UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
JOSÉ AIRTON JORGE ALVES
“A COPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL
DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM
ADULTOS”
TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE
JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
RIO DE JANEIRO FEVEREIRO
2009
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i
JOSÉ AIRTON JORGE ALVES
ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL
DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM
ADULTOS
TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Orientadores: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Profª. Maira Monteiro Fróes
Rio de Janeiro Fevereiro
2009
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FICHA CATALOGRÁFICA ALVES, José A. J.
ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O
DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS / JOSÉ AIRTON JORGE ALVES, RIO DE JANEIRO, 2009. xii, 114 f
Orientador: Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes Orientadora: Profª. Maira Monteiro Fróes Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – UFRJ – Instituto de Ciências Biomédicas – Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, 2009.
1. Junções comunicantes. 2. Medula espinhal. 3. Desenvolvimento. 4. Adultos. I. Menezes, JR. II. Fróes, MM. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-graduação em ciências morfológicas. IV. Título .
iii
JOSÉ AIRTON JORGE ALVES “ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E
EM ADULTOS”
TESE APRESENTADA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PRÉ-REQUISITO À
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR EM CIÊNCIAS MORFOLÓGICAS
Aprovada por: Prof. Dr. Vivaldo Moura Neto
Presidente da Banca Prof. Dr. João Ricardo Lacerda de Menezes Membro Profa. Drª. Tatiana Lobo Coelho de Sampaio
Membro Profa. Drª. Claudia Vargas
Membro
Prof. Dr. Luis Anastácio Alves - Fiocruz Prof. Drª. Patríca Franca Gardino Membro e Revisora
Prof. Dr. Jean Christophe-Houzel Membro
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AGRADECIMENTOS
Gostaria de agredecer especialmente ao meu orientador JOÃO RICARDO,
sem você esta tese nunca seria possível. Excelente orientador, sempre foi um amigo
e ainda torna qualquer momento divertido. Minha co-orientadora, MAIRA FRÓES,
obrigado por ceder sua casa e seu tempo para me ajudar durante a construção da
tese. CECÍLIA HEDIN, Obrigado pelas idéias e ajuda, principalmente durante o
projeto de tese.
Gostaria de agradecer também de forma especial à minha esposa SIMONE
ALENCASTRE, obrigado pela paciência de esperar tantos anos, por me incentivar
constantemente e por fornecer toda a ajuda necessária para que eu pudesse acabar
a tese. Te amo!
Outro agradecimento especial também é para a minha filha JÚLIA
ALENCASTRE. Seu nascimento foi um dos grandes eventos durante este
doutorado. Eu adorei ser pai e você é uma filha maravilhosa, e finalmente vai poder
parar de me perguntar “Quando acaba esse doutorado?”.
Agradeço também aos amigos do Laboratório de Neuroanatomia Celular, LEO
MORITA, EDUARDO, LUCIANA, ANA LENICE, ELISA, LEONARDO e ADIEL. Não
poderia esquecer também dos meus ex-alunos de iniciação científica, JOSÉ
EDUARDO e MANUELA. Muito obrigado, vocês tem grande participação neste
trabalho.
Agradeço também a minha família que sempre me ajuda e me dá força,
mesmo eu não estando muito presente. MARIA (mãe), JOSÉ (pai), ANA e
FRANCISCO (irmãos), CLARA (afilhada), JOSÉ LUIZ (sogro) e SILVÉRIA (sogra).
Obrigado.
v
Agradeço também aos amigos, AD e PATRÍCIA que compartilham das
mesmas dificuldades e sempre tem uma palavra de esperança.
Não posso deixar de agradecer a Deus por ter me dado saúde e força para
suportar as dificuldades e chegar até aqui. Muito obrigado.
vi
José Airton Jorge Alves
ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DUR ANTE O DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS
Tese de Doutorado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas, Departamento de Anatomia, no Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Morfológicas.
Esta tese foi desenvolvida, no Laboratório de Neuroanatomia Celular, sob a orientação do Prof. João Ricardo Lacerda de Menezes e co-orientação da Profa. Maira Monteiro Fróes e contou com o apoio financeiro das seguintes entidades: CAPES, CNPq, CNPq/PRONEX , FAPERJ, FUJB.
Rio de Janeiro
2009
vii
ALVES , José Airton Jorge. ACOPLAMENTO CELULAR NA MEDULA ESPINHAL DE RATOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO E EM ADULTOS. Rio de Janeiro, 2008. Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.
RESUMO
A primeira semana pós-natal é um período de refinamento sináptico da circuitaria motora e sensorial da medula espinhal. Foi demonstrado que a comunicação juncional mediada por junções comunicantes participa diretamente deste processo em motoneurônios do corno ventral durante o desenvolvimento e após lesões periféricas no adulto. Apesar de ser bem estabelecido para motoneurônios do corno ventral, pouco se conhece sobre o acoplamento juncional no corno dorsal, a porção sensorial da medula espinhal, tanto no neonato como no adulto. Neste trabalho empregamos uma técnica de carregamento celular por transecção, de uma mistura de fluorocromos permeante (lucifer yellow, LY) e não permeante juncional (rodamina-conjugada dextran 3KDa, RD), conhecida como “transection loading”, para revelar o acoplamento celular por corantes in situ na medula espinhal de ratos neonatos e adultos. Nossos resultados demonstraram que o acoplamento celular esta presente e distribuído por toda a medula espinhal no neonato e no adulto, principalmente nas lâminas I, III, IV, VIII, IX e epêndima. Este acoplamento é sensível a inibição farmacológica de junções comunicantes e responde agudamente a lesões de nervo periférico. Estes resultados demonstram de forma pioneira a presença de junções comunicantes funcionais no corno dorsal no desenvolvimento e no adulto, bem como corroboram a hipótese de que a comunicação juncional, assim como no corno ventral, também pode desempenhar um papel no refinamento da circuitaria sensorial durante a primeira semana pós natal e na resposta fisiológica a lesões.
viii
ALVES, José Airton Jorge. CELL COUPLING IN THE SPINAL CORD DURING DEVELOPMENT AND ADULT RATS. Rio de Janeiro, 2009. Tese (Doutorado em Ciências Morfológicas) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. ABSTRACT
The first postnatal week is a period of intense sinaptic remodelling of motor and sensory circuits for the spinal cord. It is well established that gap junctional communication plays a role in this process for motorneurons in the anterior horn, aswell as cellular responses to peripheral lesion. However little is known for GJC involvement in the dorsal horn, a sensory portion of the spinal cord. In this study we employed a transection-based method, call “transection loading”, for loading cells with gap juction permeant (lucifer yellow, LY) and non- permeant (rhodamine-conjugated dextran 3KDa, RD) fluorochromes to reveal the pattern of dye coupling in the developing and adult spinal cord of the rat. Our result reveal widespread dye coupling in both the neonatal and adult spinal cord, distributed mainly in laminae I, III, IV, VIII, IX and ependyma layer. Coupling was sensitive to pharmacological inhibition of gap junctions and was responsive to peripheral nerve lesion. These results show for the first time functional junctional coupling in the dorsal horn during development and adulthood. It also corroborate the hypothesis that junctional coupling, as described for motorneurons, may play a role in the refinement of sensory synaptic circuits during the first postnatal week, as well as in physiological response to lesions.
ix
Lista de Abreviaturas
AFF = Ácido Flufenamico
βIII-Tubulina = Classe III β-tubulina
CBX = Carbenoxolone
CMM = Coluna motora medial
CML = Coluna motora lateral
CT = Coluna de Terni
Cx = Conexina
DAPI - 4’,6’-diamidina-2’-fenilindol
GSS – solução salina de Gey (do inglês, Gey´s salt solution)
GJ = “Gap junction” - Junção comunicante
GFAP = Proteína glial fibrilar acídica (glial fibrillary acidic protein)
LY = Lucifer Yellow (sem tradução em português)
LY+/RD- = Células marcadas somente com Lucifer Yellow
LY+/RD+ = Células marcadas com Lucifer Yellow e Rodamina Dextran
L3 = Terceira vértebra lombar ou terceiro segmento medular
P0 = Dia do nascimento
PBS = solução de tampão fosfato (phosphate buffered saline)
RD = Rodamina dextran 3k
SNC = sistema nervoso central
SNP = sistema nervoso periférico
TL = “Transection Loading”
Ø Ca2+ - livre de Ca2+
x
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO 01
1- A medula espinhal do roedor 03
1.1 Morfologia externa da medula espinhal 05
1.1.1 – Morfologia interna e anatomia seccional da medula espinhal 06
1.1.2 – Composição celular da medula espinhal 07
1.2 – Neurogênese da medula espinhal 13
1.2.1 – Geração de neurônios motores 14
1.2.2 – Geração de interneurônios do corno ventral 16
1.2.3 – Geração de interneurônios do corno dorsal 16
1.2.4 – Geração de neurônios sensoriais primários 17
1.3 – Gliogênese 18
1.3.1 – Oligodendrócitos 18
1.3.2 – astrócitos 18
1.3.3 – Microglia 19
1.3.4 – células ependimárias 19
1.5 – Junções comunicantes 21
1.5.1 – Junções comunicantes e o desenvolvimento pós-natal da
medula espinhal
27
1.5.2 – Junções comunicantes na medula espinhal de ratos adultos 29
1.5.3 – Junções comunicantes e a resposta celular na medula espinhal
após lesão central ou periférica
31
2 – OBJETIVOS 36
xi
2.1 – objetivo geral 36
2.2 – Objetivos específicos 36
3 – MATERIAIS E MÉTODOS 37
3. 1 – Animais 37
3. 2 – “Transection Loading” 37
3.3 – Imuno-histoquímica 41
3.4 – Distribuição do acoplamento celular na medula espinhal 42
3.5 – Lesão do nervo ciático 42
3.6 – Bloqueio do acoplamento celular com Carbenoxolone (CBX) e
ácido flufenâmico
43
3.7 – Quantificação do acoplamento celular nos experimentos de
transecção do nervo ciático em ratos neonatos e adultos
44
4.0 – RESULTADOS 46
4.1 – O carregamento de corantes por transecção da medula espinhal
revela padrões esperados de marcação intracelular em ratos neonatos
46
4.2 – Distribuição espacial do acoplamento celular na medula espinhal do
rato neonato
49
4.3 – Diversos tipos celulares encontram-se acoplados na medula de
ratos neonatos
53
4.4 – Acoplamento celular está presente no epêndima de ratos neonatos 59
4.5 – O acoplamento celular é também revelado por carregamento
através dos nervos espinhais na medula espinhal do rato neonato
59
4.6 – O acoplamento celular e a expressão de conexina 43 aumentam
após lesão periférica do nervo ciático em ratos neonatos
64
4.7 – O acoplamento celular é modificado na presença de ácido 68
xii
flufenâmico
4.8 – A técnica de carregamento por transecção revela acoplamento
celular na medula espinhal de ratos adultos
70
4.9 – O acoplamento celular na medula espinhal de ratos adultos em
resposta a lesão periférica
72
4.10 – Bloqueio do acoplamento celular com carbenoxolone abole o
acoplamento entre as células da medula espinhal
74
5 – DISCUSSÃO 76
5.1 – O carregamento celular por transecção é uma forma eficiente de
demonstrar o acoplamento cleular na medula espinhal de animais neonatos
e adultos
76
5.2 – O acoplamento celular é distribuído por todas as lâminas da
medula espinhal de ratos neonatos
83
5.3 – Tipos celulares marcados com Lúcifer Yellow na medula espinhal e
possíveis parceiros acoplados
85
5.4 – A lesão ao nervo ciático aumenta o acoplamento celular mediado
por junções comunicantes na medula espinhal de ratos neonatos
88
5.5 – Junções comunicantes em ratos adultos 89
6 – CONCLUSÕES 92
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94
1
1– INTRODUÇÃO
A comunicação entre as células tem papel central durante o desenvolvimento,
na vida adulta e também em resposta a lesões e processos patológicos (Thompson
et al., 2006; John et al., 1999). Uma das formas de contato direto entre células no
sistema nervoso central (SNC) é através de junções comunicantes, que agindo
como canais intercelulares conectam o citoplasma de células adjacentes e permitem
a passagem rápida de íons e pequenas moléculas que chegam até um pouco mais
de 1 KDa. Provavelmente devido à natureza direta do intercâmbio intercelular
promovido pelos canais juncionais e à sua baixa seletividade, a comunicação
juncional desempenha papéis fisiológicos diversos no indivíduo adulto e durante o
desenvolvimento.
Durante o desenvolvimento embrionário da medula espinhal existe um grande
número de junções comunicantes envolvendo vários tipos celulares, inclusive
neurônios jovens (Bittman et al., 2004; Russo et al., 2008). Para os neurônios
motores da medula, onde este fenômeno foi melhor estudado, o acoplamento celular
alto no período neonatal precoce, gradualmente reduz-se e não é mais detectável ao
final da primeira semana pós-natal (Walton e Navarrete, 1991; Chang et al., 1999).
Durante a vida adulta, no entanto, lesões centrais ou periféricas parecem levar ao
reaparecimento de junções comunicantes funcionais entre neurônios e um aumento
da expressão das conexinas, proteínas que formam estas junções. (Rohlmann et al.,
1993; Theriault et al., 1997; Li e Nagy, 2000; Lee et al., 2005).
Trabalhos recentes demonstram que o acoplamento persistente em
motoneurônios no corno ventral da medula espinhal de ratos parece exercer um
2
papel no refinamento da circuitaria motora durante as duas primeiras semanas pós-
natais (Chang et al., 1999; Mentis et al., 2002; Personius et al., 2008)
Apesar de relativamente adiantados em bases tanto estruturais quanto
fisiopatológicas, os estudos acerca das junções comunicantes no corno ventral da
medula de roedores, reconhece-se uma lacuna quando consideramos o seu
equivalente dorsal em animais pós-natos ou mesmo em adultos. É importante
ressaltar que, também para o corno dorsal, é durante a primeira semana pós-natal
que ocorrem os processos ontogenéticos que levam ao estabelecimento da
circuitaria sináptica (Fitzgerald et al., 1994; Bardoni, 2001; Mentis et al., 2006).
Sendo assim o desenvolvimento e a plasticidade sináptica da circuitaria sensorial
podem envolver junções comunicantes, à semelhança do sugerido para os
motoneurônios do corno ventral (Chang e Balice-Gordon, 2000; Personius et al.,
2008).
O presente manuscrito de tese pretende apresentar os dados resultantes da
avaliação funcional da comunicação juncional no contexto do desenvolvimento pós-
natal e do adulto, e nas respostas fisiopatológicas do corno dorsal da medula
espinhal do rato à injúria neural periférica provocada experimentalmente. Neste
estudo, emprega-se uma técnica de acoplamento por corante, que permite rastrear a
histoarquitetonia da comunicação juncional em grandes populações celulares in
vivo/in situ. Esta técnica foi desenvolvida em nosso laboratório em anos anteriores e
denominada “transection loading” (Menezes et al., 2000).
3
1 – A medula espinhal do roedor:
A medula espinhal é a parte do SNC que conecta as estruturas corticais e/ou
subcorticais encefálicas com a rede neural periférica, esta por sua vez composta por
terminações sensoriais e efetoras distribuídas, através dos nervos espinhais, por
todo o corpo, incluindo tegumento, vísceras e músculos. A medula espinhal não é
simplesmente um centro aferente e efetor do SNC, mas possui centrais de comando
próprio, integrando reflexos e capazes de gerar ritmos na ausência de sinais dos
centros superiores, ritmos estes possíveis de gerar padrões motores específicos
(McCrea e Rybak, 2008).
A medula espinhal em ratos divide-se em 34 segmentos, distribuídos como 8
cervicais, 13 torácicos, 6 lombares, 4 sacrais e 3 caudais (Gilerovich et al., 2008). Ao
longo do canal vertebral, em roedores, estende-se do forame magno até a vértebra
L4 (Gilerovich et al., 2008). A extremidade distal apresenta a forma de um cone,
sendo assim denominado, cone medular. Um filamento delgado de tecido conjuntivo
(filamento terminal) continua inferiormente, a partir do ápice do cone medular,
fixando-se em vértebras caudais.
Cada segmento medular apresenta prolongamentos axonais (radículas) que
emergem ventralmente e conduzem estímulos motores para a periferia, e radículas
dorsais que recebem estímulos sensoriais. A união das radículas forma raízes
ventrais e dorsais, que novamente se unem para formar nervos espinhais. O número
de nervos espinhais é equivalente ao número de segmentos medulares.
No corte transversal, a medula espinhal é circular a oval com um canal central
se estendendo longitudinalmente através de toda sua extensão. A medula espinhal
apresenta duas dilatações ao longo do seu trajeto dentro do canal vertebral,
4
denominadas intumescência lombar e intumescência cervical. Estas regiões refletem
o maior número de neurônios em regiões da medula responsáveis pela inervação
dos músculos dos membros inferiores e superiores (Lent, 2001).
Figura 1. Localização da intumescência lombar na me dula espinhal de ratos. (a) vértebras (b) segmentos medulares. A intumescência lombar em roedores está localizada entre a vértebra T12 – L1. Retirado de Gilerovich et, 2008.
Ao nível das vértebras T12 – L1, em roedores, encontra-se a intumescência
lombar, correspondendo aos segmentos medulares L1 – L5, que são responsáveis
pela inervação dos membros posteriores do roedor (Figura 1) (Gilerovich et al.,
2008). Um dos nervos importantes para esta inervação dos membros posteriores é o
nervo ciático. Este formado pela junção das raízes ventrais e dorsais dos segmentos
medulares L1 –L3 (Walton e Navarrete, 1991).
Cone medular
Cauda eqüina
5
1.1 – Morfologia externa da medula espinhal:
A superfície externa da medula espinhal apresenta uma série fissuras e
sulcos que são úteis para determinações do eixo ântero-posterior. Estes são: sulco
mediano dorsal, que se estende longitudinalmente na face dorsal da medula
espinhal; fissura ventromedial, que se estende longitudinalmente na face ventral da
medula espinhal; sulco posterolateral, a cada lado da face dorsal, marcando o local
onde as radículas posteriores dos nervos espinhais entram na medula espinhal; e o
sulco ventromedial, a cada lado da face ventral, marca onde as radículas anteriores
dos nervos espinhais saem da medula espinhal. A vascularização arterial distinta
ajuda na identificação das faces ventrais e dorsais. Na face anterior, a artéria
espinhal anterior é proeminente e continua, e na face posterior a artéria espinhal
posterior é descontinua e muitas vezes sinuosa e duplicada. É possível visualizar
com grande facilidade a presença de um conjunto de corpos de neurônios
sensoriais, distribuídos ao longo da lateral da medula espinhal, denominados
gânglios das raízes dorsais (Lent, 2001).
Envolvendo a medula espinhal dentro do canal vertebral encontramos 3
camadas distintas de tecido conjuntivo, as meninges. Estas envolvem, protegem e
sustentam a medula espinhal. A camada mais externa é chamada de dura-máter, a
intermediária de aracnóide-máter e a mais interna, aderida ao tecido nervoso é
chamada de pia-máter. Entre estas meninges existem espaços clinicamente
importantes que são: espaço subdural (entre a dura-máter e a aracnóide-máter) e
espaço subaracnóide (entre a aracnóide-máter e a pia-máter), o líquido
cérebroespinhal.
6
1.1.1 – Morfologia interna e anatomia seccional da medula espinhal:
Internamente a medula espinhal apresenta um pequeno canal central cercado
por substância cinzenta e branca. Semelhante a outras estruturas do SNC, na
substância branca da medula espinhal encontramos fibras nervosas mielínicas e
amielínicas de diversos calibres, poucos corpos neuronais e células da glia (Lent,
2001). Estas fibras são agrupadas em feixes e fascículos que ascendem e
descendem em seu trajeto até os nervos periféricos ou até o encéfalo. Transportam
informações sensoriais da pele, músculos, articulações e outros tecidos do corpo ou
distribuem o comando motor gerado em níveis supra segmentares, distribuindo-os
para as demais estruturas através de nervos periféricos.
A substância branca é dividida em 3 pares bilaterais de colunas ou funículos
(Figura 2). 1. Coluna dorsal – Em humanos consiste primariamente de axônios que
conduzem informações sensoriais para o tronco encefálico. Em roedores, no
entanto, apresenta majoritariamente axônios de neurônios motores córtico-
espinhais. 2. Coluna Lateral – Contém axônios que se dirigem aos centros
sensoriais, e que partem de centros motores e autonômicos do cérebro. 3. Coluna
ventral – Contém primariamente axônios encefálicos descendentes que controlam
basicamente a musculatura axial. Além destas 3 colunas, temos o Trato de Lissauer,
contendo ramificações centrais de fibras sensoriais primarias de pequeno diâmetro,
e o fascículo próprio da medula, contendo axônios dos neurônios proprioespinhais
que interconectam diferentes regiões da medula espinhal, localizados ao longo da
margem da substância cinzenta e substância branca (Tanabe et al., 1996).
A substancia cinzenta é composta principalmente de neurônios, formando
uma série de núcleos ou grupamentos neuronais com funções correlacionadas,
7
organizados em grandes massas de substância cinzenta denominadas cornos
ventral, dorsal e lateral (Figura 2). Estas massas encontram-se agregadas,
revelando, ao corte transversal da medula espinhal, a forma da letra H, e definindo a
susbstância cinzenta da medula espinhal, referida como "H medular".
Figura 2. Anatomia geral da medula espinhal em secç ão transversal. Em (a), organização da substância cinzenta. Dorsalmente, originário da placa alar, encontramos o corno dorsal formado por neurônios sensitivos e interneurônios. Ventralmente, encontramos o corno ventral, originário da placa basal, composto por neurônios motores e interneurônios. Em (b), organização da substância branca da medula espinhal, através da formação de colunas ou funículos. Adaptado de Prometeus, 2007.
1.1.2 – Composição celular da medula espinhal:
A medula espinhal foi um modelo de estudo citológico muito empregado no
início do século XX devido ao seu caráter anátomo-histológico relativamente
simples. Esta aparente simplicidade esconde, no entanto, a grande complexidade
dos domínios fisiológicos dispostos em uma organização semi-randômica dentro da
susbtância cinzenta medular. Isto estimulou mais recentemente, a busca por
modelos, embora anatomicamente mais complexos, histo-fisiologicamente mais
organizados à luz da experimentação, como as estruturas telencefálicas, sobretudo
as corticais, definidas por camadas funcionalmente e hodologicamente distintas.
8
Esta complexidade da organização celular somado a relativa dificuldade de acesso
cirúrgico da medula espinhal (musculatura abundante e componentes ósseos
móveis em oposição a imobilidade relativa dos ossos do crânio) o estudo detalhado
dos componentes celulares nesta região ainda está por estabelecer-se à luz de
novos ferramentais tecnológicos.
A substância cinzenta da medula espinhal apresenta-se dominada por
grupamentos nucleares dispostos principalmente em colunas com orientação
longitudinal. Em cortes coronais, os grupamentos nucleares na medula espinhal têm
sua organização definida em camadas, denominadas lâminas de Rexed, as quais
são numeradas de I a X em sentido póstero-anterior tanto em humanos quanto em
roedores (Figura 3).
Figura 3. Disposição das lâminas de Rexed no segmen to lombar da medula espinhal do rato adulto . Lâminas de I – VI formam o corno dorsal. Lâmina VII forma a zona intermediária. Lâmina VIII e IX, formam o corno ventral. A lâmina X se encontra ao redor do canal central da medula espinhal. Adaptado de Gilerovich et al., 2008.
9
Classicamente, os neurônios da medula espinhal se dividem em neurônios
sensoriais, neurônios motores e interneurônios. No entanto, esta nomenclatura
simples esconde uma grande diversidade de sub-tipos neuronais, especialmente
verdadeira para os interneurônios, como veremos a seguir.
Os interneurônios na medula espinhal podem ser de projeção curta ou longa,
com alvos contidos em um mesmo segmento ou distantes, por diversos segmentos
da medula ou em níveis suprasegmentares (Petko e Antal, 2000). Apenas em
relação aos interneurônios proprioespinhais (interneurônios que conectam diferentes
segmentos da medula) acredita-se que existam na ordem de uma dezena de tipos
variados, classificados segundo seus aferentes e eferentes, suas ações gerais
(inibição ou excitação do neurônio alvo) e especializações, sejam estas definidas por
propriedades neuroquímicas adicionais, participação em circuitos medulares
específicos, eletrofisiologia celular intrínseca e padrão de excitabilidade (para
revisão ver Jankowska, 2001).
Na substância cinzenta, a maioria dos corpos celulares refere-se a neurônios.
A maioria das fibras são amielínicas, em grande densidade, assumindo padrões de
entrelace e orientações diversas. As células gliais correspondem a astrócitos
protoplasmáticos, oligodendrócitos e microglia.
A porção de substância cinzenta da medula espinhal dorsal, o corno posterior
ou dorsal (laminas I-VI), é composta principalmente por interneurônios sensoriais
que recebem informações do ambiente externo através dos axônios centrais do
gânglio da raiz dorsal. Estes aferentes primários após entrarem na medula espinhal
são distribuídos espacialmente de forma diferenciada dependendo do diâmetro das
fibras e das modalidades sensoriais conduzidas: fibras de grosso calibre correm
medialmente no funículo dorsal, enquanto fibras de pequeno diâmetro aproximam-se
10
do corno dorsal através do fascículo de Lissauer (trato de fibras longitudinais não-
mielinizadas na porção mais superficial do corno posterior lamina I-II) e são
distribuídas nas lâminas da medula espinhal. Este padrão, embora tenha sido
descrito inicialmente em gatos, pode ser, em linhas gerais, reconhecido em roedores
(Paxinos, 2001).
Os componentes celulares distribuídos nas lâminas da medula espinhal são
diferenciados por sua maquinária de neurotransmissão (Polgar et al., 2003), e por
seus atributos morfofuncionais (Lima e Coimbra, 1986; Han et al., 1998).
A grande maioria dos neurônios da lâmina I – III consiste de interneurônios,
por definição, de projeção intrínseca medular (Polgar et al., 2006). No entanto,
encontramos também neurônios de projeção para regiões supramedulares. Estes
neurônios são marcados para o receptor Neurokinina 1 que é excitado por
substância P (Spike et al., 2003). Recente trabalho quantificou o número de células
das lâminas I, III e IV que projetam diretamente para o tálamo (Al-Khater et al.,
2008). Dos interneurônios sensoriais da intumescência lombar foram encontrados
17% deles que projetam para o tálamo.
A lâmina I, também conhecida como zona marginal medular, apresenta um
grande número de neurônios de pequeno diâmetro, somáticos, em meio a alguns
maiores e alongados mediolateralmente. Por critérios fisiológicos e morfológicos
estes neurônios são categorizáveis em 3 grupos distintos: (1) piramidais, (2)
fusiformes e (3) multipolares (Lima e Coimbra, 1986; Han et al., 1998). Estes
neurônios são imunorreativos para encefalina, substância P, dinorfina (Lima et al.,
1993), calbindina e calretinina (Anelli e Heckman, 2005). Finalmente, a camada I e
sua população neuronal parece constituir uma importante estação para recepção de
11
informações de dor e temperatura, para retransmissão até o tronco encefálico
(Tavares et al., 1993) e outras áreas supratentoriais.
A lâmina II (Substância gelatinosa ou de Rolando) é paralela à lâmina I, e
caracterizada pela presença de neurônios com corpos pequenos e arredondados,
em grande densidade. Estes foram categorizados morfológica e
eletrofisiologicamente em células “islet” (ilha), central, radial e vertical. Dentre estes
tipos, as células ”islet” apresentam seus prologamentos dispostos rostrocaudalmente
por vários micrômetros (Toshiharu et al., 2007).
Na lâmina II chegam aferentes primários não mielinizados conduzindo
informações de dor (Sugiura et al., 1986), que são moduladas por interneurônios
desta camada. Grande número destes neurônios respondem a glutamato (Santos et
al., 2007) e alguns outros são gabaérgicos (Polgar et al., 2003) e glicinérgicos
(Bardoni et al., 2007). Os interneurônios da lâmina II podem ser identificados através
da expressão de calbindina e calretinina (Anelli e Heckman, 2005).
Ao nível das intumescências a lâmina II é aumentada, pois aportam-lhe
muitos aferentes não mielinizados, de origem espinhal e supraespinhal, integrando
estas informações com fibras aferentes pouco mielinizadas que projetam para a
lâmina I.
As lâminas III, IV e V formam o núcleo próprio, que integra entradas
sensoriais com informações que descendem do cérebro e da base do corno dorsal,
onde muitos neurônios que projetam para o tronco encefálico estão localizados.
Na lâmina III são encontradas células pequenas e arredondadas. No entanto,
com uma densidade celular menor do que a registrada na lâmina II. Estão presentes
também neurônios de corpo grande que projetam para o tronco encefálico. Estes
podem ser reconhecidos pela expressão de Neurokinina 1 (Polgar et al., 2007).
12
A lâmina IV é formada por algumas células pequenas e redondas, outras
triangulares e grandes neurônios que projetam para o tronco encefálico e também
expressam o receptor neurokinina 1 (Polgar et al., 2007). O limite entre a lâmina IV e
lâmina V é claramente visível pela diferença na distribuição de fibras.
A parte intermediária da medula espinhal consiste das lâminas V-VIII. A
lâmina VI ocupa a base do corno dorsal e é identificada somente nas áreas de
diâmetro aumentado da medula espinhal. Neurônios nesta lâmina são menores do
que os da lâmina V, e sua distribuição mais homogênea e projetam
contralateralmente e ipsilateralmente para o núcleo reticular lateral (Girafoli et al.,
2006).
A lâmina VII contém o núcleo de Clark, presente em segmentos torácicos e
lombares superiores. Estes neurônios recebem informações proprioceptivas dos
membros e enviam-nas para o cerebelo. O núcleo intermédio lateral encontra-se
descrito no contexto desta lâmina, apresentando na sua composição motoneurônios
autonômicos pré-ganglionares. As células desta lâmina são em sua maioria
triangulares e ovais.
O corno ventral, formado pelas lâminas VIII e IX, contém além de vários tipos
de interneurônios, os neurônios motores, ou motoneurônios inferiores (Lamina IX)
que inervam os músculos estriados esqueléticos. Estes neurônios estão dispostos
em colunas, algumas vezes abrangendo diversos segmentos medulares. As colunas
motoras são divididas morfofuncionalmente em dois grupos: medial e lateral. A
coluna motora medial estende-se por toda a medula e inerva os músculos axiais; as
colunas motoras laterais ocupam principalmente a extensão longitudinal das duas
intumescências medulares.
13
São distinguíveis 2 tipos de motoneurônios (1) motoneurônios alfa –
apresentam corpos celulares de tamanho médio ou grande e extensa arborização
dendrítica. Os axônios dos motoneurônios alfa emergem da medula espinhal e se
integram aos nervos espinhais, fazendo sinapses com fibras musculares,
caracterizadas como especializações histofisiológicas, denominadas junções
neuromusculares; são responsáveis pela contração muscular. (2) motoneurônios
gama – apresentam corpos celulares pequenos e poucos dendritos. Os axônios
destes motoneurônios inervam as fibras musculares intrafusais, controlando
indiretamente a contração muscular (Lent, 2001).
São encontrados também interneurônios, principalmente distribuídos na mal
definida lamina VIII. Estes interneuronios podem ser de axônios curtos (Lent, 2001),
e interneurônios comissurais, excitatórios ou inibitórios (Jankowska et al., 2007). São
encontrados também pequenos interneurônios, denominados células de Renshaw,
que recebem informações colaterais dos motoneurônios alfa, modulando, por alças
sinápticas de retroalimentação negativa a atividade do motoneurônio (Uchiyama e
Windhorst, 2007). As células ao redor do canal central da medula espinhal formam a
lâmina X.
1.2 – Neurogênese da medula espinhal:
Os neurônios na medula espinhal são originários de uma camada
neuroepitelial simples pseudoestratificada, caudal às vesículas encefálicas do tubo
neural primitivo, denominada camada ventricular. As células que proliferam na
camada ventricular recebem sinais moleculares que induzem a diferenciação em
variados fenótipos. Assim como em outras regiões do sistema nervoso, à medida
14
que os neurônios são gerados, migram radialmente, associados com células de glia
radial (McDermott et al., 2005). Após migrarem, acumulam-se na camada do manto
e assumem suas posições na medula espinhal. Os primeiros neurônios gerados
localizam-se nas camadas mais externas, enquanto os mais jovens encontram-se
nas regiões mais internas (Altman e Bayer, 1984).
1.2.1 – Geração de neurônios motores:
A futura região ventral da medula espinhal recebe influência da notocorda
através da expressão de SHH, dando origem a uma estrutura denominada placa
basal, que em E10,5 emite sinais moleculares iniciadores do processo de
diferenciação em neurônios motores (Goulding et al., 1993; Matsuda, 2002). Ao
longo do desenvolvimento diversos subtipos de neurônios da região ventral são
gerados e passam a expressar um complemento final do gene homeótico LIM (Islet
1, Islet 2, LIM 1 e LIM 3). A expressão de Islet 1 na região ventral da medula
espinhal confere as células geradas o fenótipo de motoneurônio (Figura 4), antes
mesmo de sua via axonal ser estabelecida na periferia e da segregação em colunas
(Toshida et al., 1994; Lumsden, 1995).
Os neurônios motores gerados podem ser classificados de acordo com as
projeções de seus axônios ou sua posição específica dentro do corno ventral (Figura
4) (Lumsden, 1995). (1) Neurônios motores localizados próximos à linha média
formam a coluna motora medial (CMM), contínua ao longo da medula espinhal, e
inervam músculos axiais do tronco. (2) Neurônios localizados mais lateralmente
formam a coluna motora lateral (CML) ocupando a intumescência cervical e lombar e
inervam músculos dos membros superiores e inferiores respectivamente. (3) Outra
15
coluna motora é formada nos níveis torácico e sacral, denominada coluna motora de
Terni (CT), responsável pela inervação dos neurônios motores pós-ganglionares
viscerais simpáticos e parassimpáticos (Lumsden, 1995).
As colunas motoras são subdivididas em: CMM lateral (inerva músculos da
parede torácica anterior) e medial (inerva músculos próximos a coluna vertebral) e
CML lateral (inerva músculos dorsais dos membros) e medial (inerva músculos
ventrais dos membros) (Lumsden, 1995; Tanabe.et al., 1996).
Prolongamentos axonais dos neurônios motores emergem ventrolateralmente,
crescendo em direção ao somito adjacente a seu ponto de emergência. Esta atração
das radículas pelos somitos mais próximos sublinha o padrão segmentar de
emergência dos nervos espinhais periféricos.
Figura 4. Distribuição anátomo-sistêmica geral da i nervação motora. Neurônios motores das colunas motoras mediais são responsáveis por inervar os músculos axiais. Enquanto neurônios motores das colunas motoras laterais inervam músculos dos membros. A coluna motora lateral apresenta-se subdividida em coluna motora lateral medial e coluna motora lateral lateral, especializadas na inervação dos músculos ventrais e dorsais. Já os neurônios motores autonômicos advêm da coluna motora intermédia. (Retirado de Tanabe et al., 1996)
Geração de neurônios motores
Músculos axiais
Músculos ventrais
Músculos dorsais
Neurônios autônomos
16
1.2.2- Geração de interneurônios do corno ventral:
Quatro subtipos de interneurônios são encontrados na coluna ventral da
medula espinhal, e são denominados de acordo com a sua origem em nichos
restritos na zona ventricular definidos por expressão diferencial de fatores de
transcrição. Estes quatro tipos são: V0, expressam Evx1/2 e são localizados mais
dorsalmente no corno ventral; V1, expressam En1 e são localizados ventralmente
aos interneurônios V0 (Burrill, et al., 1997); V2, expressam Lim3/Chx10 (Ericson et
al., 1996) e GATA 2 (Zhou et al., 2000) e são localizados entre os interneurônios V1
e os motoneurônios; e finalmente V3, que expressam Sim 1 (Pierani et al., 1999) e
estão localizados mais ventralmente na medula espinhal. Acredita-se que a principal
função destes interneurônios ventrais seja formar a circuitaria reflexa e coordenar a
atividade motora junto aos motoneurônios (Allum et al., 1989; Goulding et al., 2002).
As células de Renshaw, interneurônios inibitórios que modulam a atividade dos
motoneurônios são originários dos interneurônios V1 (Wenner e Donovan, 1999).
Neurônios gerados de V0 são interneurônios comissurais gabaérgicos e
glumatamatérgicos (Lanuza et al., 2004). V1 são interneurônios de projeção
ipsilateral gabaérgicos e glicinérgicos (Wenner et al., 2000). V2 são interneurônios
de projeção ipsilateral (Lee e Pfaff, 2001) e V3 são interneurônios excitatórios
ipsilaterais e comissurais (Zhang et al., 2008).
1.2.3 – Geração de interneurônios do corno dorsal:
Na linha média dorsal da medula espinhal, um grupo de células não neurais,
denominado placa alar, serve como centro sinalizador para a diferenciação de
17
neurônios recém gerados em interneurônios sensoriais (Lee e Jessell, 1999). Entre
E10-E12,5 são gerados seis tipos neuronais (Figura 5) denominados dI1 - dI6. Estes
neurônios podem ser divididos em duas classes distintas (A e B). Neurônios classe
A (dl1-dl3) são dependentes da sinalização da placa alar, enquanto neurônios classe
B (dl4-dl6) são independentes desta sinalização (Muller et al., 2002). Em um
segundo momento, entre E11-E13.5, são gerados dois tipos de interneurônios da
classe B (dlLa e dlLb), responsáveis por formar os interneurônios das lâminas I, II e
III do corno dorsal (Muller et al., 2002; Matise, 2002). Os neurônios classe A migram,
ventralmente, para lâminas mais profundas da medula espinhal, gerando neurônios
que processam informações proprioceptivas nas lâminas IV – VII (Bermingham et al.,
2001) e interneurônios comissurais da lâmina VIII (Lee et al., 1998).
Figura 5. Geração de neurônios no corno dorsal a pa rtir de duas ondas proliferativas. Os neurônios da camada I, II e III são gerados através da proliferação dos neurônios de classe B.Matise, 2002
1.2.4 – Geração de neurônios sensoriais primários:
Neurônios sensoriais primários são gerados a partir das células da crista
neural e formam o gânglio da raiz dorsal. Estas células emitem prolongamentos
Classe A Classe B
18
centrais e periféricos. Os prolongamentos periféricos crescem para tecidos
adjacentes como músculos, pele, vísceras. Os prolongamentos centrais formam as
raízes dorsais e penetram na medula espinhal dorso lateralmente onde podem fazer
conexões com interneurônios medulares ou ascender diretamente pelas colunas
dorsais até regiões supramedulares (Fitzgerald et al., 1991).
1.3. – Gliogênese:
1.3.1. – Oligodendrócitos:
Os oligodendrócitos são células gliais maduras que mielinizam os axônios no
SNC. Ao final da geração de motoneurônios na medula espinhal (E14), as células da
linha média ventral periventricular que expressam Olig1/Olig2 tornam-se
progenitores de oligodendrócitos (Zhou et al., 2000). Esta diferenciação parece ser
dependente de SHH (Alberta et al., 2001) e os progenitores gerados migram
dorsalmente e lateralmente através da substância branca e cinzenta, antes de
diferenciar-se em oligodendrócitos (McMahon e McDermott, 2001).
1.3.2 – Astrócitos:
Os astrócitos são originários das células de glia radial da medula espinhal. A
partir de E13 são encontradas células de glia radial (Shibata et al., 1997; McMarron
e McDermott, 2002), nas quais um dos prolongamentos fica ancorado à pia mater e
o outro aderido à superfície ventricular. O processo de transformação da glia radial
medular em astrócitos inicia-se ao final do período de neurogênese, prosseguindo
19
após o nascimento (McMahon e McDermott, 2001; Barry e MacDermott, 2005).
Semelhante à geração de neurônios na medula espinhal, as células de glia, tanto
astrócitos como oligodendrócitos, também parecem ter origem em regiões
específicas e bem delimitadas da zona germinativa da medula (Sun et al., 2006).
1.3.3 – Microglia:
As células da microglia derivam do tecido mesodérmico periférico. No entanto,
ainda não se tem total certeza sobre a identidade dos seus precursores, se são
provenientes de monócitos circulantes do sangue ou de origem extravascular (Chan
et al., 2007). No período pós-natal, os progenitores de células microgliais entram no
sistema nervoso como monócitos derivados da medula óssea (Kaur et al., 2001)
1.3.4 – Células ependimárias:
As células ependimárias são remanescentes das células neuroepiteliais do
tubo neural primitivo. São geradas a partir de E14 – E16 e a diferenciação termina
durante a primeira semana pós-natal (Spassky et al., 2005; Bruni, 1998).
Atualmente, estas células revestem-se de importância devido a sua provável
capacidade progenitora durante o desenvolvimento e no adulto (Johanson et al.,
1999; Coskun et al., 2007), hipótese esta ainda controversa (Doetsch et al., 2003).
20
1.4 – Desenvolvimento pós-natal da medula espinhal de roedores:
Roedores nascem imaturos em relação ao seu sistema motor. A primeira
semana pós-natal é um período muito importante para desenvolvimento da
locomoção e das reações posturais das quais participam os membros de ratos
(Vinay et al., 2004). Este desenvolvimento é dependente da maturação dos sistemas
muscular esquelético e sensorial, dos centros cerebrais superiores, da chegada das
vias descendentes corticais e sub-corticais à medula espinhal e estabelecimento de
conexões intrínsecas entre os interneurônios da medula espinhal (Para revisão ver
Vinay et al., 2004).
As primeiras fibras descendentes a alcançar a medula espinhal têm origem na
formação reticular bulbar e núcleos vestibulares, e chegam em E14-E15 na medula
cervical. No entanto, atingem a medula lombar somente após o nascimento e em P4
a maioria das fibras descendentes do tronco encefálico já atingiram a medula lombar
e encontram-se em fase de estabelecimento de refinamento da circuitaria sináptica
(Lakke, 1997). O trato corticoespinhal, principal via motora voluntária, penetra na
medula espinhal a partir de P0 (Gribnau et al., 1986), com os axônios pioneiros
sendo encontrados na coluna torácica em P3, e na coluna lombar a partir de P7
(Nagashima, 1994; Joosten et al., 1989). A citoarquitetura da medula espinhal está
completa ao final da segunda semana pós-natal (Vinay et al., 2004). A mielinização
axonal aumenta gradativamente a partir da segunda semana pós-natal (Schreyer e
Jones,1982).
Os ramos centrais dos neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal entram
na medula espinhal precocemente (Fitzgerald et al, 1991). As fibras de grande
diâmetro adentram na medula a partir de E15 enquanto as fibras de menor diâmetro
21
(fibras C) somente em E19. Apesar desta entrada precoce, suas terminações
sinápticas só são totalmente estabelecidas ao final da terceira semana pós-natal
(Fitzerald e Jennings, 1999; Mentis et al., 2006). A mediação por receptores NMDA e
purinérgicos, na lâmina II, parece ser importante para a estabilização sináptica que
se desenvolve nesta idade (Bardoni, 2001).
Na primeira semana pós-natal existe intensa sinaptogênese (Bardoni, 2001) e
os interneurônios comissurais já exibem forte circuitaria e são encontrados em
grupos de interneurônios na camada marginal do corno dorsal; no corno ventral e
próximo à linha média (Eide, et al., 1999). Os campos receptivos são maiores e mais
sobrepostos do que em adultos (Fitzgerald e Jennings, 1999). No entanto, a
estimulação dos campos receptivos relacionados as fibras C não provoca respostas
nas células do corno dorsal, respostas estas somente detectadas a partir de P10
(Woolf e Thompson, 1991). Após lesão de nervos periféricos, modificações
sinápticas e estruturais ocorrem no corno dorsal (Bester et al., 2000).
1.5 – Junções comunicantes ( Gap Junctions):
Os tecidos são geralmente formados por uma maioria de células com
características morfológicas ou fisiológicas semelhantes. Estas células precisam
estar coordenadas para o funcionamento normal, e mesmo para a própria formação
destes tecidos. Comunicação intercelular é, por si só, um termo bem abrangente,
pois reunindo uma miríade de formas de transferência de informações entre células,
desde aquelas dependentes de fatores humorais até as que implicam em contato
direto de membrana. É a condição fundamental para a coordenação fisiológica
22
celular e, portanto, para a homeostasia tecidual (Spray e Dermietzel, 1995; Bruzzone
et al., 1996).
A forma fisicamente mais direta de intercâmbio de metabólitos, de mediadores
de excitabilidade elétrica e de sinalização fisiológica celular é representada pela
comunicação dita juncional, dependente de especializações presentes nas regiões
de contato das membranas plasmáticas de células adjacentes, denominadas
junções comunicantes (Gap Junctions – GJ). São encontradas em vertebrados
(White et al., 2004), e organizadas como placas juncionais, isto é, agregados de
canais intercelulares distribuídos regularmente, segundo um padrão semi-cristalino,
hexaédrico em vertebrados superiores. Estas junções encontram-se descritas em
metazoários em geral, e são formadas por duas grandes classes de proteínas,
estruturalmente homólogas, porém geneticamente não relacionadas, as conexinas e
as panexinas, em vertebrados, e proteínas ortólogas às panexinas, as inexinas, em
invertebrados (Phelan, 2005; Bruzzone e Dermietzel, 2006; Shestopalov e Panchin,
2007).
Os canais intercelulares que compõem as placas juncionais conectam as
duas células adjacentes ao nível de suas membranas plasmáticas. Cada canal
intercelular permite o fluxo bidirecional de moléculas de baixa massa molecular (até
pouco mais de 1000 kDa) como íons K+, Ca2+, pequenos carboidratos, aminoácidos
e pequenos peptídeos e segundo-mensageiros como cAMP, cGMP, inositol a,4,5-
trifosfato (IP3). Desta forma, as células são ditas acopladas bioquímica e
eletricamente (Bruzzone e Dermietzel, 2006).
Um canal intercelular é resultado do alinhamento de dois hemicanais, ou
conexons, cada qual composto de um arranjo hexamérico de proteínas juncionais,
as conexinas (Cx), dispostas em torno de um poro hidrofílico (Figura 6) (Beyer et al.,
23
1990). Algumas conexinas são fosfoproteínas, sendo a fosforilação um mecanismo
relacionado à regulação da organização e das propriedades fisiológicas dos canais
juncionais (Lampe e Lau, 2004).
As conexinas são oligomerizadas e então enviadas para a membrana celular
onde formam os hemicanais ou conexons. Os conexons alinhados na formação da
placa juncional obrigam a uma aproximação dos folhetos extracelulares das duas
membranas vizinhas que passa à ordem de 2-4 nanômetros (Zampighi et al., 1988).
Hoje reconhece-se uma família de conexinas e 21 membros clonados no homem e
20 em camundongo (Söhl et al., 2004 e 2005). Destas, cerca de 11 são expressas
no SNC do roedor. As conexinas têm na massa molecular calculada a partir de
análise direta ou de dedução por clonagem da sequência primária de aminoácidos, a
base para a construção da nômina mais amplamente empregada para diferenciar
seus membros, situando-se entre 25 e 62 kDa.
Os conexons podem ser homoméricos, quando formados pela mesma
conexina, ou heteroméricos, quando formados por associações de conexinas
diferentes. O canal juncional pode compor-se por conexons idênticos, em canais
homotípicos, ou diferentes, em canais heterotípicos (Rabionet et al., 2002; Chang et
al., 2003). As junções comunicantes, por sua vez, podem ser classificadas em
homocelulares, quando conectam células de um mesmo tipo, ou heterocelulares,
quando conectam células diferentes (Rouach et al., 2002).
A formação dos conexons e a meia-vida funcional da junção sugerida para
Cx43 situa-se em torno de 1,5 hora (Van Slike e Musil, 2000; Leithe e Rivedal,
2007). Além disso, a fisiologia e a biofísica particulares aos canais intercelulares
formados por cada tipo de conexina parecem relacionar-se primariamente à
24
natureza intrínseca da conexina formadora em questão, e pouco influenciáveis pelo
tipo de tecido (Dermietzel et al., 1991).
As conexinas possuem quatro domínios transmembranares, M1 a M4 (Figura
6), que formam o poro do canal. Estes domínios são conectados com duas alças
extracelulares unidas por pontes de cistina, E1 e E2 (White et al., 1995) e
responsáveis pelo reconhecimento e conexão célula-célula. Os terminais amino- e
carboxi-, além de uma alça intracelular unindo os segmentos M2 e M3, voltam-se
para o citossol. A porção C-terminal é a principal determinante das diferenças de
massa molecular entre conexinas (Evans et al., 2006), por representar o sítio de
maior variabilidade entre seus sub-tipos (Rabionet et al., 2002). É neste terminal que
se concentram os múltiplos sítios de fosforilação das conexinas, reconhecidos, por
exemplo, para proteína C cinase (PKC), proteina cinase mitógeno ativadora (MAPK)
e Src cinase (Solan et al., 2005).
A presença da placa juncional entre células adjacentes não determina sua
funcionalidade à priori. Sensíveis ao estado metabólico e fisiológico celular, os
canais intercelulares juncionais transitam de forma dinâmica entre estados de
fechamento e abertura, por sua vez resultantes de complexos 'chaveamentos'
intramoleculares e interações entre as conexinas e complexos moleculares vizinhos
(Thomas et al., 2005; Hervé et al., 2007). Sabe-se hoje que a propriedade de
abertura dos canais juncionais encontra em elementos básicos da homeostasia
celular, tendo como sítio e graus específicos de fosforilação, voltagem ou
acidificação citoplasmática, os seus principais moduladores (Harris, 2001).
Diferentes conexinas determinam a formação de canais intercelulares com
diferentes graus de permeabilidade. De fato, à massa molecular e, menos
25
Figura 6. A junção comunicante em modelo esquemátic o. a) Placa juncional, hemicanais alinhados para a formação de canais intercelulares, e arranjo hexamérico de conexinas, as proteínas juncionais em estudo nesta tese. Observe-se o estreitamento do espaço intercelular na região de placa juncional; b) Arranjo estrutural de uma conexina na membrana plasmática, destacando-se os 4 segmentos transmembranares, as duas alças extracelulares unidas por pontes de cistina, a alça intracelular e os terminais amino- e carboxi- voltados para o citossol. Adaptado de Sohl et al., 2005.
Conexina Membrana Citoplasma
26
comumente, à carga líquida ou parcial dos permeantes juncionais, somam-se
evidências de que a conformação tridimensional destas moléculas, relativamente à
natureza específica do poro iônico considerado, toma importância na determinação
do repertório possível de agentes intercambiáveis entre as células acopladas.
Coerentemente, o diâmetro interno dos poros juncionais de permeação parece variar
pouco quando se consideram canais intercelulares formados por diferentes
conexinas, situando-se em torno de 12 Å (Harris, 2007); apesar disso, registram-se
valores bem distintos de condutância e permeabilidade (Goldberg et al., 2004). A
variabilidade no comportamento de canais heterólogos (Figura 7) frente a
representantes moleculares de uma mesma família ilustra bem este aspecto da
biofísica da comunicação juncional (Mese et al., 2007; Kanaporis et al., 2008).
Figura 7. Permeabilidade seletiva das junções comun icantes. Junções formadas por diferentes conexinas apresentam diferenças de permeabilidade a moléculas muito próximas quimicamente, como AMPc e GMPc, a exemplo de outras substâncias. Adaptado de Mese et al., 2007.
A comunicação juncional tem se revelado diretamente relacionada à
manutenção da homeostasia, morfogênese e diferenciação celular em vertebrados,
especialmente em estudos com roedores (Spray e Dermietzel, 1995; Bruzzone et al.,
1996). Os processos de crescimento e morte celular também parecem modulados
pelas proteínas juncionais (Vinken, et al., 2006). Mutações em genes que codificam
para conexinas, seus níveis de expressão e/ou estados funcionais têm sido
relacionados a doenças neurológicas como a Doença de Charcot-Marie-Tooth
27
(Braathen et al., 2007), esclerose múltipla (Brand-Schieber et al., 2005) e câncer
(Cronier et al., 2008). As conexinas 32, 36 e 43, isotipos no SNC
predominantemente oligodendrocítico, neuronal e astroglial, parecem envolvidas na
propagação de injúria pós-isquêmica (Frantseva et al., 2002). Além disso, com o
avanço do quadro pós-isquêmico, a expressão de Cx43, por exemplo, parece elevar-
se no foco gliótico, inserindo-se na regulação positiva da proliferação da astroglia
reativa (Haupt et al., 2007).
1.5.1 – Junções comunicantes e o desenvolvimento pó s-natal da medula
espinhal
Durante o desenvolvimento embrionário (Bittman et al., 2002) e pós-natal da
medula espinhal (Chang et al., 1999) o acoplamento celular entre motoneurônios é
extenso. Neste período, vários motoneurônios do corno ventral da medula espinhal
inervam simultaneamente a mesma fibra muscular. Um motoneurônio pode
estabelecer sinapses químicas com várias fibras musculares. No entanto, uma fibra
muscular só estabelece sinapse com um único motoneurônio. A cada conjunto de
motoneurônio e fibras musculares por este inervadas denominamos unidade motora.
A eliminação das sinapses entre motoneurônios e fibras musculares é
necessária ao refinamento da circuitaria motora durante a primeira semana pós-natal
(Thompson, 1985; Colman e Lichtman, 1993). Acredita-se que a exuberância na
comunicação juncional estabelecida transitoriamente entre os motoneurônios esteja
envolvida no processo seletivo de eliminação sináptica. O aumento da atividade
sináptica, presente no início da deambulação, é acompanhado no roedor por
redução drástica do acoplamento celular entre os motoneurônios ao fim da primeira
28
semana pós-natal (Mentis et al., 2002), desaparecendo em animais adultos (Chang
et al., 1999).
Pastor e colaboradores (2003) demonstraram que o acoplamento celular entre
motoneurônios aumenta após a exposição periférica à toxina botulínica durante a
primeira semana pós-natal. Após a interrupção da transmissão neuromuscular,
perifericamente, tem-se a recuperação dos altos níveis de comunicação juncional
entre motoneurônios da medula espinhal, centralmente. Este quadro é reminiscente
do daquele registrado no período embrionário do desenvolvimento da medula,
implicando diretamente o amadurecimento e a funcionalidade das sinapses químicas
periféricas, definindo e estabilizando as unidades motoras, no enfraquecimento e
desaparecimento da rede sináptica elétrica entre os membros da população de
motoneurônios espinhais. Esta regulação negativa da comunicação juncional
medular parece depender também da manutenção da neurotransmissão central local
excitatória, mediada pelo receptor glutamatérgico do tipo NMDA, uma vez que o
bloqueio farmacológico do receptor de NMDA por MK801 torna o acoplamento entre
os motoneurônios da medula espinhal persistente (Personius et al., 2008).
Diversos estudos vêm endereçando uma possível importância da
comunicação juncional para o desenvolvimento da medula espinhal, baseados na
caracterização celular e temporal da expressão de diferentes subtipos de conexinas.
As conexinas 36, 37, 40, 43 e 45 foram encontradas em motoneurônios em
desenvolvimento, desde o período embrionário E15 até o período P4 (Chang et al.,
1999), bem como em outros tipos celulares, neuronais e gliais, da medula espinhal
(Rash et al., 2001).
Enquanto a comunicação juncional está relativamente bem documentada no
corno ventral da medula espinhal, no corno dorsal da medula a literatura é ainda
29
escassa. Quanto à expressão de conexinas nesta região, destaca-se a descrição de
Cx37 (Lin et al., 2002) e de Cx 43 (Li e Nagy, 2000), não identificados, no entanto,
os tipos celulares de expressão, tampouco a funcionalidade das putativas junções
por estas formadas no corno ventral. No artigo de Lin e colaboradores (2002) a lesão
periférica e/ou ativação das fibras de aferência de dor leva ao aumento da
expressão de Cx37 no corno dorsal da medula espinhal. Em estudo complementar,
Li e Nagy (2000) demonstram que a ativação de aferentes de dor que compõem o
nervo ciático leva a um aumento da forma fosforilada da Cx43 no corno dorsal.
Sendo assim, existe um potencial para a formação de acoplamento celular, que é
evidenciado somente após lesão. Desta maneira, estudos prévios do acoplamento
celular no corno dorsal restringem-se a modelos pós-lesão, e revelam uma lacuna
na área, que aguarda por sua investigação na medula espinhal durante o
desenvolvimento e na idade adulta.
1.5.2 – Junções comunicantes na medula espinhal de ratos adultos:
A medula espinhal é uma porção filogeneticamente antiga do SNC. Uma vez
consideradas as sinapses elétricas como formas primitivas de comunicação celular,
pois não são facilmente encontradas em neurônios de mamíferos adultos (Shepherd,
1988), apostava-se mais na exuberância do que na escassez da comunicação
juncional na medula. Ao contrário, no entanto, a surpresa veio de um estudo pioneiro
em roedores adultos, que restringia as evidências morfológicas das junções
comunicantes às superfícies de aposição de membrana entre neurônios sacrais
envolvidos no controle da ejaculação (Matsumoto et al., 1988; 1989).
30
Estudos posteriores, no entanto, desenvolvidos por John Rash e
colaboradores (1996), apresentam evidências morfológicas, por eletromicroscopia,
da presença de junções comunicantes na medula espinhal adulta. O estudo ressalta
as dimensões reduzidas das placas juncionais, que teriam dificultado sua detecção
por grupos anteriores. Utilizando ensaios de crio-fratura, o grupo descreve placas
juncionais estabelecidas entre interneurônios e motoneurônios, em arranjos
sinápticos mistos (i.e., placas juncionais na região de zonas ativas pré-sinápticas e
especializações pós-sinápticas), distribuídos entre as lâminas III e IX de segmentos
lombares da medula espinhal.
Diante dos recursos de clonagem e avanço das técnicas de
imunorreconhecimento, anos mais tarde o mesmo grupo demonstraria a expressão
da Cx36 em contatos homocelulares envolvendo neurônios da medula espinhal
adulta (Rash et al., 2000, 2001). Uma recente evidência funcional da comunicação
juncional na medula veio de estudos em rã adulta, realizados por Bacskai e Matesz
(2002), demonstrando passagem de permeantes juncionais a partir de axônios de
aferentes sensoriais primários para neurônios situados no corno dorsal da medula
espinhal, no tronco encefálico e no cerebelo.
As junções comunicantes, na medula espinhal adulta, são encontradas mais
facilmente entre células não neuronais como astrócitos e oligodendrócitos (Nagy e
Rash, 2000). Sobretudo a rede astrocitária tem sido proposta como responsável pela
criação de domínios medulares de composição metabólica e iônica particulares,
exemplificadas por uma presumível barreira histológica e molecular entre o SNC e o
SNP (Fraher, 1992).
Dentre as conexinas descritas na medula espinhal adulta (CX 26, 30, 32, 36,
43 e 45), a Cx36 parece ser a forma neuronal funcional na medula espinhal de
31
animais adultos enquanto a Cx43 é predominante astrocitária (Rash et al., 2000). No
entanto, em astrócitos medulares foi determinada também a existência das
conexinas 26 e 30. A Cx32 (Rash, et al., 2001) e a Cx45 (Dermietzel et al., 2000)
são encontradas principalmente em oligodendrócitos (Figura 8).
Figura 8. Tipos celulares e conexinas predominantes na medula espinhal de ratos adultos. Adaptado de Rash et al., 2001. E = Epêndima, A = Astrócito, N = Neurônio, O = Oligodendrócito, L = Leptomeninge, Cx = Conexinas, ECM = Matriz extracelular.
Como vimos, no roedor adulto, apesar de contarmos com uma descrição não
puntual da distribuição geral histológica e celular das conexinas e de placas
juncionais por estas formadas na medula espinhal, a funcionalidade destas junções
permanece inexplorada experimentalmente.
1.5.3 – Junções comunicantes e a resposta celular n a medula espinhal após
lesão central ou periférica:
32
As lesões ao sistema nervoso provocam uma série de alterações celulares
que podem ser percebidas ao redor ou a grandes distâncias do local da lesão
(Aldskogius e Kozlova, 1998; Block et al., 2005). Estas respostas variam com a
intensidade e o mecanismo e/ou agente causador da injúria.
Desenvolvem-se nos diversos tipos celulares do sistema nervoso, incluindo
neurônios, astrócitos, microglia, oligodendrócitos, células de Schwann e epêndima,
apresentando, no entanto, perfis fisiopatológicos celulares distintos, em bases de
tempo também distintas (para revisão ver Aldskogius e Kozlova, 1998). Dentre estas
reações fisiopatológicas, incluem-se alterações de expressão de proteínas
juncionais que, se somam àquelas observadas na medula (descritas abaixo), no que
respondem a insultos isquêmicos e manobras de excitotoxicidade induzida
(Sawchuk et al., 1995; Ochalski et al., 1995).
Desde os anos 20, sabe-se que os axônios sensoriais periféricos apresentam
crescimento rápido após lesão, no entanto o ramo central, ao atingir as proximidades
da zona de transição entre o gânglio da raiz dorsal e a medula espinhal, tem o seu
crescimento bloqueado (Aldoskogius e Kozlova, 1998). Quando da lesão periférica,
as reações fisiopatológicas se estendem aos terminais axonais no corno dorsal da
medula espinhal ou tronco encefálico, dependendo se nervos espinhais ou
cranianos, incluindo degeneração do terminal central e axônios, mudanças
moleculares e em proteínas de crescimento, arborização e alterações na
transmissão sináptica (para revisão ver Woolf e Doubell, 1994)
A transecção de nervos espinhais ou cranianos exerce uma rápida resposta
glial no sistema nervoso central. Uma destas respostas é o aumento da expressão
de Cx43 em modelo de lesão do nervo facial, aumento este desenvolvido num
33
período de 45 minutos, ipsilateralmente à lesão, ao redor dos motoneurônios do
núcleo do nervo facial (Rohlmann et al., 1993). Os efeitos da lesão periférica do
nervo facial podem ser percebidos a grandes distâncias, como aumento da
expressão de Cx43 no córtex cerebral após a primeira hora (Laskawi et al., 1997). A
estimulação elétrica do nervo ciático entre 15 minutos e 1 hora aumenta os níveis de
fosforilação da Cx43 no corno dorsal da medula espinhal, ipsilateralmente ao
estímulo, sugerindo, à semelhança do córtex no modelo de lesão ao nervo facial, um
aumento da comunicação juncional mediada por arranjos desta conexina em placas
juncionais funcionais (Li e Nagy, 2000).
As respostas à lesão periférica associadas com conexinas não são exclusivas
de células gliais. Estudos anteriores, mencionados acima no contexto da
comunicação juncional na medula do roedor adulto, relatam o aumento da
expressão de conexinas e de acoplamento, evidenciado por passagem de corantes,
entre neurônios do corno ventral da medula espinhal. Esses eventos ocorrem entre 1
e 4 semanas após a lesão periférica, quando são encontrados grupos de
motoneurônios acoplados na medula lombar de gatos adultos (Chang et al., 2000).
Após lesão direta na medula espinhal, uma série de eventos ocorre dentro
das primeiras horas, estendendo-se até dias. As conexinas têm sido relacionadas
com estes eventos pós-lesão (Lee et al., 2005). Com a transecção completa da
medula espinhal, os níveis de Cx43 são elevados, especialmente na substância
cinzenta rostral ao sítio de lesão, aumentando quatro vezes relativamente ao
controle (Lee et al., 2005). Em experimentos de compressão da medula espinhal,
também são relatados níveis aumentados de Cx43 (Theriault et al., 1997). A
expressão de Cx43 também se encontra relacionada à remielinização da medula
espinhal pós-lesão (Roscoe et al., 2007).
34
Um dos fatores mais necessários à regeneração do sistema nervoso
periférico é a sobrevida neuronal após lesão axonal. A proporção de neurônios
sensoriais no gânglio da raiz dorsal que apresenta sinais de morte celular após
axotomia é de aproximadamente 10 % - 30% (Vestergaard et al., 1997; Tandrup et
al., 2000) em 8 semanas. O índice de morte de motoneurônios da medula espinhal
fica entre 0 - 10% após lesão axonal do nervo ciático (Lowrie et al., 1994; Valero-
Cabre et al., 2001). No entanto, quando a lesão periférica ocorre proximalmente à
medula, o índice aumenta significativamente, estabelecendo-se entre 50 - 80%
(Lowrie et al., 1994; Natsume et al., 2002; Hoang et al., 2003). Neurônios maduros
parecem resistir mais à axotomia do que neurônios jovens (Snider et al., 1992).
O aumento de expressão de conexinas no sistema nervoso pós-lesão parece
relacionar-se a respostas tanto neuronais como astrocitárias. Apesar da
comunicação juncional entre neurônios e astrócitos ter sido sugerida no passado
(Nedergaard et al., 1994) e demonstrada como propriedade transitória dependente
de uma janela temporal relacionada aos níveis de amadurecimento celular in vitro
(Fróes e Campos de Carvalho, 1998, Fróes et al., 1999), ainda se aguarda por
evidências estruturais desta via heterocelular de comunicação juncional (Rash et al.,
2001). Especula-se que em resposta à lesão, tais propriedades pudessem ser
resgatadas, ainda que transitoriamente, relacionando-se positivamente à
regeneração da circuitaria local no SNC (Fróes e Menezes, 2002).
Dentro deste panorama geral da comunicação juncional na medula espinhal
de ratos adultos e no período pós-natal, desenvolvemos nesta tese uma adaptação
técnica pioneira para estudos de comunicação juncional em grandes populações
celulares, a técnica de carregamento de fluorocromos por transecção da medula
espinhal, adaptada da técnica de carregamento por transecção descrita
35
anteriormente por nosso grupo (Menezes et al., 2000), e analisamos a distribuição
do acoplamento juncional em populações celulares no adulto e no pós-nato, dando
ênfase ao pouco estudado corno dorsal da medula espinhal. Em ambos os modelos
identificamos padrões de distribuição de redes celulares acopladas e mostramos
modificações destes padrões por manobras de lesão periférica em paradigmas de
resposta pós-lesão imediata (45 minutos, no adulto e neonato) e tardia (7 dias, no
adulto). Desta forma, pretendemos contribuir para a detecção e composição celular
de grandes redes de comunicação juncional presentes no desenvolvimento do SNC
e no adulto, e para o entendimento do possível papel desta forma de comunicação
na resposta tecidual e celular pós-lesão.
36
2 – OBJETIVOS
2.1 – Objetivo geral:
Demonstrar a distribuição histológica e a composição celular de redes de
comunicação juncional na medula espinhal de ratos em desenvolvimento e adultos,
bem como sua possível modificação em resposta a manobras de lesão periférica.
2.2 – Objetivos específicos:
1 - Estabelecer o método de “Transection Loading” para o uso em medula espinhal
tanto em neonatos e adultos.
2 - Caracterizar o padrão de acoplamento celular na região da intumescência lombar
da medula espinhal em desenvolvimento e no adulto.
3 - Identificação das alterações na comunicação juncional na medula espinhal após
lesão por transecção do nervo ciático.
4 - Análise dos efeitos sobre o acoplamento celular na presença de bloqueio
farmacológico das junções comunicantes.
37
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Animais:
Para o desenvolvimento deste trabalho utilizamos ratos Wistar, machos e
fêmeas, em idades pós-natais (P3-P4) e ratos adultos entre 1 e 3 meses de idade,
sendo considerado como P0 o dia do nascimento. Os animais pós-natais foram
anestesiados por hipotermia. Os adultos foram anestesiados por injeção
intraperitoneal de Cloridrato de Xilazina (500mg/Kg) e Cloridrato de Quetamina
(500mg/Kg). Estes experimentos foram realizados de acordo com os procedimentos
e normas do NIH (National Institute of Health) e este projeto foi submetido à
Comissão de Ética com Uso de Animais do CCS (CEUA-CCS).
3.2 – “Transection Loading”:
Para verificarmos o acoplamento funcional utilizamos um ensaio denominado
“Transection Loading”, carregamento de corantes por transecção. A técnica foi
adaptada do carregamento por corte (Scrape loading) utlizado por El Fouly e
colaboradores (1987), e descrita por Menezes e colaboradores (2000) para
observação do acoplamento celular na zona subventricular pós-natal.
Após rápida retirada da medula espinhal através de laminectomia, e cortes de
dissecção nas extremidades torácica e sacral, a intumescência lombar torna-se
facilmente identificável, principalmente pelo seu maior diâmetro, tanto em neonatos
como em adultos. O segmento medular lombar é então colocado em solução salina
de Gey (Gey’s basal salt solution; GBSS) gelada (4 oC) por 1 minuto. Em seguida
38
mergulhados em solução salina tamponada com fosfato livre de Ca2+ e com EGTA
(2mM) (PBS Ø Ca2+) por 1 minuto. A seguir transferimos para superfície plana e
realizamos uma única transecção, coronal, na medula espinhal, para permitir o
carregamento dos fluorocromos (corte de carregamento).
A porção de medula espinhal transeccionada é imersa em uma solução de
fluorocromos, consistindo de Lucifer Yellow (LY) (~443Da após ionização em
solução salina) e Rodamina Dextrana (RD) (3000 Da) (Molecular Probes),
respectivamente a 0,25% e 0,30% (m/v) em Ø Ca2+, por 1,5’. Os segmentos foram
lavados em GBSS por 3 minutos à temperatura ambiente, fracionados em 3 etapas
de um minuto, e fixados em paraformaldeído (PFA) 4% por imersão durante 2h. As
medulas foram então cortadas em vibratomo (Vibratome 3000, Vibratome Co) (60
µm/fatia) ou então crioprotegidas em um gradiente crescente de sacarose (10 e 20%
- m/v). Estas últimas são incluídas em OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura) e
cuidadosamente orientadas para criossecção ortogonal (12 µm a 16 µm de
espessura) em relação ao corte de carregamento, em criostato, para observarmos o
espalhamento dos corantes na profundidade da medula espinhal (cortes
parassagitais ou horizontais). Algumas medulas foram cortadas também
coronalmente (paralelo ao corte de carregamento). As mesmas variações na
orientação dos cortes foram utilizadas no procedimento realizado com o vibratomo.
Os cortes obtidos no criostato são coletados em lâminas gelatinizadas e pós-fixados
em vapor de PFA. Os cortes obtidos com o vibratomo são coletados em PBS, e
podem ser armazenados por até 30 dias flutuando a 4 oC. Uma parte dos cortes
obtidos no vibratomo são processados para determinação fenotípica por
processamento imuno-histoquímico. Todos os cortes são lavados em PBS e
marcados com 4’, 6’-diamidina-2’-fenilindol (DAPI, Sigma), um marcador nuclear que
39
revela a arquitetura tecidual. Após 3 lavagens com PBS, lâminas foram cobertas
com lamínula de vidro utilizando meio de montagem N-propilgalato em glicerol e
seladas com esmalte. As lâminas foram analisadas ao microscópio óptico invertido
(TE200, Nikon), fotografadas com câmera digital CoolSnap-Procf monocromática
(Media Cybernetics). Para análise e aquisição de imagens também foi utilizado
microscopia confocal (LSM 510, Zeiss).
Ambos os fluorocromos utilizados são hidrofílicos (não atravessam
membranas plasmáticas íntegras; desta forma apenas células lesadas durante o
corte de carregamento incorporam os corantes). No entanto, só o LY permeia
junções comunicantes, em virtude do seu baixo peso molecular; e a RD retida nas
células inicialmente marcadas pelo corte de carregamento, funciona como controle
da lesão e origem do espalhamento do corante permeante. Pela distribuição destes
dois fluorocromos temos um panorama do acoplamento juncional na medula
espinhal em desenvolvimento e no adulto. Verifica-se, então, a existência de 2
categorias de células marcadas: 1. Células duplamente marcadas com LY e RD
(LY+RD+), ou seja, células que foram lesadas pela secção, servindo de “porta de
entrada” para os corantes. A maioria destas células localiza-se próximo a superfície
do corte de carregamento, mas há algumas delas mais profundamente no tecido.
Assume-se que a dupla marcação de células profundamente situadas ocorra por
secção dos longos prolongamentos celulares e transporte retrógrado dos
fluorocromos através destes. 2. Células marcadas apenas com LY (LY+RD-), mono-
marcadas, evidenciam o acoplamento juncional, já que somente este permeia
junções comunicantes (Figura 9).
40
Figura 9. Esquema ilustrativo do padrão de marcação esperado a partir da técnica de carregamento por transecção. As categorias de marcação obtidas a partir do ensaio de “transection loading” são: 1) células marcadas com ambos os corantes LY e RD (LY+RD+), células carregadas diretamente; 2) células marcadas apenas com LY (LY+/RD-), células acopladas.
LY+RD+ LY+RD-
41
3.3 – Imuno-histoquímica:
Para as reações de imuno-histoquímica, foram utilizados cortes coronais
obtidos no Vibrátomo (Vibratome 3000, Vibrotome Co). Os cortes são lavados 3
vezes de 5 minutos com solução salina e tampão fosfato (PBS, 10mM e pH 7.4). Em
seguida, incubados com soro bloqueador por 2 horas em solução de PBS com
0,03% de Triton-X 100 (Reagen, USA) contendo 10% de soro de cabra (solução de
bloqueio). Logo depois são incubados com anticorpos primários diluídos em solução
de bloqueio por 24 horas a 4 oC. Em seguida os cortes foram lavados três vezes de
5 minutos com PBS e incubados por 2h, à temperatura ambiente, em solução de
bloqueio com anticorpos secundários.
Para detecção de fenótipo neuronal utilizamos o anticorpo monoclonal contra
classe III β-tubulina (Covance 1:500) feito no camundongo; para identificação de
subtipos de interneurônios utilizamos os anticorpos policlonais contra calbindina
(Cell signaling technology 1:200) e parvalbumina (Chemicon, 1:200) para
identificação de fenótipo glial usamos anticorpo policlonal contra GFAP (proteína
glial fibrilar acídica – Dako, USA; 1:400) feito no coelho; a expressão de conexina
Cx43 foi identificada com o anticorpo monoclonal especifico (Zymed, USA; 1:200);
feita no camundongo, ou pelo anticorpo policlonal especifico cedido pelo Dr. Juan
Saez (PUC, Chile; 1:500).
Utilizamos os seguintes anticorpos secundários feitos na cabra: contra IgG de
coelho conjugado à FITC (Accurate, USA; 1:100); contra IgG de camundongo
conjugado à Cy3 (Jackson ImmunoResearch, USA; 1:50 e 1:200); ou Alexa Flúor
488 (Molecular Probes, USA; 1:200). Para o controle da reação os primários foram
omitidos.
42
3.4 – Distribuição do acoplamento celular na medula espinhal:
Para estudarmos a distribuição do acoplamento celular na medula espinhal
através do “transection loading” como descrito acima, foram realizados cortes
coronais de 60 µm no vibrátomo. Três cortes foram escolhidos com diferentes
distâncias do corte de carregamento. 60 µm, 120 µm e 360 µm. As células marcadas
com RD e também as LY+RD- foram registradas utilizando o software Canvas X.
Após todas as células estarem sinalizadas as LY+RD- ficam destacadas. Estas são
então quantificadas e sua distribuição no eixo ântero-posterior e crânio-caudal foram
desenhadas.
3.5 – Lesão do nervo ciático:
Para estudarmos os efeitos provocados pela lesão periférica em uma
estrutura central (medula espinhal), realizamos uma transecção prévia do nervo
ciático. Para tanto, animais pós-natais (N=3) foram submetidos à anestesia por
hipotermia por 5 minutos, em seguida é realizada uma rápida incisão na fossa
poplítea direta dos animais. Os músculos são afastados e o nervo ciático exposto,
para em seguida com uma tesoura afiada, o nervo ciático ser seccionado. A pele é
imediatamente unida com a aplicação de cola de cianoacrilato. Estes animais
permanecem vivos por 45 minutos e logo após seguem o protocolo de “transection
loading” ou imuno-histoquímica. Os animais controles não receberam a transecção
do nervo ciático.
43
Para realização de transecção do nervo ciático em ratos adultos (N=4), os
animais foram previamente anestesiados com éter. Em seguida foram anestesiados
com uma injeção de Cloridrato de Quetamina (500mg/Kg) e Cloridrato de Xilazina
(500mg/Kg) intraperitonialmente. Em um período aproximadamente de 30 minutos,
foi realizado uma incisão na região posterior da coxa direita, os músculos afastados
e o nervo ciático então exposto. Utilizando uma tesoura de ponta fina, o nervo ciático
é seccionado, e a pele é imediatamente unida com a aplicação de cola de
cianocrilato. Estes animais permaneceram vivos entre 45 minutos (2 animais) até 7
dias (2 animais) após a lesão, variando de acordo com o objetivo de cada
experimento.
3.6 – Bloqueio do acoplamento celular com Carbenoxo lone (CBX) e ácido
flufenâmico (AFF):
Para determinar a natureza do acoplamento celular através de junções
comunicantes. Utilizamos drogas reconhecidas como bloqueadores parciais de
junções comunicantes (para revisão ver: Salameh e Dhein, 2005). Foram utilizados
Carbenoxolone (Ácido 3 β–hidroxi-11- oxooleano-12-eno-30-oico-3-hemissuccinato
CBX; Sigma) a uma concentração de 100-200µM (Davidson e Baumgarten,1988;
Van Haarst et al., 1996) e o acido flufenâmico (Sigma) também a uma concentração
final estimada entre 100 µM.
O CBX foi aplicado diretamente no líquido cérebro espinhal dos ratos adultos
através de injeção raquimedular com micropipeta de vidro (1-2µL) de CBX (5mM; em
água destilada) para obter uma concentração de final de 100-200µM no espaço
extracelular do SNC (supondo o volume de líquor no adulto de 250µl; Burns et al.,
44
1976). Os animais foram mantidos vivos pelo período de 30 minutos e
imediatamente anestesiados e submetidos a técnica de transection loading.
Para diluição do AFF foi usada uma solução de 3:2 de DMSO:etanol. Os
experimentos com AFF foram realizados com animais neonatos na idade de P4, foi
usada uma concentração de 100µM diluídos diretamente na mistura de corantes
(3µL/15µL). As soluções GBSS e PBS Ø Ca2+ também receberam adição de AFF
na mesma concentração. Os procedimentos do “transection loading” foram
realizados seguindo o mesmo protocolo descrito acima. Em animais controle os
meios e corantes eram diluídos com a solução de diluição do AFF.
Para quantificar o acoplamento celular na medula espinhal de ratos neonatos
em experimentos com adição de AFF foram utilizados 6 animais diferentes. Em 3
destes realizamos TL com adição de AFF. Utilizamos 3 animais para controle, sem
adição de AFF. Outro animal foi submetido ao TL com o veículo do AFF e a
quantificação do número total de células e do acoplamento foi similar aos animais
controles. O corno dorsal foi escolhido para quantificação, pois é onde normalmente
encontramos maior número de células acopladas através de TL. As lâminas I, II e III,
são identificadas e demarcadas definindo a área a ser quantificada. O número de
células acopladas é comparado em relação ao número total de células da área,
gerando assim uma proporção de acoplamento. Todos os cortes quantificados
estavam entre 120 µm – 300 µm do corte de carregamento.
3.7 – Quantificação do acoplamento celular nos expe rimentos de transecção
do nervo ciático em ratos neonatos e adultos:
45
Para quantificar o acoplamento em ratos neonatos utilizamos um número de 5
animais. Destes, 3 receberam transecção de seu nervo ciático unilateralmente
(ciático direito) e 2 animais não receberam lesão no nervo ciático. Para quantificar o
acoplamento celular em animais adultos utilizamos 6 animais (4 com lesões nos
nervos ciáticos e 2 animais sem lesão).
Para cada medula cortada coronalmente escolhemos 1 corte localizado entre
120 µm – 300 µm de distância do corte de carregamento. A região correspondente
as lâminas I, II e III do corno dorsal foram demarcadas e então as células RD+ foram
contadas e em seguida as células que apresentavam somente LY (LY+RD-). O
número total de células marcadas no corno dorsal foi identificado através da soma
das células LY+RD- mais as células RD+. A proporção de células acopladas foi
calculada utilizando o número de células LY+RD+ sobre o número total de células
LY+RD- nas lâminas superficiais do corno dorsal.
As lâminas escolhidas para quantificação foram aquelas que possuíam os
dois cornos dorsais presentes, nas camadas mais superficiais. Para efeito de
comparação utilizamos o lado contralateral à lesão e também as lâminas dos
animais sem lesão do nervo ciático.
46
4 – RESULTADOS
O método de carregamento por transecção (“transection loading”, TL) foi
desenvolvido em nosso laboratório para demonstração do acoplamento juncional em
populações celulares do telencéfalo pós-natal, tendo focalizado mais
sistematicamente a zona subventricular pós-natal (Menezes et al., 2000). Este
método vem sendo empregado no estudo de redes de células acopladas em várias
regiões do sistema nervoso central em desenvolvimento (Barbosa L, 2007 – Tese de
Mestrado, Silva M, 2003 - Tese de mestrado; e outros resultados não publicados).
No presente trabalho, demonstramos a eficiência da técnica (TL) para revelar o
acoplamento celular mediado por junções comunicantes na medula espinhal em
desenvolvimento e no adulto (ver adiante).
4.1 – O carregamento de corantes por transecção da medula espinhal revela
padrões esperados de marcação intracelular em ratos neonatos:
No presente estudo, analisamos especificamente a região da intumescência
lombar (L1 – L5) correspondendo aos segmentos vertebrais T12 – L1. Células
marcadas foram classificadas entre aquelas com ambos os corantes (LY+RD+) e
aquelas com apenas LY (LY+RD-). Ambas eram identificáveis consistentemente em
100% das cortes histológicos processadas a partir das medulas submetidas ao TL.
No entanto, o número de células marcadas por corte de carregamento é variável. A
quantificação, na forma de razões entre células LY+RD- e LY+RD+, como explicado
mais abaixo, permite uma normalização em relação à variabilidade no carregamento.
47
Figura 10. Fotomicrografia da medula espinhal após “transection loading”. Em B, note o local de corte de carregamento (cabeça de seta branca), região onde ocorre a entrada de corantes. Notamos células marcadas com LY a variadas distâncias do corte de carregamento (box). Em D e E, Maior aumento da figura B, com marcação para LY e RD. Note as células acopladas (setas brancas). F e G representam um maior aumento das figuras D e E. Note as células acopladas (setas brancas) em H e I, Maior aumento da figura F e G com marcação para RD. As setas indicam a ausência de marcação de RD. Barra de calibração: B e C = 100 µm. D e E = 20 µm. F,G,H e I = 20 µm.
48
Críticas para uma marcação eficiente e mais homogênea são a velocidade da
dissecção e a manutenção da integridade da medula durante o procedimento. Sendo
assim, alguns procedimentos experimentais foram descartados da análise por
apresentarem entradas ectópicas de corante, em decorrência, por exemplo, de
rupturas no tecido provocadas quando da manipulação do dissecto ou por baixa
higidez tecidual.
A figura 10 A, constitui-se na representação esquemática de um segmento de
medula submetida ao TL e seccionada parassagitalmente ao criostato. Na Figura 10
B, é possível identificar claramente os sítios de entrada dos corantes na borda do
corte de carregamento (cabeças de seta brancas). O espalhamento pelas bordas
dorsal e ventral deve-se ao espalhamento pela pia-máter. Algumas células
encontram-se em regiões distantes dos sítios de entrada do corante (Fig. 10 B, box),
muitas LY+RD+ conforme evidenciável na amplificação na Figura 10 G, sugerindo
que a chegada dos dois fluorocromos acontece por difusão através de longos
prolongamentos axonais e/ou dendríticos atingidos pelo corte de carregamento.
Encontramos células marcadas pelo procedimento de TL tanto no corno
dorsal como no corno ventral da medula. Exemplos de marcação no corno ventral
sugerem que o procedimento atingiu os grandes motoneurônios desta região, além
de pequenas células (Figs. 10 E, G); no corno dorsal, pequenas células (Figs. 10 D,
F). Em ambos os casos, identifica-se células LY+RD+ consideradas como
carregadas diretamente pelo corte de carregamento (Figs. 10 F, G), e células
LY+RD- consideradas como acopladas por corante (Figs. 10 F, G – setas brancas).
49
4.2 – Distribuição espacial do acoplamento celular na medula espinhal do rato
neonato:
Em cortes coronais (tangenciais ao corte inicial de carregamento) é possível ver as
células diretamente carregadas ou acopladas distribuídas por todas as laminas da
medula espinhal (Fig. 11). O corno dorsal apresenta consistentemente os maiores
números de células carregadas diretamente e de células acopladas. Apesar de
detectarmos um número significativo de células diretamente carregadas no corno
ventral, números proporcionalmente menores representam as células LY+RD-
marcadas, portanto, acopladas nesta região. A figura 11 apresenta cortes coronais
revelando a distribuição do permeante LY e do não-permeante RD, a distâncias
variadas da superfície de corte-carregamento medular e as respectivas
representações esquemáticas dos perfis duplo- e LY+RD--marcados, quantificados
como razões da primeira sobre esta segunda categoria. Um aspecto interessante é a
redução, consistente entre diferentes experimentos, do número total absoluto de
células marcadas (LY+RD+ e LY+RD-) à medida que aumenta a distância do corte
de carregamento. No exemplo mostrado, em no corte distante 60 µm da superfície
de carregamento registramos 1010 células carregadas diretamente e 78 acopladas
(Figs. 11 A-C). Em cortes a 360 µm de distância, por sua vez, contabilizamos 207
células duplo-carregadas e 17 acopladas (Fig. 11 D-F). Podemos notar, portanto,
que o número de células acopladas também diminuiu. A redução no número de
células diretamente carregadas com o distanciamento da superfície de corte-
carregamento se dá na mesma proporção da redução no número de células LY+RD-
, resultando em razões de acoplamento relativamente constantes. Quanto mais
distante do corte de carregamento, 720 µm em diante, torna-se ainda
50
Figura 11. Distribuição do acoplamento na medula espinhal durante o desenvolvimento pós-natal. O acoplamento celular pode ser identificado em todas as lâminas da medula espinhal longitudinalmente. Em A, B, D, E, G e H, fotomicrografias de um cortes coronais de medula espinhal à 60 µm, 120 µm e 360 µm do corte de carregamento. Em C, F e I, desenhos esquemáticos demonstrando o padrão de acoplamento na medula espinhal longitudinalmente. O número de células LY+RD+ são representados pelos pontos vermelhos. Os pontos verdes representam células LY+RD- e são apresentadas as distâncias do corte de carregamento. Note que a porcentagem de células acopladas se mantém uniforme, mesmo com a variação do total de células marcadas. Barra de calibração: Em todas as figuras 50 µm.
51
Figura 12. Células marcadas com LY e RD são encontradas a grandes distâncias do corte de carregamento. Em A e B, Fotomicrografias de cortes coronais de medula espinhal à 720 µm do corte de carregamento. Em C e D, cortes coronais de medula espinhal à 1180 µm do corte de carregamento. Em E e F, maior aumento da imagem em C e D. Note algumas células acopladas (cabeça de seta) na putativa lâmina IV. Células acopladas também são encontradas na lâmina I (setas). Barra de calibração: Em A, B, C e D = 100 µm. Em E e F = 20 µm.
52
mais evidente uma distribuição não homogênea de células diretamente carregadas
(Figs. 12 A, B).
As regiões mais densamente povoadas por células marcadas parecem
corresponder às lâminas I, III, IV-VI. Nestas lâminas encontram-se células com
longos prolongamentos intersegmentares comissurais e ipsilaterais e neurônios com
conexões espino-talâmicas, reticulares e/ou tectais (Eide et al., 1999; Polgar et al.,
2007).
As Figuras 12 C-F confirmam a eficácia de nosso método em revelar
carregamentos diretos e perfis de acoplamento a longa distância da superfície de
corte-carregamento. Esta é uma importante observação, pois fala a favor de uma
difusão eficiente e equivalente, dentro da janela de tempo adotada para a difusão,
de ambos os corantes, permeante e não-permeante. A diminuição da intensidade de
fluorescência para ambos os corantes, no entanto, afeta sobretudo a detecção da
marcação por RD, que precisa de um maior tempo de exposição e maiores
aumentos para ser detectada (Figs. 12 E, F). Esta diferença passa a ser importante
a partir de 800 µm. Por este motivo, para assegurar um nível ótimo de detecção de
ambos os corantes, optamos por limitar a análise quantitativa à distância de até 300
µm da superfície de corte-carregamento.
4.3 – Diversos tipos celulares encontram-se acoplad os na medula de ratos
neonatos:
Nas células carregadas diretamente, os corantes permitem visualizar a
morfologia das células, preenchendo, além do núcleo, o citoplasma e até os mais
finos prolongamentos. Com isso podemos identificar diversos tipos celulares da
53
Figura 13. Acoplamento celular no corno ventral da medula espinhal. Fotomicrografia de fluorescência de cortes coronais do segmento lombar da medula espinhal após “transection loading”. Algumas células encontram-se acopladas (LY+RD-) no corno ventral. Em A. DAPI demonstrando a citoarquitetura da medula espinhal. Em B, marcação de RD no corno ventral. Em C, dupla marcação LY (verde) RD (vermelho). Em D e E, maior aumento da figura B e C, note um motoneurônio (seta) LY+RD-. Em F e G, maior aumento de B e C, note células de pequeno tamanho ao lado de motoneurônios (setas). Quadrado em A, representa a área estudada. Quadrados em C, representam as regiões das figuras D, E, F e G. Em A = 100 µm, em B e C = 10 µm e em D, E, F e G= 5 µm
54
Figura 14. Diferentes tipos celulares são encontrados no corno ventral de ratos neonatos após TL. Em A e B, imunomarcação para GFAP. Em C e D, Note a grande expressão de Tuj1 em células do corno ventral. Em E e F, uma possível célula de Renshaw imunomarcada para calbindina (vermelho) e LY (verde). Em G e H, imunomarcação para parvalbumina. As setas indicam células duplamente marcadas. Todas as figuras possuem barra de calibração de 20 µm
55
medula espinhal pelas suas morfologias características, tanto no corno ventral (Figs.
13, 14) como no corno dorsal (Figs. 15, 16).
As Células LY+RD- encontradas no corno ventral (Figs. 13, 14) estão
dispersas nas colunas motoras medial e lateral. Identificamos raros motoneurônios
(corpo grande, núcleos pálidos) entre as células acopladas (Fig. 13 D, E),
confirmando trabalhos anteriores (Chang et al., 1999; Chang e Balice-Gordon, 2000;
Personius et al., 2001). Acreditamos que a escassez destes perfis se deva ao
carregamento direto destas células pelos nervos espinhais, dado que grande parte
destes motoneurônios encontrava-se marcada duplamente (LY+RD+). Uma
conseqüência disto é a subestimativa que estaríamos fazendo da contribuição
relativa de motoneurônios para as redes de acoplamento na medula do neonato, no
entanto, o método não se aplica e não pretende à análise de números absolutos,
mas ao levantamento dos possíveis parceiros celulares na definição destas redes de
comunicação juncional, como numa primeira análise. Inesperadamente encontramos
algumas células acopladas por corante (LY+RD-) de menor tamanho junto ao grupo
de motoneurônios, sugerindo serem interneurônios ou células gliais (Fig. 13 F, G -
setas).
Através dos ensaios de imuno-histoquímica conseguimos identificar os
diferentes tipos celulares marcados através desta técnica. Raras células carregadas
com LY foram marcadas positivamente para GFAP no corno ventral e no corno
dorsal (Fig. 14 A, B e 16 A, B). E a quase totalidade das células marcadas
expressam o isotipo classe III da beta-tubulina neurônio-especifico, identificado pela
marcação com o anticorpo Tuj1 (Fig. 14 C, D e 16 C, D). Células de Renshaw foram
marcadas junto a grupos de motoneurônios, e identificadas através de marcação
para calbindina (Fig. 14 E, F). Conseguimos encontrar pequenas células
56
marcadas para calbindina (Fig. 14 E, F). Conseguimos encontrar pequenas células
marcadas também com parvalbumina no corno ventral (Fig. 14 G, H).
Dorsalmente, encontramos uma região de contorno com alta densidade de
células carregadas (Fig. 15). Algumas apresentam-se acopladas, exibindo
exclusivamente o permeante LY. As células acopladas ocupam todas as lâminas I-VI
de Rexed. Algumas destas células representam claramente neurônios multipolares,
similares a interneurônios proprioespinhais (Fig. 15 D, E) (Bareyre et al., 2004;
Dutton et al., 2006). No entanto, as células acopladas mais distantes do corte de
carregamento constituem, em sua maioria, pequenas células arredondadas,
prevalentes na lâmina I, porém também presentes nas lâminas II, III e IV de Rexed
(Han et al., 1998) (Fig. 15 B).
Muitas das células carregadas no corno dorsal são possivelmente
interneurônios sensoriais. No entanto, a possibilidade de serem astrócitos não pode
ser descartada, apesar de encontrarmos escassas células carregadas expressando
GFAP nas lâminas I e II. A participação de interneurônios é reforçada pela
expressão, entre as células carregadas, dos marcadores interneuronais calbindina
(Fig. 16 E, F), e parvalbumina (Fig. 16 G, H), este último em raros perfis. Apesar de
não ilustrado, estes perfis eram identificáveis em diversas lâminas do corno dorsal.
4.4 – O Acoplamento celular está presente no epêndi ma de ratos neonatos:
Além de nos permitir mostrar, pela primeira vez, a presença de acoplamento
celular no corno dorsal da medula espinhal (Fig. 15), esta técnica revelou-nos
acoplamento na camada ependimária, ao redor do canal central medular, no período
pós-natal (Fig. 17).
57
Figura 15. Acoplamento celular no corno dorsal da medula espinhal. Fotomicrografia de fluorescência de cortes coronais do segmento lombar da medula espinhal após “transection loading”. Algumas células encontram-se acopladas (LY+RD-) no corno dorsal. Em A. DAPI demonstrando a citoarquitetura da medula espinhal. Em B, marcação de RD no corno dorsal. Em C, dupla marcação LY (verde) RD (vermelho). Em D e E, maior aumento da figura B e C, note células acopladas na lâmina III (setas) LY+RD-. Em F e G, maior aumento de B e C, note células de pequeno tamanho na lâmina I (setas) Quadrado em A representa a área examinada. Em A=100 µm, em B e C= 20 µm e em D, E, F e G= 10 µm
58
Figura 16. Diferentes tipos celulares são encontrados carregados com LY no corno dorsal da medula espinhal neonatal após o TL. Em A e B, marcação para GFAP. Em C e D, marcação para Tuj1. Em E e F, marcação para Calbindina. Em G e H, marcação para Parvalbumina. I e II, representam as lâminas da medula espinhal. CB = calbindina, PV = parvalbumina. As setas indicam células positivas para os imunomarcadores e também LY+. Barra de calibração. Em A, B, C, D, E e F = 20 µm. Em G e H, 10 µm.
59
Encontramos um grande número de células acopladas na camada de células
ependimárias. Em cortes horizontais foi possível detectar células a grandes
distâncias do corte de carregamento. Algumas células acopladas estão muito
próximas à luz ventricular, reforçando sua identificação como células ependimárias
(Fig. 17 D). No entanto, podemos encontrar células acopladas fora da camada
ependimária propriamente dita, que talvez representem neurônios ou células gliais
(Fig. 17 D, E).
4.5 – O acoplamento celular é também revelado por c arregamento através dos
nervos espinhais na medula espinhal do rato neonato :
Quando a medula espinhal é dissecada contendo um grande número de
segmentos (3-5 segmentos) um número correspondente de nervos espinhais
permanece aderido. É possível que estes nervos possam captar e constituir-se numa
via de entrada destes corantes para dentro da medula. Com o intuito de estudar a
contribuição desta captação, em alguns experimentos não realizamos cortes de
carregamento nas medulas dissecadas. Em lugar do procedimento padrão,
mergulhamos os dissectos de medula na mistura de corantes após lavagem com
PBS Ø Ca2+. Nos segmentos próximos à região de excisão da medula da caixa
vertebral houve entrada de corantes, de forma análoga ao descrito em ensaios onde
a medula é transectada nos segmentos lombares; neste caso, detectamos, conforme
o previsível, um grande número de células acopladas a relativamente curtas
distâncias da superfície transectada para a excisão da medula, número este que
diminuía progressivamente a longas distâncias, do corte, distantes também da
região de medula lombar, de eleição para os ensaios padrão de TL. Dentre as
60
Figura 17. O acoplamento celular no epêndima de ratos neonatos. Podemos observar que o acoplamento celular ocorre na camada de células ependimárias através da técnica de “transection loading”. Em A. Marcação com DAPI, para visualização da citoarquitetura da medula espinhal. Em B e C, LY e RD respectivamente. Em D, dupla marcação para identificação das células acopladas. Observamos várias células acopladas na camada ependimária e a alguns milímetros desta camada (cabeças de setas). CC, canal central. Barra de calibração= 10 µm.
61
células marcadas com LY, algumas ocupavam o corno dorsal e também o corno
ventral. No corno ventral, algumas células puderam ser vistas, e com características
de motoneurônios.
Para diminuir a captação por estas portas de entrada produzidas pela
dissecção, em um grupo de experimentos, as medulas foram colocadas em solução
de meio rico em cálcio (GBSS) para o fechamento das células cortadas durante a
dissecção, inclusive os nervos espinhais, e imediatamente mergulhadas na mistura
de corantes sem cálcio. Não houve marcação significativa de células com LY+RD-
(Figs. 18 e 19). As poucas células marcadas provavelmente receberam os corantes
através secção de seus longos axônios dentro da própria medula espinhal, ou
através de lesão feita após a retirada da medula espinhal da solução de alto cálcio.
Em cortes coronais da medula espinhal, distantes das regiões de entrada do
corante, encontramos uma diminuição expressiva no número de células marcadas.
Podemos notar que nos locais onde ocorreram lesões no tecido durante o
procedimento de TL, existe um grande número de células LY positivas (Fig. 18 –
cabeças de seta). No entanto, no lado contralateral à lesão tecidual não
encontramos um número expressivo de células marcadas com LY. Sendo assim,
demonstramos que a entrada de corantes pelo nervo está eventualmente presente,
mas deve responder por uma parcela pequena do total de perfis celulares
carregados. Nossos dados, portanto, valorizam as superfícies de corte-
carregamento com as maiores fontes de fluorocromos e de carregamento celular
direto e por acoplamento. Aplicando estas conclusões aos nossos dados, temos por
exemplo que, no corno dorsal, em regiões compatíveis com segmentos distantes dos
cortes de dissecção, e de áreas de possíveis lesões pós-dissecção, regiões pobres
62
Figura 18. Captação de corante através dos nervos periféricos. Quando os corantes são colocados sobre os nervos espinhais seccionados encontramos marcação celular tanto no corno ventral, quanto no corno dorsal. Em A, podemos observar o ponto de entrada principal dos corantes (seta verde). No entanto, somente utilizamos segmentos distais a este ponto de entrada, justamente para evitar as células marcadas através do corte/carregamento. Um segundo corte é realizado (linha pontilhada) para separar o local de entrada do corante dos segmentos mais distais. Alguns pontos apresentam lesões teciduais (seta vermelha) provocadas posteriormente a dissecção, desta forma servindo como fonte de entrada secundária para os corantes. Em B e C, cortes longitudinais de medula espinhal ao nível do corno dorsal e ventral, respectivamente. Note a diferença de marcação entre os dois lados da medula espinhal. No lado em que ocorreu lesão tecidual houve entrada do corante deixando um rastro rostro-caudal (seta branca). Em D e E, maior aumento de área central da figura B e C, demonstrando células marcadas com LY através de marcação por nervo espinhal. Barra de calibração, Em B e D, 100 µm. Em C e E, 20 µm.
63
Figura 19. Imagens de microscópio confocal demonstrando o a distribuição do acoplamento celular após entrada do corante pelo nervo espinhal em animais P4. Note que a passagem de corantes é restrita a algumas poucas células no corno dorsal. Estas encontram-se nas regiões correspondentes a lamina I e II de Rexed e profundamente na camada IV. Em A, localização dos grupos celulares acoplados na medula espinhal. Um grupo de células acopladas nas laminas I e II (A1) e grupo de células na camada IV (A2). Em C e D, podemos notar as células da camada I e II e seus respectivos acoplamentos (setas). Em E e F, grupo de células acopladas na camada IV da medula espinhal (setas). Barra de calibração,em B 100µm. Nas demais figuras 50 µm.
64
ou totalmente desprovidas de células marcadas foram identificadas. São
encontradas mais uma vez, pequenas células acopladas nas lâminas I (Fig. 19 C, D)
e algumas poucas na lâmina IV (Fig. 19 E, F). Estas células podem ter recebido os
corantes através de contatos com nervos periféricos, conforme descrito por Bacskai
e Matesz (2002) em sapos.
4.6 – O acoplamento celular e a expressão de conexi na 43 aumentam após
lesão periférica do nervo ciático em ratos neonatos :
Para verificarmos se o padrão de acoplamento encontrado na medula
espinhal neonatal é dinâmico e participa das respostas fisiológicas da medula
decidimos utilizar um modelo de lesão periférica, cujo algumas respostas centrais
são conhecidas. Dentre estas, o aumento da expressão de conexina 43 no corno
dorsal ipsilateral a lesão, e da proteína acídica glial (GFAP), indicando uma resposta
glial a esta manipulação (Li e Nagy, 2000). Para tanto, animais em P4 tiveram um
dos seus nervos ciáticos cortado, ao nível da fossa poplítea, em seguida
permaneceram vivos por 30-45 minutos antes do procedimento de “transection
loading” (Fig. 20).
Os níveis de acoplamento celular foram quantificados apenas nas primeiras 3
laminas do corno dorsal. Foram comparados os lados ipsi- e contralaterais à lesão
unilateral do ciático. Além disto, 2 animais não-operados foram usados para
controlar as possíveis assimetrias bilaterais detectadas pelo método na ausência de
lesão. Para a quantificação, estabelecemos razões de acoplamento, (nos dois
cornos posteriores da medula para cada animal; 3 experimentos independentes na
condição lesão e 2 na condição não-operado) definidas como o número de células
LY+RD-marcadas (LY+RD-) dividido pelo número de células duplo-marcadas
65
Figura 20 . Expressão de conexina 43 após lesão do nervo ciático. Em A, segmento medular correspondente ao nervo ciático. Podemos notar o aumento da expressão de Cx43 no lado ipsilateral a lesão do nervo. Em B, epêndima. Note a grande expressão de Cx43 tanto na luz ventricular quanto na junção com a zona ventricular. Em C, maior aumento do corno ventral contralateral a lesão, demonstrando menor marcação para Cx43, os motoneurônios foram identificados e apresentam grande marcação para Cx43. Em D, corno ventral ipsilateral a lesão. A maior expressão de Cx43, motoneurônios é notável (seta). Note a ausência de marcação nos nucléolos. Em E, corno dorsal contralateral a lesão. Note a pouca marcação para Cx43 em comparação com F, que representa o corno dorsal ipsilateral a lesão. Barra de calibração em B-F = 20 µm.
66
(LY+RD+). Dada a previsível variabilidade experimental entre animais, expressa em
nosso modelo como a fração de células diretamente carregadas quando do corte de
carregamento, variabilidade que leva a valores de desvios-padrão elevados nas
comparações unilaterais entre as razões de acoplamento, e sendo razoável assumir
a hemi-medula contralateral à lesão como um dos controles experimentais internos,
optamos por gerar razões das assimetrias entre medidas ipsi- e contralateral (ou à
direita e à esquerda) para cada um dos dois grupos de animais experimentais, lesão
e controle. Na figura 21 podemos ver a distribuição das células marcadas em ambas
condições com e sem lesão unilateral do ciático. O gráfico de barras da figura 21
resume estes resultados, revelando o aumento dos níveis de acoplamento juncional
na condição lesão, expresso como razões ipsi-/contra- elevadas, isto é de 1,63 ou
63% de assimetria nas medidas, relativamente ao índice de 1,19 ou 19%, registrado
no controle.
Desta forma, podemos comprovar pela primeira vez que o aumento agudo de
conexina 43 provocado por lesão periférica é acompanhado por aumento do
acoplamento celular.
4.7 – O acoplamento celular é modificado na presenç a de ácido flufenâmico:
O ácido flufenâmico faz parte de uma nova classe de bloqueadores de
junções comunicantes - os fenamatos, e tem sido usado experimentalmente com
êxito para o bloqueio destas junções in vivo e in vitro (Salameh et al., 2005; Harks et
al., 2001). Para revelar o efeito do AFF adicionamos a droga para a concentração
final de 100µM, a todas as soluções utilizados na realização do TL. Nossos
resultados, apresentados nas imagens fotomicrográficas da Figura 22 A, D, e de
67
Médias das assimetrias entre corno dorsal ipsilateral e contralateral à lesão
0
0,5
1
1,5
2
Controle Lesão
(1,19)
(1,63 ± 0,42)
Figura 21 . O acoplamento celular na medula espinhal após lesão do nervo ciático. Desenhos esquemáticos da distribuição das células acopladas na medula espinhal em ratos P4. Em A e C, representação dos lados lesados. Em B e D, representação dos lados contralaterais à lesão. Em E, F, G e H, representação dos experimentos controles. Em I, gráfico demonstrando as razões de acoplamento entre os animais com lesões e os controles.
I
68
forma diagramática na figura 22 G, H, demonstraram que o carregamento direto
ocorreu sem alterações detectáveis em número de perfis celulares ou de sua
distribuição histológica. De fato, conforme esperado, várias células diretamente
carregadas foram encontradas a longas distâncias do corte de carregamento (dados
não mostrados). O padrão de distribuição histológica dos perfis de acoplamento
celular se manteve em relação aos demais experimentos. Note-se que, à
semelhança do método de quantificação ilustrado pela Figura 20, também aqui
procedemos á contagem de células LY+RD+ e LY+RD- (Fig. 22 G, H), por sua vez
mapeadas a partir das imagens digitais (Fig. 22 A-D) da medula em 3 animais, 1
corte de cada. Um pequeno número de células LY+RD- foi registrado tanto no corno
dorsal (Fig. 22 F - H) quanto no corno ventral da medula tratada com AFF.
A quantificação da média da relação de células LY+RD+/LY+RD- nas lâminas
superficiais do corno dorsal da medula espinhal dos animais que receberam AFF foi
de 38,88 ± 6,61, em comparação ao controle que foi de 11,85 ± 1,88. Para excluir
efeitos dos diluentes do AFF no bloqueio da comunicação juncional, utilizamos um
animal que teve sua medula imersa na solução diluente do AFF (DMSO + Etanol), e
este não demonstrou diferença do percentual de acoplamento em relação aos
animais controles. Com isto, reforçamos, em bases agora farmacológicas, nossas
conclusões favoráveis à intermediação de junções comunicantes na transferência do
permeante juncional LY entre células da medula espinhal do rato neonato.
69
Figura 22. Bloqueio do acoplamento entre células da medula espinhal com ácido flufenâmico (100 µM). Em A e C, Fotomicrografia do corno dorsal de ratos P4 após TL com AFF. Em B e D, TL sem AFF. Em E, Fotomicrografica da medula espinhal com DAPI. Em F, Média das razões LY+RD+/LY+RD-. Em G e H, esquema representativo da quantificação de células acopladas. Barra de calibração em todas as figuras 20 µm, exceto em E = 100 µm.
Média das razões LY+RD-/LY+RD+ LY
8,39±1,52
2,33±0,57
Controle (3)
AFF (3)
70
4.8 – A técnica de carregamento por transecção reve la acoplamento celular na
medula espinhal de ratos adultos:
No início da década, Rash e colaboradores (2000; 2001) identificaram a
presença de proteínas de junções comunicantes (conexinas) distribuídas na medula
espinhal, em células gliais e neuronais. Mesmo assim, a funcionalidade das placas
juncionais formadas na medula espinhal adulta somente foi demonstrada no corno
ventral, tendo-se revelado entre motoneurônios, após lesões periféricas (Chang e
Balice-Gordon 2000). Desta forma, resolvemos investigar a existência de
acoplamento celular na medula espinhal adulta, principalmente no corno dorsal, com
a mesma metodologia utilizada em neonatos.
Ratos adultos, machos e fêmeas, sofreram laminectomia para exposição da
medula espinhal e em seguida o segmento lombar foi rapidamente retirado e
mergulhado nas soluções do procedimento.
Apesar do grande número de células carregadas (Fig. 23) com ambos os
corantes (LY+RD+), perfis celulares acoplados no corno ventral foram registrados
raramente. Acreditamos que esta escassez possa dever-se à entrada de corantes
através do nervo espinhal, carregando diretamente a maioria dos motoneurônios e
eliminando-os do compto das contagens de carregamento por acoplamento
juncional.
Em estudo pioneiro no corno dorsal da medula espinhal adulta (Fig. 23),
várias células foram identificadas como acopladas (LY+RD-). Estas células
encontravam-se distribuídas principalmente nas lâminas I e II de Rexed e
apresentavam corpos celulares pequenos e arredondados, semelhantes aos
encontrados no período neonatal. Algumas células com características morfológicas
71
Figura 23. Acoplamento celular no corno dorsal da medula espinhal de ratos adultos. O acoplamento celular foi identificado no corno dorsal da medula espinhal através do “transection loading”. Em A, marcação com LY no corno dorsal, note as setas marcando algumas células acopladas próximas a superfície pial, provável camada I e II. Em B, RD, as setas demonstram a ausência de marcação com o corante. C, dupla marcação RD/LY, o retângulo pontilhado representa a área aumentada em D e E. Em D e E, maior aumento de A e B, note as células acopladas (setas). Barra de calibração, 20 µm, exceto em D e E = 10 µm.
72
peculiares, localizadas mais profundamente na medula espinhal, dotadas de corpos
maiores e, algumas vezes, piramidais, não se apresentaram como células
acopladas, mas duplo-marcadas (LY+RD+).
4.9 – O acoplamento celular na medula espinhal de r atos adultos em resposta a
lesão periférica:
Para investigar o acoplamento celular, após lesão, através de passagem de
corantes no corno dorsal da medula espinhal, utilizamos a técnica de “transection
loading” após lesão prévia do nervo ciático de forma semelhante ao realizado para o
neonato. Encontramos um aumento do acoplamento celular após lesão prévia de
nervo ciático (Fig. 24) no corno dorsal.
No corno dorsal contralateral à lesão do nervo ciático encontramos um total
de 302 células duplomarcadas (LY+RD+) e somente 48 células (LY+RD-),
totalizando 13,71% de acoplamento celular. Em comparação, no corno dorsal
ipsilateral encontramos 289 células duplomarcadas (LY+RD+) e 70 células (LY+RD-
). Em um segundo experimento encontramos 265 células duplomarcadas (LY+RD+)
e 58 células (LY+RD-), totalizando 17,95% de acoplamento celular.
Após lesões de nervos periféricos ocorre o aumento da reatividade glial e
conseqüente formação de uma cicatriz glial central. Esta cicatriz pode ser
identificada através dos níveis elevados de GFAP em astrócitos reativos em regiões
que guardem correspondência histo-fisiológica com o sítio da lesão. Para
verificarmos se o aumento do acoplamento celular poderia estar relacionado à
formação da cicatriz glial, alguns animais foram submetidos à transecção do nervo
ciático e a expressão de GFAP foi identificada 7 dias pós-lesão.
73
Figura 24. A lesão do nervo ciático aumenta o acoplamento celular no corno dorsal ipsilateral após 7 dias. Fotomicrografias do corno dorsal. Em A, C e E, corno dorsal contralateral à lesão do nervo ciático. Encontramos um total de 13,71% de células acopladas. Em B, D, F e G, corno dorsal ipsilateral à lesão. As cabeças de setas indicam células acopladas. Em F e G, maior aumento de B, Note as células RD-/LY+ (setas). Encontramos 17,95% de células acopladas. Barra de calibração: 20 µm, exceto em F e G = 10 µm.
74
O corno dorsal ipsilateral à lesão do nervo ciático apresentou aumento
substancial da expressão de GFAP. Os astrócitos foram identificados facilmente por
sua morfologia. Podemos observar que a reatividade glial é aumentada nas
proximidades das lâminas I e II (Fig. 24, E, F).
4.10 – Bloqueio do acoplamento celular com carbenox olone abole o
acoplamento entre as células da medula espinhal:
Para demonstrar a dependência de junções comunicantes para a passagem
intercelular de LY, utilizamos um conhecido bloqueador de junções comunicantes
denominado carbenoxolone (CBX). O carbenoxolone foi injetado no espaço
subaracnóide na concentração de 100 µM, após prévia sedação dos animais. Após
30 minutos da injeção de tratamento com CBX, foi realizado o “transection loading”.
A entrada dos corantes não foi afetada pelo CBX e podemos encontrar células
LY+RD+ em diferentes distâncias do corte de carregamento. Tanto no corno dorsal
como no corno ventral, células LY+RD-, eram raras ou ausentes. Esses resultados
demonstraram que a passagem de corantes afirma-se como um processo mediado
por junções comunicantes (Fig. 25).
75
Figura 25. Carbenoxolone bloqueia o acoplamento celular na medula espinhal adulta. Em A e B, corno dorsal. Podemos perceber claramente o local de entrada do corante e o espalhamento para dentro da medula. Em, C e D, corno ventral. Note a coluna de motoneurônios (cabeça de seta). Em E e F, corno dorsal com bloqueio de carbenoxolene no espaço subdural. Em G e H, corno ventral com bloqueio de carbenoxolone no espaço subdural. Em I e J, maior aumento de A e B, para demonstração de algumas células acopladas no corno dorsal da medula espinhal do rato adulto. Note nas setas algumas células acopladas. Em K e L, maior aumento das figuras C e D. Note algumas células acopladas (setas). Em M e N, maior aumento das figuras E e F. Poucas células foram encontradas acopladas. Em O e P, maior aumento de G e H, Note também a ausência de acoplamento celular no corno ventral. Barra de calibração, A – H, 20 µm. I – P, 10 µm.
76
5 – DISCUSSÃO
No presente trabalho, demonstramos pela primeira vez a existência de
comunicação juncional no corno posterior da medula neonatal e do adulto. Para
tanto empregamos um método de estudo desta comunicação, por transferência
intercelular de corantes fluoróforos permeantes, desenvolvido anteriormente pelo
nosso laboratório, e que permite a visualização de grandes populações celulares
acopladas no SNC in situ. Também encontramos evidências pioneiras de que o
aumento rápido da expressão de Cx43 após lesão em nervo periférico no animal
neonatal é acompanhado de um aumento do acoplamento. De forma intrigante, o
mesmo não foi encontrado no adulto para respostas agudas. No entanto, resultados
preliminares sugerem que o adulto responderia com um aumento tardio na
incidência de acoplamento, paralelamente à sugestão de elevação dos níveis de
expressão da Cx43, no sétimo dia após lesão do nervo periférico. Finalmente, com a
aplicação desta técnica revelamos no animal neonatal, que o acoplamento juncional
não é limitado aos motoneurônios e que diversos tipos neuronais participam desta
modalidade de interação celular. Dado que a primeira semana pós-natal é crucial no
estabelecimento da circuitaria sináptica medular, acreditamos que as junções
comunicantes possam participar deste processo, conforme demonstrado para os
motoneurônios (Chang et al., 1999).
5.1 – O carregamento celular por transecção é uma f orma eficiente de
demonstrar o acoplamento celular na medula espinhal de animais neonatos e
adultos:
77
A técnica de “transection loading” – carregamento por transecção – foi
desenvolvida em nosso laboratório para detecção rápida do acoplamento celular
mediado por junções comunicantes funcionais in vivo/in situ. Esta metodologia foi
adotada inicialmente para visualização de redes acopladas em regiões telencefálicas
de animais neonatais, como o córtex cerebral e a zona subventricular anterior
(Menezes et al., 2000). Neste estudo, demonstramos, através de manipulações
farmacológicas, que o acoplamento celular revelado por corantes era mediado por
junções comunicantes (Menezes et al., 2000). Além disso, observações a partir
desta técnica em várias estruturas do SNC em desenvolvimento mostraram um
padrão semelhante ao do acoplamento juncional descrito por métodos
convencionais: 1. No córtex cerebral embrionário (Barbosa, L.; Tese de mestrado,
2007) encontramos células acopladas na zona ventricular, subplaca e placa cortical
(LoTurco e Kriegstein, 1991; Bittman et al., 1997); 2. No cerebelo pós-natal
(Resultados não publicados, Correia, A.; tese de Mestrado, 2002) encontramos
acoplamento na camada granular interna, e de células de Purkinje, mas não na
camada germinativa granular externa (Pakhotin e Verkhratsky, 2005; Meller et al.,
2005; Rácz et al., 2006); 3. Encontramos acoplamento celular na pia-máter
(Menezes et al., 2000; e dados não mostrados) em todas as idades estudadas
(Mercier e Hatton, 2001; Dermietzel e Spray, 1993); 4. No córtex cerebral pós-natal
(Menezes et al., 2000) em neurônios das camadas II-VI (Peinado et al., 1993); 5. No
bulbo olfatório (Menezes et al., 2000; e resultados não mostrados) na camada
granular interna e nas células mitrais (Reyher et al., 1991); 6. Na retina (Silva, M.,
2003; tese de Mestrado) nas camadas de células ganglionares, na nuclear interna e
entre células horizontais (Cusato et al., 2000).
78
A captação do corante acontece sempre próximo à superfície de
carregamento direto, onde encontram-se as células rompidas pelo corte de
carregamento. No entanto, é difícil identificar acoplamento celular nesta região,
devido à freqüência elevada de marcação das células pelos dois corantes. À medida
que nos afastamos da superfície de corte-carregamento, um menor número de
células LY+RD+ é detectado, e a chance de encontramos células carregadas
somente com LY aumenta relativamente às duplo-marcadas locais. Isso se deve ao
fato de que as células cortadas diretamente na superfície corte-carregamento já não
representam a maioria, mas aquelas poucas com axônios ou prolongamentos mais
extensos, carregadas pelos dois corantes. A relativamente grandes distâncias da
superfície de corte-carregamento, portanto, crescem as chances de detecção do
acoplamento celular.
Uma premissa importante para a validade do método é que as células
LY+RD- representem apenas acoplamento celular, i.e., a ocorrência de “falso-
positivos” para acoplamento devem ser raras ou inexistentes. Falsos positivos para
acoplamento poderiam ocorrer de duas formas: 1. Devido a velocidades de difusão
diferente para os corantes empregados; neste caso, células poderiam apresentar-se
monomarcadas por LY como conseqüência de taxas de difusão presumivelmente
lentas para a RD; 2. Captação seletiva do corante LY através de poros
intramembranares, como hemicanais de conexinas ou poros associados à ativação
de receptores purinérgicos P2X7, que excluem moléculas maiores como a RD. Como
descrito abaixo acreditamos que estes eventos são raros ou negligenciáveis.
Devido a diferenças na massa molecular e na natureza química dos corantes,
seria de se esperar taxas distintas de difusão intracitoplasmática. Acreditamos que a
diferença de massa molecular não influencie de forma detectável os resultados de
79
incidência de acoplamento em nossas preparações, pelas seguintes razões: 1. A
propagação da RD dextran independe de transporte ativo, desenvolvendo-se por
processo difusional simples a favor de gradiente de concentração, portanto, passivo,
a exemplo do que ocorre com o seu par permeante, Lucifer yellow (Fritzsch, 1993);
2. Uma comparação direta em axônios de Xenopus demonstrou a rapidez da difusão
do conjugado de Dextran 3kDa, equivalente a registradas para compostos pequenos
como sulforodamina 101 (606MW) e Biocitina (372,5MW), empregada esta última
como permeante juncional. Como estes experimentos foram realizados em
preparações de Xenopus, admitimos como possíveis as limitações em sua
extrapolação direta para modelos animais de sangue quente. A geometria peculiar
da medula espinhal e a disposição majoritariamente longitudinal dos prolongamentos
celulares oferece uma oportunidade para a verificação de taxas de difusão
determinadas experimentalmente em nossas preparações. Em experimentos
desenvolvidos para outros fins, realizamos o procedimento de TL, com um único
corte de carregamento em segmentos longos, maiores que 3mm, da medula
espinhal, de forma que os corantes tivessem uma única porta de entrada
(excetuando as entradas adicionais possíveis pelos nervos periféricos). Com este
cuidado foi possível comparar as difusões dos corantes em trânsito
predominantemente unidirecional, tendo como referência um só plano de partida.
Para nossa surpresa, encontramos transporte para o conjugado de rodamina
dextran a distâncias superiores a 1mm, gerando medidas de taxa de difusão de
aproximadamente 10mm por hora. No entanto, nestas distâncias, a rodamina
dextran tem uma intensidade de fluorescência sensivelmente mais baixa, tornando-
se as células assim marcadas de difícil detecção. Não medimos quantitativamente
este decaimento, mas subjetivamente, esta diferença fica mais visível a partir dos
80
700 micrometros da superfície de corte. Para evitar variações do número de total de
células carregadas diretamente, e também evitar as advindas de uma possível
dificuldade de interpretação, devido a baixa intensidade do corante, limitamos a
análise quantitativa a uma região entre 60 µm -300 µm de distância da superfície de
corte-carregamento.
É possível, embora pouco provável, que parte das células que apresentaram
acoplamento revelado por corantes tenha sido marcada através da captação de LY
por poros formados por receptores purinérgicos P2X7 (Surprenant et al., 1996; Illes e
Ribeiro, 2004). Apesar de não podermos excluir a participação destes receptores na
incorporação e difusão de LY na nossa preparação, por falta de ensaios
farmacológicos, algumas características de nosso modelo e marcação obtida
reduzem esta possibilidade: 1. As altas concentrações do ligante (ATP) necessárias
para abertura destes poros (Virginio et al., 1999a; 1999b) são pouco prováveis de
serem alcançadas na nossa preparação, em que utilizamos um meio pobre em ATP;
2. Apesar de alguns autores defenderem tempos mais curtos para a abertura destes
poros na presença de elevadas concentrações de ATP (Virginio et al., 1999a;
1999b), tempos prolongados, da ordem de 10 ou mais minutos têm sido relatados
para o registro de níveis detectáveis de captação direta de permeantes, portanto,
freqüentemente maiores que o breve tempo de exposição aos corantes (1-3 minutos)
utilizado em nosso método; 3. Se houvesse a participação destes poros,
esperaríamos a formação de grumos de células LY+RD-, uniformemente distribuídos
pelo tecido, não obedecendo o claro gradiente de difusão iniciado a partir do corte
de carregamento observado em nossos experimentos. Este último argumento
justifica nosso também descrédito no envolvimento de hemicanais de conexinas
(Contreras et al., 2004)
81
Por fim, apesar de ainda não confirmadas em sistemas endógenos quanto à
sua capacidade de formação de canais intercelulares completos e funcionais, não
descartamos completamente a possibilidade de que parte do acoplamento celular
observado em nossas preparações deva-se a uma classe recém descrita de
proteínas juncionais, as panexinas. Somando-se à ausência de demonstração de
sua capacidade in situ de formar canais juncionais intercelulares completos, a
conhecida resistência dos hemicanais de panexina ao ácido flufenâmico,
desacoplante de segunda geração, pertencente à classe de aril-amino-benzoatos
(Srinivas e Spray 2003), quando nossos resultados sugerem inibição acima de 50%
na incidência de acoplamento na medula em resposta ao tratamento com esta
droga, vemos enfraquecer-se a possibilidade de contribuição de hemicanais ou
canais intercelulares formados por panexinas ao nosso modelo.
O acoplamento celular encontrado em regiões muito distantes do corte-
carregamento poderia ser explicado por entrada através de nervos espinhais que
também são expostos aos corantes durante o procedimento de carregamento por
transecção. No entanto, em nossos experimentos, onde a entrada de corante foi
limitada aos nervos espinhais seccionados (ver materiais métodos), não
encontramos grande número de células carregadas (em alguns casos apenas o LY
foi usado), somente grupos de motoneurônios e algumas poucas células no corno
dorsal. Se algum acoplamento advêm da entrada de corantes pelo nervo, este não
diminui a importância deste estudo e sim aumenta sua significância, pois identifica
precisamente as células que receberam o corante: neste caso, no corno ventral,
somente motoneurônios poderiam ser marcados. A presença de LY em
interneurônios ou célula gliais indicaria a presença de acoplamento heterocelular na
medula espinhal neonatal, com origem em axônios sensoriais ou por intermédio de
82
motoneurônios como possíveis fontes doadoras. Um fato curioso é a presença de
células marcadas no corno dorsal após entrada de corante pelo nervo periférico.
Este resultado sugere a possibilidade de passagem de corante através de junções
comunicantes entre células do gânglio da raiz dorsal e interneurônios do corno
dorsal, como sugerido por Bácskai e Matesz em 2002. Mas como não pudemos
excluir a marcação direta destes interneurônios através de longos axônios
longitudinais, esta hipótese ainda precisa ser sistematicamente investigada em
nossas preparações.
Não podemos excluir também a possibilidade de marcação em células do
corno dorsal feitas por lesão indesejada da medula espinhal durante o procedimento
de TL. No entanto, todos os cuidados foram tomados para evitar estas lesões e
quando ocorriam eram facilmente distinguíveis das demais regiões por deixarem
uma borda com marcação muito forte, visível na região de lesão.
Embora ainda necessitemos de uma demonstração mais formal, os
experimentos de inibição de junções comunicantes com fármacos ou pela presença
de altas concentrações de cálcio durante o procedimento de corte/carregamento
defendem a natureza juncional do carregamento de LY em perfis de células
monomarcadas. No animal neonato (P4) empregamos o ácido flufenâmico nas
soluções utilizadas para o procedimento de TL, incluindo a solução de corantes.
Nestes experimentos, encontramos uma redução importante do acoplamento (>50%)
embora não completa. Este bloqueio parcial pode ser devido a dois possíveis
fatores. Um primeiro relativo ao tempo necessário para o efeito do fármaco, já que a
medula era mergulhada nas soluções contendo o bloqueador apenas dois minutos
antes da exposição aos corantes, talvez tempo insuficiente para uma inibição
completa destes canais. A outra possibilidade é a diferença de sensibilidade de
83
certas conexinas ao bloqueador farmacológico (Srinivas e Spray 2003, Bruzzone et
al. 2005). Nos poucos experimentos bem sucedidos de bloqueio realizados no
animal adulto com carbenoxolone, outro conhecido agente desacoplante, hidrofílico,
derivado de ácido glicirretínico, a redução do acoplamento foi mais significativa, fato
que se deve não somente à natureza química do desacoplante, mas provavelmente
também à injeção da droga no espaço subaracnóide 30 minutos antes da retirada da
medula e do procedimento de TL.
5.2 – O acoplamento celular é distribuído por todas as lâminas da medula
espinhal de ratos neonatos:
Em nosso trabalho demonstramos que o acoplamento celular é distribuído por
toda a medula espinhal em P4. Trabalhos anteriores limitaram-se a sugerir o
acoplamento entre células da medula espinhal através da expressão de conexinas
(Lee et al., 2005; Chang et al., 1999), ou por evidências funcionais de acoplamento
por corante e registros eletrofisiológicos restritos aos motoneurônios (Pastor et al.,
2003; Mentis et al., 2002; Chang et al., 1999).
Com exceção de Asghar e colaboradores (2005), que sugerem a participação
de junções comunicantes na geração de ritmos entre interneurônios do corno dorsal
durante o período pós-natal, não encontramos na literatura outras fontes que
apontem para a presença de acoplamento entre células do corno dorsal da medula
espinhal durante o período pós-natal precoce.
O acoplamento celular no corno dorsal da medula espinhal é de difícil
identificação provavelmente devido à pequenas dimensões da maioria das células
nesta região e à dificuldade técnica de acesso às mesmas, seja através de registros
84
eletrofisiológicos ou mediante injeção intracelular de permeantes juncionais. Nossa
técnica permite a identificação de passagem de corantes entre células de pequeno
tamanho, desde que estas tenham prolongamentos que se estendam por alguns
milímetros rostro- ou caudalmente. Na idade pós-natal muitas células do corno
dorsal, em especial da lâmina I, III e IV têm seus longos axônios em direção a
regiões de tronco encefálico, formando as vias espino-talâmicas, espino-reticulares e
espino-tectais sendo assim, seus axônios atravessam vários segmentos de medula
espinhal para alcançar seus alvos (Jankowska, 2001). Além disto, diversos tipos de
interneurônios também já estão presentes nesta idade, alguns com uma disposição
longitudinal, com axônios conectando diversos segmentos, e dentre estes, axônios
comissurais (Eide et al., 1999). O corte-carregamento realizado em nossa
abordagem metodológica é, portanto, capaz de marcar todas estas células e
permitindo sua identificação no corno dorsal e revelando, em alguns casos, o
acoplamento. Coincidentemente, é nas lâminas I, III e IV, ricas em interneurônios de
projeção, que encontramos os maiores números de células carregadas diretamente,
aumentando assim a probabilidade de encontrarmos possíveis parceiras acopladas.
Interneurônios comissurais e de projeção também são encontrados em outras
lâminas da medula espinhal, como as lâminas VII e VIII. Na lâmina IX, os
motoneurônios fazem estabelecem conexão com outros em segmentos rostrais e
caudais e podem também receber corantes através de secções de corte
carregamento. Através desta marcação difusa de células na medula espinhal,
revelando indistintamente células de tamanhos e morfologias diversas, podemos
concluir que não existe seletividade celular no carregamento direto dos fluorocromos
na medula espinhal transectada.
85
Como dito acima, a distâncias progressivamente maiores da superfície de
corte/carregamento, as chances de identificar células acopladas aumentaria, pois
menos células são carregadas diretamente, apenas aquelas que têm
prolongamentos maiores em direção ao corte, diminuindo o mascaramento do
acoplamento, pela marcação direta dos parceiros potencialmente acoplados. No
entanto, não se observa um aumento na proporção com a distância. A proporção de
acoplamento, razão entre células acopladas, LY+RD-, e células LY+RD+
(carregadas diretamente) mantém-se estável dentro do segmento de 300
micrometros estudado. Isto sugere que o quadro geral de acoplamento celular
revelado a curtas distâncias poderia esconder inúmeras pequenas redes de
acoplamento. Neste sentido, as placas juncionais diminutas, descritas para a medula
espinhal (Rash et al., 2000), constituem-se em substratos que poderiam explicar a
prevalência de pequenos grupos de acoplamento juncional. Uma das possibilidades
é de que as pequenas placas ofereçam maior resistência ao corante permeante LY.
Alternativamente estes pequenos grupos de acoplamento poderiam refletir
propriedades de junções estabelecidas mais especificamente por neurônios de longo
axônio, intersegmentares, distinguíveis a longas distâncias como possíveis fontes do
permeante juncional.
5.3 – Tipos celulares marcados com Lucifer yellow n a medula espinhal e
possíveis parceiros acoplados:
Alguns tipos celulares são facilmente identificáveis na medula espinhal, seja
por sua morfologia ou por sua distribuição espacial. Motoneurônios apresentam
corpo celular grande e são localizados na lâmina IX (medial e lateral) das
86
intumescências. As camadas superficiais do corno dorsal, I, II e III encontram-se
dorsalmente com uma densidade celular aumentada. Nas lâminas III e IV
encontramos células com corpos neuronais grandes.
Além da identificação morfológica e topográfica das células da medula
espinhal (nem sempre bem definidas) podem ser usados também anticorpos contra
proteínas específicas de células da medula espinhal. Por exemplo, Islet 1, para
motoneurônios, neurokinina 1 (Polgar et al. 2007), para neurônios de projeção
sensorial, e calbindina para células de Renshaw (Mentis et al., 2006). Mesmo com
todo o arsenal referencial para identificação das células acopladas, na prática isso é
tecnicamente difícil, em nossa preparação, pois exigiria a análise simultânea de
quatro cromógenos espectralmente bem separados entre si. Embora, possível com
os novos equipamentos de microscopia atualmente disponíveis, preferimos evitar as
dificuldades de interpretação previsíveis.
Em nossos experimentos utilizamos uma análise indireta, que apesar de
limitada nos permitiu chegar a algumas conclusões importantes. Por exemplo,
podemos concluir que o acoplamento identificado na medula deve ser
majoritariamente homocelular e limitado a neurônios. Esta conclusão é baseada na
observação de que a grande maioria das células marcadas com LY são positivas
para a isotipo, neurônio especifico, classe III da beta tubulina. De fato, em raros
casos identificamos dupla marcação de LY com GFAP. Coerentemente, poucas
células GFAP positivas encontravam-se perto da área de corte ou da periferia da
medula na substancia branca, onde a marcação tanto do LY como do GFAP eram
maiores. Devido a dificuldade de identificar as células pequenas na substância
branca, não realizamos investigação sistemática desta região. Uma segunda
conclusão importante é que o acoplamento deve envolver interneurônios de tipos
87
variados na medula. Esta expectativa se baseia não somente na localização das
células LY+RD-, como também no fato de que uma grande parte das células
marcadas com LY expressa calbidina e parvabulmina. Estes achados abrem uma
perspectiva futura de confirmar os parceiros específicos envolvidos no acoplamento
encontrado na medula e testar seu envolvimento no processo de refinamento da
circuitaria do corno dorsal. Por fim, em alguns poucos casos encontramos evidências
de acoplamento heterocelular, envolvendo sub-tipos neuronais, que, de forma
surpreendente, tinham motoneurônios como prováveis parceiros. Esta conclusão
repousa no achado de células de Renshaw, identificadas pela expressão de
calbindina, marcadas com LY. Como estas células não têm projeção intersegmentar
dificilmente poderiam ser carregadas diretamente pelo corte de carregamento,
situado a longa distância destas células em nossas observações. Um provável
doador de LY para estes interneurônios pela sua proximidade espacial, é o
motoneurônio, que é passível de ser carregado diretamente pelo corte de
carregamento ou pelo nervo periférico. A falha na detecção desta parceria em
experimentos anteriores de injeção intracelular de LY em motoneurônios (Chang et
al., 1999) sugere este pareamento como um evento raro. Dado que em nosso
modelo várias células são carregadas simultaneamente, isto aumenta as chances de
detecção de acoplamentos deste tipo. As raras células GFAP+LY+, longe da
superfície de carregamento, também são uma sugestão de possível acoplamento
heterocelular, já que a grandes distâncias dificilmente a fonte doadora de LY poderia
ser outra célula de glia.
5.4 – A lesão ao nervo ciático aumenta o acoplament o celular mediado por
junções comunicantes na medula espinhal de ratos ne onatos:
88
Em nosso trabalho demonstramos que as lesões de nervos periféricos
provocam alterações centrais muito rápidas, detectáveis num período de 45 minutos
aproximadamente. Estas alterações compreendem ao aumento da expressão de
conexina 43, já descrito previamente (Rohlmann et al., 1993; Chang et al., 1999; Li e
Nagy, 2000) e aumento do acoplamento celular em motoneurônios (Chang et al.,
2000). No entanto, todos os trabalhos citados anteriormente são realizados em
animais adultos. A resposta da expressão de conexina e aumento do acoplamento
no neonato, ainda não está totalmente elucidada. A maior expressão de Cx43
sugere uma resposta glial aumentada imediatamente após a lesão periférica; esta
resposta pode durar vários dias após a lesão e ser responsável pela manutenção de
uma microambiência adequada à sobrevivência neuronal após a lesão. No corno
ventral do adulto o acoplamento celular aumenta entre motoneurônios (Chang et al.,
2000). Este acoplamento está associado a um novo período de crescimento axonal
provocado após a lesão. É possível especular que também no corno dorsal, a
deaferentação funcional de interneurônios das lâminas superficiais pode conduzi-los
a um estágio similar ao desenvolvimento em termos de comunicação juncional.
Existem sugestões de que as junções comunicantes sejam responsáveis por
propagação de sinais de morte celular (Frantseva et al., 2002). Estudos anteriores
mostram que a morte neuronal encontrada no corno dorsal após lesão periférica
limita-se às lâminas IV a VI (Oliveira et al., 1997), não quantificadas no escopo desta
tese. Portanto, não acreditamos que nossos dados, extraídos por quantificação
sobre as lâminas I a III, possam ser explicados por captação inespecífica dos
fluorocromos a partir de células em processo de morte.
89
5.5 – Junções comunicantes em ratos adultos:
Junções comunicantes entre neurônios são encontradas abundantemente
durante o desenvolvimento (Bittman et al., 2004). Por muito tempo acreditou-se que,
em adultos o acoplamento celular restringia-se a algumas regiões sub-corticais como
oliva inferior, retina, núcleo supraquiasmático, núcleo coclear e núcleo trigeminal
(Sotelo et al., 1976; Bourrat e Sotelo., 1983; Liem et al., 1991; Van den Pol e Dudek,
1993). Este conceito vem sendo gradualmente abandonado, frente a novos achados
de redes neuronais funcionais mediadas principalmente por Cx36 no telencéfalo de
roedores (Hormuzdi et al., 2001; Deans et al., 2001; Connors e Long, 2004; Zhang et
al., 2006). A aceitação da presença mais generalizada de conexinas em neurônios
do adulto se deveu principalmente ao estudo da expressão destas conexinas por
imuno-histoquímica (Rash et al., 2000, 2001) e com o emprego de animais
transgênicos (Deans et al., 2001). Uma das dificuldades de trabalhos anteriores em
encontrar junções comunicantes em adultos, refere-se à metodologia empregada
para o estudo anteriormente; microscopia eletrônica, que produz muitos cortes de
espessura pequena, diminuindo as chances de detecção de placas juncionais se
relativamente mais escassas no tecido (Rash et al., 1998).
Para o corno dorsal medular, mais especificamente, vemos como um
elemento significativamente limitador, o fato das células neste sítio possuírem soma
tipicamente diminutos, desencorajando a inspeção por injeção intracelular, ao passo
em que torna a investigação dos motoneurônios no corno ventral comparativamente
mais elegível (Chang et al., 2000). Em nosso estudo, o emprego da técnica de
carregamento por corante, permitiu-nos incluir facilmente o corno dorsal na definição
de possíveis redes de acoplamento na medula, incluindo suas lâminas superficiais.
90
O acoplamento celular no adulto pode ser útil para a modulação das sinapses
aferentes de dor, intermediadas por neurônios de segunda e terceira ordem do corno
dorsal. É conhecido que a indução de dor aumenta a expressão de Cx43 (Spataro et
al., 2004; Qin et., 2006; Ohara et al., 2008). Embora a hipótese mais comum seja de
que o aumento de expressão da Cx43 reflita um aumento no acoplamento de células
gliais, é possível que interneurônios também respondam por acoplamento em uma
pequena proporção. Como este acoplamento seria mediado por Cx36 (Rash et al.,
2000), podem ter sido ignorados durante os experimentos envolvendo indução
periférica de dor. Qin e colaboradores (2006) encontraram aumento rápido da
expressão de conexinas por indução de dor exatamente na mesma região que nós
encontramos, no corno dorsal em lâminas superficiais e em células de tamanho
similar. Apesar de nossa técnica não nos permitir identificar os tipos celulares
acoplados, nossos ensaios em neonatos para GFAP demonstraram raras células
marcadas nesta região. Além disto, as células acopladas reveladas por nosso
método encontram-se localizadas mais profundamente que a astrogliose detectada
após lesão, limitada principalmente à região de interface do nervo periférico com a
medula espinhal.
Não apenas em resposta a estímulos álgicos, respostas centrais também
podem ocorrer após lesões periféricas no adulto. A expressão das conexinas 36, 37,
40, 43 e 45 na medula espinhal adulta mostrou-se inalterada 1 – 4 semanas após
axotomia (Chang et al., 2000). No entanto, em lesões diretas na medula levam a um
aumento progressivo (atinge um pico 5-7 dias depois da lesão) na expressão de
Cx43 (Theriault et al., 1997). Como encontramos uma tendência para aumento do
acoplamento celular tardio no adulto, é possível que o aumento progressivo do
acoplamento seja uma resposta comum a lesão nesta idade, diferente da medula em
91
desenvolvimento. Em adição, foi demonstrado recentemente que a Cx43 participa
positivamente da resposta inflamatória após lesão traumática direta à medula
espinhal. Os mecanismos subjacentes a esta atividade ainda não foram elucidados,
nem tampouco se envolveria acoplamento celular funcional. No entanto, acreditamos
que investigar a distribuição do acoplamento celular e elucidar o repertório de células
envolvidas nestas interações representam passos fundamentais para a
compreensão dos processos abortivos da regeneração neural.
92
6 – CONCLUSÕES
1. A técnica de carregamento por transecção (“transection loading”) mostrou-se
eficiente para identificação do acoplamento celular na medula espinhal do rato em
desenvolvimento e do adulto.
2. Vários tipos celulares, principalmente neurônios com diferentes características
morfológicas, são encontrados em meio à população de células acopladas da
medula espinhal do rato em desenvolvimento.
3. As células acopladas no corno dorsal da medula espinhal durante o
desenvolvimento estão predominantemente localizadas nas lâminas I, III e IV.
4. Dos subtipos que comporiam a população de neurônios acoplados na medula do
neonato, a análise morfológica e a distribuição laminar sugerem a participação de
interneurônios sensoriais das lâminas I e II, e de interneurônios proprioespinhais e
comissurais.
5. A grande maioria dos pareamentos celulares por acoplamento juncional descrita
na medula do neonato parece ser de natureza homocelular, interneuronal.
6. Encontramos, no entanto, sugestão de acoplamento heterocelular no corno
ventral, entre motoneurônios e interneurônios. Além disso, raras células
profundamente carregadas com LY e que expressam GFAP sugerem uma via
heterocelular neurônio-glial para a transferência do permeante juncional, a confirmar-
se.
7. Detectamos acoplamento celular juncional no corno dorsal da medula espinhal em
animais adultos.
93
8. O acoplamento celular do corno dorsal no período pós-natal responde
rapidamente à lesão do nervo ciático, no mesmo período em que obervamos
qualitativamente um aumento dos níveis de expressão de Cx43.
9. Não verificamos, no adulto, o incremento da comunicação juncional observado no
modelo de medula de neonato. No entanto encontramos uma tendência ao aumento
da taxa de acoplamento em uma resposta tardia, 7 dias após a lesão. Este
acoplamento pós-lesão é nítido no corno dorsal em regiões parcialmente
correspondentes à região de gliose reativa.
94
7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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