esperar tantos anos, por me incentivar

constantemente e por fornecer toda a ajuda necessária para que eu pudesse acabar

a tese. Te amo!

Outro agradecimento especial também é para a minha filha JÚLIA

ALENCASTRE. Seu nascimento foi um dos grandes eventos durante este

doutorado. Eu adorei ser pai e você é uma filha maravilhosa, e finalmente vai poder

parar de me perguntar “Quando acaba esse doutorado?”.

Agradeço também aos amigos do Laboratório de Neuroanatomia Celular, LEO

MORITA, EDUARDO, LUCIANA, ANA LENICE, ELISA, LEONARDO e ADIEL. Não

poderia esquecer também dos meus ex-alunos de iniciação científica, JOSÉ

EDUARDO e MANUELA. Muito obrigado, vocês tem grande participação neste

trabalho.

Agradeço também a minha família que sempre me ajuda e me dá força,

mesmo eu não estando muito presente. MARIA (mãe), JOSÉ (pai), ANA e

FRANCISCO (irmãos), CLARA (afilhada), JOSÉ LUIZ (sogro) e SILVÉRIA (sogra).

Obrigado.

v

Agradeço também aos amigos, AD e PATRÍCIA que compartilham das

mesmas dificuldades e sempre tem uma palavra de esperança.

Não posso deixar de agradecer a Deus por ter me dado saúde e força para

suportar as dificuldades e chegar até aqui. Muito obrigado.

vi

José Airton Jorge Alves

ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DUR ANTE O DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS

Tese de Doutorado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, Departamento de Anatomia, no Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas.

Esta tese foi desenvolvida, no Laboratório de Neuroanatomia Celular, sob a orientação do Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes e co-orientação da Profa. Maira Monteiro Fróes e contou com o apoio financeiro das seguintes entidades: CAPES, CNPq, CNPq/PRONEX , FAPERJ, FUJB.

Rio de Janeiro

2009

vii

ALVES , José Airton Jorge. ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS. Rio de Janeiro, 2008. Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.

RESUMO

A primeira semana pós-natal é um período de refinamento sináptico da circuitaria motora e sensorial da medula espinhal. Foi demonstrado que a comunicação juncional mediada por junções comunicantes participa diretamente deste processo em motoneurônios do corno ventral durante o desenvolvimento e após lesões periféricas no adulto. Apesar de ser bem estabelecido para motoneurônios do corno ventral, pouco se conhece sobre o acoplamento juncional no corno dorsal, a porção sensorial da medula espinhal, tanto no neonato como no adulto. Neste trabalho empregamos uma técnica de carregamento celular por transecção, de uma mistura de fluorocromos permeante (lucifer yellow, LY) e não permeante juncional (rodamina-conjugada dextran 3KDa, RD), conhecida como “transection loading”, para revelar o acoplamento celular por corantes in situ na medula espinhal de ratos neonatos e adultos. Nossos resultados demonstraram que o acoplamento celular esta presente e distribuído por toda a medula espinhal no neonato e no adulto, principalmente nas lâminas I, III, IV, VIII, IX e epêndima. Este acoplamento é sensível a inibição farmacológica de junções comunicantes e responde agudamente a lesões de nervo periférico. Estes resultados demonstram de forma pioneira a presença de junções comunicantes funcionais no corno dorsal no desenvolvimento e no adulto, bem como corroboram a hipótese de que a comunicação juncional, assim como no corno ventral, também pode desempenhar um papel no refinamento da circuitaria sensorial durante a primeira semana pós natal e na resposta fisiológica a lesões.

viii

ALVES, José Airton Jorge. CELL COUPLING IN THE SPINAL CORD DURING DEVELOPMENT AND ADULT RATS. Rio de Janeiro, 2009. Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. ABSTRACT

The first postnatal week is a period of intense sinaptic remodelling of motor and sensory circuits for the spinal cord. It is well established that gap junctional communication plays a role in this process for motorneurons in the anterior horn, aswell as cellular responses to peripheral lesion. However little is known for GJC involvement in the dorsal horn, a sensory portion of the spinal cord. In this study we employed a transection-based method, call “transection loading”, for loading cells with gap juction permeant (lucifer yellow, LY) and non- permeant (rhodamine-conjugated dextran 3KDa, RD) fluorochromes to reveal the pattern of dye coupling in the developing and adult spinal cord of the rat. Our result reveal widespread dye coupling in both the neonatal and adult spinal cord, distributed mainly in laminae I, III, IV, VIII, IX and ependyma layer. Coupling was sensitive to pharmacological inhibition of gap junctions and was responsive to peripheral nerve lesion. These results show for the first time functional junctional coupling in the dorsal horn during development and adulthood. It also corroborate the hypothesis that junctional coupling, as described for motorneurons, may play a role in the refinement of sensory synaptic circuits during the first postnatal week, as well as in physiological response to lesions.

ix

Lista de Abreviaturas

AFF = Ácido Flufenamico

βIII-Tubulina = Classe III β-tubulina

CBX = Carbenoxolone

CMM = Coluna motora medial

CML = Coluna motora lateral

CT = Coluna de Terni

Cx = Conexina

DAPI - 4’,6’-diamidina-2’-fenilindol

GSS – solução salina de Gey (do inglês, Gey´s salt solution)

GJ = “Gap junction” - Junção comunicante

GFAP = Proteína glial fibrilar acídica (glial fibrillary acidic protein)

LY = Lucifer Yellow (sem tradução em português)

LY+/RD- = Células marcadas somente com Lucifer Yellow

LY+/RD+ = Células marcadas com Lucifer Yellow e Rodamina Dextran

L3 = Terceira vértebra lombar ou terceiro segmento medular

P0 = Dia do nascimento

PBS = solução de tampão fosfato (phosphate buffered saline)

RD = Rodamina dextran 3k

SNC = sistema nervoso central

SNP = sistema nervoso periférico

TL = “Transection Loading”

Ø Ca2+ - livre de Ca2+

x

SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO 01

1- A medula espinhal do roedor 03

1.1 Morfologia externa da medula espinhal 05

1.1.1 – Morfologia interna e anatomia seccional da medula espinhal 06

1.1.2 – Composição celular da medula espinhal 07

1.2 – Neurogênese da medula espinhal 13

1.2.1 – Geração de neurônios motores 14

1.2.2 – Geração de interneurônios do corno ventral 16

1.2.3 – Geração de interneurônios do corno dorsal 16

1.2.4 – Geração de neurônios sensoriais primários 17

1.3 – Gliogênese 18

1.3.1 – Oligodendrócitos 18

1.3.2 – astrócitos 18

1.3.3 – Microglia 19

1.3.4 – células ependimárias 19

1.5 – Junções comunicantes 21

1.5.1 – Junções comunicantes e o desenvolvimento pós-natal da

medula espinhal

27

1.5.2 – Junções comunicantes na medula espinhal de ratos adultos 29

1.5.3 – Junções comunicantes e a resposta celular na medula espinhal

após lesão central ou periférica

31

2 – OBJETIVOS 36

xi

2.1 – objetivo geral 36

2.2 – Objetivos específicos 36

3 – MATERIAIS E MÉTODOS 37

3. 1 – Animais 37

3. 2 – “Transection Loading” 37

3.3 – Imuno-histoquímica 41

3.4 – Distribuição do acoplamento celular na medula espinhal 42

3.5 – Lesão do nervo ciático 42

3.6 – Bloqueio do acoplamento celular com Carbenoxolone (CBX) e

ácido flufenâmico

43

3.7 – Quantificação do acoplamento celular nos experimentos de

transecção do nervo ciático em ratos neonatos e adultos

44

4.0 – RESULTADOS 46

4.1 – O carregamento de corantes por transecção da medula espinhal

revela padrões esperados de marcação intracelular em ratos neonatos

46

4.2 – Distribuição espacial do acoplamento celular na medula espinhal do

rato neonato

49

4.3 – Diversos tipos celulares encontram-se acoplados na medula de

ratos neonatos

53

4.4 – Acoplamento celular está presente no epêndima de ratos neonatos 59

4.5 – O acoplamento celular é também revelado por carregamento

através dos nervos espinhais na medula espinhal do rato neonato

59

4.6 – O acoplamento celular e a expressão de conexina 43 aumentam

após lesão periférica do nervo ciático em ratos neonatos

64

4.7 – O acoplamento celular é modificado na presença de ácido 68

xii

flufenâmico

4.8 – A técnica de carregamento por transecção revela acoplamento

celular na medula espinhal de ratos adultos

70

4.9 – O acoplamento celular na medula espinhal de ratos adultos em

resposta a lesão periférica

72

4.10 – Bloqueio do acoplamento celular com carbenoxolone abole o

acoplamento entre as células da medula espinhal

74

5 – DISCUSSÃO 76

5.1 – O carregamento celular por transecção é uma forma eficiente de

demonstrar o acoplamento cleular na medula espinhal de animais neonatos

e adultos

76

5.2 – O acoplamento celular é distribuído por todas as lâminas da

medula espinhal de ratos neonatos

83

5.3 – Tipos celulares marcados com Lúcifer Yellow na medula espinhal e

possíveis parceiros acoplados

85

5.4 – A lesão ao nervo ciático aumenta o acoplamento celular mediado

por junções comunicantes na medula espinhal de ratos neonatos

88

5.5 – Junções comunicantes em ratos adultos 89

6 – CONCLUSÕES 92

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94

1

1– INTRODUÇÃO

A comunicação entre as células tem papel central durante o desenvolvimento,

na vida adulta e também em resposta a lesões e processos patológicos (Thompson

et al., 2006; John et al., 1999). Uma das formas de contato direto entre células no

sistema nervoso central (SNC) é através de junções comunicantes, que agindo

como canais intercelulares conectam o citoplasma de células adjacentes e permitem

a passagem rápida de íons e pequenas moléculas que chegam até um pouco mais

de 1 KDa. Provavelmente devido à natureza direta do intercâmbio intercelular

promovido pelos canais juncionais e à sua baixa seletividade, a comunicação

juncional desempenha papéis fisiológicos diversos no indivíduo adulto e durante o

desenvolvimento.

Durante o desenvolvimento embrionário da medula espinhal existe um grande

número de junções comunicantes envolvendo vários tipos celulares, inclusive

neurônios jovens (Bittman et al., 2004; Russo et al., 2008). Para os neurônios

motores da medula, onde este fenômeno foi melhor estudado, o acoplamento celular

alto no período neonatal precoce, gradualmente reduz-se e não é mais detectável ao

final da primeira semana pós-natal (Walton e Navarrete, 1991; Chang et al., 1999).

Durante a vida adulta, no entanto, lesões centrais ou periféricas parecem levar ao

reaparecimento de junções comunicantes funcionais entre neurônios e um aumento

da expressão das conexinas, proteínas que formam estas junções. (Rohlmann et al.,

1993; Theriault et al., 1997; Li e Nagy, 2000; Lee et al., 2005).

Trabalhos recentes demonstram que o acoplamento persistente em

motoneurônios no corno ventral da medula espinhal de ratos parece exercer um

2

papel no refinamento da circuitaria motora durante as duas primeiras semanas pós-

natais (Chang et al., 1999; Mentis et al., 2002; Personius et al., 2008)

Apesar de relativamente adiantados em bases tanto estruturais quanto

fisiopatológicas, os estudos acerca das junções comunicantes no corno ventral da

medula de roedores, reconhece-se uma lacuna quando consideramos o seu

equivalente dorsal em animais pós-natos ou mesmo em adultos. É importante

ressaltar que, também para o corno dorsal, é durante a primeira semana pós-natal

que ocorrem os processos ontogenéticos que levam ao estabelecimento da

circuitaria sináptica (Fitzgerald et al., 1994; Bardoni, 2001; Mentis et al., 2006).

Sendo assim o desenvolvimento e a plasticidade sináptica da circuitaria sensorial

podem envolver junções comunicantes, à semelhança do sugerido para os

motoneurônios do corno ventral (Chang e Balice-Gordon, 2000; Personius et al.,

2008).

O presente manuscrito de tese pretende apresentar os dados resultantes da

avaliação funcional da comunicação juncional no contexto do desenvolvimento pós-

natal e do adulto, e nas respostas fisiopatológicas do corno dorsal da medula

espinhal do rato à injúria neural periférica provocada experimentalmente. Neste

estudo, emprega-se uma técnica de acoplamento por corante, que permite rastrear a

histoarquitetonia da comunicação juncional em grandes populações celulares in

vivo/in situ. Esta técnica foi desenvolvida em nosso laboratório em anos anteriores e

denominada “transection loading” (Menezes et al., 2000).

3

1 – A medula espinhal do roedor:

A medula espinhal é a parte do SNC que conecta as estruturas corticais e/ou

subcorticais encefálicas com a rede neural periférica, esta por sua vez composta por

terminações sensoriais e efetoras distribuídas, através dos nervos espinhais, por

todo o corpo, incluindo tegumento, vísceras e músculos. A medula espinhal não é

simplesmente um centro aferente e efetor do SNC, mas possui centrais de comando

próprio, integrando reflexos e capazes de gerar ritmos na ausência de sinais dos

centros superiores, ritmos estes possíveis de gerar padrões motores específicos

(McCrea e Rybak, 2008).

A medula espinhal em ratos divide-se em 34 segmentos, distribuídos como 8

cervicais, 13 torácicos, 6 lombares, 4 sacrais e 3 caudais (Gilerovich et al., 2008). Ao

longo do canal vertebral, em roedores, estende-se do forame magno até a vértebra

L4 (Gilerovich et al., 2008). A extremidade distal apresenta a forma de um cone,

sendo assim denominado, cone medular. Um filamento delgado de tecido conjuntivo

(filamento terminal) continua inferiormente, a partir do ápice do cone medular,

fixando-se em vértebras caudais.

Cada segmento medular apresenta prolongamentos axonais (radículas) que

emergem ventralmente e conduzem estímulos motores para a periferia, e radículas

dorsais que recebem estímulos sensoriais. A união das radículas forma raízes

ventrais e dorsais, que novamente se unem para formar nervos espinhais. O número

de nervos espinhais é equivalente ao número de segmentos medulares.

No corte transversal, a medula espinhal é circular a oval com um canal central

se estendendo longitudinalmente através de toda sua extensão. A medula espinhal

apresenta duas dilatações ao longo do seu trajeto dentro do canal vertebral,

4

denominadas intumescência lombar e intumescência cervical. Estas regiões refletem

o maior número de neurônios em regiões da medula responsáveis pela inervação

dos músculos dos membros inferiores e superiores (Lent, 2001).

Figura 1. Localização da intumescência lombar na me dula espinhal de ratos. (a) vértebras (b) segmentos medulares. A intumescência lombar em roedores está localizada entre a vértebra T12 – L1. Retirado de Gilerovich et, 2008.

Ao nível das vértebras T12 – L1, em roedores, encontra-se a intumescência

lombar, correspondendo aos segmentos medulares L1 – L5, que são responsáveis

pela inervação dos membros posteriores do roedor (Figura 1) (Gilerovich et al.,

2008). Um dos nervos importantes para esta inervação dos membros posteriores é o

nervo ciático. Este formado pela junção das raízes ventrais e dorsais dos segmentos

medulares L1 –L3 (Walton e Navarrete, 1991).

Cone medular

Cauda eqüina

5

1.1 – Morfologia externa da medula espinhal:

A superfície externa da medula espinhal apresenta uma série fissuras e

sulcos que são úteis para determinações do eixo ântero-posterior. Estes são: sulco

mediano dorsal, que se estende longitudinalmente na face dorsal da medula

espinhal; fissura ventromedial, que se estende longitudinalmente na face ventral da

medula espinhal; sulco posterolateral, a cada lado da face dorsal, marcando o local

onde as radículas posteriores dos nervos espinhais entram na medula espinhal; e o

sulco ventromedial, a cada lado da face ventral, marca onde as radículas anteriores

dos nervos espinhais saem da medula espinhal. A vascularização arterial distinta

ajuda na identificação das faces ventrais e dorsais. Na face anterior, a artéria

espinhal anterior é proeminente e continua, e na face posterior a artéria espinhal

posterior é descontinua e muitas vezes sinuosa e duplicada. É possível visualizar

com grande facilidade a presença de um conjunto de corpos de neurônios

sensoriais, distribuídos ao longo da lateral da medula espinhal, denominados

gânglios das raízes dorsais (Lent, 2001).

Envolvendo a medula espinhal dentro do canal vertebral encontramos 3

camadas distintas de tecido conjuntivo, as meninges. Estas envolvem, protegem e

sustentam a medula espinhal. A camada mais externa é chamada de dura-máter, a

intermediária de aracnóide-máter e a mais interna, aderida ao tecido nervoso é

chamada de pia-máter. Entre estas meninges existem espaços clinicamente

importantes que são: espaço subdural (entre a dura-máter e a aracnóide-máter) e

espaço subaracnóide (entre a aracnóide-máter e a pia-máter), o líquido

cérebroespinhal.

6

1.1.1 – Morfologia interna e anatomia seccional da medula espinhal:

Internamente a medula espinhal apresenta um pequeno canal central cercado

por substância cinzenta e branca. Semelhante a outras estruturas do SNC, na

substância branca da medula espinhal encontramos fibras nervosas mielínicas e

amielínicas de diversos calibres, poucos corpos neuronais e células da glia (Lent,

2001). Estas fibras são agrupadas em feixes e fascículos que ascendem e

descendem em seu trajeto até os nervos periféricos ou até o encéfalo. Transportam

informações sensoriais da pele, músculos, articulações e outros tecidos do corpo ou

distribuem o comando motor gerado em níveis supra segmentares, distribuindo-os

para as demais estruturas através de nervos periféricos.

A substância branca é dividida em 3 pares bilaterais de colunas ou funículos

(Figura 2). 1. Coluna dorsal – Em humanos consiste primariamente de axônios que

conduzem informações sensoriais para o tronco encefálico. Em roedores, no

entanto, apresenta majoritariamente axônios de neurônios motores córtico-

espinhais. 2. Coluna Lateral – Contém axônios que se dirigem aos centros

sensoriais, e que partem de centros motores e autonômicos do cérebro. 3. Coluna

ventral – Contém primariamente axônios encefálicos descendentes que controlam

basicamente a musculatura axial. Além destas 3 colunas, temos o Trato de Lissauer,

contendo ramificações centrais de fibras sensoriais primarias de pequeno diâmetro,

e o fascículo próprio da medula, contendo axônios dos neurônios proprioespinhais

que interconectam diferentes regiões da medula espinhal, localizados ao longo da

margem da substância cinzenta e substância branca (Tanabe et al., 1996).

A substancia cinzenta é composta principalmente de neurônios, formando

uma série de núcleos ou grupamentos neuronais com funções correlacionadas,

7

organizados em grandes massas de substância cinzenta denominadas cornos

ventral, dorsal e lateral (Figura 2). Estas massas encontram-se agregadas,

revelando, ao corte transversal da medula espinhal, a forma da letra H, e definindo a

susbstância cinzenta da medula espinhal, referida como "H medular".

Figura 2. Anatomia geral da medula espinhal em secç ão transversal. Em (a), organização da substância cinzenta. Dorsalmente, originário da placa alar, encontramos o corno dorsal formado por neurônios sensitivos e interneurônios. Ventralmente, encontramos o corno ventral, originário da placa basal, composto por neurônios motores e interneurônios. Em (b), organização da substância branca da medula espinhal, através da formação de colunas ou funículos. Adaptado de Prometeus, 2007.

1.1.2 – Composição celular da medula espinhal:

A medula espinhal foi um modelo de estudo citológico muito empregado no

início do século XX devido ao seu caráter anátomo-histológico relativamente

simples. Esta aparente simplicidade esconde, no entanto, a grande complexidade

dos domínios fisiológicos dispostos em uma organização semi-randômica dentro da

susbtância cinzenta medular. Isto estimulou mais recentemente, a busca por

modelos, embora anatomicamente mais complexos, histo-fisiologicamente mais

organizados à luz da experimentação, como as estruturas telencefálicas, sobretudo

as corticais, definidas por camadas funcionalmente e hodologicamente distintas.

8

Esta complexidade da organização celular somado a relativa dificuldade de acesso

cirúrgico da medula espinhal (musculatura abundante e componentes ósseos

móveis em oposição a imobilidade relativa dos ossos do crânio) o estudo detalhado

dos componentes celulares nesta região ainda está por estabelecer-se à luz de

novos ferramentais tecnológicos.

A substância cinzenta da medula espinhal apresenta-se dominada por

grupamentos nucleares dispostos principalmente em colunas com orientação

longitudinal. Em cortes coronais, os grupamentos nucleares na medula espinhal têm

sua organização definida em camadas, denominadas lâminas de Rexed, as quais

são numeradas de I a X em sentido póstero-anterior tanto em humanos quanto em

roedores (Figura 3).

Figura 3. Disposição das lâminas de Rexed no segmen to lombar da medula espinhal do rato adulto . Lâminas de I – VI formam o corno dorsal. Lâmina VII forma a zona intermediária. Lâmina VIII e IX, formam o corno ventral. A lâmina X se encontra ao redor do canal central da medula espinhal. Adaptado de Gilerovich et al., 2008.

9

Classicamente, os neurônios da medula espinhal se dividem em neurônios

sensoriais, neurônios motores e interneurônios. No entanto, esta nomenclatura

simples esconde uma grande diversidade de sub-tipos neuronais, especialmente

verdadeira para os interneurônios, como veremos a seguir.

Os interneurônios na medula espinhal podem ser de projeção curta ou longa,

com alvos contidos em um mesmo segmento ou distantes, por diversos segmentos

da medula ou em níveis suprasegmentares (Petko e Antal, 2000). Apenas em

relação aos interneurônios proprioespinhais (interneurônios que conectam diferentes

segmentos da medula) acredita-se que existam na ordem de uma dezena de tipos

variados, classificados segundo seus aferentes e eferentes, suas ações gerais

(inibição ou excitação do neurônio alvo) e especializações, sejam estas definidas por

propriedades neuroquímicas adicionais, participação em circuitos medulares

específicos, eletrofisiologia celular intrínseca e padrão de excitabilidade (para

revisão ver Jankowska, 2001).

Na substância cinzenta, a maioria dos corpos celulares refere-se a neurônios.

A maioria das fibras são amielínicas, em grande densidade, assumindo padrões de

entrelace e orientações diversas. As células gliais correspondem a astrócitos

protoplasmáticos, oligodendrócitos e microglia.

A porção de substância cinzenta da medula espinhal dorsal, o corno posterior

ou dorsal (laminas I-VI), é composta principalmente por interneurônios sensoriais

que recebem informações do ambiente externo através dos axônios centrais do

gânglio da raiz dorsal. Estes aferentes primários após entrarem na medula espinhal

são distribuídos espacialmente de forma diferenciada dependendo do diâmetro das

fibras e das modalidades sensoriais conduzidas: fibras de grosso calibre correm

medialmente no funículo dorsal, enquanto fibras de pequeno diâmetro aproximam-se

10

do corno dorsal através do fascículo de Lissauer (trato de fibras longitudinais não-

mielinizadas na porção mais superficial do corno posterior lamina I-II) e são

distribuídas nas lâminas da medula espinhal. Este padrão, embora tenha sido

descrito inicialmente em gatos, pode ser, em linhas gerais, reconhecido em roedores

(Paxinos, 2001).

Os componentes celulares distribuídos nas lâminas da medula espinhal são

diferenciados por sua maquinária de neurotransmissão (Polgar et al., 2003), e por

seus atributos morfofuncionais (Lima e Coimbra, 1986; Han et al., 1998).

A grande maioria dos neurônios da lâmina I – III consiste de interneurônios,

por definição, de projeção intrínseca medular (Polgar et al., 2006). No entanto,

encontramos também neurônios de projeção para regiões supramedulares. Estes

neurônios são marcados para o receptor Neurokinina 1 que é excitado por

substância P (Spike et al., 2003). Recente trabalho quantificou o número de células

das lâminas I, III e IV que projetam diretamente para o tálamo (Al-Khater et al.,

2008). Dos interneurônios sensoriais da intumescência lombar foram encontrados

17% deles que projetam para o tálamo.

A lâmina I, também conhecida como zona marginal medular, apresenta um

grande número de neurônios de pequeno diâmetro, somáticos, em meio a alguns

maiores e alongados mediolateralmente. Por critérios fisiológicos e morfológicos

estes neurônios são categorizáveis em 3 grupos distintos: (1) piramidais, (2)

fusiformes e (3) multipolares (Lima e Coimbra, 1986; Han et al., 1998). Estes

neurônios são imunorreativos para encefalina, substância P, dinorfina (Lima et al.,

1993), calbindina e calretinina (Anelli e Heckman, 2005). Finalmente, a camada I e

sua população neuronal parece constituir uma importante estação para recepção de

11

informações de dor e temperatura, para retransmissão até o tronco encefálico

(Tavares et al., 1993) e outras áreas supratentoriais.

A lâmina II (Substância gelatinosa ou de Rolando) é paralela à lâmina I, e

caracterizada pela presença de neurônios com corpos pequenos e arredondados,

em grande densidade. Estes foram categorizados morfológica e

eletrofisiologicamente em células “islet” (ilha), central, radial e vertical. Dentre estes

tipos, as células ”islet” apresentam seus prologamentos dispostos rostrocaudalmente

por vários micrômetros (Toshiharu et al., 2007).

Na lâmina II chegam aferentes primários não mielinizados conduzindo

informações de dor (Sugiura et al., 1986), que são moduladas por interneurônios

desta camada. Grande número destes neurônios respondem a glutamato (Santos et

al., 2007) e alguns outros são gabaérgicos (Polgar et al., 2003) e glicinérgicos

(Bardoni et al., 2007). Os interneurônios da lâmina II podem ser identificados através

da expressão de calbindina e calretinina (Anelli e Heckman, 2005).

Ao nível das intumescências a lâmina II é aumentada, pois aportam-lhe

muitos aferentes não mielinizados, de origem espinhal e supraespinhal, integrando

estas informações com fibras aferentes pouco mielinizadas que projetam para a

lâmina I.

As lâminas III, IV e V formam o núcleo próprio, que integra entradas

sensoriais com informações que descendem do cérebro e da base do corno dorsal,

onde muitos neurônios que projetam para o tronco encefálico estão localizados.

Na lâmina III são encontradas células pequenas e arredondadas. No entanto,

com uma densidade celular menor do que a registrada na lâmina II. Estão presentes

também neurônios de corpo grande que projetam para o tronco encefálico. Estes

podem ser reconhecidos pela expressão de Neurokinina 1 (Polgar et al., 2007).

12

A lâmina IV é formada por algumas células pequenas e redondas, outras

triangulares e grandes neurônios que projetam para o tronco encefálico e também

expressam o receptor neurokinina 1 (Polgar et al., 2007). O limite entre a lâmina IV e

lâmina V é claramente visível pela diferença na distribuição de fibras.

A parte intermediária da medula espinhal consiste das lâminas V-VIII. A

lâmina VI ocupa a base do corno dorsal e é identificada somente nas áreas de

diâmetro aumentado da medula espinhal. Neurônios nesta lâmina são menores do

que os da lâmina V, e sua distribuição mais homogênea e projetam

contralateralmente e ipsilateralmente para o núcleo reticular lateral (Girafoli et al.,

2006).

A lâmina VII contém o núcleo de Clark, presente em segmentos torácicos e

lombares superiores. Estes neurônios recebem informações proprioceptivas dos

membros e enviam-nas para o cerebelo. O núcleo intermédio lateral encontra-se

descrito no contexto desta lâmina, apresentando na sua composição motoneurônios

autonômicos pré-ganglionares. As células desta lâmina são em sua maioria

triangulares e ovais.

O corno ventral, formado pelas lâminas VIII e IX, contém além de vários tipos

de interneurônios, os neurônios motores, ou motoneurônios inferiores (Lamina IX)

que inervam os músculos estriados esqueléticos. Estes neurônios estão dispostos

em colunas, algumas vezes abrangendo diversos segmentos medulares. As colunas

motoras são divididas morfofuncionalmente em dois grupos: medial e lateral. A

coluna motora medial estende-se por toda a medula e inerva os músculos axiais; as

colunas motoras laterais ocupam principalmente a extensão longitudinal das duas

intumescências medulares.

13

São distinguíveis 2 tipos de motoneurônios (1) motoneurônios alfa –

apresentam corpos celulares de tamanho médio ou grande e extensa arborização

dendrítica. Os axônios dos motoneurônios alfa emergem da medula espinhal e se

integram aos nervos espinhais, fazendo sinapses com fibras musculares,

caracterizadas como especializações histofisiológicas, denominadas junções

neuromusculares; são responsáveis pela contração muscular. (2) motoneurônios

gama – apresentam corpos celulares pequenos e poucos dendritos. Os axônios

destes motoneurônios inervam as fibras musculares intrafusais, controlando

indiretamente a contração muscular (Lent, 2001).

São encontrados também interneurônios, principalmente distribuídos na mal

definida lamina VIII. Estes interneuronios podem ser de axônios curtos (Lent, 2001),

e interneurônios comissurais, excitatórios ou inibitórios (Jankowska et al., 2007). São

encontrados também pequenos interneurônios, denominados células de Renshaw,

que recebem informações colaterais dos motoneurônios alfa, modulando, por alças

sinápticas de retroalimentação negativa a atividade do motoneurônio (Uchiyama e

Windhorst, 2007). As células ao redor do canal central da medula espinhal formam a

lâmina X.

1.2 – Neurogênese da medula espinhal:

Os neurônios na medula espinhal são originários de uma camada

neuroepitelial simples pseudoestratificada, caudal às vesículas encefálicas do tubo

neural primitivo, denominada camada ventricular. As células que proliferam na

camada ventricular recebem sinais moleculares que induzem a diferenciação em

variados fenótipos. Assim como em outras regiões do sistema nervoso, à medida

14

que os neurônios são gerados, migram radialmente, associados com células de glia

radial (McDermott et al., 2005). Após migrarem, acumulam-se na camada do manto

e assumem suas posições na medula espinhal. Os primeiros neurônios gerados

localizam-se nas camadas mais externas, enquanto os mais jovens encontram-se

nas regiões mais internas (Altman e Bayer, 1984).

1.2.1 – Geração de neurônios motores:

A futura região ventral da medula espinhal recebe influência da notocorda

através da expressão de SHH, dando origem a uma estrutura denominada placa

basal, que em E10,5 emite sinais moleculares iniciadores do processo de

diferenciação em neurônios motores (Goulding et al., 1993; Matsuda, 2002). Ao

longo do desenvolvimento diversos subtipos de neurônios da região ventral são

gerados e passam a expressar um complemento final do gene homeótico LIM (Islet

1, Islet 2, LIM 1 e LIM 3). A expressão de Islet 1 na região ventral da medula

espinhal confere as células geradas o fenótipo de motoneurônio (Figura 4), antes

mesmo de sua via axonal ser estabelecida na periferia e da segregação em colunas

(Toshida et al., 1994; Lumsden, 1995).

Os neurônios motores gerados podem ser classificados de acordo com as

projeções de seus axônios ou sua posição específica dentro do corno ventral (Figura

4) (Lumsden, 1995). (1) Neurônios motores localizados próximos à linha média

formam a coluna motora medial (CMM), contínua ao longo da medula espinhal, e

inervam músculos axiais do tronco. (2) Neurônios localizados mais lateralmente

formam a coluna motora lateral (CML) ocupando a intumescência cervical e lombar e

inervam músculos dos membros superiores e inferiores respectivamente. (3) Outra

15

coluna motora é formada nos níveis torácico e sacral, denominada coluna motora de

Terni (CT), responsável pela inervação dos neurônios motores pós-ganglionares

viscerais simpáticos e parassimpáticos (Lumsden, 1995).

As colunas motoras são subdivididas em: CMM lateral (inerva músculos da

parede torácica anterior) e medial (inerva músculos próximos a coluna vertebral) e

CML lateral (inerva músculos dorsais dos membros) e medial (inerva músculos

ventrais dos membros) (Lumsden, 1995; Tanabe.et al., 1996).

Prolongamentos axonais dos neurônios motores emergem ventrolateralmente,

crescendo em direção ao somito adjacente a seu ponto de emergência. Esta atração

das radículas pelos somitos mais próximos sublinha o padrão segmentar de

emergência dos nervos espinhais periféricos.

Figura 4. Distribuição anátomo-sistêmica geral da i nervação motora. Neurônios motores das colunas motoras mediais são responsáveis por inervar os músculos axiais. Enquanto neurônios motores das colunas motoras laterais inervam músculos dos membros. A coluna motora lateral apresenta-se subdividida em coluna motora lateral medial e coluna motora lateral lateral, especializadas na inervação dos músculos ventrais e dorsais. Já os neurônios motores autonômicos advêm da coluna motora intermédia. (Retirado de Tanabe et al., 1996)

Geração de neurônios motores

Músculos axiais

Músculos ventrais

Músculos dorsais

Neurônios autônomos

16

1.2.2- Geração de interneurônios do corno ventral:

Quatro subtipos de interneurônios são encontrados na coluna ventral da

medula espinhal, e são denominados de acordo com a sua origem em nichos

restritos na zona ventricular definidos por expressão diferencial de fatores de

transcrição. Estes quatro tipos são: V0, expressam Evx1/2 e são localizados mais

dorsalmente no corno ventral; V1, expressam En1 e são localizados ventralmente

aos interneurônios V0 (Burrill, et al., 1997); V2, expressam Lim3/Chx10 (Ericson et

al., 1996) e GATA 2 (Zhou et al., 2000) e são localizados entre os interneurônios V1

e os motoneurônios; e finalmente V3, que expressam Sim 1 (Pierani et al., 1999) e

estão localizados mais ventralmente na medula espinhal. Acredita-se que a principal

função destes interneurônios ventrais seja formar a circuitaria reflexa e coordenar a

atividade motora junto aos motoneurônios (Allum et al., 1989; Goulding et al., 2002).

As células de Renshaw, interneurônios inibitórios que modulam a atividade dos

motoneurônios são originários dos interneurônios V1 (Wenner e Donovan, 1999).

Neurônios gerados de V0 são interneurônios comissurais gabaérgicos e

glumatamatérgicos (Lanuza et al., 2004). V1 são interneurônios de projeção

ipsilateral gabaérgicos e glicinérgicos (Wenner et al., 2000). V2 são interneurônios

de projeção ipsilateral (Lee e Pfaff, 2001) e V3 são interneurônios excitatórios

ipsilaterais e comissurais (Zhang et al., 2008).

1.2.3 – Geração de interneurônios do corno dorsal:

Na linha média dorsal da medula espinhal, um grupo de células não neurais,

denominado placa alar, serve como centro sinalizador para a diferenciação de

17

neurônios recém gerados em interneurônios sensoriais (Lee e Jessell, 1999). Entre

E10-E12,5 são gerados seis tipos neuronais (Figura 5) denominados dI1 - dI6. Estes

neurônios podem ser divididos em duas classes distintas (A e B). Neurônios classe

A (dl1-dl3) são dependentes da sinalização da placa alar, enquanto neurônios classe

B (dl4-dl6) são independentes desta sinalização (Muller et al., 2002). Em um

segundo momento, entre E11-E13.5, são gerados dois tipos de interneurônios da

classe B (dlLa e dlLb), responsáveis por formar os interneurônios das lâminas I, II e

III do corno dorsal (Muller et al., 2002; Matise, 2002). Os neurônios classe A migram,

ventralmente, para lâminas mais profundas da medula espinhal, gerando neurônios

que processam informações proprioceptivas nas lâminas IV – VII (Bermingham et al.,

2001) e interneurônios comissurais da lâmina VIII (Lee et al., 1998).

Figura 5. Geração de neurônios no corno dorsal a pa rtir de duas ondas proliferativas. Os neurônios da camada I, II e III são gerados através da proliferação dos neurônios de classe B.Matise, 2002

1.2.4 – Geração de neurônios sensoriais primários:

Neurônios sensoriais primários são gerados a partir das células da crista

neural e formam o gânglio da raiz dorsal. Estas células emitem prolongamentos

Classe A Classe B

18

centrais e periféricos. Os prolongamentos periféricos crescem para tecidos

adjacentes como músculos, pele, vísceras. Os prolongamentos centrais formam as

raízes dorsais e penetram na medula espinhal dorso lateralmente onde podem fazer

conexões com interneurônios medulares ou ascender diretamente pelas colunas

dorsais até regiões supramedulares (Fitzgerald et al., 1991).

1.3. – Gliogênese:

1.3.1. – Oligodendrócitos:

Os oligodendrócitos são células gliais maduras que mielinizam os axônios no

SNC. Ao final da geração de motoneurônios na medula espinhal (E14), as células da

linha média ventral periventricular que expressam Olig1/Olig2 tornam-se

progenitores de oligodendrócitos (Zhou et al., 2000). Esta diferenciação parece ser

dependente de SHH (Alberta et al., 2001) e os progenitores gerados migram

dorsalmente e lateralmente através da substância branca e cinzenta, antes de

diferenciar-se em oligodendrócitos (McMahon e McDermott, 2001).

1.3.2 – Astrócitos:

Os astrócitos são originários das células de glia radial da medula espinhal. A

partir de E13 são encontradas células de glia radial (Shibata et al., 1997; McMarron

e McDermott, 2002), nas quais um dos prolongamentos fica ancorado à pia mater e

o outro aderido à superfície ventricular. O processo de transformação da glia radial

medular em astrócitos inicia-se ao final do período de neurogênese, prosseguindo

19

após o nascimento (McMahon e McDermott, 2001; Barry e MacDermott, 2005).

Semelhante à geração de neurônios na medula espinhal, as células de glia, tanto

astrócitos como oligodendrócitos, também parecem ter origem em regiões

específicas e bem delimitadas da zona germinativa da medula (Sun et al., 2006).

1.3.3 – Microglia:

As células da microglia derivam do tecido mesodérmico periférico. No entanto,

ainda não se tem total certeza sobre a identidade dos seus precursores, se são

provenientes de monócitos circulantes do sangue ou de origem extravascular (Chan

et al., 2007). No período pós-natal, os progenitores de células microgliais entram no

sistema nervoso como monócitos derivados da medula óssea (Kaur et al., 2001)

1.3.4 – Células ependimárias:

As células ependimárias são remanescentes das células neuroepiteliais do

tubo neural primitivo. São geradas a partir de E14 – E16 e a diferenciação termina

durante a primeira semana pós-natal (Spassky et al., 2005; Bruni, 1998).

Atualmente, estas células revestem-se de importância devido a sua provável

capacidade progenitora durante o desenvolvimento e no adulto (Johanson et al.,

1999; Coskun et al., 2007), hipótese esta ainda controversa (Doetsch et al., 2003).

20

1.4 – Desenvolvimento pós-natal da medula espinhal de roedores:

Roedores nascem imaturos em relação ao seu sistema motor. A primeira

semana pós-natal é um período muito importante para desenvolvimento da

locomoção e das reações posturais das quais participam os membros de ratos

(Vinay et al., 2004). Este desenvolvimento é dependente da maturação dos sistemas

muscular esquelético e sensorial, dos centros cerebrais superiores, da chegada das

vias descendentes corticais e sub-corticais à medula espinhal e estabelecimento de

conexões intrínsecas entre os interneurônios da medula espinhal (Para revisão ver

Vinay et al., 2004).

As primeiras fibras descendentes a alcançar a medula espinhal têm origem na

formação reticular bulbar e núcleos vestibulares, e chegam em E14-E15 na medula

cervical. No entanto, atingem a medula lombar somente após o nascimento e em P4

a maioria das fibras descendentes do tronco encefálico já atingiram a medula lombar

e encontram-se em fase de estabelecimento de refinamento da circuitaria sináptica

(Lakke, 1997). O trato corticoespinhal, principal via motora voluntária, penetra na

medula espinhal a partir de P0 (Gribnau et al., 1986), com os axônios pioneiros

sendo encontrados na coluna torácica em P3, e na coluna lombar a partir de P7

(Nagashima, 1994; Joosten et al., 1989). A citoarquitetura da medula espinhal está

completa ao final da segunda semana pós-natal (Vinay et al., 2004). A mielinização

axonal aumenta gradativamente a partir da segunda semana pós-natal (Schreyer e

Jones,1982).

Os ramos centrais dos neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal entram

na medula espinhal precocemente (Fitzgerald et al, 1991). As fibras de grande

diâmetro adentram na medula a partir de E15 enquanto as fibras de menor diâmetro

21

(fibras C) somente em E19. Apesar desta entrada precoce, suas terminações

sinápticas só são totalmente estabelecidas ao final da terceira semana pós-natal

(Fitzerald e Jennings, 1999; Mentis et al., 2006). A mediação por receptores NMDA e

purinérgicos, na lâmina II, parece ser importante para a estabilização sináptica que

se desenvolve nesta idade (Bardoni, 2001).

Na primeira semana pós-natal existe intensa sinaptogênese (Bardoni, 2001) e

os interneurônios comissurais já exibem forte circuitaria e são encontrados em

grupos de interneurônios na camada marginal do corno dorsal; no corno ventral e

próximo à linha média (Eide, et al., 1999). Os campos receptivos são maiores e mais

sobrepostos do que em adultos (Fitzgerald e Jennings, 1999). No entanto, a

estimulação dos campos receptivos relacionados as fibras C não provoca respostas

nas células do corno dorsal, respostas estas somente detectadas a partir de P10

(Woolf e Thompson, 1991). Após lesão de nervos periféricos, modificações

sinápticas e estruturais ocorrem no corno dorsal (Bester et al., 2000).

1.5 – Junções comunicantes ( Gap Junctions):

Os tecidos são geralmente formados por uma maioria de células com

características morfológicas ou fisiológicas semelhantes. Estas células precisam

estar coordenadas para o funcionamento normal, e mesmo para a própria formação

destes tecidos. Comunicação intercelular é, por si só, um termo bem abrangente,

pois reunindo uma miríade de formas de transferência de informações entre células,

desde aquelas dependentes de fatores humorais até as que implicam em contato

direto de membrana. É a condição fundamental para a coordenação fisiológica

22

celular e, portanto, para a homeostasia tecidual (Spray e Dermietzel, 1995; Bruzzone

et al., 1996).

A forma fisicamente mais direta de intercâmbio de metabólitos, de mediadores

de excitabilidade elétrica e de sinalização fisiológica celular é representada pela

comunicação dita juncional, dependente de especializações presentes nas regiões

de contato das membranas plasmáticas de células adjacentes, denominadas

junções comunicantes (Gap Junctions – GJ). São encontradas em vertebrados

(White et al., 2004), e organizadas como placas juncionais, isto é, agregados de

canais intercelulares distribuídos regularmente, segundo um padrão semi-cristalino,

hexaédrico em vertebrados superiores. Estas junções encontram-se descritas em

metazoários em geral, e são formadas por duas grandes classes de proteínas,

estruturalmente homólogas, porém geneticamente não relacionadas, as conexinas e

as panexinas, em vertebrados, e proteínas ortólogas às panexinas, as inexinas, em

invertebrados (Phelan, 2005; Bruzzone e Dermietzel, 2006; Shestopalov e Panchin,

2007).

Os canais intercelulares que compõem as placas juncionais conectam as

duas células adjacentes ao nível de suas membranas plasmáticas. Cada canal

intercelular permite o fluxo bidirecional de moléculas de baixa massa molecular (até

pouco mais de 1000 kDa) como íons K+, Ca2+, pequenos carboidratos, aminoácidos

e pequenos peptídeos e segundo-mensageiros como cAMP, cGMP, inositol a,4,5-

trifosfato (IP3). Desta forma, as células são ditas acopladas bioquímica e

eletricamente (Bruzzone e Dermietzel, 2006).

Um canal intercelular é resultado do alinhamento de dois hemicanais, ou

conexons, cada qual composto de um arranjo hexamérico de proteínas juncionais,

as conexinas (Cx), dispostas em torno de um poro hidrofílico (Figura 6) (Beyer et al.,

23

1990). Algumas conexinas são fosfoproteínas, sendo a fosforilação um mecanismo

relacionado à regulação da organização e das propriedades fisiológicas dos canais

juncionais (Lampe e Lau, 2004).

As conexinas são oligomerizadas e então enviadas para a membrana celular

onde formam os hemicanais ou conexons. Os conexons alinhados na formação da

placa juncional obrigam a uma aproximação dos folhetos extracelulares das duas

membranas vizinhas que passa à ordem de 2-4 nanômetros (Zampighi et al., 1988).

Hoje reconhece-se uma família de conexinas e 21 membros clonados no homem e

20 em camundongo (Söhl et al., 2004 e 2005). Destas, cerca de 11 são expressas

no SNC do roedor. As conexinas têm na massa molecular calculada a partir de

análise direta ou de dedução por clonagem da sequência primária de aminoácidos, a

base para a construção da nômina mais amplamente empregada para diferenciar

seus membros, situando-se entre 25 e 62 kDa.

Os conexons podem ser homoméricos, quando formados pela mesma

conexina, ou heteroméricos, quando formados por associações de conexinas

diferentes. O canal juncional pode compor-se por conexons idênticos, em canais

homotípicos, ou diferentes, em canais heterotípicos (Rabionet et al., 2002; Chang et

al., 2003). As junções comunicantes, por sua vez, podem ser classificadas em

homocelulares, quando conectam células de um mesmo tipo, ou heterocelulares,

quando conectam células diferentes (Rouach et al., 2002).

A formação dos conexons e a meia-vida funcional da junção sugerida para

Cx43 situa-se em torno de 1,5 hora (Van Slike e Musil, 2000; Leithe e Rivedal,

2007). Além disso, a fisiologia e a biofísica particulares aos canais intercelulares

formados por cada tipo de conexina parecem relacionar-se primariamente à

24

natureza intrínseca da conexina formadora em questão, e pouco influenciáveis pelo

tipo de tecido (Dermietzel et al., 1991).

As conexinas possuem quatro domínios transmembranares, M1 a M4 (Figura

6), que formam o poro do canal. Estes domínios são conectados com duas alças

extracelulares unidas por pontes de cistina, E1 e E2 (White et al., 1995) e

responsáveis pelo reconhecimento e conexão célula-célula. Os terminais amino- e

carboxi-, além de uma alça intracelular unindo os segmentos M2 e M3, voltam-se

para o citossol. A porção C-terminal é a principal determinante das diferenças de

massa molecular entre conexinas (Evans et al., 2006), por representar o sítio de

maior variabilidade entre seus sub-tipos (Rabionet et al., 2002). É neste terminal que

se concentram os múltiplos sítios de fosforilação das conexinas, reconhecidos, por

exemplo, para proteína C cinase (PKC), proteina cinase mitógeno ativadora (MAPK)

e Src cinase (Solan et al., 2005).

A presença da placa juncional entre células adjacentes não determina sua

funcionalidade à priori. Sensíveis ao estado metabólico e fisiológico celular, os

canais intercelulares juncionais transitam de forma dinâmica entre estados de

fechamento e abertura, por sua vez resultantes de complexos 'chaveamentos'

intramoleculares e interações entre as conexinas e complexos moleculares vizinhos

(Thomas et al., 2005; Hervé et al., 2007). Sabe-se hoje que a propriedade de

abertura dos canais juncionais encontra em elementos básicos da homeostasia

celular, tendo como sítio e graus específicos de fosforilação, voltagem ou

acidificação citoplasmática, os seus principais moduladores (Harris, 2001).

Diferentes conexinas determinam a formação de canais intercelulares com

diferentes graus de permeabilidade. De fato, à massa molecular e, menos

25

Figura 6. A junção comunicante em modelo esquemátic o. a) Placa juncional, hemicanais alinhados para a formação de canais intercelulares, e arranjo hexamérico de conexinas, as proteínas juncionais em estudo nesta tese. Observe-se o estreitamento do espaço intercelular na região de placa juncional; b) Arranjo estrutural de uma conexina na membrana plasmática, destacando-se os 4 segmentos transmembranares, as duas alças extracelulares unidas por pontes de cistina, a alça intracelular e os terminais amino- e carboxi- voltados para o citossol. Adaptado de Sohl et al., 2005.

Conexina Membrana Citoplasma

26

comumente, à carga líquida ou parcial dos permeantes juncionais, somam-se

evidências de que a conformação tridimensional destas moléculas, relativamente à

natureza específica do poro iônico considerado, toma importância na determinação

do repertório possível de agentes intercambiáveis entre as células acopladas.

Coerentemente, o diâmetro interno dos poros juncionais de permeação parece variar

pouco quando se consideram canais intercelulares formados por diferentes

conexinas, situando-se em torno de 12 Å (Harris, 2007); apesar disso, registram-se

valores bem distintos de condutância e permeabilidade (Goldberg et al., 2004). A

variabilidade no comportamento de canais heterólogos (Figura 7) frente a

representantes moleculares de uma mesma família ilustra bem este aspecto da

biofísica da comunicação juncional (Mese et al., 2007; Kanaporis et al., 2008).

Figura 7. Permeabilidade seletiva das junções comun icantes. Junções formadas por diferentes conexinas apresentam diferenças de permeabilidade a moléculas muito próximas quimicamente, como AMPc e GMPc, a exemplo de outras substâncias. Adaptado de Mese et al., 2007.

A comunicação juncional tem se revelado diretamente relacionada à

manutenção da homeostasia, morfogênese e diferenciação celular em vertebrados,

especialmente em estudos com roedores (Spray e Dermietzel, 1995; Bruzzone et al.,

1996). Os processos de crescimento e morte celular também parecem modulados

pelas proteínas juncionais (Vinken, et al., 2006). Mutações em genes que codificam

para conexinas, seus níveis de expressão e/ou estados funcionais têm sido

relacionados a doenças neurológicas como a Doença de Charcot-Marie-Tooth

27

(Braathen et al., 2007), esclerose múltipla (Brand-Schieber et al., 2005) e câncer

(Cronier et al., 2008). As conexinas 32, 36 e 43, isotipos no SNC

predominantemente oligodendrocítico, neuronal e astroglial, parecem envolvidas na

propagação de injúria pós-isquêmica (Frantseva et al., 2002). Além disso, com o

avanço do quadro pós-isquêmico, a expressão de Cx43, por exemplo, parece elevar-

se no foco gliótico, inserindo-se na regulação positiva da proliferação da astroglia

reativa (Haupt et al., 2007).

1.5.1 – Junções comunicantes e o desenvolvimento pó s-natal da medula

espinhal

Durante o desenvolvimento embrionário (Bittman et al., 2002) e pós-natal da

medula espinhal (Chang et al., 1999) o acoplamento celular entre motoneurônios é

extenso. Neste período, vários motoneurônios do corno ventral da medula espinhal

inervam simultaneamente a mesma fibra muscular. Um motoneurônio pode

estabelecer sinapses químicas com várias fibras musculares. No entanto, uma fibra

muscular só estabelece sinapse com um único motoneurônio. A cada conjunto de

motoneurônio e fibras musculares por este inervadas denominamos unidade motora.

A eliminação das sinapses entre motoneurônios e fibras musculares é

necessária ao refinamento da circuitaria motora durante a primeira semana pós-natal

(Thompson, 1985; Colman e Lichtman, 1993). Acredita-se que a exuberância na

comunicação juncional estabelecida transitoriamente entre os motoneurônios esteja

envolvida no processo seletivo de eliminação sináptica. O aumento da atividade

sináptica, presente no início da deambulação, é acompanhado no roedor por

redução drástica do acoplamento celular entre os motoneurônios ao fim da primeira

28

semana pós-natal (Mentis et al., 2002), desaparecendo em animais adultos (Chang

et al., 1999).

Pastor e colaboradores (2003) demonstraram que o acoplamento celular entre

motoneurônios aumenta após a exposição periférica à toxina botulínica durante a

primeira semana pós-natal. Após a interrupção da transmissão neuromuscular,

perifericamente, tem-se a recuperação dos altos níveis de comunicação juncional

entre motoneurônios da medula espinhal, centralmente. Este quadro é reminiscente

do daquele registrado no período embrionário do desenvolvimento da medula,

implicando diretamente o amadurecimento e a funcionalidade das sinapses químicas

periféricas, definindo e estabilizando as unidades motoras, no enfraquecimento e

desaparecimento da rede sináptica elétrica entre os membros da população de

motoneurônios espinhais. Esta regulação negativa da comunicação juncional

medular parece depender também da manutenção da neurotransmissão central local

excitatória, mediada pelo receptor glutamatérgico do tipo NMDA, uma vez que o

bloqueio farmacológico do receptor de NMDA por MK801 torna o acoplamento entre

os motoneurônios da medula espinhal persistente (Personius et al., 2008).

Diversos estudos vêm endereçando uma possível importância da

comunicação juncional para o desenvolvimento da medula espinhal, baseados na

caracterização celular e temporal da expressão de diferentes subtipos de conexinas.

As conexinas 36, 37, 40, 43 e 45 foram encontradas em motoneurônios em

desenvolvimento, desde o período embrionário E15 até o período P4 (Chang et al.,

1999), bem como em outros tipos celulares, neuronais e gliais, da medula espinhal

(Rash et al., 2001).

Enquanto a comunicação juncional está relativamente bem documentada no

corno ventral da medula espinhal, no corno dorsal da medula a literatura é ainda

29

escassa. Quanto à expressão de conexinas nesta região, destaca-se a descrição de

Cx37 (Lin et al., 2002) e de Cx 43 (Li e Nagy, 2000), não identificados, no entanto,

os tipos celulares de expressão, tampouco a funcionalidade das putativas junções

por estas formadas no corno ventral. No artigo de Lin e colaboradores (2002) a lesão

periférica e/ou ativação das fibras de aferência de dor leva ao aumento da

expressão de Cx37 no corno dorsal da medula espinhal. Em estudo complementar,

Li e Nagy (2000) demonstram que a ativação de aferentes de dor que compõem o

nervo ciático leva a um aumento da forma fosforilada da Cx43 no corno dorsal.

Sendo assim, existe um potencial para a formação de acoplamento celular, que é

evidenciado somente após lesão. Desta maneira, estudos prévios do acoplamento

celular no corno dorsal restringem-se a modelos pós-lesão, e revelam uma lacuna

na área, que aguarda por sua investigação na medula espinhal durante o

desenvolvimento e na idade adulta.

1.5.2 – Junções comunicantes na medula espinhal de ratos adultos:

A medula espinhal é uma porção filogeneticamente antiga do SNC. Uma vez

consideradas as sinapses elétricas como formas primitivas de comunicação celular,

pois não são facilmente encontradas em neurônios de mamíferos adultos (Shepherd,

1988), apostava-se mais na exuberância do que na escassez da comunicação

juncional na medula. Ao contrário, no entanto, a surpresa veio de um estudo pioneiro

em roedores adultos, que restringia as evidências morfológicas das junções

comunicantes às superfícies de aposição de membrana entre neurônios sacrais

envolvidos no controle da ejaculação (Matsumoto et al., 1988; 1989).

30

Estudos posteriores, no entanto, desenvolvidos por John Rash e

colaboradores (1996), apresentam evidências morfológicas, por eletromicroscopia,

da presença de junções comunicantes na medula espinhal adulta. O estudo ressalta

as dimensões reduzidas das placas juncionais, que teriam dificultado sua detecção

por grupos anteriores. Utilizando ensaios de crio-fratura, o grupo descreve placas

juncionais estabelecidas entre interneurônios e motoneurônios, em arranjos

sinápticos mistos (i.e., placas juncionais na região de zonas ativas pré-sinápticas e

especializações pós-sinápticas), distribuídos entre as lâminas III e IX de segmentos

lombares da medula espinhal.

Diante dos recursos de clonagem e avanço das técnicas de

imunorreconhecimento, anos mais tarde o mesmo grupo demonstraria a expressão

da Cx36 em contatos homocelulares envolvendo neurônios da medula espinhal

adulta (Rash et al., 2000, 2001). Uma recente evidência funcional da comunicação

juncional na medula veio de estudos em rã adulta, realizados por Bacskai e Matesz

(2002), demonstrando passagem de permeantes juncionais a partir de axônios de

aferentes sensoriais primários para neurônios situados no corno dorsal da medula

espinhal, no tronco encefálico e no cerebelo.

As junções comunicantes, na medula espinhal adulta, são encontradas mais

facilmente entre células não neuronais como astrócitos e oligodendrócitos (Nagy e

Rash, 2000). Sobretudo a rede astrocitária tem sido proposta como responsável pela

criação de domínios medulares de composição metabólica e iônica particulares,

exemplificadas por uma presumível barreira histológica e molecular entre o SNC e o

SNP (Fraher, 1992).

Dentre as conexinas descritas na medula espinhal adulta (CX 26, 30, 32, 36,

43 e 45), a Cx36 parece ser a forma neuronal funcional na medula espinhal de

31

animais adultos enquanto a Cx43 é predominante astrocitária (Rash et al., 2000). No

entanto, em astrócitos medulares foi determinada também a existência das

conexinas 26 e 30. A Cx32 (Rash, et al., 2001) e a Cx45 (Dermietzel et al., 2000)

são encontradas principalmente em oligodendrócitos (Figura 8).

Figura 8. Tipos celulares e conexinas predominantes na medula espinhal de ratos adultos. Adaptado de Rash et al., 2001. E = Epêndima, A = Astrócito, N = Neurônio, O = Oligodendrócito, L = Leptomeninge, Cx = Conexinas, ECM = Matriz extracelular.

Como vimos, no roedor adulto, apesar de contarmos com uma descrição não

puntual da distribuição geral histológica e celular das conexinas e de placas

juncionais por estas formadas na medula espinhal, a funcionalidade destas junções

permanece inexplorada experimentalmente.

1.5.3 – Junções comunicantes e a resposta celular n a medula espinhal após

lesão central ou periférica:

32

As lesões ao sistema nervoso provocam uma série de alterações celulares

que podem ser percebidas ao redor ou a grandes distâncias do local da lesão

(Aldskogius e Kozlova, 1998; Block et al., 2005). Estas respostas variam com a

intensidade e o mecanismo e/ou agente causador da injúria.

Desenvolvem-se nos diversos tipos celulares do sistema nervoso, incluindo

neurônios, astrócitos, microglia, oligodendrócitos, células de Schwann e epêndima,

apresentando, no entanto, perfis fisiopatológicos celulares distintos, em bases de

tempo também distintas (para revisão ver Aldskogius e Kozlova, 1998). Dentre estas

reações fisiopatológicas, incluem-se alterações de expressão de proteínas

juncionais que, se somam àquelas observadas na medula (descritas abaixo), no que

respondem a insultos isquêmicos e manobras de excitotoxicidade induzida

(Sawchuk et al., 1995; Ochalski et al., 1995).

Desde os anos 20, sabe-se que os axônios sensoriais periféricos apresentam

crescimento rápido após lesão, no entanto o ramo central, ao atingir as proximidades

da zona de transição entre o gânglio da raiz dorsal e a medula espinhal, tem o seu

crescimento bloqueado (Aldoskogius e Kozlova, 1998). Quando da lesão periférica,

as reações fisiopatológicas se estendem aos terminais axonais no corno dorsal da

medula espinhal ou tronco encefálico, dependendo se nervos espinhais ou

cranianos, incluindo degeneração do terminal central e axônios, mudanças

moleculares e em proteínas de crescimento, arborização e alterações na

transmissão sináptica (para revisão ver Woolf e Doubell, 1994)

A transecção de nervos espinhais ou cranianos exerce uma rápida resposta

glial no sistema nervoso central. Uma destas respostas é o aumento da expressão

de Cx43 em modelo de lesão do nervo facial, aumento este desenvolvido num

33

período de 45 minutos, ipsilateralmente à lesão, ao redor dos motoneurônios do

núcleo do nervo facial (Rohlmann et al., 1993). Os efeitos da lesão periférica do

nervo facial podem ser percebidos a grandes distâncias, como aumento da

expressão de Cx43 no córtex cerebral após a primeira hora (Laskawi et al., 1997). A

estimulação elétrica do nervo ciático entre 15 minutos e 1 hora aumenta os níveis de

fosforilação da Cx43 no corno dorsal da medula espinhal, ipsilateralmente ao

estímulo, sugerindo, à semelhança do córtex no modelo de lesão ao nervo facial, um

aumento da comunicação juncional mediada por arranjos desta conexina em placas

juncionais funcionais (Li e Nagy, 2000).

As respostas à lesão periférica associadas com conexinas não são exclusivas

de células gliais. Estudos anteriores, mencionados acima no contexto da

comunicação juncional na medula do roedor adulto, relatam o aumento da

expressão de conexinas e de acoplamento, evidenciado por passagem de corantes,

entre neurônios do corno ventral da medula espinhal. Esses eventos ocorrem entre 1

e 4 semanas após a lesão periférica, quando são encontrados grupos de

motoneurônios acoplados na medula lombar de gatos adultos (Chang et al., 2000).

Após lesão direta na medula espinhal, uma série de eventos ocorre dentro

das primeiras horas, estendendo-se até dias. As conexinas têm sido relacionadas

com estes eventos pós-lesão (Lee et al., 2005). Com a transecção completa da

medula espinhal, os níveis de Cx43 são elevados, especialmente na substância

cinzenta rostral ao sítio de lesão, aumentando quatro vezes relativamente ao

controle (Lee et al., 2005). Em experimentos de compressão da medula espinhal,

também são relatados níveis aumentados de Cx43 (Theriault et al., 1997). A

expressão de Cx43 também se encontra relacionada à remielinização da medula

espinhal pós-lesão (Roscoe et al., 2007).

34

Um dos fatores mais necessários à regeneração do sistema nervoso

periférico é a sobrevida neuronal após lesão axonal. A proporção de neurônios

sensoriais no gânglio da raiz dorsal que apresenta sinais de morte celular após

axotomia é de aproximadamente 10 % - 30% (Vestergaard et al., 1997; Tandrup et

al., 2000) em 8 semanas. O índice de morte de motoneurônios da medula espinhal

fica entre 0 - 10% após lesão axonal do nervo ciático (Lowrie et al., 1994; Valero-

Cabre et al., 2001). No entanto, quando a lesão periférica ocorre proximalmente à

medula, o índice aumenta significativamente, estabelecendo-se entre 50 - 80%

(Lowrie et al., 1994; Natsume et al., 2002; Hoang et al., 2003). Neurônios maduros

parecem resistir mais à axotomia do que neurônios jovens (Snider et al., 1992).

O aumento de expressão de conexinas no sistema nervoso pós-lesão parece

relacionar-se a respostas tanto neuronais como astrocitárias. Apesar da

comunicação juncional entre neurônios e astrócitos ter sido sugerida no passado

(Nedergaard et al., 1994) e demonstrada como propriedade transitória dependente

de uma janela temporal relacionada aos níveis de amadurecimento celular in vitro

(Fróes e Campos de Carvalho, 1998, Fróes et al., 1999), ainda se aguarda por

evidências estruturais desta via heterocelular de comunicação juncional (Rash et al.,

2001). Especula-se que em resposta à lesão, tais propriedades pudessem ser

resgatadas, ainda que transitoriamente, relacionando-se positivamente à

regeneração da circuitaria local no SNC (Fróes e Menezes, 2002).

Dentro deste panorama geral da comunicação juncional na medula espinhal

de ratos adultos e no período pós-natal, desenvolvemos nesta tese uma adaptação

técnica pioneira para estudos de comunicação juncional em grandes populações

celulares, a técnica de carregamento de fluorocromos por transecção da medula

espinhal, adaptada da técnica de carregamento por transecção descrita

35

anteriormente por nosso grupo (Menezes et al., 2000), e analisamos a distribuição

do acoplamento juncional em populações celulares no adulto e no pós-nato, dando

ênfase ao pouco estudado corno dorsal da medula espinhal. Em ambos os modelos

identificamos padrões de distribuição de redes celulares acopladas e mostramos

modificações destes padrões por manobras de lesão periférica em paradigmas de

resposta pós-lesão imediata (45 minutos, no adulto e neonato) e tardia (7 dias, no

adulto). Desta forma, pretendemos contribuir para a detecção e composição celular

de grandes redes de comunicação juncional presentes no desenvolvimento do SNC

e no adulto, e para o entendimento do possível papel desta forma de comunicação

na resposta tecidual e celular pós-lesão.

36

2 – OBJETIVOS

2.1 – Objetivo geral:

Demonstrar a distribuição histológica e a composição celular de redes de

comunicação juncional na medula espinhal de ratos em desenvolvimento e adultos,

bem como sua possível modificação em resposta a manobras de lesão periférica.

2.2 – Objetivos específicos:

1 - Estabelecer o método de “Transection Loading” para o uso em medula espinhal

tanto em neonatos e adultos.

2 - Caracterizar o padrão de acoplamento celular na região da intumescência lombar

da medula espinhal em desenvolvimento e no adulto.

3 - Identificação das alterações na comunicação juncional na medula espinhal após

lesão por transecção do nervo ciático.

4 - Análise dos efeitos sobre o acoplamento celular na presença de bloqueio

farmacológico das junções comunicantes.

37

3 – MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – Animais:

Para o desenvolvimento deste trabalho utilizamos ratos Wistar, machos e

fêmeas, em idades pós-natais (P3-P4) e ratos adultos entre 1 e 3 meses de idade,

sendo considerado como P0 o dia do nascimento. Os animais pós-natais foram

anestesiados por hipotermia. Os adultos foram anestesiados por injeção

intraperitoneal de Cloridrato de Xilazina (500mg/Kg) e Cloridrato de Quetamina

(500mg/Kg). Estes experimentos foram realizados de acordo com os procedimentos

e normas do NIH (National Institute of Health) e este projeto foi submetido à

Comissão de Ética com Uso de Animais do CCS (CEUA-CCS).

3.2 – “Transection Loading”:

Para verificarmos o acoplamento funcional utilizamos um ensaio denominado

“Transection Loading”, carregamento de corantes por transecção. A técnica foi

adaptada do carregamento por corte (Scrape loading) utlizado por El Fouly e

colaboradores (1987), e descrita por Menezes e colaboradores (2000) para

observação do acoplamento celular na zona subventricular pós-natal.

Após rápida retirada da medula espinhal através de laminectomia, e cortes de

dissecção nas extremidades torácica e sacral, a intumescência lombar torna-se

facilmente identificável, principalmente pelo seu maior diâmetro, tanto em neonatos

como em adultos. O segmento medular lombar é então colocado em solução salina

de Gey (Gey’s basal salt solution; GBSS) gelada (4 oC) por 1 minuto. Em seguida

38

mergulhados em solução salina tamponada com fosfato livre de Ca2+ e com EGTA

(2mM) (PBS Ø Ca2+) por 1 minuto. A seguir transferimos para superfície plana e

realizamos uma única transecção, coronal, na medula espinhal, para permitir o

carregamento dos fluorocromos (corte de carregamento).

A porção de medula espinhal transeccionada é imersa em uma solução de

fluorocromos, consistindo de Lucifer Yellow (LY) (~443Da após ionização em

solução salina) e Rodamina Dextrana (RD) (3000 Da) (Molecular Probes),

respectivamente a 0,25% e 0,30% (m/v) em Ø Ca2+, por 1,5’. Os segmentos foram

lavados em GBSS por 3 minutos à temperatura ambiente, fracionados em 3 etapas

de um minuto, e fixados em paraformaldeído (PFA) 4% por imersão durante 2h. As

medulas foram então cortadas em vibratomo (Vibratome 3000, Vibratome Co) (60

µm/fatia) ou então crioprotegidas em um gradiente crescente de sacarose (10 e 20%

- m/v). Estas últimas são incluídas em OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura) e

cuidadosamente orientadas para criossecção ortogonal (12 µm a 16 µm de

espessura) em relação ao corte de carregamento, em criostato, para observarmos o

espalhamento dos corantes na profundidade da medula espinhal (cortes

parassagitais ou horizontais). Algumas medulas foram cortadas também

coronalmente (paralelo ao corte de carregamento). As mesmas variações na

orientação dos cortes foram utilizadas no procedimento realizado com o vibratomo.

Os cortes obtidos no criostato são coletados em lâminas gelatinizadas e pós-fixados

em vapor de PFA. Os cortes obtidos com o vibratomo são coletados em PBS, e

podem ser armazenados por até 30 dias flutuando a 4 oC. Uma parte dos cortes

obtidos no vibratomo são processados para determinação fenotípica por

processamento imuno-histoquímico. Todos os cortes são lavados em PBS e

marcados com 4’, 6’-diamidina-2’-fenilindol (DAPI, Sigma), um marcador nuclear que

39

revela a arquitetura tecidual. Após 3 lavagens com PBS, lâminas foram cobertas

com lamínula de vidro utilizando meio de montagem N-propilgalato em glicerol e

seladas com esmalte. As lâminas foram analisadas ao microscópio óptico invertido

(TE200, Nikon), fotografadas com câmera digital CoolSnap-Procf monocromática

(Media Cybernetics). Para análise e aquisição de imagens também foi utilizado

microscopia confocal (LSM 510, Zeiss).

Ambos os fluorocromos utilizados são hidrofílicos (não atravessam

membranas plasmáticas íntegras; desta forma apenas células lesadas durante o

corte de carregamento incorporam os corantes). No entanto, só o LY permeia

junções comunicantes, em virtude do seu baixo peso molecular; e a RD retida nas

células inicialmente marcadas pelo corte de carregamento, funciona como controle

da lesão e origem do espalhamento do corante permeante. Pela distribuição destes

dois fluorocromos temos um panorama do acoplamento juncional na medula

espinhal em desenvolvimento e no adulto. Verifica-se, então, a existência de 2

categorias de células marcadas: 1. Células duplamente marcadas com LY e RD

(LY+RD+), ou seja, células que foram lesadas pela secção, servindo de “porta de

entrada” para os corantes. A maioria destas células localiza-se próximo a superfície

do corte de carregamento, mas há algumas delas mais profundamente no tecido.

Assume-se que a dupla marcação de células profundamente situadas ocorra por

secção dos longos prolongamentos celulares e transporte retrógrado dos

fluorocromos através destes. 2. Células marcadas apenas com LY (LY+RD-), mono-

marcadas, evidenciam o acoplamento juncional, já que somente este permeia

junções comunicantes (Figura 9).

40

Figura 9. Esquema ilustrativo do padrão de marcação esperado a partir da técnica de carregamento por transecção. As categorias de marcação obtidas a partir do ensaio de “transection loading” são: 1) células marcadas com ambos os corantes LY e RD (LY+RD+), células carregadas diretamente; 2) células marcadas apenas com LY (LY+/RD-), células acopladas.

LY+RD+ LY+RD-

41

3.3 – Imuno-histoquímica:

Para as reações de imuno-histoquímica, foram utilizados cortes coronais

obtidos no Vibrátomo (Vibratome 3000, Vibrotome Co). Os cortes são lavados 3

vezes de 5 minutos com solução salina e tampão fosfato (PBS, 10mM e pH 7.4). Em

seguida, incubados com soro bloqueador por 2 horas em solução de PBS com

0,03% de Triton-X 100 (Reagen, USA) contendo 10% de soro de cabra (solução de

bloqueio). Logo depois são incubados com anticorpos primários diluídos em solução

de bloqueio por 24 horas a 4 oC. Em seguida os cortes foram lavados três vezes de

5 minutos com PBS e incubados por 2h, à temperatura ambiente, em solução de

bloqueio com anticorpos secundários.

Para detecção de fenótipo neuronal utilizamos o anticorpo monoclonal contra

classe III β-tubulina (Covance 1:500) feito no camundongo; para identificação de

subtipos de interneurônios utilizamos os anticorpos policlonais contra calbindina

(Cell signaling technology 1:200) e parvalbumina (Chemicon, 1:200) para

identificação de fenótipo glial usamos anticorpo policlonal contra GFAP (proteína

glial fibrilar acídica – Dako, USA; 1:400) feito no coelho; a expressão de conexina

Cx43 foi identificada com o anticorpo monoclonal especifico (Zymed, USA; 1:200);

feita no camundongo, ou pelo anticorpo policlonal especifico cedido pelo Dr. Juan

Saez (PUC, Chile; 1:500).

Utilizamos os seguintes anticorpos secundários feitos na cabra: contra IgG de

coelho conjugado à FITC (Accurate, USA; 1:100); contra IgG de camundongo

conjugado à Cy3 (Jackson ImmunoResearch, USA; 1:50 e 1:200); ou Alexa Flúor

488 (Molecular Probes, USA; 1:200). Para o controle da reação os primários foram

omitidos.

42

3.4 – Distribuição do acoplamento celular na medula espinhal:

Para estudarmos a distribuição do acoplamento celular na medula espinhal

através do “transection loading” como descrito acima, foram realizados cortes

coronais de 60 µm no vibrátomo. Três cortes foram escolhidos com diferentes

distâncias do corte de carregamento. 60 µm, 120 µm e 360 µm. As células marcadas

com RD e também as LY+RD- foram registradas utilizando o software Canvas X.

Após todas as células estarem sinalizadas as LY+RD- ficam destacadas. Estas são

então quantificadas e sua distribuição no eixo ântero-posterior e crânio-caudal foram

desenhadas.

3.5 – Lesão do nervo ciático:

Para estudarmos os efeitos provocados pela lesão periférica em uma

estrutura central (medula espinhal), realizamos uma transecção prévia do nervo

ciático. Para tanto, animais pós-natais (N=3) foram submetidos à anestesia por

hipotermia por 5 minutos, em seguida é realizada uma rápida incisão na fossa

poplítea direta dos animais. Os músculos são afastados e o nervo ciático exposto,

para em seguida com uma tesoura afiada, o nervo ciático ser seccionado. A pele é

imediatamente unida com a aplicação de cola de cianoacrilato. Estes animais

permanecem vivos por 45 minutos e logo após seguem o protocolo de “transection

loading” ou imuno-histoquímica. Os animais controles não receberam a transecção

do nervo ciático.

43

Para realização de transecção do nervo ciático em ratos adultos (N=4), os

animais foram previamente anestesiados com éter. Em seguida foram anestesiados

com uma injeção de Cloridrato de Quetamina (500mg/Kg) e Cloridrato de Xilazina

(500mg/Kg) intraperitonialmente. Em um período aproximadamente de 30 minutos,

foi realizado uma incisão na região posterior da coxa direita, os músculos afastados

e o nervo ciático então exposto. Utilizando uma tesoura de ponta fina, o nervo ciático

é seccionado, e a pele é imediatamente unida com a aplicação de cola de

cianocrilato. Estes animais permaneceram vivos entre 45 minutos (2 animais) até 7

dias (2 animais) após a lesão, variando de acordo com o objetivo de cada

experimento.

3.6 – Bloqueio do acoplamento celular com Carbenoxo lone (CBX) e ácido

flufenâmico (AFF):

Para determinar a natureza do acoplamento celular através de junções

comunicantes. Utilizamos drogas reconhecidas como bloqueadores parciais de

junções comunicantes (para revisão ver: Salameh e Dhein, 2005). Foram utilizados

Carbenoxolone (Ácido 3 β–hidroxi-11- oxooleano-12-eno-30-oico-3-hemissuccinato

CBX; Sigma) a uma concentração de 100-200µM (Davidson e Baumgarten,1988;

Van Haarst et al., 1996) e o acido flufenâmico (Sigma) também a uma concentração

final estimada entre 100 µM.

O CBX foi aplicado diretamente no líquido cérebro espinhal dos ratos adultos

através de injeção raquimedular com micropipeta de vidro (1-2µL) de CBX (5mM; em

água destilada) para obter uma concentração de final de 100-200µM no espaço

extracelular do SNC (supondo o volume de líquor no adulto de 250µl; Burns et al.,

44

1976). Os animais foram mantidos vivos pelo período de 30 minutos e

imediatamente anestesiados e submetidos a técnica de transection loading.

Para diluição do AFF foi usada uma solução de 3:2 de DMSO:etanol. Os

experimentos com AFF foram realizados com animais neonatos na idade de P4, foi

usada uma concentração de 100µM diluídos diretamente na mistura de corantes

(3µL/15µL). As soluções GBSS e PBS Ø Ca2+ também receberam adição de AFF

na mesma concentração. Os procedimentos do “transection loading” foram

realizados seguindo o mesmo protocolo descrito acima. Em animais controle os

meios e corantes eram diluídos com a solução de diluição do AFF.

Para quantificar o acoplamento celular na medula espinhal de ratos neonatos

em experimentos com adição de AFF foram utilizados 6 animais diferentes. Em 3

destes realizamos TL com adição de AFF. Utilizamos 3 animais para controle, sem

adição de AFF. Outro animal foi submetido ao TL com o veículo do AFF e a

quantificação do número total de células e do acoplamento foi similar aos animais

controles. O corno dorsal foi escolhido para quantificação, pois é onde normalmente

encontramos maior número de células acopladas através de TL. As lâminas I, II e III,

são identificadas e demarcadas definindo a área a ser quantificada. O número de

células acopladas é comparado em relação ao número total de células da área,

gerando assim uma proporção de acoplamento. Todos os cortes quantificados

estavam entre 120 µm – 300 µm do corte de carregamento.

3.7 – Quantificação do acoplamento celular nos expe rimentos de transecção

do nervo ciático em ratos neonatos e adultos:

45

Para quantificar o acoplamento em ratos neonatos utilizamos um número de 5

animais. Destes, 3 receberam transecção de seu nervo ciático unilateralmente

(ciático direito) e 2 animais não receberam lesão no nervo ciático. Para quantificar o

acoplamento celular em animais adultos utilizamos 6 animais (4 com lesões nos

nervos ciáticos e 2 animais sem lesão).

Para cada medula cortada coronalmente escolhemos 1 corte localizado entre

120 µm – 300 µm de distância do corte de carregamento. A região correspondente

as lâminas I, II e III do corno dorsal foram demarcadas e então as células RD+ foram

contadas e em seguida as células que apresentavam somente LY (LY+RD-). O

número total de células marcadas no corno dorsal foi identificado através da soma

das células LY+RD- mais as células RD+. A proporção de células acopladas foi

calculada utilizando o número de células LY+RD+ sobre o número total de células

LY+RD- nas lâminas superficiais do corno dorsal.

As lâminas escolhidas para quantificação foram aquelas que possuíam os

dois cornos dorsais presentes, nas camadas mais superficiais. Para efeito de

comparação utilizamos o lado contralateral à lesão e também as lâminas dos

animais sem lesão do nervo ciático.

46

4 – RESULTADOS

O método de carregamento por transecção (“transection loading”, TL) foi

desenvolvido em nosso laboratório para demonstração do acoplamento juncional em

populações celulares do telencéfalo pós-natal, tendo focalizado mais

sistematicamente a zona subventricular pós-natal (Menezes et al., 2000). Este

método vem sendo empregado no estudo de redes de células acopladas em várias

regiões do sistema nervoso central em desenvolvimento (Barbosa L, 2007 – Tese de

Mestrado, Silva M, 2003 - Tese de mestrado; e outros resultados não publicados).

No presente trabalho, demonstramos a eficiência da técnica (TL) para revelar o

acoplamento celular mediado por junções comunicantes na medula espinhal em

desenvolvimento e no adulto (ver adiante).

4.1 – O carregamento de corantes por transecção da medula espinhal revela

padrões esperados de marcação intracelular em ratos neonatos:

No presente estudo, analisamos especificamente a região da intumescência

lombar (L1 – L5) correspondendo aos segmentos vertebrais T12 – L1. Células

marcadas foram classificadas entre aquelas com ambos os corantes (LY+RD+) e

aquelas com apenas LY (LY+RD-). Ambas eram identificáveis consistentemente em

100% das cortes histológicos processadas a partir das medulas submetidas ao TL.

No entanto, o número de células marcadas por corte de carregamento é variável. A

quantificação, na forma de razões entre células LY+RD- e LY+RD+, como explicado

mais abaixo, permite uma normalização em relação à variabilidade no carregamento.

47

Figura 10. Fotomicrografia da medula espinhal após “transection loading”. Em B, note o local de corte de carregamento (cabeça de seta branca), região onde ocorre a entrada de corantes. Notamos células marcadas com LY a variadas distâncias do corte de carregamento (box). Em D e E, Maior aumento da figura B, com marcação para LY e RD. Note as células acopladas (setas brancas). F e G representam um maior aumento das figuras D e E. Note as células acopladas (setas brancas) em H e I, Maior aumento da figura F e G com marcação para RD. As setas indicam a ausência de marcação de RD. Barra de calibração: B e C = 100 µm. D e E = 20 µm. F,G,H e I = 20 µm.

48

Críticas para uma marcação eficiente e mais homogênea são a velocidade da

dissecção e a manutenção da integridade da medula durante o procedimento. Sendo

assim, alguns procedimentos experimentais foram descartados da análise por

apresentarem entradas ectópicas de corante, em decorrência, por exemplo, de

rupturas no tecido provocadas quando da manipulação do dissecto ou por baixa

higidez tecidual.

A figura 10 A, constitui-se na representação esquemática de um segmento de

medula submetida ao TL e seccionada parassagitalmente ao criostato. Na Figura 10

B, é possível identificar claramente os sítios de entrada dos corantes na borda do

corte de carregamento (cabeças de seta brancas). O espalhamento pelas bordas

dorsal e ventral deve-se ao espalhamento pela pia-máter. Algumas células

encontram-se em regiões distantes dos sítios de entrada do corante (Fig. 10 B, box),

muitas LY+RD+ conforme evidenciável na amplificação na Figura 10 G, sugerindo

que a chegada dos dois fluorocromos acontece por difusão através de longos

prolongamentos axonais e/ou dendríticos atingidos pelo corte de carregamento.

Encontramos células marcadas pelo procedimento de TL tanto no corno

dorsal como no corno ventral da medula. Exemplos de marcação no corno ventral

sugerem que o procedimento atingiu os grandes motoneurônios desta região, além

de pequenas células (Figs. 10 E, G); no corno dorsal, pequenas células (Figs. 10 D,

F). Em ambos os casos, identifica-se células LY+RD+ consideradas como

carregadas diretamente pelo corte de carregamento (Figs. 10 F, G), e células

LY+RD- consideradas como acopladas por corante (Figs. 10 F, G – setas brancas).

49

4.2 – Distribuição espacial do acoplamento celular na medula espinhal do rato

neonato:

Em cortes coronais (tangenciais ao corte inicial de carregamento) é possível ver as

células diretamente carregadas ou acopladas distribuídas por todas as laminas da

medula espinhal (Fig. 11). O corno dorsal apresenta consistentemente os maiores

números de células carregadas diretamente e de células acopladas. Apesar de

detectarmos um número significativo de células diretamente carregadas no corno

ventral, números proporcionalmente menores representam as células LY+RD-

marcadas, portanto, acopladas nesta região. A figura 11 apresenta cortes coronais

revelando a distribuição do permeante LY e do não-permeante RD, a distâncias

variadas da superfície de corte-carregamento medular e as respectivas

representações esquemáticas dos perfis duplo- e LY+RD--marcados, quantificados

como razões da primeira sobre esta segunda categoria. Um aspecto interessante é a

redução, consistente entre diferentes experimentos, do número total absoluto de

células marcadas (LY+RD+ e LY+RD-) à medida que aumenta a distância do corte

de carregamento. No exemplo mostrado, em no corte distante 60 µm da superfície

de carregamento registramos 1010 células carregadas diretamente e 78 acopladas

(Figs. 11 A-C). Em cortes a 360 µm de distância, por sua vez, contabilizamos 207

células duplo-carregadas e 17 acopladas (Fig. 11 D-F). Podemos notar, portanto,

que o número de células acopladas também diminuiu. A redução no número de

células diretamente carregadas com o distanciamento da superfície de corte-

carregamento se dá na mesma proporção da redução no número de células LY+RD-

, resultando em razões de acoplamento relativamente constantes. Quanto mais

distante do corte de carregamento, 720 µm em diante, torna-se ainda

50

Figura 11. Distribuição do acoplamento na medula espinhal durante o desenvolvimento pós-natal. O acoplamento celular pode ser identificado em todas as lâminas da medula espinhal longitudinalmente. Em A, B, D, E, G e H, fotomicrografias de um cortes coronais de medula espinhal à 60 µm, 120 µm e 360 µm do corte de carregamento. Em C, F e I, desenhos esquemáticos demonstrando o padrão de acoplamento na medula espinhal longitudinalmente. O número de células LY+RD+ são representados pelos pontos vermelhos. Os pontos verdes representam células LY+RD- e são apresentadas as distâncias do corte de carregamento. Note que a porcentagem de células acopladas se mantém uniforme, mesmo com a variação do total de células marcadas. Barra de calibração: Em todas as figuras 50 µm.

51

Figura 12. Células marcadas com LY e RD são encontradas a grandes distâncias do corte de carregamento. Em A e B, Fotomicrografias de cortes coronais de medula espinhal à 720 µm do corte de carregamento. Em C e D, cortes coronais de medula espinhal à 1180 µm do corte de carregamento. Em E e F, maior aumento da imagem em C e D. Note algumas células acopladas (cabeça de seta) na putativa lâmina IV. Células acopladas também são encontradas na lâmina I (setas). Barra de calibração: Em A, B, C e D = 100 µm. Em E e F = 20 µm.

52

mais evidente uma distribuição não homogênea de células diretamente carregadas

(Figs. 12 A, B).

As regiões mais densamente povoadas por células marcadas parecem

corresponder às lâminas I, III, IV-VI. Nestas lâminas encontram-se células com

longos prolongamentos intersegmentares comissurais e ipsilaterais e neurônios com

conexões espino-talâmicas, reticulares e/ou tectais (Eide et al., 1999; Polgar et al.,

2007).

As Figuras 12 C-F confirmam a eficácia de nosso método em revelar

carregamentos diretos e perfis de acoplamento a longa distância da superfície de

corte-carregamento. Esta é uma importante observação, pois fala a favor de uma

difusão eficiente e equivalente, dentro da janela de tempo adotada para a difusão,

de ambos os corantes, permeante e não-permeante. A diminuição da intensidade de

fluorescência para ambos os corantes, no entanto, afeta sobretudo a detecção da

marcação por RD, que precisa de um maior tempo de exposição e maiores

aumentos para ser detectada (Figs. 12 E, F). Esta diferença passa a ser importante

a partir de 800 µm. Por este motivo, para assegurar um nível ótimo de detecção de

ambos os corantes, optamos por limitar a análise quantitativa à distância de até 300

µm da superfície de corte-carregamento.

4.3 – Diversos tipos celulares encontram-se acoplad os na medula de ratos

neonatos:

Nas células carregadas diretamente, os corantes permitem visualizar a

morfologia das células, preenchendo, além do núcleo, o citoplasma e até os mais

finos prolongamentos. Com isso podemos identificar diversos tipos celulares da

53

Figura 13. Acoplamento celular no corno ventral da medula espinhal. Fotomicrografia de fluorescência de cortes coronais do segmento lombar da medula espinhal após “transection loading”. Algumas células encontram-se acopladas (LY+RD-) no corno ventral. Em A. DAPI demonstrando a citoarquitetura da medula espinhal. Em B, marcação de RD no corno ventral. Em C, dupla marcação LY (verde) RD (vermelho). Em D e E, maior aumento da figura B e C, note um motoneurônio (seta) LY+RD-. Em F e G, maior aumento de B e C, note células de pequeno tamanho ao lado de motoneurônios (setas). Quadrado em A, representa a área estudada. Quadrados em C, representam as regiões das figuras D, E, F e G. Em A = 100 µm, em B e C = 10 µm e em D, E, F e G= 5 µm

54

Figura 14. Diferentes tipos celulares são encontrados no corno ventral de ratos neonatos após TL. Em A e B, imunomarcação para GFAP. Em C e D, Note a grande expressão de Tuj1 em células do corno ventral. Em E e F, uma possível célula de Renshaw imunomarcada para calbindina (vermelho) e LY (verde). Em G e H, imunomarcação para parvalbumina. As setas indicam células duplamente marcadas. Todas as figuras possuem barra de calibração de 20 µm

55

medula espinhal pelas suas morfologias características, tanto no corno ventral (Figs.

13, 14) como no corno dorsal (Figs. 15, 16).

As Células LY+RD- encontradas no corno ventral (Figs. 13, 14) estão

dispersas nas colunas motoras medial e lateral. Identificamos raros motoneurônios

(corpo grande, núcleos pálidos) entre as células acopladas (Fig. 13 D, E),

confirmando trabalhos anteriores (Chang et al., 1999; Chang e Balice-Gordon, 2000;

Personius et al., 2001). Acreditamos que a escassez destes perfis se deva ao

carregamento direto destas células pelos nervos espinhais, dado que grande parte

destes motoneurônios encontrava-se marcada duplamente (LY+RD+). Uma

conseqüência disto é a subestimativa que estaríamos fazendo da contribuição

relativa de motoneurônios para as redes de acoplamento na medula do neonato, no

entanto, o método não se aplica e não pretende à análise de números absolutos,

mas ao levantamento dos possíveis parceiros celulares na definição destas redes de

comunicação juncional, como numa primeira análise. Inesperadamente encontramos

algumas células acopladas por corante (LY+RD-) de menor tamanho junto ao grupo

de motoneurônios, sugerindo serem interneurônios ou células gliais (Fig. 13 F, G -

setas).

Através dos ensaios de imuno-histoquímica conseguimos identificar os

diferentes tipos celulares marcados através desta técnica. Raras células carregadas

com LY foram marcadas positivamente para GFAP no corno ventral e no corno

dorsal (Fig. 14 A, B e 16 A, B). E a quase totalidade das células marcadas

expressam o isotipo classe III da beta-tubulina neurônio-especifico, identificado pela

marcação com o anticorpo Tuj1 (Fig. 14 C, D e 16 C, D). Células de Renshaw foram

marcadas junto a grupos de motoneurônios, e identificadas através de marcação

para calbindina (Fig. 14 E, F). Conseguimos encontrar pequenas células

56

marcadas para calbindina (Fig. 14 E, F). Conseguimos encontrar pequenas células

marcadas também com parvalbumina no corno ventral (Fig. 14 G, H).

Dorsalmente, encontramos uma região de contorno com alta densidade de

células carregadas (Fig. 15). Algumas apresentam-se acopladas, exibindo

exclusivamente o permeante LY. As células acopladas ocupam todas as lâminas I-VI

de Rexed. Algumas destas células representam claramente neurônios multipolares,

similares a interneurônios proprioespinhais (Fig. 15 D, E) (Bareyre et al., 2004;

Dutton et al., 2006). No entanto, as células acopladas mais distantes do corte de

carregamento constituem, em sua maioria, pequenas células arredondadas,

prevalentes na lâmina I, porém também presentes nas lâminas II, III e IV de Rexed

(Han et al., 1998) (Fig. 15 B).

Muitas das células carregadas no corno dorsal são possivelmente

interneurônios sensoriais. No entanto, a possibilidade de serem astrócitos não pode

ser descartada, apesar de encontrarmos escassas células carregadas expressando

GFAP nas lâminas I e II. A participação de interneurônios é reforçada pela

expressão, entre as células carregadas, dos marcadores interneuronais calbindina

(Fig. 16 E, F), e parvalbumina (Fig. 16 G, H), este último em raros perfis. Apesar de

não ilustrado, estes perfis eram identificáveis em diversas lâminas do corno dorsal.

4.4 – O Acoplamento celular está presente no epêndi ma de ratos neonatos:

Além de nos permitir mostrar, pela primeira vez, a presença de acoplamento

celular no corno dorsal da medula espinhal (Fig. 15), esta técnica revelou-nos

acoplamento na camada ependimária, ao redor do canal central medular, no período

pós-natal (Fig. 17).

57

Figura 15. Acoplamento celular no corno dorsal da medula espinhal. Fotomicrografia de fluorescência de cortes coronais do segmento lombar da medula espinhal após “transection loading”. Algumas células encontram-se acopladas (LY+RD-) no corno dorsal. Em A. DAPI demonstrando a citoarquitetura da medula espinhal. Em B, marcação de RD no corno dorsal. Em C, dupla marcação LY (verde) RD (vermelho). Em D e E, maior aumento da figura B e C, note células acopladas na lâmina III (setas) LY+RD-. Em F e G, maior aumento de B e C, note células de pequeno tamanho na lâmina I (setas) Quadrado em A representa a área examinada. Em A=100 µm, em B e C= 20 µm e em D, E, F e G= 10 µm

58

Figura 16. Diferentes tipos celulares são encontrados carregados com LY no corno dorsal da medula espinhal neonatal após o TL. Em A e B, marcação para GFAP. Em C e D, marcação para Tuj1. Em E e F, marcação para Calbindina. Em G e H, marcação para Parvalbumina. I e II, representam as lâminas da medula espinhal. CB = calbindina, PV = parvalbumina. As setas indicam células positivas para os imunomarcadores e também LY+. Barra de calibração. Em A, B, C, D, E e F = 20 µm. Em G e H, 10 µm.

59

Encontramos um grande número de células acopladas na camada de células

ependimárias. Em cortes horizontais foi possível detectar células a grandes

distâncias do corte de carregamento. Algumas células acopladas estão muito

próximas à luz ventricular, reforçando sua identificação como células ependimárias

(Fig. 17 D). No entanto, podemos encontrar células acopladas fora da camada

ependimária propriamente dita, que talvez representem neurônios ou células gliais

(Fig. 17 D, E).

4.5 – O acoplamento celular é também revelado por c arregamento através dos

nervos espinhais na medula espinhal do rato neonato :

Quando a medula espinhal é dissecada contendo um grande número de

segmentos (3-5 segmentos) um número correspondente de nervos espinhais

permanece aderido. É possível que estes nervos possam captar e constituir-se numa

via de entrada destes corantes para dentro da medula. Com o intuito de estudar a

contribuição desta captação, em alguns experimentos não realizamos cortes de

carregamento nas medulas dissecadas. Em lugar do procedimento padrão,

mergulhamos os dissectos de medula na mistura de corantes após lavagem com

PBS Ø Ca2+. Nos segmentos próximos à região de excisão da medula da caixa

vertebral houve entrada de corantes, de forma análoga ao descrito em ensaios onde

a medula é transectada nos segmentos lombares; neste caso, detectamos, conforme

o previsível, um grande número de células acopladas a relativamente curtas

distâncias da superfície transectada para a excisão da medula, número este que

diminuía progressivamente a longas distâncias, do corte, distantes também da

região de medula lombar, de eleição para os ensaios padrão de TL. Dentre as

60

Figura 17. O acoplamento celular no epêndima de ratos neonatos. Podemos observar que o acoplamento celular ocorre na camada de células ependimárias através da técnica de “transection loading”. Em A. Marcação com DAPI, para visualização da citoarquitetura da medula espinhal. Em B e C, LY e RD respectivamente. Em D, dupla marcação para identificação das células acopladas. Observamos várias células acopladas na camada ependimária e a alguns milímetros desta camada (cabeças de setas). CC, canal central. Barra de calibração= 10 µm.

61

células marcadas com LY, algumas ocupavam o corno dorsal e também o corno

ventral. No corno ventral, algumas células puderam ser vistas, e com características

de motoneurônios.

Para diminuir a captação por estas portas de entrada produzidas pela

dissecção, em um grupo de experimentos, as medulas foram colocadas em solução

de meio rico em cálcio (GBSS) para o fechamento das células cortadas durante a

dissecção, inclusive os nervos espinhais, e imediatamente mergulhadas na mistura

de corantes sem cálcio. Não houve marcação significativa de células com LY+RD-

(Figs. 18 e 19). As poucas células marcadas provavelmente receberam os corantes

através secção de seus longos axônios dentro da própria medula espinhal, ou

através de lesão feita após a retirada da medula espinhal da solução de alto cálcio.

Em cortes coronais da medula espinhal, distantes das regiões de entrada do

corante, encontramos uma diminuição expressiva no número de células marcadas.

Podemos notar que nos locais onde ocorreram lesões no tecido durante o

procedimento de TL, existe um grande número de células LY positivas (Fig. 18 –

cabeças de seta). No entanto, no lado contralateral à lesão tecidual não

encontramos um número expressivo de células marcadas com LY. Sendo assim,

demonstramos que a entrada de corantes pelo nervo está eventualmente presente,

mas deve responder por uma parcela pequena do total de perfis celulares

carregados. Nossos dados, portanto, valorizam as superfícies de corte-

carregamento com as maiores fontes de fluorocromos e de carregamento celular

direto e por acoplamento. Aplicando estas conclusões aos nossos dados, temos por

exemplo que, no corno dorsal, em regiões compatíveis com segmentos distantes dos

cortes de dissecção, e de áreas de possíveis lesões pós-dissecção, regiões pobres

62

Figura 18. Captação de corante através dos nervos periféricos. Quando os corantes são colocados sobre os nervos espinhais seccionados encontramos marcação celular tanto no corno ventral, quanto no corno dorsal. Em A, podemos observar o ponto de entrada principal dos corantes (seta verde). No entanto, somente utilizamos segmentos distais a este ponto de entrada, justamente para evitar as células marcadas através do corte/carregamento. Um segundo corte é realizado (linha pontilhada) para separar o local de entrada do corante dos segmentos mais distais. Alguns pontos apresentam lesões teciduais (seta vermelha) provocadas posteriormente a dissecção, desta forma servindo como fonte de entrada secundária para os corantes. Em B e C, cortes longitudinais de medula espinhal ao nível do corno dorsal e ventral, respectivamente. Note a diferença de marcação entre os dois lados da medula espinhal. No lado em que ocorreu lesão tecidual houve entrada do corante deixando um rastro rostro-caudal (seta branca). Em D e E, maior aumento de área central da figura B e C, demonstrando células marcadas com LY através de marcação por nervo espinhal. Barra de calibração, Em B e D, 100 µm. Em C e E, 20 µm.

63

Figura 19. Imagens de microscópio confocal demonstrando o a distribuição do acoplamento celular após entrada do corante pelo nervo espinhal em animais P4. Note que a passagem de corantes é restrita a algumas poucas células no corno dorsal. Estas encontram-se nas regiões correspondentes a lamina I e II de Rexed e profundamente na camada IV. Em A, localização dos grupos celulares acoplados na medula espinhal. Um grupo de células acopladas nas laminas I e II (A1) e grupo de células na camada IV (A2). Em C e D, podemos notar as células da camada I e II e seus respectivos acoplamentos (setas). Em E e F, grupo de células acopladas na camada IV da medula espinhal (setas). Barra de calibração,em B 100µm. Nas demais figuras 50 µm.

64

ou totalmente desprovidas de células marcadas foram identificadas. São

encontradas mais uma vez, pequenas células acopladas nas lâminas I (Fig. 19 C, D)

e algumas poucas na lâmina IV (Fig. 19 E, F). Estas células podem ter recebido os

corantes através de contatos com nervos periféricos, conforme descrito por Bacskai

e Matesz (2002) em sapos.

4.6 – O acoplamento celular e a expressão de conexi na 43 aumentam após

lesão periférica do nervo ciático em ratos neonatos :

Para verificarmos se o padrão de acoplamento encontrado na medula

espinhal neonatal é dinâmico e participa das respostas fisiológicas da medula

decidimos utilizar um modelo de lesão periférica, cujo algumas respostas centrais

são conhecidas. Dentre estas, o aumento da expressão de conexina 43 no corno

dorsal ipsilateral a lesão, e da proteína acídica glial (GFAP), indicando uma resposta

glial a esta manipulação (Li e Nagy, 2000). Para tanto, animais em P4 tiveram um

dos seus nervos ciáticos cortado, ao nível da fossa poplítea, em seguida

permaneceram vivos por 30-45 minutos antes do procedimento de “transection

loading” (Fig. 20).

Os níveis de acoplamento celular foram quantificados apenas nas primeiras 3

laminas do corno dorsal. Foram comparados os lados ipsi- e contralaterais à lesão

unilateral do ciático. Além disto, 2 animais não-operados foram usados para

controlar as possíveis assimetrias bilaterais detectadas pelo método na ausência de

lesão. Para a quantificação, estabelecemos razões de acoplamento, (nos dois

cornos posteriores da medula para cada animal; 3 experimentos independentes na

condição lesão e 2 na condição não-operado) definidas como o número de células

LY+RD-marcadas (LY+RD-) dividido pelo número de células duplo-marcadas

65

Figura 20 . Expressão de conexina 43 após lesão do nervo ciático. Em A, segmento medular correspondente ao nervo ciático. Podemos notar o aumento da expressão de Cx43 no lado ipsilateral a lesão do nervo. Em B, epêndima. Note a grande expressão de Cx43 tanto na luz ventricular quanto na junção com a zona ventricular. Em C, maior aumento do corno ventral contralateral a lesão, demonstrando menor marcação para Cx43, os motoneurônios foram identificados e apresentam grande marcação para Cx43. Em D, corno ventral ipsilateral a lesão. A maior expressão de Cx43, motoneurônios é notável (seta). Note a ausência de marcação nos nucléolos. Em E, corno dorsal contralateral a lesão. Note a pouca marcação para Cx43 em comparação com F, que representa o corno dorsal ipsilateral a lesão. Barra de calibração em B-F = 20 µm.

66

(LY+RD+). Dada a previsível variabilidade experimental entre animais, expressa em

nosso modelo como a fração de células diretamente carregadas quando do corte de

carregamento, variabilidade que leva a valores de desvios-padrão elevados nas

comparações unilaterais entre as razões de acoplamento, e sendo razoável assumir

a hemi-medula contralateral à lesão como um dos controles experimentais internos,

optamos por gerar razões das assimetrias entre medidas ipsi- e contralateral (ou à

direita e à esquerda) para cada um dos dois grupos de animais experimentais, lesão

e controle. Na figura 21 podemos ver a distribuição das células marcadas em ambas

condições com e sem lesão unilateral do ciático. O gráfico de barras da figura 21

resume estes resultados, revelando o aumento dos níveis de acoplamento juncional

na condição lesão, expresso como razões ipsi-/contra- elevadas, isto é de 1,63 ou

63% de assimetria nas medidas, relativamente ao índice de 1,19 ou 19%, registrado

no controle.

Desta forma, podemos comprovar pela primeira vez que o aumento agudo de

conexina 43 provocado por lesão periférica é acompanhado por aumento do

acoplamento celular.

4.7 – O acoplamento celular é modificado na presenç a de ácido flufenâmico:

O ácido flufenâmico faz parte de uma nova classe de bloqueadores de

junções comunicantes - os fenamatos, e tem sido usado experimentalmente com

êxito para o bloqueio destas junções in vivo e in vitro (Salameh et al., 2005; Harks et

al., 2001). Para revelar o efeito do AFF adicionamos a droga para a concentração

final de 100µM, a todas as soluções utilizados na realização do TL. Nossos

resultados, apresentados nas imagens fotomicrográficas da Figura 22 A, D, e de

67

Médias das assimetrias entre corno dorsal ipsilateral e contralateral à lesão

0

0,5

1

1,5

2

Controle Lesão

(1,19)

(1,63 ± 0,42)

Figura 21 . O acoplamento celular na medula espinhal após lesão do nervo ciático. Desenhos esquemáticos da distribuição das células acopladas na medula espinhal em ratos P4. Em A e C, representação dos lados lesados. Em B e D, representação dos lados contralaterais à lesão. Em E, F, G e H, representação dos experimentos controles. Em I, gráfico demonstrando as razões de acoplamento entre os animais com lesões e os controles.

I

68

forma diagramática na figura 22 G, H, demonstraram que o carregamento direto

ocorreu sem alterações detectáveis em número de perfis celulares ou de sua

distribuição histológica. De fato, conforme esperado, várias células diretamente

carregadas foram encontradas a longas distâncias do corte de carregamento (dados

não mostrados). O padrão de distribuição histológica dos perfis de acoplamento

celular se manteve em relação aos demais experimentos. Note-se que, à

semelhança do método de quantificação ilustrado pela Figura 20, também aqui

procedemos á contagem de células LY+RD+ e LY+RD- (Fig. 22 G, H), por sua vez

mapeadas a partir das imagens digitais (Fig. 22 A-D) da medula em 3 animais, 1

corte de cada. Um pequeno número de células LY+RD- foi registrado tanto no corno

dorsal (Fig. 22 F - H) quanto no corno ventral da medula tratada com AFF.

A quantificação da média da relação de células LY+RD+/LY+RD- nas lâminas

superficiais do corno dorsal da medula espinhal dos animais que receberam AFF foi

de 38,88 ± 6,61, em comparação ao controle que foi de 11,85 ± 1,88. Para excluir

efeitos dos diluentes do AFF no bloqueio da comunicação juncional, utilizamos um

animal que teve sua medula imersa na solução diluente do AFF (DMSO + Etanol), e

este não demonstrou diferença do percentual de acoplamento em relação aos

animais controles. Com isto, reforçamos, em bases agora farmacológicas, nossas

conclusões favoráveis à intermediação de junções comunicantes na transferência do

permeante juncional LY entre células da medula espinhal do rato neonato.

69

Figura 22. Bloqueio do acoplamento entre células da medula espinhal com ácido flufenâmico (100 µM). Em A e C, Fotomicrografia do corno dorsal de ratos P4 após TL com AFF. Em B e D, TL sem AFF. Em E, Fotomicrografica da medula espinhal com DAPI. Em F, Média das razões LY+RD+/LY+RD-. Em G e H, esquema representativo da quantificação de células acopladas. Barra de calibração em todas as figuras 20 µm, exceto em E = 100 µm.

Média das razões LY+RD-/LY+RD+ LY

8,39±1,52

2,33±0,57

Controle (3)

AFF (3)

70

4.8 – A técnica de carregamento por transecção reve la acoplamento celular na

medula espinhal de ratos adultos:

No início da década, Rash e colaboradores (2000; 2001) identificaram a

presença de proteínas de junções comunicantes (conexinas) distribuídas na medula

espinhal, em células gliais e neuronais. Mesmo assim, a funcionalidade das placas

juncionais formadas na medula espinhal adulta somente foi demonstrada no corno

ventral, tendo-se revelado entre motoneurônios, após lesões periféricas (Chang e

Balice-Gordon 2000). Desta forma, resolvemos investigar a existência de

acoplamento celular na medula espinhal adulta, principalmente no corno dorsal, com

a mesma metodologia utilizada em neonatos.

Ratos adultos, machos e fêmeas, sofreram laminectomia para exposição da

medula espinhal e em seguida o segmento lombar foi rapidamente retirado e

mergulhado nas soluções do procedimento.

Apesar do grande número de células carregadas (Fig. 23) com ambos os

corantes (LY+RD+), perfis celulares acoplados no corno ventral foram registrados

raramente. Acreditamos que esta escassez possa dever-se à entrada de corantes

através do nervo espinhal, carregando diretamente a maioria dos motoneurônios e

eliminando-os do compto das contagens de carregamento por acoplamento

juncional.

Em estudo pioneiro no corno dorsal da medula espinhal adulta (Fig. 23),

várias células foram identificadas como acopladas (LY+RD-). Estas células

encontravam-se distribuídas principalmente nas lâminas I e II de Rexed e

apresentavam corpos celulares pequenos e arredondados, semelhantes aos

encontrados no período neonatal. Algumas células com características morfológicas

71

Figura 23. Acoplamento celular no corno dorsal da medula espinhal de ratos adultos. O acoplamento celular foi identificado no corno dorsal da medula espinhal através do “transection loading”. Em A, marcação com LY no corno dorsal, note as setas marcando algumas células acopladas próximas a superfície pial, provável camada I e II. Em B, RD, as setas demonstram a ausência de marcação com o corante. C, dupla marcação RD/LY, o retângulo pontilhado representa a área aumentada em D e E. Em D e E, maior aumento de A e B, note as células acopladas (setas). Barra de calibração, 20 µm, exceto em D e E = 10 µm.

72

peculiares, localizadas mais profundamente na medula espinhal, dotadas de corpos

maiores e, algumas vezes, piramidais, não se apresentaram como células

acopladas, mas duplo-marcadas (LY+RD+).

4.9 – O acoplamento celular na medula espinhal de r atos adultos em resposta a

lesão periférica:

Para investigar o acoplamento celular, após lesão, através de passagem de

corantes no corno dorsal da medula espinhal, utilizamos a técnica de “transection

loading” após lesão prévia do nervo ciático de forma semelhante ao realizado para o

neonato. Encontramos um aumento do acoplamento celular após lesão prévia de

nervo ciático (Fig. 24) no corno dorsal.

No corno dorsal contralateral à lesão do nervo ciático encontramos um total

de 302 células duplomarcadas (LY+RD+) e somente 48 células (LY+RD-),

totalizando 13,71% de acoplamento celular. Em comparação, no corno dorsal

ipsilateral encontramos 289 células duplomarcadas (LY+RD+) e 70 células (LY+RD-

). Em um segundo experimento encontramos 265 células duplomarcadas (LY+RD+)

e 58 células (LY+RD-), totalizando 17,95% de acoplamento celular.

Após lesões de nervos periféricos ocorre o aumento da reatividade glial e

conseqüente formação de uma cicatriz glial central. Esta cicatriz pode ser

identificada através dos níveis elevados de GFAP em astrócitos reativos em regiões

que guardem correspondência histo-fisiológica com o sítio da lesão. Para

verificarmos se o aumento do acoplamento celular poderia estar relacionado à

formação da cicatriz glial, alguns animais foram submetidos à transecção do nervo

ciático e a expressão de GFAP foi identificada 7 dias pós-lesão.

73

Figura 24. A lesão do nervo ciático aumenta o acoplamento celular no corno dorsal ipsilateral após 7 dias. Fotomicrografias do corno dorsal. Em A, C e E, corno dorsal contralateral à lesão do nervo ciático. Encontramos um total de 13,71% de células acopladas. Em B, D, F e G, corno dorsal ipsilateral à lesão. As cabeças de setas indicam células acopladas. Em F e G, maior aumento de B, Note as células RD-/LY+ (setas). Encontramos 17,95% de células acopladas. Barra de calibração: 20 µm, exceto em F e G = 10 µm.

74

O corno dorsal ipsilateral à lesão do nervo ciático apresentou aumento

substancial da expressão de GFAP. Os astrócitos foram identificados facilmente por

sua morfologia. Podemos observar que a reatividade glial é aumentada nas

proximidades das lâminas I e II (Fig. 24, E, F).

4.10 – Bloqueio do acoplamento celular com carbenox olone abole o

acoplamento entre as células da medula espinhal:

Para demonstrar a dependência de junções comunicantes para a passagem

intercelular de LY, utilizamos um conhecido bloqueador de junções comunicantes

denominado carbenoxolone (CBX). O carbenoxolone foi injetado no espaço

subaracnóide na concentração de 100 µM, após prévia sedação dos animais. Após

30 minutos da injeção de tratamento com CBX, foi realizado o “transection loading”.

A entrada dos corantes não foi afetada pelo CBX e podemos encontrar células

LY+RD+ em diferentes distâncias do corte de carregamento. Tanto no corno dorsal

como no corno ventral, células LY+RD-, eram raras ou ausentes. Esses resultados

demonstraram que a passagem de corantes afirma-se como um processo mediado

por junções comunicantes (Fig. 25).

75

Figura 25. Carbenoxolone bloqueia o acoplamento celular na medula espinhal adulta. Em A e B, corno dorsal. Podemos perceber claramente o local de entrada do corante e o espalhamento para dentro da medula. Em, C e D, corno ventral. Note a coluna de motoneurônios (cabeça de seta). Em E e F, corno dorsal com bloqueio de carbenoxolene no espaço subdural. Em G e H, corno ventral com bloqueio de carbenoxolone no espaço subdural. Em I e J, maior aumento de A e B, para demonstração de algumas células acopladas no corno dorsal da medula espinhal do rato adulto. Note nas setas algumas células acopladas. Em K e L, maior aumento das figuras C e D. Note algumas células acopladas (setas). Em M e N, maior aumento das figuras E e F. Poucas células foram encontradas acopladas. Em O e P, maior aumento de G e H, Note também a ausência de acoplamento celular no corno ventral. Barra de calibração, A – H, 20 µm. I – P, 10 µm.

76

5 – DISCUSSÃO

No presente trabalho, demonstramos pela primeira vez a existência de

comunicação juncional no corno posterior da medula neonatal e do adulto. Para

tanto empregamos um método de estudo desta comunicação, por transferência

intercelular de corantes fluoróforos permeantes, desenvolvido anteriormente pelo

nosso laboratório, e que permite a visualização de grandes populações celulares

acopladas no SNC in situ. Também encontramos evidências pioneiras de que o

aumento rápido da expressão de Cx43 após lesão em nervo periférico no animal

neonatal é acompanhado de um aumento do acoplamento. De forma intrigante, o

mesmo não foi encontrado no adulto para respostas agudas. No entanto, resultados

preliminares sugerem que o adulto responderia com um aumento tardio na

incidência de acoplamento, paralelamente à sugestão de elevação dos níveis de

expressão da Cx43, no sétimo dia após lesão do nervo periférico. Finalmente, com a

aplicação desta técnica revelamos no animal neonatal, que o acoplamento juncional

não é limitado aos motoneurônios e que diversos tipos neuronais participam desta

modalidade de interação celular. Dado que a primeira semana pós-natal é crucial no

estabelecimento da circuitaria sináptica medular, acreditamos que as junções

comunicantes possam participar deste processo, conforme demonstrado para os

motoneurônios (Chang et al., 1999).

5.1 – O carregamento celular por transecção é uma f orma eficiente de

demonstrar o acoplamento celular na medula espinhal de animais neonatos e

adultos:

77

A técnica de “transection loading” – carregamento por transecção – foi

desenvolvida em nosso laboratório para detecção rápida do acoplamento celular

mediado por junções comunicantes funcionais in vivo/in situ. Esta metodologia foi

adotada inicialmente para visualização de redes acopladas em regiões telencefálicas

de animais neonatais, como o córtex cerebral e a zona subventricular anterior

(Menezes et al., 2000). Neste estudo, demonstramos, através de manipulações

farmacológicas, que o acoplamento celular revelado por corantes era mediado por

junções comunicantes (Menezes et al., 2000). Além disso, observações a partir

desta técnica em várias estruturas do SNC em desenvolvimento mostraram um

padrão semelhante ao do acoplamento juncional descrito por métodos

convencionais: 1. No córtex cerebral embrionário (Barbosa, L.; Tese de mestrado,

2007) encontramos células acopladas na zona ventricular, subplaca e placa cortical

(LoTurco e Kriegstein, 1991; Bittman et al., 1997); 2. No cerebelo pós-natal

(Resultados não publicados, Correia, A.; tese de Mestrado, 2002) encontramos

acoplamento na camada granular interna, e de células de Purkinje, mas não na

camada germinativa granular externa (Pakhotin e Verkhratsky, 2005; Meller et al.,

2005; Rácz et al., 2006); 3. Encontramos acoplamento celular na pia-máter

(Menezes et al., 2000; e dados não mostrados) em todas as idades estudadas

(Mercier e Hatton, 2001; Dermietzel e Spray, 1993); 4. No córtex cerebral pós-natal

(Menezes et al., 2000) em neurônios das camadas II-VI (Peinado et al., 1993); 5. No

bulbo olfatório (Menezes et al., 2000; e resultados não mostrados) na camada

granular interna e nas células mitrais (Reyher et al., 1991); 6. Na retina (Silva, M.,

2003; tese de Mestrado) nas camadas de células ganglionares, na nuclear interna e

entre células horizontais (Cusato et al., 2000).

78

A captação do corante acontece sempre próximo à superfície de

carregamento direto, onde encontram-se as células rompidas pelo corte de

carregamento. No entanto, é difícil identificar acoplamento celular nesta região,

devido à freqüência elevada de marcação das células pelos dois corantes. À medida

que nos afastamos da superfície de corte-carregamento, um menor número de

células LY+RD+ é detectado, e a chance de encontramos células carregadas

somente com LY aumenta relativamente às duplo-marcadas locais. Isso se deve ao

fato de que as células cortadas diretamente na superfície corte-carregamento já não

representam a maioria, mas aquelas poucas com axônios ou prolongamentos mais

extensos, carregadas pelos dois corantes. A relativamente grandes distâncias da

superfície de corte-carregamento, portanto, crescem as chances de detecção do

acoplamento celular.

Uma premissa importante para a validade do método é que as células

LY+RD- representem apenas acoplamento celular, i.e., a ocorrência de “falso-

positivos” para acoplamento devem ser raras ou inexistentes. Falsos positivos para

acoplamento poderiam ocorrer de duas formas: 1. Devido a velocidades de difusão

diferente para os corantes empregados; neste caso, células poderiam apresentar-se

monomarcadas por LY como conseqüência de taxas de difusão presumivelmente

lentas para a RD; 2. Captação seletiva do corante LY através de poros

intramembranares, como hemicanais de conexinas ou poros associados à ativação

de receptores purinérgicos P2X7, que excluem moléculas maiores como a RD. Como

descrito abaixo acreditamos que estes eventos são raros ou negligenciáveis.

Devido a diferenças na massa molecular e na natureza química dos corantes,

seria de se esperar taxas distintas de difusão intracitoplasmática. Acreditamos que a

diferença de massa molecular não influencie de forma detectável os resultados de

79

incidência de acoplamento em nossas preparações, pelas seguintes razões: 1. A

propagação da RD dextran independe de transporte ativo, desenvolvendo-se por

processo difusional simples a favor de gradiente de concentração, portanto, passivo,

a exemplo do que ocorre com o seu par permeante, Lucifer yellow (Fritzsch, 1993);

2. Uma comparação direta em axônios de Xenopus demonstrou a rapidez da difusão

do conjugado de Dextran 3kDa, equivalente a registradas para compostos pequenos

como sulforodamina 101 (606MW) e Biocitina (372,5MW), empregada esta última

como permeante juncional. Como estes experimentos foram realizados em

preparações de Xenopus, admitimos como possíveis as limitações em sua

extrapolação direta para modelos animais de sangue quente. A geometria peculiar

da medula espinhal e a disposição majoritariamente longitudinal dos prolongamentos

celulares oferece uma oportunidade para a verificação de taxas de difusão

determinadas experimentalmente em nossas preparações. Em experimentos

desenvolvidos para outros fins, realizamos o procedimento de TL, com um único

corte de carregamento em segmentos longos, maiores que 3mm, da medula

espinhal, de forma que os corantes tivessem uma única porta de entrada

(excetuando as entradas adicionais possíveis pelos nervos periféricos). Com este

cuidado foi possível comparar as difusões dos corantes em trânsito

predominantemente unidirecional, tendo como referência um só plano de partida.

Para nossa surpresa, encontramos transporte para o conjugado de rodamina

dextran a distâncias superiores a 1mm, gerando medidas de taxa de difusão de

aproximadamente 10mm por hora. No entanto, nestas distâncias, a rodamina

dextran tem uma intensidade de fluorescência sensivelmente mais baixa, tornando-

se as células assim marcadas de difícil detecção. Não medimos quantitativamente

este decaimento, mas subjetivamente, esta diferença fica mais visível a partir dos

80

700 micrometros da superfície de corte. Para evitar variações do número de total de

células carregadas diretamente, e também evitar as advindas de uma possível

dificuldade de interpretação, devido a baixa intensidade do corante, limitamos a

análise quantitativa a uma região entre 60 µm -300 µm de distância da superfície de

corte-carregamento.

É possível, embora pouco provável, que parte das células que apresentaram

acoplamento revelado por corantes tenha sido marcada através da captação de LY

por poros formados por receptores purinérgicos P2X7 (Surprenant et al., 1996; Illes e

Ribeiro, 2004). Apesar de não podermos excluir a participação destes receptores na

incorporação e difusão de LY na nossa preparação, por falta de ensaios

farmacológicos, algumas características de nosso modelo e marcação obtida

reduzem esta possibilidade: 1. As altas concentrações do ligante (ATP) necessárias

para abertura destes poros (Virginio et al., 1999a; 1999b) são pouco prováveis de

serem alcançadas na nossa preparação, em que utilizamos um meio pobre em ATP;

2. Apesar de alguns autores defenderem tempos mais curtos para a abertura destes

poros na presença de elevadas concentrações de ATP (Virginio et al., 1999a;

1999b), tempos prolongados, da ordem de 10 ou mais minutos têm sido relatados

para o registro de níveis detectáveis de captação direta de permeantes, portanto,

freqüentemente maiores que o breve tempo de exposição aos corantes (1-3 minutos)

utilizado em nosso método; 3. Se houvesse a participação destes poros,

esperaríamos a formação de grumos de células LY+RD-, uniformemente distribuídos

pelo tecido, não obedecendo o claro gradiente de difusão iniciado a partir do corte

de carregamento observado em nossos experimentos. Este último argumento

justifica nosso também descrédito no envolvimento de hemicanais de conexinas

(Contreras et al., 2004)

81

Por fim, apesar de ainda não confirmadas em sistemas endógenos quanto à

sua capacidade de formação de canais intercelulares completos e funcionais, não

descartamos completamente a possibilidade de que parte do acoplamento celular

observado em nossas preparações deva-se a uma classe recém descrita de

proteínas juncionais, as panexinas. Somando-se à ausência de demonstração de

sua capacidade in situ de formar canais juncionais intercelulares completos, a

conhecida resistência dos hemicanais de panexina ao ácido flufenâmico,

desacoplante de segunda geração, pertencente à classe de aril-amino-benzoatos

(Srinivas e Spray 2003), quando nossos resultados sugerem inibição acima de 50%

na incidência de acoplamento na medula em resposta ao tratamento com esta

droga, vemos enfraquecer-se a possibilidade de contribuição de hemicanais ou

canais intercelulares formados por panexinas ao nosso modelo.

O acoplamento celular encontrado em regiões muito distantes do corte-

carregamento poderia ser explicado por entrada através de nervos espinhais que

também são expostos aos corantes durante o procedimento de carregamento por

transecção. No entanto, em nossos experimentos, onde a entrada de corante foi

limitada aos nervos espinhais seccionados (ver materiais métodos), não

encontramos grande número de células carregadas (em alguns casos apenas o LY

foi usado), somente grupos de motoneurônios e algumas poucas células no corno

dorsal. Se algum acoplamento advêm da entrada de corantes pelo nervo, este não

diminui a importância deste estudo e sim aumenta sua significância, pois identifica

precisamente as células que receberam o corante: neste caso, no corno ventral,

somente motoneurônios poderiam ser marcados. A presença de LY em

interneurônios ou célula gliais indicaria a presença de acoplamento heterocelular na

medula espinhal neonatal, com origem em axônios sensoriais ou por intermédio de

82

motoneurônios como possíveis fontes doadoras. Um fato curioso é a presença de

células marcadas no corno dorsal após entrada de corante pelo nervo periférico.

Este resultado sugere a possibilidade de passagem de corante através de junções

comunicantes entre células do gânglio da raiz dorsal e interneurônios do corno

dorsal, como sugerido por Bácskai e Matesz em 2002. Mas como não pudemos

excluir a marcação direta destes interneurônios através de longos axônios

longitudinais, esta hipótese ainda precisa ser sistematicamente investigada em

nossas preparações.

Não podemos excluir também a possibilidade de marcação em células do

corno dorsal feitas por lesão indesejada da medula espinhal durante o procedimento

de TL. No entanto, todos os cuidados foram tomados para evitar estas lesões e

quando ocorriam eram facilmente distinguíveis das demais regiões por deixarem

uma borda com marcação muito forte, visível na região de lesão.

Embora ainda necessitemos de uma demonstração mais formal, os

experimentos de inibição de junções comunicantes com fármacos ou pela presença

de altas concentrações de cálcio durante o procedimento de corte/carregamento

defendem a natureza juncional do carregamento de LY em perfis de células

monomarcadas. No animal neonato (P4) empregamos o ácido flufenâmico nas

soluções utilizadas para o procedimento de TL, incluindo a solução de corantes.

Nestes experimentos, encontramos uma redução importante do acoplamento (>50%)

embora não completa. Este bloqueio parcial pode ser devido a dois possíveis

fatores. Um primeiro relativo ao tempo necessário para o efeito do fármaco, já que a

medula era mergulhada nas soluções contendo o bloqueador apenas dois minutos

antes da exposição aos corantes, talvez tempo insuficiente para uma inibição

completa destes canais. A outra possibilidade é a diferença de sensibilidade de

83

certas conexinas ao bloqueador farmacológico (Srinivas e Spray 2003, Bruzzone et

al. 2005). Nos poucos experimentos bem sucedidos de bloqueio realizados no

animal adulto com carbenoxolone, outro conhecido agente desacoplante, hidrofílico,

derivado de ácido glicirretínico, a redução do acoplamento foi mais significativa, fato

que se deve não somente à natureza química do desacoplante, mas provavelmente

também à injeção da droga no espaço subaracnóide 30 minutos antes da retirada da

medula e do procedimento de TL.

5.2 – O acoplamento celular é distribuído por todas as lâminas da medula

espinhal de ratos neonatos:

Em nosso trabalho demonstramos que o acoplamento celular é distribuído por

toda a medula espinhal em P4. Trabalhos anteriores limitaram-se a sugerir o

acoplamento entre células da medula espinhal através da expressão de conexinas

(Lee et al., 2005; Chang et al., 1999), ou por evidências funcionais de acoplamento

por corante e registros eletrofisiológicos restritos aos motoneurônios (Pastor et al.,

2003; Mentis et al., 2002; Chang et al., 1999).

Com exceção de Asghar e colaboradores (2005), que sugerem a participação

de junções comunicantes na geração de ritmos entre interneurônios do corno dorsal

durante o período pós-natal, não encontramos na literatura outras fontes que

apontem para a presença de acoplamento entre células do corno dorsal da medula

espinhal durante o período pós-natal precoce.

O acoplamento celular no corno dorsal da medula espinhal é de difícil

identificação provavelmente devido à pequenas dimensões da maioria das células

nesta região e à dificuldade técnica de acesso às mesmas, seja através de registros

84

eletrofisiológicos ou mediante injeção intracelular de permeantes juncionais. Nossa

técnica permite a identificação de passagem de corantes entre células de pequeno

tamanho, desde que estas tenham prolongamentos que se estendam por alguns

milímetros rostro- ou caudalmente. Na idade pós-natal muitas células do corno

dorsal, em especial da lâmina I, III e IV têm seus longos axônios em direção a

regiões de tronco encefálico, formando as vias espino-talâmicas, espino-reticulares e

espino-tectais sendo assim, seus axônios atravessam vários segmentos de medula

espinhal para alcançar seus alvos (Jankowska, 2001). Além disto, diversos tipos de

interneurônios também já estão presentes nesta idade, alguns com uma disposição

longitudinal, com axônios conectando diversos segmentos, e dentre estes, axônios

comissurais (Eide et al., 1999). O corte-carregamento realizado em nossa

abordagem metodológica é, portanto, capaz de marcar todas estas células e

permitindo sua identificação no corno dorsal e revelando, em alguns casos, o

acoplamento. Coincidentemente, é nas lâminas I, III e IV, ricas em interneurônios de

projeção, que encontramos os maiores números de células carregadas diretamente,

aumentando assim a probabilidade de encontrarmos possíveis parceiras acopladas.

Interneurônios comissurais e de projeção também são encontrados em outras

lâminas da medula espinhal, como as lâminas VII e VIII. Na lâmina IX, os

motoneurônios fazem estabelecem conexão com outros em segmentos rostrais e

caudais e podem também receber corantes através de secções de corte

carregamento. Através desta marcação difusa de células na medula espinhal,

revelando indistintamente células de tamanhos e morfologias diversas, podemos

concluir que não existe seletividade celular no carregamento direto dos fluorocromos

na medula espinhal transectada.

85

Como dito acima, a distâncias progressivamente maiores da superfície de

corte/carregamento, as chances de identificar células acopladas aumentaria, pois

menos células são carregadas diretamente, apenas aquelas que têm

prolongamentos maiores em direção ao corte, diminuindo o mascaramento do

acoplamento, pela marcação direta dos parceiros potencialmente acoplados. No

entanto, não se observa um aumento na proporção com a distância. A proporção de

acoplamento, razão entre células acopladas, LY+RD-, e células LY+RD+

(carregadas diretamente) mantém-se estável dentro do segmento de 300

micrometros estudado. Isto sugere que o quadro geral de acoplamento celular

revelado a curtas distâncias poderia esconder inúmeras pequenas redes de

acoplamento. Neste sentido, as placas juncionais diminutas, descritas para a medula

espinhal (Rash et al., 2000), constituem-se em substratos que poderiam explicar a

prevalência de pequenos grupos de acoplamento juncional. Uma das possibilidades

é de que as pequenas placas ofereçam maior resistência ao corante permeante LY.

Alternativamente estes pequenos grupos de acoplamento poderiam refletir

propriedades de junções estabelecidas mais especificamente por neurônios de longo

axônio, intersegmentares, distinguíveis a longas distâncias como possíveis fontes do

permeante juncional.

5.3 – Tipos celulares marcados com Lucifer yellow n a medula espinhal e

possíveis parceiros acoplados:

Alguns tipos celulares são facilmente identificáveis na medula espinhal, seja

por sua morfologia ou por sua distribuição espacial. Motoneurônios apresentam

corpo celular grande e são localizados na lâmina IX (medial e lateral) das

86

intumescências. As camadas superficiais do corno dorsal, I, II e III encontram-se

dorsalmente com uma densidade celular aumentada. Nas lâminas III e IV

encontramos células com corpos neuronais grandes.

Além da identificação morfológica e topográfica das células da medula

espinhal (nem sempre bem definidas) podem ser usados também anticorpos contra

proteínas específicas de células da medula espinhal. Por exemplo, Islet 1, para

motoneurônios, neurokinina 1 (Polgar et al. 2007), para neurônios de projeção

sensorial, e calbindina para células de Renshaw (Mentis et al., 2006). Mesmo com

todo o arsenal referencial para identificação das células acopladas, na prática isso é

tecnicamente difícil, em nossa preparação, pois exigiria a análise simultânea de

quatro cromógenos espectralmente bem separados entre si. Embora, possível com

os novos equipamentos de microscopia atualmente disponíveis, preferimos evitar as

dificuldades de interpretação previsíveis.

Em nossos experimentos utilizamos uma análise indireta, que apesar de

limitada nos permitiu chegar a algumas conclusões importantes. Por exemplo,

podemos concluir que o acoplamento identificado na medula deve ser

majoritariamente homocelular e limitado a neurônios. Esta conclusão é baseada na

observação de que a grande maioria das células marcadas com LY são positivas

para a isotipo, neurônio especifico, classe III da beta tubulina. De fato, em raros

casos identificamos dupla marcação de LY com GFAP. Coerentemente, poucas

células GFAP positivas encontravam-se perto da área de corte ou da periferia da

medula na substancia branca, onde a marcação tanto do LY como do GFAP eram

maiores. Devido a dificuldade de identificar as células pequenas na substância

branca, não realizamos investigação sistemática desta região. Uma segunda

conclusão importante é que o acoplamento deve envolver interneurônios de tipos

87

variados na medula. Esta expectativa se baseia não somente na localização das

células LY+RD-, como também no fato de que uma grande parte das células

marcadas com LY expressa calbidina e parvabulmina. Estes achados abrem uma

perspectiva futura de confirmar os parceiros específicos envolvidos no acoplamento

encontrado na medula e testar seu envolvimento no processo de refinamento da

circuitaria do corno dorsal. Por fim, em alguns poucos casos encontramos evidências

de acoplamento heterocelular, envolvendo sub-tipos neuronais, que, de forma

surpreendente, tinham motoneurônios como prováveis parceiros. Esta conclusão

repousa no achado de células de Renshaw, identificadas pela expressão de

calbindina, marcadas com LY. Como estas células não têm projeção intersegmentar

dificilmente poderiam ser carregadas diretamente pelo corte de carregamento,

situado a longa distância destas células em nossas observações. Um provável

doador de LY para estes interneurônios pela sua proximidade espacial, é o

motoneurônio, que é passível de ser carregado diretamente pelo corte de

carregamento ou pelo nervo periférico. A falha na detecção desta parceria em

experimentos anteriores de injeção intracelular de LY em motoneurônios (Chang et

al., 1999) sugere este pareamento como um evento raro. Dado que em nosso

modelo várias células são carregadas simultaneamente, isto aumenta as chances de

detecção de acoplamentos deste tipo. As raras células GFAP+LY+, longe da

superfície de carregamento, também são uma sugestão de possível acoplamento

heterocelular, já que a grandes distâncias dificilmente a fonte doadora de LY poderia

ser outra célula de glia.

5.4 – A lesão ao nervo ciático aumenta o acoplament o celular mediado por

junções comunicantes na medula espinhal de ratos ne onatos:

88

Em nosso trabalho demonstramos que as lesões de nervos periféricos

provocam alterações centrais muito rápidas, detectáveis num período de 45 minutos

aproximadamente. Estas alterações compreendem ao aumento da expressão de

conexina 43, já descrito previamente (Rohlmann et al., 1993; Chang et al., 1999; Li e

Nagy, 2000) e aumento do acoplamento celular em motoneurônios (Chang et al.,

2000). No entanto, todos os trabalhos citados anteriormente são realizados em

animais adultos. A resposta da expressão de conexina e aumento do acoplamento

no neonato, ainda não está totalmente elucidada. A maior expressão de Cx43

sugere uma resposta glial aumentada imediatamente após a lesão periférica; esta

resposta pode durar vários dias após a lesão e ser responsável pela manutenção de

uma microambiência adequada à sobrevivência neuronal após a lesão. No corno

ventral do adulto o acoplamento celular aumenta entre motoneurônios (Chang et al.,

2000). Este acoplamento está associado a um novo período de crescimento axonal

provocado após a lesão. É possível especular que também no corno dorsal, a

deaferentação funcional de interneurônios das lâminas superficiais pode conduzi-los

a um estágio similar ao desenvolvimento em termos de comunicação juncional.

Existem sugestões de que as junções comunicantes sejam responsáveis por

propagação de sinais de morte celular (Frantseva et al., 2002). Estudos anteriores

mostram que a morte neuronal encontrada no corno dorsal após lesão periférica

limita-se às lâminas IV a VI (Oliveira et al., 1997), não quantificadas no escopo desta

tese. Portanto, não acreditamos que nossos dados, extraídos por quantificação

sobre as lâminas I a III, possam ser explicados por captação inespecífica dos

fluorocromos a partir de células em processo de morte.

89

5.5 – Junções comunicantes em ratos adultos:

Junções comunicantes entre neurônios são encontradas abundantemente

durante o desenvolvimento (Bittman et al., 2004). Por muito tempo acreditou-se que,

em adultos o acoplamento celular restringia-se a algumas regiões sub-corticais como

oliva inferior, retina, núcleo supraquiasmático, núcleo coclear e núcleo trigeminal

(Sotelo et al., 1976; Bourrat e Sotelo., 1983; Liem et al., 1991; Van den Pol e Dudek,

1993). Este conceito vem sendo gradualmente abandonado, frente a novos achados

de redes neuronais funcionais mediadas principalmente por Cx36 no telencéfalo de

roedores (Hormuzdi et al., 2001; Deans et al., 2001; Connors e Long, 2004; Zhang et

al., 2006). A aceitação da presença mais generalizada de conexinas em neurônios

do adulto se deveu principalmente ao estudo da expressão destas conexinas por

imuno-histoquímica (Rash et al., 2000, 2001) e com o emprego de animais

transgênicos (Deans et al., 2001). Uma das dificuldades de trabalhos anteriores em

encontrar junções comunicantes em adultos, refere-se à metodologia empregada

para o estudo anteriormente; microscopia eletrônica, que produz muitos cortes de

espessura pequena, diminuindo as chances de detecção de placas juncionais se

relativamente mais escassas no tecido (Rash et al., 1998).

Para o corno dorsal medular, mais especificamente, vemos como um

elemento significativamente limitador, o fato das células neste sítio possuírem soma

tipicamente diminutos, desencorajando a inspeção por injeção intracelular, ao passo

em que torna a investigação dos motoneurônios no corno ventral comparativamente

mais elegível (Chang et al., 2000). Em nosso estudo, o emprego da técnica de

carregamento por corante, permitiu-nos incluir facilmente o corno dorsal na definição

de possíveis redes de acoplamento na medula, incluindo suas lâminas superficiais.

90

O acoplamento celular no adulto pode ser útil para a modulação das sinapses

aferentes de dor, intermediadas por neurônios de segunda e terceira ordem do corno

dorsal. É conhecido que a indução de dor aumenta a expressão de Cx43 (Spataro et

al., 2004; Qin et., 2006; Ohara et al., 2008). Embora a hipótese mais comum seja de

que o aumento de expressão da Cx43 reflita um aumento no acoplamento de células

gliais, é possível que interneurônios também respondam por acoplamento em uma

pequena proporção. Como este acoplamento seria mediado por Cx36 (Rash et al.,

2000), podem ter sido ignorados durante os experimentos envolvendo indução

periférica de dor. Qin e colaboradores (2006) encontraram aumento rápido da

expressão de conexinas por indução de dor exatamente na mesma região que nós

encontramos, no corno dorsal em lâminas superficiais e em células de tamanho

similar. Apesar de nossa técnica não nos permitir identificar os tipos celulares

acoplados, nossos ensaios em neonatos para GFAP demonstraram raras células

marcadas nesta região. Além disto, as células acopladas reveladas por nosso

método encontram-se localizadas mais profundamente que a astrogliose detectada

após lesão, limitada principalmente à região de interface do nervo periférico com a

medula espinhal.

Não apenas em resposta a estímulos álgicos, respostas centrais também

podem ocorrer após lesões periféricas no adulto. A expressão das conexinas 36, 37,

40, 43 e 45 na medula espinhal adulta mostrou-se inalterada 1 – 4 semanas após

axotomia (Chang et al., 2000). No entanto, em lesões diretas na medula levam a um

aumento progressivo (atinge um pico 5-7 dias depois da lesão) na expressão de

Cx43 (Theriault et al., 1997). Como encontramos uma tendência para aumento do

acoplamento celular tardio no adulto, é possível que o aumento progressivo do

acoplamento seja uma resposta comum a lesão nesta idade, diferente da medula em

91

desenvolvimento. Em adição, foi demonstrado recentemente que a Cx43 participa

positivamente da resposta inflamatória após lesão traumática direta à medula

espinhal. Os mecanismos subjacentes a esta atividade ainda não foram elucidados,

nem tampouco se envolveria acoplamento celular funcional. No entanto, acreditamos

que investigar a distribuição do acoplamento celular e elucidar o repertório de células

envolvidas nestas interações representam passos fundamentais para a

compreensão dos processos abortivos da regeneração neural.

92

6 – CONCLUSÕES

1. A técnica de carregamento por transecção (“transection loading”) mostrou-se

eficiente para identificação do acoplamento celular na medula espinhal do rato em

desenvolvimento e do adulto.

2. Vários tipos celulares, principalmente neurônios com diferentes características

morfológicas, são encontrados em meio à população de células acopladas da

medula espinhal do rato em desenvolvimento.

3. As células acopladas no corno dorsal da medula espinhal durante o

desenvolvimento estão predominantemente localizadas nas lâminas I, III e IV.

4. Dos subtipos que comporiam a população de neurônios acoplados na medula do

neonato, a análise morfológica e a distribuição laminar sugerem a participação de

interneurônios sensoriais das lâminas I e II, e de interneurônios proprioespinhais e

comissurais.

5. A grande maioria dos pareamentos celulares por acoplamento juncional descrita

na medula do neonato parece ser de natureza homocelular, interneuronal.

6. Encontramos, no entanto, sugestão de acoplamento heterocelular no corno

ventral, entre motoneurônios e interneurônios. Além disso, raras células

profundamente carregadas com LY e que expressam GFAP sugerem uma via

heterocelular neurônio-glial para a transferência do permeante juncional, a confirmar-

se.

7. Detectamos acoplamento celular juncional no corno dorsal da medula espinhal em

animais adultos.

93

8. O acoplamento celular do corno dorsal no período pós-natal responde

rapidamente à lesão do nervo ciático, no mesmo período em que obervamos

qualitativamente um aumento dos níveis de expressão de Cx43.

9. Não verificamos, no adulto, o incremento da comunicação juncional observado no

modelo de medula de neonato. No entanto encontramos uma tendência ao aumento

da taxa de acoplamento em uma resposta tardia, 7 dias após a lesão. Este

acoplamento pós-lesão é nítido no corno dorsal em regiões parcialmente

correspondentes à região de gliose reativa.

94

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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