Apostila_genética_2003

7/27/2019 Apostila_gentica_2003

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UNIVERSIDADE DE SO PAULOFACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRO PRETO

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Alexandra A. C. NascimentoEnilza Maria Espreafico

Maria Luisa Pa LarsonNdia MonesiNilce Maria Martinez RossiVanderlei Rodrigues

Reviso 1: Eliana Valria PatussiMrcia A. S. Graminha

Reviso 2: Fbio Mrcio SquinaJosane de Freitas SousaRoberto RullerValeria Valente

2003


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I. CONCEITOS BSICOS

1. INTRODUO

At a dcada de 70, o DNA era o componente celular mais difcil deser analisado. Sua sequncia de nucleotdeos de enorme tamanho e

monotonia qumica era geralmente analisada atravs de meios indiretos

como a sequncia de protenas e anlise gentica. A partir da dcada de

70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a

purificao de genes especficos num processo chamado de clonagem

gnica. Na verdade, muitas destas tcnicas so provenientes da

Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e

permitiram que a anlise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA

tornou-se ento, a molcula mais fcil de ser analisada, sendo possvel

isolar regies especficas, obt-las em grande quantidade e determinar a

sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia.

A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou

denominar este conjunto de tcnicas, tem uma ampla aplicao. Ela podeser usada para estudar mecanismos de replicao e expresso gnica, na

determinao da seqncia de um gene e conseqentemente da protena

que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes

de produzir substncias teis tais como a insulina humana, hormnio de

crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua

aplicao comercial ou biotecnolgica parece ter um potencial

inesgotvel.

Como conseqncia do desenvolvimento desta tecnologia

atualmente possvel realizar investigao de paternidade e o diagnstico

de doenas genticas e infecciosas atravs da anlise de DNA.

2. CONCEITO DE CLONAGEM MOLECULAR

A origem do termo clonagem vem da Gentica Bacteriana que

considera uma colnia de bactrias como um clone porque todos os

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indivduos so geneticamente idnticos bactria inicial.

A tcnica central da metodologia do DNA recombinante a

clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagao de

molculas de DNA idnticas. A clonagem molecular compreende pelo

menos dois estgios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de

interesse chamado de inserto ligado a uma outra molcula de DNA

chamada de vetorpara formar o que se chama de DNArecombinante.

Segundo, a molcula do DNA recombinante introduzida numa clula

hospedeira compatvel, num processo chamado de transformao. A

clula hospedeira que adquiriu a molcula do DNA recombinante agora

chamada de transformante ou clula transformada.Um nico transformante, em condies ideais, sofre muitos ciclos

de diviso celular, produzindo uma colnia que contm milhares de

cpias do DNA recombinante.

3. ENZIMAS DE RESTRIO

Em 1953 foi descrito um estranho fenmeno no qual a eficincia dareplicao de um bacterifago (vrus de bactrias) dependia da clula

hospedeira na qual ele estava inserido. Algum tempo depois percebeu-se

que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens

bacterianas era devido a presena de nucleases altamente especficas

que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de

defesa bacteriano que degrada DNA que lhe estranho (restrio). A

bactria protege seu prprio DNA desta degradao camuflando-oatravs da metilao de algumas bases especficas (modificao). Como

conseqncia, este sistema frequentemente descrito como fenmeno

da restrio/modificao e existe em um grande nmero de bactrias.

As enzimas de restrio ou endonucleases de restrio so divididas

em vrias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos stios de

reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes

na Tecnologia do DNA Recombinante, so proteinas monomricas ou

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dimricas e clivam o DNA no mesmo stio do seu reconhecimento. O stio

de reconhecimento deste tipo de enzima normalmente uma seqncia

palindrmica, isto , ela tem um eixo de simetria e a seqncia de

bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na

direo oposta (Figura 1).

Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrio. As setasindicam os stios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro desimetria da sequncia.

Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares

de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita.

H 2 tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de

simetria da seqncia especfica, gerando extremidades abruptas, ou b)

os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria,

gerando extremidades coesivas. Estes dois tipos de clivagens e suas

conseqncias esto mostrados na Figura 1.Atualmente, mais de 1000 enzimas de restrio j foram

identificadas. A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviao do

nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra

representa o gnero e as outras duas a espcie, seguido de um algarismo

romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem

da qual ela foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio denominada

de EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de

transferncia de resistncia RI, enquanto que a Hind III isolada da

3

a ) C l i v a g e m n o e i x o d e s i m e t r i a

M o l c u l a s c o m e x t r e m i d a d e s a b r u p t a s M o l c u l a s c o m e x t r e m i d a d e s c o e s i v a s

b ) C l i v a g e m s i m t r i c a m e n t e s i t u a d a a or e d o r d o e i x o d e s i m e t r i a

. . . T C G A . . .

. . . A G C T . . .

3

5 3

5

+

. . . G A A T T C . . .

. . . C T T A A G . . .

+

3

5 3

5


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Haemophilus influenzae, linhagem d III.

A Tabela 1 mostra a seqncia palindrmica e o local de clivagem

de algumas enzimas de restrio. Note que algumas enzimas deixam

terminaes coesivas enquanto que outras fazem cortes abruptos ou no

coesivos.

Tabela 1. Algumas endonucleases de restrio: origem e stios de clivagem. A

seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a

qualquer purina e pirimidina.

O interesse por estas enzimas de restrio aumentou em 1973quando se percebeu que elas poderiam ser usadas para fragmentar o

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M i c r o r g a n i s m o E n z i m a S e q u n c i a A l v o

E c o R IE s c h e r i c h i a c o l i

B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s H

H a e m o p h i l u s a e g y p t i u s



P r o v i d e n c i a s t u a r t i i

S t r e p t o c o c c u s a l b u s G

T h e r m u s a q u a t i c u s

S e r r a t i a m a r c e s c e n s

B r e v i b a c t e r i u m a l b i d i u m

B a c i l l u s g l o b i g i i

B a m H I

B g l I I

P s t I

B a l I

S m a I

H a e I I I

T a q I

S a l I

H i n d I I I

H a e I I

G A A T T C

C T T A A G

G G A T C C

C C T A G G

A G A T C T

T C T A G A

P G C G C P iP i C G C G P

u

y u

A A G C T T

T T C G A A

C T G C A G

G A C G T C

G T C G A C

C A G C T G

T G G C C A

A C C G G T

A G G C C T

T C C G G A

C C C G G GG G G C C C

T C G A

A G C T


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DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitiam a

ligao dos fragmentos. Isto significava que a recombinao poderia ser

efetuada em tubos de ensaio. Alm disto, DNA bacteriano poderia

recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espcie, abrindo a

possibilidade de clonar genes humanos ou isolar protenas de culturas

bacterianas.

Uma importante conseqncia da especificidade destas enzimas de

restrio que o nmero de clivagens feito por cada uma delas no DNA

de qualquer organismo definido e permite o isolamento de fragmentos

deste DNA. Portanto, cada enzima de restrio gera uma famlia nica de

fragmentos quando cliva uma molcula de DNA especfica. Enzimas quereconhecem stios de restrio compostos por 4 pares de bases clivam o

DNA em mdia a cada 256 nucleotdeos (44=256). Aquelas que

reconhecem stios com 6 e 8 pb clivam o DNA em mdia a cada 4096 e

65536 pb, respectivamente. No entanto, esta mdia pode sofrer

variaes significativas, dependendo principalmente da composio de

bases do DNA analisado. Por exemplo, a enzima NotI reconhece um stio

de restrio contendo 8pb, incluindo nucleotdeos CpG, que raramente

ocorre no DNA de mamferos.

A famlia de fragmentos gerados por digesto com enzima de

restrio geralmente detectada pela separao destes fragmentos por

eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em funo de

seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente

(Figura 2).

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Figura 2. Molculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas poreletroforese. Molculas menores movem-se mais rapidamente que molculasmaiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA corado combrometo de etdio, uma molcula que fluoresce quando iluminada com luzUltra Violeta.

4. CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE

Uma enzima de restrio particular reconhece somente uma

seqncia nica de bases. DNAs de origens diferentes sob a ao da

mesma enzima de restrio produzem fragmentos com o mesmo

conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois

diferentes organismos (por exemplo, bactria e homem) podem ser

ligados por renaturao das regies de fita simples. Alm disto, se a

ligao for "selada" com a enzima DNA ligase, depois do pareamento debases, os fragmentos sero ligados permanentemente.

6

S

e

n

t

i

d

o

d

a

m

i

g

r

a

o

P a r e s d eb a s e


9/104

A tcnica de DNA recombinante tem um interesse especial se uma

das fontes de DNA clivado for um plasmdeo.

Figura 3. Construo de uma molcula de DNA hbrida a partir de fragmentosde diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrio.

A figura 3 mostra uma molcula de DNA de plasmdeo que temsomente um stio de clivagem para uma determinada enzima de

restrio. A mesma enzima usada para clivar DNA humano. Se os

fragmentos de DNA humano so misturados com o DNA plasmidial

linearizado, permitindo a ligao entre eles, uma molcula de DNA

plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmdeo

hbrido pode ser inserido numa bactria atravs de transformao e

ento o inserto ser replicado como parte do plasmdeo. Geralmente,

antibiticos so acrescentados ao meio da cultura para selecionar somente

as linhagens que portam os plasmdeos (o plasmdeo usado para esta

finalidade porta resistncia a pelo menos um antibitico).

5. DNA LIGASE

7

P l a s m d e od e

E . c o l i

D N A h u m a n o

D N A l i g a s e

P l a s m d e o h b r i d o

E n z i m a E n z i m a

G C A T

T A C G

T G C A T G C A

A C G T A C G T

TG CA

ACGT

TGC A

TGC

A

A

CGT AC

GT


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Conforme mencionado anteriormente, esta enzima promove a ligao

dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases

de restrio. A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de

uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra

cadeia (Figura 4). A E.coli e o fago T4 codificam uma DNA ligase capaz de

selar fragmentos de DNA com dupla fita. DNA ligase isolada de E.coli e de

outras bactrias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacterifago T4

requer ATP como cofator.

Figura 4. DNA ligase cataliza a juno de duas fitas de DNA que so partesda molcula da dupla-hlice.

5.1. Tipos de fragmentos de DNA que so ligados pela DNA

ligase

a) Fragmentos com extremidades coesivas

As extremidades coesivas produzidas por vrias enzimas de

restrio permitem que dois fragmentos de DNA sejam mais facilmenteligados. Isto porque ocorre inicialmente o pareamento das fitas simples

das extremidades coesivas das duas diferentes molculas, atravs da

formao de pontes de hidrognio pela complementariedade das bases.

Finalmente, a ligao covalente (fosfodister) dos fragmentos realizada

pela DNA ligase (ver figura 4).

b) Fragmentos com extremidade no coesivas

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D N A D N A3 O H-

O O 5 P

O

-

O

D N A D N A 3 O O 5

O

P

-

O

+

D N A - L i g a s eA T P o u N A D


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DNAs portando extremidades no coesivas so ligados com muito

menos eficincia que aqueles que tem extremidades coesivas. Uma

concentrao muito maior de DNA ligase e mesmo dos DNAs envolvidos

necessria para que as molculas com extremidades no coesivas sofram

reao de ligao.

No entanto, a ligao deste tipo de fragmento facilitada pela

transformao prvia das extremidades no coesivas em coesivas. Este

procedimento pode ser feito atravs de dois processos:

a) Adio de polidesoxiadenina na extremidade 3' de um fragmento

de DNA e polidesoxitimina na extremidade 3' de um outro fragmento de

DNA, atravs da enzima desoxinucleotidil-transferase-terminal ousimplesmente transferase. Esta enzima, uma DNA polimerase incomum,

adiciona nucleotdeos extremidade 3-OH de fragmentos fita simples

proeminentes de uma cadeia de DNA. Para gerar este tipo de

extremidade proeminente a molcula tratada previamente com uma

exonuclease 5-especfica para remover alguns nucleotdeos terminais.

Aps a mistura dos dois tipos de fragmentos complementares e

anelamento dos mesmos, as molculas so unidas preenchendo-se os

espaos existentes com o auxlio da DNA pol I e selando-os com DNA

ligase (Figura 5)

b) Adio de adaptadores s extremidades no coesivas. Os

adaptadores so oligonucleotdeos sintticos que contm stios de

clivagem para uma ou mais enzimas de restrio. Eles so unidos ao DNA

com o auxlio da DNA ligase (Figura 6).

Alternativamente, no lugar de modificar a extremidade no coesiva,

pode-se optar pela utilizao de T4 ligase em grande concentrao, o que

permitir a ligao entre molculas de DNA sem proeminncias.

6. TRANSFORMAO BACTERIANA

6.1.Conceito de transformao induzidaO processo de transformao constitui um evento de alta

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importncia na tcnica de manipulao gnica. A transformao natural

descrita por Griffith, em 1928, e por Avery e colaboradores, em 1944,

um evento raro. No entanto, em 1970, Mandel e Higa encontraram que a

E.coli tornou-se marcadamente competente para transformao com

DNA exgeno, quando a bactria foi suspensa em cloreto de clcio

gelado e submetida a um curto choque trmico 42oC. Estes mesmos

autores tambm verificaram que as bactrias crescidas at a fase log

eram mais competentes do que aquelas isoladas de outros estgios do

crescimento.

Figura 5. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadas

em coesivas pela adio de poli (A) e poli (T).

10

5 5

5 5 3

3

A A A A T T T T

3

3

3

A A A A T T T T

3

3

3

5 - E x o n u c l e a s e e s p e c f i c a

D e o x i n u c l e o t d i o t r a n s f e r a s e t e r m i n a l

E s p a o s p r e e n c h i d o s c o m D N A P o l I . D N A l i g a s ep a r a c o m p l e t a r a l i g a o

+ d A T P + d T T P


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Figura 6. Fragmentos de DNA com extremidades no coesivas podem ser transformadosem coesivas pela adio de adaptadores e posterior tratamento com a enzima de restrioque reconhece o adaptador.

O procedimento do cloreto de clcio que usado at hoje produz

uma eficincia de transformao da ordem de 105 a 107 transformantes

por micrograma de DNA (a eficincia de transformao geralmente

expressa como o nmero de clulas transformadas, obtido a partir de um

micrograma de DNA plasmidial intacto).

O tamanho e a conformao da molcula do DNA, afetam o

processo de transformao. Plasmdeos pequenos so mais facilmente

incorporados pela clula bacteriana competente; DNA linear

pobremente incorporado, talvez pelo fato de sofrer degradao pelasenxonucleases presentes no espao periplasmtico.

6.2. Mecanismos de captao do DNA

O mecanismo de captao da molcula do DNA pela bactria

competente ainda desconhecido. Uma hiptese que as molculas do

DNA passam atravs de canais situados nas chamadas zonas de adeso,que so locais onde a membrana interna e externa da clula bacteriana

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D N A a s e r i n s e r i d o

+

G A A T T C

C T T A A G

A d a p t a d o r

S i n t t i c o

T 4 D N A l i g a s e

G A A T T C

C T T A A G

G A A T T C

C T T A A G

E c o R I

A A T T CG

GC T T A A

G A A T T C

C T T A A GV e t o r

E c o R I

G A A T T CC T T A A G


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unem-se formando poros. Estes poros s esto presentes durante o

crescimento bacteriano (fase de crescimento exponencial).

Em condies naturais, a captao do DNA torna-se difcil devido a

repulso eletrosttica existente entre as cargas negativas da camada de

fosfolipdeos da membrana bacteriana e dos grupo fosfato da molcula

do DNA.

O papel do clcio explicado pela hiptese de que a 0oC a fluidez

da membrana celular cristalizada, estabilizando a distribuio dos

fosfatos carregados. Os ons Ca+2 formam um complexo com este

grupamento, cobrindo as cargas negativas e assim facilitando a atrao

eletrosttica com as molculas do DNA na zona de adeso. O choquetrmico, complementa este processo de captao, provavelmente

criando um desbalano trmico entre o interior e o exterior da clula

bacteriana, auxiliando o bombeamento do DNA atravs da zona de

adeso. A figura 7 ilustra este processo.

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Figura 7. Mecanismo molecular proposto para explicar a transformao de E.coli com uma molcula de DNA exgeno.

II. VETORES DE CLONAGEM MOLECULAR

Aps o isolamento de uma informao gentica, por exemplo um

fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrio, este

fragmento dever ser inserido numa outra molcula de DNA diferente,

capaz de amplificar aquela informao gentica em centenas de cpias.Este processo de amplificao obtido atravs do uso de molculas de

DNA que so os chamados vetores de clonagem molecular.

Atualmente, os tipos bsicos de vetores usados na metodologia do

DNA recombinante apresentam caractersticas especiais que os tornam

excelentes veculos de clonagem em diferentes situaes.

A seguir, vamos apresentar os principais tipos de vetores

atualmente em uso na biologia molecular.

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- - - --

-- - ---

-

-

-

-

-

-

-

--

-

-

--

-

-

-

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

- - - - -

----

Z o n a d e a d e s o

P l a s m d e o

B i c a m a d a l ip d i c a( i n t e r n a )

B i c a m a d a l i p d i c a( e x t e r n a )F o s f o l i p d e o s

o n d e c l c i o

C a m a d a p e p t i d og l u c a n

D N A g e n m i c o C l u l aB a c t e r i a n a


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1. PLASMDEO

Plasmdeos so pequenas molculas de DNA dupla fita, contendo

os elementos necessrios para a sua replicao e pelo menos um gene

que confere resistncia a antibitico. Estes elementos genticos extra

cromossomais variam de 5 a 400 kilobases e comumente esto presentes

em duas ou mais cpias por clula. Os plasmdeos presentes num grande

nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que

capacitem a amplificao do segmento do DNA neles clonado.

Um plasmdeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as

seguintes propriedades:

a) possuir uma origem de replicao (O), ou seja, uma seqncia de

DNA que permita que o vetor seja replicado na clula hospedeira;

b) apresentar dois ou mais stios nicos de clivagem para endonucleases

de restrio. O conjunto destes stios, denominado de Mltiplos Stios

de Clonagem (MSC), o local onde o inserto incorporado ao vetor de

clonagem;

c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a clula

transformada da clula no transformada. Por exemplo, muitos vetoresde clonagem carregam o gene que confere resistncia ampicilina

(AmpR). As clulas transformadas com tais vetores so capazes de

crescer num meio contendo o antibitico, enquanto que as clulas no

tranformadas acabam morrendo.

A figura a seguir ilustra as principais caractersticas estruturais de

um plasmdeo.

14

A m p R

O

M S C


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Figura 8. Estrutura molecular de um plasmdeo tpico usado em clonagemmolecular. Esto representados o gene de resistncia (AmpR), a regio demltiplos stios de clonagem (MSC) e a origem de replicao (O).

Um dos passos fundamentais no processo de clonagem molecular

o uso de enzima de restrio que produz extremidades compatveis

durante a clivagem do DNA a ser clonado (inserto) e a do DNA receptor

(vetor).

Uma vez que o DNA foi ligado ao vetor, esta molcula hbrida

dever ser introduzida numa clula hospedeira geralmente bactrias, por

um processo chamado de transformao, para que o vetor possa sofrer

replicaes e consequentemente amplificar o nmero de cpias do

inserto. A bactria transformada ser facilmente reconhecida pela

aquisio de um novo fentipo dado pelo plasmdeo, ou seja, capacidade

de crescer em meios contendo antibitico.

2. FAGOS

Um dos vetores mais utilizados nos processos de clonagem

molecular o denominado bacterifago , o qual comporta-se como umvrus da E.coli. Antes de analisarmos o uso deste elemento como veculo

de clonagem molecular, vamos mostrar resumidamente as suas

propriedades biolgicas e estruturais.

2.1 Biologia do fago O fago um parasita obrigatrio da E.coli, o qual

necessariamente deve injetar o seu DNA na bactria hospedeira para a

sua multiplicao. Aps a infeco da E.coli o genoma do fago pode

seguir duas vias:

a) No primeiro caso denominado estado ltico, o DNA do fago

permanece na bactria como uma molcula independente, havendo aativao de alguns genes do fago e a concomitante inativao de outros,

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dentro de um programa estritamente definido. Como resultado o

cromossomo do fago replicado ativamente, ocorre a sntese das

protenas da capa e da cauda e formam-se novas partculas virais. Em

aproximadamente 45 minutos aps a infeco a clula hospedeira

lisada havendo a liberao de cerca de 100 novos fagos.

b) A outra via que o cromossomo do fago pode seguir o denominado

estado lisognico. Neste caso, o DNA do fago integrado no

cromossomo da bactria passando a ser chamado profago. No estado

lisognico, todos os genes do profago esto inativos com excesso do

gene que produz a protena repressora. A bactria hospedeira carregando

o profago multiplica-se e este replicado passivamente e distribudo paraas bactrias descendentes.

Em condies naturais a opo entre seguir o estado ltico ou

lisognico depende das condies do meio. Assim, via de regra, em meio

rico em nutrientes o estado ltico preferencial, por exemplo o fago na

bactria E.coli intestinal. Por outro lado, em meio pobre de nutrientes

como o caso da E.coli no solo, o fago prefere o estado lisognico. Em

condies experimentais, o estado a ser seguido depende de um balano

entre os fatores do meio intra e extra celular e de fatores genticos da

bactria hospedeira e do bacterifago.

2.2 Genoma do fago O bacterifago uma partcula viral constituda de

aproximadamente 50% de protenas e 50% de DNA. O DNA do fago , na

forma como ele isolado da partcula viral, uma molcula linear com

dupla fita de aproximadamente 48.500 pares de bases. As extremidades

da molcula contm uma frao de DNA fita simples com cerca de 12

nucleotdeos, os quais so complementares na sequncia de bases e

atravs delas que o DNA assume a forma circular quando ele injetado

na clula hospedeira. Estas extremidades so denominadas de stios

cos. O genoma do fago codifica para aproximadamente 50 protenas,

16


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cujos genes tem um cronograma de expresso bem definido, o que

determina a instalao do estado ltico ou lisognico.

As figuras 9 e 10 ilustram o ciclo biolgico do fago em uma

clula hospedeira e o genoma do fago com alguns dos seus principais

genes, respectivamente.

2.3 Controle de expresso dos genes do fago Seja qual for a via a ser seguida pelo fago , ou seja via ltica ou

lisognica, a expresso dos genes envolvidos nestes circuitos comea

pelos produtos dos genes N e Cro, regulados pelos promotores pL e pR

respectivamente situados esquerda (pL) e direita (pR) do gene cI.

Durante o transcurso da via ltica, o produto do gene cro est

diretamente relacionado com a replicao do genoma do fago , atravs

da induo da expresso dos genes OP. Por outro lado, o produto do

gene N est diretamente relacionado com a expresso dos genes da

regio de empacotamento, ou seja genes A eJ, responsveis pela sntese

das protenas da cabea e da cauda do fago , como tambm daexpresso dos genes S e R, diretamente envolvidos com a lise da clula

hospedeira.

17

1

2

6

34

5


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Figura 9. Replicao do fago no interior da clula hospedeira. Apsadsoro (1) e injeo (2) do genoma do fago na bactria, a via lticaindicada pelos nmeros 3, 4 e 5 leva a formao de novas partculas virais.Alternativamente, a via lisognica (6) pode ser ativada levando integraodo material gentico viral ao genoma da bactria hospedeira.

Figura 10. Representao esquemtica do genoma do fago .

Durante a via lisognica, a transcrio tambm inicia-se pelos

promotores pL e pR coordenando a expresso dos genes cII e cIII. O

produto destes dois genes coordena a expresso do gene cI que produz

uma protena repressora inibindo a expresso dos genes responsveis

pelo empacotamento e a lise. Por outro lado, um outro gene importante

o int, cujo produto relaciona-se com a integrao do fago no genomabacteriano estabelecendo o estado lisognico.

2.4 O uso do fago como vetor de clonagem molecularDurante o ciclo ltico, os genes envolvidos no processo de lisognia

so dispensveis e consequentemente a regio de integrao do genoma

do fago pode ser totalmente substituda por um outro fragmento de DNA,sem que haja qualquer alterao nos processos envolvidos na via ltica.

Uma das maiores vantagens de usar o fago como vetor de

clonagem que o DNA inserido no fago empacotado in vitro. Embora a

eficincia de empacotamento seja cerca de 10%, uma vez que os fagos

so empacotados teremos 100% de eficincia na infeco da E.coli

hospedeira. Este processo altamente eficiente quando comparado com

o da transformao bacteriana com plasmdeos. Neste caso, os melhores

resultados situam-se ao redor de 108 transformantes por g de DNA o que

18

E m p a c o t a m e n t o R e c o m b i n a o R e g u l a o R e p l i c a o L i s e

c o s A J

N C r op L p r

. c I I I c I c I I O P S Ri n t


21/104

significa que menos de 1 em 1000 plasmdeos so incorporados na E.coli

hospedeira.

Atualmente, existem vrios derivados do fago nos quais um ou

mais stios de restrio flanqueiam a regio de recombinao, facilitando

a sua substituio por um outro DNA. Estes so os chamados vetores de

substituio. Um exemplo tpico destes vetores o EMBL3, no qual a

regio de recombinao flanqueada pelas enzimas de restrio EcoRI,

BamHI e SalI. Esse vetor quando quando clivado pode receber

fragmentos de DNA variando de 10,4 a 20 kb, como mostra a figura

abaixo.

Outros derivados do fago so os chamados vetores deinsero. Neste tipo de vetor, os fragmentos de DNA que podem ser

inseridos devem ter no mximo at 7kb de tamanho para no alterar os

processos de empacotamento do genoma do fago.

Os vetores de insero derivados do fago mais bem utilizados

especialmente na clonagem de cDNA, so os vetores gt10 e o gt11.

Vamos a seguir fazer algumas consideraes sobre estes dois tipos de

vetores.

No fago gt10, o inserto geralmente cDNA, inserido no stio da

EcoRI situado no gene repressor cI. O fago recombinante ter agora o

gene cI obstrudo e consequentemente durante a cultura provocar a lise

das colnias de bactrias transformadas. Essas colnias lisadas so

visualizadas como crculos com o centro claro (placas de lise), bastante

distintos das colnias no recombinantes, que por possurem o gene cIntegro no so lisadas e permanecem como colnias turvas.

19


22/104

Figura 11. Representao esquemtica da clonagem de um fragmento deDNA genmico no fago . As regies indicadas por a contm todas asinformaes necessrias para replicao em E. coli e empacotamento in vitro.Os diferentes fragmentos obtidos da digesto do DNA de interesse com

enzima apropriada esto indicados pelas letras b e c, onde somente c possuitamanho adequado para o empacotamento.

Por outro lado, o fago gt11 contm um stio de restrio EcoRI

localizado num gene chamado LacZ, a 53 nucleotdeos do cdon de

trmino da enzima codificada por esse gene (-galactosidase). Essa

enzima, cuja expresso pode ser induzida por IPTG (isopropil--D-

galactosdeo), degrada o substrato X-gal produzindo um precipitado decor azul. Portanto, colnias de bactrias carregando o DNA do fago com o

20

E c o R I

E c o R I

l i g a s e

e m p a c o t a m e n t oi n v i t r o

a

a

b

b

b

b

c

D N A b a c t e r i f a g o

D N A c a m u n d o n g o

b a c t e r i f a g o

c o n t e n d o

g e n e s d o

c a m u n d o n g o

i n f o r m a e s

d e s n e c e s s r i a s

r e p l i c a o

c


23/104

gene LacZ intacto (sem inserto), na presena do indutor IPTG e do

substrato X-gal, ficaro azuis. Enquanto que, aquelas portanto o DNA o

fago que incorporou o inserto no stio de EcoRI, no expressam a -

galactosidade e permanecem de cor branca, o que facilita a identificao

dos clones recombinantes.

3. COSMDEO

A clonagem de fragmentos de DNA no fago apresenta uma

limitao, pois o fragmento a ser clonado no pode ser maior do que

cerca de 15kb (Figura 12). Na maioria das vezes, esta dimenso

suficiente para conter um gene completo, incluindo as sequnciasflanqueadoras. Entretanto, muitos genes apresentam dimenses da

ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a tcnica usada para a clonagem

deste tipo de fragmento a chamada clonagem em cosmdeos.

Os cosmdeos, so plasmdeos que contm um fragmento de DNA

do fago que inclui o stio cos. Estes cosmdeos podem ser usados como

veculos de clonagem molecular empregando o sistema deempacotamento in vitro que reconstitui a estrutura do fago (cabea e

cauda) e assim usado para infectar a clula hospedeira.

As enzimas do sistema de empacotamento do fago reconhecem

os dois stios cos situados de 35 a 49 kb de distncia e neste caso,

somente fragmentos desta ordem de tamanho sero convenientemente

empacotados.

O DNA genmico de interesse clivado com uma enzima de

restrio que produz grandes fragmentos de DNA, os quais sero ligados

ao cosmdeo, tambm clivado com a mesma enzima.

A situao ideal que cada fragmento do DNA genmico

apresente um stio cos nas suas extremidades. Durante o

empacotamento, as enzimas do sistema reconhecem os stios cos

situados a uma distncia dentro de 49Kb, clivam estes stios e

empacotam estas molculas.

21


24/104

O DNA do cosmdeo injetado no interior da clula hospedeira,

circulariza igual ao DNA do fago e replica como um plasmdeo normal,

sem expresso de qualquer funo do fago. As clulas infectadas sero

selecionadas com base na resistncia adquirida a um determinado

antibitico. A figura 12 ilustra um tpico processo de clonagem em

cosmdeo.

Figura 12. Esquema de clonagem em cosmdeo.

4. VRUS

A biologia molecular dos vrus de DNA e RNA foi extensivamente

estudada antes do advento da metodologia do DNA recombinante. O

vrus SV40, isolado de clulas tumorais de macacos, foi um dos

22

f r a g m e n t o s d e r e s t r i o

d e 3 5 a 4 0 k b

A m pR S t i o a l v o d e r e s t r i o

c o s

D N A c i r c u l a r i z a

a p s i n f e c o

s e l e o d ec l o n e s r e s i s t e n t e sa a m p i c i l i n a


25/104

primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas de

mamferos. O DNA do SV40 apresenta 5.200 pares de bases e pode ser

dividido em duas regies quanto a expresso gnica viral. Estas regies

so chamadas de regio precoce e regio tardia.

A regio precoce expressa atravs do ciclo ltico, enquanto que a

expresso dos genes da regio tardia ocorre somente aps o incio da

replicao do DNA viral. Entre estas duas regies situa-se a origem de

replicao do DNA do vrus.

Um produto de expresso da regio precoce o antgeno T, o qual

responsvel pela transformao maligna de clulas no permissveis

(clulas nas quais o vrus no completa a sua replicao), como tambmpelo incio da replicao viral em clulas permissveis. Os produtos de

expresso codificados pela regio tardia correspondem s protenas que

formam o capsdeo da partcula viral. A figura 13 ilustra o genoma do

virus SV40.

Figura 13. O DNA do virus SV40

4.1. Clonagem no vrus SV40

A produo de DNA recombinante no vrus SV40, pode ser

realizada atravs da substituio do segmento de expresso precoce ou

do segmento de expresso tardia.

23

o

E x p r e s s op r e c o c e

E x p r e s s ot a r d i a

S V 4 0

G e n o m a d o S V 4 0


26/104

No primeiro caso, o vrus recombinante no produz o antgeno T,

ao passo que na segunda opo no haver produo das protenas do

capsdeo. Entretanto, estas funes deletadas podem ser suprimidas

como veremos a seguir.

4.1.1. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA,

perde-se a expresso das protenas do capsdeo (funes tardias). Para

que o sistema de clonagem funcione adequadamente pode-se realizar a

infeco simultnea com um outro vrus SV40 que tem uma deleo nos

genes da regio precoce, mas a regio tardia intacta. Nas clulas co-infectadas as protenas da regio precoce sero produzidas pelo vrus

recombinante e as protenas do capsdeo pelo vrus deletado. Como

resultado, teremos a produo de uma populao de partculas virais

mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante. A figura 14 ilustra

este procedimento.

24


27/104

Figura 14. Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia

4.1.2. Clonagem no SV40 pela substituio da regio precoce

Quando a clonagem no SV40 feita na regio precoce, a produo

de partculas virais depende do suprimento, por uma outra fonte, das

protenas codificadas pela regio precoce (antgeno T). Para evitar umainfeco mista com um vrus SV40 deletado, usa-se uma linhagem

25

S V 4 0

g e n e

c o t r a n s f e c o

p a r t c u l a s V i r a i s

S V 4 0

R e g i o f u n c i o n a lt a r d i a

R e g i o

f u n c i o n a lp r e c o c e

O

d ag l o b i n a

S V 4 0 - g l o b i n a

e m p a c o t a m e n t o e l i s e


28/104

celular, as clulas COS as quais, apresentam uma poro do genoma do

SV40 integrado ao seu prprio cromossomo. Esta linhagem celular produz

a protena viral denominada antgeno T, a qual liga-se na origem de

replicao do vrus e induz a sua replicao. A figura 15 ilustra este tipo

de clonagem.

Apesar deste sistema viral ter sido usado como vetor de expresso

em muitas estratgias de clonagem, existem algumas desvantagens de

seu uso. Uma delas que o gene a ser clonado no pode ser grande, a

outra que as clulas hospedeira s podem ser clulas de macacos e

finalmente, o genoma da clula hospedeira pode sofrer rearranjados ou

delees.Atualmente, dois outros sistemas virais mais versteis esto em

uso, so eles o vrus da vacina e o Baculovrus, os quais podem

aceitar genes bem maiores do que aqueles aceitos pelo SV40. Um

inconveniente para estes dois sistemas virais que ambos apresentam

um grande genoma e o gene a ser clonado s pode ser inserido por

processos de recombinao dentro das clulas, o qual bastante lento

em relao aos processos tradicionais em uso na metodologia do DNA

recombinante.

Finalmente, um sistema viral bastante promissor so os

retrovrus que so vrus cujo material gentico o RNA e apresentam

um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente que so

ciclos lticos. Os retrovrus infectam uma grande variedade de clulas de

mamferos e o seu RNA transcrito reversamente para DNA o qual

incorporado ao genoma da clula hospedeira. Neste estado ele produz

continuamente novas partculas virais, juntamente com o produto do

gene nele clonado. Devido a sua versatilidade, os retrovrus so

atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica.

5. BACTERIFAGO M13

O bacterifago M13 um fago filamentoso da E. coli e contm uma

nica fita de DNA envolvida por protenas virais. Durante o seu ciclo, a

26


29/104

clula hospedeira infectada pela fita (+) a qual servir como molde

para a sntese da outra fita (-). A dupla fita denominada de forma

replicativa, permanece no interior da clula hospedeira e amplificada

at 200 cpias por clula, quando ento a fita negativa no mais se

replica e a fita positiva continua a ser sintetizada, adquire as protenas da

cpsula viral e sai da clula hospedeira atravs de processo no ltico

(Figura 16).

27


30/104

Figura 15. Esquema de clonagem no SV40 pela substituio da regio

precoce.

28

S V 4 0

g e n e

P a r t c u l a V i r a l

O

d a

R e g i o f u n c i o n a l

t a r d i a

R e g i of u n c i o n a l

p r e c o c e

S V 4 0 - H a

h e m a g l u t i n i n a ( H a )

c o - t r a n s f e c o

S V 4 0m u t a n t e

e m p a c o t a m e n t oe l i s e

S V 4 0 m u t a n t ei n t e g r a d o a og e n o m a d a c l u l a C O S

a n t g e n o T r e p l i c a o


31/104

Figura16. Replicao do bacteriofago M13.

5.1. Clonagem no bacterifago M13

A grande utilidade deste sistema de clonagem a sua facilidade na

produo de DNA fita simples, facilmente recupervel do sobrenadante

de uma cultura lquida da E.coli infectada com este vetor. Como veremos

futuramente, este DNA fita simples bastante til no processo desequenciamento do DNA pelo mtodo desenvolvido por Sanger e

colaboradores (1977).

Para facilitar o seu uso especialmente em estratgias de

seqenciamento, foram desenvolvidos vetores da srie M13mp, os quais

contm o MSC inserido no gene que expressa a -galactosidase.

Mutaes foram realizadas de tal modo que a enzima s ativa

quando o vetor est na clula hospedeira, convenientemente preparada.

Este processo denomina-se de alfacomplementao. A incluso do

mltiplo stio de clonagem no gene da galactosidade visa a

identificao dos possveis recombinantes quando na presena de um

substrato cromognico o X-gal ou Bluogal (5-bromo-4-cloro-indolil--D-

galactosdeo) e o indutor IPTG. Quando o vetor est intacto (no

recombinante), a enzima funcional e frente ao substrato cromognicoeste clivado produzindo placas de cor azul. Por outro lado, quando um

29

++ ++

+

-

M 1 3

E . c o l i


32/104

fragmento de DNA inserido no mltiplo sitio de clonagem, a expresso

da enzima suprimida, portanto as clulas so incapazes de metabolizar

o substrato cromognico formando placas incolores.

5.2. Estratgia de clonagem em vetores da srie M13mp

A utilizao de vetores com diferentes orientaes do mltiplo stio

de clonagem, tais como M13mp8 e o M13mp9, facilita a insero de um

fragmento de DNA em ambas as orientaes. Como veremos adiante,

esta estratgia apresenta grande aplicao no programa de

sequenciamento de um DNA pelo mtodo de Sanger.

A figura 17 ilustra a insero de um fragmento de DNA clivado com

as enzimas Pst1 (P) e EcoRI (E) nos vetores M13mp8 e M13mp9, ambosclivados com as mesmas enzimas. Esta clonagem orientada permite a

insero do fragmento de DNA na orientao 5'3' no vetor M13mp8 e

na orientao 3'5' no vetor M13mp9.

Figura 17. Clonagem de um fragmento de DNA nos vetores M13mp8 eM13mp9 clivadoscom as enzimas EcoRI (E) e PstI (P).

6. FAGOMDEOS

Apesar do bacterifago M13 apresentar grande aplicabilidade

30

P5 3

P E

EP

E

E P

PE

M 1 3 m p 9 M 1 3 m p 8


33/104

especialmente nos processos de seqenciamento de DNA, foram

desenvolvidas outras geraes de fagos, os quais reunem as vantagens

do fago M13 e a do plasmdeo. Os primeiros foram os vetores da srie

pEMBL e mais tarde os plasmdeos pTZ, pBluescript e pGEM (+/-). Estes

vetores so chamados de fasmdeos ou fagomdeos e apresentam as

seguintes caractersticas principais:

fagomdeo apresenta um verstil MSC, permitindo a clonagem

de grandes insertos sem maiores dificuldades, alm de que, as

enzimas situadas neste stio foram ordenadas de tal modo a

permitir uma alternativa interessante durante o processo de

sequenciamento. utilizando uma combinao estratgica de duas enzimas de

restrio, possvel criar terminaes 5' e 3' proeminentes,

tornando agora uma extremidade (a do inserto) susceptvel

ao da Exonuclease III. Esta estratgia, permite a obteno

progressiva e controlada de vrios fragmentos deletados do

inserto, os quais aps a recircularizao tornam-se apropriados

para o sequenciamento. Este procedimento, facilita o

seqenciamento de um grande inserto de DNA, sem a

necessidade de mltiplas subclonagens como usual no

sistema M13 ou a sntese de vrios oligonucleotdeos internos,

usados como iniciadores no processo de seqenciamento.

6.1. Clonagem no fagomdeoVamos utilizar como exemplo, o fagemdeo ZAP que

particularmente til para clonagem de cDNA. Este vetor, incorpora a

biologia do fago M13 de tal modo que um cDNA clonado neste vetor pode

ser automaticamente excisado do fago para um fagomdeo denominado

pBluescript.

Basicamente, qualquer DNA clonado no MSC inativa o gene LacZ,

produzindo uma protena de fuso quando na orientao correta,

podendo assim tambm ser rastreada com anticorpos.

31


34/104

Quando uma cepa da E.coli (F') infectada com o fago

recombinante e superinfectada com o fago auxiliar, esse produz as

protenas do sistema M13. Essas protenas reconhecem os sinais de

iniciao e trmino da sntese de DNA do fago auxilar (f1) que esto

flanqueando o pBluescript, que por sua vez est incorporado no fago

ZAP e carrega o inserto. Com a clivagem destas duas seqncias, o DNA

automaticamente circularizado na bactria para originar a forma

recombinante do plasmdeo Bluescript SK(M13).

O inserto clonado no Bluescript flanqueado por promotores para

as RNA polimerases dos fagos T3 e T7. Neste sentido, aps o vetor ser

convenientemente linearizado, cpias do RNA relativo ao inserto, podemser obtidas em ambas as direes atravs do uso das RNA polimerases

T3 e T7.

7. VETORES PARA TRANSFORMAO DE LEVEDURAS

O grande interesse existente no estudo das leveduras

Saccharomyces cerevisiae e Schizosacharomyces pombe deve-se ao fato

de que tratam-se de organismos eucariotos inferiores e como tais

possuem organizao celular similar de eucariotos superiores. Alm

disso, muitas protenas de leveduras so similares estrutural e

funcionalmente s suas homlogas em mamferos. A utilizao de

leveduras como um modelo de estudo traz as seguintes vantagens:

tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de

grandes quantidades de leveduras em pouco tempo. genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o

genoma de mamferos, o que simplifica anlises moleculares e

genticas.

possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou

diplides, o que permite a obteno de mutaes recessivas em

clulas haplides, bem como a realizao de experimentos de

complementao gentica. As clulas de mamferos so

32


35/104

diplides o que torna impossvel a deteco de mutaes

recessivas.

Existem diferentes marcadores de seleo que so utilizados em

leveduras. A maior parte dos genes marcadores utilizados em leveduras

so genes envolvidos na biossntese de aminocidos e nucleotdeos. Um

dos marcadores frequentemente utilizados o gene de levedura LEU2

que codifica para uma das enzimas da via de sntese da leucina, a enzima

-isopropilmalato dehidrogenase. A linhagem mutante de levedura, leu2,

no cresce em meio de cultura que no contm leucina. Assim quando o

gene LEU2 utilizado na transformao da linhagem leu 2, as clulas

desta linhagem que adquiriram o gene LEU2 sero capazes de crescer emmeio de cultura deficiente no aminocido leucina. Esta estratgia

semelhante a resistncia ampicilina adquirida por bactrias que foram

transformadas com plasmdeos que contm o gene que promove a

resistncia ampicilina.

A tabela a seguir lista alguns dos marcadores de seleo comumente utilizados em

levedura.GENE ENZIMA SELEO

HIS3 Imidazol glicerolfosfatodesidratase

Histidina

LEU2 -Isopropilmalato desidrogenase Leucina

LYS2 -Aminoadipato redutase Lisina

TRP1 N-(5'-fosforibosil)- antranilatoisomerase

Triptofano

URA3 Orotidina-5'fosfato decarboxilase Uracil

Tabela 2. Genes marcadores de seleo em levedura. Os meios decultura utilizados em geral contm todos os aminocidos necessrios manuteno da levedura com exceo de um. Assim, por exemplo, clulastransformadas com o gene HIS 3 so selecionadas em meio de culturadeficiente em histidina.

Os vetores utilizados na transformao de leveduras so capazes

de se propagar tanto em E. coli quanto em levedura. A manipulao

destes vetores (clonagem, mutagnese, seqenciamento, etc) realizadaem bactria como para qualquer plasmdeo convencional e ento o

33


36/104

mesmo transferido para levedura, organismo onde os ensaios de

interesse so realizados. Tais vetores so denominados vetores do tipo

ponte (shuttle vectors) e contm entre outros elementos origens de

replicao de bactria e levedura bem como genes marcadores que

funcionam para a seleo nos dois organismos.

Diferentes tipos de vetores so utilizados na transformao de

leveduras:

Vetores de integrao: tais vetores contm origem de replicao de

bactrias e genes marcadores para seleo em bactria e levedura.

Neste caso o plasmdeo no capaz de replicar de modo autnomo na

levedura. O modo pelo qual este tipo de vetor propagado e capaz deexpressar o marcador de seleo atravs da integrao em um dos

cromossomos de levedura.

Vetores que replicam em levedura: tais vetores tambm contm

origem de replicao de bactria e genes marcadores para seleo em

bactria e levedura. Dois tipos de origens de replicao de levedura so

empregadas nestes plasmdeos. O primeiro tipo consiste na origem de

replicao do plasmdeo de 2 m, que de ocorrncia natural em

levedura. O segundo consiste de origens de replicao isoladas de DNA

cromossomal denominadas ARS (Autonomously Replicating Sequence,

sequncias de replicao autnoma). Plasmdeos contendo a origem de

replicao do plasmdeo de 2m ou sequncias tipo ARS replicam em

mltiplas cpias em levedura (Figura 18). Uma variante deste tipo de

vetor inclui, alm da sequncia ARS, uma sequncia tipo centromrica,denominada CEN, que garante que a replicao destes plasmdeos seja

estvel, ocorrendo uma nica vez por ciclo celular e que eles sejam

segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores

contendo sequncias tipo CEN so mantidos em cpia nica na levedura

(Figura 18).

YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura)

so uma variao de um vetor de cpia nica, que contm sequncias

centromricas (CEN) e sequncias telomricas, que so sequncias das

34


37/104

extremidades dos cromossomos. A presena de sequncias telomricas

nestes vetores permite que sejam replicados como molculas lineares,

com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs no so

utilizados de rotina em experimentos de clonagem, entretanto, tm se

mostrado uma ferramenta valiosa na caracterizao de grandes

segmentos genmicos na medida em que possvel clonar em um YAC

fragmentos que vo de 100 a 2000 kb (Figura 19).

Figura 18. Vetores de levedura. Contm sequncias de plasmdeo (aqui depUC118) que permitem a propagao e do resistncia a ampicilina em E.coli,o gene de seleo em levedura (neste caso LEU 2) e stios nicos de restrio.Vetores multicpias: Estes plasmdeos existem na forma circular na levedura.Alguns destes vetores empregam a origem de replicao do plasmdeo de 2m, outros utilizam origens de replicao isoladas de cromossomos que so

denominadas ARS. 2m e ARS permitem a replicao do plasmdio emmltiplas cpias. Vetores cpia nica: Vetores que contm origens dereplicao tipo ARS podem ser mantidos estavelmente atravs da adio desequncias centromricas, CEN. A existncia de sequncias tipo CEN asseguraque o plasmdeo seja mantido em 1 ou 2 cpias na levedura e segregado demodo preciso durante a diviso celular.

GLOSSRIO- ARS: (autonomous replication sequence, sequncia de replicao

autnoma). Sequncia que funciona como uma origem de replicaoem cromossomos de levedura.

- BAC: (bacterial artificial chromosome, cromossomo artificial de

bactria). Vetor utilizado na clonagem de DNA genmico, baseado no

fator F de plasmdeo que assegura que o plasmdeo seja mantido em

pequeno nmero de cpias na bactria.

- Centrmero: regio do cromossomo que apresenta uma constrico

e qual liga-se o fuso mittico durante a meiose ou mitose.

necessria para a manutno da estabilidade e segregao correta

35

L E U 2 L E U 2

A R S A R S

P u c 1 1 8 P u c 1 1 8

D N A L e v e d u r a

D N A L e v e d u r a

C p i a n i c a C E N

M u l t i c p i a s


38/104

dos cromossomos durante a diviso celular.

- Origem de replicao: regio onde iniciada a sntese de DNA em

um dado fragmento de DNA.

- Telmero: extremidade do cromossomo que contm sequncias

repetitivas de DNA sintetizadas pela enzima telomerase e importantes

na manuteno da integridade cromossomal.

- YAC: (yeast artificial chromosome, cromossomo artificial de levedura).

Sistema de clonagem em levedura que consiste de um vetor linear que

tem capacidade de replicao autnoma e que contm um centromro

de levedura e duas sequncias telomricas em suas extremidades.

Figura 19. YACs: Contm um centrmero, dois telmeros, gene(s)marcadores para seleo em levedura e uma seqncia tipo ARS. Devido presena destas seqncias os YACs so replicados como pequenoscromossomos lineares na levedura.

III. CONSTRUO E USO DE BIBLIOTECAS DE DNA RECOMBINANTE

A obteno de uma molcula de DNA recombinante, atravs da

ligao de um fragmento de DNA de interesse com o DNA de um vetor,

um processo direto e relativamente simples. Entretanto, problemas

especiais surgem quando o fragmento de interesse constitui uma frao

pequena do DNA total. Este o caso encontrado comumente quando o

objetivo o isolamento de genes presentes em uma nica cpia num

genoma complexo, ou quando o objetivo o isolamento de clones

portadores do DNA complementar RNA mensageiro raro. Deste modo,

36

A m pR

T R P 1

A R S 1

C E N 4

E c o R I

U R A 3

+ E L+ E LH IB a m

Y A C


39/104

claro que quando queremos clonar um determinado gene ou o DNA

complementar da mensagem ou mensagens por ele codificado(s)

necessrio obteno de colees de clones recombinantes, portadores

de molculas representantes de todo o genoma, ou de colees de clones

de cDNAs derivados de toda a populao de mensageiros da clula ou

tecido de interesse. Essas colees de clones de DNA recombinante so

chamadas de bibliotecas: Biblioteca Genmica, no caso dos clones

terem sido obtidos a partir do DNA genmico ou Biblioteca de cDNA,

no caso dos clones terem sido construdos a partir de DNA complementar.

O DNA de organismos superiores bastante complexo: por

exemplo, o genoma haplide de mamfero composto deaproximadamente 3x109 pares de bases (pb). Portanto, se o fragmento

de interesse tiver 3000 pb, ele compreender somente 1 parte em 106 de

uma preparao do DNA total. De modo similar, uma espcie de RNAm

particularmente rara pode compreender somente 1 parte em 105 ou 106

da frao de RNA mensageiros de uma clula. Deste modo, para que seja

garantida a presena na biblioteca de pelo menos uma verso de todasas seqncias da populao alvo, um dos pontos principais na construo

de bibliotecas teis a obteno de grandes quantidades de clones.

Embora a soluo deste problema envolva estratgias especficas no

preparo do DNA alvo e na escolha do vetor de clonagem, em linhas gerais

a construo de bibliotecas genmicas e de cDNAs segue um

procedimento bsico bastante semelhante. Nos dois casos, o DNA

genmico ou os cDNAs so preparados para a insero no vetor

escolhido. O vetor e o DNA alvo so ligados e introduzidos em E. coli

atravs de infeco ou em alguns casos, por transformao direta (Figura

20).

1. BIBLIOTECA DE cDNA

A descoberta da enzima transcriptase reversa, uma DNA polimerase

dependente de RNA encontrada predominantemente em vrus de RNA de

37


40/104

tumor, tornou possvel a sntese in vitro de DNA usando-se como molde

RNAm. O DNA produto dessa reao o DNA complementar ou cpia da

mensagem, abreviadamente chamado de cDNA. A sntese e possvel

clonagem de cDNAs contriburam para grandes avanos na anlise da

estrutura e expresso de genes de eucariotos e propiciaram uma

revoluo tecnolgica nas indstrias farmacutica e de alimentos. Esses

clones so comumente isolados de bibliotecas de cDNA, construdas a

partir da populao de RNAm isolada da clula ou do tecido de interesse.

Portanto, em comparao com bibliotecas do genoma total essas

bibliotecas so enriquecidas com seqncias gnicas. Uma vez que o

cDNA cpia da mensagem, ele no contm introns e apresentasignificativamente poucas seqncias que no codificam para protenas

(Figura 21). A ausncia de introns permite que cDNAs relativos a clulas

de eucariotos superiores sejam diretamente transcritos e traduzidos em

bactrias e em outros microorganismos, permitindo assim a produo em

grande escala de polipeptdios importantes tanto na rea de pesquisa

como na rea aplicada. A ausncia de introns tambm facilita a

determinao direta da seqncia da mensagem e subseqente deduo

da seqncia de aminocidos da protena por ela codificada. Isso tem

resultado na identificao da seqncia de uma enorme quantidade de

protenas, algumas vezes mesmo antes de terem sido identificadas

gentica ou bioquimicamente.

38


41/104

Figura 20. Passos envolvidos na construo de Bibliotecas de cDNA eBibliotecas genmicas.

Figura 21. Diagrama representando de forma simplificada as diferenas entre

39

Escolha doVetor

mRNA

Tecido

DNA

cDNA

Digerir o DNA,

Fracionar por tamanho

DNA clonvel

Titulao e caracterizaoda Biblioteca

Ligar DNA a um vetor

Introduzir o produtoda ligao em E.coli

Parcial ou completamente


42/104

um fragmento de DNA genmico e do cDNA relativo a ele.

De modo resumido, o procedimento para a sntese, clonagem e

isolamento de cDNAs especficos envolve 4 etapas:

1) Sntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros

isolados do tecido de interesse.

2) Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor escolhido.

3) Introduo dos cDNA recombinantes nas clulas hospedeiras, onde

sero replicados. Isto resultar na amplificao dos recombinantes e

dependendo do vetor utilizado, na expresso das protenas codificadas

pelas mensagens que deram origem aos cDNAs.

4) Identificao dos clones de interesse atravs de um processo de

triagem dos clones recombinantes.

1.1. Sntesede cDNAs de fita dupla

A construo de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento

do RNA total do tecido e subseqente seleo da frao de RNA poli(A)+,

que compreende a maioria das mensagens presentes na clula. O

isolamento de RNA poli(A)+ de boa qualidade essencial, uma vez que

qualquer degradao do RNAm afetar a representatividade das

seqncias na biblioteca.

Uma vez obtida a frao de RNA poli(A)+, procede-se sntese dos

cDNAs atravs de uma srie de reaes enzimticas (Figura 22). Nosltimos dez anos foram descritos vrios mtodos para sntese de cDNA,

cada um apresentando vantagens e desvantagens particulares. Como

exemplo, apresentamos a seguir um procedimento amplamente usado

para esse fim:

a) Sntese da fita de DNA complementar ao RNAm (cDNA) atravs da

enzima transcriptase reversa. Essa enzima capaz de catalisar in vitro a

polimerizao de DNA a partir RNA e requer um "primer" com a

extremidade 3'OH livre para iniciar a sntese. Na maioria das vezes, a

40


43/104

molcula utilizada como "primer" um oligo (dT), que se anela na cauda

poli (A)+ do RNA.

b) Aps a sntese dessa fita de cDNA, o RNAm parcialmente removido,

pelo uso da RNase A para cortar pedaos do RNA da molcula hbrida

RNA-DNA.

c) Utilizando como "primer" os fragmentos de RNA no digeridos pela

RNaseA, a DNA polimerase de E. coli substitui eficientemente o RNA por

DNA, resultando em uma molcula de cDNA de fita dupla.

d) O cDNA fita dupla tratado com T4 polimerase. Atravs da atividade

3'-5' exonuclesica dessa enzima remove-se possveis nucleotdeos

extras nas extremidades 3'.

e) O produto final desse conjunto de reaes uma molcula de DNA de

fita dupla, cpia exata da mensagem.

1.2. Preparo dos cDNAs para a ligao com o vetor

Uma vez obtido o cDNA, o prximo passo prepar-lo para a

insero em um vetor de clonagem (Figura. 22). Para isso tambm

existem vrios mtodos disponveis, que diferem entre si dependendo do

tipo de vetor escolhido: plasmdio ou fago. O fago tem sido o vetor de

escolha para a construo de bibliotecas de cDNA. A razo bsica desta

preferncia a eficincia. Em comparao com plasmdios, o fago

requer cerca de 16 vezes menos cDNA por g do vetor para produzir

nmero equivalente de clones recombinantes. Alm disso, bibliotecas em

fago so mais fceis de serem manipuladas do que bibliotecas em

plasmdios. Entretanto, uma desvantagem dos vetores que no so

favorveis para procedimentos de seqenciamento do DNA e de

mutagnese dirigida. Mais recentemente, outro tipo de vetor foi

idealizado para suprir essas deficincias. Essa classe de vetores

compreende os fagemdios que, como o prprio nome sugere, soplasmdios contendo pores do genoma de fago e que renem

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44/104

vantagens desses dois vetores.

Figura 22. Sntese de cDNA fita dupla.

Para dar uma noo dos passos implicados na clonagem do cDNA

relatamos a seguir um procedimento adotado para a clonagem de cDNA

em fago .

metilao dos stios de EcoRI atravs do tratamento do cDNA com

EcoRI, na presena de S-adenosil metionina. Esse passo essencial

para proteger os stios EcoRI que possam existir no cDNA contra a

ao da EcoRI em digesto a ser realizada subseqentemente no

processo de clonagem.

adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do

cDNA. Essa reao resulta em molculas de cDNA com adaptadores

mltiplos ligados nas duas pontas (ver figura 23). um nico stio de EcoRI produzido em cada ponta do cDNA pela

42


45/104

digesto com EcoRI, liberando o excesso de adaptadores ligados na

molcula. A metilao prvia do cDNA garante que no haja digesto

interna do cDNA.

antes de ser inserido no vetor, o cDNA separado do excesso de

molculas de adaptadores. Isso feito atravs de filtrao em colunas

de Sephadex.

as molculas de cDNA so ligadas ao vetor, atravs de reao com T4

ligase.

o produto da ligao empacotado com as protenas formadora do

capsdeo do fago. os fagos obtidos so utilizados para infectar bactria de linhagem que

favorece o crescimento dos recombinantes.

aps a infeco da bactria com os cDNA recombinantes temos como

produto uma biblioteca de cDNA, que deve conter cpias de toda as

seqncias de RNAm da populao original. Essa biblioteca pode ser

estocada na geladeira, ou submetida a uma triagem em busca doclone de interesse.

2. BIBLIOTECA GENMICA

Para se obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene

de eucariotos necessrio o isolamento da poro do DNA genmico que

contenha toda a unidade de transcrio, mais as regies flanqueadoras

onde se localizam os elementos controladores da expresso desse gene.

O modo mais eficiente para se conseguir isolar essa poro do DNA

atravs do uso de uma biblioteca genmica, que deve conter clones

portando fragmentos de DNA representantes de todo o genoma do

organismo em questo. Deste modo, o aspecto principal considerado na

construo de uma biblioteca genmica est na obteno de um nmerogrande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos

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46/104

aleatoriamente. O tamanho necessrio de uma biblioteca genmica, para

que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos

clonados, determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo

tamanho do genoma. Deste modo, a estratgia bsica na construo de

bibliotecas genmicas busca minimizar o nmero de clones necessrios

atravs da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possvel,

e maximizar a eficincia da clonagem, atravs da utilizao de vetores

baseados no fago . Basicamente, a construo da biblioteca genmica

envolve os seguintes passos:

a) isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente

quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanhocompatvel com o vetor de clonagem.

b) ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos

recombinantes obtidos nas clulas hospedeiras.

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47/104

Figura 23. Clonagem de cDNA em fago .

Dentre esses passos, o modo de preparo dos fragmentos a serem

clonados (insertos) merece ser discutido criticamente dada sua

importncia na representatividade da biblioteca.

2.1. Preparo do DNA do inserto

A representatividade de uma biblioteca genmica depende

grandemente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados

so gerados, para que no haja excluso sistemtica de nenhuma

seqncia. O fracionamento mecnico do DNA o meio de se obter

completa aleatoriedade na fragmentao do DNA. Entretanto, esse

45

1

5 6

2 3

4

7 8 9

Me

Me

Metilao do cDNA para proteger

os st ios internos de RIEcoLigao dos adaptadores RI

com o cDNA

EcoDigesto com RI paragerar st ios coesivos RI

Eco

Eco

Separao do cDNA do excesso de

adaptadorescDNA purificado Ligao do cDNA dos braos

do fago lambda

Empacotamento dos recombinantescom as protenas formadoras da

partcula viral

Infeco da bactria hospedeirao fago recombinante

Plaqueamento dos recombinantes


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mtodo no comumente adotado devido trabalhosa manipulao

necessria para que os fragmentos assim obtidos possam ser inseridos

no vetor. Com bom senso e cuidado possvel conseguir fragmentao

suficientemente aleatria atravs de digestes parciais do DNA com

enzimas de restrio. Uma vantagem em se utilizar a digesto parcial do

DNA a produo de fragmentos com pontas coesivas e que, portanto,

podem ser diretamente ligados ao vetor. Para garantir que a digesto

atinja todo o genoma so utilizadas enzimas de restrio que cortam

freqentemente o DNA e que no apresentam desvios de distribuio de

stios. A enzima Sau3A I, que reconhece o stio de 4 bases GATC, e que

gera fragmentos compatveis com stios de clonagem de vrios fagos ecosmdios, tem provado ser bastante til na produo de bibliotecas de

DNA genmico digerido parcialmente. Aps a digesto parcial, os

fragmentos gerados precisam ser fracionados antes de serem ligados ao

vetor. Sem esse fracionamento, fragmentos pequenos podero ligar-se

entre si produzindo falsos recombinantes. Fragmentos muito grandes que

no permitem o crescimento do fago podero ligar-se aos braos do fago,

alterando a relao entre as quantidades de DNA de inserto e vetor.

Um mtodo de fracionamento freqentemente adotado o de

centrifugao em gradiente de sacarose. Aps a digesto parcial, a

soluo de DNA aquecida para que possveis fragmentos agregados se

dissociem, e ento, aplicada sobre um gradiente de sacarose de alta

salinidade. Aps a centrifugao, so coletadas fraes desse gradiente.

Essas fraes so analisadas por eletroforese em um gel de agarose. As

fraes contendo os fragmentos de DNA de tamanho apropriado so

utilizadas para a ligao com o vetor. A figura abaixo ilustra esse

procedimento.

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49/104

Figura 24. Mtodo para fracionamento do DNA por centrifugao emgradiente de sacarose. O gradiente aspirado, de baixo para cima, com ajudade uma bomba peristltica. A poro mais densa do gradiente contendo o DNAde maior peso molecular, aspirada primeiro.

Uma vez garantida a aleatoriedade dos fragmentos clonados,

bastante razovel se pensar que a probabilidade de uma dada seqncia

de interesse estar presente em uma biblioteca genmica possa ser

estimada estatisticamente, com base na distribuio de Poisson.

Especificamente, o nmero de clone independentes (N) que precisam ser

triados para uma probabilidade (P) de se isolar uma seqncia especfica

dada por:

N = ln(1-P)/ ln[1-(I/G)]

onde I o tamanho mdio dos fragmentos clonados, em pares de base, e

G o tamanho do genoma, em pares de base.

Deste modo, precisamos triar cerca de 690.000 clones de uma

biblioteca que usa como vetor um fago , para termos 99% de chance de

isolar qualquer dada seqncia presente em uma nica cpia em um

genoma tpico de mamfero.

N = ln(1-0,99)/ln[1- (2x104/3x109)]= 690.000

2.2. Vetores utilizados na construo biblioteca genmica

47

1

Tubo de plstico

Tubo capilar

Tubos de coleta

Bomba

Gradiente desacarose 2 3 4 5


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Fagos e cosmdeos so comumente usados na construo de bibliotecas genmicas.

Nos dois casos, fragmentos grandes de DNA gerados por fragmentao aleatria so ligados

com o DNA do vetor para formar concatmeros que podem ento ser empacotados em

partculas de fago . As bibliotecas construdas em vetores so armazenadas e propagadasna forma de fagos recombinantes. No caso de clonagem em cosmdios, entretanto, essas

partculas virais servem meramente como veculos para introduzir o DNA recombinante

dentro da bactria. Uma vez dentro da bactria o cosmdio se comporta como um plasmdio

grande.Os cosmdios podem aceitar insertos de aproximadamente 45kb,

quase duas vezes o tamanho dos insertos clonveis em fago . Deste

modo, usando-se o cosmdio como vetor, necessrio gerar somente

350.000 recombinantes para atingir 99% de probabilidade de uma

seqncia de cpia nica estar representada em uma biblioteca

genmica de mamfero. Entretanto, bibliotecas em cosmdios so mais

difceis de se construir e manter do que as bibliotecas de fagos.

Cosmdios so ento usados quando o gene de interesse muito grande

ou quando uma regio extensa do DNA cromossomal desejada. No casode isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstncias

onde a biblioteca ser usada muitas vezes, o uso de vetores mais

recomendado.

Na figura abaixo apresentamos um diagrama da estrutura de um

vetor tipo , bastante utilizado na construo de bibliotecas genmicas.

Figura 25. Estrutura do vetor EMBL3. BE=brao esquerdo; BD=braodireito; stuffer= fragmento central; S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Conforme indicado no diagrama este vetor apresenta um

48

5'

5'3'

3'BE

BE=brao esquerdo BD=brao direito

B B

S E E S

BDFragmento centralcos cos


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fragmento central flanqueado por dois fragmentos essenciais (direito e

esquerdo). O fragmento esquerda, chamado de brao esquerdo,

codifica para as protenas do capsdeo e o fragmento direita, chamado

de brao direito, contm a origem de replicao do fago e promotores de

outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos

encontram-se os stios de restrio utilizados na clonagem - SalI, BamHI,

EcoRI - em orientao inversa.

Como todo fago , a extremidade de cada brao apresenta um

segmento de fita simples (cos). Esses segmentos so complementares

entre si e permitem a recircularizao da molcula, e a conseqente

replicao do DNA do fago dentro da clula hospedeira.Esse tipo de vetor chamado de vetor de substituio por que no

processo de clonagem a parte central do DNA do fago substituda pelo

fragmento de DNA a ser clonado, originando a molcula recombinante.

Mais recentemente outros vetores com capacidade para grandes

insertos foram desenvolvidos. Os cromossomos artificiais de

levedura (YACs) so molculas lineares de DNA cuja arquitetura

mimetiza a estrutura de um cromossomo autntico (Figura 26). Os YACs

recombinantes so criados pela ligao de fragmentos grandes de DNA

genmico exgeno (at 2000 kb) com os dois "braos" do vetor YAC e o

produto da ligao introduzido na levedura por transformao. Nos

YACs recombinantes, o segmento de DNA genmico exgeno

flanqueado de um lado por um centrmero, uma origem de replicao e

uma marca de seleo e pelo outro lado, por uma segunda marca de

seleo. As leveduras transformantes com cromossomo artificial so

selecionadas como colnias em meio com as drogas de seleo.

Os cromossomos artificiais de bactrias (BAC) so molculas

de DNA circulares que carregam uma marca de seleo a antibitico. Os

segmentos de DNA genmico exgeno so clonados no vetor BAC in vitro

e o produto da reao de ligao introduzido por eletroporao em

cepas de E. coli, onde mantido como um plasmdio de cpia nica. Osvetores BACs carregam marcadores que permitem a discriminao dos

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clones vazios e cheios. A mdia de tamanho dos clones de BACs 120

kb, mas alguns clones podem chegar 300kb.

Os vetores de bacterifago P1 acomodam fragmentos genmicos

de 70 a 100Kb. Neste sistema, as molculas lineares recombinantes

geradas a partir de seqncias do vetor e do genoma so empacotadas in

vitro em bacterifago P1. Aps a injeo em E. coli, as molculas se

tornam circulares pela atividade de uma recombinase, que promove a

recombinao de seqncias especficas presentes no vetor. Estes

vetores carregam marca de seleo para antibitico, marca de seleo

positiva para seleo dos clones com inserto de DNA genmico exgeno

e uma origem de replicao plasmdial P1, que mantm uma ou duascpias dos plasmdios recombinantes na clula. Uma segunda origem de

replicao pode ser ativada para amplificao dos plasmdios antes do

isolamento do DNA.

Figura 26. Construindo um cromossomo artificial de levedura (YAC). O vetor

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YAC carrega uma origem de replicao (ORI), um centrmero (CEN), doistelmeros e marcas de seleo (X e Y). Lehninger, Principles of Biochemistry.Figura 29-16, p. 1139.

Os cromossomos artificiais P1 combinam as caractersticas dos

bacterifagos P1 e dos BACs, incluindo a marca de seleo positiva e asorigens de replicao do bacterifago P1. Os clones circulares

recombinantes de PACs gerados durante a reao de ligao in vitro so

introduzidos em E.coli por eletroporao e mantidos como um plasmdio

de cpia nica na clula. Os insertos da biblioteca de DNA do genoma

humano em PACs variam de 60kb a 150kb.

IV. DETECO E ANLISE DO CLONE RECOMBINANTE

Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante encontrar o

clone correto na mistura de clones que foi criada durante os

procedimentos da confeco da biblioteca genmica ou de cDNA. Embora

seja relativamente fcil selecionar as colnias que abrigam os vetores de

clonagem usando os marcadores de resistncia a antibiticos que esto

presentes nos vetores (Figura 27A), muito mais difcil selecionar o clone

que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um

plasmdio devero ser examinadas milhares de colnias de bactrias

crescidas em placas de petri contendo agar, para a deteco daquela(s)

colnia(s) que produza(m) pequenas quantidades da protena expressapelo gene de interesse ou ento que possua(m) o gene de interesse sem

qualquer expresso protica que o caracterize (Figura 27B). Ser

discutida inicialmente a situao na qual a protena expressa no

hospedeiro. Em seguida ser discutida a situao mais comum onde a

protena no expressa e a anlise ser feita atravs da prpria

presena do DNA de interesse no fago ou na bactria.

1. QUANDO O GENE DE INTERESSE EXPRESSO NO HOSPEDEIRO

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Se o gene de interesse capaz de se expressar na clula

hospedeira pode-se identificar o clone que carrega este gene pela

presena desta protena entre as colnias recombinantes. Para isto, o

hospedeiro no deve produzir esta protena, a menos que ele carregue o

clone que a produza. Se esta protena for produzida normalmente pela

clula hospedeira, ser ento necessrio o uso de uma clula hospedeira

defectiva ou mutante para o gene de interesse. Quando este gene for

incorporado ele pode ser detectado por complementao daquela funo.

Se a protena a ser detectada for especfica de mamfero, por exemplo, a

clula hospedeira j ser naturalmente defectiva. Se a protena for uma

enzima que catalisa uma reao mensurvel pode ser possvel triar ascolnias por sua atividade enzimtica.

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Se a protena de interesse no for uma enzima com funo

detectvel, uma outra estratgia ser necessria para a identificao do

clone correto, como por exemplo, o uso de um anticorpo especfico para

a protena de interesse. Anticorpo uma protena do soro produzida pelos

mamferos que se combina com alta especificidade com outra protena, o

antgeno. Neste caso, a protena de interesse o antgeno. Como o

anticorpo se combina especificamente com o antgeno, se o antgeno

estiver presente em uma ou mais colnias de uma placa de petri, a

identificao destas colnias poder ser feita observando-se a reao

antgeno-anticorpo.

Figura 27. Em A, estrutura do plasmdio pBR322, um tpico vetor declonagem. Em B, mtodo da inativao insercional para isolar plasmdioscontendo DNA exgeno. A insero do DNA exgeno no plasmdio pBR322

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causa inativao da resistncia tetraciclina, permitindo o isolamento detransformantes contendo o fragmento de DNA clonado (B). Lehninger,Principles of Biochemistry. Figura 29-6, p. 1126.

Para que o antgeno seja produzido na clula hospedeira a

biblioteca de cDNA ter de ser construda num vetor de expresso.

Neste caso os cDNAs so inseridos nestes vetores em regies que

promovam sua expresso em E.coli, normalmente em promotores que

possam ser regulados. Esta protena antignica ser expressa como uma

protena de fuso, ou seja, ser sintetizada subseqente a alguns

aminocidos pertencentes protena do vetor bacteriano. Estas protenas

de fuso so geralmente mais estveis que a correspondente protena de

eucarioto produzida em bactria e, portanto podem ser obtidas em

grande quantidade. Para visualizar a produo destas protenas, uma

parte dos fagos de cada placa de lise (ou bactrias) recombinantes

desenvolvidos numa placa de Petri so transferidos (como um carimbo)

para uma membrana de nitrocelulose, tratados para expor suas protenas

e ento submetidos a uma soluo contendo um anticorpo especfico

para a protena desejada. Depois que os anticorpos livres so removidos,um segundo anticorpo adicionado para localizar a posio do primeiro.

O segundo anticorpo normalmente radioativo e pode ser identificado

por autoradiografia utilizando-se um filme de raio X. Se uma colnia

radioativa estiver presente, uma mancha no filme de raios-X ser

observada depois que o filme for revelado (Figura 28). A localizao desta

mancha no filme corresponde localizao da colnia que produziu

aquela protena, na placa de petri original. Esta colnia ser ento

recuperada da placa original e cultivada.

Uma limitao deste procedimento que o anticorpo utilizado nesta

triagem precisa ser especfico para a protena de interesse. A produo

de anticorpos pode ser obtida pela injeo da protena (antgeno) em um

animal. No entanto, esta protena injetada deve ser pura, caso contrrio

mais que um anticorpo ser formado.

54


57/104

2 O USO DE SONDAS MOLECULARES DE CIDOS NUCLICOS PARAIDENTIFICAR O GENE DE INTERESSE

Como pode ser detectado um gene de interesse entre as colnias

da biblioteca genmica ou de cDNA, se este gene no expresso?

Quando o DNA em soluo aquosa aquecido 100C, ou exposto pH alto, as bases complementares que normalmente seguram as

duplas hlices juntas so dissociadas em duas fitas simples. Este

processo chamado de desnaturao. Estas mesmas fitas simples

podero se reassociar se forem conservadas 65C, por longos perodos,

num processo chamado de renaturao (ou hibridao, quando a

associao ocorre entre cidos nuclicos de diferentes origens). Reaes

de hibridao ocorrem entre quaisquer duas cadeias de cidos nuclicos

de fita simples (DNA:DNA, RNA:DNA ou RNA:RNA) desde que tenham

seqncias de nucleotdeos complementares.

55


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Figura 28. Triagem de bibliotecas de expresso com anticorpos. Se o inserto estiver naorientao correta e na apropriada seqncia aberta de leitura traduzido em protena defuso (antgeno). Os anticorpos identificam as placas de lise especficas destes antgenos.

Este princpio da hibridao molecular fundamental paracaracterizar DNAs recombinantes quando o gene de interesse no

56

Promotor

EcoRI lac

-Galactosidasegfll

EcoRI

EcoRI EcoRI

EcoRIlinker

cDNA

Proteina de Fuso

Empacotamento dos fagose plaqueamento em

camada bacterianain vitro

Membrana denitrocelulose

Placas de lise

Nitrocelulosesobre as placasde lise

Remoo damembrana

Protenas se ligama nitrocelulose

Incuba membrana com

anticorpo primrio

Lava membrana

Incuba membrana comanticorpo secundrio

anticorpo secundrio

anticorpo pr imrio

Filme de raio-X

" "


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expresso. Sondas de cidos nuclicos (fragmentos de cido nuclico

marcados radioativamente, geralmente com 32P) so utilizadas para

localizar clones, numa biblioteca genmica ou de cDNA, que carreguem

uma seqncia de DNA de interesse. Aps a confeco da biblioteca

genmica (ou de cDNA) os fagos carregando DNA recombinante so

espalhados juntamente com uma suspenso de bactrias numa placa de

petri contendo meio de cultura slido. Uma vez visualizada as placas de

lise (ou as colnias, no caso do vetor ser um plasmdio) preparada uma

rplica de cada placa de petri com uma membrana de nilon ou de

nitrocelulose. Este processo permite a transferncia de uma poro de

fagos de cada placa de lise (ou de bactrias de cada colnia) para amembrana, de tal maneira que o padro das placas de lise da placa de

petri original seja mantido na membrana. Para identificar qual das placas

de lise porta o gene de interesse esta membrana tratada para expor e

desnaturar o DNA das colnias ali presentes e incubados com uma

soluo de DNA ou RNA fita simples, marcada radioativamente e

complementar ao gene de interesse para permitir a hibridao. Dois

polinucleotdios simples fitas somente iro se hibridar se forem

complementares. A localizao da placa de lise que se hibridou sonda

determinada aps a exposio da membrana a um filme de Raios-X

(autoradiografia) e a comparao deste filme com a disposio das

colnias na placa de petri original (Figura 29).

Esta sonda molecular radioativa pode ser parte de um gene j

clonado para o qual se procura o gene total, pode ser o DNA de um gene

vizinho ao gene de interesse, pode ser o RNA de genes que so expressos

em tecidos especficos ou em estgios especficos do ciclo celular, ou

mesmo o gene de uma outra espcie que codifica para a mesma

protena. Neste ltimo caso, a reao de hibridao pode ser realizada

em baixa temperatura (420C ao invs de 650C) e em baixa concentrao

de sal (baixa estringncia) para permitir a hibridao mesmo entre DNAs

que tenham algumas bases no complementares.

57


60/104

Figura 29. Triagem de uma biblioteca genmica ou de cDNA, construdas nofago , com uma sonda molecular para encontrar um clone de interesse. Estatriagem feita espalhando-se os fagos previamente incubados numa culturade bactrias, em vrias placas de agar. Depois que as placas de lise tornam-sevisveis, so feitas as rplicas em membrana de nitrocelulose, seu DNA exposto e hibridizado com a sonda molecular. A posio do clonerecombinante de interesse identificada atravs de autoradiografia. O DNA

58

Membrana denitrocelulose

Placas de lise Fagos absorvem anitrocelulose

Placa mestra

Membrana rplica

Sonda de cidonucleico marcadacom 32p

Sonda Hibridiza

DNA ligado ao filtro

Lavagem das sondasno incorporadas

Sonda hibridiza ao DNA do fagoque contem a sequncia complementar Filme de raio-X

Placa mestra

DNA lambdaisolado da placa delise

DNA clonado

Clone lambda purificado


61/104

isolado dos fagos presentes na placa de lise positiva, identificada na placa depetri original e submetida a anlises posteriores.

Genes que respondem a um mesmo mecanismo de regulao

podem ser identificados numa biblioteca de cDNA por hibridao

diferencial. Isto , genes expressos em tecidos especficos, em estgios

especficos do desenvolvimento ou do ciclo celular e genes regulados por

fatores de crescimento so adequados para serem analisados por este

tipo de abordagem. Para esta identificao necessrio produzir duas

populaes celulares (ou extrair mRNA de dois difere

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