AÇÃO DA TERAPIA ULTRASSÔNICA PULSADA EM CÉLULAS ... · tecido ósseo. Caracterizam-se por...
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO MAYRA PAULA DE OLIVEIRA LIMA AÇÃO DA TERAPIA ULTRASSÔNICA PULSADA EM CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS OFCOL II Londrina 2016
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
MAYRA PAULA DE OLIVEIRA LIMA
AÇÃO DA TERAPIA ULTRASSÔNICA PULSADA EM CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS OFCOL II
Londrina
2016
MAYRA PAULA DE OLIVEIRA LIMA
Londrina
2016
AÇÃO DA TERAPIA ULTRASSÔNICA PULSADA EM CÉLULAS OSTEOBLÁSTICAS OFCOL II
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná – UNOPAR). Orientador: Profa. Dra. Deise A. A. Pires Oliveira
MAYRA PAULA DE OLIVEIRA LIMA
AÇÃO DA TERAPIA ULTRASSÔNICA PULSADA EM CÉLULAS
OSTEOBLÁSTICAS OFCOL II
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Programa de Pós-Graduação Mestrado
em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual
de Londrina [UEL] e Universidade Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora
formada pelos professores:
_________________________________________
Profa. Dra. Deise A. A. Pires Oliveira
(Orientadora)
Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
_________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
(Membro Interno)
Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
_________________________________________
Prof. Dra. Berlis Ribeiro dos Santos Menossi
(Membro Externo)
Universidade Estadual do Norte do Paraná - UENP
Londrina, 02 de Dezembro de 2016
Dedico este trabalho a minha família que me
apoiou durante toda essa caminhada e que não
mediu esforços para que eu chegasse até aqui.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por me permitir começar e concluir essa
etapa e me carregar no colo durante todo o caminho.
A Professora Deise Aparecida de Almeida Pires Oliveira, minha
orientadora, por todo conhecimento, dedicação e empenho na formação desse
trabalho. Além de professora, hoje se tornou uma grande amiga.
Ao Professor Rodrigo Franco de Oliveira e Professora Regina
Célia Poli Frederico, por todo auxílio e incentivo durante esta trajetória, muito
obrigada pelos ensinamentos.
Aos meus pais, Paulo e Jaqueline, que muitas vezes
renunciaram seus sonhos para que os meus se tornassem reais. Por todas as
vezes que não me deixaram desistir e me incentivaram a ser cada vez melhor.
E a minha irmã Mylena por estar sempre ao meu lado, sendo parceira e aliviando
minha carga sempre que possível.
Ao meu noivo Fernando, por toda a paciência, pelo apoio e por
me amar mesmo quando eu não estava presente. Por me ajudar e não medir
esforços para que esse sonho se tornasse real.
A Ana Flávia que me ajudou muito, que me incentivou desde a
inscrição até o último momento. Que é minha parceira de profissão e de vida.
Obrigada por tudo!
E as meninas do LACCEL, Priscila, Stheace, Jéssica, Larissa e
Flávia por toda a ajuda, conhecimento e paciência para nos ensinar.
“É melhor lançar-se em busca de conquistas
grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do
que alinhar-se com os pobres de espírito, que
nem gozam muito, nem sofrem muito, porque
vivem numa penumbra cinzenta, onde não
conhecem nem vitória nem derrota..."
Theodore Roosevelt
RESUMO Introdução: O osso é um tecido extremamente ativo e por isso no esqueleto em desenvolvimento, essa atividade é primariamente voltada para o crescimento e a remodelação óssea. Sendo assim, as células osteoblásticas são responsáveis pela formação de matriz óssea e também pela remodelação óssea. A estimulação com ultrassom pulsado de baixa intensidade é um dos recursos mais conhecidos para estimular a formação óssea e é amplamente utilizado para acelerar a cicatrização de fraturas e maturação óssea na osteogênese. Objetivo: Analisar os efeitos da terapia ultrassônica de baixa intensidade em cultura celular de osteoblastos. Métodos: As células OFCOLII foram cultivadas em frascos de 25 cm3 com 90% meio DMEM, suplementados com 10% SFB e 1% antibiótico e antimicótico; mantidas na estufa de CO2 em atmosfera de 5% a 37°C e em seguida, foram plaqueadas em placas de 12 poços. A irradiação foi realizada com ultrassom de 1 MHz e as células foram divididas em cinco grupos: Grupo 1 (controle), Grupo 2 (0,2 W/cm² - 10%), Grupo 3 (0,5 W/cm² - 10%), Grupo 4 (0,2 W/cm² - 20%), Grupo 5 (0,5 W/cm² - 20%), onde cada poço recebeu 2 minutos de irradiação nos tempos 24, 48 e 72 horas. Para avaliação de proliferação celular foi utilizado o método MTT, que foi realizado em 24 horas após cada irradiação ultrassônica. Resultados: Dos grupos analisados, o G2 (0,2 W/cm² - 10%) foi o que apresentou um aumento significativo na proliferação celular, em 24 e 48 horas (p=0,04), e posteriormente apresentando uma queda para 72 horas. Conclusão: A dosagem 0,2 W/cm2 com regime de pulso 10%, apresentou a melhor resposta para a proliferação celular. Os resultados in vitro demonstram efeito do ultrassom nas células osteoblásticas OFCOLII, indicando que este recurso induz proliferação celular, sendo assim, este resultado pode ajudar futuras investigações no uso da terapia ultrassônica e tratamento de patologias ósseas. Palavras Chave: Ultrassom, Osteoblastos, Reparo ósseo, Reabilitação
ABSTRACT Introduction: Bone is an extremely active tissue and therefore in the developing skeleton, this activity is primarily geared towards bone growth and remodeling. Thus, osteoblastic cells are responsible for the formation of bone matrix and also for bone remodeling. Low intensity pulsed ultrasound stimulation is one of the most well-known features to stimulate bone formation and is widely used to accelerate the healing of fractures and bone maturation in osteogenesis. Objective: To analyze the effects of low intensity ultrasonic therapy on osteoblast cell culture. Methods: OFCOLII cells were cultured in 25 cm 3 flasks with 90% DMEM medium, supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic and antimycotic; Maintained in the CO2 oven in 5% atmosphere at 37 ° C and then plated in 12-well plates. The irradiation was performed with 1 MHz ultrasound and the cells were divided into five groups: Group 1 (control), Group 2 (0.2 W / cm² - 10%), Group 3 (0.5 W / cm² - 10% ), Group 4 (0.2 W / cm² - 20%), Group 5 (0.5 W / cm² - 20%), where each well received 2 minutes of irradiation at times 24, 48 and 72 hours. To evaluate cell proliferation, the MTT method was used, which was performed 24 hours after each ultrasonic irradiation. Results: G2 (0.2 W / cm² - 10%) showed a significant increase in cell proliferation, in 24 and 48 hours (p = 0.04), and afterwards showed a drop to 72 Hours. Conclusion: The dosage 0.2 W / cm2 with a 10% pulse rate presented the best response to cell proliferation. The in vitro results demonstrate the effect of ultrasound on the OFCOLII osteoblastic cells, indicating that this feature induces cell proliferation, so this result may help future investigations in the use of ultrasonic therapy and treatment of bone pathologies. Keywords: Ultrasound, Osteoblasts, Bone repair, Rehabilitation
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Comparação das médias intra-grupo .......................................... 30
Tabela 2- Comparação das médias entre os grupos ................................... 30
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Modo de propagação das ondas ultrassônicas .......................... 17
ARTIGO
Quadro 1. Parâmetros de irradiação ultrassônica ....................................... 29
Figura 1. Proliferação celular em relação ao tempo e intensidade ............ 32
Figura 2. Microscopia Óptica ........................................................................ 33
LISTA ABREVIATURAS OU SIGLAS:
USP – Ultrassom Pulsado
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
RNA – Ácido Ribonucleico
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
MTT - [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazoliumbromide]
US – Ultrassom
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 13
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 15
2.1 Objetivo Geral ......................................................................................... 15
2.3 Objetivo Específico ................................................................................. 15
3. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 16
3.1 Tecido ósseo ........................................................................................... 16
3.2 Características Gerais do Ultrassom Pulsado e Contínuo ...................... 16
3.2.1 Efeitos do Ultrassom pulsado e contínuo ............................................. 19
3.3 Aplicação do ultrassom em reparo do tecido ósseo ................................ 23
3.4 Instrumentos de Avaliação ...................................................................... 25
4. ARTIGO ....................................................................................................... 26
5. CONCLUSÃO GERAL ................................................................................. 43
6. REFERENCIAS GERAIS ............................................................................. 44
7. ANEXOS ...................................................................................................... 53
Projeto de Pesquisa ...................................................................................... 53
Normas Da Revista ....................................................................................... 56
13
1. INTRODUÇÃO
As células osteoblásticas, responsáveis pela formação de matriz óssea
consistem num espectro de células osteoprogenitoras derivadas de células
estaminais mesenquimais que se diferenciam para a formação de osso maduro;
estas células também são responsáveis pela manutenção de outros sistemas
fisiológicos como a eritropoiese e modulação das funções endócrinas do osso,
entre outras. Além disso, são responsáveis pela remodelação óssea, porém,
este processo está suscetível a agressões externas, que podem influenciar no
equilíbrio dessa atividade, alterando o processo de remodelação.1,2
É bem relatado o fato de que agentes físicos, podem estimular o processo
de cicatrização e regeneração de diferentes tecidos, como a pele, o osso,
tendões e nervos periféricos. O ultrassom (US) é uma modalidade terapêutica
bem estabelecida que apresenta uma influência positiva sobre a inflamação,
reparação e remodelação óssea, uma vez que, pode aumentar a atividade
angiogênica, condrogênica e osteogênica.3,4
A terapia com ultrassom pulsado (USP) de 1 MHz é um dos recursos mais
conhecido para estimular a formação óssea na área de ortopedia. É amplamente
utilizado para acelerar a cicatrização de fraturas, maturação óssea na
osteogênese. Para influenciar a reparação óssea, o USP se distingue por ser
não invasivo e de fácil aplicação, além de que o USP apresenta uma intensidade
suficientemente baixa para ser considerado não destrutivo.5
Nesse contexto, pode-se destacar que os efeitos do US quando aplicado
in vitro evidenciam íntima ligação com o tipo celular, propiciando síntese do ácido
Desoxirribonucleico (DNA) em periósteo, osteoblastos e fibroblastos. Sendo
assim, ressalta-se a relevância dos estudos em cultura celular quando
correlacionados à ação do ultrassom, uma vez que possibilitam a
complementação das investigações in vivo, proporcionam controle rígido sobre
as inúmeras variáveis e, ainda, potencializam os conhecimentos sobre o
emprego dessa ferramenta terapêutica.6
No entanto, a ação do USP atuante no metabolismo celular osteoblástico
in vitro, não foram totalmente elucidados, há uma escassez de literatura cientifica
14
com este recurso em cultura celular osteoblástica. Diante do exposto, os
resultados dessa pesquisa nortearão para o aumento do processo de
estimulação e proliferação de células osteoblásticas a partir da terapia
ultrassônica.
15
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Analisar os efeitos da terapia ultrassônica pulsada de baixa intensidade
(1 MHz) em cultura celular de osteoblastos.
2.3 Objetivo Específico
Analisar o efeito do ultrassom em diferentes parâmetros em cultura
osteoblástica, avaliando a proliferação celular correlacionando com o reparo
ósseo.
16
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Tecido ósseo
O osso é um tecido mineralizado e extremamente ativo. No esqueleto em
desenvolvimento, essa atividade é primariamente voltada para o crescimento e
a remodelação óssea, processos pelos quais o osso atinge sua forma e seu
tamanho. 7
As células osteoblásticas são células responsáveis pela formação do
tecido ósseo. Caracterizam-se por possuir grande quantidade de retículo
endoplasmático rugoso e complexo de Golgi, sendo assim, sintetizam os
componentes de matriz orgânica e controlam a mineralização dessa matriz.8
A remodelação óssea é definida como um processo de aposição no qual
há remoção localizada do osso antigo (reabsorção) e substituição por osso
recentemente formado. Esse evento continua por toda a vida adulta do indivíduo,
sendo responsável pela renovação do esqueleto e mantendo sua integridade
anatômica e estrutural. Isso é um processo fisiológico constante no qual a
formação óssea é correspondente à reabsorção, sendo regulada por diversos
fatores, como mecanismos regulatórios intracelulares, influência hormonal,
fatores locais e externos.7
Um desequilíbrio entre formação e reabsorção óssea pode gerar uma
modificação na microarquitetura óssea. Uma diminuição da densidade mineral
óssea leva à osteoporose, o que gera um comprometimento da resistência do
osso a traumas de baixa energia predisposto a um aumento da ocorrência de
fraturas.9
3.2 Características Gerais do Ultrassom
O ultrassom é uma forma de energia mecânica que se propaga por
ondas de pressão acústica de alta frequência. Ao serem transmitidas para o
interior do corpo, as ondas promovem microdeformações nos tecidos
estimulados, e são capazes de gerar efeitos positivos sobre a inflamação,
reparação e remodelação óssea para acelerar ou iniciar os processos
17
angiogênicos, condrogênicos e osteogênicos. 3,10
Os equipamentos específicos de ultrassom terapêutico são compostos
por um transdutor e um circuito elétrico. O circuito elétrico transforma a tensão
da rede de alta frequência em corrente alternada que é convertida por um
transdutor em vibrações acústicas ou mecânicas pela inversão do efeito
piezoelétrico.11,12
Segundo Ter Haar,13 as vibrações acústicas produzidas pelo ultrassom
induzem mudanças celulares alterando o gradiente de concentração das
moléculas e íons de cálcio e potássio, o que estimula a atividade celular;
podendo resultar em diversas alterações, como aumento da síntese proteica e
secreção de mastócitos bem como, modificações na mobilidade dos fibroblastos.
Na fisioterapia, o ultrassom é definido pelas oscilações, ondas cinéticas
ou mecânicas produzidas pelo transdutor vibratório que, colocado sobre a pele,
atravessa e penetra no organismo em diferentes profundidades, dependendo da
frequência. Dessa forma, o efeito piezoelétrico só pode ser obtido se o material
cristalino possuir dipolos (regiões com cargas negativas e positivas) em suas
moléculas. Esse efeito, então, transforma tanto energia acústica em energia
elétrica, quanto energia elétrica em acústica, produzindo uma vibração mecânica
que é o ultrassom.14
As ondas ultrassônicas são ondas mecânicas e longitudinais que
transmitem energia através da matéria causando uma oscilação nas posições de
equilíbrio e de suas partículas. As ondas de água, o movimento de uma corda
de violino e as ondas eletromagnéticas, como as usadas na diatermia de ondas
curtas, terapia com infravermelho e corrente interferencial, são exemplos de
ondas transversas.15,16
As ondas se propagam a partir uma corrente alternada que é transmitida
através de um cristal piezoelétrico (quartzo) alojado em um transdutor. A
vibração desses cristais provoca a produção mecânica das ondas sonoras de
alta frequência acima de 20.000 Hz.17,18
A possibilidade de usar diferentes frequências entre 1 e 3MHz é
importante na medida em que as frequências mais altas (3MHz) são absorvidas
mais intensamente, tornando-as mais específicas para o tratamento de tecidos
superficiais, enquanto que as frequências mais baixas (1MHz) penetram mais
profundamente, devendo ser usadas para os tecidos mais profundos. 17
18
Nos meios sólidos as ondas ultrassônicas, podem ser produzidas ondas
de três tipos: longitudinal, transversal e superficial. A onda longitudinal ou
depressão caracteriza-se por causar oscilações nas partículas na mesma
direção de propagação da onda. A onda transversal causa oscilações nas
partículas em direção perpendicular à direção de propagação da onda; e a onda
superficial causa oscilações elipsoidais nas partículas. Nos meios líquidos e
gasosos só podem ser produzidas ondas do tipo longitudinal.17
Figura 1. Modo de propagação das ondas ultrassônicas.
O Ultrassom destaca-se como uma forma terapêutica que apresenta
evidências clínicas para uso em lesões musculoesqueléticas com o objetivo de
acelerar a cicatrização, diminuir a rigidez articular, reduzir dor e espasmo
muscular, aumentar a síntese de colágeno e regeneração da inervação
periférica. Além disso, o ultrassom pode aumentar a densidade de osteoblastos,
estimular a secreção de matriz celular e de fatores de crescimento envolvidos na
consolidação de fraturas. Contudo, existem relatos sobre sua aplicação em
fraturas, apresentando bons resultados na formação e consolidação do calo
ósseo, tanto em modelos animais, como em humanos.19
19
3.2.1 Indicações do Ultrassom pulsado e contínuo
A aplicação terapêutica do ultrassom tem sido muito empregada
em lesões de tecidos, ósseas e articulares e na otimização da cicatrização. Suas
indicações são muito abrangentes em relação às doenças musculoesqueléticas
envolvendo desde traumas, cicatrização de úlceras, aumento de circulação
sanguínea de tecido isquêmicos, redução de edema, estímulo cicatricial
tendinoso, liberação de aderências e ainda como recurso analgésico e anti-
inflamatório.20
Clinicamente, o ultrassom produz respostas significativas a partir de
células e tecidos, incluindo a degranulação das células de suporte, que altera a
função celular da membrana, o aumento dos níveis de cálcio intracelular, o
estímulo às atividades fibroblásticas, o aumento da síntese de proteínas,
angiogênese, aumento da permeabilidade vascular, aumento da densidade de
osteoblastos, estimula a secreção de matriz celular e de fatores de crescimento
envolvidos na consolidação de fraturas. Dessa forma, o uso deste recurso em
consolidação de fraturas, apresenta bons resultados na formação e consolidação
do calo ósseo, tanto em modelos animais, como em humanos. 15
O ultrassom pode ser indicado nas fases aguda e crônica do processo
inflamatório. Os efeitos são dependentes de alguns fatores, tais como tempo de
exposição, intensidade, a estrutura espacial e temporal do campo ultrassônico e
o estado fisiológico do local a ser tratado. Sendo assim, os mecanismos físicos,
térmicos e atérmicos acarretam respostas clinicamente significantes sobre o
organismo, órgãos, tecidos e células tratados.21,22
Existem algumas implicações da exposição à irradiação ultrassônica
como: regeneração tissular, reparação dos tecidos moles, aumento na circulação
sanguínea, liberação de macrófagos, síntese de proteína e ativação do ciclo de
cálcio, consequentemente aumentar a mobilidade articular e a extensibilidade
em tecidos ricos em colágeno, reduzir os espasmos musculares e aliviar a dor.22
Os efeitos benéficos do ultrassom observados na aplicação pulsada de
baixa intensidade são: aceleração no processo de reparo tecidual , ativando a
proliferação de fibroblastos, angiogênese, formação de tecido de granulação, e
consequente síntese de colágeno, favorecendo a redução do número de
leucócitos e macrófagos no interior da lesão,23 proporciona ainda, a modulação
20
na atividade biosintética e expressão de integrinas24 e estimulação de sistemas
anti-inflamatórios em células de membrana sinovial.25
Os efeitos biológicos do ultrassom dependem de muitos fatores físicos,
tais como intensidade, tempo de exposição, estrutura espacial e temporal do
campo ultrassônico e estado fisiológico do objeto. O ultrassom é um recurso
amplamente empregado nas afecções do sistema musculoesquelético, visando
principalmente ao controle dos sinais e dos sintomas inflamatórios, ao estímulo
a fibroplasia, a osteogênese e a modulação da dor.12,26
Em geral, estes efeitos estão relacionados com a permeabilização
transitória da membrana celular mediada pelo ultrassom e são muitas vezes
atribuídas aos efeitos biofísicos, como a cavitação e microfluxo acústico. 27
O ultrassom pode exercer efeitos anabólicos diretos, como a estimulação
do fator de crescimento, expressão gênica e produção de matriz extracelular
para melhorar o efeito terapêutico. Os efeitos biofísicos são causados por
estresse mecânico, cavitação e calor na membrana plasmática e do
citoesqueleto. Este recurso, tem sido utilizado na fisioterapia para estimular a
diferenciação de células formadoras de ossos e cicatrização de feridas. 28
Os efeitos do ultrassom sobre os tecidos ocorrem através de 2
mecanismos:
(1) efeitos térmicos que são adquiridos com a aplicação contínua;
(2) e os efeitos não térmicos adquiridos com a aplicação pulsada.
O efeito térmico usualmente é acompanhado de intensidades mais altas,
e é proveniente do modo contínuo, condicionando a célula a uma excitação que
aumenta a atividade celular, por meio da associação entre a cavitação estável e
a transmissão acústica.29 Também através da aplicação no modo contínuo são
encontrados efeitos como expressão de ácido ribonucleico (RNA) específico
para cartilagem em cultura de condrócitos30 e hipertrofia das fibras
musculares.31,32
A ação térmica apresenta fins curativos de lesões em partes ósseas e
moles, tendo como objetivo analgesia, redução da espasticidade e rigidez
articular, aumento do fluxo sanguíneo e produção de colágeno.33
Já o efeito atérmico, obtido na aplicação pulsada, habitualmente é
direcionado ao tratamento de lesões mais graves ou agudas, por melhorar a
qualidade e velocidade da recuperação sem aumentar a temperatura local29.Os
21
efeitos atérmicos resultam de eventos mecânicos (cavitação, correntes acústicas
e microfluxo) produzidos pela passagem da onda sonora nos tecidos e estão
relacionados: ao aumento da permeabilidade da pele e da membrana celular, ao
aumento dos níveis de cálcio intracelular, ao aumento da síntese proteica, da
atividade de fibroblastos e condrócitos, ao aumento da degranulação de
mastócitos e da atividade dos macrófagos.26
Uma série de processos biológicos estão entre os efeitos atérmicos do
ultrassom, a micromassagem, correntes acústicas, ondas estacionárias e
cavitação.34
A micromassagem atribui-se as oscilações provocadas pelo feixe
ultrassônico que atravessa os tecidos. A movimentação desses provoca um
aumento na circulação dos fluidos intra e extracelulares, facilitando a retirada de
catabólitos e a oferta de nutrientes. A micromassagem, devido ao efeito
mecânico, vibrações sônicas que o ultrassom provoca, acaba gerando calor por
fricção.34,35,36
Cavitação é a formação e o crescimento de cavidades ou bolhas de ar, ou
vapor, em um meio. Esse fenômeno pode ser induzido pela irradiação
ultrassônica. Nas células biológicas, o ultrassom pode alterá-las tanto estrutural
como funcionalmente através da cavitação, pois o colapso das bolhas libera
grande energia que pode romper ligações moleculares, provocando a produção
de radicais livres H+ e OH-, altamente reativos, e, como consequência, causar
alterações químicas nas células, chegando até a provocar a lise celular.15
Existem dois tipos de cavitação: a cavitação estável e cavitação
instável, sendo a primeira responsável pela produção dos efeitos terapêuticos
desejados e a segunda pelos efeitos deletérios as células.
A cavitação estável define a presença de bolhas de gás nos fluídos
devido à energia ultrassônica.37 Estas bolhas são em diferentes espessuras e
tamanhos dependendo do tipo do sinal do ultrassom e com o movimento do
fluído local.
Transmissão acústica é definida como um fluído perto de uma estrutura
vibrante como uma bolha de gás de cavitação estável resultando em
transmissões localizadas de alta velocidade. Estes mecanismos causam
movimentação e transferência nos íons intra e extracelular. Um aumento na
22
transferência de íons intra-celular altera a permeabilidade da membrana,
resultando em alteração das propriedades eletrofisiológicas das células. Foi
provado que a aplicação do ultrassom aumenta a condutibilidade dos íons para
22% e diminui a necessidade de consumo da adenosina trifosfato pelo canal de
sódio-potássio.38
O ultrassom pode se apresentar em altas e baixas frequências e
potencias, consequentemente pode ter diferentes efeitos no tecido a ser tratado.
Quando o ultrassom se propaga, o material torna-se compactado. Assim, as
ondas de pressão entram no meio e se expandem novamente quando saem. Em
tecidos vivos, estas repetidas compressões e rarefações podem causar bolhas
microscópicas em forma biológica de fluidos que crescem em tamanho e oscilam
até que implodem. Altas temperaturas podem ocorrer dentro das bolhas e as
forças geradas pelo colapso das bolhas podem causar a morte celular através
de processos mecânicos.39
O processo pelo qual pequenas bolhas em um líquido são forçadas a
oscilar na presença de um campo sonoro é chamado de cavitação não-inercial
ou estável. No entanto, quando um volume de líquido é submetido a uma pressão
suficientemente baixa, pode ocorrer o rompimento da bolha, sendo
consequência deste efeito a cavitação instável.40 Este processo mecânico é
produzido por equipamentos de ultrassom em altas potências ou em baixas
frequências e associado às altas temperaturas produzidas pelo fenômeno de
cavitação que são suficientes para destruir o tecido focalizado, mas existe a
grande vantagem de que o tecido circundante tratado permanece inalterado.41
Os efeitos da cavitação no tecido têm aplicações terapêuticas, mas ainda pouco
estudadas e, às vezes, estes efeitos podem ser imprevisíveis e difíceis de
controlar.42, 43
A frequência, a intensidade e o tipo de tecido submetido à irradiação
implicam no grau de aquecimento gerado pelo aparelho. Mas, para que esteja
dentro dos padrões desejados, é fundamental que o tecido tratado atinja uma
temperatura entra 40 e 45°C por cerca de cinco minutos. Caso a temperatura
não atinja esse número, existe a possibilidade de não serem obtidas as ações
terapêuticas desejadas, e também se esse valor for superior, pode haver danos
celular. 44,45
Para que haja uma resposta fisiológica, a área a ser tratada, o modo de
23
emissão (contínuo ou pulsado), o período de aplicação e de aquecimento, a
dimensão a ser aquecida, a presença de superfícies refletoras, a temperatura
máxima alcançada, a profundidade (1 ou 3 MHz), a técnica de aplicação, e as
características específicas de cada aparelho, são essenciais em sua
delimitação.19
Tanto no modo pulsado como no contínuo, há indução de respostas como
analgesia, regressão de edema e aceleração cicatricial em injúrias teciduais,
propiciando assim, maior rapidez no retorno da função.31
Ambos ocorrem no organismo, mas a proporção e a magnitude de cada
um deles dependem do ciclo de fornecimento e da intensidade de saída37. Sendo
assim, a profundidade de penetração aumenta com a elevação da frequência.32
3.3 Aplicação do ultrassom em reparo do tecido ósseo
O USP é utilizado desde quando Yasuda, em 1957,45 constatou o conceito
de piezoeletricidade do osso. Desde então, estudos vem sendo realizados para
investigar os efeitos do ultrassom na aceleração do reparo ósseo.
O reparo ósseo é um processo regenerativo complexo que inclui uma
série de eventos biológicos, como a síntese ativa de genes e a ação de um
grande número de células e proteínas, que determinarão a reestruturação do
tecido ósseo. No entanto, no decorrer desse processo, podem ocorrer alterações
que irão prejudicar ou atrasar a regeneração ou até mesmo que ocorra a não-
união óssea.46
O reparo ósseo pode ser influenciado positivamente pelo uso do USP por
acelerar o metabolismo e auxiliar no controle do processo inflamatório, com
consequente aumento da síntese de colágeno, permitindo a aceleração da
consolidação óssea.22
A consolidação da fratura é um processo que envolve a proliferação e
diferenciação celular, quimiotaxia e síntese de matriz extracelular, responsável
pelo restabelecimento da integridade mecânica, e consequentemente funcional,
do tecido ósseo. No entanto, este processo, pode ocorrer lentamente (retardo de
consolidação) ou até não acontecer (pseudoartrose), resultando em deficiência
ou incapacidade dos indivíduos.47
24
A propriedade elétrica do tecido ósseo, particularmente a
piezoeletricidade, motivou diversos pesquisadores a desenvolverem técnicas
que repercutissem na alteração do metabolismo ósseo, caso a consolidação não
ocorresse no tempo esperado ou até mesmo para acelerar esse metabolismo
em fraturas recentes. A aceleração do processo de consolidação de fraturas por
US, de forma pulsada, encontra-se bem documentada na literatura científica.41,42
O estímulo elétrico produz uma maior atividade mitótica das células, as
quais se agruparão segundo polaridades compatíveis com sua natureza, onde
osteoblastos serão atraídos pelo pólo negativo e os osteoclastos pelo pólo
positivo, promovendo, assim, o reparo ósseo segundo o processo de
retroalimentação negativa.49
Em estudo de Oliveira et al.,50 estes relatam que a aceleração da
consolidação da fratura utilizando o USP está interligada ao tipo de fratura, a
modulação do aparelho do ultrassom e a fase de reparo em que será estimulada.
O modo de ultrassom efetivo para tal resultado deve ser pulsado e com
intensidade de 30 mW/cm2, de forma estacionária. Os resultados indicaram que
a irradiação deve ser realizada na fase inflamatória até a segunda semana pós
fratura.
De acordo com Silveira et al.,51 utilizando ultrassom no reparo ósseo de
cães na modalidade de emissão pulsado e contínuo; frequência do transdutor de
1 e 3 MHz, com intensidade de 0,5 e 1 W/cm² com duração de aplicação de 5
minutos por 20 dias, não observaram alterações significativas da densidade
mineral óssea entre os membros tratado e controle.
Segundo Gonçalves et al.,52 relatam que no tecido ósseo fraturado, as
cargas elétricas ultrassônicas atuam alterando o comportamento das células
mesenquimais e aumentando a atividade mitótica, o que resulta em um aumento
local das células precursoras de fibroblastos e osteoblastos. Portanto, o
ultrassom, também, aumenta a síntese proteica, interferindo favoravelmente na
polimerização dos precursores do colágeno e, consequentemente, promovendo
maior deposição óssea.
Guerino et al.,53 relatam que o ultrassom tem sido amplamente utilizado
como um agente terapêutico com a finalidade de acelerar o processo de
reparação, modificando a produção de tecido cicatricial e reduzindo a dor.
25
3.4 Instrumentos de Avaliação
O MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide é
um composto de tetrazólio que tem sido utilizado nos ensaios de viabilidade
celular in vitro para avaliar a citotoxicidade, proliferação de células para detectar
células viáveis. O mesmo é carregado positivamente e penetra prontamente nas
células eucarióticas viáveis. O ensaio de MTT quantifica, portanto, a taxa de
proliferação celular.54
Estes ensaios são baseados na absorção óptica e avaliam a função
celular por uma redução detectável de um produto por enzimas específicas
(ELISA – Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), determinando assim
atividades fisiológicas vitais. Entre outros, ensaios que utilizam reagentes
colorimétricos destaca-se Vermelho Neutro (NR), Commassie Azul (CB), Alamar
Blue (AB) e das Enzimas Lactato Desidrogenase (LDH). 54,55
O ensaio colorimétrico quantitativo mede sobrevivência e proliferação,
pois o anel de tetrazólio é clivado na mitocôndria ativa, por conseguinte, é
utilizado para medir citotoxicidade, proliferação ou ativação, os resultados
podem ser lidos num espectrofotômetro de varrimento com múltiplas cavidades
(Leitor de ELISA) e apresenta um elevado grau de precisão.56
As células viáveis com metabolismo ativo convertem o MTT em um
produto formazana roxo. Quando as células morrem, perdem a capacidade de
converter MTT em cristais de formazana, portanto, a cor serve como um
marcador útil apenas as células viáveis. 55
26
4. ARTIGO
AÇÃO DA TERAPIA ULTRASSÔNICA PULSADA EM CÉLULAS
OSTEOBLÁSTICAS OFCOL II
Mayra Paula de Oliveira Lima¹, Ana Flávia Spadaccini Silva¹, Priscila Daniele de
Oliveira2, Rodrigo Franco de Oliveira3, Deise Aparecida de Almeida Pires-Oliveira3
1. Fisioterapeuta, mestranda do Programa de Pós-Graduação Mestrado e doutorado
associado UEL/UNOPAR Ciências da Reabilitação – Universidade Norte do Paraná
2. Fisioterapeuta, doutoranda do Programa de Pós-Graduação Mestrado e doutorado
associado UEL/UNOPAR Ciências da Reabilitação – Universidade Norte do Paraná
3. Fisioterapeuta, doutor, docente do Programa de Pós-Graduação Mestrado e doutorado
associado UEL/UNOPAR Ciências da Reabilitação – Universidade Norte do Paraná
Endereço para correspondência:
Deise A. A. Pires-Oliveira
UNOPAR - Universidade do Norte do Paraná. Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde.
Laboratório de Cultura Celular. Av. Paris, 675. Jd. Piza, CEP: 86041-140, Londrina-PR.
e-mail: [email protected]
Conflito de Interesse: Não há conflito de interesses.
Agradecimento
Fonte de Financiamento: Fundação Nacional de Desenvolvimento do Ensino Superior
Particular (FUNADESP).
27
Resumo
Introdução: O Tecido ósseo, é um tecido em desenvolvimento que tem atividade de
crescimento e remodelação. No entanto, para reparo de uma lesão óssea, o ultrassom
pulsado (USP) tem sido muito utilizado, pois apresenta grande potencial osteogênico.
Objetivo: Analisar os efeitos da terapia ultrassônica de baixa intensidade em cultura
celular de osteoblastos. Métodos: As células OFCOLII foram cultivadas em frascos de
25 cm3 com 90% meio DMEM, suplementados com 10% SFB e 1% antibiótico e
antimicótico, mantidas na estufa de CO2 em atmosfera de 5% a 37°C e em seguida foram
plaqueadas em placa de 12 poços. Para irradiação foi utilizado o ultrassom de 1 MHz e as
células foram divididas em cinco grupos: Grupo 1 (controle), Grupo 2 (0,2 W/cm² - 10%),
Grupo 3 (0,5 W/cm² - 10%), Grupo 4 (0,2 W/cm² - 20%), Grupo 5 (0,5 W/cm² - 20%), e
os grupos receberam irradiação a cada 24 horas, com duração de 2 minutos cada poço,
sendo 24, 48 e 72 horas. Para avaliação de proliferação celular foi utilizado o método
MTT, realizado 24 horas após a cada irradiação ultrassônica. Resultados: Dos grupos
analisados, o G2 (0,2 W/cm² - 10%) foi o que apresentou um aumento significativo na
proliferação celular, em 24 e 48 horas (p=0,04), e posteriormente apresentando uma queda
para 72 horas. Conclusão: A dosagem 0,2 W/cm2 com regime de pulso 10%, apresentou
a melhor resposta para a proliferação celular. Os resultados in vitro demonstram efeito do
ultrassom nas células osteoblásticas OFCOLII, indicando que este recurso induz
proliferação celular, sendo assim, este resultado pode ajudar futuras investigações no uso
da terapia ultrassônica e tratamento de patologias ósseas.
Palavras-chave: Ultrassom, Osteoblastos, Reparo ósseo, Reabilitação
28
ABSTRACT
Introduction: Bone tissue is a developing tissue that has growth and remodeling activity.
However, for repair of a bone lesion, pulsed ultrasound (USP) has been widely used
because it presents great osteogenic potential. Objective: To analyze the effects of low
intensity ultrasonic therapy on osteoblast cell culture. Methods: OFCOLII cells were
cultured in 25 cm 3 flasks with 90% DMEM medium, supplemented with 10% FBS and
1% antibiotic and antimycotic, maintained in the CO2 oven in 5% atmosphere at 37 ° C
and then plated in 12 well plate. For irradiation, 1 MHz ultrasound was used and the cells
were divided into five groups: Group 1 (control), Group 2 (0.2 W / cm² - 10%), Group 3
(0.5 W / cm² - 10% ), Group 4 (0.2 W / cm² - 20%), Group 5 (0.5 W / cm² - 20%), and
the groups received irradiation every 24 hours, lasting 2 minutes each well, 24 , 48 and
72 hours. To evaluate cell proliferation, the MTT method was used 24 hours after each
ultrasonic irradiation. Results: G2 (0.2 W / cm² - 10%) showed a significant increase in
cell proliferation, in 24 and 48 hours (p = 0.04), and afterwards showed a drop to 72
Hours. Conclusion: The dosage 0.2 W / cm2 with a 10% pulse rate presented the best
response to cell proliferation. The in vitro results demonstrate the effect of ultrasound on
the OFCOLII osteoblastic cells, indicating that this feature induces cell proliferation, thus,
this result may help future investigations in the use of ultrasonic therapy and treatment of
bone pathologies
Key words: Ultrasound, Osteoblasts, Bone repair, Rehabilitation
29
1- INTRODUÇÃO
O osso é um tecido extremamente ativo. No esqueleto em desenvolvimento, essa
atividade é primariamente voltada para o crescimento e a remodelação óssea, processos
pelos quais o osso atinge sua forma e seu tamanho. A remodelação óssea é definida como
um processo de aposição no qual há remoção localizada do osso antigo (reabsorção) e
substituição por osso recentemente formado. [1].
Entretanto quando ocorre uma lesão óssea o ultrassom terapêutico vem se
destacando devido ao seu grande potencial osteogênico. Vários autores demonstraram a
eficiência do USP na aceleração da consolidação óssea após uma fratura e também no
aumento das propriedades biomecânicas do calo ósseo em animais. [2, 3].
De acordo com Korstjens [4], a terapia ultrassonica de baixa intensidade é uma
forma de energia mecânica administrada a um organismo com muitas ondas de pressão
acústica frequentes. Esta terapia é considerado como não-térmica e não-destrutiva, pois
são ondas de baixa pressão acustica. O aquecimento dos tecidos é menor que 1ºC e,
nenhuma atividade elevada de temperatura ocorre a nível celular.
Adicionalmente, esta terapia tem sido amplamente investigada como um
estimulador de formação óssea. Embora o seu mecanismo ainda não seja completamente
conhecido e definido, sabe-se que o ultrassom estimula vários estágios no processo de
regeneração óssea [5].
De acordo com Xu et al. [6], os ensaios clínicos têm demonstrado potenciais
terapêuticos na aplicação do ultrassom pulsado de baixa intensidade na cicatrização de
fratura. As evidências sugerem que este recurso pode aumentar a espessura osteóide e
volume ósseo, onde atinge os seus efeitos biológicos por osteogênese e remodelação
óssea.
Várias investigações têm estabelecido um efeito estimulador do tratamento com
ultrassom pulsado (USP) sobre a osteogênese e fratura. No entanto, a ação desse recurso
atuante no metabolismo celular osteoblástico in vitro, não foi totalmente elucidado,
havendo uma escassez de literatura cientifica com este recurso em cultura celular
osteoblástica. Diante do exposto, os resultados dessa pesquisa nortearão para o aumento
do processo de estimulação e proliferação de células osteoblásticas a partir da terapia
ultrassônica de baixa intensidade. [1,7,8]
30
Espera-se, dessa forma que o USP tenha um efeito positivo sobre as células
osteoblásticas contribuindo para a proliferação das mesmas, e ainda constatar qual a
melhor dose para a estimulação desse processo.
Sendo assim esse estudo tem como objetivos analisar os efeitos da terapia
ultrassônica pulsada de baixa intensidade em cultura celular de osteoblastos, avaliando a
proliferação celular e parâmetros de dosimetria da irradiação ultrassônica,
correlacionando com processo de reparo ósseo.
2- MATERIAIS E MÉTODOS
Cultura Celular
Células osteoblásticas OFCOL II, Mus Musculus (Mouse, Balb/C), obtidas de
Banco de Células do Rio de Janeiro – BCRJ - Brasil) sub cultivadas em garrafas de 25cm3
(TPP, Switzerland, Europe) com meio DMEM Low Glucose (Dulbecco Minimum
Essential Medium – GibcoBRL, Grandlsland, NY), contendo 5% (vol/vol) soro fetal
bovino (SFB – GibcoBRL), 100 U/mLpenicilina, 100 mM/mLstreptomicina e 0.25
μg/mLfungicida (GibcoBRL), mantidas em uma estufa de CO2 em atmosfera 5% a 37ºC.
O estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética da Universidade Norte do Paraná
(UNOPAR), sob o protocolo nº 462.478/2013.
Irradiação
A irradiação ultrassônica foi realizada com um equipamento da marca KLD®
(Biossistemas Equipamentos Eletrônicos Ltda.), modelo Avatar III, com cabeçote de 1
MHz, BNR (taxa de uniformidade do feixe) ≤ 6 com área de irradiação efetiva (ERA) de
1 cm², devidamente calibrado pelo fabricante.
Após as células apresentarem semi confluência (80%), foram tripsinizadas e
plaqueadas em uma placa TPP de 12 poços com medidas de 24mm de diâmetro e 18 mm
de profundidade, em uma densidade 1x106 células/ml. Após o plaqueamento as células
ficaram 24 horas em repouso para a sedimentação. Em seguida iniciou-se o processo de
irradiação de acordo com os grupos apresentados a seguir.
31
Grupo Intensidade
(W/cm²)
Regime de
pulso
Ciclo de
trabalho
Frequência
GI Grupo controle – Não irradiado
G2 0,2 10% 1:9 100 Hz
G3 0,5 10% 1:9 100 Hz
G4 0,2 20% 2:8 100 Hz
G5 0,5 20% 2:8 100 Hz
Quadro 1. Parâmetros de irradiação ultrassônica
Objetivando um bom acoplamento do transdutor (distância da camada de células
a interface do ultrassom 18mm) e propagação da onda mecânica para que a irradiação
fosse eficaz, os volumes dos poços foram completados com meio DMEM até a borda e
cada poço foi irradiado e mantido sempre na mesma posição em relação a face do
transdutor do ultrassom. Dessa forma, a irradiação foi realizada 2 minutos por poço em
temperatura ambiente, nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. Todos os experimentos foram
realizados em triplicata e após cada período as culturas foram avaliadas pelo teste MTT.
Teste de citotoxicidade celular por MTT
Os experimentos de citotoxicidade foram avaliados pelo método de MTT Brometo
de [3-(4,5-dimetiltiazol)- 2,5-difeniltetrazólio]. As culturas de células OFCOL II
receberam irradiação de ultrassom nos intervalos de 24, 48 e 72 horas, sendo que após 24
horas de cada irradiação realizou-se o teste de MTT de acordo com ensaio a seguir:
retirou-se o meio de cultura de cada poço, adicionado 500l MTT e incubado por 01 hora
a 37C em atmosfera de 5% em estufa de CO2. Em seguida, retirou-se o MTT e adicionou
500l de DMSO (Dimetil Sulfóxido) em cada poço, posteriormente as placas foram
mantidas em agitação por 20 minutos para solubilização dos cristais de formazana e sua
concentração quantificada espectroscopicamente por meio de um leitor de microplacas
(Leitor ELISA – SpectraCount – Packards Instrument, Offeburg – Alemanha), em
comprimento de onda de 546 nm. [9]
32
Análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o programa BioEstat 5.0. Os
resultados foram expressos em valores de média e desvio padrão, com avaliação da
normalidade verificada pelo teste de Shapiro-Wilk. Para análise simultânea dos grupos,
utilizou-se a Análise de Variância (ANOVA) e o teste post hoc de Tukey para verificar
os efeitos entre as diferentes intensidades e em relação ao tempo. Ambos adotaram o
intervalo de confiança de 95% e valores de p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente
significativos. Foi utilizado o GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA,
EUA) para a realização dos gráficos. Considerou-se resultado estatisticamente
significativamente quando o valor de p≤0,001 ou alterações maiores que 1,5 vezes
considerando valor de p<0,05.
3- RESULTADOS
MTT
Os efeitos induzidos nas células OFCOL II irradiadas pelo ultrassom nas
diferentes intensidades e regimes de pulso, foram determinadas com o auxílio do teste de
MTT e a microscopia óptica nos respectivos grupos G2: 0,2W/cm2-10%; G3: 0,5W/cm2-
10%; G4: 0,2W/cm2-20% e G5: 0,5W/cm2-20% respectivamente. Todos foram
acompanhados a cada 24 horas de intervalo. O G1 (controle - não irradiado), foi
submetido as mesmas condições e análises.
A média do valor de crescimento celular baseado em cada densidade de energia
está apresentado na Tabela 1. Observa-se que as células irradiadas a 0,2 e 0,5 W/cm2 10%
e 0,2 W/cm2 com regime de pulso 20% apresentaram o mesmo comportamento de
crescimento no tempo 48 horas, quando comparado intra-grupo, porem ressalta o melhor
crescimento a 0,2W/cm2-10% (p<0,04). Ressaltando queda da proliferação celular após
72 horas da primeira irradiação.
33
Tabela 1 – Comparação das médias de proliferação celular intra-grupo em relação
aos tempos.
24 hrs 48 hrs 72 hrs p
G1 94 ± 5,57 92,6 ± 4,13 83 ± 9,19 0,78
G2 103 ± 8,71 113 ± 4,96 103,8 ± 12,71 0,04*
G3 107 ± 14,62 108 ± 13,65 93,4 ± 6,18 0,99
G4 97,8 ± 2,16 104,8 ± 8,75 88,6 ± 3,45 0,25
G5 91,8 ± 5,21 89,8 ± 2,68 80,4 ± 4,27 0,63
*Valores significativos
Quando analisados entre os grupos, observa-se diferença significativa em todos
os tempos conforme demonstra a tabela 2 e figura 1.
Tabela 2 – Comparação das médias da proliferação celular entre os grupos
G1 G2 G3 G4 G5 p
24 hrs 94 ± 5,57 103 ± 8,71 107 ± 14,62 97,8 ± 2,16 91,8 ± 5,21 0,03*
48 hrs 92,6 ± 4,13 113 ± 4,96 108 ± 13,65 104,8 ± 8,75 89,8 ± 2,68 0,00*
72 hrs 83 ± 9,19 103,8 ± 12,71 93,4 ± 6,18 88,6 ± 3,45 80,4 ± 4,27 0,00*
*Valores significativos
Ao comparar os valores de células viáveis pelo teste MTT nos grupos G1, G2,
G3, G4 e G5, observou diferença significativa entre os grupos em todos tempos (24hs:
p=0,03; 48hs: p=0,00 e 72hs: p=0,00) e momentos avaliados.
Ao analisar aos pares, em 24 horas, observa-se a variação entre os grupos
0,5W/cm2- 10% e 0,55W/cm2 - 20% (p=0,00). No tempo 48 horas, o grupo que apresentou
maior porcentagem de proliferação celular foi o 0,2W/cm2-10% (113%) o que diferiu dos
demais grupos quando comparados. A proliferação celular no pulso 10% foi maior do que
no pulso 20% neste tempo. A partir do pós-teste, foi possível observar as diferenças entre
controle e as demais intensidades no tempo de 48 horas, 0,2W/cm2-10% (p=0,01),
0,5W/cm2-10% (p=0,05), 0,2W/cm2-10% e 0,5W/cm2-20% (p=0,01), 0,5W/cm2-10% e
0,5 W/cm2-20% (p=0,05), 0,2W/cm2-20% e 0,5 W/cm2-20% (p=0,05).
34
Apesar do tempo 72 horas ter apresentado uma diminuição nas médias de
proliferação celular, ainda foi possível notar diferença significativa entre os grupos
(p=0,00). A variação significativa ocorreu entre controle e 0,2W/cm2-10% (p=0,01),
controle e 0,5W/cm2-10% (p=0,05), 0,2W/cm2-10% e 0,5W/cm2-20% (p=0,01),
0,5W/cm2-10% e 0,5W/cm2-20% (p=0,05), 0,2W/cm2-20% e 0,5W/cm2-20% (p=0,05).
No presente tempo, o grupo 0,2W/cm2-10% também apresentou a maior porcentagem de
proliferação celular e os dois grupos no regime de pulso 10% obtiveram as maiores
médias em relação ao regime de pulso 20%.
Figura 1. Crescimento celular em relação ao tempo e intensidade
35
MICROSCOPIA ÓPTICA
As análises fotográficas foram realizadas antes de cada Teste de MTT. As células
foram fotografadas pelo microscópio invertido Nikon TS-100, em lente objetiva 20x
LWD 20 x 0,40, as mesmas se encontravam sedimentadas em placas de 24 poços.
As imagens da figura 2 apresentam as células OFCOLII, após irradiação com
ultrassom em relação aos tempos do grupo 0,2 W/cm²-10%. Figura 2A: grupo controle
não irradiado, figura 2B: 24 horas, observa-se células com morfologia adequada e semi
confluência, figura 2C: 48 horas onde obteve a melhor média de proliferação; as células
apresentaram espraiadas, aderidas, e confluentes e a figura 2D: 72 horas observa-se
células retraídas, perda de confluência e de morfologia.
Figura 2. Microscopia Óptica - Células OFCOLII - A: controle não irradiado, B:
irradiadas a 24 horas, C: irradiadas a 48 horas, D: irradiadas a 72 horas
36
4 - DISCUSSÃO
Os resultados deste estudo demonstram que a terapia ultrassônica estimulou a
proliferação celular osteoblástica, principalmente em 24 e 48 horas observando este
comportamento em todos os tempos e parâmetros apresentados, porém na intensidade de
0,2 w/cm2 a 10% no tempo de 48hs apresentou o melhor desempenho celular.
Embora exista uma extensiva literatura sobre aplicação da terapia ultrassônica
para estimulação de consolidação óssea in vivo, há escassez de informações em relação a
esta terapia in vitro, principalmente em relação a células osteoblásticas e diversidade de
parâmetros. [4,10]
A terapia ultrassônica de baixa intensidade, é uma forma de energia mecânica
administrada a um organismo (in vivo) que pode ser considerada como não térmica e não
destrutiva, a partir da baixa intensidade das ondas de pressão acustica; porém, ocorre um
pequeno aquecimento dos tecidos, menor que 1ºC, o que não altera a atividade celular
[11,12].
A escolha do recurso na frequência de 1MHz, fundamentou-se em relação ao
presente estudo por ser em células osteoblásticas. Devido a sua capacidade de estimulação
mecânica este recurso é amplamente investigado como um estimulador de formação
óssea. [5] A interação do ultrassom com tecidos pode induzir efeitos mecânicos, químicos
e térmicos, dependendo do equipamento usado, bem como os parâmetros estabelecidos,
que por sua vez pode levar a vários efeitos biológicos. [12]
Gusmão e Belangero, [13], Kang et al., [14] relataramm que este recurso é
extensamente utilizado para diversos fins na área da ciências da saúde e que os princípios
físicos como amplificação do estímulo mecânico, força de arrasto e estresse de
cisalhamanto, têm a capacidade de produzir in vitro resultados positivos em relação à
proliferação e à diferenciação das células ósseas.
Tassinary et al., [15] objetivando avaliarem o efeito do USP (1MHz; 0,2W/cm2-
20%, por 30 min) na proliferação de pré-osteoblastos in vitro, observaram que o USP
aumentou o número de células pré osteoblásticas após 16, 24 e 48 horas pós irradiação.
Os estudos sugeriram que tanto in vivo quanto in vitro o uso do USP foi capaz de
promover proliferação celular, diferenciação osteogênica e formação de matriz
extracelular. Nossa pesquisa corrobora com os resultados de Tassinary em relação a
intensidade 0,2W/cm2 tanto para o ciclo de pulso 10% e 20% no tempo de 48 horas.
37
Pires-Oliveira, [16] em um estudo comparativo entre laser e USP em células
fibroblásticas (L929) avaliaram citoesqueleto e reticulo endoplasmático, estruturas estas,
importantes para proliferação celular e observaram que o ultrassom foi mais efetivo nas
células marcadas para análise de reticulo endoplasmático nas intensidades (0,2 e
0,6W/cm2 - 20%), enquanto o laser demonstrou mais efetivo para citoesqueleto. O
presente estudo apresentou maior efetividade do ultrassom na intensidade de 0,2 W/cm2
-10%, quando comparado com estudo acima.
Segundo Wu et al., [17] analisando os efeitos do ultrassom pulsado de baixa
intensidade (1.0 MHz, intensidade de 30 mW/cm2 por 20 min.) em celulas osteoblásticas
humanas normais (NHOst) e em modelo animais com osteoporose, observaram que o US
acelerou formação de nódulos mineralizados, diferenciação celular e aumento da
fosfatase alcalina. Mediante estes dados os autores concluiram que o US acelera
osteogênese, e uma vez que este impede perda de massa óssea, pode ser um tratamento
promissor para osteoporose.
Na mesma linha de estudo de Wu et al., [17], Xu et al., [6], relatam que o US é
um recurso de grande potencial terapêutico, sendo uma modalidade de tratamento não
invasivo em lesões ósseas e não apresenta efeitos adversos. As evidências sugerem que o
US pode aumentar a espessura osteóide e volume ósseo. Em estudos in vitro, o US
aumentou a proliferação e maturação osteoblásticas, bem como a formação da matriz
extracelular. Evidencia-se que a angiogênese está associada com a osteogênese,
fornecimento de oxigênio, células estaminais e fatores de crescimento que promovem o
processo osteogênico.
O ultrassom tem sido interesse de varios pesquisadores, não somente em células
normais ósseas bem como em células tumorais. Sawai et al., [18] investigaram o efeito
do US (30 mW/cm2, frequência de 1,5 MHz, 20 minutos, 48 hs) em diversas células
tumorais, ósseas, pulmão, renal e próstata, objetivando analisar se a terapia ultrassônica,
promovia a formação óssea sem acelerar a proliferação de células tumorais. Dessa forma
observaram que a estimulação pelo US em tumores ósseos metastáticos induziu a
diferenciação de osteoblastos sem proliferação de células tumorais, sugerindo que US
pode ser também um novo método de tratamento sem cirurgia para tumores ósseos
metastáticos.
No estudo de Silva et al., [19] ressalta-se que os efeitos da aplicação do ultrassom
não dependem apenas da intensidade, modo de emissão e frequência, mas também têm
relação com o tempo de intervenção. O atual estudo, utilizou um tempo padrão de 2
38
minutos por poço baseado no estudo de Oliveira et al., 2008 que também obtiveram
viabilidade celular com esse tempo, porém utilizando células fibroblásticas.
De acordo com Oliveira et al., [2] utilizando a terapia Ultrassônica em células
fibroblásticas, irradiadas a 0,3W/cm2(10% e 20%) e 0,5W/cm2 (20%), observaram
aumento no percentual da viabilidade celular nestes grupos, porém o grupo irradiado a
0,5W/cm2 (10%) obteve o melhor crescimento em todos os tempos avaliados (24, 48 e 72
horas). No presente estudo, no tempo de 48 apresentou o melhor comportamento celular
para os grupos 0,2 e 0,5-10% e 0,2-20%; havendo um decréscimo celular para o tempo
de 72 horas, contrariando os resultados de Oliveira et al. 2015.
Segundo Nagasaki et al.,[20] relatam que em relação a terapia ultrassônica há uma
diversidade de parâmetros para análise de proliferação celular; bem como, resposta
divergente em relação aos efeitos sobre osteoblastos ou outras células. Os efeitos dessa
terapia podem variar devido os parâmetros de excitação tais como intensidade, frequência
e tipo de onda.
A utilização de cultura de células tem sido de fundamental importância para a
pesquisas. Investigações indicam que o USP é eficaz para o
tratamento de diferentes tipos de células que desempenham um papel importante nos
processos de cicatrização de fratura. [21]
Katiyar et al., [22] referem que a aplicação do USP próximo ao campo de
estimulação é um método viável para aumentar proliferação celular de cultura em
monocamada, neste caso cultura osteoblastica. A proliferação das celulas osteoblasticas
induzidas pelo USP desempenha um papel importante na formação dos ossos, acelerando
a consolidação da fratura. Porém há necessidade de melhor padronização parâmetros
para aplicação clinica. E por conseguinte, receber cada vez mais atenção no campo das
terapias de regeneração.
39
CONCLUSÃO
Os avanços nos estudos do uso do USP com frequência de 1 MHz em células
osteoblásticas têm contribuído para uma maior compreensão tanto da remodelação óssea
quanto do seu processo de reparação. Especialmente a intensidade 0,2 W/cm2 com regime
de pulso 10%, indicando que este recurso induz proliferação celular, no qual pode ajudar
futuras investigações no uso da terapia ultrassônica e tratamento de patologias ósseas.
40
REFERÊNCIAS ARTIGO
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influência da deficiência estrogênica no processo de remodelação e reparação óssea, J
Bras Patol Med Lab 42 (2006) 5-12
[2] P. D. Oliveira, D. A. A. Pires-Oliveira, C. C. Martinago, R. C. Poli-Frederico, C.
P.Soares, R. F.Oliveira.Efeito da terapia ultrassônica de baixa intensidade em cultura
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5. CONCLUSÃO GERAL
Existem muitas evidências científicas que demonstram os efeitos
biológicos positivos do ultrassom de baixa intensidade, sobre o tecido ósseo,
este é um dos vários recursos capazes de promover a estimulação mecânica em
células ósseas. A terapia ultrassônica é um método viável para proliferação
celular de osteoblastos, dessa forma, o aumento de osteoblastos estimulados
pela terapia, desempenha papel importante na formação e regeneração óssea e
consolidação de fraturas.
No entanto, afirmar qual o melhor parâmetro é muito difícil, pois estes
parâmetros são bastante variáveis, tempos de tratamento e regimes de pulso
utilizados em cada estudo são muito distintos. Pesquisar sobre os parâmetros
ideais para estimular a osteogênese em diferentes estados biológicos como, por
exemplo, no tecido ósseo normal, ou com consolidação tardia ou na
osteoporose, faz-se necessário.
Assim a investigação de pesquisas in vitro é importante a fim de que os
resultados possam ser extrapolados para a prática clínica. A fisioterapia com
auxílio do ultrassom na consolidação óssea desempenha um papel fundamental
na reabilitação. Por isso, é necessário a continuidade e aprofundamento das
pesquisas utilizando esse recurso em cultura celular, visando à elaboração de
protocolos e a determinação de parâmetros ideais, fortalecendo, assim, sua
comprovação científica para a prática clínica.
44
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Projeto de Pesquisa
54
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Normas Da Revista
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59
60
61
62
63
64
65
