Análise de QTL associados com a qualidade de sementes

Uma abordagem rápida sobre o que foi apresentado no curso e sua relação com os trabalhos desenvolvidos no LBBB

Baseado em: 27/04/2012 – Quinta–feiraAnálise de QTL associados com a qualidade de sementes Prof. Dr. Henk W. W. Hilhorst

Apresentado por:

Dr. Guilherme Araújo Lacerda

Salvador – BA, 18 de maio de 2012

A qualidade das sementes é um conjunto de características complexas

Potencial de GerminaçãoGerminação sob condições normais

Germinação sob estresse osmótico

Germinação sob estresse salino

Germinação sob estresse térmico

Germinação sob estresse oxidativo

Dormência (pós-maturação vs. sementes frescas)

Logenvidade da semente

Germinação após deteriorização controlada

Germinação após o envelhecimento

Reserva nutricional

Tamanho e massa da semente

Arquitetura do embrião

Morfologia da plântulaPlântulas normais

Tamanho da parte aérea

Tamanho da raíz

Tamanho do hipocótilo

Raio de crescimento radicular

Arquitetura da raíz

Plantas utilizáveis

Plântulas de mamoneira

Gaspar-Oliveira et al (2010)

Gaspar-Oliveira et al (2010)

A qualidade da sementes é um conjunto de características complexas e poligências.

Abordagem integradaParâmetros fisiológicos (fenotipagem)

Herança genética e interação entre loci

Expressão genética (transcriptômicas)

Metabólitos e perfil hormonal (metabolômica)

Estudos usando sementes de Arabidopsis, Tomate e Alface

Plântulas de mamoneira

http://indocorporation.en.nobodybuy.com/pid753607/premium-jatropha-curcas-seeds-10-tons-av.htm

Lactuca sativa L. – arquivo pessoal

Como podemos encontrar o(s) gene(s) relacionado(s) a uma determinada característica?

Cromossomometafásico

Armação condensada –cromatina associada

Intérfase:Armação extendida –cromatina associada

Armação do cromossomo

Fibras de cromatina são compactadas em nucleossomos

“Contas de um colar” formam a cromatina

Região curta do DNA dupla hélice

“Conceito é melhor que definição, pois esta necessita ser absoluta”

João Nakagawa (2012)João Nakagawa (2012)

O conceito de gene

Um gene é visto como uma unidade física do cromossomo, relacionada a uma função específica, como a síntese de uma proteína.

“We’ve come to therealization that thegenome is full ofoverlapping transcripts.”— Phillip Kapranov

“Nós chegamos à conclusão de que o genoma está cheio de transcritos sobrepostos.” — Phillip Kapranov

Números cromossômicos importantes:

• As análises dos genótipos cultivados e silvestres de mamoneira Mirante e IAC-80 revelaram metáfases com 20 cromossomos (2n=20), todos metacêntricos (Barbosa et al. 2010).

• A espécie Jatropha curcas é uma espécie diplóide com 2n=22 cromossomos (NUNES, 2007).

O conceito de QTL (quantitative trait locus)

Versão - locus de característica quantitativa

A análise por QTL revela em qual cromossomo se encontra o gene e o nível de expressão relativa deste com sua interação com outros genes.

Adaptado de Hilhorst (2012)

Conceito de Análise de QTLs

É um método estatístico que conecta dois tipos de informação – dados fenotípicos (caracteres mensuráveis) e dados genotípicos (usualmente marcadores moleculares).

Miles e Wayne (2008)

Parentais

F1

F2

F2:3

⊗

⊗

×

A B

RC1, RIL , DHL Campo

PopulaçãoMAPEAMENTO DE QTLs

Dos QTLs para o genes

O mapa de QTL representa uma centana de genes. Então, como encontrar um único gene responsável por certa característica?

Abordagem clássica:Comfimação QTLs por novas linhagens isogênicas + subsequente mapeamento refinado;Novas Linhagens Isogênicas (NILs);Famílias endogâmicas heterogêneas (HIFs);Etc.

ISSO PODE LEVAR ANOS!

Figura 1. Desenvolvimento de linhagem F6 de mamona porte baixo com baixa concentração de toxinas.

Auld et al (2001)

NOVA ABORDAGEMConectando a variação genômica com o fenótipo e performance

VARIAÇÃO GENÉTICA

SNPs deletados, outros marcadores

PERFIS

TranscritosProteínas

Metabólitos

Interações

Performance dosFENÓTIPOS

Fenótipo PHT[cM]

210 190 203 159 206 . . 171

Marcadores # 1 2 3 4 5 .. M 1 B B H H A .. A 2 H A H A A .. H 3 B B H H H .. A 4 H H B B B .. H 5 H B H H A .. B . . . . . . . . . . . . . . . . N A H H H A .. A

Laboratório

Cromossoma 1

LOD score PHT

Análises

Parentais

F1

F2

F2:3

⊗

⊗

×

A B

RC1, RIL, DHLCampo

PopulaçãoMAPEAMENTO DE QTLs

Como a análise de QTL é conduzida?

A análise de QTL requer 2 ítens:

(3)Necessita-se de 2 ou mais variedades de organismos com diferenças genéticas considerando-se a característica de interesse;

(5)Requere-se marcadores genéticos que distinguem as linhagens parentais.

Miles e Wayne (2008)

Um comportamento normal exibe um padrão de expressão diferente de um controle.

O uso de microarrays permite conhecer que genes são usados (e com que intensidade) em uma infinidade de situações.

A análise da expressão de genes pode fornecer informações importantes sobre as funções da célula.

Microarray - compara expressão de genes

Arranjos (arrays), que contêm um grande número de genes distribuídos de forma ordenada sobre placas de vidro.

www.microarrays.med.uu.nl/pix/spotter1.jpg

Fundamentos:O princípio da técnica de microarray se baseia na habilidade da molécula de mRNA se ligar, ou hibridizar, ao DNA molde do qual foi originado.

http://www.imtek.de/anwendungen/content/workinggroups/topspotmikroarrayer/Microarray_Illustration_Kopplung.gif

Moléculas de mRNA são utilizadas como moldes para a sintese de cDNA marcadas com rótulos fluorescentes verdes Cy3 (Cianina 3).

Da mesma forma, as moléculas de mRNA da célula controle são separadas e transcritas, marcadas com tótulos vermelhos Cy5 (cianina 5).

Análise de expressão gênica usando microarray.

Duggan et al., 1999

Clones DNA Teste Referência

TranscriçãoReversa

Sondas com fluoroforos

Purificação eamplificação por PCR

Impressãorobótica

Alvos hibridizados para o microarranjo

Laser 1 Laser 2

excitação

emissão

Análise computacional

Fig. 1 Sensibilidade de germinação de sementes de Lactuca sativa cv. Salinas(Sal, círculos) e L. serriola UC96US23 (UC, triângulos) à temperaturae priming (não tratados, símbolos fechados; condicionadas, símbolos abertos).Sementes (25 em cada uma das duas repetições) foram embebidas em placas de Petri em cada temperatura e a emergência radícula foi observada 72 h após plantio.

Fig. 2 Respostas de temperaturade germinação do controle (a)e osmocondicionadas (b) as sementes de 89linhagens recombinantes (RILs)em 27-35 ºC. Duas réplicas de25 sementes foram testadas acada temperatura sobre uma mesa gradiente, a emergência da radículafoi observada 48 h após o plantio.Em ambos os painéis, RILs são classificados a fim de aumentar seupercentual de germinação dassementes ativadas no máximode temperatura à qual agerminação ocorreu.

LsNECD4 codifica para NINE-CIS_EPOXYCAROTENOID DIOXYGENASE 4uma enzima chave na síntese de ABA

LsGA3ox1 codifica para GA 3-ß-HYDROXYLASEregula a síntese de GA pela luz em alface

LsACS1 codifica para 1-aminocyclopropane carboxylate (ACC)uma enzima catalítica na biossintese de etileno

Confirmação do QTL por fenotipagem de uma nova linhagem isogênica com o alelo Htg6.1 a partir

de ambas variedades Salinas e UC96US23

Um QTL (Ht6.1) de efeito do priming mensurado a 35º C em 43cM colocado com LsNCED4 a 43.5 cM

Confirmado futuramente em mapa refinado (intevalo de < 1 cM)

Salinas

UC96US23

Inibição em alta temperatura

LsNCED4

ABA

Priming ou Htg6.1 alelo UCLsGA3ox1

LsACS1Luz

GAetileno

Germinação

Schwember e Bradford (2010)

Contato:guilhermebiologia@yahoo.com.br

Pós-doutorando do Programa de Pós-graduação

Bolsista do Programa Nacional de Pós-doutorado (PNPD)