APLICAÇÃO DE CÉLULAS RECOMBINANTES DA LEVEDURA · 4.3- Diminuição da atividade da enzima...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Centro de Ciências Biológicas

Doutorado em Ciências Biológicas

CLÁUDIO GALVÃO DE SOUZA JÚNIOR

Tese de Doutorado

APLICAÇÃO DE CÉLULAS RECOMBINANTES DA LEVEDURA

Kluyveromyces marxianus EM SORO DE QUEIJO

RECIFE 2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Centro de Ciências Biológicas

Doutorado em Ciências Biológicas


Tese de Doutorado



Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Pernambuco como

parte dos requisitos para obtenção do grau de

Doutor na área de concentração em Genética.

Orientador: Dr. Marcos Antônio Morais Júnior

Recife 2004




BANCA EXAMINADORA

Prof. Marcos Antônio de Morais Júnior (Orientador) Doutor em Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Profª. Elza Áurea de Luna Alves Lima

Doutora em Ciências Biológicas pela Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prof. Diogo Ardaillon Simões

Doutor em Microbiologia e Biotecnologia pelo Instituto Nacional de Ciências Aplicadas de

Toulouse, França.

Profª. Alexandra Amorim Salgueiro

Ph.D. em Microbiologia Aplicada pela Universidade de St. Andrews, Escócia.

Prof. Marco Antonio Zachia Ayub

Ph.D. em Biotecnologia pela Universidade de Manchester, Inglaterra.

Tese defendida no Auditório Professor Marcionilo de Barros Lins do Departamento de Bioquímica – UFPE, em 18 de junho de 2004

Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes de K. marxianus... ii

SUMÁRIO

Pág

LISTA DE FIGURAS iii

LISTA DE TABELAS iv

RESUMO 05

ABSTRACT 06

1- INTRODUÇÃO 07

2- REVISÃO DA LITERATURA 10

2.1. Potencial biotecnológico das leveduras 11

2.2. Genética de leveduras 12

2.3. Expressão heteróloga em leveduras 14

2.4. A levedura Kluyveromyces marxianus 17

2.5. Vetores plasmidiais 20

2.5.1- K. marxianus transformada com o vetor plasmidial pDblet 24

2.6. K. marxianus em lactose 26

2.7. Soro-de-queijo 28

3- MATERIAL E MÉTODOS 31

4- ARTIGOS 42

4.1- Método simples e rápido de transformação por acetato de lítio de células da

levedura Kluyveromyces marxianus

43

4.2- Utilização do soro de queijo como meio de crescimento alternativo para linhagens

recombinantes de Kluyveromyces marxianus

47

4.3- Diminuição da atividade da enzima β-galactosidase em Kluyveromyces marxianus

CBS 6556 por altas concentrações de galactose

53

5- OUTROS RESULTADOS 59

5.1- Parâmetros fermentativos das células recombinantes 60

6 - CONCLUSÕES 67

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69

Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes de K. marxianus... iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 12. Estabilidade plasmidial dos vetores pDblet e pDαAmy em células de K. marxianus

cultivadas em soro de queijo...........................................................................................

65

Figura 13. Atividade β-gal nos cultivos em soro de queijo das linhagens selvagem CBS 6556 (■)

e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus......................

66

Pág

Figura 1. Desenho esquemático do mapa físico do vetor pDblet..................................................... 26

Figura 2. Hidrólise da molécula de lactose resultando em uma molécula de galactose e outra de

Glicose...............................................................................................................................

27

Figura 3. Desenho esquemático da construção do vetor pDαAmy pela inserção do gene STA 1 no

vetor pDblet.......................................................................................................................

36

Figura 4. Gel de agarose contendo os vetores estudados e seus fragmentos inseridos.................... 37

Figura 5. Desenho esquemático da construção do vetor pDKan pela substituição do inserto URA4

pelo fragmento Kanr (2,6 Kb) + URA3 (1,1 Kb)..............................................................

38

Figura 6. Desenho esquemático da construção do vetor pDHLZ pela substituição do inserto Kanr

do vetor pDKan pelo fragmento HLZ de 1,8 Kb..............................................................

39

Figura 7. Biomassa produzida pelo cultivo em soro de queijo das linhagens selvagem CBS 6556

( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus.................

63

Figura 8. Curva de crescimento das linhagens selvagem CBS6556 ( ) e recombinantes KMDB-1

(▲) e KαAMY (•) da levedura K. marxianus em soro de queijo.....................................

63

Figura 9. Consumo de proteína extracelular do soro de queijo entre as linhagens selvagem CBS

6556 ( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (∆) da levedura K. marxianus.Os

resultados representam valores médios de experimentos em triplicata sob condições de

cultivo descritas no tópico 6.2.1.......................................................................................

64

Figura 10. Consumo de lactose do soro de queijo entre as linhagens selvagem CBS 6556 (■) e das

linhagens recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus.........

64

Figura 11. Variação do pH do soro de queijo durante o cultivo das linhagens selvagem CBS 6556

(∆)e recombinantes KMDB-1 (●) e KαAMY (□) da levedura K. marxianus ................

65

Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes de K. marxianus... iv

Figura 14. Atividade proteásica extracelular nos cultivos em soro de queijo em linhagens

selvagem CBS6556 (◊) e recombinantes KMDB-1 (▲) e KαAMY ( ) da levedura K.

marxianus. Os resultados representam valores médios de experimentos em triplicata

sob condições de cultivo descritas no tópico 6.2.1 ........................................................

66

LISTA DE TABELAS

Pág

Tabela 1. Quadro comparativo da capacidade de utilização de diferentes de fontes carbono entre

duas espécies de Kluyveromyces e Saccharomyces ........................................................

17

Tabela 2. Estudo comparativo entre recombinantes das leveduras Saccharomyces cerevisiae

(MM10-2a) e Kluyveromyces marxianus (KMS2) portadores dos vetores epissomais

pE1 e pDblet em células ..................................................................................................

25

Tabela 3. Composição padrão do soro de queijo fresco................................................................... 29

Souza Jr., C.G. Aplicação de células recombinantes da levedura K. marxianus 5

RESUMO

A levedura Kluyveromyces marxianus Hansen tem sido apontada como

sistema biológico para estudos genéticos e biotecnológicos baseado nas suas

vantagens fisiológicas e bioquímicas. Contudo, a ausência de plasmídios

naturais e o pouco conhecimento sobre sua genética e comportamento têm sido

os principais entraves para estudos mais aplicados. Sua capacidade de utilizar

lactose como fonte de carbono possibilita o uso do soro de queijo, atualmente

um importante poluente da indústria de laticínios, como matéria-prima para

outros processos industriais. Buscou-se, portanto, construir vetores plasmidiais

eficientes e compatíveis com a levedura K. marxianus para avaliar a

capacidade de linhagens recombinantes utilizarem o soro de queijo como meio

de crescimento de baixo custo no processo de expressão de genes de interesse

industrial, tais como enzimas extracelulares ou peptídeos antimicrobianos. Este

trabalho permitiu verificar que: um método simples e rápido de transformação

mediado por acetato de lítio permitiu um aumento da eficiência de

transformação de células de K. marxianus em 2,5 vezes em relação ao método

convencional; o crescimento de células de leveduras recombinantes

transformadas com pDblet ou seus derivados não foi afetado pela alta

concentração de lactose no soro de queijo, apresentando perfil de crescimento

similar ao de células parentais. Esses dados sugerem a possibilidade do uso de

linhagens recombinantes de Kluyveromyces marxianus portadoras de

plasmídios baseados no pDblet para processos biotecnológicos a partir do soro

de queijo advindo das indústrias de laticínios.

Palavras chave: Kluyveromyces marxianus; soro de queijo; vetores

plasmidiais, leveduras recombinantes; parâmetros fermentativos.


ABSTRACT

The yeast Kluyveromyces marxianus Hansen has been pointed as a biological

system tool for biotechnological and genetic purposes, due its physiologic and

biochemical features. However, the absence of natural plasmids and the little

knowledge about its physiological behavior has been the main constrains for

advanced studies. K. marxianus ability to utilize lactose as carbon source

allows it to use cheese whey, an important by-product of the cheese making

industry, for potential value-added product formation. Therefore, compatible

and efficient cloning vectors were constructed for K. marxianus aiming to

evaluate the recombinant strains ability for cheese whey utilization, as an

alternative inexpensive growth substrate. It should be used for the expression

of gene of industrial interest, such as extra cellular enzymes or anti-microbial

peptides. The main results of this study show a rapid and simple LiAc-

mediated transformation procedure to produce K. marxianus transformants

with an efficiency of 2.5-folds higher than basic method. Growth of

recombinant yeast cells transformed with pDblet or its derivatives was not

affected by high lactose concentration in the cheese whey, presenting

fermentative profile similar to parental cells. These data suggest the use of

recombinant plasmid bearing strains of Kluyveromyces marxianus to further

process cheese whey from cheese making industry.

Key-words: Kluyveromyces marxianus; cheese whey; plasmidial vector,

recombinant yeast; fermentation parameters.

Endereço eletrônico do autor:

[email protected]


_______________________________________________1. INTRODUÇÃO


Entre os seres eucariontes, as leveduras têm sido os organismos mais

utilizados em genética molecular por aliar características vantajosas similares

às dos seres procariontes (unicelulares, com genomas pequenos e alta taxa de

crescimento) e de seres eucariontes (apresentam todo um sistema genético,

bioquímico e fisiológico deste grupo), o que possibilita estudar as funções

celulares de eucariontes, como expressão gênica e excreção protéica.

Saccharomyces cerevisiae é a levedura melhor estudada, devido à

aplicação e ao conhecimento acumulado na preparação de vinhos e cerveja e

na fabricação do pão, atividades conhecidamente milenares da civilização. A

aplicação desta levedura se estendeu para a moderna biotecnologia como

resultado do advento da tecnologia do DNA recombinante. Porém, existe um

grande número de espécies de leveduras, que, em sua maioria, são pouco ou

nada estudadas, mas que podem reunir melhores condições de uso específico

para determinados objetivos da biotecnologia.

A levedura Kluyveromyces marxianus é uma espécie industrialmente

mais atrativa quando comparada à S. cerevisiae e demais leveduras, devido às

suas características fisiológicas. Os conhecimentos adquiridos na utilização

industrial desta espécie de levedura na produção de biomassa alimentar,

inulinase e pectinase, bem como a sua maior capacidade de excreção protéica

em relação a Saccharomyces, fazem dela uma excelente candidata à produção

de proteínas heterólogas de interesse industrial. Notavelmente, a capacidade

desta levedura de consumir lactose possibilita a utilização de substratos como

o soro de queijo, um resíduo da industria de laticínios, responsável por

problemas de poluição de mananciais hídricos em todo o planeta pelo seu

descarte descontrolado.

Apesar de se tratar de um organismo não patogênico de uso seguro e alto

potencial industrial, K. marxianus não tem sido utilizada como hospedeira em


experimentos de clonagem gênica devido ao pouco conhecimento de seus

mecanismos genéticos e à falta de plasmídios endógenos que possibilitem a

construção de vetores de expressão. Portanto, o estabelecimento de um sistema

genético baseado em uma linhagem de K. marxianus portadora de um vetor

plasmidial de alta estabilidade e capaz de utilizar o soro de queijo como

substrato para a produção de biomassa alimentar e proteínas de interesse será

uma importante contribuição para o progresso da utilização industrial desta

levedura e um passo no avanço da biotecnologia microbiana.

OBJETIVOS:

• Geral:

Avaliar a capacidade do soro de queijo de ser usado como meio de crescimento de

baixo custo para linhagens recombinantes da levedura Kluyveromyces marxianus para

permitir a utilização deste importante dejeto industrial no processo de clonagem e expressão

de genes homólogos e heterólogos.

• Específicos:

1. Avaliar a influência da alta concentração de lactose do soro sobre o crescimento

celular e produção enzimática das linhagens estudadas;

2. Construir as linhagens recombinantes das células de K. marxianus com plasmídios

pDblet (linhagem KMDB-1) e pDαAmy (linhagem KMDα);

3. Avaliar o perfil de crescimento das linhagens recipiente e transformadas de

Kluyveromyces marxianus utilizando o soro de queijo como substrato para o cultivo;


__________________________________2. REVISÃO DA LITERATURA


2.1. Potencial Biotecnológico das Leveduras

As leveduras são microrganismos eucariontes, sapróbios ou parasitas,

dependentes de carbono orgânico como fonte de energia. São naturalmente

encontradas associadas a vegetais, insetos, húmus ou qualquer outro substrato

fornecedor de açúcar (Phaff, 1990). Seus diferentes habitats e características

diferenciadas de crescimento como baixo pH, onde apenas poucos

microrganismos podem se desenvolver, facilitam seu isolamento e manutenção

em laboratório (Phaff e Stamer, 1987).

Dentre as diferentes áreas de aplicação da biotecnologia de leveduras

pode-se citar a indústria de fermentação (vinhos, cerveja, pão e bioetanol), a

indústria química (enzimas, pigmentos, acidulantes de alimentos e redutores

químicos), a indústria farmacêutica (vacinas, probióticos, hormônios e fatores

sangüíneos), pesquisas biomédicas (metabolismo de drogas, doenças genéticas

humanas, câncer e AIDS), tecnologia ambiental (biorremediação, utilização de

subprodutos industriais, controle biológico e bioabsorção de metais) e as

pesquisas fundamentais (biologia celular e molecular, bioquímica e genética)

(Walker, 1998).

Com o advento da tecnologia do DNA recombinante novas aplicações

têm surgido para as leveduras além da tradicional importância na fermentação

de alimentos e bebidas. As leveduras geneticamente manipuladas têm sido

estudadas visando a produção de diversos agentes biofarmacêuticos para

prevenção e tratamento de doenças humanas (Walker, 1998). Particularmente,

os estudos de leveduras têm contribuído para a bioquímica, atuando na

elucidação da glicólise e natureza e função de enzimas (respiração, proteólise,

etc.), para a citologia, no que diz respeito ao mecanismo de mitose e meiose, a

biogênese de organelas e elucidação de rotas secretoras de proteínas, e para a

genética e biologia molecular, nos estudos de acasalamento celular, estrutura


de genomas e ácidos nucléicos, mecanismos de recombinação e reparação de

DNA, controle da expressão gênica, mapeamento e sequenciamento gênico,

controle do ciclo celular e funções dos oncogenes (Castilho-Valavicius et al.,

1992; Walker, 1998).

2.2. Genética de leveduras

As leveduras possuem genoma pequeno, não maior do que 15.000 kb e

com poucos íntrons e seqüências repetidas. Possuem cromossomos lineares e

de diferentes tamanhos, formados por cadeias de dupla fita de DNA associadas

às histonas H2, H3 e H4. Em função de não apresentarem a histona H1,

provavelmente formam nucleossomos com empacotamento menos denso do

que os de eucariontes superiores. Todo material genético se encontra

compartimentalizado em um núcleo bem definido, e dessa forma todo o

mecanismo transcricional e traducional, assim como a regulação da expressão

gênica é própria de organismos eucariontes (Perez-Ortin et al., 1989).

Dentre os eucariontes, as leveduras são os organismos melhor

caracterizados geneticamente. Saccharomyces cerevisiae, espécie mais

estudada, possui todo o seu genoma seqüenciado (Goffeau et al.,1996) e mais

de seis mil genes identificados, sendo mais da metade com função conhecida

(Oliver, 1996; Walker, 1998; Brachat et al., 2003). O número de cromossomos

de isolados de K. marxianus varia entre seis a doze, porém em sua maioria são

encontrados em número de oito cromossomos por célula. Após recentes

estudos baseados na construção de uma biblioteca genômica parcial (17% do

genoma total) de K. marxianus constatou-se uma grande proximidade

evolutiva entre esta espécie e a S. cerevisiae quanto à classificação funcional

dos genes seqüenciados (Llorente et al., 2000).


Assim como em todos os outros campos de estudo sobre leveduras, as

características reprodutivas desses organismos baseiam-se no estudo do ciclo

de vida da levedura de brotamento S. cerevisiae. As células desta levedura

podem existir principalmente em duas formas na natureza, haplóide ou

diplóide. Em células diplóides, o ciclo de vida mantém-se vegetativo até a

escassez dos nutrientes ou que outras condições de estresse ocorram, quando

então o ciclo meiótico passa a ser adotado. Na reprodução vegetativa

(assexuada), que ocorre por mitose, novas células são formadas a partir do

brotamento da célula mãe.

A exemplo do ciclo de vida mitótico de outros eucariontes, a interfase se

caracteriza por três sub-fases: a G1, que precede a síntese de DNA

cromossômico, a fase S, quando ocorre a replicação cromossômica e a fase

G2, que precede a mitose (Castilho-Valavicius et al., 1992). Em leveduras de

brotamento, na sub-fase G2 ocorre um crescimento lateral do protoplasma da

célula, o broto, que dará origem à formação da célula filha. Em geral o

tamanho do broto é um indicativo do estágio celular ao longo do ciclo

mitótico. Células sem broto estão na fase G1, com a presença de um pequeno

broto indicam já haver sido iniciada a mitose e, células portadoras de brotos

grandes (com, no mínimo, metade do tamanho da célula mãe) indicam a

ocorrência de segregação cromossômica, divisão nuclear e migração (Castilho-

Valavicius et al., 1992).

O ciclo meiótico em leveduras Ascomycetes é caracterizado pela

geração de quatro células haplóides (esporos) agrupadas em ascos. Nestes

ascos são encontradas duas células com o sinal de acasalamento a e outras

duas com o sinal de acasalamento α. As conjugações ocorrem unicamente

entre células de diferentes sinais de acasalamento. Em cepas selvagens, estes

dois tipos de células haplóides podem se interconverter para promover a


conjugação, isto é, uma célula a se tornar α ou vice-versa. Desta forma, a fase

haplóide das leveduras Ascomycetes selvagens se reduz apenas a um pequeno

período do ascósporo (Phaff, 1990). Os fatores que determinam os dois tipos

de sinais de acasalamento se localizam no lócus MAT (Mating type)

(Castilho-Valavicius et al., 1992; Walker, 1998). Estes fatores regulam uma

série de genes que determinam a capacidade das células se conjugarem e assim

formarem diplóides.

As cepas de leveduras preferencialmente usadas em laboratório para

estudos genéticos são heterotálicas, não portadoras da propriedade de

interconversão; desta forma, as células haplóides expressam sempre o mesmo

sinal de acasalamento (ou a ou α), o que impede o acasalamento e a

conseqüente recombinação, garantindo a estabilidade das informações

genéticas em estudo (Castilho-Valavicius et al., 1992).

2.3. Expressão heteróloga em leveduras

O estudo de genes heterólogos em leveduras tem início pela introdução

de fragmentos de DNA portando o gene de interesse. Fatores tais como alta

eficiência de transformação (introdução do DNA exógeno na célula) e boa

estabilidade (permanência por gerações) são essenciais para esse processo.

Os plasmídios, moléculas de DNA extracromossomal presentes

naturalmente em alguns microrganismos, têm sido utilizados como vetores de

inserção de fragmentos de DNA de interesse para estudos moleculares. Para

tanto, uma grande variedade de plasmídios originais de leveduras e

principalmente de bactérias tem sido geneticamente modificados para poderem

ser inseridos e mantidos nas células alvo (células hospedeiras). A molécula de

DNA inserida pode ser mantida na levedura integrada ao genoma ou como

plasmídio, a partir de dois tipos de vetores desenvolvidos para este fim: os


integrativos e os epissomais, respectivamente. Os vetores plasmidiais

desenvolvidos para estudo genético em leveduras apresentam propriedades

úteis para sua manutenção, propagação e expressão gênica, tanto em leveduras

como em bactérias. Isto porque toda a manipulação genética precedente à

expressão em células de leveduras é feita em células de Escherichia coli. Estas

características são próprias de vetores chamados bifuncionais (Ausubel et al.,

1989; Johnston, 1994).

As marcas de seleção de plasmídios para bactérias são geralmente genes

que codificam resistência a antibióticos, enquanto que as marcas de seleção

para leveduras geralmente são genes envolvidos na rota biossintética de

aminoácidos ou bases nitrogenada, que, por mutação, foram silenciados no

genoma da levedura. Assim, a seleção das células de leveduras portadoras de

plasmídio (transformadas) é monitorada pelo semeio das células em meio de

cultura desprovido do nutriente em questão, chamado meio seletivo. Desta

forma, apenas se desenvolvem neste meio aquelas células que possuem o

plasmídio (Ausubel et al., 1989; Guthier e Fink, 1991).

Deve-se ter cuidado especial na escolha de uma espécie hospedeira para

o vetor plasmidial para se obter rendimentos e prevenir problemas em etapas

posteriores como a instabilidade plasmidial e com a purificação do produto

desejado, assim como se faz importante o hospedeiro ter um conjunto de

técnicas moleculares bem estabelecidas (Ausubel et al., 1989).

A levedura S. cerevisiae, por ser considerada como um modelo de

organismo eucarionte, tem sido alvo de numerosos estudos nos mais diversos

campos da ciência. Nos últimos quinze anos, um grande número de técnicas

foi desenvolvido para estudos nessa espécie de problemas e funções comuns a

todas as células de seres eucariontes (Gellissen e Hollenberg, 1997). Em

função disso, essa levedura vem sendo utilizada como hospedeira nos


processos de clonagem e expressão gênica. S. cerevisiae tem muitas aplicações

industriais na produção de cerveja, vinho, álcool, fermento e proteínas

heterólogas. Seu uso data de milhares de anos e apesar de várias linhagens

terem sido selecionadas para vários fins, como boa produtividade em etanol e

tolerância a altos teores de etanol, existe algumas características que tornam S.

cerevisiae ainda imperfeita do ponto de vista industrial (Antunes, 2003). Três

problemas podem ser observados: 1) a glicose reprime a utilização de outras

fontes de carbono que estejam presentes no meio; 2) formação de glicerol sob

condições anaeróbicas; e 3) efeito “Crabtree” (produção de etanol sob

condições aeróbicas) (Olson e Nielsen, 2000).

Segundo Romanos et al., (1992), apesar de possuir um sistema genético

já bem estudado, a levedura S. cerevisiae apresenta inconveniências para a

produção em larga escala de algumas proteínas heterólogas, devido a certos

obstáculos, tais como a necessidade de fermentação alimentada para alcançar

altas densidades celulares, além da hiperglicosilação de algumas proteínas

heterólogas. Sistemas alternativos têm sido desenvolvidos com base em outras

leveduras, devido às suas propriedades metabólicas. Estudos de sistemas de

expressão utilizando as leveduras Kluyveromyces lactis Dombrowski e Picchia

pastoris Guilliermond estão bem adiantados e algumas linhagens e vetores de

expressão desta última já estão sendo comercializados. Contudo, o menor

tempo de geração, a maior diversidade de substratos e a capacidade de crescer

em temperaturas mais elevadas do que estas espécies indicam ser a K.

marxianus uma boa candidata a sistemas alternativos de expressão (Bergkamp

et al. 1993) (Tabelas 1 e 2).


Uma vez que as principais técnicas moleculares adotadas na

manipulação de Kluyveromyces são provenientes de estudos com linhagens de

S. cerevisiae (Bergkamp et al., 1993; Iborra, 1993), adaptações e

melhoramentos têm sido alvo de pesquisas visando aumentar eficiência de

transformação em K. marxianus.

2.4. A levedura Kluyveromyces marxianus

K. marxianus é um fungo pertencente ao filo Ascomycota, à

ordem Saccharomycetales e à família Saccharomycetaceae. Esta família inclui

leveduras que são predominantemente unicelulares e podem produzir

pseudomicélio, têm reprodução assexuada primariamente por brotamento

Fontes de carbono assimiladas (fonte: Kreger-van Rij, 1984). Legenda: (+) assimila, (-) não assimila, (v) depende da linhagem, (nd) não determinado.

Tabela 1: Quadro comparativo da capacidade de utilização de diferentes de fontes carbono

entre duas espécies de Kluyveromyces e Saccharomyces cerevisiae.

Fonte de Carbono K. marxianus K. lactis S. cerevisiae

Lactose V + -

Inulina + - nd

Maltose - v v

Rafinose + v v

Sacarose + v v

Celobiose + + -

D-Ribose + - -

D-Xilose + v -


multilateral e que produzem ascosporos que se originam tanto de um zigoto

como partenogeneticamente (Alexopoulos et al., 1996).

K. marxianus apresenta características ideais para utilização

industrial, tais como altas taxas de crescimento, capacidade de ser cultivada a

temperaturas elevadas (40 a 45oC) e em ampla faixa de pH (2,6 a 6), e a

utilização de uma grande variedade de açúcares como fonte de carbono, como

por exemplo lactose e frutanos, mediante a produção de lactase e inulinase

(Grootwassing e Fleming, 1980). Essa levedura é considerada como organismo

GRAS (Generally Recognized as Safe) pelo FDA (Food and Drug

Administration) dos EUA, e sua capacidade de utilizar lactose como fonte de

carbono poderá possibilitar o uso do soro de queijo, atualmente um importante

poluente da indústria de laticínios, como matéria-prima para outros processos

industriais (de Mercado, 1995). A lactase (β-Galactosidase) produzida por esta

levedura é utilizada para reduzir os níveis de lactose do leite, possibilitando o

consumo do leite hidrolisado e seus derivados por indivíduos com intolerância

à lactose, os quais compreendem aproximadamente 70% dos brasileiros, e

também para resolver os problemas de cristalização do doce-de-leite, que

ocorrem durante a estocagem, devido à baixa solubilidade da lactose (Furlan et

al., 2000).

Dois outros campos têm sido explorados pela fermentação por K.

marxianus: a produção de biomassa e a produção enzimática. Esta levedura

pode ser utilizada como complemento alimentar, atuando como probiótico em

ração para aves, bovinos e suínos. A biomassa celular pode suprir estas rações

com “fatores de crescimento” reduzindo os custos com a suplementação

vitamínica (de Mercado, 1995; Furlan et al., 2000). Outrossim, a K. marxianus

possui uma alta produtividade enzimática que, se aliada a eficientes sistemas


de expressão e secreção de proteínas, pode ser explorada para a produção de

proteínas heterólogas (Van den Berg et al., 1990; Laloux et al., 1991).

Comparativamente, os conhecimentos acumulados pela utilização

industrial de K. marxianus na produção de biomassa alimentar, inulinase e

pectinases, bem como na expressão e secreção de proquimosina bovina (Van

den Berg et al., 1990), confirmam que essa espécie tem uma capacidade de

produção maior que a de S. cerevisiae, o que a torna uma excelente candidata à

produção de proteínas heterólogas de interesse industrial (Laloux et al., 1991).

Tal como S. cerevisiae, a levedura K. marxianus possui os sinais sexuais

a e α, os quais podem ser segregados após esporulação para a propagação das

linhagens haplóides ou para cruzamentos planejados, possibilitando a

introdução de marcas genéticas para seleção (Walker, 1998). Entretanto, a

genética de K. marxianus ainda é pouco conhecida devido à falta de cepas

mutantes auxotróficas e do desenvolvimento de cepas heterotálicas e haplóides

estáveis (Bergkamp et al. 1993).

Estudos de transformação com plasmídios replicativos demonstraram

que esta levedura apresenta uma boa capacidade de transformação com

plasmídios de outras leveduras, entretanto esses transformantes mostraram-se

muito instáveis (Iborra, 1993;; Basabe et al., 1996; Souza Jr, 1999),

provavelmente devido à incompatibilidade das origens de replicação entre a

célula e o plasmídio. Assim, para que se possa estabelecer K. marxianus como

um sistema genético, fez-se necessário a identificação de vetores de expressão

replicativos de alta estabilidade nesta levedura que permitam a clonagem e

expressão gênica (Souza Jr, 1999).

As origens de replicação autônoma cromossomais KARS1 e KARS2 de

K. lactis e a origem de replicação do plasmídio natural pKD1 de K.

drosophilarum Shehata foram utilizadas na transformação e estabilização de


plasmídios epissomais em células de K. marxianus (Iborra, 1993; Bergkamp et

al., 1993; Basabe et al., 1996). Destes, a maior estabilidade foi encontrada em

plasmídios contendo a origem de replicação de pKD1, como o vetor pE1

inicialmente desenvolvido para K. lactis. Recentemente, Souza Jr. e Morais Jr.,

(2000) demonstraram uma maior estabilidade do plasmídio pDblet, o qual

contém a origem de replicação ars3002 e o gene URA4 da levedura

Schizosaccharomyces pombe e também a possibilidade de utilização deste

plasmídio como vetor de expressão gênica em K. marxianus (Tabela 2).

Em relação às novas tecnologias, estudos recentes têm mostrado que a

levedura K. marxianus é bastante eficiente na expressão de algumas proteínas

heterólogas, ou seja, proteínas produzidas naturalmente por outros organismos.

Como exemplo, foram obtidas a produção e a secreção de proquimosina

bovina (Van den Berg et al., 1990) e da α-galactosidase de Cyamopsis

tetragonoloba L. (Bergkamp et al., 1993). Contudo, um campo promissor deve

se consolidar com o estabelecimento de um sistema de clonagem eficiente e

estável formado entre linhagens de K. marxianus e vetores plasmidiais

multifuncionais de expressão.

2.5. Vetores Plasmidiais

Dado que o sucesso de fermentações baseadas em tecnologia de DNA

recombinante é uma combinação das interações entre o ambiente fermentativo,

o organismo hospedeiro e os elementos genéticos recombinantes, como os

vetores plasmidiais, o estudo do comportamento das células transformadas

com vetores tanto em meio líquido como em meio sólido é de suma

importância para linhagens de leveduras usadas em fermentação industrial;

afinal, estas células podem sofrer vários estresses físicos e químicos que

podem vir a impedir o crescimento e o metabolismo (O’Kennedy et al.2000).


A instabilidade é a tendência das células transformadas perderem suas

propriedades de engenharia molecular por casa de mudanças ou perdas do

plasmídio ao longo de gerações.Portanto, após o plasmídio recombinante ser

introduzido dentro de células hospedeiras, as interações dentre plasmídio e o

hospedeiro são de suma importância uma vez que determinam a instabilidade

plasmidial e o grau de expressão dos genes clonados (Zhang et al., 1996;

Moreira, 2003).

Existem dois tipos de instabilidade plasmidial: a estrutural e a

segregacional. A primeira é causada usualmente por deleção, inserção,

recombinação ou outros eventos ao nível de DNA, enquanto que a

segregacional é causada pela partição desigual de plasmídios durante a divisão

celular (Zhang et al., 1996).

Os plasmídios centroméricos, caracterizados por possuírem origem de

replicação cromossomal, comportam-se como minicromossomos durante a

divisão celular, e apresentam uma alta estabilidade, aliada a um baixo número

de cópias. Estas características os limitam a funções específicas, como o uso

para construção de bibliotecas genômicas. Os plasmídios integrativos

apresentam a maior estabilidade dentre os vetores adotados para sistemas

recombinantes de transformação. Este tipo de vetor caracteriza-se pela

ausência de uma origem de replicação de levedura e pelo fato de se integrar ao

cromossomo da célula alvo pela complementaridade de seqüências homólogas

de DNA. Todavia, apresentam baixa eficiência de transformação (Hinnen et

al., 1978), e, a menos que possuam sítio de integração ribossomal, seu baixo

número de cópias não satisfaz a quantidade mínima necessária para expressão

ótima e alta estabilidade de proteínas recombinantes (Van der Aar et al.,

1990).


Os plasmídios epissomais baseados no plasmídio natural 2µm de S.

cerevisiae têm sido bastante adotados para estudos biotecnológicos em

leveduras, em função do alto número de cópias e da alta estabilidade.

Entretanto, esses vetores necessitam da presença do 2µm nativo para promover

a complementação in trans das funções envolvidas com a amplificação e

estabilidade (Futcher e Cox, 1984; Macreadie et al., 1991; Hosford et al.,

1992; Hottiger et al., 1995). Além do mais, plasmídios tipo 2µm como o pKD1

de Kluyveromyces drosophilarum, têm se mostrado pouco estáveis em

Saccharomyces ou em outras espécies de Kluyveromyces (Bianchi et al. 1991;

Chen, 1996; Hsieh e da Silva, 1998).

O pE1, vetor portador da seqüência completa do plasmídio pKD1 em

fusão com o plasmídio integrativo YIp5 de S. cerevisiae, foi desenvolvido para

a levedura K. lactis e tem sido usado para estudo da expressão de genes tanto

em K. lactis como em K. marxianus pela relativa estabilidade apresentada

(Bianchi et al., 1991; Chen, 1996; Basabe et al., 1996). Contudo os estudos

com a levedura K. marxianus ainda não têm apresentado resultados

satisfatórios para sua adoção como vetor definitivo de sistema de clonagem,

assim como a eficiência de transformação para esta espécie (6,0 x 102

transformantes µg-1 DNA) está bem aquém das que são observadas quando se

transforma S. cerevisiae e K. lactis (6,0 x 104 e 3,0 x 105 transformantes µg-1

DNA, respectivamente) (Souza Jr e Morais Jr, 2000), o que justifica o a

aprimoramento de técnicas.

Iborra (1993) construiu um vetor para K. marxianus usando uma ARS

de K. lactis (KARS2) que, embora apresentasse uma alta eficiência de

transformação, demonstrou uma baixíssima estabilidade plasmidial (15% após

crescimento em meio seletivo e 3,3% após dez gerações em meio rico).


Estudos utilizando plasmídios replicativos em K. marxianus têm reforçado a

necessidade de identificação de vetores replicativos mais estáveis. Basabe et

al. (1996) relatam uma estabilidade de 77% ao usar um plasmídio replicativo

com origem ARS de K. lactis em células de K. marxianus após 16 horas de

cultivo em meio seletivo. Iborra e Ball (1994) clonaram dois fragmentos do

DNA de K. marxianus que apresentaram seqüências ARS e ARS-CEN, de

aproximadamente 600 e 1200 pares de bases, respectivamente. A taxa de perda

plasmidial de 2 e 4,6% por geração celular (20 a 46% por cultivo de 16 horas)

dos plasmídios contendo apenas a ARS foram maiores do que as taxas

observadas para os plasmídios centroméricos (ARS-CEN), tanto para K.

marxianus como K. lactis. Entretanto, o mesmo não foi evidenciado para S.

cerevisiae, que apresentou taxas de perda plasmidial de 18 e 20%,

respectivamente.

De toda forma, fica evidente a necessidade da identificação entre o

sistema de replicação celular e de replicação plasmidial para o estabelecimento

de um eficiente sistema de clonagem (Fournier et al., 1993; Clyne e Kelly,

1995; Dubey et al., 1996; Okuno et al., 1997). Este fato pode ser bem

representado pelos estudos comparativos com plasmídios desenvolvidos para a

levedura de fissão Sz. pombe. O vetor replicativo pFL20 apresentou uma

estabilidade mitótica de 95%±5 após vinte e quatro horas e um número de

cópias de até 80 por célula quando estudado por Heyer et al. (1986) e de

apenas 62% portando 8 (oito) cópias plasmidiais quando estudado por Brun et

al. (1995), durante o mesmo tempo. Tais diferenças devem estar relacionadas

com a constituição genética das linhagens celulares utilizadas nos dois

trabalhos (Brun et al., 1995).

Com o objetivo de ampliar a capacidade de permanência de plasmídios

replicativos em leveduras, estratégias genéticas como combinação de marcas e


pressão seletiva, implantação de condição de autoseleção e amplificação de

seqüências de replicação têm sido adotadas (Chen, 1996). Hsieh e da Silva

(1998) estabeleceram um sistema de auto-seleção para a levedura K. lactis

baseado na presença da dupla mutação ura3 fur1 e aumentaram a estabilidade

de um plasmídio contendo a origem de replicação pKD1 em relação ao simples

mutante ura3. O mesmo fundamento pode ser aplicado quando se somam as

pressões seletivas de marcadores auxotróficos e de resistência a antibióticos,

que provocam uma maior necessidade do vetor de se replicar para garantir sua

sobrevivência (Reiser et al., 1990; Romanos et al., 1992; Steensma et al.,

2001). Entretanto, esta estratégia é apenas indicada para estudos laboratoriais,

uma vez que sistemas de vetores de clonagem baseados em marcas de

resistência a antibióticos são de alto custo, além de restritos pela legislação

vigente para uso industrial.

2.5.1. K. marxianus transformada com o vetor plasmidial pDblet

Trabalhos recentes avaliaram o desempenho da linhagem KMS2

(CBS6556, ura3-) da levedura K. marxianus transformada com o vetor

plasmidial pDblet, originalmente desenvolvido para a levedura de fissão

Schizosaccharomyces pombe. (Souza Jr e Morais Jr, 2000) (Tabela 2). Nestes

estudos, os autores observaram que, em comparação com vetores comumente

adotados para estudos moleculares em K. marxianus como o pE1, o plasmídio

replicativo pDblet (Figura 1) representa um vetor melhor indicado para

construção de bibliotecas genômicas e expressão de genes provindos de outras

leveduras em células de K. marxianus. Baseado nestes resultados, este

plasmídio replicativo foi utilizado neste trabalho como vetor plasmidial.


O vetor plasmidial pDblet possui características vantajosas para os

trabalhos de clonagem e expressão gênica em células de leveduras. Este

plasmídio possui uma dupla seqüência do fragmento ars3002 de Sz. pombe

dispostos in tandem e o gene URA4, o qual pode complementar a mutação

ura3 de S. cerevisiae. Além disso, possui um sítio múltiplo de clonagem para a

introdução de fragmentos digeridos com uma grande variedade de enzimas de

restrição, a capacidade de seleção das moléculas recombinantes em bactérias

pelo sistema “white-blue”, indicado pela ausência de cor azul nas colônias

contendo o plasmídio recombinante crescidas em meio contendo IPTG/X-Gal,

e é capaz de produzir DNA em fita simples por portar a origem de replicação

do fago f1, além de sintetizar RNAm in vitro pelo uso de promotores de fago

T3/T7 (Brun et al., 1995).

Tabela 2. Estudo comparativo entre recombinantes das leveduras Saccharomyces cerevisiae (MM10-

2a) e Kluyveromyces marxianus (KMS2) portadores dos vetores epissomais pE1 e pDblet em células.

Linhagem MM10-2a KMS2

Plasmídios pE1 pDblet pE1 pDblet

Transformantes/µg plasmidio 6,1 x 104 2,2 x 105 7,0 x 102 1,1 x 104

Estabilidade Plasmidial 24 h 55 27 78 75

Taxa de segregação Plasmidial (%) 3,4 6,1 1,03 1,19

Taxa de crescimento especifico (h-1) 0,47 0,51 0,68 0,68

Tempo de duplicação Celular (min) 87 80 60 60

Fonte: Souza Jr. e Morais Jr., 2000.


2.6. K. marxianus em Lactose

A lactose, 4-O-β-D-galactopiranosil-D-glicose (C12H22O11), é um

dissacarídeo formado por uma molécula de glicose e uma molécula de

galactose encontrada no leite e seus derivados. Sua utilização pela levedura

depende da ativação de uma proteína transportadora de lactose e da produção

da enzima lactase (β-galactosidase, EC 3.2.1.23), que catalisa a hidrólise da

lactose em glicose e galactose (Fiedurek e Szczodrak, 1994; Hensing et al.,

1994; Furlan et al., 2000) (Figura 2).

Figura 1. Desenho esquemático do mapa físico do vetor

plasmidial pDblet. (Fonte: Brun et al., 1995)


A lactose dos derivados de laticínios é pouco solúvel, o que potencializa

seu efeito poluente em mananciais hídricos, contribuindo para o

comprometimento da demanda de água potável mundial (Hetzner e Richarts,

1996) e propicia efeitos tóxicos em peixes e laxativos em humanos quando

consumidos em quantidade excessiva (Fiedurek e Szczodrak, 1994).

As espécies do gênero Kluyveromyces têm sido adotadas para uso

industrial pela capacidade de produzir a β-D-galactosidase, e K. marxianus

tem sido considerada um dos mais adequados organismos para a bioconversão

da lactose do soro de queijo, diminuindo o seu potencial poluente (Berruga et

al., 1997; Rech et al.,1999). Neste processo, a lactose é hidrolisada pela lactase

à glicose e galactose que são convertidas à glicose 6-fosfato para ser

assimiladas como fonte de carbono (Silva e Martins, 1990).

Figura 2. Hidrólise de uma molécula de lactose resultando em uma molécula de galactose e outra de glicose.


2.7. Soro de Queijo

O soro de queijo é um resíduo da indústria de laticínios decorrente da

precipitação da caseína que consiste na parte líquida composta por 5% de

lactose, 1% de proteínas, 0,8% de sais e 0,5% de ácido láctico, com pH em

torno de 5,5 (ver tabela 3). Sua demanda biológica de oxigênio fica em torno

de 40.000 mg/l, o que o torna um dos mais potentes poluentes orgânicos no

mundo (Hetzner e Richarts, 1996). O reprocessamento e a estocagem tem

incidência expressiva sobre os custos da indústria.

Mundialmente, para cada quilo de queijo produzido nove quilos de soro

são obtidos, o que o torna o maior problema da indústria de laticínios. Hetzner

e Richarts (1996) registraram que só nos países da União Européia, Estados

Unidos, Canadá, Japão, somam-se mais de 15 milhões de toneladas de soro

produzidos anualmente. Estes autores enfatizaram que embora exista um

esforço nestes países desenvolvidos para reduzir o descarte do soro de queijo

desde 1990, o mesmo não ocorre entre os países chamados “em

desenvolvimento”, onde a produção de queijo vem crescendo ano a ano. Para

se ter uma idéia do que isso representa em termos de poluição, basta tomar-se

como exemplo o Canadá. Berruga et al. (1997) relataram que dos 1,7 milhões

de toneladas de soro produzido naquele país, cerca de 17% eram despejados no

saneamento e 26% diretamente no solo, comprometendo sua estrutura física e

química, diminuindo o rendimento da agricultura.

No Brasil, cerca de metade do volume de soro de queijo produzido é

descartado in natura, comprometendo as fontes de água potável (Rech et al.,

1999). O aproveitamento deste sub-produto ainda não é satisfatório e a

utilização de tecnologias de ponta, como o uso da biotecnologia, pode permitir

a reutilização deste sub-produto na produção de produtos de alto valor

agregado (Rech et al., 1999).


Na região Nordeste do Brasil a chamada indústria de laticínios é secular,

porém, em sua grande maioria, assim como em todos os países em

desenvolvimento, é administrada de forma artesanal, com pouca tecnologia e

nenhuma preocupação em biossegurança e impacto ambiental. Nesse contexto,

o soro de queijo é considerado um dejeto a ser descartado nos rios ou solo, ou

quando muito, nas cooperativas de queijo ou indústrias de médio porte, é

reutilizado para dar cheiro e sabor à ração do gado, o que significa um

Tabela 3: Composição padrão do soro de queijo fresco (Jenness e Koops, 1962; Franco, 1986).

Componente Concentração

Lactose 50,0 g/L

Proteínas 7,5 g/L

Lipídios 5,0 g/L

Fosfato de potássio 1,58 g/L

Citrato de potássio 0,98 g/L

Sulfato de potássio 0,18 g/L

Citrato de sódio 1,79 g/L

Cloreto de cálcio 1,30 g/L

Citrato de magnésio 0,38 g/L

Carbonato de potássio 0,30 g/L

Cloreto de potássio 1,00 g/L

Ferro 0,1 g/L

pH 5,6

Cinzas 1%


desperdício e um prejuízo altíssimo a se considerar o alto teor protéico e de

lactose.

Apesar do crescente número de publicações com linhagens de K.

marxianus na área de fisiologia do processo fermentativo em soro de queijo

(Rech et al.,1999; Revillion et al., 2003; Longhi et al., 2004) e na área da

expressão de genes heterólogos (Van der Berg et al., 1990; Bergkamp et al.,

1993; Hsieh e da Silva, 1998), nenhum trabalho tem sido encontrado com a

utilização deste substrato por células recombinantes de K. marxianus,

justificando este trabalho de Doutorado.


__________________________________3. MATERIAL E MÉTODOS


3.1. Local de trabalho:

O presente trabalho foi realizado no Setor de Biologia Molecular

do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA, na

Universidade Federal de Pernambuco.

3.2. Linhagens de bactéria e leveduras:

Foi utilizada a linhagem de E. coli DH5α (amp-) para a

manutenção e amplificação dos plasmídios a serem utilizados. O meio

Luria Broth (LB) foi adotado para crescimento bacteriano, sendo

adicionado ampicilina a uma concentração final de 100 µg/mL para

seleção de transformantes.

A linhagem selvagem de K. marxianus var. marxianus CBS6556

(Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Delft, Holanda) e seu

mutante auxotrófico KMS2 (CBS6556 ura-; Bergkamp et al., 1993)

foram utilizados como as linhagens padrão e recipiente para a

introdução dos plasmídios, respectivamente. As linhagens

recombinantes construídas para este estudo foram: KMDB-1 (KMS2

portadora do vetor pDblet), KMDamy (KMS2 portadora do vetor

pDαAmy), KMDkan (KMS2 portadora do vetor pDkan) e KDHLZ

(KMS2 portadora do vetor pDHLZ).

3.3. Tipos plasmidiais e transformação celular:

O plasmídio pDBlet (Brun et al., 1995) contem o gene ura4 e a

origem de replicação ars3002 de Sz. pombe. O plasmídio pDαAmy

contem o gene da α-Amilase inserido no plasmídio pDBlet. O plasmídio

pDkan contem o gene da G-418 inserido no plasmídio pDBlet. O


plasmídio pDHLZ possui o gene da lisozima humana (HLZ). As células

de bactéria foram transformadas com o DNA plasmidial pelo método do

cloreto de cálcio (Sambrook et al., 1989) e as células de levedura foram

transformadas pelo método rápido mediado por acetato de lítio (Antunes

et al., 2000).

3.4. Construções dos Vetores

Para alcançar os objetivos almejados quanto ao estudo do

crescimento fermentativo em batelada das linhagens recombinantes de

K. marxianus em soro de queijo, vetores plasmidiais baseados no

pDblet, apresentando insertos de DNA heterólogo ao material genético

da K. marxianus foram construídos.

3.4.1. Construção do plasmídio pDαAmy

Com o objetivo de avaliar a estabilidade de vetores com eficiência

de produção enzimática um segundo recombinante de K. marxianus foi

construído adicionando-se um fragmento portador do gene STA-1 que

codifica a enzima α-amilase de Aspergillus ao vetor plasmidial pDblet

(Figura 3).

A presença deste vetor plasmidial, denominado pDαAmy, nas

células cultivadas no soro de queijo foi monitorada: a partir do

crescimento de colônias em placa contendo como fonte de carbono o

amido 1% e através de constatação em gel de agarose 0,8 % de

fragmento relativo ao gene (banda de 2,2 Kb) dentro dos plasmídios

extraídos da cultura em pontos aleatórios ao longo do cultivo (Figura 4).


3.4.2. Construção do plasmídio pDKan

O plasmídio pDKan foi construído a partir da substitição do gene

URA 4 (1.8 Kb) do pDblet pelo fragmento de 3.7 Kb contendo os genes

URA 3 de S. cerevisiae (1.1 Kb) e Kanr de E. coli (2,6 Kb), o qual é

capaz de conferir às células de levedura resistência ao antibiótico

geneticina, ambos extraídos do vetor pNF2. As células transformadas

com este plasmídio são capazes de crescer em meio seletivo contendo

geneticina (Figura 5).

Esta estratégia tem relevância no fato de que vetores portadores de

marcas de seleção por pressão seletiva dominante, como os vetores que

contém o gene bacteriano codificador de resistência à kanamicina (kanr),

podem ter o seu número de cópias aumentado e, conseqüentemente,

aumentar sua estabilidade plasmidial, além de serem úteis para estudos

de genes que precisam ser superexpressos (Chen, 1996).

A obtenção de uma linhagem de K. marxianus portadora do vetor

pDKan permitiu a monitoração, através de um ensaio simples

qualitativo em meio sólido, da permanência do plasmídio nas células de

K. marxianus crescidas durante os ensaios fermentativos em soro de

queijo e ao mesmo tempo a constatação da capacidade de expressão do

gene heterólogo ao longo do crescimento. A presença do vetor

construído pode ser monitorada pela presença das bandas relacionadas

ao vetor (4,5 Kb) e ao fragmento onde está inserido o gene (3,7 Kb) em

gel de agarose 0,8%, após extração ao longo do cultivo (ver figura 4).

Em adição, esta estratégia pode contribuir para estudos posteriores

de análise comparativa de perfil fermentativo entre as linhagens KMS2

(CBS 6556, ura 3-) e ATCC 36907 em meios contendo lactose como

substrato, uma vez que esta última não possui linhagem auxotrófica


disponível. Este estudo pode ser muito informativo, dado que a

avaliação da produção de biomasssa e atividade enzimática entre as

linhagens CBS 6556 e ATCC 36907, demonstrou que a segunda

apresentou um melhor perfil destes parâmetros quando crescidas em

meio contendo sacarose (Souza et al., 2003).

3.4.3. Construção do plasmídio pDHLZ

O plasmídio pDHLZ foi construído para se estudar a produção da

proteína lisozima humana, codificada pelo gene HLZ, em células

recombinantes de K. marxianus. Para tal, o fragmento de 1,8 Kb

contendo o promotor do gene Gal-7 de K. lactis e o gene HLZ foi

extraído do vetor plasmidial YIpRD2-Lys com a enzima de restrição

Hind III e utilizado para substituir um fragmento Hind III de

aproximadamente 2,0Kb do plasmídio pDKan que compreende o gene

Kanr (Figura 6).

A presença do vetor construído pode ser monitorada pela presença das

bandas relacionadas ao vetor (8,1 Kb) e ao fragmento onde está inserido

o gene (1,8 Kb) em gel de agarose 0,8%, após extração ao longo do

cultivo (Figura 4).


Figura 3. Desenho esquemático da construção do pDαAmy pela inserção do

gene STA 1 no vetor pDblet.

Sta 1 (2,6 Kb)

YepSta 1

Xba I Sac I Sta 1 (2,6 Kb)

Xba I

PDblet 6,2 Kb

∧

Sac I

pDα amy 8,8 Kb

Xba I Sac I


4,34 Kb

23,130 Kb 9,416 Kb

6,78 Kb

2,25 Kb

1,98 Kb

λ - H ind III (48,377 Kb)

L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7

Figura 4. Gel de agarose contendo os vetores estudados e seus fragmentos

inseridos:

L1 – Marcador de Peso Molecular λ-Hind III;

L2 – pDblet linearizado com Hind III (6,2 Kb);

L3 - pDαamy digerido com Xba I e Sac I (6,2 Kb + 2,2 Kb);

L4 - pDαamy linearizado com Hind III (8,4 Kb);

L5 – pDkan digerido com Xho I e Xba I (4,5 Kb + 3,7 Kb);

L6 – Gene HLZ (~1,8 Kb) extraído do vetor YipRD2-Lys com Hind III;

L7 – pDHLZ linearizado com Xba I (8,1 Kb) .


Xba IXho I

Kanr (2,6 Kb) + URA 3 (1,1 Kb)

pNF2 10,3 Kb

Xho I Xba I

pDblet

URA 4 (1,8 Kb)

Kanr + URA 3)(3,7 Kb)

pDKan 8,2 Kb

Xho I Xba I

Figura 5. Desenho esquemático da construção do pDKan pela substituição do

inserto URA 4 pelo fragmento Kanr (2,6 Kb) + URA 3 (1,1 Kb).


YipRD2-Lys 1

Hind IIIHind IIIHLZ (1,8 Kb)

pDKan

Hind IIIHind IIIKanr (2,0 Kb)

HLZ (1,8 Kb)

pDHLZ 8,1 Kb

Hind III Hind III

Figura 6. Desenho esquemático da construção do pDHLZ pela substituição do inserto Kanr do vetor pDKan pelo fragmento HLZ de 1,8 Kb.


3.5. Cultivo celular e processamento das amostras:

As células de bactéria foram cultivadas em meio LB

suplementado com ampicilina para os transformantes. As células de

levedura foram cultivadas nos meios ricos YPD e YPL, em meio

mínimo contendo glicose ou lactose e em soro de leite. A produção de

biomassa foi avaliada pelo peso seco celular e o crescimento celular foi

avaliado por absorbância a 660 nm, segundo descrito em Dewes and

Southeland (1992). As amostras retiradas ao longo dos cultivos foram

centrifugadas e o sobrenadante da cultura foi avaliado para o consumo

de substratos e atividade das enzimas extracelulares. Todos os

experimentos foram repetidos em triplicata e a média dos resultados foi

adotada.

3.6. Consumo de substratos:

Os consumos de proteína e lactose do meio de cultura ao longo do

cultivo foram avaliados respectivamente pelos métodos do Folin-

Ciocalteau (Lowry et al., 1951) e de.DNSA (Miller, 1959).

3.7. Fermentação em batelada:

As fermentações em batelada foram feitas em frascos de 1 litro

em volume de 300 mL. As culturas foram incubadas após inoculo inicial

de 0,3gL-1 em Shaker orbital com agitação de 200 rpm e temperatura de

30°C ou 37ºC, ambos constantes, por até 36 horas.

3.8. Produção de biomassa:

A produção de biomassa foi avaliada pelo peso seco celular e pelo

crescimento celular:


Crescimento celular durante o cultivo – 1mL do cultivo foi retirado a

cada ponto de coleta para leitura de sua densidade em espectrofotômetro

( avaliada por absovância a 600nm, segundo descrito por Dewes and

Southerland, 1992). Sendo usado como “branco”, 1mL de meio não

contaminado, fazendo-se diluições para leitura a partir da densidade

ótica de 0,700.

Peso seco – 2 mL do cultivo aliquotado foi centrifugado em tubo estéril

pré-pesado e o tubo contendo o sedimento resultante foi levado para

estufa (80ºC por 2 horas). Após repesagem do tubo, a diferença de peso

foi anotada e dividida pelo volume utilizado. (g de células / L de

cultura).

3.9. Atividades enzimáticas:

As atividades enzimáticas foram avaliadas de acordo com as

metodologias correntes: β-galactosidase (Ausubel et al., 1989) e

protease (Bergmeyer, 1974).

A atividade enzimática da β-galactosidase foi avaliada a 30ºC em

um espectrofotômetro Hitachi a 340 nm de comprimento de onda (λ)

segundo o método de Ausoubel et al. (1972), utilizando o ONPG

(o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside) como substrato cromogênico:


_________________________________________________4. ARTIGOS


____________________________________ARTIGO CIENTÍFICO 1


MÉTODO SIMPLES E RÁPIDO DE TRANSFORMAÇÃO POR

ACETATO DE LÍTIO DE CÉLULAS DA LEVEDURA

Kluyveromyces marxianus.

Artigo publicado na revista World Journal of

Microbiology & Biotechnology (ISSN 0959-3993).

A simple and rapid method for lithium acetate-mediated transformationof Kluyveromyces marxianus cells

Daiane Felberg Antunes, ClaÂ udio GalvaÄ o de Souza Junior and Marcos Antonio de Morais Junior*Setor de Biologia Molecular/LIKA and Departamento de GeneÂtica, Universidade Federal de Pernambuco,Recife, PE, Brasil*Author for correspondence: Setor de Biologia Molecular/LIKA, Universidade Federal de Pernambuco.Av. Moraes Rego, s/n, Cidade UniversitaÂria, 50670-901, Recife, PE, BrasilFax: +55 81 271 8485, E-mail: [email protected], URL: www.lika.ufpe.br/setores/biomol.html

Received 30 May 2000; accepted 19 September 2000

Keywords: Dithiothreitol, lithium acetate, Kluyveromyces marxianus, yeast transformation

Summary

E�cient plasmid transformation of Kluyveromyces marxianus cells of 1.9 ´ 103 transformant lg)1 DNA with anepisomal plasmid was achieved by the use of a simple lithium acetate method with the addition of 10 mM DTT andan increased heat shock temperature of 47 °C. This method is shown to be also e�cient for replicative plasmids.Therefore, we suggest its use as a routine method to transform K. marxianus cells.

Introduction

Kluyveromyces marxianus is a budding yeast with in-creasing applications in the production of food biomass,several hydrolytic enzymes and useful products, speciallyused in the food and pharmaceutical industries (reviewedby BeleÂ m & Lee 1998). Some papers have reported theuse of K. marxianus as an e�cient host for geneheterologous expression and protein production (Berg-kamp et al. 1993). However, only a few reports can befound in the literature on the construction of e�cientcloning vectors and speci®c transformation methodol-ogy. The episomal vectors based on the K. drosophilarum2-lm-like endogenous plasmid pKD1, like the pE1plasmid (Bergkamp et al. 1993), and replicative vectorsbased on the K. lactis replication origins have been used(Iborra 1993). Recently, we reported that the Schizosac-charomyces pombe plasmid pDblet was e�ciently intro-duced and stable in K. marxianus cells (Souza Jr &Morais Jr 2000). Moreover, the lithium acetate (LiAc)procedure described for S. cerevisiae or the laborious andexpensive electroporation method have been used forK. marxianus cell transformation (Meilhoc et al. 1990;Bergkamp et al. 1993; Iborra 1993). In this context, wedescribe a rapid and simple LiAc-mediated transforma-tion procedure to produce K. marxianus transformants.

Results and Discussion

We have used the procedure described by Soni et al.(1993) for S. cerevisiae to transform stationary

K. marxianus cells with the episomal plasmid pE1. Afterapproximately 16 h of incubation, the cultures reachedaround 2 ´ 108 cell ml)1 and the transformatione�ciency was 7 ´ 102 transformant lg)1 pE1 plasmidusing the basic procedure. This last value was the sameas described by Souza Jr & Morais Jr (2000) forexponentially growing K. marxianus cells. Therefore, wetested the e�ect of dithiothreitol (DTT) or dimethylsulphoxide (DMSO) added to Polyethyleneglycol(PEG)/LiAc solution and ethanol (EtOH) added duringthe heat shock on the transformation e�ciency of yeastcells.The incubation of the cells in PEG/LiAc solution in

the presence of DMSO decreased cell transformation forvalues below the basic procedure, and at a concentrationof 10% (v/v) practically no transformants could beobserved (Figure 1). The use of DMSO was based onthe ®nding that this compound can stimulate lithiumacetate-mediated whole-cell transformation in S. cerevi-siae, although it decreased cell viability (Hill et al. 1991;Soni et al. 1993). In this context, it could be suggestedthat if DMSO is e�ective in increasing cell wall porosityit may be very toxic to K. marxianus cells. On the otherhand, the presence of 10 mM DTT during lithiumacetate incubation period promoted a 2.5-fold increasein the transformation e�ciency over the basic protocolto 1.9 ´ 103 transformant lg)1 DNA, while someinhibitory e�ect was observed at a higher DTT concen-tration of 15 mM (Figure 1). It has been reported thatDTT increases yeast competence and transformation(Meilhoc et al. 1990; Chen et al. 1992; Iborra 1993) andthat an inhibitory e�ect was also observed for

World Journal of Microbiology & Biotechnology 16: 653±654, 2000. 653Ó 2001 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.

K. marxianus cells using electroporation procedure byboth higher DTT concentration or prolongated periodof incubation (Iborra 1993).Post-incubation with ethanol during heat-shock treat-

ment also increased the transformation e�ciency in therange of 2-fold over the basic procedure and practicallyno di�erence was found whether 5 or 10% (v/v) ethanolwas used (Figure 1). Ethanol at a concentration of 10%(v/v) was also found to increase cell transformation in S.cerevisiae (Lauermann 1991; Soni et al. 1993), probablyby increasing yeast cell membrane ¯uidity (Jones 1987).Combined addition of pre-incubation agents and ethanolhad a synergistic e�ect on cell toxicity that resulted in adecrease of the transformation e�ciency (Figure 1). Thesame e�ect was also observed in S. cerevisiae cells by thecombination of DMSO and ethanol (Soni et al. 1993).The results presented here suggest for use of 10 mM

DTT during the incubation in LiAc solution as the bestcondition for e�cient transformation of K. marxianus inthe stationary phase of growth. Additionally, prepara-tion of LiAc/PEG solution in Tris-bu�ered solution andthe increase of heat shock temperature from 42 to 47 °Cpromoted a 2-fold increase in the e�ciency of transfor-mation (data not shown). We used another plasmid, thereplicative vector pDBlet and its recombinant formspDBKan and pDBaAM, to transform K. marxianuscells with our improved protocol. The transformatione�ciency was around 1.3 ´ 103 transformant lg)1 DNAfor the three plasmids, which was 10 times lower thanthat described for pDBlet (Souza Jr & Morais Jr 2000)but double that obtained for the replicative plasmidpKL2 (Iborra 1993), both using LiAc-mediated trans-formation of exponential K. marxianus cells.

Recommended Procedure

The optimized procedure described here is as follows:cells from 1.5 ml overnight culture were washed withsterile water and resuspended by vortexing in 20 ll(200 lg) of carrier DNA, transforming DNA at mini-mum volume, 0.4 ml of PEG solution (40% PEG 4000,0.1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA)and DTT to 10 mM at ®nal concentration. The mixturewas incubated for 15 min at room temperature andsubmitted to heat shock at 47 °C for 15 min. The cellswere centrifuged and resuspended in 1 ml sterile waterbefore plating 200 ll on selective plates.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the ConselhoNacional de Desenvolvimento Cienti®co e Tecnologico(CNPq) and Fundacao de Amparo a Ciencia e Tecno-logia do Estado de Pernambuco (Facepe). The authorsthank Dr W.M. Ledingham, St Andrews University,UK, for his critical review of the manuscript.

References

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pDblet plasmid as a cloning vector with enhanced stability in

Kluyveromyces marxianus. Biotechnology Letters 22, 43±45.

Figure 1. Transformation e�ciency of the K. marxianus KMS2 strain

by the plasmid pE1 using modi®ed LiAc-mediated procedure with the

permeabilization agents at indicated concentrations. Details of the

procedure are described in the text and the values represent the mean

of triplicates.

654 D.F. Antunes et al.


______________________________________ARTIGO CIENTÍFICO 2


UTILIZAÇÃO DO SORO DE QUEIJO COMO MEIO DE

CRESCIMENTO ALTERNATIVO PARA LINHAGENS

RECOMBINANTES DE Kluyveromyces marxianus.

Artigo publicado na revista

Biotechnology Letters (ISSN 0141-5492).

Biotechnology Letters 23: 1413–1416, 2001.© 2001 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.

1413

Utilisation of cheese whey as an alternative growth medium forrecombinant strains of Kluyveromyces marxianus

Claudio Galvão de Souza Junior1, William MacDonald Ledingham3 & Marcos Antônio deMorais Junior1,2,∗1Setor de Biologia Molecular-LIKA and 2Departamento de Genetica, Universidade Federal de Pernambuco,Recife, PE, Brasil3School of Biology, University of St. Andrews, St. Andrews, UK∗Author for correspondence (Fax: +55 81 3271 8485; E-mail: [email protected])

Received 2 January 2001; Revisions requested 12 January 2001/10 April 2001; Revisions received 6 April 2001/25 June 2001; Accepted 2 July2001

Key words: cheese whey, fermentative parameters, Kluyveromyces marxianus, recombinant physiology

Abstract

Kluyveromyces marxianus KMDB-1, a plasmid-bearing recombinant, not carrying any particular gene of relevance,derived from auxotrophic strain KMS-2 (ura−), grew in cheese whey with a maximum specific growth rate of0.34 h−1. This recombinant strain showed the same lactose uptake and extracellular protease production kineticsas the wild type CBS6556 with no evidence of catabolite repression. The plasmid was retained in 50% of cellsafter 36 h of batch culture. The presence of this vector in Kluyveromyces marxianus, which possesses no naturalplasmids, together with the absence of any metabolic loading effect, creates a suitable microbial system for cheesewhey processing for potential value-added product formation.

Introduction

Cheese whey is an important by-product of the cheesemaking industry. Some 83% by volume of totalmilk utilised is discarded thereby imposing a highBOD loading on municipal sewage and natural watercourses. The budding yeast Kluyveromyces marxi-anus can be used to decrease pollution by utilisationof lactose within the whey (Ghaly & Singh 1989).Considered as a GRAS (Generally Recognized AsSafe) organism, K. marxianus has been used for in-dustrial purposes due to its physiological character-istics and bioproducts yield, in particular hydrolyticenzymes and food biomass (Walker 1998), ribonu-clotides, oligosaccharides and oligopeptides (Belém& Lee 1998). In addition this yeast is highly efficientin the expression of heterologous proteins (Bergkampet al. 1993). The possibility of using an inexpen-sive growth substrate for production of added valueproducts has gained increased attention. Maullu et al.(1999) reported the production of lysozyme enriched-

biomass by recombinant K. lactis cells during cottagecheese whey fermentation. However, there has beenno report on the cheese whey fermentation by recom-binant K. marxianus cells. Recently, we have reportedthe possibility of using the plasmid, pDblet, as acloning vector with enhanced stability in K. marxi-anus (Souza & Morais 2000). This replicative plas-mid transformed yeast cells with high efficiency andit did not impose any physiological loading on theyeast cells under batch fermentation using laboratorymedium (Souza & Morais 2000). In the present report,we further investigated the physiological behaviourof K. marxianus recombinant cells during the fer-mentation of sweet cheese whey and its feasibility asa cheap biotechnological tool for heterologous geneexpression.

1414

Materials and methods

Strains and plasmids

Kluyveromyces marxianus KMS2 is a ura3− aux-otrophic derivative of CBS6556 strain. KMDB-1is a KMS2 strain bearing (transformed with) thereplicative pDblet vector. Plasmid pDblet is pBlue-script II SK+-based that contains the URA4 gene andtwo copies in tandem of the Autonomous Replica-tion Sequence (ARS) ars3002 from the fission yeastSchizosaccharomyces pombe (Brun et al. 1995).

Miscellaneous molecular techniques

Plasmid extraction and digestion, agarose gel elec-trophoresis and bacterial transformation were per-formed according to Sambrook et al. (1989). Im-proved lithium acetate-mediated procedure describedby Antunes et al. (2000) was adopted for yeast trans-formations. Mitotic plasmid stability was measured bya duplicate plate method described by Futcher & Cox(1984). The value of 100% indicates that all the cellsmaintained the plasmid under cultivation in uracil-freemedium (lactose minimal medium – see below).

Cell cultivation and procedures

All experiments were carried out in an orbital shakerat 37 ◦C/200 rpm. YPD medium consists of 20 g pep-tone l−1, 10 g yeast l−1 extract and 20 g glucose l−1.Pre-inocula in lactose minimal media (1.6 g yeast ni-trogen l−1 base, 5 g (NH4)2SO4 l−1, 20 g lactosel−1) were used to inoculate 2 l flasks with 500 mlfresh media (minimal medium or sterile cheese whey)for an initial cell concentration of 0.3 g l−1. Thecultures were incubated for 36 h at the same condi-tions described above and samples were withdrawnat indicated intervals and harvested by centrifuga-tion. Biomass was analysed for cellular dry weightand plasmid stability and the supernatant was usedto measure external pH, substrate consumption andextracellular proteolytic activity.

Enzymatic activities and substrate consumption

Protein was measured by the Lowry method and lac-tose by the dinitrosalicylic acid (DNSA) method. Asno free glucose was observed in the whey by using theglucose oxidase kit (BioClin, Brazil), it was assumedthat DNSA measured the total lactose in the substrate.

Fig. 1. Shake flask fermentation of CBS6556 (closed symbols) andKMDB-1 (open symbols) strains in minimal medium containinginitial lactose concentrations of 10 g l−1 (O), 30 g l−1 (�) and60 g l−1 (�). Cultivation condition is described in Materials andmethods. The results represent the mean value of two experimentsfor each strain.

Extracellular acidic protease was measured accordingto Bergmeyer (1974) using azocasein as substrate.

Results and discussion

Batch growth of yeast cells in defined medium withdifferent lactose concentrations

Varying the initial lactose concentration (10 g l−1,30 g l−1, 60 g l−1) in minimal media had no effect onthe maximum specific growth rate for either the wildstrain or the recombinant KMDB-1 strain (Figure 1).As we used cheese whey with 36 g lactose l−1, thiswill have no significant catabolic repressive effect tothe cells.

Growth rate and biomass production in cheese whey

Wild type CBS6556 and the plasmid-bearing KMDB-1 strains grew at the same rate (Figure 2), suggestingthat the additional genetic load of the plasmid didnot affect cell physiology. The specific growth ratewas 0.34 h−1 with a yield of 5.5 g dry cell l−1 forboth strains (Figure 2). However, the maximum spe-cific growth rate of 0.34 h−1 for KMDB-1 strain washalf that of the same strain grown in glucose medium(Souza & Morais 2000). However, it was twice that re-ported of another K. marxianus strain grown in cheesewhey (Ben-Hassan et al. 1992).

No additional nitrogen source was required formaximum yeast growth, as supplementation of whey

1415

Fig. 2. Shake flask cultivation of the strains CBS6556 (O) andKMDB-1 (�) in cheese whey containing 36 g lactose l−1. Themedium was inoculated with 0.3 g cell l−1 and incubated at 30 ◦Cand 200 rpm. At defined times, samples were withdrawn and har-vested cells were used for dry weight (closed symbols) while thesupernatant was used for lactose consumption (open symbols) andpH variation (dashed lines). The results represent the mean value ofthree experiments for each strain.

Fig. 3. Fermentation profile of the strains CBS6556 (©,�) andKMDB-1 (�,�) for protein consumption (open symbols) and ex-tracellular protease activity (closed symbols). Conditions for cheesewhey fermentation and the reproducibility were as described inFigure 2.

with 5 g (NH4)2SO4 l−1 had no effect as growth (datanot shown). Biomass production of 5.5 g l−1 and a bio-mass yield (YX/S) of 1.6 g cells g−1 lactose shown heresuggests a good system for production of biomass-dependent bioproduct without any further additionalfermentation media costs.

Fig. 4. Plasmid stability of KMDB-1 recombinant strain (O) grownunder conditions mentioned in Figure 2. Plasmid stability in mini-mal (�) and YPD (�) media are shown as control. Mitotic stabilitywas evaluated by duplicate plate method using 300 to 500 cells perplate. The results represent the mean value of three experiments intriplicate plates for each transformant.

Protein consumption and protease activity in cheesewhey

Initial protein concentration in cheese whey was about3 g l−1, as measured by the Folin–Ciocalteau method.Whey protein consumption was observed during theexponential growth phase (up to 20 h of cultivation)and the same kinetics were observed for both wildtype and recombinant cells (Figure 3). Acidic proteaseactivity in the medium started to increase after 14 h ofincubation, at the same time whey protein was below1 g l−1 (Figure 3) and the pH value dropped to 4.6(Figure 1).

Plasmid stability

Plasmid mitotic stability was evaluated for K. marxi-anus recombinant strain since cheese whey does notimpose any selective pressure on these cells. Figure 4demonstrates that all KMDB-1 cells maintained theirplasmids during the first 12 h of cultivation. Plasmidpresence decreased to 75% (24 h) and 50% at the endof fermentation (still a high mitotic stability value con-sidering pDblet is a replicative plasmid). This result issimilar for KMDB-1 cells in YPD fermentation wherebatch cultures retained plasmids during cell growthbut started to lose them upon entry into the stationaryphase (Souza & Morais 2000).

Growth rate is one of the major determinants inselecting yeast strains for industrial, commercial orresearch use, especially if the products of interest are

1416

biomass-associated (Mason 1991). The presence ofchimeric plasmids may impose a metabolic burden onyeast cells, with an influence on the host cell growthas well as on substrate consumption. They promotea direct influence on the segregation rate, therebyaffecting plasmid stability (Romanos et al. 1992). Dif-ferent Kluyveromyces strains have been transformedwith chimeric vectors bearing the replication originand cis-stabilization of the natural episomal plasmidpKD1 from K. drosophilarum (Bergkamp et al. 1993).Although well established, this 2 µm-like vector needsa complementary endogenous fragment for long-term(e.g., fed-batch or continuous) fermentation (Hsieh& Da Silva 1998). Several strategies for stabiliz-ing pKD1-derivative vectors in yeast cells by usingresistance to geneticin (Chen 1996) or by inducing in-tegrated copies of the recombinase gene for plasmidamplification (Morlino et al. 1999) have been pro-posed. However, problems of stability of decreasedyields have arisen. We have previously shown thatpDblet was successfully maintained in batch fermen-tation compared to other replicative vectors reported(Souza & Morais 2000).

Our data suggest that the use of recombinantplasmid-bearing strains of Kluyveromyces marxianusto further process cheese whey has industrial poten-tial considering the absence in this system of negativeeffects (specific growth rate, plasmid stability, etc.)

Acknowledgements

This work was supported with grants from the Brazil-ian agencies CNPq ,CAPES (WML as Visiting Profes-sor) and FACEPE.

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_______________________________________ARTIGO CIENTÍFICO 3


DIMINUIÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA

β-GALACTOSIDASE EM Kluyveromyces marxianus CBS6556

POR ALTAS CONCENTRAÇÕES DE GALACTOSE

Artigo publicado na revista

Current Microbiology (ISSN 1432-0991).


___________________________________5 OUTROS RESULTADOS


5.1. Parâmetros fermentativos das células recombinantes

5.1.1. Biomassa celular e taxa específica de crescimento

Parâmetros como biomassa celular e taxa específica de crescimento são

indicativos da adaptabilidade do microrganismo ao meio de crescimento

adotado, além de representar um dos fatores mais visados na escolha de cepas

produtivas em escala industrial.

Em tempos definidos, amostras das células das linhagens estudadas

foram coletadas e centrifugadas, sendo o precipitado usado para da

estabilidade plasmidial e determinação da biomassa por peso seco, enquanto o

sobrenadante fora utilizado para determinação da concentração de proteína e

carboidrato, variação de pH e atividade proteásica.

A biomassa acumulada durante o crescimento das linhagens

recombinantes (KMDB-1 e KαAMY) no soro de queijo denotou não haver

diferença significativa quando comparada a biomassa obtida com a linhagem

selvagem CBS6556 sob mesmas condições (Figura. 7 e Figura 8). Este

resultado é um forte indicativo que as células da K. marxianus transformadas

pelos vetores construídos não apresentaram redução do seu tempo de

duplicação e capacidade de crescimento celular.

5.1.2. Consumo da lactose e proteína total

O consumo da lactose e proteína total das células recombinantes

cultivadas em soro de queijo foram monitorados visando avaliar se a

sobrecarga genética imposta pela presença do DNA dos vetores inseridos

comprometeria o perfil fermentativo das células transformadas. Os resultados

observados ao longo dos experimentos ratificaram que todos dos vetores

plasmidiais projetados não modificaram estes parâmetros quando as células


recombinantes foram comparadas à linhagem parental de K. marxianus (Figura

9 e Figura 10).

5.1.3. pH do meio de cultura

O pH inicial de 5.6 apresentado pelo soro de queijo utilizado enquadra-

se na faixa de crescimento da levedura K. marxianus, que pode variar de 2.6 a

6.0. A curva observada na figura 11 revela que, ao longo do cultivo, o pH do

meio atinge um patamar mínimo estável em 4.6 após as primeiras 12 horas de

crescimento. Este difere da variação de pH de culturas de K. marxianus em

glicose que atinge um valor em torno de 2,0 ao final da fermentação (Souza Jr.

e Morais Jr, 2000). Entretanto, este está em concordância com a variação em

meio rico com lactose. A presença de DNA plasmidial não influenciou nesta

variação de pH do soro de queijo durante a fermentação.

5.1.4. Estabilidade plasmidial

O estudo da estabilidade plasmidial nas linhagens recombinantes

permitiu averiguar a presença dos vetores plasmidiais ao longo das gerações

das células de KMDB-1 e KαAMY submetidas ao crescimento em soro de

queijo como substrato (Figura 12). Os resultados indicam que os dois

plasmídios adotados mostraram-se altamente estáveis nas primeiras 12h de

crescimento (100% de estabilidade). Estes perfis foram semelhantes ao

observado para o vetor pDblet em células de K. marxianus crescidas em meio

rico YPD (Souza Jr e Morais Jr, 2000).

5.1.5. Atividade enzimática intra e extra celular

O perfil enzimático intra e extra celular ao longo do crescimento das

linhagens estudadas no soro de queijo estéril foram obtidos através da


avaliação da atividade β-galactosidásica (β-gal) e pela atividade da protease

ácida, respectivamente. Os resultados sobre a atividade específica intracelular

entre as células selvagem e recombinantes (Figura 13) demonstraram um

aumento nas primeiras 4 horas de crescimento e outro após as 16 horas de

atividade, intercalados por um decréscimo, provavelmente relacionado com

uma ação inibitória do aumento de galactose intracelular causado pelo

metabolismo da lactose (Martins et al., 2002). Esse resultado é importante para

a determinação do período para a produção da β-galactosidase por fermentação

de soro de queijo.

Os resultados apresentados na Figura 14 demonstram uma baixa

atividade proteásica extracelular nas primeiras 12 horas de cultivo, seguida de

um aumento de cerca de 4 vezes. Isso sugere ser esse um período ótimo de

produção de proteínas secretadas no soro de queijo, sem haver hidrólise do

produto dos recombinantes pela protease extracelular. É importante mencionar

que durante as primeiras 12h de cultivo a estabilidade plasmidial é máxima

(Figura 12), permitindo maior produção de proteína heteróloga.

Fica claro, contudo, que estes parâmetros e considerações são apenas

válidos quando se leva em conta cultivos experimentais em batelada e em

bancada, fazendo-se primordial para avaliação de um processo em escala

industrial, condições onde altas concentrações celulares possam se obtidas e

uma conseqüência da atividade proteásica possa ser monitorada.


0,01

0,1

1

10

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 20 24 28 32 36

Tempo (h)

DO

600

Figura 8. Curva de crescimento das linhagens selvagem CBS6556 ( )

e recombinantes KMDB-1 (▲) e KαAMY (•) da levedura K.

marxianus em soro de queijo.

0,0

0,1

1,0

10,0

0h 4h 8h 12h

16h

20h

24h

32h

36h

Tempo(h)

Bio

mas

sa (g

/L)

Figura 7. Biomassa produzida pelo cultivo em soro de queijo das linhagens selvagem CBS 6556 ( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K. marxianus.


0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0h 2h 4h 6h 8h 12h 16h 20h 24h 36h

Tempo (h)

Pro

teín

a ex

trace

lar (

mg/

mL)

Figura 9. Consumo de proteína extracelular do soro de queijo entre as

linhagens selvagem CBS 6556 ( ) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY

(∆) da levedura K. marxianus.Os resultados representam valores médios de

experimentos em triplicata sob condições de cultivo descritas no tópico 6.2.1.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0h 4h 8h 14h 18h 22h 28h 36h

Tempo(h)

Con

cent

raçã

o de

Lac

tose

(mM

)

Figura 10. Consumo de lactose do soro de queijo entre as linhagens selvagem CBS

6556 (■) e das linhagens recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura

K. marxianus.


0

1

2

3

4

5

6

7

0 6 12 24 36

Tempo (h)

pH

Figura 11. Variação do pH do soro de queijo durante o cultivo das linhagens

selvagem CBS 6556 (∆)e recombinantes KMDB-1 (●) e KαAMY (□) da

levedura K. marxianus.

Figura 12. Estabilidade plasmidial dos vetores pDblet e pDαAmy em células de K. marxianus cultivadas em soro de queijo.

0

20

40

60

80

100

120

0 12 24 36

Tempo (h)

% p

lasm

ídio

+ cé

lula

s


0

4000

8000

12000

16000

0 2 4 6 8 12 16 20 24 28 32

Tempo (h)

Uni

dade

s β-

Gal

Figura 13. Atividade β-gal nos cultivos em soro de queijo das linhagens selvagem

CBS 6556 (■) e recombinantes KMDB-1 (•) e KαAMY (▲) da levedura K.

marxianus.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 12 16 20 24 36

Tempo (h)

Ativ

. Esp

ecífi

ca (U

/440

nm)

Figura 14. Atividade proteásica extracelular nos cultivos em soro de queijo

em linhagens selvagem CBS6556 (◊) e recombinantes KMDB-1 (▲) e

KαAMY ( ) da levedura K. marxianus. Os resultados representam valores

médios de experimentos em triplicata sob condições de cultivo descritas no

tópico 6.2.1.


________________________________________6. CONCLUSÕES


• Através de adaptações de métodos desenvolvidos para a levedura

Saccharomyces cerevisiae, melhores resultados de eficiência de

transformação em células de Kluyveromyces marxianus foram obtidos;

• Os altos níveis de lactose presentes no soro de queijo, assim como

variações entre níveis de lactose em soros de diferentes produtores não

mostraram influência significativa no desempenho da linhagem CBS 6556

e suas derivadas (mutantes e recombinantes) quanto ao rendimento em

biomassa;

• Células recombinantes da levedura Kluyveromyces marxianus portadoras

de vetores com genes heterólogos apresentaram comportamento em soro

de queijo idêntico ao de células recipientes com e sem vetores inseridos

revelando serem adequadas para processos laboratoriais;

• Os vetores plasmidiais quiméricos pDαamy e pDkan desenvolvidos neste

estudo não influenciaram negativamente sobre o crescimento das células

de K. marxianus, sobre o consumo do substrato e nem demonstraram ter

influência direta na estabilidade plasmidial pela presença dos genes

inseridos.


____________________________7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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