Apostila de Quimica
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIROINSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUíMICASETOR DE BIOQUÍMICA
Bioquímica ExperimentalBioquímica Experimental
Roteiros de Práticas e Fundamentos
Teóricos
2013
ESPECTROFOTOMETRIA
INTRODUÇÃO:
A espectrofotometria é uma técnica analítica que avalia a capacidade dos
solutos absorverem luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz
c = f X
absorvida permite, entre outras coisas, inferir sobre a concentração do soluto em
determinada solução ou material biológico.
Radiação Eletromagnética - Uma radiação eletromagnética, como a luz visível, pode
ser descrita (Figura 1):
Como uma onda constituída por um componente vetor elétrico e por um
componente vetor magnético
Como uma série de pacotes discretos de energia (fótons)
No primeiro caso, pode-se aplicar à radiação os parâmetros característicos de um
movimento ondulatório (comprimento de onda, frequência e número de ondas).
Figura 1: Representação esquemática de uma radiação eletromagnética. O campo elétrico
e o campo magnético são perpendiculares entre si e ambos oscilam perpendicularmente à
direção de propagação da onda, onde E é o campo elétrico e M o campo magnético.
A energia eletromagnética não precisa de um meio material para se propagar,
sendo definida como uma energia que se move na forma de ondas eletromagnéticas à
velocidade da luz (300.000 km/s). Dado que a velocidade de propagação das ondas
eletromagnéticas é diretamente proporcional à sua frequência e comprimento de onda,
esta pode ser expressa por:
Onde:
c: velocidade da luz (m/s)
f: frequência (ciclos/s ou Hz)
λ: comprimento de onda (m)
(1)
Comprimento de onda (λ) é a distância linear entre dois picos de ondas. As
unidades usadas para o comprimento de onda de uma radiação eletromagnética:
1 nanômetro (nm) = 10-9 m
1 micrômetro (µm) = 10-6 m
1 angstrom (Å) = 10-10 m = 10-8 cm
Frequência (f) é o número de ondas completas (ciclos) que passam por um
determinado ponto por segundo. Unidade: s-1
Número de ondas é o número de ciclos (ondas) por cm. Unidade: cm-1
Teoria de Planck e o espectro eletromagnético - A distribuição das radiações
eletromagnético existentes na natureza pela ordem dos seus comprimentos de onda
ou número de onda constitui o espectro eletromagnético.
Em que h é a constante de Planck = 6,62 x 10-27 erg.s. Combinando (1) e (2),
temos:
Assim a energia de cada fóton é proporcional à frequência e ao número de
onda e inversamente proporcional ao comprimento de onda (Figura 2).
Figura 2: Representação do espectro eletromagnético.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:
Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz e construção de curva
padrão.
I. DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO:
1. Objetivo:
Determinar o comprimento de onda ótimo (pico de absorção máximo) para o
corante indicado.
2. Princípio do método:
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um
procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies
químicas mediante a absorção de energia radiante (luz).
Fotometria é uma técnica de análise quantitativa que envolve a medida de
intensidade de absorção de luz monocromática de um composto químico em solução.
Serve para identificar o comprimento de onda característico para cada composto e
para quantificação do composto através de: 1) absorção direta e 2) através de método
colorimétrico.
As relações quantitativas nesta técnica são dadas pela combinação de duas
leis (Lei de Lambert-Beer):
Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa através de um meio
absorvente (sólido ou líquido), porções iguais deste meio irão absorver luz.
Lei de Beer: a absorção da luz é proporcional à concentração do soluto na
solução.
Então, a intensidade de absorção depende:
• do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λmáx – onde o composto
absorve mais luz);
• do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução;
• da concentração do composto nessa solução.
A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que:
A = ε.l.c
Onde: A = absorvância (definida pela reação seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma
razão, não possui unidade (Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz
transmitida);
ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1;
l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm;
c = concentração da substância em mol/L.
Figura 3: Io é intensidade de luz incidente; It é intensidade de luz transmitida após percorrer o
caminho óptico (l) pela solução da amostra.
Desta forma, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorvância torna-se
diretamente proporcional à concentração da substância no respectivo λmáx. A fração
de luz que passa por uma amostra (a transmitância = It/I0) está relacionada
logaritmicamente, e não linearmente, com a concentração da amostra (Figura 3).
Então, estabelecendo a relação:
A = log Io/It log 100/It log 100 – log It A = 2 – log It
Ou seja:
Quando Io = 100% A = 2 – log It
Quando It = 1 A = 2
Quando It = 100% A = 0
Quando It = zero A = ∞
A intensidade da radiação transmitida por uma substância é utilizada para a
sua determinação quantitativa. Essa é a base dos ensaios colorimétricos e
espectrofotométricos. Para descontarmos a absorvância do meio em que o soluto está
dissolvido (solventes como água, tampões, solventes apolares, etc) utiliza-se um
branco (que vai conter tudo que se tem no meio a ser medido a absorvância menos o
soluto).
• Espectrofotômetros – instrumento utilizado para medir a quantidade de luz de
um dado comprimento de onda que é transmitida por uma amostra (Figura 4).
LâmpadaMonocromador
Cubeta com amostra com c moles/litros da espécie a ser analisada
Intensidade da luz
incidente I0
Intensidade da luz
transmitida I
Detector
Figura 4: Principais componentes de um espectrofotômetro. Uma fonte (lâmpada) emite a
luz com uma grande faixa de espectro. Essa luz é selecionada por um monocromador que
transmite em um comprimento de onda específico. A luz monocromática passa através da
amostra em uma cubeta com caminho óptico l. Uma parte da luz é absorvida pela amostra
dependendo da concentração (quanto maior é a concentração da amostra maior será a luz
absorvida). A luz transmitida é medida por um detector.
Cubetas: uma vez selecionado o λ no qual se deseja fazer a análise, essa radiação
específica atravessará um recipiente, com caminho ótico definido, que contem a
amostra (cubeta). As cubetas de vidro são as mais baratas do que as de quartzo e por
isso devem ser usadas sempre que possível. No entanto o vidro absorve radiação na
faixa do UV e tem sua utilização limitada para a faixa de 360 a 800nm, enquanto as
cubetas de quartzo podem ser usadas de 200 a 800nm.
3. Reagentes e preparo das soluções:
Azul de metileno, alaranjado de metila, violeta cristal e vermelho de metila,
soluções 1 mg% (0,001%):
Dissolver 0,001 g do corante em 100 mL de água destilada (usar um balão
volumétrico).
4. Procedimento:
Branco: pipetar 3 mL do solvente (água) utilizado para solubilizar o corante na
cubeta de vidro;
Realizar a leitura no espectrofotômetro (zerar a leitura - branco);
Pipetar 3 mL da solução contendo o corante designado na cubeta de vidro;
Realizar as leituras e anotar as absorvâncias nos comprimentos de onda
relacionados abaixo:
CORANTE:
λ (nm) 400 420 440 470 500 530 570 600 630 660 690
ABS
II. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO (DETERMINAÇÃO DA LEI DE
LAMBERT-BEER):
1. Objetivo:
Construir uma curva padrão e determinar a concentração de uma amostra de
corante desconhecida.
2. Princípio do método:
Podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a ser
analisado (ou outra substância de características químicas semelhantes) para
construir um gráfico de absorvância em função da concentração da substância em
questão. Com este gráfico, denominado curva padrão, podemos medir a
quantidade da molécula (soluto) que absorve um determinado comprimento de luz
em amostras de concentração desconhecida, desde que, estas estejam nas
mesmo condições utilizadas para a construção da curva padrão (mesmos
reagentes, mesma temperatura, etc) (Figura 5).
Figura 5: Um exemplo de uma curva padrão. ABS x concentração (mol/L)
3. Reagentes e preparo das soluções:
Idem a seção anterior.
4. Procedimento:
Identificar 7 tubos de ensaio e colocá-los em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo;
TUBO B 1 2 3 4 5 D
Corante 1mg% (mL) 0 1 2 3 4 5 0
Amostra (mL) 0 0 0 0 0 0 5
Água destilada (mL) 5 4 3 2 1 0 0
ABS
Concentração (mg%)
Realizar as leituras no espectrofotômetro (tubos 1-5 e D) no comprimento de
onda ideal para o seu corante (volumes e procedimento similares ao efetuado
na prática anterior) e anotar os valores obtidos;
III. REGRESSÃO LINEAR E CONSTRUÇÃO DOS GRÁFICOS
Após a construção da curva padrão temos as absorvâncias para diferentes
diluições de uma solução de concentração conhecida (solução padrão). A absorvância
de uma solução é proporcional à concentração da solução e a distância percorrida
pelo feixe de luz através da solução (Lei de Lambert-Beer). Então, ao se construir o
gráfico com os dados obtidos acima (curva padrão), temos:
C1 = A1
C2 = A2
C3 = A3
...
CN = AN
Teoricamente, A1/C1 = A2/C2 = A3/C3 = AN/CN
No entanto, há dispersão dos pontos na prática, então, se traça a melhor reta, ou se
determina o coeficiente angular médio:
Segundo a equação da reta:
y = ax + b
(sendo a o coeficiente angular da reta e b o coeficiente linear)
Ou seja:
Onde:
A = absorvância;
C = concentração conhecida do padrão
C2
CN
AN
A3
A2
A1
C1 C3
A = . C + b (b = 0) ou = A/ C
Calcula-se o para cada concentração (1 = A1/C1; 2 = A2/C2 ....)
O médio é obtido a partir do somatório de todos os calculados e representa a
inclinação da reta.
Então:
Se = A/ C
C = A/
Pode-se calcular a Cd (desconhecida) com os seguintes dados:
Cd = Ad/ m
REFERÊNCIAS:
PETKOWICZ, C.L.O. Bioquímica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007.
CISTERNAS, J.R.; VARGA, J.; MONTE, O. Fundamentos de bioquímica
experimental. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 2005.
MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioquímica: práticas adaptadas. São Paulo:
Atheneu, 2008.
NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Práticas de laboratório de
bioquímica e biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2009.
MÉTODOS QUALITATIVOS DE ANÁLISE DE BIOMOLÉCULAS
INTRODUÇÃO:
Muitas moléculas biológicas são macromoléculas, que são polímeros de alto peso
molecular constituídos pela repetição de unidades menores, chamados monômeros.
Estas macromoléculas se apresentam em grande variedade quanto ao tamanho e
também quanto aos seus monômeros constituintes. Entre as macromoléculas de maior
importância estão as proteínas, formadas por aminoácidos; os polissacarídeos
(carboidratos), polímeros de açúcares simples, como a glicose; e os ácidos nucléicos
(DNA e RNA), constituídos por nucleotídeos. Além destas macromoléculas, moléculas
menores como lipídios, água, sais minerais e vitaminas também possuem um importante
papel na constituição e função celular. Embora moléculas individuais de lipídios sejam
muito menores do que proteínas, ácidos nucléicos e carboidratos, estes também
apresentam unidades monoméricas e muitos podem se associar não covalentemente
formando agregados maiores. A bioquímica preocupa-se com o estudo tanto da
constituição destas biomoléculas como a importância biológica dos processos e
interações destas. A identificação destas biomoléculas, assim como o conhecimento de
suas características e propriedades é um passo essencial para o entendimento destes
processos.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:
Identificar a presença de diferentes biomoléculas (proteínas, lipídios, ácidos
nucleicos, carboidratos e também aminoácidos) em amostras biológicas através de
reações específicas.
Nesta prática cada grupo irá receber um conjunto com 6 amostras e deverá
identificar para cada amostra se esta é um lipídio, uma proteína, um aminoácido, um
carboidrato ou um ácido nucléico. Para atingir este objetivo serão realizados os testes
qualitativos descritos abaixo.
A. TESTE PARA LIPÍDIOS (TESTE DE SOLUBILIDADE EM ÁGUA):
1. Objetivo:
Identificação da presença de lipídios nas amostras desconhecidas.
2. Princípio do método:
Os lipídios são moléculas com grande variedade estrutural e funcional, no
entanto, estas substâncias são caracterizadas pela baixa solubilidade em água e
outros solventes polares, e alta solubilidade em solventes apolares.
3. Procedimento:
Identificar 7 tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma
estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “controle positivo do teste” usando uma amostra de óleo.
TUBOLipídio
(mL)
Amostra
(mL)Água
Resultados
CP 1,0 - 2,0
A no__ - 1,0 2,0
A no__ - 1,0 2,0
A no__ - 1,0 2,0
A no__ - 1,0 2,0
Legenda: CP (controle positivo); A (amostra).
No teste é considerado positivo para a presença de lipídios quando houver a
formação de duas fases.
B. TESTE PARA PROTEÍNAS (REAÇÃO DO BIURETO)
1. Objetivo:
Identificar a presença de proteínas nas amostras desconhecidas.
2. Princípio do método:
Proteínas e peptídeos com no mínimo três aminoácidos, na presença do
“Reativo de Biureto” desenvolvem uma coloração púrpura. Este método é baseado na
reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de Biureto) com proteínas e
peptídeos. O nome do método provém do fato de que a uréia aquecida a 180oC forma
um composto chamado Biureto. Este composto na presença de íons de cobre em meio
fortemente alcalino formará um composto de cor azul.
Figura 14: Reação do Biureto.
Quando o composto contém duas ou mais ligações peptídicas, produz um
complexo cobre-proteína ou cobre-peptídeo de cor púrpura ou azul-violeta, que
absorve luz a 545 nm. A intensidade de cor produzida é proporcional ao número de
ligações peptídicas que estão reagindo, portanto, a quantidade de proteínas presentes
pode ser determinada. Quando a solução possuir elevada concentração de peptídeos
Uréia Biureto Complexo com cobre
(tri-, oligo- e polipeptídeos) a coloração desenvolvida será rosa a avermelhada. A
sensibilidade do método é de 0,5 a 5 mg/mL.
3. Reagentes e preparo das soluções:
Reagente de Biureto:
Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio
(C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água;
Adicionar 300 mL de NaOH 10%;
Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de
solução. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.
Solução padrão de caseína 1%:
1. Dissolver 2 g de caseína em 200 mL de água destilada. Aliquotar em frações
de 10 mL e conservar a –20oC.
4. Procedimento:
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma
estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle
positivo do teste” usando caseína (uma proteína encontrada no leite).
TUBOÀgua(mL)
Caseína10 mg/mL
(mL)
Amostra(mL)
Reativo do
Biureto(mL)
Resultados
B 1,0 - - 4,0CP - 1,0 - 4,0
A no__ - - 1,0 4,0A no__ - - 1,0 4,0A no__ - - 1,0 4,0
Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra).
Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em
repouso por 30 minutos;
No teste é considerado positivo se a amostra desenvolver uma
coloração púrpura de forma semelhante ao controle positivo (porém a
intensidade depende da concentração de proteína, como veremos em
práticas posteriores.
O
O
H
H
H
H
OH
OH
O
O
H
H
H
H
OH
OHO
NH3+
O-
R
+ +
CO2 +O
H
H
+ H2O + H+
O
O
N
H
H
H
H
O
O
H
H
H
H
ninidrina
aminoácido
Pigmento púrpura
C. TESTE PARA AMINOÁCIDOS (REAÇÃO DA NIHNIDRINA)
1. Objetivo:
Identificar a presença de aminoácidos nas amostras desconhecidas.
2. Princípio do método:
O grupo amino dos aminoácidos é muito resistente à hidrólise, porém pode ser
removido facilmente por oxidação. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) é um
poderoso agente oxidante causando a desaminação oxidativa de -aminoácidos
produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um carbono a menos que o aminoácido inicial
(Figura 6). Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e outra
molécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta absorção
máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base para um
teste quantitativo extremamente útil. Outras aminas, além dos -aminoácidos, também
reagem com a ninhidrina dando uma coloração azul, mas sem a liberação de CO2.
Cabe ressaltar que o produto da reação de iminoácidos, como a prolina e
hidroxiprolina, com ninhidrina apresenta coloração amarela ao invés de roxa, cujo
máximo de absorção ocorre em = 440 nm. Neste caso não há liberação de NH3,
porém há produção de teores quantitativos de CO2.
Figura 6: Esquema geral da reação de aminoácidos com ninhidrina.
3. Reagentes e preparo de soluções
Ninhidrina 0,25%
Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.
Alanina 0,1 M
Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em água destilada e avolumar para um balão
volumétrico de 100 mL
Prolina 0,1M
Pesar 2,30 g de L-prolina, dissolver em água destilada e avolumar para um balão de
200 mL.
4. Procedimento:
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma
estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle
positivo do teste” usando o aminoácido alanina e um controle positivo para prolina ou
alanina que resultam em uma coloração amarela.
Tubo Água(mL)
Alanina 0,1 M(mL)
Prolina 0,1 M (mL)
Amostra(mL)
Ninhidrina 0,25% (gotas)
Resultados
B 1,0 - - - 5CP1 - 1,0 - - 5CP2 - - 1,0 - 5
A no__ - - - 1,0 5A no__ - - - 1,0 5
Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C
por 3 minutos;
No teste é considerado positivo para a presença de aminoácidos quando
ocorre a formação de uma coloração rosa (no caso da maioria dos aminoácidos) e
para iminoácidos (prolina) ou cisteína coloração amarela.
D. TESTE PARA CARBOIDRATOS (REAÇÃO DA ANTRONA):
1. Objetivo:
Identificar a presença de carboidratos nas amostras desconhecidas.
2. Princípio do método:
O reagente de antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor
liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso de
oligo e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se a
monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante levando
à formação de hidroximetilfurfural e furfural que, na presença de antranol, dão
produtos de condensação coloridos.
Figura 7: Reação de Antrona.
O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses produz uma
substância de coloração verde musgo relativamente estável enquanto que o furfural
proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor análoga, mas que
em alguns minutos se torna vermelho-amarelada ou rubi.
3. Reagentes e preparo das soluções:
Reativo Antrona
Pesar 0,2 g de antrona (C14H10O) e dissolver em 100 mL de ácido sulfúrico (H2SO4)
95%.
Glicose 2 mg/mL
Pesar 0,2 g de glicose dissolver em água destilada e avolumar para um balão
volumétrico de 100 mL.
4. Procedimento:
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma
estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água e um “controle
positivo do teste” usando glicose.
TUBOÁgua
(mL)
Glicose
2 mg/mL
(mL)
Amostra
(mL)
Reagente de
Antrona
(mL)
Resultados
B 0,1 - - 0,5
CP - 0,1 - 0,5
OC C
H
OH
HO
H
OH
OC C
H
OH
H
H
OH
OH
OC C
H
OH
H
H
OH
OH
hidroximetilfurfural antranol
Complexo verde musgo
A no__ - - 0,1 0,5
A no__ - - 0,1 0,5
Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra).
Em banho de gelo, adicionar o reagente de Antrona e deixar por 5 minutos;
Aquecer em banho fervente (100oC) por 10 minutos;
No teste é considerado positivo para a presença de carboidratos quando ocorre
a formação de uma coloração verde.
REFERÊNCIAS:
MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioquímica: práticas adaptadas. São Paulo: Atheneu, 2008.
DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª Edition. W.
H. Freeman and Company. New York.
ANÁLISE QUALITATIVA DE AMINOÁCIDOS
1. Objetivo:
Identificar a presença de aminoácidos nas amostras desconhecidas.
2. Princípio do método:
O grupo amino dos aminoácidos é muito resistente à hidrólise, porém pode ser
removido facilmente por oxidação. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) é um
poderoso agente oxidante causando a desaminação oxidativa de -aminoácidos
produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um carbono a menos que o aminoácido inicial
(Figura abaixo). Então, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e
outra molécula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta
absorção máxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condições padrão, é a base
para um teste quantitativo
extremamente útil. Outras aminas,
além dos -aminoácidos, também
reagem com a ninhidrina dando uma
coloração azul, mas sem a liberação
de CO2.
Cabe ressaltar que o produto da
reação de iminoácidos, como a
prolina e hidroxiprolina, com
ninhidrina apresenta coloração
amarela ao invés de roxa, cujo máximo de absorção ocorre em = 440 nm. Neste
caso não há liberação de NH3, porém há produção de teores quantitativos de CO2.
3. Reagentes e preparo de soluções
Ninhidrina 0,25%
Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.
Alanina 0,1 M
Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em água destilada e avolumar para um balão
volumétrico de 100 mL
Glicina 0,1M
Pesar 2,30 g de L-glicina, dissolver em água destilada e avolumar para um balão de
200 mL.
4. Procedimento:
Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma
estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:
Obs. Note que você fará um “branco de reação” usando apenas água
Tubo Amostra/Concentração Volume - mL Ninhidrina 0,25% - (gotas)
1 Água 1,0 5
2 Triptofano 0,1 M 1,0 5
3 Alanina 0,1 M 1,0 5
4 Leucina 0,1 M 1,0 5
5 Aspartame 4 %* 1,0 5
6 Solução protéica 1,0 5
* Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil éster), adoçante 200 vezes mais potente do
que o açúcar. Dissolver o conteúdo de um envelope em 20 mL de água destilada.
Após a adição da ninhidrina, aquecê-los em banho-maria a 100º C
por 3 minutos;
No teste é considerado positivo para a presença de aminoácidos quando
ocorre a formação de uma coloração rosa (no caso da maioria dos aminoácidos) e
para iminoácidos (prolina) ou cisteína coloração amarela.
I. CROMATOGRAFIA EM PAPEL
1. Objetivo:
No caso desta aula prática confirmar a identidade do aminoácido presente na
amostra dada ao grupo. Porém, cabe ressaltar que esta técnica pode ser usada para
separação e detecção de aminoácidos presentes em misturas.
2. Princípio do método:
As técnicas de cromatografia em geral são utilizadas para separação e purificação
de várias classes de biomoléculas, porém o tipo de cromatografia e o protocolo variam
com o objetivo e características/tipo de amostra. No entanto, todos os tipos de
cromatografia baseiam-se na interação da amostra a ser analisada (soluto) com duas
entidades físicas distintas: a fase móvel (que pode ser gasosa ou líquida), e a fase
estacionária. A fase móvel move a amostra pela fase estacionária e a separação dos
componentes depende da sua distribuição e interação diferencial com a fase móvel
e/ou com a fase estacionária.
Na presente aula prática, usaremos cromatografia em papel (CP), técnica usada
para separação, detecção e caracterização de aminoácidos e que constitui uma das
técnicas cromatográficas mais simples e que requer menos instrumentos para sua
realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em
termos analíticos.
Para iniciar o processo a(s) amostra(s) contendo o(s) aminoácido(s) é(são)
aplicada(s) em uma fase estacionária (no caso, o papel) na parte inferior marcada por
uma linha à lápis (origem). Os pontos de aplicação de cada amostra são secos e
aplica-se novamente a respectiva amostra a cada ponto várias vezes, secando sempre
o papel antes da próxima aplicação (Figura 3). Finalmente, o papel com as amostras
secas é posto em uma câmara tendo a extremidade inferior em contato com o solvente
(que pode ser uma mistura de solventes e água), porém sem permitir que os pontos
onde as amostras foram aplicadas tenha contato direto ou seja submerso pelo
solvente contido no recipiente. Assim, o solvente se difunde pelo papel por
capilaridade, os componentes da amostra se distribuem pelas fases móvel (solvente) e
estacionária (papel) de acordo com sua solubilidade (Figura 11).
O papel é composto por moléculas de celulose que possuem uma forte
afinidade pela água presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela
fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária aquosa
(polar). A medida que o solvente contendo o soluto flui através do papel, uma partição
deste composto ocorre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e a fase estacionária
aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase móvel.
Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o
fenômeno de partição ocorre novamente, só que agora o soluto é transferido da fase
móvel para a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta
partição entre as fases móvel e estacionária possibilita a transferência do soluto do
seu ponto de aplicação no papel, para outro ponto localizado a alguma distância do
local de aplicação no sentido do fluxo de solvente.
Como os aminoácidos diferem no grupamento R, possuem diferentes
solubilidades, propriedade usada para sua separação no presente método,
apresentando portanto diferentes taxas de migração (Rf). A detecção (Figura 3) se dá
através de agentes capazes de revelar os aminoácidos em geral (como ninhidrina) ou
específicos para determinados aminoácidos (como Sakaguchi para arginina, Pauly
para histidina e Nitroprussiato para cisteína).
3. Reagentes e preparo das soluções:
Solvente de Partridge (n-butanol/ácido acético glacial/água 4:1:1)
Misturar 400 mL de n-butanol com 100 mL de ácido acético glacial e 100 mL de água
Ninhidrina 0,25%
Pesar 0,25g de ninhidrina e dissolver em acetona até completar o volume de 100 mL.
4. Procedimento:
Traçar linhas (bem leves) de lápis, a 2 cm da borda inferior e 1,0 cm da borda
superior do papel de filtro. Evitar tocar no papel durante toda a operação. As
amostras devem ser aplicadas (com tubos capilares) nos pontos numerados de
tal modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possível.
Aplique a amostra em um ponto do papel conforme o desenho:
P1 P2 P3 M
2,0 cm
Seque as amostras (pode ser usado um secador).
Front
Colocar o papel em uma cuba apropriada contendo o solvente de Partridge.
Tome o cuidado de não tocá-lo com os dedos e não encostar na parede da
cuba.
Fechar a cuba. Deixar o solvente migrar até 1,0 cm da borda superior.
Retirar o papel. Deixar secar à temperatura ambiente.
Pulverizar a tira de papel com a solução reveladora de Ninhidrina e levar à
estufa (60°C) por 15 minutos.
Após revelação, calcular o RF dos padrões e da mistura, para sua
identificação.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA
AMOSTRA BIOLÓGICA PELO MÉTODO DO BIURETO
Métodos de determinação da concentração de proteínas
A determinação da concentração de proteínas em materiais biológicos é necessária
em diversas situações, como na purificação de uma determinada proteína a partir de um
extrato de material biológico para o estudo de suas propriedades e funções, ou na
avaliação dos níveis de certas proteínas que têm suas quantidades alteradas em
determinadas situações patológicas.
Existem diversos métodos para a determinação do conteúdo total de proteínas em
uma amostra. Suspensões puras de proteínas apresentam absorção de luz de
comprimento de onda abaixo de 230 nm com absorção máxima a 220 nm,
correspondente principalmente às ligações peptídicas. Entretanto, já que outros
compostos como ácidos carboxílicos, íons de tampão, alcoóis, bicarbonato e
substâncias aromáticas também absorvem nesta região, os resultados obtidos devem
ser interpretados com cuidado. As proteínas também absorvem luz ultravioleta em
comprimentos de onda próximos a 280 nm que correspondem a presença de tirosina
(275 nm), triptofano (280 nm) e fenilalanina (260 nm) nas moléculas. Como o teor destes
aminoácidos varia entre diferentes proteínas, a absorção a 280 nm será particular de
cada grupo de proteínas. A quantificação de proteínas através da absorção a 280 nm é
uma técnica rápida e eficiente, entretanto ela está sujeita a interferências,
particularmente de ácidos nucléicos que exibem absorção máxima a 260 nm. Outros
métodos bastante comuns baseiam-se no conteúdo de nitrogênio de proteínas (todas as
proteínas possuem um conteúdo médio de nitrogênio de 16%), como o “método de
Kjeldahl”, ou na reação de sulfato de cobre em meio alcalino com proteínas, que fornece
um produto de coloração púrpura, como no “método do Biureto”. Também bastante
utilizado, o “método de Folin-Lowry” apresenta modificações ao método do Biureto.
Neste método, após a realização do método do Biureto é adicionado à reação o
reagente de Ciocalteau (ácido fosfotúngstico fosfomobilídico) que é reduzido pela
tirosina presente nas moléculas de proteínas. Nesta reação a coloração desenvolvida é
mais muito mais intensa, tornando o método 100 vezes mais sensível do que o método
do Biureto, sendo este bastante útil para amostras muito diluídas.
Todos os métodos possuem vantagens e limitações, portanto a escolha deve
ser cautelosa e levar em consideração os diversos fatores relativos aquela analise,
como, por exemplo, as características da amostra e a disponibilidade de recursos
como equipamentos e reagentes.
Nesta prática será realizado o método do Biureto, que será descrito em
maiores detalhes a seguir.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:
Construir uma curva padrão de proteínas e determinar a concentração de
proteínas totais em uma amostra biológica desconhecida pelo método do Biureto.
I. CONSTRUÇÃO DE UMA CURVA PADRÃO E DETERMINAÇÃO DA
CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA:
1. Objetivo:
Determinação da concentração de proteínas através da formação de produtos com
coloração que poderão ser quantificados por espectrofotometria.
2. Princípio do método:
Este método é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de
Biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos). Maiores detalhes podem
ser encontrados no roteiro da aula “Análise Qualitativa de Biomoléculas”.
3. Reagentes e preparo das soluções:
Reagente de Biureto:
Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sódio e potássio
(C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de água;
Adicionar 300 mL de NaOH 10%;
Adicionar água destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de
solução. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.
Solução padrão de caseína 1% (10 mg/mL):
2. Pesar 1g de caseína, dissolver com aproximadamente 70mL de água destilada
e depois adicionar hidróxido de sódio 1M até a solução tornar-se límpida e
completar o volume para 100mL. Aliquotar em frações de 10 mL e conservar a
–20oC.
4. Procedimento:
A) Construção da curva padrão (ou curva de calibração) e determinação
da concentração de proteínas em uma amostra biológica de concentração
desconhecida
Identificar 7 tubos de ensaio e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela seguinte:
Tubo (No)H2O(mL)
Caseína 10 mg/mL
(mL)
Amostra Reativo de Biureto
(mL)
Abs.540 nm
B 1,0 0 - 4,01 0,8 0,2 - 4,02 0,6 0,4 - 4,04 0,4 0,6 - 4,05 0,2 0,8 - 4,06 - 1,0 - 4,07 - - 1,0 4,0
Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em
repouso por 30 minutos (a coloração púrpura formada é indicativa da presença
de proteínas);
Neste momento, inicie a realização do protocolo seguinte (abaixo) para
a determinação da concentração de proteínas na amostra de concentração
desconhecida que seu grupo recebeu no inicio desta aula;
REFERÊNCIAS:
PETKOWICZ, C.L.O. Bioquímica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007.
NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Práticas de laboratório de bioquímica e
biofísica: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009.
DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª
Edition. W. H. Freeman and Company. New York.
CINÉTICA E NZIMÁTICA
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:
Determinação da atividade enzimática da invertase de levedura.
I. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇUCAR REDUTOR:
1. Objetivo:
A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para
determinar a concentração de glicose produzida pela reação da invertase.
2. Princípio do experimento:
As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua grande
maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatíveis
com as exigências metabólicas.
A enzima escolhida para este estudo é justamente a invertase da levedura
que catalisa a hidrólise da sacarose para produzir glicose e frutose:
C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6
sacarose água glicose frutose
Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µg) de açúcar redutor
formado, por um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidade
correspondente (µg) sacarose hidrolisada.
Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da
reação que catalisa utilizando um valor KM, que é a concentração de substrato
necessária para se atingir metade da velocidade máxima da reação catalisada pela
enzima em questão. Um modelo da reação onde a enzima interage com o substrato
está fornecido abaixo:
E + S ES E + P
onde E é a enzima, S é o substrato, ES é o complexo enzima-substrato e P é o
produto da reação. Observe que a enzima é devolvida ao meio na mesma proporção
em que foi utilizada na reação à esquerda.
Michaelis e Menten, com essas considerações, desenvolveram a expressão
de velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e desta forma puderam
descrever o comportamento de diversas enzimas.
V = Vmáx * [S] KM + [S]
onde [S] é a concentração do substrato e Vmáx é a velocidade máxima da
reação, em mol (de produto formado) por unidade de tempo.
Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermédio da
"invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e
frutose, açúcares esses que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é
impermeável à sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma
exoenzima) para a hidrólise ocorrer fora da célula de levedura.
Hidrólise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose são açúcares
redutores.
No presente experimento a invertase será obtida de levedura de
panificação (fermento Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor),
cuja hidrólise resulta na formação de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão
estimados pela reação de Somogyi-Nelson.
Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de
substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reação enzimática,
permitindo, mediante um tratamento matemático adequado, determinar graficamente
os valores de Km e Vm para a reação enzimática da levedura.
II. CONSTRUÇÃO DA CURVA PADRÃO DE AÇUCAR REDUTOR:
3. Objetivo:
A construção da curva padrão de açúcar redutor (glicose) servirá para
determinar a concentração de glicose produzida pela reação da invertase.
O
CH2OH
H
OH
H
H
OH
H
OH
H
O
H
OHH
OH
CH2
CH2OH
HOHO
SACAROSE(NÃO REDUTOR)
O
CH2OH
H
OH
H
H
OH
OH
H
OH
HHO
H
OHH
OH
CH2
CH2OH
HO
H
GLICOSE
+
FRUTOSE
REDUTORES
4. Princípio do experimento:
A invertase é uma enzima hidrolítica que catalisa a hidrólise da sacarose, dando
como produto a glicose e a frutose. A sacarose é um dissacarídeo não-redutor assim
para cada molécula de sacarose hidrolisada, duas moléculas redutoras são formadas.
Figura 19: Esquema geral da reação da invertase.
O nome da invertase foi dado a esta enzima porque ao hidrolisar a sacarose
liberando glicose e frutose, ocorre uma inversão do sinal da rotação óptica de positivo
para negativo sendo denominado açúcar invertido. A sacarose tem um desvio de
+66,5, a glicose de +52,7 enquanto o desvio da frutose é de -92, portanto após a
hidrólise, a rotação óptica que era de 66,5 passa a ser -39,3.
As propriedades químicas da sacarose e do açúcar invertido são bem
diferentes quanto ao poder edulcorante, solubilidade, poder redutor.
As enzimas que catalisam a hidrólise da sacarose são largamente distribuídas.
As mais conhecidas são a invertase de leveduras e a sacarase intestinal.
Sendo um açúcar não redutor, pode-se medir a atividade hidrolítica da enzima pelo
aparecimento de açúcar redutor (glicose mais frutose) após a incubação com a
enzima. Para determinar a quantidade de açúcar redutor formado, basta utilizar uma
curva-padrão de açúcar redutor elaborado nas mesmas condições.
5. Reagentes e preparo das soluções:
Reativo de Somoggy
Dissolver 28 g de fosfato dissódico anidro (Na2HPO4) e 40 g de tartarato duplo
de sódio e potássio (C4H4O6NaK) em 500 mL de água destilada; adicionar 100 mL
de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M, dissolver 8 g de sulfato de cobre cristalizado em
80 mL de água destilada e adicionar lentamente com agitação. Após, acrescentar
180 g de sulfato de sódio anidro (Na2SO4), homogeneizar e completar o volume
para 1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar se
necessário. Manter em frasco âmbar.
Reativo de Nelson
Dissolver 50 g de molibdato de amônio [(NH4) MoO4] em 800 mL de água
destilada; adicionar 52 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado lentamente com
agitação. Após, dissolver 3 g de arseniato de sódio (Na2HAsO4.7H2O) em 50 mL de
água destilada, adicionar à solução acima e homogeneizar. Completar o volume
para 1000 mL em um balão volumétrico. Deixar em repouso por 2 dias, manter em
frasco âmbar.
Glicose 0,02% (0,2 mg/mL)
Pesar 0,02 g de glicose, dissolver em água destilada e completar o volume
para 100 mL em um balão volumétrico.
6. Procedimento:
Identificar 6 tubos de ensaio, colocar em uma estante e adicionar os reagentes
conforme a tabela abaixo:
Tubo
s
H2O
(mL)
Glicose
0,2
mg/mL
Reativo
de
Somogg
Agitar bem e
levar ao
banho-maria
fervente
(100C) por
10 min
Reativo
de
Nelson
H2O
(mL)
Glicose
(mg)
ABS
(530
nm)B 1,0 0 1,0 1,0 7,0
1 0,8 0,2 1,0 1,0 7,0
2 0,6 0,4 1,0 1,0 7,0
3 0,4 0,6 1,0 1,0 7,0
4 0,2 0,8 1,0 1,0 7,0
5 0 1,0 1,0 1,0 7,0
Esta curva servirá para determinar a concentração do açúcar redutor produzido
a partir da sacarose por ação da invertase;
Com os dados obtidos construir a curva-padrão (absorvância x concentração
de glicose).
III. CONSTRUÇÃO DA CURVA DE MICHAELIS-MENTEN E CÁLCULO DO
GRÁFICO DE LINEWEAVER-BURK:
1. Objetivo:
Determinação dos parâmetros cinéticos Km (constante de Michaelis) e Vmáx
(velocidade máxima) através da construção dos gráficos de Michaelis-Menten e de
Lineweaver-Burk.
.
2. Reagentes e preparo das soluções:
Os mesmos utilizados nos experimentos anteriores.
3. Procedimento:
Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:
Tampão*
(mL)
Sacarose
0,4 M
(mL)
Enzima
(mL) Agitar
bem e
levar ao
banho-
maria
por 15
min.
A 37oC
Reativo de
Somoggy
(mL)
Agitar bem
e levar ao
banho-
maria
fervente
(100C) por
10 min
Reativo de
Nelson
(mL)
H2O
(mL)
Absorvância
a 530 nm
B1 2,3 0,2 - 1,0 1,0 5,5
1 1,8 0,2 0,5 1,0 1,0 5,5
B2 2,1 0,4 - 1,0 1,0 5,5
2 1,6 0,4 0,5 1,0 1,0 5,5
B3 1,7 0,8 - 1,0 1,0 5,5
3 1,2 0,8 0,5 1,0 1,0 5,5
B4 0,9 1,6 - 1,0 1,0 5,5
4 0,4 1,6 0,5 1,0 1,0 5,5
B5 0,5 2,0 - 1,0 1,0 5,5
5 0 2,0 0,5 1,0 1,0 5,5
Construir os gráficos: velocidade x concentração de sacarose (Gráfico de
Michaelis-Menten) e 1/V x 1/S (Gráfico de Lineweaver-Burk ou duplo-recíproco).
1. Agora com seus dados experimentais complete a tabela abaixo:
tubo [sacarose] (M) Atividade
(g/mL/min)
1
2
3
4
5
2 Construa o gráfico de Michaelis-Menten (curva de sbstrato) em papel milimetrado.
3. Calcule os inversos e complete a tabela abaixo
tubo 1/[sacarose] 1/atividade
1
2
3
4
5
4. Construa o gráfico de Lineweaver-Burk (duplo recíproco) em papel milimetrado.
5. Calcule a constante de Michaelis e a velocidade máxima da enzima
ANÁLISE QUALITATIVA DE CARBOIDRATOS
Propriedades Químicas dos carboidratos
Diferentemente dos aminoácidos que apresentam reações específicas
baseadas principalmente na natureza química de seu radical, os carboidratos
apresentam estruturas muito parecidas entre si o que os torna quase impossíveis de
identificá-los.
Neste caso o que se faz é caracterizar grupos de carboidratos utilizando suas
propriedades químicas comuns.
As reações mais utilizadas na prática estão baseadas em 2 dessas propriedades:
1) Desidratação de carboidratos por ácidos fortes
OC C
H
OH
HO
H
OH
OC C
H
OH
H
H
OH
OH
OC C
H
OH
H
H
OH
OH
OHOH2C
H
H
CH2OHOH H
OHH
OHOH2C
COH
HH
OH
OH
Hexoses e pentoses colocadas nestas condições são desidratadas,
respectivamente a hidroximetilfurfural e furfural; estes compostos são capazes de se
condensar com substâncias fenólicas, com aminas aromáticas, tiocompostos, uréia.
Os complexos formados são, algumas vezes, coloridos e utilizados para a
caracterização de certos grupos glicídicos. Neste caso, situam-se:
A) Reação de antrona
Teste geral de glicídios
O reagente de antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O
calor liberado pela diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso
de oligo e polissacarídeos, o ácido atua como catalisador de hidrólise convertendo-se
a monossacarídeos (hexoses e pentoses) e também como agente desidratante
levando a formação de hidroximetilfurfural e furfural que, em presença de antranol, dão
produtos de condensação coloridos.
O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses
produz uma substância de coloração verde azulada realtivamente estável enquanto
que o furfural proveniente da desidratação de pentoses fornece um produto de cor
análoga, mas que em alguns inutos se torna vermelho-amarelada ou rubi.
O teste de antrona é muito sensível e pode ser usado, quando modificado, para a
quantificação de glicídios.
B) Reação de Seliwanoff
Teste de diferenciação entre aldoses e cetose
A reação é feita com resorcinol em meio de HCl à quente. As cetohexoses dão
um produto de coloração vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses
correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que cetohexoses são
desidratadas e reagem com o resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses
fornecem apenas um produto levemente rosa.
+
hidroximetilfurfural antranol
Complexo verde azulado
COH
H
C H H
OH
COH
H
C
OHC
H
OH
OH
COH
HH
CH3
OHHO
C) Reação de Bial
Teste para a identificação de pentoses e certos ácidos urônicos (galacturônico,
glicurônico e outros) que se decompõem durante o aquecimento em presença de H+,
formando pentoses.
O reagente consiste de orcinol em meio de HCl concentrado e em presença de
íons Fe+3. O furfural proveniente da desidratação de pentoses quando aquecido em
presença do reagente de Bial fornece uma cor verde. O hidroximetilfurfural (hexoses)
reage formando um produto diferente que oscila entre amarelo e marrom.
O teste de Bial foi modificado a permitir quantificar pentoses, trioses e o ácio 5-
cetoaldônico. As cetoheptoses fornecem produtos de coloração púrpura, as
cetohexoses e metilpentoses formam inicialmente um produto de cor laranja que em
repouso, posteriormente, precipita apresentando uma cor verde.
2) Poder redutor
Os açucares contêm grupos aldeídos e cetonas capazes de reduzir sais de metais
pesados; desses os sais mais usados são dos de Cu+2.
O princípio fundamental de todos os procedimentos analíticos que utilizam Cu+2 é sua
dissolução em meio alcalino em presença de ácidos orgânicos (como ácido c´trico e o
ácido tartárico) capazes de formarem complexos. Também podem ser empregados
outros ácidos orgânicos como EDTA, ácido láctico, ácido trihidroxiglutárico ou ácido
sacárico.
+
cetohexosehidroximetilfurfural
H2O
resorcinol
Produto de coloração vermelha
2H2O
Produto de coloração verde
pentose furfural orcinol
+
A reação de formação do complexo ocorre em geral em meio fortemente
alcalino e isto promove profundas modificações na estrutura do açúcar. Os açucares
apresentam um poder redutor diferente sobre o íon Cu+2. Isso significa que dois tipos
de hexoses em uma mesma concentração fornecem quantidades diferentes de óxido
cuproso (produto final da reação). A quantidade de íons cobre reduzida pelos
diferentes glicídios é função do pH, da temperatura, da concentração e dos tipos de
glicídios e íons orgânicos complexantes.
Há diversos métodos para a determinação de teor de Cu2O, os mais utilizados
para a determinação em material biológico, são os colorimétricos que utilizam o Cu2O
dissolvido em excesso de reagentes como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsênio-
molibdato, formando um complexo azul. Dentre os testes baseados em poder redutor
de glicídio destacam-se:
A) Teste de Benedict
Teste geral de glicídio redutores.
O reagente consiste de uma única solução onde estão presentes íons Cu+2, citrato
e carbonato de sódio. A reação é complexa e influenciada por uma série de fatores
podendo ser esquematizada por:
B) Teste de Barfoed modificado
Teste de diferenciação entre monossacarídeos e dissacarídeos redutores
A reação é feita usando-se acetato de cobre em meio de ácido láctico
(reagente de Barfoed) a quente e por 30 segundos; o produto formado nesta primeira
etapa é posteriormente revelado com solução de fosfomolibdato. Só monossacarídeos
formam produto de cor azul. A adição de ácido fosfomolíbdico leva a formação de um
complexo corado de azul intenso.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA
Identificar os carboidratos presentes em diferentes amostras dadas. Determinar
algumas de suas propriedades químicas.
Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O (precipitadovermelho)
Cu+2 + glicídio Composto oxidado + Cu2O
H3PO4 . 12 MoO3
Complexo de cor azul
I. TESTE DE BENEDICT:
1. Objetivo:
Identificar se amostra apresenta açúcar redutor (monossacarídeos e
dissacarídeos) em sua composição.
2. Reagentes e preparo das soluções:
Reativo BenedictPesar 17,3 g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O), 173 g de citrato de sódio (Na3C6H5O7), 100
g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3), dissolver em água destilada e completar o volume
para 1000 mL em um balão volumétrico.
3. Procedimento:
Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:
Obs. Note que você irá fazer um controle positivo do teste usando uma solução de
glicose.
Tubos H2O (mL) Amostras (mL) Reagente de
Benedict (mL)
Resultados
B 0,2 ----- 1,0
CP ----- 0,2 1,0
CN ----- 0,2 1,0
A ----- 0,2 1,0
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - açúcar redutor); CN (Controle Negativo
– açúcar não redutor) e A (Amostra).
Aquecer os tubos em banho fervente (100oC) por 5 minutos;
O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração vermelha
tijolo.
II. TESTE DE BARFOED MODIFICADO:
1. Objetivos:
Diferenciar monossacarídeos redutores de dissacarídeos redutores.
2. Reagentes e preparo das soluções:
Reativo Barfoed Modificado:
Dissolver 48 g de acetato cúprico ((CH3COO)2 Cu.H2O) em 900 mL de água destilada
quente, adicionar lentamente 50 mL de ácido lático (C3H6O3) 8,5%. Resfriar e completar o
volume para 1000 mL em um balão volumétrico. Filtrar se necessário.
Reagente Fosfomolídico:
Dissolver 150 g de ácido molíbdico (H2MoO4) e 75 g de carbonato de sódio anidro
(Na2CO3) em 500 mL de água destilada quente com agitação. Aquecer até ebulição. Filtrar.
Adicionar 300 mL de ácido fosfórico (H3PO4) 85%. Completar o volume para 1000 mL em um
balão volumétrico.
3. Procedimento:
Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:
Tubos H2O
(mL)
Amostras
(mL)
Reagente de
Barfoed
(mL)
Aquecer os
tubos em
banho
fervente
(100oC) por
30 segundos
Reagente
Fosfomobdílico
(mL)
Resultados
B 0,2 ----- 1,0 0,5
CP ----- 0,2 1,0 0,5
CN ----- 0,2 1,0 0,5
A ----- 0,2 1,0 0,5
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo – monossacarídeo redutor); CN (Controle negativo
– dissacarídeo redutor); A (Amostra).
O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração azul escuro.
III. TESTE DO IODO
1. Objetivos:
O objetivo do teste é permitir que o aluno seja capaz de identificar uma amostra
contendo o polissacarídeo amido.
2. Princípio do método:
3. Reagentes e preparo das soluções:
Lugol (KI -I2)Pesar 5 g de iodo (I2) e 10 g de iodeto de potássio (KI), dissolver em água destilada
e completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.
4. Procedimento:
Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:
Tubos H2O
(mL)
Amostras
(mL)
LUGOL
(gotas)
Resultados
B 2,0 ----- 2
CP ----- 2,0 2
CN ----- 2,0 2
A ----- 2,0 2
Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - amido); CN (Controle negativo –
glicose); A (Amostra).
Aguardar 30 segundos à temperatura ambiente;
O teste é positivo se houver o desenvolvimento da coloração verde
azulada.
REFERÊNCIAS:
DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª
Edition. W. H. Freeman and Company. New York.
ANÁLISE QUANTITATIVA DE COLESTEROL
( Reação de Liebermann-Buchard)
1. Objetivos:
Determinar concentração de colesterol em uma amostra biológica
desconhecida.
2. Princípio do método:
Os esteróides, incluindo o colesterol, apresentam em sua estrutura o
ciclopentanoperidrofenantreno que é representado por
quatro anéis fundidos (A, B, C, D). O colesterol, que é um
álcool esteróide ou esterol, apresenta uma função alcoólica
na posição C3, uma insaturação entre os carbonos C5 e C6
e uma cadeia alquila em C17. Embora as propriedades de solubilidade sejam análogas
as dos lipídios, esteróides como colesterol, possuem estrutura e propriedades químicas
diferentes, podendo ser evidenciados através de reações de coloração específicas:
O ácido sulfúrico concentrado causa a desidratação da molécula de colesterol
no grupo hidroxila C3 , fornecendo como produto o 3,5-colestadieno. O derivado
desidratado na presença do reativo cromogênico produz o ácido bis-3,5-colestadienil-
mono-sulfônico de coloração verde.
3. Procedimento:
I. Construção de uma curva padrão e determinação da concentração de
colesterol em uma amostra desconhecida:
Em tubos de ensaios, adicione os reagentes seguindo a ordem da tabela:
TUBO Padrão de colesterol
(0,3 mg/ mL)(mL)
Amostra(mL)
Clorofórmio (mL)
Anidrido Acético
(mL)
H2SO4
Conc(mL)
Colesterol(mg)
ABS
Branco - - 5,0 1,0 0,1
1 0,1 - 4,9 1,0 0,1
2 0,2 - 4,8 1,0 0,1
3 0,4 - 4,6 1,0 0,1
4 0,8 - 4,2 1,0 0,1
5 1,0 - 4,0 1,0 0,1
A 1,0 4,0 1,0 0,1
Misturar e deixar em repouso por 10 minutos no escuro (em caso de presença
de colesterol desenvolve-se uma coloração verde);
Realizar a leitura em espectrofotômetro a 650 nm.
REFERÊNCIAS:
DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5ª
Edition. W. H. Freeman and Company. New York.
ANÁLISE QUALITATIVA DE ÁCIDOS NUCLEICOS
(Extração e caracterização de DNA de cebola)
INTRODUÇÃO:
Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) são macromoléculas formadas por subunidades
repetidas chamadas nucleotídeos, os quais são unidos através de ligações fosfodiéster,
formando uma fita de comprimento variado (Figura 1). Os nucleotídeos, que possuem as
características de serem estáveis em uma ampla
faixa de pH, são constituídos por três estruturas:
• uma base nitrogenada: existem duas classes
de bases nitrogenadas: as purinas e as
pirimidinas. As principais purinas são guanina e
adenina; e as principais pirimidinas são citosina,
uracila e timina. Uracila é, geralmente,
encontrada só em RNA e timina, só em DNA;
• um açúcar do tipo pentose: as pentoses podem ser de dois tipos: ribose, presente
apenas nas moléculas de RNA e desoxirribose, presente apenas nas moléculas de
DNA;
• um grupo fosfato: PO43-.
Figura 1. Estrutura do DNA.
O DNA é relativamente estável em soluções aquosas próximas do pH neutro, o que o
torna adequado para o armazenamento da informação genética ao longo do tempo. Ao
contrario, o RNA é mais instável (é mais suscetível à hidrólise). A separação das fitas de
DNA pode ser estudada elevando-se a temperatura de uma solução. Em temperaturas
relativamente baixas, poucos pares de bases são rompidos. Em temperaturas elevadas,
as fitas de DNA se separam e adquirem uma conformação em espiral aleatória. A esse
fenômeno dá-se o nome de desnaturação.
OBJETIVO GERAL DA PRÁTICA:
Realizar a extração e a caracterização de DNA de uma amostra biológica.
EXTRAÇÃO DE DNA:
1. Objetivo:
Extrair DNA de uma amostra biológica (cebola).
2. Princípio do método:
Os métodos utilizados para a extração e dosagem do DNA celular nuclear de
eucariontes implicam no rompimento das membranas citoplasmática e nuclear. Neste
experimento, o rompimento das membranas plasmática e nuclear será realizado com o
tratamento de um detergente comum. Os tratamentos com detergentes, iônicos ou
não, são largamente utilizados na solubilização de proteínas e lipídeos de membrana.
Nestes processos de solubilização por detergentes, são formadas micelas, que
consistem de proteínas, lipídios e detergentes. O tratamento das células com uma
concentração relativamente alta de detergente resulta no rompimento das membranas
celulares e subsequente liberação das nucleoproteínas. A atividade da enzima
digestiva (DNAase) será inibida pela ação do EDTA em meio alcalino − que altera pH
e quela os íons divalentes necessários à ação da DNAase. A solução salina (NaCl) no
início da experiência diminui a agregação proteica e minimiza a formação de
precipitados (nucleoproteínas). A adição de etanol sobre a fase aquosa, contendo os
ácidos nucleicos dissolvidos, resultará na precipitação destes, uma vez que o etanol
diminui a constante dielétrica da água, promovendo uma menor solubilização das
moléculas de DNA.
3. Reagentes e preparo das soluções:
Amostra: cebola
Água destilada
Solução salina concentrada
Etanol absoluto 95%
Detergente (solução de lise – SDS 0,1 % + EDTA 25 mM, pH 8,0)
Reativo de difenilamina
4. Procedimento:
Descascar 1/2 cebola de tamanho médio;
Ralar a cebola em ralador comum ou processador de alimentos (é importante que
não haja grandes pedaços de cebola);
Homogeneizar em água destilada (20 mL aproximadamente);
Acrescentar ao homogeneizado, ½ colher de cloreto de sódio e 3 mL de
detergente;
Misturar evitando a formação de espuma;
Filtrar a suspensão em um funil com filtro de papel, perfex, algodão ou gase,
recolhendo o filtrado em uma proveta;
Adicionar ao filtrado 20 mL de etanol 95% com auxílio do bastão de vidro. Não
misturar! Observar na interfase a formação de um material insolúvel filamentoso
(Figura 2).
Com auxílio do bastão de vidro, transferir o material insolúvel para um recipiente
contento 1 mL de H2O destilada.
COH
CH2
C
C
C
OH
OH
OH
H
H
H
H
COH
CH2
CH2
C
C
O
OHH
H
NH
Figura 2: Formação do material insolúvel filamentoso (novelo) após adição de
álcool à solução.
REAÇÃO DE DIFENILAMINA:
1. Objetivo:
Detectar a presença de desoxirribose.
2. Princípio do método:
Em meio ácido, as desoxirriboses livres de bases nitrogenadas geram
grupamentos aldeídicos livres, que por sua vez sofrem desidratação, originando como
produto aldeídos -hidroxilevulínicos (Figura 3). Estes aldeídos formados reagem com
a difenilamina, gerando um produto de coloração azul (com absorvância máxima em
595 nm). Assim a reação da difenilamina é útil para caracterizar, indiretamente, a
presença de DNA.
Figura 3: Reação da desoxirribose com difenilamina em meio ácido.
Ácido Nucleico
Antes Depois
2-desoxirribose
+ H+
Aldeído -hidroxilevulínico
H2O
+
Difenilamina
Complexo de cor azul
3. Reagentes e preparo das soluções:
Reativo de difenilamina:
Pesar 1 g de difenilamina, dissolver em 100 mL de ácido acético P.A e adicionar 2,75
mL ácido sulfúrico P.A.
4. Procedimento:
Identificar 2 tubos de ensaio e colocar em uma estante;
Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo.
TUBO Amostra Volume de (mL) Reativo de
Difenilamina (mL)
HCl 37%
(GOTAS)
B Água 1,0 1 2
D DNA de cebola 1,0 1 2
Legenda: B (branco) e D (DNA).
Misturar e manter os tubos em banho fervente (100oC) por 10 min;
Retirar os tubos do banho-maria e resfriá-los;
Identificar a formação de uma coloração azul na tubo contendo a amostra de
DNA (realizar a leitura no espectrofotômetro a 595 nm no caso de quantificação).