Apostila Pratica Vet UFF

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA CURSO: MEDICINA VETERINÁRIA

APOSTILA DE

AULAS PRÁTICAS

- DISCIPLINA - BACTERIOLOGIA

MEDICINA VETERINÁRIA

ORIENTADOR DIDÁTICO: PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA

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ASSUNTO - Material utilizado nas práticas de Bacteriologia - Técnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia - Microscopia

OBJETIVOS

1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratório de Microbiologia.

2- Executar técnicas de preparo de material e montagem para esterilização. 3- Treinar técnicas de distribuição asséptica. 4- Evidenciar a existência de bactérias no ar, roupas, etc. 5- Explanação sobre o microscópio.

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Técnicas de Assepsia É fundamental tomar certos cuidados com a assepsia durante os procedimentos realizados num laboratório de Microbiologia, a fim de se evitar contaminação de materiais e erros nos resultados finais. Estes cuidados incluem:

§ Desinfecção da bancada e das mãos antes e depois da prática executada § Trabalhar na área estéril ao redor do Bico de Bunsen § Esterilizar alças e agulhas antes e depois do seu uso. § Flambar bocas de tubos e frascos antes e depois das inoculações

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Cuidados de assepsia na remoção de bactérias

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O Bico de Bunsen

O bico de Bunsen é utilizado nos laboratórios de bacteriologia para evitar a contaminação do manipulador, do material esterilizado ou das culturas de microrganismos, a fim de evitar a penetração de um microrganismo num local que não o contenha.

Deve-se deixá-lo na chama azul, que é mais quente que a laranja. Ele cria uma área de segurança (estéril) de 10 cm de raio ao seu redor, porque o ar frio chega (com microorganismos em suspensão) e ao esquentar, se dispersa, dispersando com ele os microorganismos.

As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen. A alça e a agulha de platina A platina ou o aço (mais freqüentemente usado) são os materiais ideais porque esquentam e esfriam rapidamente. As alças e agulhas bacteriológicas são feitas de fio de platina, de calibre 24 a 26, fixados a um suporte. Nas alças, o fio de platina é fechado na extremidade em forma circular, com um diâmetro de 2 a 3 mm, onde cabe um inoculo de 10 milhões de bactérias.

A alça é utilizada para repique e semeadura de bactérias em meios líquidos e sólidos. Para sua esterilização, devem ser flambadas no Bico de Bunsen até ficarem rubras, num aquecimento progressivo da base para a ponta, para evitar a formação de aerossóis. Após flambar, deve-se deixá-las esfriar um pouco na área de segurança antes de iniciar os procedimentos nos meios de cultura.

MATERIAL

- Vidrarias. - Outros materiais de uso em um laboratório de Microbiologia. - Água peptonada. - Placas de Petri com Ágar simples. - Pipetas e tubos de ensaio estéreis. - Papel, barbante, algodão cardado, gaze.

PRÁTICA PARA EXECUTAR A. Apresentação da vidraria e outros objetos de uso freqüente nos laboratórios de Microbiologia. B. Demonstração, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos microbiológicos. C. Cada grupo de alunos treinar, com água peptonada, as técnicas de distribuição asséptica, usando pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mínimo 48 horas. D. Expor placas de Ágar simples (1 por grupo) ao ar por diferentes espaços de tempo. Deixar à temperatura ambiente o mínimo de 48 horas. E. Evidenciar bactérias da pele, roupa, bancada em meio Ágar simples.

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F. Montagem de vários materiais (tubos, placas, pipetas) para esterilização. RESULTADOS E OBSERVAÇÕES ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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ASSUNTO - Meios de Cultura - Técnicas de Semeadura

OBJETIVOS

1- Explanação sobre os principais meios de cultura empregados em laboratórios de Microbiologia

2- Identificação das técnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriológica 3- Cultivo de bactérias com finalidade de obtenção de cultura pura, ou seja, uma população

onde todas as bactérias se originam de uma única célula bacteriana. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Meios de cultura O estudo das bactérias necessita normalmente do seu prévio isolamento e identificação. Para tanto diversos meios de cultura são utilizados. Define-se meio de cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrogênio, sais minerais e água, que propiciam o crescimento in vitro de bactérias.

A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. Exceções são as riquétsias e clamídias que por serem parasitas intracelulares obrigatórios só se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema pallidum.

A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura. Toda a manipulação de culturas bacterianas, meios e instrumental necessário deve ser feita seguindo-se os procedimentos básicos de assepsia e antissepsia, visando evitar qualquer tipo de contaminação. Classificação dos meios de cultura

A) Quanto à composição: A.1) Naturais – são aqueles de origem vegetal (um pedaço de batata, pão, frutas)

ou animal (gema de ovo). A.2) Artificiais – são aqueles constituídos de substâncias químicas podendo ser

definidos ou indefinidos (complexos). Ä Definidos: é sabido toda a sua composição química. Ä Indefinidos ou Complexos: é desconhecido por si. Sabe-se apenas

aproximadamente sua composição. Os meios utilizados na rotina são complexos.

B) Quanto ao seu estado físico: Ä Líquido – são os caldos, desprovidos de Agar. Utilizados para transporte e para

bactérias que já sofreram a ação de antimicrobianos. Ä Semi-sólido – são aqueles que apresentam em sua composição até 1% de Agar.

Geralmente utilizados para bactérias microaerófilas. Ä Sólido – são aqueles que apresentam em sua composição 1,5 a 2,5% de Agar.

OBS: O Agar é um polissacarídeo extraído de algas, utilizado para solidificar os meios e que é escolhido por não reagir com nenhuma bactéria e por ser altamente resistente a variações.

C) Quanto à finalidade e características:

ÄSimples – contém apenas componentes básicos para o crescimento de uma bactéria.

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Ä Enriquecido – meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a bactéria pela adição de substâncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro, leite. De uso freqüente para bactérias de difícil crescimento (fastidiosas).

Ä De enriquecimento – meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactérias acompanhantes e permitir o crescimento da bactéria alvo que se pretende posteriormente isolar, aumentando assim a proporção desta em relação às demais. Por ser um meio líquido não se destina ao isolamento da bactéria.

Ä Seletivo – contém substâncias seletivas que inibem o crescimento de certas bactérias e permitem o crescimento de outras. São meios sólidos e têm como objetivo isolar culturas puras.

Ä Indicadores – meios que permitem a diferenciação visual do crescimento bacteriano facilitando a sua identificação. Freqüentemente os meios seletivos são também indicadores e todos os meios utilizados na confirmação bioquímica dos isolamentos são indicadores. A indicação mais freqüente é a alteração de cor do meio por mudança no pH do mesmo, podendo ainda ser a produção de gás, precipitação de componentes do meio por atividade proteolítica e lipolítica das bactérias, etc...

Ä Estoque – são meios normalmente semi-sólidos com a finalidade de preservar uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizações no laboratório.

Técnicas de semeadura

Procedimento para remover bactérias de um caldo com a alça de platina

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A finalidade básica das técnicas de semeadura é permitir a transferência (inoculação) de bactérias ou de uma cultura bacteriana de um material (secreção, alimento, etc) ou de um meio de cultura para outro (s) garantindo que apenas os microrganismos em questão sejam semeados.

De acordo com o tipo de meio de origem e destino bem como da finalidade específica da inoculação, diferentes técnicas são executadas, a saber: I - Semeadura em meios sólidos

A. Meio Inclinado em tubos (utilizar alça ou agulhas)

o Em estria sinuosa: semear com alça de platina, em ziguezague, partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio. Este tipo de semeadura permite a obtenção de intensa massa de microorganismos.

o Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio, ou em profundidade e superfície. Este tipo de semeadura é utilizado quando se necessita um inoculo pequeno de bactérias, como em provas bioquímicas para identificação bacteriana.

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Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de uma Placa de Petri

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Procedimento para repique de um meio inclinado para outro

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B. Meios em pé (camada alta)

o Em picada em profundidade: com agulha de platina perfurar o centro do meio, sem movimentos de lateralidade e fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro do meio de cultura. Este tipo de semeadura é bastante utilizado para conservação de bactérias no meio de cultura e quando o meio utilizado é semi-sólido, esta semeadura é utilizada para a verificação da motilidade (As bactérias que cresceram somente ao redor do pico de semeadura não são móveis).

C. Em Placa de Petri C.1. Em superfície

o Estrias múltiplas ou esgotamento: faz-se o inóculo num ponto da superfície do meio espalhando-se o mesmo por estrias em toda a placa, de modo a gradativamente esgotar o material contido no inóculo. Preferencialmente usa-se um esquema de divisão da placa em 4 quadrantes sendo que a estria de cada quadrante toca no final da estria do quadrante anterior arrastando bactérias deste último. Nesse caso, deve-se flambar a alça após a inoculação de cada quadrante. Pode-se também optar por não tocar no final da estria do quadrante anterior, não sendo assim necessário flambar a alça após cada quadrante. A estria do último quadrante ocupa a maior parte da placa. Alternativamente pode-se fazer 3 estrias, a primeira ocupando metade da placa e as outras duas um quarto da placa cada. Neste modo as estrias não se tocam. Este tipo de semeadura é empregado para o isolamento de colônias bacterianas e obtenção culturas puras.

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o Por distensão: com pipeta, colocar no centro da superfície do meio 0,1 mL da suspensão e espalhar uniformemente com swab ou alça de Drigalski. Com swab, obteremos crescimento confluente, para realização de antibiogramas, por exemplo. Com alça de Drigalski, utilizamos para obtenção de colônias dispostas de modo regular para contagem.

C.2. Em profundidade ou disseminação

o Pour plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspensão bacteriana. Adicionar 10 mL do meio fundido (O Agar funde a 85º C) em tubo de ensaio e resfriado a 45-50º C. Homogeneizar com movimentos giratórios da placa sobre uma superfície plana.Utilizado para isolamento, contagem e identificação bacteriana, conforme o meio de cultura utilizado.

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Pour Plate

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Inoculação na Placa de Petri

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D. Repique por pescaria: colônia em placa de Petri retirada através de uma agulha para um meio de cultura líquido ou sólido. Método empregado para isolamento bacteriano. II. Semeadura em meios líquidos

o Difusão: com alça de platina ou pipeta, introduzir o inoculo (> 0,1 mL) na massa do meio, esfregando contra o interior do tubo na área exposta pela inclinação do mesmo em 30º. Após se recolocar o tubo na posição vertical, as bactérias inoculadas se difundem para o meio. Este tipo de semeadura é empregado para obtenção do crescimento bacteriano (o meio fica turvo se houve crescimento). É um repique normal.

MATERIAL

- Tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-sólido. - Placas de Petri com Agar simples. - Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri). - Alça e agulha de platina.

PRÁTICA PARA EXECUTAR § Definir meio de cultura, cultivo e condições necessárias ao crescimento de

microorganismos (pH, pressão osmótica, temperatura de incubação, etc.). § Classificação dos meios de cultura quanto à origem, estado físico, força seletiva. § Seqüência da preparação dos meios.

RESULTADOS E OBSERVAÇÕES ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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ASSUNTO - Bactérias no Ambiente

OBJETIVOS

Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de constatar a presença de bactérias no ambiente; compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e manipulação de alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais.

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na água, no ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). Freqüentemente tais bactérias não estão associadas a nenhum prejuízo.

A microbiota intestinal desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas infecções; existem estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das defesas imunológicas. Ao mesmo tempo em que desenvolve atividades benéficas, a microbiota pode ser responsável por uma série de doenças oportunistas que podem ser relacionadas, por exemplo, ao uso constante de drogas imunossupressoras, antibióticos e internações em UTI.

Muitas infecções causadas por bactérias são adquiridas por contato direto ou veiculadas por alimentos. Ao contrário do que se pensava antigamente, a disseminação de bactérias patogênicas pelo ar e poeira não ocorre com grande freqüência, pois de um modo geral, não sobrevivem por longos períodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de transmissão podem ser de grande importância em determinadas situações. No caso de bactérias esporuladas a transmissão aérea é mais importante. Os alimentos são uma importante via de transmissão de doenças bacterianas como a shigelose e a salmonellose.

MATERIAL

- 01 placa com Agar simples divididas em 4 quadrantes - 01 placa com Agar simples - 01 swab estéril

PRÁTICA PARA EXECUTAR

A) Inocular em cada quadrante, respectivamente:

- a impressão do dedo polegar - um “carimbo” do tecido do jaleco - alguns fios de cabelo - um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho Incubar a 37o C por 24 horas Analisar o crescimento obtido B) Abrir as placas, fora da área de segurança, deixando cada uma por 5’, 10’, 15’ e 20’, fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 37o C por 24 horas e analisar o crescimento obtido.

5 min 10 min 15 min 20 min

1.º DEDO

2.º JALECO

3.º BANCADA

4.º CABELO

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RESULTADOS E OBSERVAÇÕES ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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ASSUNTO - Esterilização e Desinfecção - Ação dos Agentes Físicos e Químicos sobre as Bactérias

OBJETIVOS 1. Verificar a eficiência de agente químico sobre as bactérias 2. Verificar a eficiência de agente físico sobre as bactérias FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

As taxas de crescimento e morte microbianas são fortemente influenciadas por vários fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir a multiplicação de microrganismos existentes em um determinado equipamento, ambiente, em alimentos ou em superfícies vivas. É de extrema importância apresentando inúmeras aplicações práticas na área médica.

É importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiológico:

A) Desinfecção – redução do número de microrganismos em superfícies inanimadas (ambiente ou materiais) e conseqüente eliminação de sua potencialidade infecciosa.

B) Sanitização – mesmo significado de desinfecção, porém utilizado rotineiramente em indústria de alimentos.

C) Antissepsia – redução do número de microrganismos em tecidos vivos. D) Esterilização – destruição ou remoção completa dos microrganismos em ambientes ou materiais. E) Assepsia – Ausência de microrganismos. As técnicas assépticas representam uma série de

cuidados que previnem a contaminação.

O controle de microrganismos pode ser feito por agentes físicos ou químicos. Controle Microbiano por Agentes Físicos

o Calor É o método mais empregado para destruição de microrganismos por ser barato, eficaz e prático. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a destruição das formas esporuladas de bactérias, mais resistentes. Pode ser utilizado na forma de calor seco ou calor úmido em função da presença de água. O primeiro mata as bactérias por oxidação protéica enquanto o segundo por desnaturação protéica. Além disso, o calor úmido é um método de maior eficiência devido à água ser um melhor condutor de calor do que o ar.

Ä Calor Seco: na ausência de água - Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo. É um tipo de esterilização. - Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180o C por 1 - 2 horas. É

um tipo de esterilização, porém não é qualquer material que pode ser submetido a esse tratamento. Utilizado principalmente para vidraria e metais (instrumentos cirúrgicos p. ex.).

- Incineração: é a queima total de um material. Método utilizado com materiais descartáveis, principalmente aqueles materiais hospitalares.

Ä Calor Úmido: na presença de água (ou vapor d’água)

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- < 100o C: pasteurização (método desinfetante). Muito utilizado para alimentos e bebidas. A pasteurização rápida do leite emprega uma temperatura em torno de 72o C por 15 a 20 segundos, seguida de resfriamento rápido. A pasteurização consegue eliminar cerca de 99,5% de microrganismos, porém aqueles esporulados são termoresistentes, conseguindo resistir a esse tratamento.

- = 100o C: fervura (método desinfetante). O alimento é submetido a uma temperatura igual a 100o C por até 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas bacterianas, mas não destrói completamente as formas esporuladas.

- > 100o C: autoclavação (método esterilizante). Os materiais e alimentos são submetidos a uma temperatura em torno de 121o C por 15-30 minutos, um tempo e temperatura bem inferiores àqueles empregados em calor seco. Isso é possível pelo emprego de alta pressão interna (1 ATM) na autoclave. A autoclave é similar a uma panela de pressão.

o Radiação ÄUltravioleta (radiação não ionizante): Possui uma atividade máxima num comprimento de onda de 260nm. Geralmente são desinfetantes e usados em ambientes.

- Limitação: não tem poder de penetração, tudo que estiver embalado ou protegido por vidro não é desinfetado. Após umas 200 horas de uso da lämpada sua eficiência é diminuída.

- Por que mata? Ela penetra nos microrganismos e é captada pelos seus cromossomos, causando mutação letal por ser absorvida diretamente.

ÄRadiação Gama (radiação ionizante): É um método de esterilização mais energético que as

radiações UV, com menor comprimento de onda e desequilibra quimicamente as células irradiadas. Todos os seus componentes químicos podem ser alterados. Muito utilizado para esterilização de produtos hospitalares descartáveis.

o Filtração

Método utilizado principalmente para materiais líquidos, que são alterados pelo calor.

Ä Clarificantes: são os filtros domésticos, retém as impurezas grosseiras, são desinfetantes.

Ä Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1mm podendo reter inclusive alguns vírus.

o Outros

Ä Pressão Osmótica (Salga); Dessecação; Uso de baixas temperaturas (refrigeração,

congelamento). Controle Microbiano por Agentes Químicos

o Fenóis e derivados É um desinfetante fraco, porém utilizado como um desinfetante de referência para ser comparado com outros produtos. ® Atuação: fenóis/cresóis – desnaturam proteínas. OBS: Dos cresóis o mais importante é a creolina, utilizada para pisos e sanitários. O hexaclorofeno é muito usado na antissepsia cirúrgica.

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o Álcool Etílico

Possui vários mecanismos de ação, sendo relativamente eficiente. São solventes de lipídios (ação detergente), desidratantes (retiram a água das células) e desnaturam proteínas. O álcool etílico pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico. O álcool absoluto (não hidratado) é fraco germicida. Um álcool parcialmente hidratado (60- 70%) é mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de penetração e conseqüente desnaturação protéica mais rápida.

o Cloro / Iodo (Halogênios)

- O Cloro é desinfetante de águas, alimentos e pisos. Mecanismo de ação é oxidação.

- O mecanismo de ação do Iodo é a sua combinação irreversível com proteínas através da interação com aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, levando à desnaturação das mesmas. É um dos anti-sépticos mais utilizados na prática cirúrgica.

o Detergentes catiônicos (agentes de superfície)

Alteram a permeabilidade de membrana (ex: compostos quaternários de amônioÞ cloreto de benzalcônio). Mais ativo contra Gram negativos.

o Sais de Metais Pesados

- Mercúrio (Hg): anti-séptico. Em desuso pelo risco de intoxicação por absorção.

- Sulfato de Cobre (CuSO4): desinfetante para águas de recreação.

- Nitrato de Prata (AgNO3): anti-séptico. É altamente eficiente contra gonococos, que causam oftalmia em recém-nascidos.

® Atuação: afinidade por proteínas, inativando enzimas, por isso é importante não ingeri-los.

Uso tópico apenas.

o Ácidos orgânicos e inorgânicos

Freqüentemente usados na conservação de alimentos. Ex: ácidos acético, lático, benzóico.

o Álcalis

- Hidróxido de Sódio (NaOH) = presente nos sabões conferindo a estes a sua relativa ação anti-séptica.

- Outros: KOH, Ca (OH)2

o Corantes Básicos

Mais eficientes contra Gram positivos. Ex: Cristal Violeta, Azul de Metileno.

o Oxidantes e Redutores

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A célula microbiana está em equilíbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilíbrio, matando a célula.

- Oxidantes: oxidam componentes celulares levando à morte das células. Ex: Ozônio (O3), água oxigenada (H2O2), permanganato de potássio, peróxido de zinco. Usados como anti-sépticos.

- Redutores: reduzem compostos celulares levando à morte das células.

Þ Aldeídos e derivados:

- Formaldeído/ formalina: muito irritante, São usados para desinfetar paredes e pisos.

-Glutaraldeído: mais ativo e menos tóxico que o formaldeído. Esporocida após 6 horas de contato.

Þ Óxido de Etileno (gás):

É um agente alquilante, inativando proteínas e ácido nucléico. Usado em um recipiente fechado que recebe todo material a ser utilizado (contém algumas ampolas de óxido de etileno – líquido), à temperatura de 52o C, este líquido torna-se gasoso, assim, seus vapores são esterilizantes. Usado para esterilização de materiais de borracha ou plástico.

o Antimicrobianos

Ao contrário dos anteriores possuem ação seletiva contra microrganismos por isso não serão discutidos neste assunto.

MATERIAL - Placas de Petri com Agar simples ou caldo simples - Culturas de E. coli e Bacillus sp - Soluções antissépticas - Gaze - Tripé, tela de amianto e panela. Prática para executar a. Definição de alguns termos utilizados no controle da população microbiana:

- Agente antimicrobiano, assepsia, asséptico, antissepsia, bactericida, bacteriostático, desinfecção, esterilização, germicida, saneador, sanitização.

- Agentes físicos: radiações, calor, filtração. - Agentes químicos

b. Atividade antisséptica do sabão, álcool e álcool iodado: - Observação de existência de bactérias na superfície do dedo: 1. Pegar uma placa de Agar simples e fazer a semeadura utilizando a ponta do polegar (fazer a impressão digital suavemente para não ferir a camada do meio de cultura). 2. Em seguida, lavar o dedo com sabão. 3. Após 1 minuto, fazer a impressão digital no 2º quadrante da placa. 4. Repita a operação com os demais antissépticos (álcool e álcool iodado) 5. Incubar a placa a 37º C por 24 horas.

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c. Atividade do agente físico: calor

1. Cultura de E. coli em caldo. Para o primeiro inóculo, marcar t = zero, colocar o tubo em água fervente por 5, 10 e 20 minutos. 2. Após cada intervalo de tempo retirar um inóculo marcando t5, t10,e t20. Incubar a 37º C por 24 horas. 3. Repetir a técnica com a cultura de Bacillus sp.

d. Atividade de diferentes agentes químicos:

1.Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma placa de Petri com Agar simples. 2.Assepticamente, com pinça, embeber discos de papel de filtro com diferentes agentes químicos. 3. Colocar os discos eqüidistantes na placa semeada. 4. Incubar a 37º C por 24 horas. 5. Leitura e interpretação dos dados obtidos.

B A

C D

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ASSUNTO - Diluição - Contagem de u.f.c.viáveis - Obtenção de Cultura Pura

OBJETIVOS 1. Metodologia de Diluições 2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viáveis 3. Contagem de u.f.c. viáveis 4. Obtenção de cultura pura MATERIAL - Tubos com 9mL de salina - Placas de Petri com Agar simples - Alças de Drigalski - Cubas com álcool 70º - Agar inclinado - Caldo simples - Cultura bacteriana em caldo - Pipetas de 1mL PRÁTICA PARA EXECUTAR a. Diluição (É necessária para diminuir o número de bactérias no inóculo, facilitando a contagem) A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL do caldo em 9mL de salina (que deve estar morna), homogeneizar, retirar 1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... Obtendo assim, as diluições 1/10, 1/100, 1/1000... b. De cada diluição inocular 0,1mL na superfície do meio de Agar simples. Semear por distensão com alça de Drigalski. Incubar a 37ºC por 24 horas. c. Contagem da u.f.c. com diluição nº placa 1 + nº placa 2 aplicar na fórmula: 2

u.f.c. = nº encontrado x inverso da diluição x inverso do inoculo

d. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples.

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RESULTADOS E OBSERVAÇÕES ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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ASSUNTO - Coloração de Gram

OBJETIVOS 1. Observar e interpretar o mecanismo de reação de Gram como um método de coloração diferencial. 2. Discutir as várias etapas da metodologia e a importância taxonômica do método na Bacteriologia. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

O método de coloração de Gram é o mais utilizado em Bacteriologia e permite a diferenciação da maioria das bactérias em 2 grupos pelas diferenças marcantes na parede celular que apresentam. Com base nessas diferenças de parede celular os corantes utilizados coram as bactérias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em vermelho.

O método de Gram é utilizado na maioria das infecções bacterianas, permitindo o diagnóstico de algumas delas com bastante segurança. Porém não se aplica para micoplasmas, bactérias desprovidas de parede, micobactérias pela presença de muitos lipídios insolúveis na parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco permeável aos corantes.

A coloração pelo método de Gram é chamada de coloração diferencial porque são utilizados dois corantes e as bactérias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso é possível devido à composição da parede celular das mesmas.

Bactérias Gram-negativas possuem uma parede composta de várias camadas que diferem na sua composição química e, conseqüentemente, são mais complexas. O arranjo dessa parede é dado por uma fina camada de peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos (membrana externa).

As bactérias Gram-positivas possuem parede celular mais espessa em comparação às Gram-negativas, apesar disso, apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula, uma espessa camada de peptidoglicano (representando aproximadamente 90%) e ácido tecóico.

Essas bactérias podem ser aeróbias, anaeróbias facultativas e anaeróbias. Possuem a forma de cocos, bacilos ou víbrios (bacilos encurvados). Muitas são patogênicas e outras, membros da microbiota normal.

A maioria dos cocos é Gram-positiva, com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que são os únicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium; os demais bacilos são Gram-negativos (a maioria); os víbrios são Gram-negativos.

A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias é a etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de material clínico. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma.

O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das Gram negativas Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as Gram negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído.

Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas bactérias G+, o complexo CV-I é retido na parede após o tratamento pelo álcool, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou

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peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactérias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do tratamento pelo álcool, possibilitando a extração do complexo CV-I.

Segundo o autor Trabulsi, na etapa diferencial com álcool, as bactérias G- devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo corado extraído pelo álcool que deixa as células descoradas. O preparo e a fixação do esfregaço a) Preparo das lâminas

As lâminas novas oferecem maior garantia para a confecção de boas preparações coradas,

não obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo de limpeza e esterilização dessas lâminas implica numa série de medidas que passaremos a enumerar: lavar com água e sabão, mergulhar em solução detergente e deixar em ebulição por cerca de 1 a 2 horas, lavar novamente em água corrente, escorrer e rinsar com água destilada, escorrer e secar. As lâminas devem ser colocadas em frascos fechados contendo álcool. As preparações coradas são feitas em 3 etapas: 1º esfregaço 2º fixação 3º coloração b) Esfregaço - Tirar do frasco uma lâmina esterilizada e enxugar bem - Flambar, rapidamente, nos dois lados da lâmina - Flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar próximo à chama - Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mão esquerda e com os dedos médio e anular da mão direita remover o tampão de algodão da boca do tubo -Flambar a boca do tubo de cultura - A alça de platina, segura entre o polegar e o indicador da mão direita, será introduzida no interior do tubo até tocar no meio de cultura - Flambar novamente a boca do tubo - Fechar o tubo com o tampão de algodão e colocá-lo na estante - Tomar a lâmina com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma gotícula (uma alçada) da suspensão bacteriana - Com movimentos de rotação da alça de platina, o material deve ser bem espalhado a fim de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme - Deixar secar ao ar e marcar com lápis dermatográfico do lado oposto onde se situa a preparação Em se tratando de material de cultura em meio sólido, deve ser observado o seguinte: - Depositar uma pequena gota de água destilada ou solução fisiológica estéril no centro da lâmina - Tocar a colônia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na gotícula d’água, de forma a obter um esfregaço fino e uniforme c) Fixação do material A fixação evita que o material se desprenda no decurso das manipulações posteriores. Pode ser feita por:

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# Agentes Físicos (calor) – consiste em passar a lâmina, com a face onde se acha o esfregaço para cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente # Agentes Químicos – utiliza-se uma substância química como álcool metílico, álcool etílico, álcool-acetona, éter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os esfregaços dessecados durante alguns minutos (2 a 10 minutos). O fixador pode ser posto sobre o esfregaço convenientemente protegido contra a evaporação rápida, ou então o preparado será mergulhado no fixador contido em recipientes apropriados. MATERIAL - Lâminas - Culturas em meios líquido e sólido - Alça e agulha de platina - Cristal violeta - Lugol - Álcool etílico - Fucsina de Ziehl. Soluções reagentes 1. Cristal violeta: - Cristal violeta 1,0g - Álcool a 95° 10mL - Água 100mL 2. Lugol: - Iodo 1,0g - Iodeto de potássio 10mL - Água 300mL 3. Fucsina: - Fucsina básica 0,3g - Fenol 5,0g - Álcool a 95° 10mL - Água 100mL 4. Álcool-acetona proporção 1:1. PRÁTICA PARA EXECUTAR COLORAÇÃO DE GRAM (MÉTODO CLÁSSICO) a. Preparar um esfregaço fino, secar a temperatura ambiente e fixar pelo calor. b. Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante) durante 1 minuto. c. Esgotar a lâmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto. O Lugol fixa as moléculas do corante às proteínas citoplasmáticas, formando compostos estáveis. d. Inclinar a lâmina 45° e lavar em água corrente. e. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com álcool 95° GL (diferenciador).

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f. Lavar e depois cobrir a preparação com solução diluída de fucsina de Ziehl (contra-corante) (15 a 30 segundos). g. Lavar e secar entre duas fitas de papel de filtro, delicadamente. h. Colocar uma gota de óleo de cedro no centro do esfregaço. i. Observar com a objetiva de imersão.

Vi Lulu Ali A Fumar Algo

Cristal Lugol Álcool Água Fucsina Água Violeta

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Mudanças de coloração que ocorrem em cada passo do Método de Gram. NOTAS 1. O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco. 2. O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal violeta poderá aparecer como artefato. 3. O descoramento para mais ou para menos é resultante de incorreta diferenciação pelo álcool. 4. A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-negativas. Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à membrana da célula, como, por exemplo, alterando a permeabilidade dos solventes. Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. 5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da cultura, uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas como G+ (Staphylococcus aureus) e G- (Escherichia coli) como controle. INTERPRETAÇÃO Bactérias G+ coradas em roxo. Bactérias G- coradas em vermelho.

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ASSUNTO - Cocos Gram-positivos

OBJETIVOS: 1. Isolamento de bactérias das vias aéreas superiores. 2. Identificação bioquímica através da interpretação do metabolismo microbiano. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Identificação das bactérias de importância médica

Þ Material de colheita: secreções, líquidos biológicos e outros. Cocos Gram positivos aeróbios I. Staphylococcus

http://de.wikipedia.org/wiki/Staphylokokken

Este gênero, membro da família Micrococcaceae, é constituído de várias espécies, sendo 5 as

de maior interesse em Veterinária (S. aureus, S. intermedius, S. epidermidis, S. hycius e S. schleiferi) . São microorganismos esféricos, imóveis, gram positivos, que crescem em agrupamentos semelhantes a cachos de uva, devido aos seus arranjos irregulares. São membros normais da microbiota anfibiôntica da pele e membranas mucosas de mamíferos e aves, sendo encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe.

Causam diferentes doenças supurativas tais como: furúnculo, impetigo, osteomielite, abcessos de tecidos, pneumonia, meningite, artrite purulenta, etc. Algumas amostras (S. aureus) produzem uma “enterotoxina” que provoca um quadro agudo de intoxicação alimentar, enquanto outros (S. aureus e S. saprophyticcus) causam infecções do trato urinário. Espécies de importância veterinária

Þ S. aureus (coagulase +) – Agente piogênico comum em diferentes espécies animais.

Recebe esse nome, pois pigmentos carotenóides na membrana celular podem conferir coloração “áurea” (latim – aureus) às colônias.

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OBS: Coagulase + são os Staphylococcus com potencial patogênico. Estes crescem melhor em condições de restrição de ferro, se comparados aos coagulase -, com menor potencial patogênico.

Þ S. intermedius (coagulase +) – Mais freqüente em cães, estando envolvida na piodermite canina (inflamação cutânea piogênica). Pode causar também urolitíase de cães (pela urease)

Þ S. epidermidis (coagulase -) – Encontrado na pele e em algumas membranas mucosas. Raramente é patogênico.

Þ S. hycius – Causa epidermite exsudativa em suínos. É a chamada Doença do porco gordo, que acomete suínos jovens, é sistêmica e rapidamente fatal. As lesões cutâneas caracterizam-se pela presença de um exsudato espesso, cinza acastanhado, especialmente ao redor das faces e das orelhas.

Þ S. schleiferi subespécie coagulans – Está associado a otite externa em cães.

Grande parte das infecções de animais é provavelmente endógena, isto é, provocada por uma cepa residente.

Supuração e formação de abcesso (lesão típica) são um modelo predominante da patogenia. A estafilococose em perus é uma bacteremia que se localiza em articulações e bainhas

tendinosas. Piemia em cordeiros decorre de inoculação cutânea de S. aureus por picada de carrapato. A colheita do material deve ser realizada com o máximo de assepsia: swab de nasofaringe,

fezes, urina. Em se tratando de sangue, este deverá ser colhido com heparina, ou ser desfibrinado, nunca utilizar citrato de sódio, pois o sódio inibe G+, principalmente em pH próximo a 6. Características do crescimento

São bactérias anaeróbias facultativas, de fácil crescimento. Crescem dentro de 12hs em meio

de Agar Simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colônias são redondas, lisas, elevadas, opacas, de coloração amarelo-dourado a branco e com mais de 1mm de diâmetro no Agar. Crescem em presença de altas concentrações de NaCl, sendo este um fator de estimulação da produção da enzima coagulase. São inibidos pela presença de corantes dos tipos Azul de Metileno e Violeta de Genciana.

O meio Chapman é seletivo, porque contém 7,5% de NaCl; é indicador porque possui manitol e o indicador Vermelho de Fenol, as UFCs fermentadoras do manitol apresentam-se com coloração amarelas após 24 – 48 horas de incubação a 37ºC. Após o crescimento de colônias típicas fazemos a coloração de Gram para observarmos a presença de cocos Gram + dispostos em grupos (cachos) ou isolados.

Diferenciamos o gênero Staphylococcus do gênero Streptococcus através da prova da catalase. A diferenciação das espécies do gênero se dá através das provas de fermentação do manitol, da coagulase, da DNAse, da sensibilidade a novobiocina e da redução de nitratos.

Provas bioquímicas - Prova da Catalase:

A catalase é uma enzima responsável pela neutralização de formas tóxicas do oxigênio ao

microorganismo (peróxidos e superóxidos). Na prova, é utilizado o peróxido de hidrogênio (H2O2 a 30%). Se o microorganismo produzir

catalase, o H2O2 (água oxigenada) será degradado em H2O e ½ O2 (oxigênio molecular). A reação é observada através do desprendimento de bolhas gasosas (O2) da cultura. Na ausência da catalase, não há decomposição do peróxido.

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A prova pode ser realizada com o microorganismo obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, pois este possui catalase, levando a resultados falso-positivos.

http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/bms5300/bugs/stapaure.html

- Fermentação do Manitol:

O manitol é um açúcar que alguns microorganismos são capazes de utilizar como fonte de

energia, a través da fermentação. A prova se baseia na alteração do pH do meio, graças à produção de ácidos durante o processo de fermentação. Essa mudança de pH pode ser observada pela viragem de cor do meio devido à presença do indicador de pH Vermelho de Fenol. A prova pode ser realizada em meios de cultura líquidos ou sólidos. Após a semeadura, o meio deve ser incubado a 37ºC por 18 – 24 horas.

Interpretação: Positivo: meio amarelo Negativo: não há alteração da cor do meio.

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pathmicro.med.sc.edu/fox/Mannitol.jpg

- Prova da coagulase:

A coagulase estafilocócica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. A coagulase ligada, presente na parede da célula bacteriana, converte o fibrinogênio em

fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulação, e pode ser detectado em teste direto em lâmina, utilizando-se da suspensão de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e observando-se a formação de coágulo no tempo de 1-2 minutos. Pode-se tornar mais sensível o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre quanto a ligada, sendo a prova de escolha.

A coagulase livre é produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o fator de coagulação do plasma, o CRF, formando uma substância semelhante, mas não idêntica, à trombina, que converte fibrinogênio em fibrina. Para o teste, utiliza-se plasma citratado humano ou de coelho, estéril, diluído em solução salina na proporção de 1:5. A reação ocorre volume a volume a 37ºC.

Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica quando o microorganismo é crescido em meio contendo alta concentração de NaCl. Desta forma, aconselha-se a utilização de colônias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado contendo NaCl e Vermelho de Fenol. Este procedimento aumentaria a sensibilidade do teste.

A prova consiste da semeadura de uma alçada do microorganismo em estudo em tubo contendo o plasma diluído e incubação a 37ºC. A menor coagulação é considerada positiva. Devem ser feitas leituras periódicas a cada 2 horas, por até 24 horas, pois algumas espécies produzem fibrinogênio, que dissolve o coágulo formado.

Aconselha-se também utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus.

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http://www.aic.cuhk.edu.hk/web8/staphylococci.htm

- Prova da DNAse:

Alguns microorganismos são capazes de utilizar o DNA presente no meio como fonte de

energia, através da produção da enzima DNAse. No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de semeadura)

central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37ºC por 24 horas e adicionar ao meio HCl 1N e aguardar a turvação do meio.

Lembrando que o DNA é material protéico e que o HCl, como ácido, tem poder desnaturante sobre as proteínas, a turvação do meio é apenas a precipitação do DNA desnaturado. Se a bactéria produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor terá sido degradado, então ao adicionar o HCL não haverá turvação nesta área. Portanto, se houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o resultado é positivo.

- Sensibilidade a Novobiocina:

Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton com swab,

para obtenção de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina (5g/ml). Incubar a 37ºC por 24 horas. As bactérias resistentes não apresentarão halo de inibição, enquanto as sensíveis sim.

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Interpretação das provas bioquímicas Provas bioquímicas S. aureus S. epidermidis S. sapophyticus Catalase + + + Fermentação do manitol + - - Coagulase +/- - - DNAse + - - Sensibilidade a novobicina R S R Redução de nitratos + -

II. Streptococcus

textbookofbacteriology.net/nfStreptococcus

Animais de sangue quente albergam uma flora de Streptococcus nas mucosas dos tratos

respiratório superior, genital inferior e quase todo o trato digestivo (enterococcus). Apresentam-se em forma de cadeia ou em pares, e são Gram positivos. Em 1903, Schottmuller propôs que os estreptococos fossem classificados conforme a

capacidade de lisar hemácias “in vitro”. Em 1919, Brown chamou de alfa, beta e gama as lises observadas nas hemácias em placas de Agar sangue.

Os estreptococos alfa hemolíticos apresentam zonas de hemólise parciais, com hemácias integras na parte mais interna (junto à colônia) e hemólise maior na parte mais externa. Frequentemente aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana – libera biliverdina e bilirrubina), que originou a qualificação “estreptococos do grupo esverdecente” ou Streptococcus viridans. O Streptococcus pneumoniae apresenta hemólise alfa e colônia puntiforme com aprofundamento no ápice da colônia (parecendo um pequeno vulcão). A maior parte dos Streptococcus comensais de animais é alfa hemolítico.

Os estreptococos beta hemolíticos produzem uma zona de hemólise total, não se observando hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x), ou seja, produzem zonas de transparência ao redor de suas colônias. O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas: O e S. A hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio atmosférico e, portanto, só demonstrada em colônias crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S é estável ao oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias crescidas na superfície do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessária a semeadura do microorganismo pela técnica do pour-plate. A maioria dos tipos patogênicos é beta-hemolítica.

Os estreptococos gama são anemolíticos, ou seja, não produzem hemólise no meio. A maior parte não é patogênica.

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Espécies de importância veterinária Principais espécies acometidas Principais doenças S. pyogenes Roedores, bovinos e humanos. Piodermites, erisipelas, febre

puerperal, febre reumática, glomerulonefrite

S. agalactie Bovinos de raças leiteiras Mastite* e infecções neonatais S. equi Equinos Garrotilha ** S. equismilis Suínos, equinos Condições supurativas mistas S. zooepidemicus Equinos Problemas genitais (metrite) e

neonatais (infecções umbilicais disseminadas pela corrente sanguínea). Pneumonias secundárias.

S. canis Carnívoros Linfadenite felina, condições supurativas mistas em cães e gatos.

S. suis Suínos Infecções neonatais, septicemias, pneumonia.

S. pneumoniae Primatas Pneumonia***, septicemia e meningite.

S. uberis Bovinos Mastite (geralmente mais suave).

* A mastite é transmitida por ordenha sem condições higiênicas adequadas. A infecção instala-se na glândula mamária pelo canal da teta e a proliferação causa uma inflamação aguda e por fim a glândula inteira pode ser perdida. ** Rinofaringite eqüina contagiosa, que se caracteriza por secreção nasal serosa ou purulenta, dor local, tosse e anorexia. Desenvolvem-se abscessos nos linfonodos regionais, que tipicamente se drenam e rompem em 2 semanas. *** A evolução é muito aguda em macacos, levando a altas taxas de mortalidade. Um Streptococcus beta-hemolítico é responsável por uma forma de septicemia em peixes de água doce em aquários. Infecções neonatais comumente originam-se de infecção no trato genital materno. Características do crescimento As exigências de crescimento são mais bem supridas por meios contendo sangue. Produzem colônias claras após 12 horas de incubação. São anaeróbios facultativos, catalase negativos. Suportam a azida sódica a 0,02%, que é empregada nos meios utilizados para isolá-los. Cultura (“pour plate”)

Fazer uma suspensão do material colhido em um tubo contendo 1 ml de solução fisiológica

estéril e adicionar a uma placa de Petri estéril. Juntar o Agar Sangue fundido e resfriado e promover a difusão do inóculo no meio através de movimentos circulares. Incubar a 37ºC por 18 horas em atmosfera de microaerofilia para melhor rendimento, ou jarra com vela.

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Leitura:

Observação do tipo de hemólise em Agar Sangue.

Provas bioquímicas - Prova da optoquina:

Colocar um disco de optoquina na superfície do Agar Sangue (pode-se incluir no

antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colônias ao redor do disco de optoquina (2 cm de diâmetro), trata-se de teste positivo.

- Bile solubilidade:

A prova é realizada conforme esquema que se segue:

1. A 1,0 ml de cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol. 2. Acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rósea) 3. Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sódio ou bílis 4. Incubar juntamente com o tubo sem bílis a 37ºC por 3 horas

* clareamento: positivo * inalterado: negativo

- Bacitracina:

Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfície do meio de

cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no antibiograma) e incubar a 37ºC por 24 horas em microaerofilia.

* Grupo A: sensível a bacitracina * demais grupos: resistentes

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- Crescimento a 56ºC: Para evitar dúvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter a

cultura a um aquecimento a 56ºC por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a este tratamento. - Crescimento em Agar Chapman:

Os enterococos toleram altas concentrações de NaCl, como acontece com Staphylococcus.

- Crescimento em Agar EMB:

Os enterococos suportam a presença de corantes, como o azul de metileno

MATERIAL:

- cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis - Placas de Chapman - Tubos de caldo simples - Tubos com plasma citratado - Tubos com Agar simples - Tubos com água destilada estéril - Placas DNAse

- Bateria de Gram - Água oxigenada a 30% - Swabs - Solução salina estéril - Lâminas, alças... - Microscópio PRÁTICA PARA EXECUTAR 1º DIA:

a. Inocular swab de orofaringe em Caldo Hitchens-Pike (para observação de Streptococcus) b. Inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela técnica de esgotamento (para observação de

Staphylococcus) 2º DIA:

a. Semear material do crescimento em Hitchens Pike em placa de Agar Sangue, pela técnica de esgotamento.

b. Inocular a UFC típica de Staphylococcus nas provas bioquímicas (catalase, coagulase e DNAse)

c. Realizar a coloração de Gram 3º DIA:

a. Leitura e interpretação da placa de Agar Sangue b. Leitura e interpretação das provas bioquímicas

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ASSUNTO - Provas Bioquímicas para a Identificação de Bacilos Gram-negativos

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Bacilos gram negativos causam doenças em animais de produção (como a diarréia neonatal e salmonelose) e de companhia (infecções no trato urinário, abscessos, etc). Quanto à morfologia, são bastonetes pleomórficos, anaeróbios facultativos. É muito difícil distinguir os gêneros entre si por microscopia (observação visual). Características de crescimento Em condições anaeróbicas, são dependentes da presença de carboidratos fermentáveis. Os produtos finais da fermentação de açúcares são úteis para a identificação do microorganismo. Uma importante característica bioquímica de todas as espécies da família útil para o diagnóstico é a ausência de citocromo C, tornando-as oxidase negativas. Resistência Não resistem à luz solar, dessecação, pasteurização e desinfetantes comuns. Em ambientes sombreados, como pastos, estercos e cama de palha podem sobreviver por vários meses. Características de cultura Microorganismos entéricos (E.coli, Klebsiella, Enterobacter) crescem muito bem em Agar MacConkey. Os métodos utilizados para isolamento de patógenos entéricos dependem da fonte da amostra ser intestinal ou extra-intestinal. Quando a fonte é extra-intestinal e a amostra colhida de locais normalmente estéreis, o isolamento de qualquer microorganismo da família é significativo. Quando a fonte é intestinal, dois gêneros patogênicos são freqüentemente isolados de amostras de fezes: Salmonella e Shigella. Os princípios dos meios de cultura para isolamento de bactérias entéricas são: - Uma substância inibidora (normalmente um sal biliar ou um corante), que inibe o crescimento de bactérias gram positivas; - Um substrato utilizado ou não por Salmonella, Shigella e alguns outros microorganismos; - Um indicador de pH para revelar mudanças de cor do meio de cultura. O enriquecimento seletivo é feito em meios líquidos seletivos, visando aumentar a proporção de Salmonella em relação ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento: Os meios usados são o caldo tetrationato e o caldo selenito. Espécies de importância veterinária As espécies que mais freqüentemente acometem animais são: Enterobacter, E.coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella, Yersinia, Providencia. Dentre elas, as mais importantes são:

Þ E. coli – A principal espécie que compõe a flora normal do TGI inferior pode ser causa de doença septicêmica em potros, bezerros, leitões, filhotes de cães e cordeiros; de diarréia enterotoxigênica em neonatos de animais de produção e de doença edematosa em suínos (uma enterotoxemia aguda) e também causa a colibacilose dos pintinhos (Cepas potencialmente patogênicas que contaminam a

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superfície do ovo, por ocasião da postura, podendo penetrar a casca e infectar o saco vitelínico) ou o pintinho é infectado pelo trato respiratório. Pode também ser oportunista em quase todas as espécies animais.

Þ Salmonella – Tem o TGI como reservatório. Fontes de infecção incluem: solo contaminado, vegetação, água e componentes de rações animais (farinhas de peixe, carne e osso) e fezes de animais contaminados. Lagartos e cobras (geralmente assintomáticos) estão comumente infectados. A salmonelose é caracterizada por diarréia e resposta inflamatória no tecido linfóide e submucosa, podendo ou não ocorrer septicemia. É uma doença significativa em ruminantes, especialmente bovinos, afetando principalmente animais em confinamento. Pode ocorrer aborto após a septicemia e pneumonia adquirida por via hematógena em bezerros com S. dublin (que junto com S. typhimurium e S. newport são os sorotipos mais comuns em bovinos.) Em suínos apresenta-se como septicemia aguda e fulminante ou como doença crônica debilitante e é mais freqüentemente vista em suínos submetidos a stress, em regime de engorda, uma faixa etária em que a salmonelose é muito comum, sendo a S. typhimurium e S. cholerae suis os sorotipos predominantes. Em cavalos, cólica, cirurgia gastrointestinal e agentes antimicrobianos predispõem o animal ao desenvolvimento de sinais clínicos e S. typhimurium e S. anatum são os sorotipos comumente isolados. É incomum em cães e gatos. S. pullorum é específico de aves domésticas, causando a chamada pulorose. A bactéria infecta o óvulo de perus e galinhas e uma vez posto o ovo infectado, o ambiente de incubação é contaminado, infectando outras aves. A morte resulta de septicemia. Os animais e seus subprodutos também são importantes fontes de infecção para o homem, sendo o S. typhimurium o mais comum, produzindo gastroenterite. S. gallinarum causa o tifo aviário, uma doença septicêmica aguda ou grave que acomete aves adultas, principalmente galinhas. S. arizonae é o agente da arizonose aviária, freqüentemente isolada de perus. A bactéria se mantém nas granjas por meio de ovos incubados infectados após a ingestão do microorganismo pelas aves e também se dissemina pelas fezes.

Þ Shigella – Causa disenteria bacilar em primatas, principalmente em cativeiro. A doença parece estar relacionada a situações de stress ou disfunções imunológicas. O reservatório é o intestino grosso de animais clinicamente doentes, assintomáticos ou convalescentes. Drogas antimicrobianas e mudanças dietéticas aumentam o risco de infecção. S. flexneri 4 é isolada em doença periodontal de macacos. A Shigella é não fermentadora de lactose. OBJETIVO Identificar enterobactérias em gêneros ou espécies, utilizando-se para isso vários meios de cultura especiais, de acordo com o esquema a seguir: 1. Plaqueamento Seletivo Etapa de isolamento bacteriano a partir de espécies clínicos, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactérias Gram positivas são inibidas pela presença

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de eosina e azul de metileno. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose (LAC +) apresentam-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem centro negro, enquanto as não-fermentadoras (LAC -) formam colônias transparentes. 2. Triagem Conjunto de provas bioquímicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios, permitindo uma diferenciação inicial dos isolamentos e direcionamento da contaminação bioquímica. Quando realizada em meio TSI, podemos observar: - Fermentação de glicose e produção de gás - Fermentação de lactose e/ou sacarose - Produção de H2S Bactérias que utilizam apenas glicose provocam acidificação (de coloração amarela) apenas na base, permanecendo o ápice alcalino (de cor avermelhada). Bactérias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formação de gás é evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produção de H2S se manifesta pelo escurecimento do meio (devido a sua reação com o ferro). 3. Confirmação Bioquímica Conjunto de provas necessárias para a identificação bioquímica das colônias suspeitas. Algumas dessas provas estão descritas abaixo: a. Fermentação de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose. A utilização dos carboidratos leva à formação de ácidos, com viragem do indicador (vermelho de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar também a produção ou não de gás (CO2, H2) no interior do tubo de Durhan. A inoculação é realizada a partir de cultura bacteriana overnight (+/- 18h) em Agar. Incubar por 24 horas a 37ºC. Leitura: cor amarelada = + (positivo) sem alteração = - (negativo) b. VM: Verifica a ocorrência de fermentação ácido-mista ( glicose→ ácidos estáveis). Meio: Clark & Lubs. Inoculação: idem ao item a. Após incubação ( 48 h ), adicionar 3 – 5 gotas do reativo de VM (vermelho de metila → alcalino = amarelo pálido / ácido = vermelho). Leitura: Cor vermelha = + (Indica a produção de ácido estável) Cor amarela = - (Não houve produção de ácido estável)

c. VP ( Voges & Proskauer ): Verifica a ocorrência de fermentação acetoínica (glicose→acetoína). Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado). Inoculação: idem ao item a. Após inoculação (48 h), adicionar os reativos: VP I (Barrit I): alfa-naftol (0, 6 mL) VP II (Barrit II): KOH 40% (0, 2 mL) Leitura (após 10 – 15 minutos):

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* observar o aparecimento de anel vermelho na superfície do tubo (resultado positivo) * sem alteração: resultado negativo (forma-se um halo marrom)

d. Citrato: Verifica a utilização do citrato como única fonte de carbono. Meio: Citrato de Simmon. Inoculação: idem ao item a. Leitura:

* Meio azulado = + * Sem crescimento = - (O meio continua verde)

e. Indol:

Verifica a produção de triptofanase, que quebra triptofano, liberando indol, este é revelado com o reativo de Kovacs, observa-se a formação de um anel escarlate na superfície do meio. Meio: Caldo semi-sólido (SIM). Inoculação: idem ao item a. após a inoculação, adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs. Leitura: cor rosa = + Sem alteração = -

f. Mobilidade: Verifica se a bactéria é móvel ou imóvel. Meio: Agar semi-sólido (SIM). Inoculação: utilizar agulha bacteriológica, fazendo uma picada central até ¾ da profundidade do tubo. Leitura: Crescimento fora do local da picada = + (móvel) Crescimento somente ao redor da picada = - (imóvel)

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g. Nitrato: Verifica a capacidade de redução do nitrato ( NO3) à nitrito (NO2). Inoculação: idem ao item a. Após incubação, adicionar 3 a 5 gotas dos reativos: Nitrato A: alfa naftilamina Nitrato B: ácido sulfanílico Leitura: Cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3) Sem alteração = -

h. Uréia: Meio contendo uréia para verificar a produção da enzima urease. Inoculação: idem ao item a. Leitura: cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3) sem alteração = - OBJETIVOS Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de: 1- Compreender o papel das enterobactérias como agentes de toxinfecções alimentares; 2- Caracterizar e compreender o modo de ação dos meios de Teague (ou EMB) utilizado para o isolamento de bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e não fermentadores da lactose; 3- Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactérias; 4- Caracterizar as provas básicas de triagem e confirmação bioquímica para identificação e diferenciação de enterobactérias compreendendo seu mecanismo de ação. MATERIAL 1a. aula: tubo de caldo triptcase soja (TSB) com crescimento de enterobactéria; placa de ágar

EMB; 2a. aula: ágar TSI, ágar Citrato de Simmons, ágar SIM, caldo (água) triptonada; caldo MR-VP

(glicosado tamponado) [2 tubos]; caldo uréia, caldos de fermentação com glicose (e tubo de Durhan), lactose e manitol;

3a. aula: Reativo para indol (Kovac’s= paradimetilaminobenzaldeído); reativo para VM (vermelho de metila), reativos para VP (VP1= a-naftol; VP2= KOH)

PRÁTICA PARA EXECUTAR 1o. dia - inocular o meio de EMB com a cultura de TSB ATENCÃO: técnica de esgotamento em

estria !; 2o. dia - observar o crescimento obtido: anotar as características das colônias e comparar com os

dados da tabela abaixo:

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Característica colonial Gêneros (ou espécies) - colônias transparentes ou de cor âmbar Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia - colônias com brilho verde metálico à luz refletida e centro negro à luz transmitida

Escherichia coli

- colônias maiores que as de E. coli, mucosas, confluentes, com centro escuro à luz transmitida.

Enterobacter, Klebsiella

- inocular os meios de triagem e confirmação bioquímica da seguinte forma:

- TSI: picada central na coluna ou base e estria na superfície inclinada (agulha); - SIM: picada central até o meio do tubo (agulha); - citrato: estria reta na superfície (agulha); - caldo uréia, caldo triptonado, caldos MR-VP e caldos de fermentação: repique com

alça (difusão). 3o.dia - utilizando os reativos próprios, quando necessário, e segundo orientação do professor,

fazer as leituras das provas bioquímicas e conferir de acordo com a tabela a seguir, procurando identificar a enterobactéria estudada:

* exceto S. pullorum e S. gallinarum

Gênero GLI LAC SAC MAN H2S MOT IND CIT VM VP URE TSI GÁS

Salmonella + - - + + + * - + + - - Alc/ác

+

Escherichia + + +/- + - + + - + - - Ac/ác +

Klebsiella + + + + - - - + - + +/- Ac/ác +

Proteus + - +/- - + + +/- +/- + - + Alc/ác ou ác/ác

+

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ASSUNTO - Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) Método de Kirby-Bauer


O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias apresentam um perfil de sensibilidade previsível e constante, no entanto muitas outras são altamente suscetíveis ao desenvolvimento ou aquisição de resistência a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso adequado e criterioso de antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de amostras bacterianas multirresistentes. O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o esclarecimento objetivo do perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de drogas eficazes no tratamento. É feito principalmente para bactérias que realizam a conjugação.

O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo infeccioso mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na terapia não seja previsível como por exemplo: S. aureus, bacilos gram-negativos não fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactérias) etc.

Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior àquela que o antimicrobiano atinge no sangue, caso contrário ela é considerada resistente. O meio termo (bactérias moderadamente resistentes) é dado por aquelas cujo crescimento é inibido por concentrações intermediárias.

A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente. A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de difusão em placa com discos impregnados com as drogas.

No método de diluição, concentrações variadas do antibiótico, obtidas pela diluição em caldo ou Agar, são inoculadas com o microrganismo. A concentração mais baixa do antibiótico que evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 horas é a concentração inibitória mínima, é a medida da sensibilidade.

Nos testes pelo método de difusão, discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados uniformemente na superfície do Agar semeado com o microrganismo. Forma-se, então, um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco para o Agar com conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível ao (s) determinado (os) antibiótico (os).

Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os métodos de difusão com discos (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de diluição para os testes de rotina, mas é indispensável que sejam rigorosamente padronizados, porque a presença de algumas substâncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição.

Então utilizamos o meio enriquecedor denominado Muller-Hinton, que é um meio padronizado, de pH neutro, lembrando que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma coloração de Gram antes de qualquer TSA para a confirmação da pureza da cultura.

A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona sem crescimento em volta dos discos de antibiótico), o tamanho do halo sozinho não é uma medida quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais potente seja o antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos produzidos por antibióticos não relacionados são falsas e não devem ser realizadas. Deve-se interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação aos dados da tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica.

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o Limites para Interpretação do Antibiograma com 32 Antimicrobianos de uso corrente na Terapêutica Clínica

Antimicrobiano Símbolo CONC. DISCO. DIÂMETRO DO HALO DE INIBIÇÃO

RESISTENTE INTERMEDIÁRIO SENSÍVEL

Amicacina BB 30 mcg < 14 15-18 > 17

Ampicilina ao testar microorganismos gram-negativos e enterococos

AP 10mcg £ 11 12-13 ³ 14

Ampicilina ao testar estafilococos e microorganismos sensíveis à

Penicilina G

AP 10 mcg < 20 21-28 > 29

Ampicilina ao testar Haemophilus sp.

AP 10 mcg < 19 - >20

Ác. Nalidíxico NA 30 mcg £ 13 14 -18 ³ 19

Bacitracina BC 10 un. < 8 9-12 >13

Carbenicilina ao testar Proteus sp. e E. coli

CR 100 mcg < 17 18-22 > 23

Carbenicilina ao testar Pseudomonas aeruginosa

CR 100 mcg < 13 14-16 > 17

Cefalotina ao relatar sensibilidade a todas as cefalosporinas

CF 30 mcg < 14 15-17 > 18

Cefoxitina CT - £ 14 15-17 ³ 18

Clindamicina ao relatar sensibilidade à clindamicina e à lindomicina

CI 2 mcg < 14 15-16 > 17

Cloranfenicol CO 30 mcg £ 12 13 -17 ³ 18

Colistina CL 10 mcg < 8 9-10 > 11

Eritromicina EL 15 mcg £ 13 14-17 ³ 18

Estreptomicina ET 10 mcg £ 11 12 -14 ³ 15

Gentamicina GN 10 mcg < 12 13-14 > 15

Konanilcina KN 30 mcg < 13 14-17 > 18

Nalidíxico ácido AN 30 mcg < 13 14-18 > 19

Neomicina NO 30 mcg < 12 13-16 > 17

Nitrofurantoína NT 300 mcg < 14 15-16 > 17

Novoblocina NV 30 mcg < 17 18-21 > 22

Oxocilina OX 6 mcg < 9 10-13 > 14

Penicilina G. ao testar Estafilococos

PN 10 un. < 20 21-28 > 29

Penicilina G. ao testar outros microorganismos

PN 10 un. < 11 12-21 > 22

Penicilina G. PL 500 un. < 8 0-11 > 12

Polimixina - - £ 8 09-11 ³ 12

Sulfa-Trimetropim STX 30 mcg £ 10 11-15 ³ 16

Sulfazotrim (Sulfamotoxazol + Trimetoprim)

SFT 25 mcg £ 10 11 -15 ³ 16

Sulfonamidas SF 300 mcg £ 12 13-16 ³ 17

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Tetraciclina TT 30 mcg £ 14 15-18 ³ 19

Tobramicina TB 10 mcg £ 12 13-14 ³ 15

Vancomicina VC 30 mcg £ 9 10-11 ³ 12

OBJETIVOS 1. Determinar a sensibilidade de uma bactéria frente a diferentes antimicrobianos, para a escolha da droga mais adequada no tratamento de uma doença. 2. Interpretar um antibiograma em função do halo de inibição de diferentes antibióticos. MATERIAL - cultura pura recente do microorganismo em teste - discos com antimicrobianos - placas com Agar Mueller-Hinton - swabs estéreis - pinças, régua graduada. PRÁTICA PARA EXECUTAR 1. Inóculo: Cultura pura, em fase log, padronizado, diluída até obtenção de turvação semelhante ao tubo nº 0,5 da escala de McFarland (1,0x108) 2. Meio Mueller-Hinton, recente, em camada de 4 – 5 mm, pH = 7,2 – 7, 4, com umidade adequada. Em alguns casos pode ser enriquecido com 5% de sangue, etc. 3. Semeadura Inocular a cultura a ser testada na superfície do Agar, com o auxílio de um swab, para um crescimento confluente. 4. Antimicrobianos Com o auxílio de uma pinça flambada, aplicar os discos com antimicrobianos sobre o meio recém-semeado de modo eqüidistante. Identificar a placa e incubar a 37°C por 18 – 24 horas em posição invertida. Ocorrerá difusão das substâncias e suas concentrações diminuem gradativamente à medida que se afastam do disco. A eficiência de uma droga é demonstrada pelo aparecimento de um halo de inibição do crescimento do microorganismo. 5. Leitura Com o auxílio de uma régua graduada, medir o diâmetro dos halos de inibição, incluindo o diâmetro do disco. 6. Interpretação Interpretar a sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o diâmetro do halo de inibição encontrado em tabelas padronizadas que contém os valores em mm, para as drogas disponíveis comercialmente.

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7. Controle Usar como controles os seguintes microorganismos, de acordo com as drogas utilizadas: - Staphylococcus aureus ATCC 25923 - Escherichia coli ATCC 25922 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

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Notas: 1. leituras de 4 e 6 horas poderão ser feitas em caso de emergência, mas leituras definitivas deverão ser feitas somente após o tempo estipulado (18 – 24 horas) 2. Não usar sinais para expressar os resultados. Usar as letras “S” para os microorganismos sensíveis e “R” para os microorganismos resistentes. 3. Lembrar que um halo de inibição maior que outro não indica propriamente uma maior atividade do antibacteriano sobre o microorganismo em teste. Outros fatores, como carga antibiótica, difusibilidade, etc., intervêm na formação dos halos. Portanto, deve ser utilizada a tabela na interpretação dos resultados. 4. Atualmente, no intuito de minimizar erros de interpretação, considera-se a sensibilidade intermediária como resistente. RESULTADOS E OBSERVAÇÕES ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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ANEXO I TÉCNICAS DE COLORAÇÃO A utilização de corantes em microbiologia é atribuída a Goeppert e Cohn (1849). Os corantes empregados, geralmente derivados da anilina, têm fórmula quimicamente complexa, e são obtidos por síntese; quase sempre são sais de potássio ou de sódio, sendo classificados em: naturais, entre os quais podemos citar o carmim e a hematoxilina, e artificiais, que se dividem em: básicos ou nucleares, ácidos ou citoplasmáticos e neutros. As células bacterianas são ricas em ácido nucléico, conduzindo cargas negativas sob a forma de grupamentos fosfato, e estes se combinam com os corantes básicos, que são carregados positivamente. Os corantes ácidos não coram as células bacterianas, e por isso podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante. As soluções corantes são classificadas quanto ao veículo nos seguintes grupos: soluções aquosas, soluções hidroalcoólicas e soluções hidroalcoólicas mordentes. Utilizam-se as soluções aquosas quando se quer preservar a vitalidade dos microorganismos. A adição de substâncias mordentes tem a vantagem de preservá-las da contaminação mais ou menos estável entre ambas. Como exemplos de substâncias que funcionam como mordentes citamos o fenol, iodo, formol e tanino. As colorações podem ser simples, quando utilizamos um só corante, duplas e mistas. Assim podemos ter uma noção da morfologia dos germes utilizando uma coloração simples, e de outras informações com o emprego de técnicas especiais de coloração, como por exemplo, para diferenciar flagelos, cápsulas, paredes celulares, membranas celulares, grânulos, núcleos e esporos. I. TÉCNICA DE COLORAÇÃO ZIEHL-NEELSEN FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

O gênero Mycobacterium constitui um grupo que causa doenças no homem e nos animais superiores. No homem essas doenças variam de infecções superficiais até a tuberculose.

As micobactérias são microorganismos encontrados com facilidade no meio ambiente, com exceção do Mycobacterium tuberculosis e M. leprae. Podem sobreviver por longos períodos no solo, pois produzem esporos. Apresentam-se como bacilos longos, delgados, retos ou ligeiramente encurvados, imóveis e aeróbios estritos. Apresentam crescimento lento e alto conteúdo lipídico (ácidos micólicos) na parede celular. Esses lipídios são os responsáveis pela estabilidade ácida.

As micobactérias liberam tuberculinas (peptídeos bacterianos) no meio de cultura durante o crescimento. Pode-se desenvolver reações de hipersensibilidade tardia para esses peptídeos, durante a infecção, o que os torna reagentes diagnósticos úteis. As micobactérias são eliminadas pela luz solar e por radiação UV e pasteurização. Características do crescimento

Algumas espécies podem crescer em meios simples, mas em geral, crescem melhor em

meios orgânicos complexos, como o de Lowenstein – Jensen, que contém, entre outros ingredientes, ovos inteiros.

A presença de glicerol no meio favorece o desenvolvimento de M. tuberculosis , mas não de M. bovis e M. avium. A duração do desenvolvimento leva 12 horas ou mais, podendo passar semanas até que colônias sejam visíveis.

O crescimento de colônias dos bacilos de mamíferos é irregular. As formas aviárias crescem em colônias do tipo arredondadas.

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Espécies de importância veterinária

Þ M. tuberculosis – É o agente etiológico da tuberculose humana (típica) e de primatas. Esta pode se apresentar em

diversas formas clínicas, sendo a mais comum a pulmonar (cerca de 80%), a única forma clínica contagiosa. O teste confirmativo para diagnóstico da tuberculose é a demonstração do M. tuberculosis em material clínico (escarro, em humanos) colhido do paciente suspeito, através de baciloscopia, pelo Método de Ziehl-Neelsen ou cultura em meios apropriados (diagnóstico bacteriológico).

Þ M. bovis – Agente da tuberculose bovina e da zoonótica em humanos.

Þ M. avium – Agente da tuberculose aviária e em humanos imunossuprimidos (Tuberculose atípica)

Þ M. leprae – É o agente etiológico da hanseníase, uma doença que se caracteriza por lesões da pele, mucosas

e nervos periféricos. Caracterizam-se pela disposição em feixes ou globias. Até o momento não se obteve êxito para o seu cultivo em laboratório, sendo considerado parasita intracelular obrigatório. As rãs são potenciais reservatórios, sendo importantíssimo fazer controle em raniculturas. Esse é um dos motivos para a carne de rã não ser muito consumida atualmente.

A tuberculose é uma doença que se estabelece num processo crônico. A infecção em bovinos concentra-se no trato respiratório e em linfonodos e cavidades serosas adjacentes, ocorrendo disseminação hematógena.

Eqüinos são raramente infectados, mas com freqüência relativamente maior por M. avium do que por M. bovis e a infecção entra pelo trato alimentar.

Em suínos somente M. bovis causa doença progressiva com lesões clássicas, geralmente pela via alimentar.

Cães e gatos são susceptíveis a M. bovis e M. tuberculosis, mas raramente são infectados por M avium.

Canários e psitacídeos são mais susceptíveis a M. tuberculosis do que M. avium. A tuberculose bovina está erradicada em países industriais. É uma doença típica de cativeiro

e da domesticação, devido a alta transmissão nos grupos confinados. As lesões são mais intensas em indivíduos imaturos. A maior prevalência é em rebanhos leiteiros do que em rebanhos de corte, devido ao grande stress de produtividade em vacas leiteiras.

As micobactérias resistem à coloração de gram devido à espessura da camada de ácidos micólicos de sua parede.

A coloração de Ziehl-Neelsen é uma técnica de fácil execução, muito útil e importante para o diagnóstico clínico das micobacterioses e se fundamenta na propriedade tintorial que têm as micobactérias de quando coradas resistirem ao descoramento por soluções álcool-ácido (sendo, por isso, chamadas de BAARs - Bacilos álcool-ácido resistentes). A evidenciação direta de BAARs no material clínico suspeito (escarro, urina, líquor, fezes, lesões de pele e lavado gástrico) é apenas presuntiva, pois não identifica a espécie observada. OBJETIVOS

1. Evidenciar as características morfotintoriais de M. tuberculosis e micobactérias em geral. 2. Diagnóstico e avaliação do tratamento de tuberculose pulmonar.

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TÉCNICA

1. No material suspeito, observar o aspecto, coloração e presença ou não de sangue. 2. Na lâmina limpa e desengordurada, fazer o esfregaço do material com bastante assepsia,

retirando a alçada da porção mais densa. 3. Flambar a alça. 4. Deixar o esfregaço secar ao ar. 5. Fixar na chama do Bico de Bunsen. 6. Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo a lâmina até a emissão de

vapores (mais 5 minutos). OBS: É importante queimar os lipídeos da parede, amolecendo-os, para facilitar a entrada do corante. 7. Escorrer o corante e lavar com a solução álcool-ácido clorídrico 3% (diferenciador) – tempo

delicado. 8. Lavar com água OBS: Após esfriar, os lipídeos voltam ao normal e o corante não sai. 9. Cobrir a lâmina com solução de azul de metileno (contra corante) - (1 minuto) 10. Lavar, secar e observar ao microscópio com objetiva de imersão, óleo de cedro e

iluminação forte.

No método de Ziehl-Neelsen as micobactérias permanecem coradas, por serem BAARs, com tonalidade vermelha, enquanto as outras estruturas e bactérias se mostram azuis. Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra a Tuberculose, a interpretação da lâmina pode ser: Negativo (-) ausência de BAARs em 100 campos microscópicos Positivo (+) menos de 1 bacilo/campo em 100 campos Positivo (++) 1 a 10 bacilos/campo em 50 campos Positivo (+++) mais de 10 bacilos/campo em 20 campos

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II. TÉCNICA PARA EVIDENCIAÇÃO DE ESPIROQUETAS FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Os organismos espiralados de significado médico, os Treponemataceae, incluem três grupos patogênicos para o homem e vários outros animais: Leptospira, Borrelia e Treponema, responsável pelas doenças conhecidas como treponematoses, destacando-se T. pallidum, que causa a sífilis e o T. cuniculi, que causa a sífilis em coelhos. Os hospedeiros naturais são o homem, os macacos superiores e os coelhos, mas todos de sangue quente até agora testados podem ser infectados. Leptospirose é um termo aplicado à doença causada por todas as leptospiras, sem considerar o sorotipo específico. A doença ocorre em uma grande variedade de hospedeiros animais, domésticos e selvagens e nos seres humanos é uma ocorrência acidental. As leptospiras são classificadas pela composição antigênica, divididas em 23 sorogrupos e mais de 200 sorotipos. Os principais são: Hospedeiros adaptados Hospedeiros clínicos L. icterohaemorrhagiae Roedores (são os portadores

mais comuns de leptospiras) Cães, eqüinos, bovinos e suínos

L.canicola Cães Suínos e bovinos L. pomona Bovinos, suínos Eqüinos, ovinos L. hardjo bovinos Bovinos não adaptados Manifestações de leptospirose

o Canina: Doença septicêmica, hepática e renal. o Bovinos e suínos: doença septicêmica nos jovens, enquanto o aborto é a principal

manifestação em adultos, causado por morte fetal primária. Em leitões – septicemia com icterícia e hemorragias.

o Eqüinos: Aborto e uveíte recidivante (cegueira periódica ou oftalmia periódica), febre e icterícia moderada em infecções naturais.

Espiroquetas entram na corrente sanguínea após inoculação em mucosa ou trato

reprodutivo, colonizando vários órgãos, onde produzem alterações degenerativas, além de lesar o endotélio vascular, resultando em hemorragias.

A infecção do animal por um sorotipo adaptado ao hospedeiro cursa como um quadro inaparente. Infecções clínicas que manifestam sinais evidentes são decorrentes de infecções por sorotipos não adaptados ao hospedeiro.

A transferência direta ocorre por aerossóis de urina em baldes de leite e galpões bovinos ou pelos hábitos de cortejar dos cães, o que explica a predisposição dos machos a leptospirose canina. A vacinação em geral previne a doença, mas não impede infecção nem o estado de portador, embora reduza sua existência. Morfologia

A família Spirochaetaceae compreende bactérias de formas espiraladas, com 0,1 x 6 a 20 micrômetros, delgadas, tamanho variável, possuindo cinco gêneros. Esfregaços a fresco demonstram que são móveis. Características de crescimento

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São microorganismos anaeróbios estritos, que crescem melhor entre 29 e 30º C. O meio é essencialmente soro de coelho (<10%) em soluções que variam de salina normal a misturas de preparados de peptonas, vitaminas, eletrólitos e tampões. A maioria dos meios são líquidos ou semi-sólidos (Agar a 0,1%). Nos meios líquidos desenvolve-se ligeira turbidez. Em meios semi-sólidos, o crescimento é concentrado em um disco – chamado zona turva – cerca de 0,5 cm abaixo da superfície. São catalase e oxidase positivos. A identificação é baseada na sorologia. São eliminados por ressecamento, congelamento, calor (50º C por 10 minutos), sabão, ácidos biliares, detergentes e putrefação. Visualização

Como são microrganismos muito delgados e recobertos por uma bainha protéica, a

coloração de Gram não é útil na sua visualização. Para tanto são empregados métodos de impregnação com sais de prata de tecidos fixados – artifício que aumenta a espessura de sua parede - (método de Fontana-Tribondeau) que permite sua observação em microscopia de campo claro e a observação direta em microscopia de campo escuro. Os sais de prata, uma vez aquecidos sofrem oxidação e conseqüente escurecimento.

As espirais são mais bem demonstradas por microscopia eletrônica. O campo escuro é conseguido pelo uso de um condensador especial que faz com que os

raios luminosos penetrem na objetiva apenas pelos seus bordos de modo que a iluminação das partículas se faça por reflexão e não transmissão. Desse modo apenas as partículas presentes são iluminadas contrastando com um fundo escuro. Através desta visualização se faz possível inclusive a realização do diagnóstico por soroaglutinação microscópica (microaglutinação) na leptospirose.

Microorganismos transparentes, como os espiroque-

tídeos podem ser vistos mais facilmente quando observados em microscopia de campo escuro.

A microscopia de campo escuro deve ser limitada a urina, porque outros líquidos corporais contém artefatos similares a leptospiras. OBJETIVO - Evidenciação de espiroquetas através da microscopia de campo escuro e/ou impregnação pela prata.

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MATERIAL

a. Microscópio óptico (M.O.) b. M.O. + condensador c. Lâminas d. Reagentes Fontana-Tribondeau e. SWAB f. Álcool g. Óleo de cedro h. Solução salina i. Culturas em meios líquidos e sólidos

j. Exsudato positivo PRÁTICA PARA EXECUTAR – Microscopia em campo escuro

Partículas cujas dimensões são inferiores a 0,2micrômetros ou objetos cujos índices de refração são muito próximos daquele do meio em que estão suspensos não são visíveis ao microscópio óptico, ao exame em campo claro. Para vê-los, recorre-se ao artifício do campo escuro, que consiste em adaptar ao microscópio óptico comum um dispositivo que impede a penetração dos raios diretos provenientes de uma fonte luminosa intensa, de tal maneira que só penetram na objetiva os raios refratados e refletidos pelo objeto observado. Solução impregnadora (nitrato de prata amoniacal):

o Dissolver 5 g de nitrato de prata em 100 ml de água o Retirar alguns mL o Ao restante, adicionar gota a gota solução concentrada de amônia até que o precipitado

castanho formado dissolva-se totalmente. o Adicionar gota a gota a solução de nitrato que foi retirada até que apareça uma fraca

turvação persistente.

Resultado: num campo escuro as espiroquetas aparecem claras. - Método de Fontana-Tribondeau (Impregnação pela Prata)

· Preparar o esfregaço numa lâmina limpa e desengordurada · Secar ao ar · Fixar o esfregaço com líquido de Ruge durante 1 minuto · Lavar com água destilada · Cobrir a preparação com ácido tânico (mordente) e com chama de um swab embebido em

álcool, aquecer a lâmina com solução de nitrato de prata amoniacal aquecê-la até a emissão de vapores (30 segundos)

· Lavar com água destilada · Cobrir a lâmina com solução de nitrato de prata amoniacal e aquecê-la até a emissão de

vapore (30 segundos) · Lavar com água destilada

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· Secar ao ar · Examinar ao microscópio com objetiva de imersão.

Resultado: As formas espiraladas aparecem em marrom escuro em um campo marrom claro. Os espiralados possuem uma parede delgada que não é evidenciada pelos métodos habituais, o nitrato de prata impregna na parede.

Reagentes de Fontana-Tribondeau:

1. Líquido de Ruge - Ácido acético 1,0 mL - Formalina 2,0 mL - Água 100 mL

2. Mordente - fenol 1,0 g - ácido tânico 5,0 g - água 100 ml

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ASSUNTO - Colimetria


A água é elemento fundamental para a sobrevivência humana e animal.

As águas para abastecimento podem ser poluídas por derramamento de despejos dos mais diversos tipos, o que representa um grande risco para a saúde pública e grande impacto sobre os ecossistemas aquáticos. A noção de que o ambiente aquático pode servir de reservatório para espécies microbianas patogênicas e permitir a sobrevivência das mesmas é reconhecida desde os primórdios da civilização. Várias doenças podem ser veiculadas pela água, tais como febre tifóide, disenterias, leptospirose, tuberculose, doenças parasitárias e fúngicas. Essas doenças são resultantes da ingestão de água e alimentos contaminados ou do emprego de água poluída pela irrigação, pesca, lazer, piscicultura, cultura de marisco. Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitário, o esgoto doméstico é um dos principais responsáveis pela poluição das águas, estimulando o crescimento de microrganismos. A assimilação destes contaminantes orgânicos biodegradáveis é realizada com o concurso de bactérias presentes, por meio de um processo que consome o oxigênio dissolvido na água dos rios ou reservatórios. Quando a carga contaminante dos esgotos é superior a capacidade de auto depuração do rio ou açude, estes ficam sem oxigênio, ocasionando odores fétidos e impedindo a sobrevivência dos peixes.

Além dos esgotos domésticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial urbano contribuem grandemente na poluição dos corpos d’água. Os efluentes industriais contêm grande número de contaminantes, como metais pesados, entre outros. O escoamento superficial urbano contém todos os poluentes que se depositam na superfície do solo na ausência de chuvas, como lixo e matéria orgânica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros são arrastos quando da estação chuvosa para os cursos d’água superficiais, constituindo-se numa outra fonte de poluição. Os microrganismos dotados de potencial patogênico chegam às extensões hídricas procedentes das excreções intestinais do homem e de outros animais. Embora já existam métodos desenvolvidos para a detecção de vários organismos patogênicos de veiculação hídrica, os mesmos não são aplicáveis na rotina devido ao alto custo e necessidade de pessoal especializado.

Uma alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de organismos não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrência de contaminação fecal, evidenciando o risco da presença de patógenos. No indivíduo saudável essas bactérias constituem os habitantes normais do intestinos onde a Escherichia coli é a representante característica. O número desses microrganismos pode atingir 10 a nona células/g de fezes. Assim a presença da Escherichia coli em alimentos e água é indicativo de contaminação fecal e possibilidade de presença de patógenos entéricos.

Microrganismos indicadores de poluição de água são utilizados para monitorar, classificar e restringir o uso das águas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critérios: 1. Ser aplicável a todo tipo de água; 2. Estar presente simultaneamente com os microrganismos patogênicos, com um tempo de sobrevivência igual àquele patógeno entérico mais resistente; 3. Não se reproduzir em águas contaminadas, para não resultar em valores aumentados ( HAGLER E MENDONÇA-HAGLER, 1998 ).

Não se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismo que atenda a todos esses requisitos, mas há vários que se aproximam das exigências referidas e que são muito úteis.

As bactérias empregadas como indicadores de poluição fecal em águas são: os coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. O Indicador microbiológico mais empregado é o grupo dos coliformes. Este e outros indicadores de poluição orientam a margem de segurança sanitária de água potável, da água utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestíveis.

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A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda para águas recreacionais um máximo de 100 coliformes fecais por 100ml de água. Coleta de amostras

A coleta de amostras para exame microbiológico deve ser feita em garrafas esterilizadas

que tenham sofrido tratamento prévio de limpeza e rinsagem com água destilada. → Água clorada: adiciona-se 0,1 ml de tiossulfato de sódio 10% para cada 250ml de água para neutralizar o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades desinfetantes entre o período da coleta e o momento da inoculação. →Água com alto teor de cobre e zinco: coleta na presença de um agente quelante, de forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais ( 0,3 ml de EDTA a 15%, ph = 6,5para cada 120mL de água ). Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espaço livre na garrafa (cerca de 2,5 cm) para facilitar a homogeneização antes da inoculação. As garrafas devem ser mantidas vedadas até o momento da coleta da amostra e devem ser tomados todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar contaminações secundárias. Pontos de coleta

1. Água da torneira

a. Abrir a torneira e deixar correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a água na acumulada nas tubulações. b. Com algodão embebido em álcool, passar na abertura e internamente e em seguida flambar. c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos. d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a água. Introduzir água no frasco até cerca de três quartos do seu volume. e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratório.

2. Poços e Cisternas

a. Preparação do frasco – amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um barbante para facilitar a descida no poço. b. Descer o frasco dentro do poço sem permitir que o mesmo toque nos lados. c. Submergir o frasco completamente na água. d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da água para criar um espaço de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.

3. Rios, Lagoas e Mares a. Coleta da amostra de água de rios e lagoas – nestes casos deve-se mergulhar o frasco até uma profundidade de 20cm, com abertura voltada em direção contrária a corrente, a fim de evitar a contaminação da água com as mãos. b. Coleta da água do mar – a coleta deve ser feita na região onde as pessoas costumam banhar-se, que corresponde à profundidade aproximadamente de 1,0 m, que é a região das praias mais utilizada para a recreação de contato primário, na maré baixa e 24 horas sem chuvas.

Acondicionamento e transporte da amostra para laboratório

O ideal é a análise iniciar-se até 1 hora após a coleta. Caso isto seja impossível, a amostra deve ser transportada sob refrigeração. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10 graus Celsius no prazo máximo de até 30 horas após a coleta.

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Amostras presumivelmente poluídas têm de ser inoculadas no máximo após 6 horas da coleta.

Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculação, a mesma deve ser mantida em geladeira (cerca de 5 graus Celsius). Exames bacteriológicos da água

O exame bacteriológico da água é feito através de dois processos: Contagem de bactérias heterotróficas viáveis na água e determinação ou estimativa do número de bactérias coliformes.

A metodologia padrão empregada no exame bacteriológico da água, para medida do grupo coliforme, inclui dois procedimentos: a técnica dos tubos múltiplos e a técnica da membrana filtrante (“Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater” -APHA, 1980). - Determinação de coliformes pela técnica dos tubos múltiplos – NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)

A técnica do número mais provável consiste no exame de uma série de tubos onde foram

inoculados volumes diferentes de amostra. O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em fórmulas de

probabilidade. Considerações teóricas e determinações repetidas em grande escala indicam que este tipo de técnica tende a fornecer valores mais elevados do que o número real. As disparidades tendem a diminuir quando se adota séries com maior número de tubos em cada diluição. Portanto, a sensibilidade do teste depende do número de tubos adotados.

Existem várias tabelas de NMP e a escolha da série a ser adotada é função das características microbiológicas da amostra.

Tabelas de NMP/100 ml de amostra:

1. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP 16

2. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP > ou = 240

i. 1 X 1 ml ii. 1 X 0,1 ml

3. 3 X 10 ml ----- 3 > NMP > ou = 2400

a. 3 X 1 ml b. 3 X 0,1 ml

4. 1 X 50 ml ------ 1 > NMP > ou = 240

a. 5 X 10 ml b. 5 X 1 ml

5. 5 X 10 ml ----- 2 > NMP > ou = 2400

i. 5 X 1 ii. 5 X 0,1 ml

6. 5 X 50ml ----- 1 > NMP > ou = 240

→OBS: nos tubos onde o inoculo é de 10 ou 50 ml, usar concentração dupla do meio e volume igual ao inoculo.

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TABELA DOS PADRÕES MICROBIOLÓGICOS DE PROBABILIDADE VIGENTES

TUBOS POSITIVOS POR: Nmp PARA 100 ml 10 ml 1 ml 0,1 ml 3 tubos 0 0 0 < 3 0 0 1 3 0 1 0 3 0 2 0 6 1 0 0 4 1 0 1 7 1 1 0 7 1 1 1 11 1 2 0 11 2 0 0 9 2 0 1 14 2 1 0 15 2 1 1 20 2 2 0 21 2 2 1 28 2 3 0 30 3 0 0 23 3 0 1 39 3 0 2 64 3 1 0 43 3 1 1 75 3 1 2 120 3 2 0 93 3 2 1 150 3 2 2 210 3 3 0 240 3 3 1 460 3 3 2 1100 3 3 3 2400 Água potável: Ausência de coliformes totais Ausência de coliformes fecais PRÁTICA PARA EXECUTAR

Teste Presuntivo

Inocular, após a escolha da tabela, em tubos contendo caldo lauril sulfato triptose ou caldo de lactose em concentrações dupla ou simples. Os tubos devem conter tubinhos de Durham. O crescimento com formação de gás significa teste presuntivo positivo para coliformes totais. Os tubos que não apresentarem formação de gás com 24 horas de incubação devem ser incubados até 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente inoculados nos meios de confirmação para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos.

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Teste de Confirmação

· Coliformes Totais A partir dos tubos com formação de gás, semear por alçada (diâmetro =3 mm) em tubos contendo caldo de bílis para igual número de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 35 ± 0,5º por 48 ± 3 horas. A formação de qualquer quantidade de gás constitui teste positivo para coliformes totais.

· Coliformes Fecais Dos tubos positivos do teste presuntivo, transferir com uma alça de platina uma pequena porção do meio para igual número de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 44,5 ±0,2 ºC por 24 horas. A presença de gás no interior dos tubinhos de Durhan é considerada reação positiva, indicando contaminação de origem fecal. A ausência de gás mesmo com evidência de crescimento indica a presença de coliformes de outra fonte que não seja de intestinos de animais de sangue quente. Teste complemento A partir dos tubos positivos de caldo bílis verde brilhante, semear por estrias em placa contendo endo agar ou azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 ± 0,5ºC por 24 ± 2 horas. Colônias típicas: Meio endo agar - colônias vermelhas Meio agar BEM - colônias verdes com centro escuro. De cada placa, escolher uma ou mais colônias típicas e bem isoladas; transferir cada colônia para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril triptose e para um tubo inclinado de agar nutriente. Incubar a 35 ± 0,5ºC por 24 ± horas, prosseguindo a incubação até 48 ± 3 horas caso não tenha ocorrido formação de gás após a primeira incubação. RESULTADOS E OBSERVAÇÕES ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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- TÉCNICA DE FILTRAÇÃO EM MEMBRANA A técnica de filtração na membrana para análise da água passou a ser recomendada pelo "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", ao lado da ténica de NMP, após a 13ª edição. A recomendação afirma que a técnica pode ser adotada para determinar a potabilidade de qualquer água, desde que, após uma série de exames paralelos, obtenha-se com as duas técnicas, resultados compatíveis. Entretanto, deve ser observado, quanto à técnica de filtração em membrana: Vantagens: - Os resultados são obtidos após 22-24 horas. - Podem ser analisados volumes maiores e mais representativos das amostras. - Os resultados em membrana têm maior grau de precisão, em relação à técnica dos tubos múltiplos, proporcionando também maior reprodutibilidade. - Um maior número de amostras pode ser processado com um mínimo de espaço e equipamentos. Limitações: - As amostras com alta densidade de bactérias não coliformes, porém capazes de se desenvolver sobre o meio de cultura, pois os coliformes poderão ser impedidos de se desenvolverem ou senão a densidade de coliformes poderão ser impedidos de se desenvolverem ou senão a densidade de coliformes pode ser menor do que a obtida pela técnica do NMP. - águas com alta turbidez devido as algas ou substâncias em suspensão, pois estas podem formar uma película na superfície da membrana e interferir no desenvolvimento de colônias característica de coliformes. Técnica: Um volume de 100 ml de amostra é filtrada a vácuo através de uma membrana de 0,45 µ de diâmetro de poro. As bactérias ficam retidas na membrana e esta é transferida para placas apropriadas contendo almofadas de papel absorventes embebidas nos meios adequados. Meio para coliformes totais: Endo (caldo ou agar) Incubação 35 ± 0,5 ºC por 22-24 horas. Colônias Típicas: cor rosa ou vermelha escura com brilho metálico característico. Meio para coliformes fecais: M-FC-Broth Incubação: 44,5 ± 0,2º por 24 horas. Colônias Típicas: cor azul. RESULTADOS E OBSERVAÇÕES ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ANEXO

Padrões de crescimento de acordo com a necessidade de oxigênio

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Bibliografia

· Hirsh, Dwight C. e Yuan Chung Zee. Microbiologia Veterinária. 2ª edição, 2003. Editora: Guanabara Koogan.

· Trabulsi, Luiz Rachid e Alterthum, Flávio. Microbiologia. 3ª edição, 2000.

Editora: Atheneu

· Benson. Microbiological Applications – Laboratory Manual in General Microbiology. 8ª edição.

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