Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

ANA GABRIELA LEDO SANTOS DA SILVA

A INTERLEUCINA-4 BLOQUEIA A PROLIFERAÇÃO DE PROGENITORES E

AUMENTA A DIFERENCIAÇÃO DE FOTORRECEPTORES NA RETINA POR VIAS

DE SINALIZAÇÃO DISTINTAS

Rio de Janeiro 2008

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ANA GABRIELA LEDO SANTOS DA SILVA

A INTERLEUCINA-4 BLOQUEIA A PROLIFERAÇÃO DE PROGENITORES E

AUMENTA A DIFERENCIAÇÃO DE FOTORRECEPTORES NA RETINA POR VIAS

DE SINALIZAÇÃO DISTINTAS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).

Orientador: Alfred Sholl Franco

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2008

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Neurogênese, Programa de Neurobiologia, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF), Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), sob orientação do professor Alfred Sholl Franco, na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), e pelo Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX).

ii

Silva, Ana Gabriela Ledo Santos da A Interleucina-4 bloqueia a proliferação de progenitores e aumenta a

diferenciação de fotorreceptores na retina por vias de sinalização distintas / Ana Gabriela Ledo Santos da Silva. – Rio de Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2007. XVII, 192f.: 28 il.; 29,7 cm.

Orientador: Alfred Sholl-Franco. Dissertação (mestrado) – UFRJ, IBCCF, Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2008. Referências bibliográficas: f. 114-134. 1. Neuroimunologia 2.Citocinas 3. Interleucina-4 4. Retina 5.

Desenvolvimento 6. IL-4Rα I. Sholl-Franco, Alfred. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Biofísica. IV. Título.

FOLHA DE APROVAÇÃO

“A Interleucina-4 bloqueia a proliferação de progenitores e aumenta a diferenciação de fotorreceptores na retina por

vias de sinalização distintas”

ANA GABRIELA LEDO SANTOS DA SILVA

DISSERTAÇÃO SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM

CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)

Rio de Janeiro, 12 de fevereiro de 2008. _____________________________________________ DRA. PATRÍCIA FRANCA GARDINO _____________________________________________ DRA. ANA LÚCIA MARQUES VENTURA _____________________________________________ DR. PEDRO MUANIS PERSECHINI _____________________________________________ DR. ALFRED SHOLL FRANCO (ORIENTADOR) _____________________________________________ DRA. MARIANA SOUZA DA SILVEIRA (REVISORA)

iii

Dedico este trabalho a minha amada mãe Cida, a

minha linda avó Zélia e ao meu querido orientador Alfred.

iv

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter muita saúde e poder estar aqui agora muito feliz agradecendo isso tudo a vocês! Deus, muito obrigada por nos amparar nos momentos difíceis, nos dar força interior para superar as dificuldades, mostrar-nos o caminho certo nas horas incertas e nos suprir em todas as necessidades. Que Deus nos abençoe sempre!!!

À minha linda, querida e amada Mamãe Cida, por sempre me ensinar o que é o amor incondicional. Minha melhor amiga que eu amo e me orgulho demais, obrigada por ter me dado a vida, porque a minha vida é maravilhosa!Te amo muito! Agradeço pelo seu eterno incentivo, ajuda, amor, carinho, e principalmente por ter rezado muito por mim. Nunca esquecerei das frases cativantes: “boa sorte, excelente prova” e “boa sorte, excelente apresentação”. Mamy: “todo amor que houver nessa vida”.

Ao meu querido “Papai Oscar”, por todo o amor e carinho.Pai, te amo muito!!!

À minha linda, querida e amada Vovó Zélia, te amo muito! Seu amor foi muito

importante durante esse tempo... ASNF...a son never forgets... Ao meu vovô Antonio Ledo, de 95 anos, que ainda está vivo para ver isso!!!Te

amo lindoh! À minha linda, querida e amada tia Sylvia, tb te amo muito! Ao mestre com

carinho...minha tia-avó super poderosa!!!

Ao meu tio Edu que sempre me incentivou a estudar, principalmente inglês, e inclusive já foi um grande “paitrocinador” de cursos rss...

À toda a minha família, a qual amo muito. Dinda Fátima e Tio Sam, Tio

Armando, por ajudar a carregar os muitos livros e artigos quando eu saía de casa com a “casa” nas costas, prima Bruna, pelo seu computador que usei várias vezes, Tia Tereza. Agradeço a todos pelo incentivo, amor e carinho.

Ao Curso de Pós-Graduação do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF) da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela excelência de trabalho organizacional e operacional.

Às instituições: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), e Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX).pelo suporte financeiro.

v

Ao Prof. Dr. Alfred Sholl Franco, meu querido Orientador, com muito carinho, agradeço pela bela amizade, pela excelente orientação. Agradeço pela constante presença em todos os meus seminários e reuniões de dados. Agradeço por ter me proporcionado esta maravilhosa vivência acadêmica (seminários, cursos, disciplinas, congressos, simpósios) a qual vem me acrescentando muito, tanto em âmbito profissional quanto pessoal. Agradeço pela maravilhosa companhia em todos os Congressos, os quais tive a oportunidade de participar. Querido Alf, você é o meu Príncipe Encantado da Ciência. Obrigada de todo o coração por tudo!

Ao Prof. Dr. Rafael Linden, por ter aberto as portas do Laboratório de Neurogênese para mim.

A Profa. Dra Mariana Silveira por ter sido a revisora desta tese.

A Profa. Dra Paula Campello pela sua colaboração, e também por todos os momentos simpáticos os quais pudemos vivenciar juntas nos Congressos, os quais tive a oportunidade de participar. Aproveito para agradecer a enorme simpatia de todos os membros da UFF, que tive o prazer de conhecer em Congressos, Palestras, Cursos, etc.

A Fernanda Chagas, Fernandinha, pela amizade e carinho, por torcer e acreditar em mim, pelos diversos experimentos que fizemos juntas e pelos momentos alegres e divertidos no Congresso da Fesbe/2006. A “Lammy” Arciolanda Macamma, por ter torcido e acreditado muito em mim, por ter sido uma incentivadora incansável, pelo seu carinho e amizade e também pela sua companhia maravilhosa na Fesbe/2005 e em outros Cursos que fizemos juntas.

A todos os Membros do Laboratório de Neurogênese agradeço muitíssimo pelas inúmeras ajudas que recebi na bancada (preparo de soluções e experimentos), cortes no criostato, perfusões, microscópio, e especialmente pelas inúmeras perguntas respondidas sobre os pontos do THE CELL.

A todos os Membros do Laboratório de Fisiologia da Respiração os quais

fizeram parte das etapas finais desta tese (a formatação e as intermináveis referências) e com isso me brindaram com uma dose extra de entusiasmo.

Aos meus amigos da Pós-Graduação.

vi

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho

original.”

Albert Einstein

vii

RESUMO

A Interleucina-4 (IL-4) é uma citocina anti-inflamatória que tem sido relacionada com

a diferenciação da retina de roedores in vitro. Entretanto, a presença constitutiva da

IL-4 ou do seu receptor ainda não foi relatada neste tecido. Neste trabalho nós

examinamos a expressão da IL-4 e da subunidade α do seu receptor (IL - 4Rα).

Verificamos que a IL-4Rα é expressa por células neurais retinianas e por tecidos

não-neurais oculares, enquanto a expressão da molécula de IL-4 é mais restrita ao

tecido não-neural. Nós caracterizamos um novo papel trófico para a IL-4 na retina,

onde esta molécula inibe a proliferação de células retinianas (~40%) através da

ativação da via AMPc-PKA. Além disso, este efeito está relacionado a uma redução

na expressão de ciclina D1 e a um aumento na expressão de p27kip1. A IL-4 também

promove a diferenciação de bastonetes. Este efeito foi dependente da ativação de

tirosinas cinases, da proteína cinase C, da proteína cinase ativada por mitógenos da

família da Erk e independente da liberação de outros fatores tróficos na cultura.

Juntos, os resultados mostram, pela primeira vez, que a IL-4 modula diretamente a

proliferação de células retinianas e a diferenciação de bastonetes, através de vias de

sinalização distintas.

viii

ABSTRACT

Interleukin-4 (IL-4), an anti-inflammatory cytokine, has been related to the

differentiation of the rodent retina in vitro, but constitutive presence of either IL-4 or of

IL-4 receptor in the retina has not been reported. In this work we examined the

expression of IL-4 and its specific receptor α subunit (IL-4Rα). IL-4Rα is expressed

both in neural retina and non-neural ocular tissue, while IL-4 is found mainly in non-

neural tissue. We characterized a novel trophic effect of IL-4 upon the retina. We

showed that IL-4 can inhibit the proliferation of retinal cells (~40%) through the

cAMP-PKA pathway and associated with a reduction of cyclin D1 and increase of

p27kip1. IL-4 also promotes the differentiation of rod photoreceptors. Activation of

tyrosine kinases, protein kinase C, and mitogen activated kinases of the Erk family

were required for IL-4-induced rod photoreceptor differentiation, independent of the

release of other trophic factors in culture. Taken together, our results show, for the

first time, that IL-4 directly modulates proliferation of retinal cells and rod

photoreceptor differentiation, through distinct signaling pathways.

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPc adenosina monofosfato cíclica BCGF-1 fator-1 de crescimento de células B BDNF fator neurotrófico derivado do cérebro BFA brefeldina BSA albumina de soro bovino BSF-1 fator estimulante de células B CDK cinases dependentes de ciclinas ChCl cloreto de queleritrina CKI ciclinas inibidoras de cinases CNTF fator neurotrófico ciliar CRE elemento responsivo ao AMPc CREB elemento de ligação responsivo ao AMPc DAB tetrahidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina DAG diacilglecerol DHA ácido docosahexanóico DIV dia in vitro DMEM meio de Eagle modificado por Dulbecco FCS soro fetal bovino FGFb fator de crescimento de fibroblasto básico GCL camada de células ganglionares GDNF fator neurotrófico derivado da glia GMPc guanina monofosfato cíclica GTP trifosfato de guanosina IAP proteína inibidora de apoptose IL interleucina (e.g. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 dentre outras) IL-13Rα1 subunidade α1 do receptor de IL-13 IL-2Rγ subunidade γ do receptor de IL-2 IL-4Rα subunidade α do receptor de IL-4 ILM membrana limitante interna INL camada nuclear interna iNOS óxido nítrico sintase do tipo induzida IP3 inositol-trifosfato IPL camada plexiforme interna JAK janus cinase (e.g. JAK1, JAK2, dentre outras) LIF fator inibidor de leucemia MAPK cinase ativada por mitógeno NBL camada neuroblástica NGF fator de crescimento de nervo NMDA N-metil-D-aspartato NT neurotrofina (e.g. NT-3, NT-4/5, NT-6 e NT-7) OL camada de fibras do nervo óptico OLM membrana limitante externa ONL camada nuclear externa OPL camada plexiforme externa OS segmentos externos de fotoreceptores P1 dia pós-natal 1 PBS salina tamponada com fosfato

x

PDGF fator de crescimento derivado de plaquetas PI3K fosfoinositol 3 cinase PIP2 fosfatidilinositol 4,5-bifosfato PKA proteína cinase dependente de AMPc PKC proteína cinase dependente de cálcio PLC fosfolipase C p-L-l poli-L-lisina PM peso molecular pRB proteína supressora de tumor de retinoblastoma pRGCs subgrupo de células ganglionares da retina fotossensíveis à luz RGC células ganglionares da retina RPC células progenitoras retinianas RPE epitélio pigmentado da retina RS retículo sarcoplasmático SEM erro padrão da média SN sistema nervoso SNC sistema nervoso central SNP sistema nervoso periférico STAT proteína de transdução de sinal e ativador transcricional (e.g. STAT6) TGF-β fator de crescimento tumoral β TNF-α fator de necrose tumoral-α VN vermelho neutro

xi

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Corte esquemático do globo ocular .......................................... 19

Figura 2 Esquema da passagem de luz pelo globo ocular e a estrutura da retina .................................................................................... 23

Figura 3 Retinogênese em camundongo, galinha, rato, coelho e humanos ................................................................................... 26

Figura 4 Esquema mostrando o desenvolvimento do tecido retiniano de roedores ...............................................................................

29

Figura 5 Esquema representando as fases do ciclo celular.................... 31Figura 6 Esquema mostrando as principais famílias de proteínas que

regulam a progressão do ciclo celular durante as fases G1/S.. 35Figura 7 Morfologia dos fotorreceptores (cones e bastonetes)............... 38Figura 8 Superfamília de receptores para citocinas ............................... 46Figura 9 Representação espacial da estrutura molecular da

Interleucina-4 ............................................................................ 50Figura 10 Os receptores tipo I e tipo II para IL-4 ...................................... 54Figura 11 Ativação do receptor para IL-4 leva a ativação de vias de

sobrevida, proliferação e diferenciação celular ........................ 55Figura 12 IL-4 é expressa na retina e no tecido ocular adjacente não

neural ........................................................................................ 74Figura 13 IL-4Rα é abundantemente expressa na retina e no tecido

ocular adjacente não neural ..................................................... 75Figura 14 Imunolocalização de IL-4Rα em diferentes estágios do

desenvolvimento retiniano pós-natal ........................................ 77Figura 15 A IL-4 reduz a proliferação de células da retina através da

atividade da PKA ..................................................................... 79Figura 16 IL-4 aumenta os níveis intracelulares de AMPc ....................... 81Figura 17 IL-4 reduz a proliferação de precursores retinianos através da

modulação da expressão de ciclina D1 e de p27kip1 ................. 83Figura 18 A IL-4 não altera a incorporação de [3H]-timidina nas

primeiras 4 e 8 horas in vitro .................................................... 84Figura 19 IL-4 aumenta o número de células Rho 4D2+ positivas ........... 86Figura 20 IL-4 aumenta o número de células positivas para Rho 4D2+

em culturas de monocamada e aumenta a expressão de rodopsina .................................................................................. 87

Figura 21 A IL-4, mas não a IL-2 e nem a IL-8, aumenta o número de células positivas para Rho 4D2+ de maneira dose e tempo dependente .............................................................................. 88

Figura 22 O efeito específico de IL-4 na diferenciação de fotorreceptores ....................................................................... 90

Figura 23 A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é independente do seu efeito anti-proliferativo ............................ 92

Figura 24 A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é dependente da atividade das proteínas tirosina cinase ............ 95

Figura 25 A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é dependente da atividade de Erk e de PKC ............................... 96

xii

Figura 26 A fosforilação de Erk induzida pela IL-4 é dependente da atividade de PKC .................................................................... 98

Figura 27 Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove seu efeito anti-proliferativo em células da retina de camundongos P0...... 106

Figura 28 Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove a diferenciação de bastonetes em células da retina de camundongos P0....................................................................... 111

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 O efeito da IL–4 na diferenciação de bastonetes é

independente da liberação de outros fatores de crescimento na cultura .......................................................................................... 90

Tabela 2 O efeito da IL–4 na diferenciação de fotorreceptores é independente da ativação das vias de JAK, Src, p38 e JNK....... 94

xiv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 17VISÃO ............................................................................................ 171.1.1 Anatomia do olho .............................................................. 171.1.2 A retina como modelo experimental ................................. 241.1.3 Estrutura e desenvolvimento da retina ............................. 241.1.4 Ciclo celular e proliferação na retina ................................ 29

Células fotorreceptoras: cones e bastonetes ................... 35

1.1

1.1.5 1.1.5.1 Diferenciação de fotorreceptores (bastonetes) 38

CITOCINAS E O SISTEMA NERVOSO ........................................ 421.2.1 Interleucinas: sinalizadores no sistema nervoso?......…… 47 1.2.1.1 A Interleucina-4 (IL-4) ....................................... 48

1.2.1.2 IL-4R e vias de transdução ............................... 53

1.2

1.2.1.3 A Interleucina-4 e o sistema visual ................... 56

2 OBJETIVOS ............................................................................................... 58

3 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 59 3.1 MATERIAIS .................................................................................... 59

TRATAMENTO EXPERIMENTAL .................................................. 603.2.1 Cultura de monocamada .................................................. 603.2.2 Cultura de explantes da retina .......................................... 61

3.2

3.2.3 Cultura de células do baço ............................................... 62 3.3 WESTERN BLOTS ........................................................................ 63

PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS ........................................... 653.4.1 Criopreservação e realização dos cortes dos explantes e

retina ................................................................................. 653.4.2 Imunohistoquímica ............................................................ 66

3.4

3.4.3 Coloração com vermelho neutro …………………………. 68 3.5 INCORPORAÇÃO DE [H3]-TIMIDINA ………………………………. 68 3.6 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS INTRACELULARES DE AMPc . 69 3.7 ANALISE E QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS Rho 4D2+ .............. 71 3.8 APRESENTAÇÃO DOS DADOS E ANÁLISES ESTATÍSTICAS .. 71

4 RESULTADOS ........................................................................................... 72 4.1 LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO RECEPTOR

DE IL-4 NO TECIDO RETINIANO ................................................. 72IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITO-RAS EM RETINAS P0 ................................................................... 784.2.1 IL-4 aumenta os níveis intracelulares de AMPc em

retinas P0 .......................................................................... 80

4.2

4.2.2 IL-4 regula a expressão de Ciclina D1 e de p27kip1 em retinas P0 .......................................................................... 82

4.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES EM RETINA P0 .. 844.3.1 IL-4 aumenta a expressão e o número de células

contendo rodopsina........................................................... 84

4.3.2 O efeito da IL-4 na diferenciação de bastonetes é específico .......................................................................... 89

4.3.3 A diferenciação de bastonetes induzida por IL-4 é independente do seu efeito anti-proliferativo..................... 91

4.3.4 A atividade das proteínas tirosinas cinases, a fosforilação de Erk, e a atividade de PKC estão relacionadas com a diferenciação de bastonetes induzida pela IL-4.............................................................. 93

5 DISCUSSÃO .............................................................................................. 99

5.1 LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO RECEPTOR DE IL-4 NO TECIDO RETINIANO........................ 100

5 2 IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITORAS...................................................................... 103

5.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES........................ 1076 CONCLUSÕES .......................................................................................... 1137 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 1148 ANEXO I MANUSCRITO JOURNAL OF NEUROIMMUNOLOGY .. 135

1 INTRODUÇÃO

1.1 VISÃO

1.1.1 ANATOMIA DO OLHO

Os globos oculares (Figura 1) estão alojados em cavidades denominadas

órbitas, formadas por um conjunto de ossos (frontal, maxilar, zigomático, esfenóide,

etmóide, lacrimal e palatino), onde se encontram associadas estruturas tais como

pálpebras, supercílios (sobrancelhas), conjuntiva, músculos oculares e aparelho

lacrimal. Cada globo ocular compõe-se de três túnicas (uma mais externa ou fibrosa,

uma média ou vascular/muscular e uma mais interna ou sensorial) e de quatro meios

transparentes (Presland, 2007, para revisão).

O olho, estrutura altamente especializada, além de detectar, localizar e

processar inicialmente a informação luminosa proveniente do ambiente, apresenta

uma organização destinada a otimizar o foco da imagem visual para a retina, com

a mínima distorção óptica (Cepko, 2000). Na parte anterior do olho encontramos a

córnea, uma camada curva e transparente que funciona como lente, sendo

responsável por dois terços da capacidade de focalização que o olho humano

possui. A superfície da córnea encontra-se em continuidade com a da esclera, que

circunda todo o globo ocular, sendo comumente conhecida como o “branco dos

olhos”. Internamente e adjacente à esclera e em continuidade à íris temos a

coróide, que une a esclera ao tecido epitelial pigmentado e à retina neural. Dado

que a córnea não possui vasos sanguíneos, esta é nutrida em sua superfície

externa, pelo filme aquoso proveniente do fluido lacrimal (lágrima), que é

continuamente reposto pelo piscar das pálpebras, e posteriormente pelo humor

aquoso, um líquido cristalino, que preenche a câmara anterior do olho, entre a

córnea e o cristalino banhando-os. Este fluido é composto de água, aminoácidos,

ácido ascórbico e glicose. A quantidade de humor aquoso é um fator determinante

para a pressão intra-ocular, que em humanos em condições normais é menor que

22 mmHg (22 torr). Um problema de drenagem do humor aquoso, realizado pelo

canal de Schlemm, pode levar à cegueira, pois com o aumento da pressão intra-

ocular a irrigação da retina é dificultada, o que provoca a lesão do nervo óptico

(Patil e Dowd, 2000; Smerdon, 2000; Presland, 2007).

Posteriormente à câmara anterior, sendo banhada pelo humor aquoso,

encontramos a íris, que possui pigmentação diferenciada e proporciona a grande

variedade de cores dos olhos. A íris funciona como um diafragma, regulando a

quantidade de luz que penetra no olho. A abertura por onde passa a luz chama-se

pupila. A pupila e a íris são recobertas em sua superfície externa pela córnea, a

primeira lente onde incidem os raios luminosos. Em ambientes mal iluminados, por

ação do sistema nervoso simpático, o diâmetro da pupila aumenta e permite a

entrada de maior quantidade de luz. Em locais muito claros, a ação do sistema

nervoso parassimpático acarreta diminuição do diâmetro da pupila e da entrada de

luz. Esse mecanismo evita o ofuscamento e impede que a luz em excesso lese os

fotorreceptores. O diâmetro da pupila pode variar de 1,5mm a 8,0mm, em humanos,

sendo que são necessários cerca de 5 segundos para a pupila se contrair (miose) ao

máximo e 300 segundos para se dilatar (midríase) ao máximo (Patil e Dowd, 2000;

Presland, 2007).

Vasos Sangüneos da Retina Figura 1 – Corte esquemático do globo ocular. 1, Camada externa ou fibrosa, composta pelos músculos extra-oculares, córnea e esclera; 2. Camada média ou vascular/muscular, composta pelo humor vítreo, cristalino, íris, pupila, câmara anterior e posterior, corpo ciliar, coróide, disco óptico, mácula e vasos sanguíneos da retina e nervo óptico 3. Camada interna ou sensorial que contém a retina. (Modificado de Presland, 2007).

Em seguida, encontramos o cristalino, estrutura gelatinosa, porém

consistente, que funciona como uma lente biconvexa responsável por praticamente

um terço do poder de focalização da luz na retina. O cristalino é uma lente com raio

de curvatura variável, graças aos músculos ciliares que estão situados no corpo

ciliar. Esse processo de mudar a curvatura do cristalino gerando um poder de

focalização adicional chama-se acomodação. Após a luz ter passado pelo cristalino

1

2 3

Músculos extra-oculares Humor Vítreo

Cristalino

Íris

Pupila

Córnea

Esclera

Coróide

Retina

Nervo Óptico Câmara anterior

Corpo Ciliar

Câmara Posterior

Disco Óptico Mácula

Vasos Sangüneos da Retina

ela encontra a câmara posterior, que é preenchida pelo humor vítreo, substância

transparente, porém mais viscosa do que o humor aquoso e responsável pela

manutenção de uma pressão interna essencial para que o globo ocular permaneça

esférico. Como o índice de refração do humor vítreo é pouco distinto do cristalino, a

luz desvia muito pouco sua trajetória. A câmara posterior do olho, em sua face

posterior entra em contato direto com a retina propriamente dita (Patil e Dowd, 2000;

Presland, 2007).

A retina é uma fina camada de tecido neural que contém uma intrincada rede

de diversos tipos neuronais (Masland, 2001), com espessura de aproximadamente

0,5 mm em humanos e localizadas a frente do epitélio pigmentado (PE), envolve

quase toda a superfície interna do olho (Figura 2) (Presland, 2007). É na retina que

ocorre a conversão da imagem luminosa em impulsos elétricos, os quais são

enviados pelo nervo óptico (NO) as outras áreas centrais encefálicas. A retina é

muito sensível, chegando ao limite de detecção de um único fóton em algumas

regiões (Presland, 2007). De acordo com a figura 2, após a conversão do sinal

luminoso em sinal elétrico pelos dois tipos de fotorreceptores presentes na retina,

cones e bastonetes, cujos corpos celulares se encontram na camada nuclear

externa (ONL), a informação visual é transmitida através da camada plexiforme

externa (OPL) aos interneurônios presentes na camada nuclear interna (INL). Essa

transmissão, feita pelos fotorreceptores, é modulada por células horizontais que, por

sua vez, também se contactam com as células bipolares. Na retina interna, as

células bipolares fazem conexões, na camada plexiforme interna (IPL), com as

células amácrinas e as células ganglionares, estas últimas presentes na camada de

células ganglionares (GCL). As células amácrinas não só modulam os sinais vindos

das células bipolares através de uma inibição direta nas células ganglionares, como

também modulam a liberação da transmissão vinda das células bipolares (Cepko,

2000).

A informação gerada pela luz deixa a retina via os axônios das células

ganglionares, os quais coletivamente formam o nervo óptico. Estas células são os

neurônios de projeção da retina, responsáveis por gerar potenciais de ação e por

propagá-los ao longo do nervo óptico, até os centros visuais superiores (Cepko,

2000). Vale citar que um subgrupo de células ganglionares da retina fotossensíveis à

luz foi recentemente identificado e caracterizado por formar uma via paralela e

independente da atividade dos fotorreceptores clássicos (pRGCs; Berson et al.,

2002; Hattar et al., 2002), cuja função principal é a de modular várias respostas

comportamentais e fisiológicas em relação à presença ou ausência de luz (Hattar et

al., 2002). Inclusive, estudos recentes sobre a expressão de pigmentos

fotossensíveis mostraram evidências de que a melanopsina é realmente o

fotopigmento das pRGCs, embora o seu mecanismo de transdução da informação

luminosa ainda permanece como uma questão em aberto (Peirson e Foster, 2006).

As células do epitélio pigmentado da retina (RPE) possuem um pigmento

preto, a melanina, que absorve a luz não capturada que passa pela retina. Este

mecanismo previne a degradação da imagem visual, impedindo que a luz seja

refletida da parte posterior do olho de volta para a retina neural (Fain et al., 1996).

Todas as outras células da retina estão na frente dos fotorreceptores, próximas ao

cristalino, o que implica que a luz precisa atravessar toda a retina antes que atinja os

fotorreceptores. De fato, os processos celulares localizados nas camadas proximais

da retina são amielínicos, permitindo, desta forma, que estas camadas sejam

relativamente transparentes (Cepko, 2000)

Vale salientar ainda que na região próxima ao local de emergência do NO

encontramos a mácula (Figura 1) e no centro desta uma depressão chamada fóvea

(Figura 2), onde os corpos celulares neuronais encontram-se estrategicamente

deslocados para o lado, com o propósito de que os fotorreceptores desta região

recebam a imagem visual em sua forma menos distorcida. Assim, as imagens

formadas na fóvea têm grande acuidade, o que permite boa nitidez, principalmente

em sua porção mais central (fovéola), região que apresenta um deslocamento ainda

mais acentuado. Opostamente, no local onde emerge o NO é gerada uma região

chamada de disco óptico ou ponto cego. Esta região é desprovida de qualquer tipo

de fotoreceptores. Desta forma, uma imagem projetada nesta região não pode ser

detectada e sua percepção depende exclusivamente do processamento central da

informação (Cepko, 2000; Presland, 2007).

Figura 2 – Esquema da passagem de luz pelo globo ocular e a estrutura da retina. Fotorreceptores: cones (C) e bastonetes (R), células bipolares (B), células ganglionares (G), células amácrinas (A), células horizontais (H), células ganglionares fotossensíveis a luz (pRGCs), camada plexiforme externa (ONL), camada plexiforme interna (INL) (Modificado de Cepko, 2000; Foster e Hankins, 2007).

Retina

Fóvea

Nervo Óptico

Luz

Nervo Óptico

Luz

Retina Interna

Retina Externa

Epitélio Pigmentado

1.1.2 A RETINA COMO MODELO EXPERIMENTAL

O desenvolvimento do sistema nervoso (SN) vem sendo amplamente estudado

através de abordagens multidisciplinares, o que tem gerado uma grande diversidade

de modelos experimentais, dentre os quais destacamos o tecido retiniano.

A retina é um tecido extremamente delgado e translúcido com a mesma origem

do sistema nervoso central (SNC), o ectoderma neural embrionário, mas que possui

uma localização periférica privilegiada, a qual permite sua fácil obtenção livre do tecido

conjuntivo adjacente e de outras populações neuronais e gliais (Dowling, 1991). Estas

características, aliadas a uma organização histotípica em camadas sinápticas e

nucleares, muito semelhante ao observado em outras estruturas do SN, tornam a

retina um excelente modelo experimental para os estudos de sobrevida, proliferação e

degeneração neuronal uma vez que as populações neuronais e gliais da retina podem

ser identificadas e acompanhadas desde os estágios mais precoces do desenvolvi-

mento até a sua perda natural ou patológica in vitro e in vivo (Adler, 1993; Cepko et al.,

1996).

1.1.3 ESTRUTURA E DESENVOLVIMENTO DA RETINA

A correta formação e funcionalidade da retina dependem de uma precisa

coordenação temporal dos múltiplos processos que ocorrem durante o seu

desenvolvimento (Martins e Pearson, 2007, para revisão). Dentre estes processos,

destacam-se a proliferação de precursores, a gênese dos diferentes tipos celulares

retinianos, sinaptogênese e morte celular programada, de forma a se obter a

citoarquitetura funcional clássica de uma retina madura (Liversey e Cepko, 2001;

Klassen et al., 2004).

A retina, como muitas outras estruturas do SNC, contém grande diversidade

de tipos neuronais (Masland, 2001), que se comunicam por meio de conexões

sinápticas com um arranjo anatômico ordenado em camadas.

Durante a retinogênese, os seis tipos de células neuronais, os fotorreceptores

(cones e bastonetes), células amácrinas, células horizontais, células bipolares e

células ganglionares e o tipo de célula glial predominante em roedores (a glia de

Müller) são gerados em uma ordem temporal, a qual é geralmente conservada entre

as espécies (Carter-Dawson e LaVail, 1979; Young, 1985; Stiemke e Hollyfield,

1995; Belecky-Adams et al., 1996; Cepko et al., 1996; Hu e Easter, 1999; Martins e

Pearson, 2007). Vale citar que astrócitos e células microgliais também podem estar

presentes na retina (Fischer e Reh, 2003).

Como pode ser visto na figura 3, em diferentes espécies, sempre as primeiras

células a serem geradas na retina de vertebrados são as células ganglionares, entre

o 14º e o 20º dia embrionário (Reese e Colello, 1992; Marquardt e Gruss, 2002). Em

seguida, temos a gênese das células horizontais, cones e células amácrinas. As

últimas células a deixarem o ciclo celular são os precursores dos bastonetes, das

células bipolares e das células de Müller (Holt et al., 1988; Wetts e Fraser, 1989;

Prada et al., 1991; Hu e Easter, 1999; Das et al., 2003).

A retinogênese possui duas características importantes: (1) os diferentes tipos

de células presentes na retina são derivados de progenitores multipotentes comuns,

as células progenitoras retinianas (RPC), as quais retêm a habilidade de gerar

diferentes tipos de células mesmo durante a retinogênese tardia; (2) embora haja

uma ordem conservada para a gênese dos diferentes tipos celulares presentes na

retina, muitos estudos sobre as “datas de nascimento” dessas células revelaram que

existe uma extensa sobreposição durante os períodos nos quais cada tipo celular é

produzido (Young, 1985; Turner e Cepko, 1987; Holt et al., 1988; Turner et al., 1990;

Jensen e Raff, 1997). Estas e outras descobertas (Austin et al., 1995; Belliveau e

Cepko,1999) deram origem ao atual modelo de retinogênese no qual as decisões do

destino celular são governadas por um coordenado conjunto de fatores intrínsecos e

extrínsecos que atuam de uma maneira dependente do estágio de desenvolvimento

no qual a célula se encontra. (Cepko, 1999; Livesey e Cepko, 2001; Marquardt e

Gruss, 2002).

Em camundongos neonatos (P0-P1; figura 4) a retina é composta por dois

extratos celulares, a GCL e a camada neuroblástica (NBL) separadas pelos

primórdios da IPL. As células ganglionares estão entre os primeiros tipos celulares a

Figura 3 – Retinogênese em camundongo, galinha, rato, coelho e humanos. E, embrionário; P, pós-natal; wk, semanas (Modificado de Martins e Pearson, 2007).

Células Ganglionares

FotorreceptorCone

Célula Horizontall

Fotorreceptor Bastonete

Célula Bipolar

Célula Amácrina

Glia de Müller

Galinha

Camundongo

Humano

Coelho

Rato

E9

emergirem da NBL em direção a membrana limitante interna (ILM), uma membrana

glial, formada por projeções membranosas, que separa a retina neural do humor

vítreo (Maslim e Stone, 1986; Zimmerman et al., 1988). Com o término desta

migração, estas células começam a estender dendritos horizontais, iniciando a

formação da IPL (Maslim e Stone, 1986). As células amácrinas deslocadas, geradas

no período pré-natal, atingem a GCL entre o primeiro e o quinto dia pós-natal (Perry

et al., 1983; Sengelaub et al., 1986; Reese e Colello, 1992) e constituem 40-50% da

população de células da GCL em roedores adultos (Perry et al., 1983). A NBL é

composta principalmente por células indiferenciadas e em proliferação (Chiarini et

al., 2003).

A divisão celular continua dentro da NBL até pelo menos o final da primeira

semana pós-natal (Alexiades e Cepko, 1996). Entre o 4º e o 5º dia após o

nascimento (P4-P5), a OPL aparece devido ao progresso da diferenciação de

células horizontais (Craft et al., 1982), A região de início da formação da OPL

coincide com a região de término da atividade mitótica na retina central (Rapaport e

Stone, 1984; Robison et al., 1985).

A INL contém os núcleos das células bipolares, amácrinas, interplexiformes,

horizontais e ganglionares deslocadas. Células bipolares e bastonetes terminam o

ciclo celular neste período pós-natal (Araki et al., 1988) e são os últimos neurônios

adicionados ao circuito sináptico (Maslim e Stone, 1986).

Assim, a partir da primeira semana pós-natal, as células amácrinas estão

dispostas entre a GCL e a NBL, sendo esta última camada formada por células pós-

mitóticas e células ainda proliferantes. As células horizontais, já em pleno processo

de diferenciação, estão uniformemente localizadas na porção intermediária na NBL

(Linden et al., 1999). Nesta fase, a NBL está restrita à porção intermediária da retina

e na porção mais externa estão presentes os fotorreceptores, fazendo com que a

retina assuma, em roedores, um aspecto morfológico intermediário entre a retina

neonatal e a retina adulta (Figura 4). Ao longo da segunda semana pós-natal, os

demais tipos celulares se diferenciam e formam o circuito de conexões nas camadas

plexiformes (OPL e IPL) antes da abertura dos olhos, que em ratos ocorre

aproximadamente no final da segunda semana pós-natal (14º dia pós-natal) e que

caracteriza o início da chegada de estímulos visuais aos fotorreceptores.

Em camundongos adultos, a camada de fibras do nervo óptico (OL) ocupa a

posição mais ao centro do globo ocular, seguida pela GCL, onde se encontram os

somas de células amácrinas deslocadas e células ganglionares, enquanto a camada

de células epiteliais pigmentadas, RPE, ocupa a porção mais externa, adjacente à

coróide e à esclera. Mais externamente à ONL podemos observar uma camada

formada apenas pelos segmentos externos (OS) dos fotorreceptores. A INL contém

os núcleos das células amácrinas, bipolares, horizontais, sendo esta camada

separada da ONL pela OPL, a qual aparece 4 a 5 dias após o nascimento, em ratos

(Linden et al., 1999). O soma das células de Müller está localizado na INL e seus

prolongamentos se estendem por todas as camadas da retina, desde a OL até a OS

(Newman e Reichenbach, 1996; Figura 4).

A retina, portanto, apresenta uma estrutura com camadas diferenciadas, em

que os diversos tipos neuronais e gliais, assim como as regiões de contatos

sinápticos são bem definidas. Além disso, as diferentes classes celulares

apresentam marcadores bioquímicos que permitem a localização específica dos

tipos e subtipos celulares presentes em uma mesma camada.

1.1.4 CICLO CELULAR E PROLIFERAÇÃO NA RETINA

Dado que todas as células progenitoras retinianas são multipotentes e podem

gerar diferentes tipos celulares retinianos, numa ordem de nascimento característica,

podemos dizer que tanto a proliferação quanto a saída do ciclo celular devem ser

precisamente regulados durante o desenvolvimento. Desta forma, as células

NBL Padrão em P0-P1 Padrão em P6-P7 Padrão em Adultos

RPE

IPL

GCL ILM OL

OLM

RPE

OS

ONL

INL

IPL

GCLILMOL

OPL

OLM

Figura 4 – Esquema mostrando o desenvolvimento do tecido retiniano de roedores. A ilustração é dividida conforme três padrões distintos do desenvolvimento: no recém-nascido (P0-P1); na primeira semana pós-natal (P6-P7); no adulto. Pode-se observar o crescimento retiniano a partir da progressão na organização celular retiniana em camadas nucleares e de plexos. RPE, epitélio pigmentar da retina; OLM, camada limitante externa; NBL, camada neuroblástica; IPL, camada plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares; ILM, camada limitante interna; OL, camada do nervo óptico; OS, segmentos externos dos fotorreceptores; OPL, camada plexiforme externa; INL, camada nuclear interna.

NBL

progenitoras precisam regular estas duas forças opostas: enquanto muitos

progenitores retinianos precisam sair do ciclo celular para que assim produzam os

tipos celulares que possuem um nascimento mais precoce outros, entretanto, devem

continuar proliferando para assim produzirem o número suficiente de células que irão

gerar os tipos celulares que nascem mais tardiamente. Se houver algum desbalanço

precoce entre estas duas forças opostas (proliferação x saída do ciclo celular), os

tipos celulares que seriam gerados mais tardiamente ficariam desfalcados. Caso

aconteça o oposto, ou seja, se os progenitores não saírem do ciclo celular na hora

exata para darem origem aos tipos celulares que são gerados mais precocemente,

neste caso, estes tipos celulares também ficarão desfalcados na retina, e teríamos

uma retina com excesso celular dos tipos celulares gerados mais tardiamente.

Ambos cenários resultariam em uma retina apresentando uma histogênese atípica e

não funcional (Cepko et al., 1996).

Em 1839, Schleiden e Sachwann propuseram a teoria celular, estabelecendo

que cada organismo é composto de uma ou mais células e que cada nova célula era

originada da divisão de outra célula pré-existente. Com o desenvolvimento das

pesquisas, foi visto que as células ao se dividirem repartem seus componentes com

as células filhas. Isso acontece durante o ciclo celular, um conjunto de processos

que tem início no momento em que a célula toma a decisão de dividir-se e não

termina até que as novas células sejam originadas.

Apesar das diferenças em alguns detalhes do ciclo celular em eucariotos, os

pontos essenciais são comuns. Geralmente, para que sejam originadas células filhas

idênticas, o DNA deve ser duplicado antes que finalmente a célula original se divida

em duas células independentes, cada uma com carga genética idêntica. O ciclo

celular divide-se em dois períodos: intérfase e mitose (Figura 5):

Intérfase: fase responsável pelo crescimento. As células estão muito ativas,

sintetizando os componentes que irão constituir as células filhas. Esta fase se

subdivide em três:

• G1: período entre o final da mitose e o início da fase S.

• Fase S: fase onde ocorre a replicação do DNA. Sinais citoplasmáticos

são enviados ao núcleo induzindo-o a iniciar a replicação. Nesta fase

as células podem ser marcadas com [3H]-timidina, um nucleotídeo

derivado da timina, utilizado exclusivamente para a síntese de DNA.

• G2: período entre o fim da fase S e o início da mitose. Uma célula que

completa a fase S e entra na G2 condensa seus cromossomos e segue

para mitose. Este é um período de preparação para a produção de

fatores cruciais que disparam a mitose.

Fase M (mitose): fase onde ocorre a divisão celular.

Figura 5 – Esquema representando as fases do ciclo celular. (Retirado de Calzada et al., 2000).

As fases G1 e G2 proporcionam um tempo adicional para o crescimento.

Durante a fase G1, a célula analisa se as condições ambientais são adequadas para

começar o processo de divisão celular. Quando o sinal induz a célula a atravessar o

ponto de partida, se as condições ambientais são favoráveis, há um

comprometimento irreversível da célula iniciando-se assim, a progressão no ciclo

celular. Se as condições são desfavoráveis para a entrada no ciclo, a célula entra

em um período de quiescência denominado G0, no qual ela pode permanecer por

um longo tempo. Se estas condições ambientais voltarem a ser favoráveis, a célula

pode sair dessa fase G0 e iniciar seu ciclo de divisão. Na fase G2, a célula analisa

se a fase S foi realizada de forma correta e decide se será iniciada a mitose, ou se

espera para que sejam realizados reparos necessários ao DNA devido a erros

ocorridos durante a fase S.

O ciclo celular precisa ser altamente controlado e para isso possui vários

pontos de checagem. O ponto de restrição da etapa de transição da fase G1 para a

S possui destaque dentre os demais, por ser o período que os progenitores saem do

ciclo celular e se diferenciam. Esta decisão é determinada por interações complexas

de fatores extrínsecos e intrínsecos. A transição da fase G1 para S é controlada por

proteínas chaves da maquinaria do ciclo celular como as ciclinas, CDKs (cinases

dependentes de ciclinas) e inibidores das CDKs (família INK e Cip/Kip). As CDKs

são cinases serina-treonina e apresentam atividade cinase somente quando

complexadas com as ciclinas. A formação deste complexo induz a passagem da

fase G1 para S pela fosforilação das proteínas retinoblastoma (Rb), p107 e p130. A

hiperfosforilação dessas proteínas por sua vez libera o fator de transcrição E2F

permitindo a transcrição de genes pró-mitóticos (Figura 6) (Dyer e Cepko, 2001).

O nível de expressão das ciclinas é regulado em várias fases do ciclo. O

ponto de checagem da fase G1 do ciclo celular é regulado por diferentes complexos

de ciclinas-CDKs. O complexo ciclina D/CDK4/6 atua na fase inicial da G1 e é

regulado por sinais mitogênicos. As ciclinas D são sintetizadas durante a fase G1, e

sua inibição previne a entrada da célula na fase S (Resnitzky et al., 1994).

A Ciclina D1 é importante para a proliferação dos progenitores da retina. As

evidências que indicam esse papel no controle da proliferação em retinas de

camundongos foram baseadas em animais nocautes para ciclina D1 que

apresentam uma redução considerável no número de células em todas as camadas

da retina neural devido à falha na proliferação dos progenitores durante o

desenvolvimento deste tecido. Além disso, essa proteína está altamente expressa no

período proliferativo da retina normal desses animais (Sicinski et al., 1995).

O outro complexo que promove a transição da fase G1 para a fase S é o

ciclina E/CDK2. A especificidade deste complexo é bem ampla, apresentando como

substratos as proteínas histonas H1, a proteína Rb, a proteína p27/Kip1 e outros

substratos necessários para a passagem da fase G1 para S (Blow e Nurse, 1990).

Esses dois complexos apresentam funções diferentes durante a progressão do ciclo

celular. A ciclina D atua como sensor de sinais mitogênicos. A principal função do

complexo formado por esta ciclina seria a de promover a interação entre fatores

extracelulares e outras proteínas chaves que participam do ciclo celular, como o

complexo ciclina E/CDK2. A atividade deste último complexo é independente de

sinal externo, porém essencial para a progressão do ciclo celular (Matshushime et

al.,1994; Taya, 1997).

Existem duas famílias de proteínas inibidoras das CDKs (CKIs; ciclinas

inibidoras de cinases): a Cip/Kip e a INK 4. As proteínas p27, p21 e p57 são

membros da família Cip/Kip e as proteínas p15, p16, p18 e p19 são membros da

família INK 4. Os membros da família INK4 inibem especificamente a subunidade

catalítica das CDK4 e CDK6. Já as proteínas da família Cip/Kip apresentam uma

atividade inibitória mais ampla, que afeta as cinases dependentes de ciclina A, D e E

(Sherr e Roberts, 1999). Com base em estudos de estrutura, acredita-se que uma α

hélice das proteínas Cip/Kip interage com a ciclina e uma segunda hélice com a

subunidade catalítica da CDK, provavelmente bloqueando o seu carregamento de

ATP (Russo et al., 1996).

Além das evidências de que fatores intrínsecos regulem a proliferação dos

progenitores da retina, como ciclina D1 e p27/Kip1, existem evidências crescentes

do envolvimento de neurotransmissores na regulação da proliferação celular (Martins

e Pearson, 2007; Pearson et al., 2002).

1.1.5 CÉLULAS FOTORRECEPTORAS: CONES E BASTONETES

Os fotorreceptores são neurônios sensoriais altamente especializados em

detectar luz (Schulte e Bumsted-O`Brien, 2007, para revisão). Os dois tipos de

fotorreceptores (cones e bastonetes) presentes na retina de vertebrados diferem em

vários aspectos (Rodieck, 1998). Primeiramente, a distribuição dos tipos particulares

de fotorreceptores na retina não é uniforme (Ahnelt e Kolb, 2000; Raymond e

Barthel, 2004; Peichl, 2005). Além disso, os bastonetes superam em grande número

os cones. Nos humanos, os bastonetes são em cada olho, cerca de 120 milhões,

Figura 6 – Esquema mostrando as principais famílias de proteínas que regulam a progressão do ciclo celular durante as fases G1/S. As proteínas da família do retinoblastoma encontram-se ativas quando defosforiladas e podem ser fosforiladas pelo complexo Ciclina/CDK. A fosforilação induz a perda da afinidade do retinoblastoma pelo fator de transcrição E2F. Uma vez liberado este fator induz a transcrição de enzimas necessárias para a fase S do ciclo celular. As proteínas KIP/CIP inibem a formação do complexo ciclina/CDK, impedindo a fosforilação da proteína retinoblastoma e a transcrição de genes pró-mitóticos (Retirado de Dyer e Cepko, 2001).

enquanto os cones são cerca de 6,5 milhões por olho (Rodieck, 1998; Cepko, 2000).

Em camundongos, 75% de todas as células da retina são fotorreceptores, e 97%

destas são bastonetes (Morrow et al., 1998b). Bastonetes são especializados para

visão de baixa intensidade luminosa (visão escotópica), enquanto os cones são

especializados para a visão em alta intensidade luminosa de forma a mediarem a

visão a cores (visão fotópica). Os bastonetes, por sua vez, são mais sensíveis à luz

por possuírem mais fotopigmento do que os cones (Jacobs, 1996; Schulte e

Bumsted-O`Brien, 2007). Dado que a visão de camundongos é principalmente

mediada por bastonetes e também pelo fato destes animais apresentarem

comportamento crepuscular e noturno, observa-se a necessidade de uma visão

sensível aos baixos níveis de luminosidade (Morrow et al., 1998b)

A maioria dos vertebrados possui apenas um único tipo de bastonete e

diversos tipos de cones. Os humanos possuem três tipos de cones, ou seja,

possuem uma visão tricromática, devido a presença de 3 tipos distintos de opsinas:

(1) opsinas-S, sensíveis a ~420nm (comprimentos de ondas curtos; cones azuis); (2)

opsinas-M, sensíveis a ~530nm (comprimentos de ondas médios; cones verdes); (3)

opsinas-L, sensíveis a ~560nm (comprimentos de ondas longos; cones

vermelhos)(Jacobs, 1996). Na maioria dos vertebrados os cones são encontrados

em alta densidade na fóvea. Na fóvea, encontramos apenas cones verdes e

vermelhos, enquanto que os cones azuis são encontrados fora da fóvea, nas regiões

mais excêntricas da retina (Cepko, 2000).

Vale ressaltar ainda que a maior parte dos roedores tem uma visão

dicromática, ou seja, possuem apenas dois tipos de pigmentos visuais.

Camundongos, entretanto, possuem opsinas-S (sensíveis a faixa entre 360-365nm)

e opsinas-M (sensíveis a faixa entre 509-512nm) (Jacobs et al., 2004).

Morfologicamente, tanto os bastonetes como os cones possuem três regiões

funcionais principais (Figura 7): o segmento externo, localizado na superfície externa

ou distal da retina, e que contém fotopigmento, é especializado para a

fototransdução; o segmento interno, localizado na região mais proximal da retina,

que contém o núcleo da célula e a maioria da maquinaria celular; e um terminal

sináptico, que estabelece contato com as células-alvo dos fotorreceptores. Os

segmentos externos são preenchidos com pigmentos visuais que absorvem luz

(Kandel et al., 2003). Desta forma, como em camundongos 97% dos fotorreceptores

presentes na retina são bastonetes (Morrow et al., 1998b) a rodopsina passa a ser a

proteína fototransdutora mais abundante, com localização subcelular restrita ao

segmento externo (OS), nos animais adultos (Morrow et al., 1998a, 1998b). Isto

torna a rodopsina um excelente marcador para os estágios de diferenciação, onde a

mesma estará presente abundantemente no corpo celular, e estágios de

manutenção, onde ela se mostrará restrita aos OS dos fotorreceptores.

Figura 7 – Morfologia dos fotorreceptores (cones e bastonetes). (modificado apartir da figura obtida no endereço eletrônico http://thebrain.mcgill.ca/flash/index_ d.html).

1.1.5.1 DIFERENCIAÇÃO DE FOTORRECEPTORES (BASTONETES)

A especificação dos tipos celulares retinianos envolve uma complexa

interação de fatores extrínsecos e intrínsecos. Fatores intrínsecos são responsáveis

por controlar o destino celular durante o ciclo celular enquanto fatores extrínsecos

influenciam temporalmente, proporcionalmente e funcionalmente os diferentes tipos

celulares após a saída do ciclo celular, ou seja, durante a diferenciação retiniana

(Reh, 1991; Cepko et al., 1996; Jean et al., 1998; Reh e Levine, 1998; Adler, 2000;

Fuhrmann et al., 2000; Lupo et al., 2000; Galli-Resta, 2001; Liversey e Cepko, 2001;

Marquardt e Gruss, 2002; Zhang, 2002; Bailey et al., 2004; Boulton e Albon, 2004;

Segmentos Externos

Segmentos Externos

Segmentos Internos

Segmentos Internos

Cone

Bastonete

Hatakeyama e Kageyama, 2004; Malicki, 2004; Rapaport et al., 2004; Adler e

Raymond, 2007)

Todos os tipos de células neuronais da retina são derivados de um pool

comum de progenitores multipotentes (Turner e Cepko,1987), gerados em uma

ordem conservada, com grande sobreposição temporal (Young, 1985; Turner e

Cepko, 1987; Holt et al., 1988; Turner et al., 1990; Jensen e Raff, 1997). Em

roedores (Figura 3), os cones são gerados no período embrionário E11,5–E18,5,

enquanto a gênese dos bastonetes envolve um período bem mais longo, que se

estende desde a fase embrionária E12,5 até o 7º dia pós-natal (P7) tendo um pico

em P0 (Carter-Dawson e LaVail, 1979; Young, 1985). Entretanto, existe um

significativo atraso para que os fotorreceptores pós-mitóticos comecem a expressar

o seu tipo específico de opsina, assim como para a ativação de outros genes

específicos que lhes conferem o fenótipo maduro (Watanabe e Raff, 1990; Cepko et

al., 1996). Durante esta lacuna temporal, os precursores de fotorreceptores parecem

estar num estado “plástico” e, portanto, podem ser induzidos a se diferenciar em

diferentes subtipos de fotorreceptores, dependendo dos fatores regulatórios

intrínsecos e extrínsecos a que forem expostos (Nishida et al., 2003; Cheng et al.,

2006; MacLaren et al., 2006; Roberts et al., 2006).

A regulação intrínseca dos bastonetes é mediada por uma rede de fatores de

transcrição específicos de fotorreceptores, como por exemplo, o Crx, um fator de

transcrição pertencente a família de fatores com homodomínio semelhante à Otx.

Outros fatores regulatórios transcripcionais também estão implicados no

desenvolvimento dos fotorreceptores, dentre eles: Otx2 (Nishida et al., 2003); Nrl

(Swaroop et al., 1992; Mears et al., 2001; Strettoi et al., 2004); Rb (Zhang et al.,

2004); receptor nuclear órfão específico para rodopsina Nr2e3 (Akhmedov et al.,

2000; Haider et al., 2001; Cheng et al., 2004; Peng et al., 2005; Chen et al., 2005).

Desta forma, consistente com seus papéis na regulação gênica dos fotorreceptores,

mutações em humanos no gene Crx e no Nr2e3 resultam em retinopatias (Swain et

al., 1997; Swaroop et al., 1999). Recentemente, Oh e colaboradores (2007)

relataram que o Nrl não é somente essencial, mas também suficiente para a

diferenciação de bastonetes.

Dentre os fatores extrínsecos relacionados ao desenvolvimento dos

bastonetes temos o fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF ou FGF-2),

sonic hedgehog, taurina e laminina-β 2 (Hicks e Courtois, 1992; Hunter et al., 1992;

Altshuler et al., 1993; Libby et al., 1996; Levine et al., 1997). No entanto, o fator

neurotrófico ciliar (CNTF) e o fator inibidor de leucemia (LIF), membros da família de

fatores hematopoiéticos, inibem a diferenciação de fotorreceptores em mamíferos,

fazendo com que as células destinadas a se tornar bastonetes passem a apresentar

fenótipo de neurônios bipolares (Ezzeddine et al.,1997). Entretanto, estudos in vitro

na retina de galinha sugerem que o CNTF pode desempenhar um papel regulatório

transitório, promovendo o desenvolvimento dos fotorreceptores por aumentar a

expressão de opsinas (Fuhrmann et al., 1998).

O fator neurotrófico derivado de glia (GDNF) pode também desempenhar um

papel na regulação do desenvolvimento dos fotorreceptores, pelo menos in vitro

(Rothermel e Layer, 2003), onde, dependendo do estágio de desenvolvimento, este

fator pode influenciar a proliferação, diferenciação e sobrevida dos bastonetes ou de

seus precursores. As proteínas hedgehog também são fortes candidatas a

promoverem a diferenciação de fotorreceptores. Tanto os subtipos indian hedgehog

quanto sonic hedgehog promovem a diferenciação de bastonetes de mamíferos

mantidos em cultura (Levine et al., 1997).

O ácido retinóico também foi descrito como capaz de promover a

diferenciação de fotorreceptores em retinas de zebrafish, galinha, roedores e

humanos in vitro (Stenkamp et al.,1993; Kelley et al., 1994, 1995, 1999; Hyatt et al.,

1996) e in vivo (Levine et al., 2000). Além disso, o ácido retinóico modula a

expressão de diversos genes específicos para os fotorreceptores, inclusive arrestina

e crx (Li et al., 2002; Boatright et al., 2002; Li et al., 2003). A Activina A, uma

proteína da família do fator de crescimento tumoral β (TGF-β), também é uma

importante reguladora da diferenciação de fotorreceptores na retina em

desenvolvimento, tanto in vitro quanto in vivo (Davis et al., 2000). Recentemente, o

DHA (ácido docosahexanóico) também foi descrito como promotor da diferenciação

de fotorreceptores sem, entretanto, alterar a expressão de Crx (Garelli et al., 2006).

Em suma, os bastonetes são considerados como um caso especial em termos

de re-especificação pós-mitótica, uma vez que muitos fatores têm sido descritos

como capazes de influenciar positivamente e/ou negativamente a sua diferenciação

pós-mitótica in vitro (Levine et al., 2000). Neste sistema, as células pós-mitóticas,

comprometidas em se tornar células fotorreceptoras geradas durante o período

embrionário tardio são mantidas em um estado indiferenciado pela forte ativação do

fator de transcrição STAT3 (transdutor e ativador de transcrição do tipo 3), o qual é

induzido por fatores extrínsecos difusíveis, tais como o CNTF (Caffe et al.,2001;

Neophytou et al., 1997; Rhee et al., 2004; Zhang et al.,2004). Dado que a expressão

de CNTF é alta na retina embrionária, porém declina na idade pós-natal (Kirsch e

Hofmann, 1994; Schulz-Key et al., 2002), esta diminuição parece ser a responsável

pela baixa regulação da ativação de STAT3 em P0, o que por sua vez levaria ao

início da expresão de rodopsina e a diferenciação dos bastonetes (Ozawa et al.,

2004). Entretanto, embora a ativação de STAT3 na maioria das células

fotorreceptoras já tenha diminuído substancialmente em P0, se comparada com E18

(4,5 vezes) (Ozawa et al., 2004), o início da expressão de rodopsina não começa

simultaneamente em todas as células pós-mitóticas. De fato, existem duas fases

distintas na diferenciação dos fotorreceptores: uma fase mais precoce e uma fase

mais tardia. Sendo assim, devem existir outros sistemas regulatórios capazes de

reduzir a ativação de STAT3 residual presente em cada célula pós-mitótica

fotorreceptora até um nível baixo o bastante para o início da expressão de

rodopsina. De fato, a proteína SOCS3 é requerida para este ajuste fino e sua

expressão tem sido relacionada a uma rápida diminuição na ativação de STAT3, o

que permite que os bastonetes se diferenciem (Ozawa et al., 2007).

1.2 CITOCINAS E O SISTEMA NERVOSO

Citocinas são polipeptídeos de pequeno peso molecular, mediadores cruciais

nas comunicações intercelulares e em processos de regulação da atividade celular

(Nicod, 1993; Holtmann e Resch, 1995;Haddad, 2002; Gao e Miller, 2006). Atuam

como reguladoras humorais, em concentrações nano- a picomolares, de maneira

autócrina, parácrina, ou como mensageiros endócrinos, agindo tanto em processos

fisiológicos quanto patológicos (Raber et al., 1998). Estas moléculas podem atuar

também modulando atividades durante os mais diversos eventos no SNC e no

sistema nervoso periférico (SNP), de forma imuno- ou neuromodulatória. (Parkin,

2001; Szelényi, 2001; Haddad, 2002; Gao e Miller, 2006; Murphy e Saravanapavan,

2006; Owens et al., 2006).

De modo geral, podemos dizer que o termo citocinas engloba uma ampla

gama de moléculas, nomeadas em grupos afins conforme os tipos celulares

produtores, como as interleucinas, linfocinas, monocinas e interferons (Nicod, 1993;

Debets e Savelkoul, 1996; Haddad, 2002; Holloway et al., 2002). Atualmente se

sabe que estas moléculas são produzidas por uma variedade de tipos celulares e

que apresentam populações-alvo bem distintas daquelas inicialmente descritas.

Inicialmente, as citocinas foram descritas como importantes mediadores da

resposta inflamatória. Por conseguinte, de acordo com o balanço final de suas ações

no sistema imune elas foram classificadas em pró-inflamatórias ou anti-inflamatórias.

(Haddad, 2002). Desta forma, células T do tipo Th1, tidas como estimulatórias,

secretam citocinas do tipo 1, conhecidas como pró-inflamatórias, tais como:

interleucina (IL)-2, interferon-γ (IFN-γ), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e

linfotoxinas. As células T do tipo Th2, tidas como inibitórias, secretam citocinas tipo

2, conhecidas como anti-inflamatórias, tais como as IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13

(Opal e DePalo, 2000; Haddad, 2002; Li et al., 2004; Odbileg et al, 2005).

Diversas citocinas e células produtoras de citocinas têm sido descobertas

através das técnicas inovadoras de biologia molecular, entretanto, classificar e dividir

todas as citocinas em classes tem sido uma questão de grande polêmica entre

vários pesquisadores (Haddad, 2002). Elas podem ser secretadas por monócitos,

macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, linfócitos B e T (Holtmann e Resch,

1995), adipócitos (para revisão ver Coppack, 2001; Fain, 2006), dentre outros tipos

celulares como os neurônios e as células gliais (e.g. astrócitos, e células microgliais)

(Brodie, 1996; Aschner, 1998; Szelényi, 2001), e sua produção pode ser constitutiva

ou estimulada (Arai et al., 1990; Korshing, 1993; Cavaillon, 1994; Holtmann e Resch,

1995; Rouveix, 1997; Boraschi et al., 1998; Dinarello, 2000; Oppenheim, 2001;

Haddad, 2002; Holloway et al., 2002). Desta forma, a classificação mais plausível e

aceita por diversos pesquisadores é a que destaca apenas as classes mais

representativas para este nome genérico “citocinas”, as quais compreendem fatores

de crescimento, neurotrofinas, interleucinas, interferons e outros fatores que

são capazes de direcionar a diferenciação de uma determinada população celular,

como os fatores neuro-hematopoiéticos (Patterson, 1993; Holtmann e Resch,

1995; Haddad, 2002).

A constatação de que citocinas atuam como importantes mediadores entre

células dos sistemas imune e nervoso consolidou várias linhas de pesquisa visando

a caracterização dos mecanismos de interação entre estes sistemas e a

compreensão dos diferentes eventos-chave observados durante o desenvolvimento

ou após lesão (Dantzer, 2004; Konsman et al., 2002; Dantzer e Winther, 2001;

Dantzer et al., 2000; Mehler e Kessler, 1997; Sholl-Franco et al., 2001a, 2001b,

2002). De fato, sabe-se que no SN citocinas estão implicadas na liberação de

neurotransmissores e regulação hormonal (Hopkins e Rothwell, 1995), sobrevida

neuronal (para revisão, Levi Montalcini, 1987; Davies, 1994; Lewin e Barde, 1996,

Huang e Reichardt 2001) regulação da diferenciação neuronal e axonal, crescimento

dendrítico, funcionamento sináptico, diferenciação celular, migração e proliferação,

assim como plasticidade funcional neuronal (McAllister et al., 1999; Cepko, 1999;

Levine et al., 2000; Schinder e Poo, 2000; Jankowsky e Patterson, 2001; Poo, 2001;

Sholl-Franco et al., 2001a, 2002). Além disso, têm sido amplamente relacionadas a

diferentes quadros patológicos presentes nos SNP e SNC (Szelényi, 2000; Murphy e

Saravanapavan, 2006; Owens et al., 2006).

As citocinas, assim como os hormônios e os outros sinalizadores

intercelulares polipeptídicos, iniciam suas ações ligando-se aos seus receptores

específicos de alta afinidade (Rose-John e Heinrich,1994; Holloway et al., 2002).

Estes receptores podem estar presentes na membrana plasmática das células-alvo

ou também em sua forma solúvel (receptores solúveis), e pode-se observar o

compartilhamento de subunidades transdutoras de sinal entre várias citocinas (Rose-

John e Heinrich, 1994; Haddad, 2002; Kelly-Welch, 2003, 2005).

Desta forma, as citocinas geram sinais que além de promover respostas de

curta ou média duração ao nível citoplasmático e de membrana, podem levar a

ativação de fatores transcricionais que irão alterar a expressão gênica (Gadina et al.,

2001; Holloway et al., 2002; Grötzinger, 2002; Haddad, 2002) de forma ampla e

muitas das vezes dependente de co-estimulação por outras citocinas, hormônios,

neurotransmissores e outros fatores. Assim, podemos observar ações pleiotrópicas,

redundantes, aditivas, sinérgicas e/ou antagônicas entre os mais variados fatores em

um mesmo tipo celular, de modo a se formar uma rede de interações nomeada como

rede de citocinas (Nicod, 1993; Holtmann e Resch, 1995; Haddad, 2002).

Um dos mais bem conhecidos mecanismos pelos quais as citocinas

transduzem sinais nas células-alvo envolve o recrutamento de proteínas tirosinas

cinases associadas a receptores denominadas de Janus cinases (JAKs), com

subseqüente ativação de membros da família de fatores de transcrição chamados

STATs. As vias de sinalização JAK/STAT são usadas por todos os receptores de

citocinas, os quais podem ser classificados como receptores tipo I ou tipo II, como

ilustrado na figura 8 (Kirken et al., 1988; Haddad, 2002; Hanada e Yoshimura, 2002).

Figura 8 – Superfamília de receptores para citocinas. Receptores para citocinas tipo I e tipo II, classificados, conforme suas características estruturais. (Retirado de Mehler e Kessler, 1997).

1.2.1 INTERLEUCINAS: SINALIZADORES NO SISTEMA NERVOSO?

Em adição aos polipeptídeos com ação trófica e de diferenciação classicamente

descritos para o SN como, por exemplo, as neurotrofinas e as citocinas neuro-

hematopoiéticas, tem sido descrita uma série de linfocinas e monocinas produzidas

por linfócitos T e B, células do estroma, macrófagos, fibroblastos ou por outros tipos

celulares. Estas glicoproteínas são as Interleucinas (Holtmann e Resch, 1995, para

revisão).

Os estudos a respeito das ações de interleucinas no SNC estão, na maioria das

vezes, relacionados ao crescimento, diferenciação, sobrevivência neuronal, respostas

inflamatórias e processos degenerativos, assim como no SNP eles se voltam para a

regeneração de nervos periféricos e a plasticidade do fenótipo neuronal. Por exemplo,

as IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7 e IL-8 têm sido descritas como fatores estimuladores

da neuritogênese em células ou linhagens de células neuronais (Hanisch e Quirion,

1996; Sarder et al., 1993; Kamegai et al., 1990). Além disso, vários pesquisadores têm

sugerido papéis de fatores neurotróficos, fatores de diferenciação ou ainda de fatores

de lesão para as diferentes citocinas conforme o paradigma experimental. Neurônios

de várias áreas do SNC (e.g. retina, córtex, hipocampo, prosencéfalo basal e região do

septo) têm sua sobrevida aumentada in vitro após tratamento com as IL-2, IL-4, IL-5,

IL-7 e IL-8 em baixas concentrações (nM ou µM) sugerindo um papel neurotrófico para

estas citocinas (Araujo e Cotman, 1993; Sholl-Franco et al., 2001a). A modulação

fenotípica de diferentes tipos neuronais por ILs também tem sido alvo intenso de

estudos, bem como a regulação da atividade neuronal e a liberação e captação de

diferentes neurotransmissores (Mennicken et al., 1994; Hopkins e Rothwell, 1995;

Mehler e Kessler, 1997; Sholl-Franco et al., 2000, 2001b, 2002).

1.2.1.1 A INTERLEUCINA-4 (IL-4)

A IL-4 é uma citocina anti-inflamatória, inicialmente descrita como um fator

estimulante de células B (BSF-1) ou como fator-1 de crescimento de células B

(BCGF-1), tendo sido sua ação inicialmente relacionada à proliferação dessas

células quando da co-estimulação por anticorpos anti-IgM (Farrar et al., 1983). Além

disso, foi descrita como uma citocina de ação pleiotrópica sobre várias populações

celulares, podendo atuar em vários estágios da diferenciação celular (Banchereau et

al., 1994; Duschl e Sebald, 1996).

A IL-4 foi identificada pela primeira vez em 1982 por Chomarat e Banchereau

(1997, para revisão) como uma citocina multifuncional secretada por células Th2,

basófilos e mastócitos. A IL-4 promove a diferenciação de células T em células do

tipo Th2 (Paul,1991). Ela é uma glicoproteína de peso molecular de 20 KDa,

secretada principalmente pelos linfócitos T CD4+ da subpopulação Th2 (Holtmann e

Resch, 1995; Crane et al., 1998), atuando como uma importante citocinas de ação

central na diferenciação de células T CD4+ em células Th2, porém sem apresentar,

ainda, funções definidas na diferenciação das células Th1 (Li et al., 2004).

Recentemente foi descrito que a IL-4 é capaz de induzir células progenitoras da

medula óssea a se diferenciarem em células Th2 inatas in vitro (Chen et al., 2004).

Em linfócitos B, por sua vez, a IL-4 participa dos processos de ativação,

proliferação e diferenciação celular, promovendo a produção de IgG1 e IgE (Vitetta

et al., 1985; Coffman et al., 1986; Nelms et al., 1999; Ansel et al., 2006). A IL-4 induz

a transcrição dos genes IgCγ1 e Cε como um precedente, e como é a principal

estimuladora da troca de classe de Ig para o isotipo IgE, faz isso induzindo ou

aumentando a expressão de moléculas MHC classe II, Thy-1, CD23 nas células B e

T (Coffman et al., 1986; Snapper e Paul, 1987; Snapper et al., 1988). Além disso,

tem sido mostrado que a IL-4 atua como fator de sobrevida prevenindo a apoptose

de diferentes tipos celulares, incluindo células T e B e mastócitos (Foote et al., 1996;

Zamorano, et al., 1996).

A IL-4 é composta por 129 aminoácidos e apresenta 20% de homologia de

sequência de aminoácidos com a IL-13. Esta é outra citocina anti-inflamatória

também derivada de células Th2, que compartilha inúmeras propriedades biológicas,

estruturais e funcionais com a IL-4 (Chomarat e Banchereau, 1997; Müeller et al.,

2002). A IL-4 possui uma estrutura molecular peculiar sendo formada por 4 α-hélices

orientadas de forma ‘up-up-down-down’ (LaPort et al., 2005) e duas longas alças

terminais (Mueller et al., 2002), como pode ser observado na figura 9.

Figura 9 – Representação espacial da estrutura molecular da interleucina-4. (Retirada do endereço eletrônico: http://www.mcld.co.uk/hiv).

Em adição às suas funções imunomodulatórias, a IL-4 tem sido descrita, nas

últimas décadas, atuando sobre células do SNC adulto ou em desenvolvimento

(Sholl-Franco et al., 2001a; Sholl-Franco et al., 2001b; Sholl-Franco et al., 2002;

Sredni-Kenigsbuch, 2002; Schroeter e Jander, 2005). Entretanto, poucos são os

dados disponíveis a respeito das populações produtoras desta citocinas, ficando, na

maior parte das vezes, a informação restrita à descrição de seus efeitos sobre

populações neuronais e/ou gliais específicas.

Na década de 1990, os trabalhos pioneiros de Brodie (1996) e de Araújo e

Cotman (1993, 1995) mostravam o envolvimento principalmente de células gliais

como as populações-alvo desta citocina. Em 2005, Butovsky e colaboradores

mostraram que a IL-4 e o IFN-γ induziam indiretamente a neurogênese e

oligodendrogênese de células progenitoras neurais, em camundongos adultos. Foi

demonstrado que células microgliais tratadas com IL-4 co-cultivas com células

progenitoras neurais estimulam, nestas últimas, a oligodendrogênese (Butovsky et

al., 2005). Além disso, já foi demonstrado que a IL-4 diminui a proliferação de

astrócitos em humanos (Estes et al., 1993, Barna et al., 1995) e aumenta o efeito

anti-proliferativo do TNF-α em uma linhagem celular de glioblastoma (Iwasaki et al.,

1993). Ainda em glioblastomas, foi demostrado, em células C6, que a IL-4 induz um

efeito proliferativo bifásico, levando a um aumento da proliferação celular em baixas

concentrações e inibição em altas concentrações.(Iwasaki et al., 1993).

A indução da síntese e secreção de NGF pela IL-4 também foi observada em

células astrogliais de ratos (Awatsuji et al., 1993), em células de linhagem C6 (Brodie

e Goldreich, 1994) e em astrócios corticais e cerebelares de camundongos (Brodie

et al.,1998). Estudos desenvolvidos in vitro mostraram ainda que a IL-4 atua inibindo

a liberação de agentes neurotóxicos, tais como o IL-1 β, TNF-α e o óxido nítrico

(Chao et al., 1993; Lee et al., 1995; Mori et al., 1995) e antagonizando os efeitos do

IFN-γ (Fiorentino et al., 1991).

Os efeitos diretos da IL-4 na sobrevida de diferentes populações neuronais

foram avaliados in vitro como, por exemplo, sobre neurônios hipocampais de

embriões de ratos (Araujo e Cotman, 1993) ou sobre células ganglionares da retina

(Sholl-Franco et al., 2001a). Entretando, a ação neuroprotetora da IL-4 in vivo pôde

ser confirmada por estudos que utilizaram a expressão desta citocina, através de

transferência gênica, com o uso de adenovírus associado. Neste trabalho foi

demonstrado o aumento da sobrevida das células ganglionares da retina 14 dias

após axotomia (Koeberle et al., 2004). Esse efeito foi observado com a

administração do vetor nos colículos superiores ou intravitriamente (Koeberle et al.,

2004).

Outros estudos têm demonstrado que a IL-4 também exerce uma importante

ação anti-inflamatória no cérebro. Experimentos realizados in vivo mostram que a IL-

4 pode regular a inflamação cerebral induzindo a morte da microglia ativada e

aumentando, conseqüentemente, a sobrevida neuronal (Park et al., 2005). Além

disso, Mössner e colaboradores (2001) mostraram que a IL-4 é capaz de diminuir o

número de transportadores de serotonina (5-HTT) em linfócitos B imortalizados.

Essas células representam um modelo prático para o estudo do que ocorre com

neurônios serotoninérgicos, visto que os efeitos do polimorfismo no RNAm para 5-

HTT e na proteína 5-HTT são semelhantes em células periféricas e no cérebro

humano. A diminuição nos níveis de 5-HTT reduz a quantidade de serotonina

disponível para ser liberada nos sítios de inflamação. Como a serotonina faz parte

da cascata inflamatória, a IL-4 também exerceria, desta forma, um papel anti-

inflamatório.

Nolan e colaboradores (2005) demostraram a presença funcional de

receptores para IL-4 em células granulares do giro denteado de ratos e que a

ativação deste receptor é regulada durante o desenvolvimento desta estrutura, onde

é marcante a diminuição com o avanço da idade do animal. De fato, doenças

neurodegenerativas relacionadas com a idade estão fortemente associadas com

uma alteração significativa no balanço funcional entre citocinas pró- e anti-

inflamatórias, o que poderia estar acarretando em pertubação na eficiência sináptica

(Maher et al., 2005).

1.2.1.2 IL-4R E VIAS DE TRANSDUÇÃO

A IL-4 exerce suas atividades biológicas através da interação com os seus

receptores de superfície (Lischke et al., 1998), os quais são compostos de duas

proteínas transmembrana (Dushl e Sebald, 1996; Wells e DeVos, 1996, para

revisão). A resposta celular a esta citocina depende da presença do componente α

(IL-4Rα), também denominado CD 124 (Hinton e Welham, 1999), com peso

molecular de 140 kDa (Keegan e Pierce, 1994; Galizzi et al., 1990), e responsável

pelo processo de dimerização formador dos dois tipos de receptores para IL-4 (IL-

4R) já descritos (Figura 10). Nos IL-4R do tipo I, presentes em linhagens de células

hematopoiéticas, a outra subunidade formadora do complexo é a cadeia IL-2γc

(CD132) (Russell et al., 1993; Hinton e Welham, 1999.), a qual é compartilhada

ainda por receptores para outras citocinas como, por exemplo, a IL-2, IL-7, IL-9 e IL-

15 e IL-21 (Müller et al., 2002; Kelly-Welch et al., 2003; 2005). O IL-4R do tipo II está

presente em linhagens celulares de células não hematopoiéticas, sendo formado

pela interação do IL-4Rα com o IL-13Rα1, ao invés de IL-2Rγc (Nelms et al., 1999;

Müller et al., 2002; Pernis e Rothman, 2002; Kelly-Welch et al., 2003, 2005).

Entretanto, a IL-13 também é capaz de se ligar ao complexo formado pela

heterodimerização do IL-4Rα com o IL-3Rα1 (Kelly-Welch et al., 2003)

Figura 10 – Os receptores tipo I e tipo II para IL-4. A, O receptor tipo I para IL-4, composto pelo IL-4Rα e pelo IL-2Rγc e todas as outras interleucinas já descritas que compartilham a subunidade γc: IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, e IL-21. B, O receptor tipo II para a IL-4, composto pelo IL-4Rα e o pelo IL-13Rα1, também pode ser ativado pela IL-13. (Modificado de Ozaki e Leonard, 2002).

A dimerização do IL-4R ativa membros da família de janus cinases (JAK),

composta por quatro componentes (JAK1, JAK2, JAK3 e Tyk2), os quais podem

estar associados com a região citoplasmática do receptor (figura 11). O receptor tipo

I ativa predominantemente as JAK1 e JAK3, enquanto o receptor tipo II ativa as

JAK1, JAK2 e Tyk2. Resíduos de tirosina, presentes na cauda citoplasmática do IL-

4Rα, tornam-se fosforilados e atuam como sítios de ligação para outras moléculas

sinalizadoras (Murata et al., 1998; Müeller et al., 2002; Kelly-Welch et al., 2003). Na

via mais clássica de ativação do receptor para IL-4, o primeiro resíduo tirosina

citoplasmático (Y1) interage com proteínas ligadoras de resíduo tirosina (PTB),

enquanto os resíduos de tirosina de 2 a 4 interagem com domínios SH2 de

transdução de sinal e o ativador transcricional 6 (STAT6). A STAT6 fosforilada, se

dimeriza, migra para o núcleo e se liga a promotores de genes, atuando como um

ativador ou repressor transcricional (Takeda et al., 1997; Hebenstreit et al., 2006).

Figura 11 – Ativação do receptor para IL-4 leva a ativação de vias de sobrevida, proliferação e diferenciação celular. (disponível no endereço eletrônico: http://www.biocarta.com/pathfiles/il4pathways.asp). A transdução de sinais através dos receptores de IL-4 envolve três principais

vias de sinalização: JAK-STAT6, Raf-MEK-MAPK e fosfatidilinositol-3`- cinase

(PI3K)-Akt (para revisão, Nelms et al., 1999; Kelly-Welch, 2003). Adicionalmente, um

aumento citoplasmático nos níveis de cálcio livre e de AMPc (Finney et al., 1990),

assim como um aumento na atividade da proteína cinase C (PKC) (Ikizawa et al.,

1996; Yanagihara et al., 1997) podem também desencadear as respostas celulares

da IL-4. A possibilidade de ativação de múltiplas vias setorizadamente e de maneira

compartimentalizada colaboram para os fenômenos de pleiotropismo, antagonismo,

sinergismo e redundância desencadeados pelas ações da IL-4 e de outras citocinas

nos mais diversos tipos celulares (Guzdek et al., 2000).

1.2.1.3 A INTERLEUCINA-4 E O SISTEMA VISUAL

Na retina de ratos em desenvolvimento, foi demonstrado que a IL-4 aumenta

a sobrevida de células ganglionares axotomizadas após 48h em cultura de maneira

dose-dependente (Sholl-Franco et al., 2001a), assim como a diferenciação de

células amácrinas colinérgicas e GABAérgicas (Sholl-Franco et al., 2001b, 2002).

Reforçando a hipótese de agente neuroprotetor, estudos recentes mostram que a

transfecção gênica da IL-4 mediada por adenovírus (Ad.IL-4) aumenta a sobrevida

das células ganglionares da retina in vivo, após axotomia. Esse efeito foi observado

tanto na administração intraocular do vetor como na sua injeção nos colículos

superiores. O Ad.IL-4 também diminuiu a imunorreatividade à nitrotirosina, sugerindo

que a IL-4 protege as RGC da formação de peroxinitrito, que resultaria da síntese de

óxido nítrico por células gliais ativadas (Koeberle et al., 2004).

Entretanto, a sua presença constitutiva, ou a presença da subunidade α

específica para o seu receptor (IL-4Rα) ainda não foram demonstradas na retina.

Adicionalmente, dada a literatuta atual não se sabe se interleucinas podem afetar a

proliferação e diferenciação de fotorreceptores (Morrow et al., 1998; Liversey e

Cepko, 2001), que particularmente são dependentes de fatores de crescimento

derivados de células não-neurais do epitélio pigmentar (Tanihara et al., 1997;

Behling et al., 2002).

Fukuda e colaboradores (2002) demonstraram a expressão do RNAm para

os componentes do receptor tipo I e tipo II de IL-4 (IL-4R): IL-4Rα, IL-2Rγc, IL-

13Rα1, e IL-13Rα2 em culturas de fibroblastos da córnea humana. Adicionalmente,

mostraram que a expressão das proteínas IL-4Rα e IL-2Rγc também estavam

presentes na superfície dos fibroblastos da córnea humana. De fato, nestas células

a IL-4 pode atuar via seus receptores tipo I e tipo II (Kelly-Welch et al., 2003, 2005).

2 OBJETIVOS

A IL-4, citocina anti-inflamatória com efeitos neuromoduladores, tem sido

implicada com a diferenciação e sobrevida das células retinianas. Assim, dividimos

nossos objetivos da seguinte forma:

Gerais:

Avaliar a presença e ação da IL-4 na retina.

Específicos:

Avaliar a expressão de IL-4 no tecido retiniano.

Verificar e localizar a expressão de IL-4 no tecido retiniano.

Verificar e localizar a expressão da subunidade α do receptor de IL-4.

Avaliar o papel da IL-4 na proliferação das células progenitoras retinianas.

O efeito da IL-4 na proliferação das células precursoras retinianas.

A modulação da expressão de duas proteínas reguladoras do ciclo

celular: Ciclina D1 e p27kip1 pela IL-4.

As vias de sinalização envolvidas neste efeito.

Avaliar o papel da IL-4 na diferenciação de células fotorreceptoras.

O efeito da IL-4 na diferenciação das células fotorreceptoras na retina

durante o desenvolvimento in vitro.

A modulação da expressão da proteína rodopsina pela IL-4.

As vias de sinalização envolvidas neste efeito.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Todos os animais utilizados foram tratados segundo as normas estabelecidas

pela ARVO (Statement for the use of animals in ophtalmic and vision resarch) e pelo

Comitê de Experimentação Animal do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.

3.1 MATERIAIS

IL-4 recombinante humana (atividade específica, 5,0 x 106 U/mg), IL-2

recombinante humana (atividade específica, 2,0 x 108 U/mg), IL-8 recombinante

humana (atividade específica, 2,0 x 106 U/mg), anticorpo primário anti-bFGF

(bioatividade, ND50=2,0 µg/mL), anticorpo anti-IL-4R (bioatividade, ND50=2,0 µg/mL)

foram obtidos da Peprotech (USA). Os anticorpos primários anti-IL-4 (bioatividade,

ND50=2,1 µg/mL), anti-IL-4Rα, anti-Erk2, anti-phospho-Erk1/2, e anti-actin foram

obtidos da Santa Cruz Biotechnology (USA). O anticorpo primário anti-rodopsina

(Rho 4D2) foi gentilmente cedido pelo Dr. R. Molday (1998, University of British

Columbia, Vancouver, Canada). O meio de inclusão (OCT) foi obtido da Tissue-Tek,

Sakura Finetek U.S.A Inc. (USA). A poli-L-lisina (p-L-l), a fluorodeoxiuridina (FDUR),

o inibidor I de JAK, o PP1, a poli-l-ornitina (p-L-O), o HEPES, a penicillina G, o

sulfato de estreptomicina, a glutamina L, e o tetrahidrocloreto de 3,3’-

diaminobenzidina (DAB) foram obtidos da Sigma Chemical Co. (St. Luis, USA). O

H89 (inibidor de PKA), a forscolina (ativadora da adenilil ciclase), o PD98059

(inibidor de MAPK),o LY294002 (inibidor de PI3K);U0126 (inibidor de MEK), o

inibidor de Jak1 (inibidor da via JAK-STAT) foram obtidos da Calbiochem (USA). O

kit peroxidase (HRP)-ABC foi obtido da Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA).

A tripsina foi obtida da Worthington Biochemical Co. (Freehold, NJ, USA). Os

anticorpos secundários foram obtidos da Cell Signalling (USA). A genisteína foi

obtida da RBI (Research Biochemicals Int. Natick, MA, USA). O K-252a, a brefeldina

A, o cloreto de queleritrina (ChCl), SB239063, SB203580, e SP600125 foram obtidos

da Biomol (PA, USA). O meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Dulbecco's

modified Eagle medium) e o soro fetal bovino (FCS, fetal calf seerum) foram obtidos

da GIBCO (BRL). [metil-3H]-timidina (atividade específica, 47,0 Ci/mmol) e o kit ECL

Plus foram obtidos da Amersham Int. Plc. (Buckinghamshire, UK). As placas Petri

(35mm) foram obtidas de Corning (NY, USA). O entelan foi obtido da Merck

(USA).Todos os outros reagentes utilizados foram obtidos a partir de fornecedores

de escala analítica.

3.2 TRATAMENTO EXPERIMENTAL

Os tratamentos das culturas de explantes feitos com as drogas ou com os

anticorpos de bloqueio foram feitos 1 hora antes do período de incubação das

culturas.

3.2.1 CULTURA DE MONOCAMADA

As culturas primárias de células retinianas foram preparadas utilizando os

procedimentos previamente descritos (Sholl-Franco et al., 2000). Primeiramente,

camundongos C57bl/6 neonatos (dia pós-natal 0, P0) foram sacrificados por

decaptação, e os globos oculares são acumulados em uma solução salina sem

cálcio e sem magnésio (CMF, composta por: NaCl -131,0 mM; KCl - 4,09 mM;

Na2HPO4 - 0,92 mM; KH2PO4 - 0,45 mM; NaHCO3 - 9,4 mM; Glicose - 12,2 mM). As

retinas são dissecadas em CMF e, livres do epitélio pigmentado, transferidas para

um tubo de ensaio contendo CMF. A dissociação das células foi realizada, primeira-

mente, com tripsina (Worthington, USA) na concentração de 0.05% por aproxima-

damente 20 min, a 37°C. Após o período de tratamento enzimático, adiciona-se o

meio de cultura completo que consiste de BME suplementado com 2 mM de

glutamina L , 100 µg/mL de sulfato de streptomicina, 100 U/mL de penicilina G, 20

mM de HEPES e 5% de soro fetal bovino (FCS). Em seguida, as preparações eram

lavadas duas vezes com meio de cultura completo. Finalizando o processo de

dissociação, passavam-se os tecidos de 20 a 30 vezes através de uma pipeta

Pasteur de ponta afilada. Este processo de trituração fornecia uma suspensão

homogênea de células. Após contagem, em um hemocitômetro, o número de células

contidas na suspensão era estimado. Em seguida, procede-se à diluição desejada.

A densidade de plaqueamento utilizada nos diferentes experimentos foi de 1,0

x 105 células por cm2 da placa de Petri. O plaqueamento das células foi feito em

placas de Petri de 35mm previamente tratadas com poli-l-ornitina (50 µg/mL) em um

volume de 1,0 ml. O volume final de 2,0 ml foi obtido pela adição de meio de cultura

controle ou experimental, conforme o caso. Esta adição foi realizada no momento do

plaqueamento, ou após um período de adesão que varia de 0 a 4 horas. As culturas

em monocamadas foram mantidas a 37°C em atmosfera de 5 % de CO2 e 95 % de

ar, por períodos de tempo que variam conforme o experimento. Trocas de meio de

cultura controle ou experimental eram realizadas a cada 3 dias.

3.2.2 CULTURA DE EXPLANTES DA RETINA

Camundongos C57bl/6 P0 foram sacrificados por decaptação, os olhos foram

rapidamente removidos e transferidos para uma placa de Petri contendo CMF. As

retinas foram dissecadas livres da esclera e do RPE e cortadas com auxílio de bisturi

(lâmina no 15), em explantes de aproximadamente 1mm2 (Rehen et al., 1996) em

meio de cultura BME completo.Os explantes foram incubados por vários períodos de

tempo, a 37oC, em um agitador orbital na rotação de 80-90rpm, No período de

cultura, não foi relatada nenhuma mudança nem na estrutura geral e nem na

laminação do tecido retiniano, quando comparado com a retina in situ (para revisão

Linden et al., 1999), conforme constatado pela análise por coloração com vermelho

neutro (dado não mostrado).

3.2.3 CULTURA DE CÉLULAS DO BAÇO

As células do baço foram obtidas utilizando-se os procedimentos

modificados do protocolo previamente descrito por Sholl-Franco e colaboradores

(2000). Primeiramente, camundongos C57bl/6 adultos foram sacrificados por

anestesia profunda com clorofórmio, os baços foram removidos e suspensões

homogêneas do tecido foram preparadas através da passagem por uma malha

plástica (peneira de 50-gauge) em CMF. A suspensão otida foi centrifugada e

ressuspendida em meio de cultura (RPMI), para a seguir ser deixada em repouso,

por 1 hora, em placas de Petri plásticas (100mm) para permitir a adesão dos

macrófagos. A suspensão contendo as células não aderentes foi aspirada, lavada e

adicionada a frascos de cultura (75cm2) em uma densidade de plaqueamento de

107 células/mL, em meio de cultura completo (RPMI) suplementado com 25 µM de 2-

mercaptoetanol e 5µg/mL de concanavalina A (ConA). Os esplenócitos foram

incubados por aproximadamente 12 horas, a 37°C, em uma atmosfera de 5% CO2 e

95% ar.

3.3 WESTERN BLOTS

Os extratos protéicos totais foram preparados a partir de células retinianas

mantidas em monocamada ou explantes por diferentes períodos de tempo em meio

de cultura controle ou tratado. Para a observação tanto de IL-4 quanto da IL-4Rα

foram utilizados vários extratos, descritos a seguir: extrato de tecidos adjacentes à

retina neural, que compreendem células da esclera, coróide e RPE obtidos de

camundongos P0 (identificados como E); extrato de retina neural, obtidos de

camundongos P0 (R); extrato de tecido cérebro-cortical total, obtido de

camundongos P0 (C); esplenócitos (células do baço) mantidas em cultura por 12 h

na presença de ConA (S).

Todos os extratos protéicos foram obtidos a partir da incubação de diferentes

tecidos ou células em PBS gelado por 5 min e posteriormente com tampão de lise

(20 mM Tris HCl, pH7,.4, 250 mM sacarose, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM

glicerofosfato de sódio, 50 mM fluoreto de sódio, 5 mM pirofosfato de sódio, 1%

Triton X-100, 1 mM ortovanadato de sódio, 1 mM benzamidina, 5g/mL leupeptina,

0,2 mM PMSF, 0,1% 2-mercaptoetanol), no gelo, por 5 min. Em seguida, as

preparações foram vortexadas e incubadas, no gelo, por 5 minutos adicionais. Este

procedimento foi repetido três vezes. A seguir, os extratos protéicos totais foram

submetidos a centrifugação e os sobrenadantes recolhidos e armazenados a -20º C.

A quantidade total de proteína contida nas amostras foram dosadas pelo método de

Lowry (Lowry et al., 1951), que usa o BSA como padrão.

Quantidades estipuladas de proteína (25 µg) das amostras foram aplicadas

nas colunas de um gel de acrilamida/bis-acrilamida (7,5% gel de corrida e 3,9%

stacking gel). O gel foi submetido a uma voltagem de 100V durante

aproximadamente 15 minutos (ou até que a proteína chegasse ao gel de corrida) e

150V por aproximadamente quarenta e cinco minutos em tampão de corrida. A

transferência da proteína do gel para a membrana de nitrocelulose aconteceu a uma

amperagem constante de 200mA, durante 90 minutos, em tampão de transferência.

A transferência foi verificada pela marcação da membrana com o vermelho de

Ponceau. Após esse procedimento, a membrana foi lavada três vezes, durante

quinze minutos cada, com TBS-T e depois incubada com BSA 5% em TBS-T por 1

hora e trinta minutos sob leve agitação, quando então foram adicionados os

anticorpos anti-rodopsina (Rho 4D2), anti-IL-4, anti-IL-4Rα, anti-ciclina D1, anti-

p27kip1 ou anti-fosfo-Erk (p-Erk) overnight, a 4°C, também sob leve agitação. A

membrana foi novamente lavada com TBS-T, três vezes, de quinze minutos cada, e

incubadas com o anticorpo secundário IgG específico, conjugado a peroxidase de

raiz forte (HRP) em leite integral (molico) 5%, em TBS-T, por duas horas, a

temperatura ambiente. Lavou-se novamente a membrana por três vezes de quinze

minutos com TBS-T e então a presença da atividade peroxidase na membrana foi

revelada utilizando-se ECL plus.

Para o reaproveitamento das membranas com o objetivo de incubação com

outros anticorpos, estas foram submetidas a um protocolo de stripping.

Resumidamente, elas eram lavadas com tampão tris-HCL (tris base + SDS + β-

mercaptoetanol, pH 6,7), por 30 minutos, a 56ºC, mexendo ocasionalmente. Lavou-

se a membrana com TBS-T e recomeçou-se o blotting incubando a membrana com

o anticorpo primário anti-Erk2 (1:3000) ou anti-actina (1:2000) e secundário IgG de

cabra contra coelho acoplado a HRP (1:4000) repetindo-se todo o processo já

descrito anteriormente.

3.4 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS

3.4.1 CRIOPRESERVAÇÃO E REALIZAÇÃO DOS CORTES DOS EXPLANTES DA RETINA E DO GLOBO OCULAR. Os explantes de retina foram fixados por imersão em paraformaldeído 4%

diluído em tampão fosfato, 0,1M, pH 7,4, por 1h. Em seguida foi realizada lavagem

dos mesmos em tampão fosfato, 0,1M, pH 7,4 e armazenagem a 4ºC. Vinte e quatro

horas antes da realização dos cortes, o tecido foi imerso em solução de sacarose

30% no mesmo tampão, a fim de conferir ao tecido crioproteção, impedindo sua

destruição pelo congelamento. Os explantes foram orientados transversalmente em

orientadores de explantes (Rehen et al., 1996), os quais já estavam preenchidos

com meio inerte para inclusão (OCT). Posteriormente foram congelados em

nitrogênio líquido e cortados na espessura de 10µm. Os cortes obtidos foram

recolhidos em lâminas previamente tratadas com poli-L-lisina (200µg/mL), com o

objetivo de facilitar a aderência dos mesmos.

Para a obtenção dos cortes de olhos inteiros os camundongos P0 foram

sacrificados por decaptação, enquanto animais P14 e P60 (adultos) foram

anestesiados e perfundidos com solução salina seguida de solução de para-

formaldeído a 4%. Todos os globos oculares foram fixados, ou no caso de P14 e de

P30 pós-fixados por imersão em paraformaldeído 4% diluído em tampão fosfato,

0,1M, pH 7,4, por 2h. Em seguida foi realizada lavagem dos mesmos em tampão

fosfato, 0,1M, pH 7,4 e armazenagem a 4ºC. Vinte e quatro horas antes da

realização dos cortes, o tecido foi imerso em solução de sacarose 30% no mesmo

tampão, a fim de conferir ao tecido crioproteção, impedindo sua destruição pelo

congelamento. Os globos oculares foram orientados transversalmente em

orientadores de olhos, previamente preenchidos com OCT, e posteriormente

congelados em nitrogênio líquido e cortados coronalmente na espessura de 10µm.

Os cortes obtidos foram recolhidos em lâminas previamente tratadas com poli-L-

lisina (200µg/mL), com o objetivo de facilitar a aderência dos mesmos e mantidos à -

20 ºC.

3.4.2 IMUNOHISTOQUÍMICA

PARA RODOPSINA

Para a imunodetecção dos fotorreceptores bastonetes as lâminas foram

lavadas, por 3 vezes de 5min, em uma salina tamponada com fosfato (PBS), 0.1M,

pH 7,4. Logo após, os cortes foram permeabilizados por incubação com Triton X-100

(0,5%) em PBS, por 15min. As preparações foram novamente lavadas por 3 vezes

de 5 min com PBS e, em seguida, bloquearam-se os sítios de ligação não

específicos pela incubação com albumina de soro bovino (BSA) 1% em PBS (PBS-

BSA 1%), por 30min. A próxima etapa consistiu em incubar os cortes com o

anticorpo monoclonal Rho 4D2 (1:200) (Molday, 1989), diluído em PBS-BSA 1%, a

37οC, em câmara úmida overnight. Após esta incubação as preparações foram

lavadas em PBS, incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo

(1:200), diluído em PBS-BSA 1%, por 30min, a 37οC. Ao final do período de

incubação, foram realizadas 3 lavagens de 5 min com PBS, seguidas pela

incubação com os reagentes A + B (kit ABC de peroxidase), por 30min, à

temperatura ambiente, seguida por 3 lavagens de 5 min em PBS. A revelação da

peroxidase, para visualização das células positivas para rodopsina (Rho 4D2+), foi

realizada por incubação com o cromógeno DAB, que na presença dessa enzima e

do peróxido de hidrogênio presente na solução, forma um precipitado marrom.

Controles negativos para a reação de imunohistoquímica foram obtidos pela

substituição do anticorpo primário pela incubação apenas com PBS-BSA 1%. Os

cortes foram analisados (Microscópio Axiophot, Nikkon) em um aumento de 1000x e

fotografados digitalmente (Câmera Nikkon) em microscopia óptica convencional.

PARA IL-4Rα (IMUNOHISTOQUÍMICA DE FLUORESCÊNCIA)

Para a imunodetecção de IL-4Rα as lâminas foram lavadas, por 3 vezes de

5min, em uma salina tamponada com fosfato (PBS), 0,1M, pH 7,4, e em seguida,

bloqueou-se os sítios de ligação não específicos pela incubação com albumina de

soro bovino (BSA) 1% em PBS (PBS-BSA 1%), por 30min. A próxima etapa consistiu

em incubar os cortes com o anticorpo primário policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα)

(1:200), diluído em PBS-BSA 1%, a 4οC, em câmara úmida overnight. Após esta

incubação as preparações foram lavadas por três vezes de 5 min em PBS, e em

seguida incubadas com anticorpo secundário fluorescente Alexa 488 verde (1:200),

diluído em PBS-BSA 1%, por 2 horas, em câmara úmida, a temperatura ambiente,

protegidas da luz. Ao final do período de incubação, foram realizadas 3 lavagens de

5 min com PBS, seguidas pela incubação com DAPI (intercalante de DNA; cor azul),

por 30 segundos, à temperatura ambiente, seguida por 3 lavagens consecutivas de

PBS. Finalmente, as lâminas foram montadas em meio de montagem para

fluorescência (n-propilgalato em glicerol 80%) e conservadas a 4 °C, protegidas da

luz.

Controles negativos para a reação de imunohistoquímica foram obtidos pela

substituição do anticorpo primário pela incubação apenas com PBS-BSA 1%. Os

cortes foram analisados (Microscópio Axiophot, Nikkon) em um aumento de 1000x e

fotografados digitalmente (Câmera Nikkon) em microscopia óptica convencional de

fluorescência.

3.4.3 COLORAÇÃO COM VERMELHO NEUTRO

As lâminas foram inicialmente lavadas, por 2min, em uma solução de tampão

acetado 5% , pH 3,3. A próxima etapa consistiu em incubar as lâminas em solução

de vermelho neutro por aproximadamente 10 seg. Ao final desse período as lâminas

foram lavadas com o mesmo tampão inicialmente utilizado, por duas vezes. A seguir,

as preparações foram colocadas para secar, em temperatura ambiente por um dia.

Para a montagem, as lâminas foram seqüencialmente incubadas em álcool absoluto,

por 5s, e em Xilol, por 5 min. As preparações foram montadas com lamínulas

utilizando-se entelan como meio de montagem.

3.5 INCORPORAÇÃO DE [H3]-TIMIDINA

A incorporação de timidina foi realizada em culturas (explantes e

monocamadas) de retina, realizadas como descrito no item 3.2 Resumidamente,

uma hora antes do final de cada experimento, as culturas (monocamada ou

explantes) foram lavadas por duas vezes com BME sem FCS, a 37 oC e então

incubadas com 0,5µCi/mL de [metil-3H]-timidina, em 1mL do mesmo meio por mais

1h, a 37 oC, em atmosfera umidificada. Em seguida as culturas foram lavadas quatro

vezes, com meio sem FCS, a 37 ºC para a retirada do excesso de [metil-3H]-timidina

não incorporada. Seqüencialmente, o meio de cultura foi retirado, sendo adicionado

200µL/poço de NaOH 0,4N, por 15min. O conteúdo de cada poço foi raspado e

transferido para tubos de vidro, acondicionados sobre gelo, junto com 3mL de água

(MILIQ). A cada tubo foi adicionado 300µL de TCA 100%, seguida por uma

incubação de 30min. As amostras foram passadas por filtros Whatman GF/B sob

pressão negativa, gerada por uma bomba de sucção, onde o excesso de

radioatividade não incorporado no DNA foi retirado. Os tubos de vidro onde estavam

as amostras foram lavados com 2mL de TCA 5%, por três vezes. Em seguida, os

filtros foram submetidos à secagem a 100 oC, por 30 min, e transferidos para frascos

de cintilação com solução de cintilação (5mL tolueno absoluto acrescido de 2,5-

difenil-oxazol 0,4%). A contagem da radioatividade presente nas amostras foi feita

em um contador de cintilação líquida e corrigida segundo a quantidade de proteína

presente em cada amostra, dosada de acordo com o método de Lowry e

colaboradores (1951).

3.6 QUANTIFICAÇÃO DOS NÍVEIS INTRACELULARES DE AMPc

Os níveis intracelulares de AMPc foram quantificados de acordo com uma

modificação do método competitivo de ligação de Gilman (1970), descrito

previamente por Varella e colaboradores (1999). Explantes de retinas, obtidos como

descrito no item 3.2, foram deixados em repouso na presença de DMEM, a 37 οC,

por 30 min. A seguir, os tecidos foram pré-incubados por 15 min, a 37 οC, em DMEM

contendo isobutilmetilxantina (inibidor de fosfodiesterase) 0,5 mM e ácido ascórbico

100 µM, e estimulados com IL-4 ou forscolina, sendo esta última utilizada como um

controle positivo, por ser um agente capaz de aumentar os níveis de AMPc

intracelular pela ativação direta da adenilil ciclase. Após períodos estabelecidos de

incubação, a reação foi interrompida pela adição de TCA na concentração final de

5%. O sobrenadante foi transferido para um tubo e congelado até a etapa seguinte.

Posteriormente, as amostras foram descongeladas e centrifugadas a 15.000

rpm por 20-30 min; o sobrenadante foi recolhido e submetido a uma coluna de troca

iônica previamente tratada (resina DOWEX 50) para que o TCA e outros

nucleotídeos fossem eliminados; o pellet foi ressuspendido em 0,5mL NaOH 1N e

posteriormente utilizado para dosagem de proteína pelo método de Lowry (Lowry et

al., 1951).

As frações obtidas, a partir da passagem do sobrenadante pelas colunas, e

que continham as maiores quantidades do traçador [3H]-AMPc, por grupo

experimental, foram determinadas e submetidas a um ensaio competitivo para a

determinação da quantidade de AMPc endógeno. Para isso, as amostras foram

incubadas com PKA e [3H]-AMPc, na presença de 50 mM de acetato de sódio, pH

4,0, por 100 minutos, a 4ºC. Ao término da incubação a reação foi interrompida com

200 mM de tampão fosfato, pH 6,0. Nesse momento, as amostras foram filtradas, em

pressão negativa, em filtros Millipore, com o auxílio de um aparato Kitasato. Após a

secagem dos filtros por 30 min, a 100 ºC, os mesmos foram colocados em frascos

de cintilação contendo líquido de cintilação para quantificação da radioatividade

referente ao [3H]-AMPc presente em cada amostra em um contador de cintilação

líquida. Os valores obtidos foram corrigidos conforme a quantidade de proteína

presente.

3.7 ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS Rho 4D2+

A análise de células Rho 4D2+ foi feitas em seções de grupos de células

presentes nas culturas de monocamada distribuídos randomicamente dentro dos

grupos experimentais. Em todos os casos, foi tido cuidado em se distinguir o que era

marcação inespecífica ou de fundo (background) e o que era realmente marcação

para DAB. Nos experimentos apresentados não houve nenhuma diferença

significativa nas taxas de morte celular (verificado por análise de núcleos com perfis

picnóticos em coloração com vermelho neutro ou por marcação nuclear com DAPI).

Pelo menos 27 campos de pelo menos 3 lamínulas por grupo experimental foram

contados em cada ponto experimental, usando o microscópio Zeiss na magnificação

de 1000x, em campo claro.

3.8 APRESENTAÇÃO DOS DADOS E ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM)

de um mínimo de três experimentos realizados, pelo menos, em triplicata. A

significância estatística foi inicialmente obtida pela análise de variância em uma via

(one-way ANOVA) e a comparação dos múltiplos grupos foi obtida pelo teste de

comparação Newman–Keuls (Programa GraphPad Prism 4.00 for Windows

GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Os valores estatísticos considerados

foram aqueles com valores de p inferiores a 0,05 (p<0,05) ou inferiores a 0,001

(p<0,001).

4. RESULTADOS

O conjunto dos resultados apresentados nesta dissertação compõem o

Manuscrito (Anexo I) intitulado: “interleukin-4 blocks proliferation of retinal

progenitor cells and increases rod photoreceptor differentiation through

distinct signaling pathways” submetido ao Journal of Neuroimmunology

(Manuscript ID: JNI-S-07-00552; Status: aceito).

4.1 LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO RECEPTOR DE IL-4 (IL-

4Rα) NO TECIDO RETINIANO.

Muitos trabalhos vêm descrevendo a expressão de diversos fatores de

crescimento e de seus receptores, os quais por sua vez desempenham papéis

importantes durante o desenvolvimento, na retina neural e no RPE (Tanihara et al.,

1997). Entretanto, apesar de várias ações para a IL-4 já terem sido descritas na

retina (Sholl-Franco et al., 2001a, 2001b, 2002; Koeberle et al., 2004), a presença

constitutiva ou induzida desta molécula ou da subunidade específica do seu receptor

ainda não foram descritas neste tecido até o presente momento. Sendo assim,

procuramos, primeiramente, avaliar se a IL-4 e a subunidade IL-4Rα estariam

presentes em células da retina neural e no tecido não-neural adjacente à retina.

Os resultados presentes na figura 12 mostram que a IL-4 encontra-se

presente abundantemente no tecido não neural adjacente à retina (células do RPE,

coróide e esclera), assim como em esplenócitos estimulados com concavalina A

(controle positivo). Na retina neural, entretanto, a quantidade de IL-4 presente foi

muito baixa, o que levanta a hipótese desta citocina ser predominantemente

secretada pelo RPE nesta idade do desenvolvimento (P0). Além disso, não foi

possível a detecção da IL-4, por imunohistoquímica, em células neurais retinianas

(dados não mostrados). Extratos de tecido córtico-cerebral foram utilizados como

controle negativo para a presença de IL-4 no SNC (Figura 12).

A subunidade α do IL-4R, diferentemente da molécula de IL-4, foi encontrada

abundantemente tanto na retina não neural (células do RPE, coróide e esclera),

quanto na retina neural (Figura 13). O IL-4Rα também estava presente em extratos

das células do baço (esplenócitos estimulados com concavalina A, controle positivo)

e ausente nos extratos de tecido córtico-cerebral (controle negativo; Figura 13).

Figura 12 – IL-4 é expressa na retina e no tecido ocular adjacente não neural. A, diferentes extratos protéicos foram avaliados por western blot com um anticorpo policlonal contra IL-4 (painel superior) e então re-avaliados com um anticorpo contra actina, proteína constitutiva (painel inferior). E, extrato de proteína de tecidos não-neurais adjacentes à retina (epitélio pigmentado da retina, RPE; coróide; esclera); R, extrato protéico de retina neural; C, extrato protéico de tecido córtico-cerebral; S, extrato protéico de esplenócitos (células do baço) estimulados com concavalina A por 12 horas. B, análise de densidade óptica relativa (densitometria) de três western blots diferentes, comparando a expressão de IL-4 normalizada com a expressão de actina. Os valores estão expressos como média ± SEM de três experimentos independentes.

actina

18 KDa

43 KDa

E R C S

IL-4

A

E R C S0

1

2

3

4

5

Den

sida

de Ó

ptic

a R

elat

iva

B

Figura 13 – IL-4Rα é abundantemente expressa na retina e no tecido ocular adjacente não neural. A, Diferentes extratos protéicos avaliados por western blot com um anticorpo policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα) (painel superior) e então re-avaliados com um anticorpo contra actina, proteína constitutiva (painel inferior). E, extrato de proteína de tecidos não-neurais adjacentes à retina (epitélio pigmentado da retina, RPE; coróide; esclera); R, extrato protéico de retina neural; C, extrato protéico de tecido córtico-cerebral; S, extrato protéico de esplenócitos (células do baço) estimulados com concavalina A por 12 horas. B, análise de densidade óptica relativa (densitometria) de três western blots diferentes, comparando a expressão de IL-4Rα normalizada com a expressão de actina. Os valores estão expressos como média ± SEM de três experimentos independentes.

E R C S0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Den

sida

de Ó

ptic

a R

elat

iva

B

A

140KDa

43KDa

E R C S

IL-4Rα

actina

Adicionalmente, devido a sua forte expressão na retina neural, fez-se uma

análise, por imunohistoquímica, da localização e distribuição do IL-4Rα no tecido

retiniano. Foram utilizadas retinas em três estágios do desenvolvimento pós-natal:

P0, P14 e P60 (adulto). A detecção de IL-4Rα foi analisada por imunofluorescência,

usando um anticorpo primário policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα) e marcação

nuclear com DAPI (intercalante de DNA, em azul). Controles foram realizados com a

omissão do anticorpo primário de modo a se evitar a presença de marcação

inespecífica com os anticorpos secundários. Nossos resultados mostram que o IL-

4Rα encontra-se expresso em todas as camadas da retina pós-natal P0 (Figura 14

A-D), assim como na retina não neural, embora a marcação na camada plexiforme

interna (IPL) tenha se mostrado mais intensa.

No momento da abertura dos olhos, aproximadamente na segunda semana

de vida (P14), a marcação para IL-4Rα se mostrou mais intensa nos segmentos

externos dos fotorreceptores. Entretanto, a marcação para o IL-4Rα pode ser

claramente vista nos corpos celulares de fotorreceptores (ONL; Figura 14 E-G). A

marcação para o IL-4Rα também está presente nas camadas plexiformes (IPL e

OPL), exibindo um padrão consistente com o de processos de células de Muller. Em

adultos, a expressão do IL-4Rα foi observada predominantemente nos segmentos

externos dos fotorreceptores, podendo ser observada em um número restrito de

células na INL, apresentando morfologia semelhante à de células horizontais (Figura

14 I-L).

Figura 14 – Imunolocalização de IL-4Rα em diferentes estágios do desenvolvimento retiniano pós-natal. Imagens de imunohistoquímica de fluorescência de retinas de camundongos P0 (A, B, C, D), P14 (E, F, G, H), adulto (I, J, K, L). Seções ópticas de microscopia óptica de contraste de fase (A, E, I); DAPI (B, F, J; azul); imunomarcação para IL-4Rα (C, G, K; green) e a sobreposição (D, H, L). Escala no canto inferior correspondente a 50 µm. Sc, esclera; PE, epitélio pigmentado; OS,segmentos externos; ONL, camada nuclear externa; OPL, camada plexiforme externa; NBL, camada neuroblástica; INL, camada nuclear interna; IPL, camada plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares.

4.2 IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITORAS EM

RETINAS P0

Com o objetivo de verificar se a ação da IL-4 nas células retinianas estaria

relacionada ao controle de células precursoras retinianas em proliferação,

analisamos se esta citocina regularia a proliferação nestas células e comparamos o

seu efeito com aquele obtido com o uso da forscolina, um agente farmacológico

capaz de aumentar os níveis intracelulares de AMPc e de modular a proliferação de

células retinianas in vitro através, da ativação da PKA (Stork e Schmitt, 2002;

Fogarty et al., 2007).

Culturas de células da retina, obtidas de camundongos P0, foram pré-

incubadas por 30 min com 1µM de H89, um inibidor de PKA. Em seguida, foram

tratadas com forscolina e/ou IL-4, e então mantidas por 3 dias in vitro (DIV). Na

última hora, as culturas foram submetidas ao ensaio de incorporação de [3H]-

timidina. Os resultados demonstram que tanto a IL-4 quanto a forscolina (50µM)

bloquearam em ∼40% a incorporação de [3H]-timidina das células retinianas no

período estudado (Figura 15). O tratamento das culturas com o H-89 bloqueou

completamente o efeito anti-proliferativo da IL-4, assim como aquele induzido pela

forscolina, indicando, assim, que a atividade de PKA está envolvida no efeito anti-

proliferativo da IL-4. Adicionalmente, não foi observado nenhum efeito aditivo

quando tratamos as culturas concomitantemente com IL-4 e forscolina.

Figura 15 – A IL-4 reduz a proliferação de células da retina através da atividade da PKA. Células da retina mantidas em cultura foram pré-incubadas por 30 min com 1µM H89, um inibidor de PKA, e então tratadas com a forscolina e/ou IL-4 e mantidas por 3 dias in vitro. Na última hora as culturas foram submetidas ao ensaio de incorporação de [3H]-timidina. Os valores da [3H]-timidina foram normalizados e expressos como porcentagem em relação ao grupo controle (100% control = 3,820.87 ± 176,32 cpm/mg protein). Os valores estão expressos como média ± SEM de três experimentos independentes feitos em triplicata * p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

5.0 U/mL IL-4 - + - + - + - +

* **

**

50 µM Forscolina - - + + - - + +1 µM H-89 - - - - + + + +

Inco

rpor

ação

de

[H3 ]-T

imid

ina

(% d

o co

ntro

le)

4.2.1 IL-4 AUMENTA OS NÍVEIS INTRACELULARES DE AMPc EM RETINAS P0

A atividade da PKA tem sido relacionada ao processo de interrupção do

estado proliferativo e o inicio da diferenciação em vários tipos celulares, sempre de

modo dependente do aumento nos níveis citoplasmáticos de AMPc (Sherwood et al.,

2000; Stork e Schmitt, 2002; Fogarty et al., 2007). Em nosso resultado anterior, a

ação anti-proliferativa da IL-4 mostrou-se dependente da ativação de PKA, indicando

o envolvimento da IL-4 na produção de AMPc. Assim, explantes de retina de

camundongos P0 foram estimulados, por 30min, com IL-4 (em diferentes

concentrações) ou forscolina (50µM; controle positivo). Os resultados apresentados

na figura 16 mostram que a IL-4 aumenta, de maneira dose-dependente, os níveis

de AMPc intracelular, sendo este aumento na ordem de aproximadamente sete

vezes em relação ao controle. Desta forma, conclui-se que a ativação da PKA pela

IL-4, mimetizada pela forscolina, se dá a partir do aumento nos níveis

citoplasmáticos de AMPc, e que este mecanismo é o iniciador do efeito anti-

proliferativo de IL-4 nas células progenitoras.

Figura 16 – IL-4 aumenta os níveis intracelulares de AMPc. Avaliação dos níveis citoplasmáticos de AMPc. Explantes de retina de camundongo P0 foram tratados com IL-4 (0.1, 0.5, 5.0, 50 U/mL) ou com 50µM de forscolina por 10 min. A seguir o tecido foi processado para a determinação da quantidade de AMPc acumulado citoplasmaticamente. Os valores estão expressos como média ± SEM de quatro experimentos independentes feitos em triplicata * p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).

0

250

500

750

1000

1250

1500

IL-4 (U/mL) - 0.1 0.5 5.0 50 -

***

*

*

Forscolina (µM) - - - - - 50

Acú

mul

o de

AM

Pc In

trac

elul

ar(p

mol

/mg

de p

rote

ína)

4.2.2 IL-4 REGULA A EXPRESSÃO DE CICLINA D1 E DE p27kip1 EM RETINAS P0

A Ciclina D1 é uma importante reguladora positiva do ciclo celular e, além

disso, está altamente expressa no período proliferativo da retina normal de

camundongos (Sicinski et al., 1995). Em contrapartida, a proteína p27Kip1, um inibidor

do ciclo celular encontra-se altamente expressa no período de saída dos

progenitores do ciclo celular, diminuindo drasticamente na retina madura (Levine et

al., 2000). Desta forma, a nossa proposta foi analisar se a regulação da proliferação

celular mediada pela IL-4, quantificada pelo ensaio de incorporação de [3H]-timidina,

estaria relacionada a modulação da expressão de p27kip1 e de ciclina D1. Nossos

dados mostram que retinas P0 tratadas com 5.0 U/mL de IL-4 por diferentes

períodos de tempo (4 ou 8 horas) diminuem a expressão de ciclina D1 e aumentam

a expressão de p27kip1 apenas após as primeiras 8 horas in vitro (figuras 17A-B),

sem que haja qualquer alteração nos níveis de incorporação de timidina (figura 18).

Alterações nos níveis de incorporação de timidina só foram observadas após as

primeiras 12 horas in vitro (dado não mostrado).

Figura 17 – IL-4 reduz a proliferação de precursores retinianos através da modulação da expressão de ciclina D1 e de p27kip1. A, western blot de extratos protéicos obtidos de células da retina de camundongos P0 tratados com 5.0 U/mL de IL-4 por 4 ou 8 horas e depois avaliados com um anticorpo policlonal contra ciclina D1 (painel superior) e então reavaliados com um anticorpo contra p27kip1 (painel do meio) e para a proteína constitutiva Erk2 (painel inferior). B, análise de densidade óptica relativa (densitometria) de três westerns blots diferentes, comparando a o efeito de IL-4 na modulação da expressão de ciclina D1 e de p27kip1 com a expressão normalizada de Erk2. Os valores são expressos como media ± SEM de três experimentos independentes.

Ciclina D1

p27kip1

A

44KDa Erk 2

5.0U/mL IL-4 - + - +

4 h 8 h

CT IL-4 CT IL-40255075

100125150175

*

*

4 horas 8 horas

Ciclina D1 p27kip1

Den

sida

de Ó

ptic

a(%

do

Con

trol

e)

B

Figura 18 – A IL-4 não altera a incorporação de [3H]-timidina nas primeiras 4 e 8 horas in vitro. As culturas foram tratadas com 5.0 U/mL de IL-4 e então mantidas por 4 ou 8 horas em cultura. Na última hora as culturas foram submetidas a ensaio de incorporação de [3H]-timidina. Os valores do ensaio de incorporação [3H]-timidina foram normalizados e expressos como porcentagem do grupo controle (100% controle 4 h = 3,283.62 cpm/mg protein). Os valores são expressos como media ± SEM de três experimentos independentes feitos em triplicata em * p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas). 4.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES EM RETINAS P0

4.3.1 IL-4 AUMENTA A EXPRESSÃO E O NÚMERO DE CÉLULAS CONTENDO

RODOPSINA

A IL-4 tem sido descrita como um potente fator de diferenciação durante o

desenvolvimento das células retinianas (Sholl-Franco et al., 2001a, 2001b, 2002).

Aliado ao seu efeito anti-proliferativo, avaliamos se esta citocina apresentaria efeito

0

25

50

75

100

125

150Controle5.0 U/mL IL-4

4 horas 8 horas

Inco

rpor

ação

de

[3 H]-T

imid

ina

(% d

o C

ontr

ole

de 4

hor

as)

sobre a diferenciação de fotorreceptores do tipo bastonete, a população mais

numerosa a se diferenciar neste estágio de desenvolvimento retiniano in vivo, uma

vez que a localização do IL-4Rα está presente nas células retinianas desde o

primeiro dia pós-natal até o animal adulto (Figura 14).

O número de células positivas para rodopsina (Rho 4D2+) foi avaliado quando

do tratamento com várias concentrações de IL-4 em explantes mantidos por 3 DIV.

As fotomicrografias presentes na figura 19 mostram que a IL-4 aumenta

significantemente o número de células Rho 4D2+ em todas as concentrações

utilizadas (0,5; 5,0; 50 e 100 U/mL). Adicionalmente, a incubação de explantes de

retina com altas concentrações de IL-4, como 50 e 100U/mL (Figura 19 D-E) não

interferiu na estrutura celular retiniana ou no número de núcleos com perfis

picnóticos após coloração com vermelho neutro (dados não mostrados).

A análise quantitativa nesta preparação é dificultada devido a estrutura

compacta dos explantes. Desta forma, optou-se pelo uso de culturas em

monocamada para se quantificar o efeito da IL-4 (Figura 20A-D). Na figura 21

podemos observar que a IL-4 aumenta, de modo dose- e tempo- dependentes, o

número de células Rho 4D2+ (Figuras 21A e 21D, respectivamente), assim como a

expressão de rodopsina (Figura 20E) ao longo do tempo em cultura. Este efeito não

foi reproduzido por outras citocinas, como no caso do tratamento com as IL-2 e IL-8

(Figuras 21 B-C).

Figura 19 – IL-4 aumenta o número de células Rho 4D2+ positivas. Imunohistoquímica para rodopsina (anticorpo Rho 4D2) em seções transversais da retina de camundongos P0 pós-natais mantidos por 3 dias in vitro: A, controle (não estimulado); B, 0,5U/mL; C, 5,0 U/mL; D, 50 U/mL, e E, 100 U/mL de IL-4. Representação esquemática das células retinianas e das camadas estão presentes no topo a esquerda. pc, células fotorreceptoras; nc, células da neuroblástica; mc, célula de Müller; ac, célula amácrina; gc, célula ganglionar; nbl, camada neuroblástica; inl, camada nuclear interna; ipl, camada plexiforma interna; gcl, camada de células ganglionares. Escala no canto inferior correspondente a 50µm.

nbl

ipl

gcgc

ac

mc

nc pc

inl

A B

C D E

Figura 20 – IL-4 aumenta o número de células positivas para Rho 4D2 em culturas de monocamada e aumenta a expressão de rodopsina. Fotomicrografias de células retinianas marcadas para rodopsina (A e C) ou com DAPI (B e D) mantidas por 3 dias in vitro. A e B, controle; C e D tratadas com 5.0 U/mL de IL-4. E, exemplos de western blots de extratos totais de proteína de monocamadas mantidas por 1 ou 3 dias in vitro (DIV) avaliadas com um anticorpo policlonal contra rodopsina (Rho 4D2, painel superior) e então re-avaliados com um anticorpo para a proteína constitutiva Erk2 (painel inferior). Escala no canto inferior correspondente a 20µm.

A B

C D

CT

44

39

KDIL-4 CT IL-4

3 DIV1 DIV

Erk

Rho

E

Figura 21 – A IL-4, mas não a IL-2 e nem a IL-8, aumenta o número de células positivas para Rho 4D2+ de maneira dose e tempo dependente. O número de células Rho 4D2+ cells foi quantificado em culturas de monocamada mantidas por diferentes tempos em cultura. A, B e C Curva dose resposta para IL-4, IL-2 e IL-8, respectivamente. D, Análise temporal para IL-2, IL-4 e IL-8. Os valores são expressos como média ± SEM de cinco experimentos independentes feitos em triplicata. * p < 0.001 vs controle em A, B, C e em D vs respectivos tempos controle em A, B, C.

B

0

50

100

150

200

250

300

IL-4 (U/mL) - 0.1 0.5 1.0 5.0 50

*

*

**

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+

(% d

o C

ontr

ole)

A

0

25

50

75

100

125

150

IL-2 (U/mL) - 0.5 5.0 50 100 200

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+

(% d

o C

ontr

ole)

C

0 1 2 3 40.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

CT 50 U/mL IL-220 ng/mL IL-850 U/mL IL-4

Dias in Vitro

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+ . 1

03 /mm

2

D

0

25

50

75

100

125

150

IL-8 (ng/mL) - 0.2 2.0 20 100 200

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+

(% d

o C

ontr

ole)

4.3.2 O EFEITO DA IL-4 NA DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES É ESPECÍFICO

Diversos fatores de crescimento, como por exemplo o FGFb (Hicks e

Courtois, 1992) e o VEGF (Yourey et al., 2000), são conhecidos reguladores da

proliferação de precursores e diferenciação de fotorreceptores, assim como da

manutenção e sobrevida de células retinianas (Gauthier et al., 2005; Elliot et al.,

2006). Dessa forma, testamos se o efeito da IL-4 na diferenciação de bastonetes

poderia estar sendo mediado por fatores de crescimento liberados na cultura, tais

como o FGFb ou neurotrofinas. Interessantemente, nem a brefeldina-A (BFA), um

inibidor da secreção vesicular de peptídeos, nem o K252a, um inibidor da

sinalização do receptor de neutrofinas, assim como nem anticorpos bloqueadores

para o FGFb (anti-FGFb) bloquearam o efeito diferenciador da IL-4 (tabela 1).

Entretanto, uma redução significante no número de células Rho 4D2+ foi

documentado nas culturas controles, quando estas foram tratadas com BFA (∼52.68

%), K252a (∼49.46 %), ou com anticorpos anti-FGFb (∼69.35 %), indicando assim a

importância da liberação constitutiva desses fatores de crescimento in vitro para a

expressão de rodopsina durante o processo de diferenciação de células fotorrecep-

toras.

Para confirmar o efeito específico da IL-4 na diferenciação de fotorreceptores,

culturas foram incubadas com um anticorpo de bloqueio para a subunidade IL-4Rα

(anti-IL-4Rα). A figura 22 mostra que o tratamento das culturas com concentrações

crescentes deste anticorpo (0,02-2,0 µg/mL), bloqueou em ~ 20% o número de

células Rho 4D2+ nas culturas controle. Adicionalmente, a diluição de 2,0 µg/mL de

anti-IL-4Rα inibiu completamente o efeito estimulatório da IL-4.

Tabela 1 – O efeito da IL–4 na diferenciação de bastonetes é independente daliberação de outros fatores de crescimento na cultura. Controle 5.0 U/mL IL–4 Sem tratamento 100 265.42 ± 16.51* 30 ng/mL BFA 37.32 ± 4.89* 237.76 ± 21.72* 50 nM K252a 50.56 ± 2.45* 278.57 ± 10.05* 100 µM anti-bFGF 30.65 ± 1.65* 235.02 ± 20.51* Número de células Rho 4D2+ em culturas mantidas por 3 dias in vitro (% do controle). Cada valor representa a média ± SEM de três experimentos independentes realizados em quadruplicata. * Significativamente diferente do controle (100%, p<0.001).

Figura 22 – O efeito específico de IL-4 na diferenciação de fotorreceptores. Culturas obtidas de camundongos P0 foram pré-incubadas por 30 minutos com diferentes concentrações do anticorpo policlonal contra IL-4Rα (anti-IL-4Rα) (anticorpo de bloqueio) e então mantidas por 3 dias in vitro. Os valores são expressos como média ± SEM de cinco experimentos independentes feitos em triplicata p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).

0

50

100

150

200

250

300

*

*

- 0.002 0.02 0.2 2.0

*

*Anti-IL-4R (µg/mL)IL-4 + Anti-IL-4R (µg/mL)

****

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+

(% d

o C

ontr

ole)

4.3.3 A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES INDUZIDA POR IL-4 É INDEPENDENTE DO SEU EFEITO ANTI-PROLIFERATIVO

Anteriormente (item 4.2) demonstramos que a ativação da PKA, promovida

pelo aumento nos níveis citoplasmáticos de AMPc, está relacionada ao efeito anti-

proliferativo mediado pala IL-4 (figura 15). De fato, a diferenciação de bastonetes em

nossas preparações poderia estar sendo promovida pela inibição do estado

proliferativo das células precursoras. Assim, buscamos avaliar se o tratamento com

a forscolina seria capaz de aumentar o número de células Rho 4D2+. O resultado

apresentado na figura 23 mostra que o aumento nos níveis citoplasmáticos de

AMPc, assim como a atividade de PKA, não estão relacionados com a diferenciação

de bastonetes mediada pela IL-4 in vitro. O tratamento das culturas com 1µM de

H89, um inibidor específico da atividade de PKA, não alterou o efeito da IL-4 no

número de células Rho 4D2+, embora tenha revertido a ação anti-proliferativa desta

citocina. Assim, estes resultados nos mostram que a via de sinalização AMPc-PKA é

ativada pela IL-4 para reduzir a proliferação de precursores na retina, mas não para

mediar a diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4. Adicionalmente, para

confirmar a desvinculação entre a inibição do estado prolliferativo do processo de

diferenciação induzido pela IL-4, realizamos o co-tratamento das culturas com 20µM

de fluorodeoxiuridina (FDUR), um inibidor de divisão celular. Nossos resultados

(tabela 2) mostram que o efeito da IL-4 não passa simplesmente pela inibição da

divisão celular na cultura.

Figura 23 – A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é independente do seu efeito anti-proliferativo. O número de células positivas para Rho 4D2+ foi quantificado em culturas de monocamada mantidas por 3 dias in vitro. As culturas foram pré-incubadas por 30 min com 1µM de H89, inibidor da atividade da PKA, e então tratadas com a forscolina e/ou com a IL-4. Os valores são expressos como média ± SEM de três experimentos independentes feitos em triplicata * p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).

0

50

100

150

200

250

300

5.0 U/mL IL-4 - + - + - + - +

* **

*

50 µM Forskolin - - + + - - + +1 µM H-89 - - - - + + + +

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+

(% d

o C

ontr

ole)

4.3.4 A ATIVIDADE DAS PROTEÍNAS TIROSINAS CINASES, A FOSFORILAÇÃO

DE ERK E A ATIVIDADE DE PKC ESTÃO RELACIONADAS COM A

DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES INDUZIDA PELA IL-4

A transdução de sinais mediada pelo IL-4R envolve três principais vias de

sinalização conhecidas: JAK-STAT6, Raf-MEK-MAPK e PI3K-Akt (Nelms et al., 1999

para revisão). Desta forma, com a finalidade de caracterizar as vias de sinalização

envolvidas na diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 primeiramente

analisamos o envolvimento da via JAK-STAT, através do pré-tratamento das culturas

com 1 ou 5 nM do inibidor de JAK I, um potente inibidor das proteínas JAKs. Os

nossos resultados (tabela 2) mostram que a via clássica JAK3-STAT6 não está

envolvida no aumento no número de células Rho 4D2+. Ainda na tabela 2 pode-se

analisar que não há o envolvimento das proteínas tirosinas cinases associadas ao

receptor da família das Src (inibidas com 1 µM de PP1), da JNK e p38 MAPK

(inibidas com 20µM de SB239063, 10µM de SB203580 ou 20µM de SP600125) e da

PI3K (inibida com 25 µM de LY294002) no efeito da IL-4.

Tabela 2– O efeito da IL–4 na diferenciação de fotorreceptores é independenteda ativação das vias de JAK, Src, p38 e JNK. Controle 5.0 U/mL IL–4 Sem tratamento 100 254.56 ± 12.34* 20 µM FDUR 110.45 ± 3.45 290.32 ± 22.42* 1 nM JAK inhibitor I 96.45 ± 7.56 256.04 ± 23.81* 5 nM JAK inhibitor I 101.20 ± 3.74 270.93 ± 45.52* 1 µM PP1 105.52 ± 2.50 258.54 ± 18.62* 20 µM SB239063 95.06 ± 3.67 260.30 ± 18.43* 10 µM SB203580 102.45 ± 4.34 255.89 ± 23.03* 20 µM SP600125 105.67 ± 10.34 240.92 ± 16.75* 25 µM LY294002 110.54 ± 9.45 234.59 ± 14.64* Número de células Rho 4D2+ em culturas mantidas por 3 dias in vitro (% do controle). Cada valor representa a média ± SEM de três experimentosindependentes realizados em quadruplicata. * Significativamente diferente do controle (100%, p<0.001).

Na figura 24 podemos observar que 30 µM de genisteína, um inibidor não

específico da atividade tirosina cinase, inibiu totalmente o efeito da IL-4.

Adicionalmente, o tratamento com 1,25 µM de cloreto de queleritrina (ChCl), um

inibidor da atividade de PKC, mostrou que o aumento no número de células Rho

4D2+, induzido pela IL-4, é dependente desta via de sinalização (figura 25). Nossos

dados mostram ainda que o efeito da IL-4 na diferenciação de bastonetes é

dependente de atividade MAPK-Erk. Para se avaliar melhor este envolvimento,

realizamos o pré-tratamento das culturas com 50 µM de PD98059 ou com 20 µM de

U0126, inibidores da atividade da Erk e, em seguida, tratamos com a IL-4. Os

resultados presentes na figura 25 mostram que o número de células Rho 4D2+ tanto

no controle, quanto nas culturas tratadas pela IL-4, depende da atividade de Erk, em

semelhança ao observado para a atividade da PKC.

Figura 24 – A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é dependente da atividade das proteínas tirosina cinase. O número de células Rho 4D2+ foi quantificado em culturas de monocamada mantidas por 3 dias in vitro. As culturas foram pré-incubadas por 30 minutos com 30µM de genisteína, um inibidor das proteínas tirosinas cinases, e então tratadas com IL-4. Os valores estão expressos como média ± SEM de quatro experimentos feitos em triplicata. * p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).

0

50

100

150

200

250

300

5.0 U/mL IL-4 -

*

*

+

*

30 µM genisteina +++- -

-

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+

(% d

o C

ontr

ole)

Figura 25 – A diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 é dependente da atividade de Erk e de PKC. O número de células Rho 4D2+ foi quantificado em culturas de monocamada mantidas por 3 dias in vitro. Culturas foram pré-incubadas por 30 com 1.25 µM de cloreto de queleritrina (ChCl), um inibidor de PKC, 50 µM de PD98059, um inibidor de MAPK, ou 20 µM de U0126, um inibidor de Erk, e então tratadas com IL-4. Os valores estão expressos como média ± SEM de quatro experimentos independentes feitos em triplicata.. * p < 0.001 vs controle (culturas não tratadas).

0

50

100

150

200

250

300

5.0 U/mL IL-4 -

*

*

**

50 µM PD98059

+

20 µM U0126

* * *

1.25 µM ChCl ++ + +

+ ++

+ +

---

---

-

--

--

-

-

----

-

-

--

Núm

ero

de C

élul

as R

ho 4

D2+

(% d

o C

ontr

ole)

Uma vez que a ação da IL-4 mostrou-se dependente da atividade da Erk,

analisou-se, a seguir, o efeito da IL-4 nos níveis intracelulares de Erk1/2 fosforiladas.

Realmente, a IL-4 induz fosforilação de Erk1/2 de modo dose- e tempo-dependentes

em explantes de retina (Figura 26A). Verificamos que as retinas de animais P0,

quando estimuladas por 30 minutos com diferentes concentrações de IL-4 (0,5 U/mL;

5,0 U/mL; 50 U/mL; Figura 26A) apresentam um aumento significativo nos níveis de

fosforilação deste substrato. Adicionalmente, nossos resultados mostram que o

aumento na fosforilação de Erk1/2 obtido pela estimulação com 5,0 U/mL de IL-4 foi

bloqueado pelo pré-tratamento com PD98059, um inibidor da atividade MAPK

(Figura 26B).

Como os dados apresentados até o momento sobre a fosforilação de Erk1/2

referem-se ao tratamento de explantes recém-dissecados e os dados sobre a

diferenciação de bastonetes foram baseados em ensaios de monocamada,

buscamos verificar os níveis de Erk1/2 fosforiladas neste modelo. Outra questão a

ser respondida é como as vias da PKC e da Erk1/2 poderiam estar interagindo para

a produção no efeito observado. Assim, analisou-se a fosforilação de Erk1/2 em

culturas de monocamada estimuladas com IL-4 na presença de 50 µM de PD98059

ou de 1,25 µM de ChCl. Os resultados presentes na figura 26C mostram que o

aumento na fosforilação de Erk1/2, induzida pela manutenção de culturas com 5,0

U/mL de IL-4, por 30 min é dependente da atividade da PKC e de MAPK, sugerindo

assim que a ativação de PKC esteja upstream à fosforilação de Erk1/2, em nossa

preparação.

Figura 26 – A fosforilação de Erk induzida pela IL-4 é dependente da atividade de PKC. Western blot representativos obtidos a partir de extratos proteicos de explantes de retina P0 (A, B) ou de monocamadas mantidas por 4 horas in vitro (C) avaliadas com o uso de um anticorpo contra phospho-Erk1/2 (p-Erk1/2, painéis superiores) e posteriormente re-avaliados para a quantidade total de Erk2 (painéis inferiores). A, tecido incubado por 30 min com diferentes concentrações de IL-4 (0,5; 5,0 ou 50 U/mL) ou com a concentração fixa de 5,0 U/mL IL-4 por diferentes períodos de tempo (5, 15, 30 ou 60 min); B, tecido retiniano foi pré-tratado por 30 min com 50 µM PD98059, um inibidor de MAPK, e depois com ou sem 5,0 U/mL IL-4 por adicionais 30 min. C, monocamadas de células retinianas foram pré-incubadas com 1,25 µM de cloreto de queleritrina (ChCl), um inibidor da PKC, or 50 µM PD98059, um inibidor da MAPK, e depois incubadas por mais 30 min com 0,5 U/mL IL-4.

B

50 µM PD98059 5U/mL IL4 - +

+ + - -

- +

pErk1/2

44KDa Erk 2

5U/mL IL4

50 µM PD98059

-

1.25 µM ChCl

+

+ + +

- - -

- - -

- + +

+ - - -

pErk1/2

44KDa Erk 2

C

pErk1/2

44KDa Erk 2

IL4 (U/mL)

CT 0.5 5.0 50

A

min

0 5 15 30 60

IL4 (5U/mL)

5. DISCUSSÃO

A descrição de diferentes citocinas como importantes mediadores entre

células dos sistemas imune e nervoso permitiu a consolidação de várias linhas de

pesquisa visando a caracterização dos mecanismos de interação entre estes

sistemas e a compreensão dos diferentes eventos-chave observados durante o

desenvolvimento ou quando da presença de quadros traumáticos, inflamatórios ou

degenerativos (Mehler e Kessler, 1997; Dantzer et al., 2000; Dantzer, 2004; Gao e

Miller, 2006; Murphy e Saravanapavan, 2006; Owens et al., 2006).

O papel da IL-4 no SNC e em particular sobre diferentes populações celulares

retinianas tem sido explorado nos últimos anos. Em 2001, Sholl-Franco e

colaboradores (2001a) mostraram que a IL-4 aumenta a sobrevida de células

ganglionares de ratos neonatos axotomizadas durante o desenvolvimento, estudo

que foi ampliado por Koeberle e colaboradores (2004), a partir de experimentos in

vivo utilizando-se da técnica de transferência gênica de IL-4 e o uso de vetores virais

diretamente na retina ou nos colículos superiores. Além disso, esta citocina se

mostrou importante para a diferenciação in vitro de células amácrinas colinérgicas e

GABAérgicas na retina de ratos em desenvolvimento (Sholl-Franco et al., 2001b,

2002). Recentemente, foi demonstrado por Adão-Novaes (2007) que a IL-4 pode

agir sobre outra população retiniana específica, a de fotorreceptores, bloqueando

sua morte em um modelo de indução de morte por tapsigargina (Chiarini et al.,

2003). Este conjunto de dados mostra que vários tipos celulares retinianos são

responsivos a esta citocina, sem, contudo ter sido ainda descrita a presença dos

receptores ou a(s) possível(is) fonte(s) desta citocina no tecido retiniano. Os dados

apresentados nesta dissertação mostram, pela primeira vez, a presença do receptor

de alta afinidade para a IL-4 no tecido retiniano, assim como associa o RPE como

principal fonte fisiológica da IL-4 para o tecido retiniano. Outrossim, caracterizamos

mais dois papéis importantes para esta citocina durante o desenvolvimento pós-natal

na retina de camundongos: (i) a inibição da proliferação de células retinianas; (ii) o

aumento na expressão e no número de células imunorreativas para rodopsina.

5.1 LOCALIZAÇÃO DA IL-4 E DA SUBUNIDADE α DO RECEPTOR DE IL-4 NO TECIDO RETINIANO

A IL-4 pode se associar com dois complexos de receptores diferentes: o tipo I

e o tipo II. A ligação da IL-4 ao IL-4Rα induz a heterodimerização com o IL-2Rγ para

formar o receptor tipo I, enquanto a ligação da IL-4 ao complexo formado pelas

subunidades IL-4Rα e IL-13Rα1 forma o receptor tipo II (Müeller et al., 2002; Kelly-

Welch et al., 2003). A subunidade IL-4Rα é a responsável pela associação direta e

com alta afinidade à molécula de IL-4 (Galizzi et al., 1990; Keegan e Pierce, 1994),

representando a parte funcional do complexo do receptor para as IL-4 e IL-13

(Müeller et al., 2002). Apenas em 2005, foi demonstrada a presença do IL-4Rα no

SNC. Nolan e colaboradores (2005) demonstraram a presença de receptores para

IL-4 em células granulares do giro denteado de ratos. Entretanto, não existem outros

dados consistentes sobre a localização específica do IL-4Rα em células neuronais

e/ou gliais em outras regiões do SNC até o presente momento (Sawada et al., 1993;

Brodie et al., 1998). A expressão constitutiva desta subunidade de receptor no SN é

questionada e a literatura apresenta-se inconsistente, principalmente no que se

refere aos estudos abordando o desenvolvimento. Ao olharmos para as outras

subunidades formadoras dos receptores tipos I ou II para IL-4 a situação fica mais

complicada, uma vez que não existem dados referentes à expressão de IL-13Rα1 e

a expressão constitutiva do RNAm da subunidade de IL-2γc só foi demonstrada em

astrócitos não estimulados in vitro (Pousset et al., 1999), sendo ainda inexistentes

estudos que abordem a expressão desta subunidade em tecidos neurais in vivo.

Assim, registramos aqui a necessidade de ampliar o atual estudo, de forma a

explorar, no tecido retiniano neural e não-neural adjacente, a expressão das

subunidades IL-2γc e IL-13α1, assim como de outras subunidades para receptores

de citocinas.

Quanto ao tecido ocular, Fukuda e colaboradores (2002) demonstraram a

expressão do RNAm para os componentes do receptor tipo I e tipo II de IL-4: IL-

4Rα, IL-2Rγc, IL-13Rα1, e IL-13Rα2 em culturas de fibroblastos da córnea humana.

Adicionalmente, estes mesmos autores mostraram que a expressão das proteínas

IL-4Rα e IL-2Rγc também estavam presentes na superfície dos fibroblastos da

córnea humana. De fato, nestas células a IL-4 pode atuar via ambos os receptores

tipos I e II (Kelly-Welch et al., 2003, 2005). No entanto, não há dados na literatura

sobre a expressão de qualquer um dos receptores para IL-4 no tecido retiniano ou

no tecido não neural adjacente à retina, assim como não há descrição sobre as

populações produtoras desta citocina, apesar de já terem sido descritos vários

papéis para esta citocina sobre populações neuronais retinianas distintas (Sholl-

Franco et al., 2001a, 2001b, 2002; Koeberle et al., 2004).

O conjunto dos resultados apresentados nesta dissertação mostram, pela

primeira vez, a expressão da molécula de IL-4 e da subunidade IL-4Rα na retina de

camundongos. Demonstramos que a IL-4 apresenta-se abundantemente expressa

no RPE, coróide e esclera de camundongos durante a fase inicial do

desenvolvimento pós-natal (P0; Figura 12). Na retina neural, entretanto, a

quantidade de IL-4 presente foi muito baixa (Figura 12) o que levanta a hipótese

desta citocina estar sendo predominantemente secretada pelo RPE nesta idade para

se difundir e atuar sobre as populações celulares retinianas, de modo semelhante ao

já descrito para o FGFb (Hicks e Courtois, 1992; Hicks et al., 1998). Este resultado,

entretanto, não exclui a possibilidade da IL-4 ter uma fonte celular retiniana.

Diferentemente da molécula de IL-4, a subunidade IL-4Rα foi encontrada

abundantemente na retina neural, assim como nos tecidos adjacentes não neurais

(Figura 13). A análise imunohistoquímica da expressão da IL-4Rα mostra que a

proteína está presente em todas as camadas da retina no primeiro dia pós-natal,

embora a marcação seja mais intensa na IPL. Com o decorrer do desenvolvimento,

quando da abertura dos olhos (P14), a marcação para IL-4Rα restringe-se mais aos

segmentos externos dos fotorreceptores. Todavia, pode ainda ser claramente vista

nos corpos celulares de fotorreceptores e nas regiões de contatos sinápticos (IPL e

OPL), indicando um padrão consistente com o de processos das células de Muller.

De fato, o soma das células de Müller está localizado na INL e seus prolongamentos

se estendem por todas as camadas da retina, desde a OL até a OS (Newman e

Reichenbach, 1996). O padrão adulto de expressão para a IL-4Rα mostra uma

restrição quase absoluta aos segmentos internos e externos dos fotorreceptores.

Sendo assim, podemos concluir que o padrão de distribuição da subunidade

IL-4Rα, acoplado aos efeitos da molécula IL-4 sobre o tecido retiniano descrito mais

adiante nesta dissertação, reforçam a proposta de que a IL-4 possa ser uma

importante molécula trófica derivada do RPE durante o desenvolvimento da retina

neural. Baseado no padrão de restrição de expressão do IL-4Rα no adulto, podemos

especular ainda que a IL-4 possa desempenhar um papel relevante na manuntenção

dos segmentos externos de bastonetes, embora outros experimentos precisem ser

desenvolvidos para corroborar tal idéia. Principalmente se levarmos em

consideração os resultados de Adão-Novaes (2007), que mostram ser a IL-4 capaz

de evitar a morte de bastonetes no modelo experimental de indução de morte de

bastonetes por tapsigargina (Chiarini et al., 2003), efeito esse que se mostrou

dependente da produção de AMPc, em animais com idade entre P6-P7.

5.2 IL-4 DIMINUI A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS PROGENITORAS

Nesta dissertação mostramos que a IL-4 aumenta os níveis citoplasmáticos

de AMPc, do mesmo modo que já descrito em outros tipos celulares (Taieb et al.,

1991; Galea et al., 1993) e que este aumento está relacionado à inibição da

proliferação celular na retina. A IL-4 foi descrita inibindo a proliferação de células do

músculo liso vascular (Southgate e Newby, 1990; Oiso et al., 1993; Vadiveloo et al.,

1997) por uma via dependente do aumento de AMPc e outras evidências ainda

reforçam a relação existente entre o aumento nos níveis de AMPc, a inibição da

proliferação e o começo da diferenciação em vários tipos celulares através da

ativação da PKA (Sherwood et al., 2000; Stork e Schmitt, 2002; Fogarty et al., 2007).

Vários podem ser os efeitos mediados após o aumento nos níveis de AMPc

intracelular. Adão-Novaes (2007) mostrou que a ação neuroprotetora da IL-4 no

modelo de morte de fotoreceptores induzida por tapsigargina é dependente da

ativação do sistema AMPc/PKA e, ainda em 1993, Galéa e colaboradores

demonstraram que esta citocina aumenta a adesividade em células endoteliais

através da ativação da via dependente de AMPc.

É sabido que em roedores neonatos a vasta maioria das células proliferantes

eventualmente irão se diferenciar em fotorreceptores tipo bastonetes (Alexiades e

Cepko, 1996). No presente estudo, o aumento de AMPc citoplasmático e a ativação

de PKA reduziu significativamente a proliferação das células progenitoras retinianas.

Esta nossa análise difere daquela obtida em outros tipos celulares, nos quais a

ativação de PKA por AMPc está relacionada tanto na inibição da proliferação quanto

no aumento da diferenciação celular (Stork e Schmitt, 2002), uma vez que o AMPc

não promoveu a diferenciação de bastonetes como uma consequência da saída do

ciclo celular. Realmente, simplesmente bloquear a proliferação in vitro, quer seja

pelo aumento nos níveis de AMPc ou com o uso de um inibidor da divisão celular

(fluorodeoxiuridina, 20µM), não foi eficiente em induzir a diferenciação, por exemplo,

de bastonetes. Entretanto, não podemos afirmar se outros tipos celulares, como as

células horizontais, amácrinas, bipolares ou células de Muller não poderiam estar

sendo estimuladas a se diferenciar in vitro pelo aumento nos níveis de AMPc

induzido pela IL-4, uma vez que neste estágio de diferenciação o comprometimento

celular ainda está sendo estabelecido (Maslim e Stone, 1986; Araki et al., 1988; Holt

et al., 1988; Wetts e Fraser, 1989; Prada et al., 1991; Stiemke e Hollyfield, 1995;

Belecky-Adams et al., 1996; Cepko et al., 1996 Hu e Easter, 1999; Das et al., 2003).

A proliferação e a diferenciação dos progenitores são processos altamente

coordenados e regulados durante o desenvolvimento da retina. O ciclo celular é

precisamente controlado e possui vários pontos de checagem, dentre os quais o

ponto de restrição encontrado na etapa de transição das fases G1 e S tem recebido

maior atenção, pois é neste período que as células progenitoras saem do ciclo

celular para se diferenciarem. A transição da fase G1 para S é controlada por

proteínas chaves da maquinaria do ciclo celular como as ciclinas, CDKs (cinases

dependentes de ciclinas) e inibidores das CDKs (Dyer e Cepko, 2001, para revisão).

A Ciclina D1 é uma proteína chave para o controle da proliferação de RPC, sendo

que estas evidências em retinas de camundongos baseadas em animais knockouts

para ciclina D1, os quais apresentam uma redução considerável no número de

células em todas as camadas da retina neural devido à falha na proliferação dos

progenitores durante o desenvolvimento deste tecido. Nossos resultados mostram

que a IL-4 diminui a expressão desta ciclina, o que previne a entrada das células na

fase S (Resnitzky et al., 1994).

A expressão de p27Kip1 em retinas de camundongos está correlacionada com

a saída do ciclo celular, tendo uma permanência restrita às células de Müller em

retinas de roedores adultos (Levine et al, 2000). Dentro desse contexto, Dyer e

Cepko (2001), demonstraram em retinas de camundongos que a superexpressão de

p27Kip1 permite a saída prematura de progenitores retinianos do ciclo celular,

reforçando a nossa hipótese de que a IL-4 estaria regulando a proliferação de RPC

através da inibição da expressão de ciclina D1 e do aumento na expressão de

p27Kip1.

Em conclusão, podemos dizer que a IL-4 atua, nas céluas precursoras,

ativando a via de sinalização AMPc-PKA e modulando a expressão de duas

proteínas regulatórias chaves do ciclo celular, a ciclina D1 e o p27kip1, de forma a

promover seu efeito anti-proliferativo, como ilustrado no esquema da figura 27.

Figura 27 – Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove seu efeito anti-proliferativo em células da retina de camundongos P0. A IL-4, através do aumento nos níveis citoplasmáticos de AMPc e da ativação da PKA leva a modulação nos níveis de expressão de ciclina D1 e p27kip1, proteínas responsáveis pela diminuição na proliferação.

5.3 IL-4 E A DIFERENCIAÇÃO DE BASTONETES

A IL-4 tem sido descrita como uma citocina de ação pleiotrópica sobre várias

populações celulares em diferentes estágios da diferenciação celular (Banchereau et

al., 1994; Duschl e Sebald, 1996). No SN, em particular, a ação da IL-4 na

diferenciação fenotípica está mais bem descrita nas populações de células gliais,

onde ela é responsável por alterações morfológicas, acompanhadas pela indução da

expressão de GFAP e da enzima glutamina sintetase (Brodie e Goldreich, 1994).

Na retina, a IL-4 está relacionada com a diferenciação colinérgica e

GABAérgica (Sholl-Franco et al., 2001b; 2002), indicando seu importante papel

como molécula neuromoduladora durante o desenvolvimento deste tecido. Além

deste fato, a literatura atual não apresenta dados sobre interleucinas afetando a

proliferação e/ou diferenciação de fotorreceptores (Morrow et al., 1998; Liversey e

Cepko, 2001), pois o mais corrente na literatura é que estes fenômenos são

particularmente dependentes de fatores de crescimento clássicos derivados de

células não-neurais do epitélio pigmentar (Tanihara et al., 1997; Behling et al., 2002).

Alguns fatores já foram descritos como sendo importantes para o desenvolvimento

dos bastonetes, dentre os quais destacamos o bFGF, taurina e laminina-β 2 (Hicks e

Courtois, 1992; Hunter et al., 1992; Altshuler et al., 1993; Libby et al., 1996; Levine et

al., 1997). Ao contrário, o CNTF e o LIF apresentam papel inibitório sobre a

diferenciação de fotorreceptores de roedores, fazendo com que as células

destinadas a se tornar bastonetes passem a apresentar fenótipo de neurônios

bipolares (Ezzeddine et al.,1997). O GDNF também já foi descrito regulando o

desenvolvimento de fotorreceptores in vitro (Rothermel e Layer, 2003), onde,

dependendo do estágio de desenvolvimento pode influenciar a proliferação,

diferenciação e sobrevida dos bastonetes. Em adição, proteínas indian e sonic

hedgehog promovem a diferenciação de bastonetes a partir de RPC mantidos em

cultura (Levine et al., 1997).

Nesta dissertação mostramos que a IL-4 possui um efeito anti-proliferativo em

células progenitoras retinianas. Sabe-se que em roedores neonatos a vasta maioria

das células proliferantes irá se diferenciar em fotorreceptores tipo bastonetes

(Alexiades e Cepko, 1996). Dentro desse contexto, verificamos se esta citocina

apresentaria efeito sobre a diferenciação de fotorreceptores do tipo bastonete, a

população mais numerosa a se diferenciar neste estágio de desenvolvimento

retiniano in vivo (Morrow et al., 1998). O propósito desta busca foi ainda mais

estimulado por nossos resultados obtidos sobre o padrão temporal de localização de

IL-4Rα, que por sua vez indicava nitidamente justamente esta população de células

fotorreceptoras como possíveis alvos desde o primeiro dia pós-natal até o animal

adulto (figura 14).

Nossos dados mostram claramente que em explantes da retina a IL-4

aumenta significantemente o número de células Rho 4D2+. Demonstramos que a IL-

4 aumenta, de modo dose- e tempo- dependentes, o número de células Rho 4D2+

em explantes ou em monocamadas. O efeito da IL-4 de aumentar a diferenciação de

bastonetes não foi mimetizado por IL-2 e nem por IL-8 (figura 21 B-C) o que de certa

forma é interessante porque tanto a IL-2 quanto a IL-8 são importantes reguladores

funcionais no SNC (Jiang e Lu, 1998; .Kadi et al., 2006). A IL-2 apresenta uma série

de ações sobre células neuronais, assim como muitas semelhanças quando

comparamos suas ações com as da IL-4 no tecido retiniano. Sholl-Franco e

colaboradores (2001a) demonstraram que ambas as citocinas apresentam efeito

neuroprotetor sobre células ganglionares da retina submetidas à axotomia.

Entretanto, embora o efeito da IL-2 pareça ser direto sobre as células ganglionares,

a ação de IL-4 mostrou-se dependente da proliferação celular e da ativação

colinérgica. A resposta de células retinianas à IL-2 indica a existência da subunidade

IL-2Rγ, embora ainda não se tenha descrição na literatura sobre a expressão desta

molécula ou do seu receptor no tecido ocular, como já demonstrado para a IL-8, em

retina embrionária humana (Juul e Dame, 2000).

Diversas citocinas, assim como seus receptores encontram-se expressos na

retina neural e no RPE, de forma a desempenhar papéis importantes no

desenvolvimento retiniano quando liberados em quantidades e em tempos definidos

(Tanihara et al., 1997; Aymerich et al., 2001; Cao et al., 2001; Machida et al., 2001;

Behlinget al., 2002). Além disso, vários autores já demonstraram que as células do

RPE mantidas em cultura são eficientes fontes de citocinas, onde podemos destacar

aqui algumas delas: FGFb, EGF, NGF e BDNF (Schweigerer et al., 1987;

Chakrabarti et al., 1990; Bost et al., 1992; Campochiaro, 1993; Cao et al., 1995;

Campochiaro et al., 1996; Ishida et al., 1997). Desta forma, o uso de da brefeldina

como potente inibidor da secreção vesicular de peptídeos (Fujiwara et al., 1988) do

K252a como inibidor da ativação de receptores neurotrofinas (Hazari et al., 2007) e

de anticorpos de bloqueio para o FGFb auxiliou na tentativa de mostrar um efeito

direto da IL-4 sobre a população a se diferenciar e a expressar rodopsina. É

interessante salientarmos que a diferenciação de células Rho 4D2+ nas culturas

controle foi drasticamente inibida quando do uso destes agentes, o que corrobora a

importância da secreção in vitro de fatores (citocinas) pelas células retinianas no

controle da diferenciação de bastonetes, como já descrito na literatura (Hicks e

Courtois, 1992; Yourey et al., 2000),

Nossos dados mostram que a via clássica JAK-STAT6, envolvida em diversos

eventos de diferenciação celular induzidos pela IL-4 (Nelms et al., 1999, para

revisão), não medeia a diferenciação de fotorreceptores induzida pela IL-4 (tabela 2).

Vale citar que esta via de sinalização é comum a outras citocinas tais como a

INFα/β, IL-3, IL-13 e o PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas) (Patel et

al., 1996) o que sugere o envolvimento de outras vias transducionais e fatores

transcripcionais. Realmente, embora o sítio de ligação da STAT6 presente no

receptor seja suficiente para mediar a indução de certos genes pela IL-4 (Kraus et

al., 2001), muitos estudos recentes demonstraram que a STAT6 não é a única

transdutora de sinais e que a sinalização de IL-4 envolve várias vias que são

específicas para cada tipo de receptor, célula e espécie estudada (Finney et

al.,1990; Nelms et al., 1999; Doucet et al., 2000; David et al., 2001).

A transdução de sinal de IL-4R através das vias de sinalização Raf-MEK-

MAPK e PI3K-Akt (Nelms et al., 1999, para revisão) são bem conhecidas por sua

contribuição nos processos de regulação da proliferação e da sobrevida celulares.

Entre as outras possíveis vias de sinalização testadas, a atividade das proteínas

tirosinas cinases e a fosforilação de Erk, mas não a atividade específica das vias

mediadas pelas p38, JNK, Src cinases ou PI3K foi relacionada ao processo de

diferenciação de bastonetes induzida pela IL-4 (tabela 2; figuras 24, 25 e 26).

A ativação de PKC também tem sido implicada na regulação de diversos

genes alvos pela IL-4 (Ikizawa et al., 1996; Shubinsky e Schlesinger, 1996;

Yanagihara et al., 1997) e nossos resultados corroboram isso, uma vez que

demonstramos que tanto a diferenciação de bastonetes quanto a ativação de Erk1/2

induzidas pela IL-4 foram bloqueadas quando da inibição de PKC. Isso sugere a

existência de uma cascata seqüencial de sinalização entre a PKC e a Erk cinase

(figura 28), a qual já foi descrita como relacionada ao processo de diferenciação de

vários tipos celulares (Suzuki et al., 2002; Kim et al., 2005, 2007), inclusive na retina

(Ojima et al., 2006) reforçando a existência de mecanismos adicionais de interação

entre as vias transducionais ativadas pela IL-4 na retina.

Desta forma, nossos resultados demonstram, pela primeira vez, que a IL-4 é

capaz de induzir a expressão de rodopsina por células retinianas, como um indicador

da diferenciação de bastonetes. Um ponto chave a ser destacado neste trabalho é o

da integração dos eventos de sinalização intracellular disparados pelo IL-4R em

células progenitoras e nas células pós-mitóticas, o que contribuiu para o controle in

vitro da proliferação das PCRs e a diferenciação de bastonetes na retina de

camundongos em um estágio precoce do desenvolvimento pós-natal. Estudos

adicionais são necessários para que possamos analizar o papel da IL-4 endógena

no balanço entre a gênese dos tipos celulares e sua correta diferenciação durante o

desenvolvimento retiniano in vivo, assim como para avaliar a ação da IL-4 sobre

fatores de transcrição envolvidos com a deferenciação celular na retina.

Figura 28 – Esquema do mecanismo pelo qual a IL-4 promove a diferenciação de bastonetes em células da retina de camundongos P0. A IL-4, através da ativação da PKC promove a fosforilação da via da ERK, levando a um aumento na expressão de rodopsina.

???

6 CONCLUSÕES

A partir dos resultados aqui apresentados podemos concluir que:

• A IL-4 é pouco expressa na retina neural e muito no tecido ocular adjacente

não neural (células do RPE, coróide e esclera) em animais P0.

• A IL-4Rα é expressa abundantemente na retina neural e no tecido ocular

adjacente não neural (células do RPE, coróide e esclera) em animais P0.

Além disso, esta subunidade de receptor apresenta um padrão temporal

diferenciado de expressão, conforme o estágio do desenvolvimento retiniano

pós-natal.

• P0: NBL, GCL e IPL. • P14: OS, ONL, OPL, IPL • P60: OS, OPL.

• Quanto ao efeito anti-proliferativo in vitro, a IL-4:

• Aumenta (∼7x) os níveis de AMPc e reduz a proliferação de células da retina através da via AMPc-PKA.

• Modula a expressão de ciclina D1 e de p27kip1.

• Quanto à diferenciação de bastonetes in vitro, a IL-4:

• Aumenta a expressão de rodopsina e o número de células Rho 4D2+ de modo dose- e tempo-dependentes.

• Apresenta efeito específico e independente da liberação de outros fatores de crescimento na cultura.

• Apresenta ação independente do seu efeito anti-proliferativo e da ativação das vias de JAK, Src, p38 e JNK e dependente da atividade das proteínas tirosina cinase, Erk e PKC.

• Aumenta os níveis de fosforilação de Erk, de modo dependente da atividade de PKC.

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO I

Manuscrito intitulado “Interleukin-4 blocks proliferation of retinal progenitor

cells and increases rod photoreceptor differentiation through distinct

signalling pathways”

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