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HISTÓRICO DA CLONAGEM: 1986- IL4, IL5 E IL6

Revisiting the 1986 molecular cloning of interleukin 6

Toshio Hirano*

Osaka University, Suita, Osaka, Japan

*Correspondence: hirano@molonc.med.osaka-u.ac.jp

Edited by:

Kendall A. Smith,Weill Medical College of Cornell University, USA

Artigo original na NATURE-1986

CONCEITOS TEÓRICOS

• Clonagem molecular: Construção de uma molécula de DNA recombinante e sua propagação em hospedeiro apropriado que possibilite a seleção deste DNA. Introdução de um gene dentro de um vetor, através das enzimas de restrição ( enzimas modificadoras do DNA- reconhecem determinados pares de base e clivam) e o propaga dentro de um organismo (célula) hospedeiro (a) para estudá-lo.

CONCEITOS TEÓRICOS

• Inserto: Fragmento de DNA que se tem interesse em estudar ( expressar ou reproduzir). A união de um inserto e um vetor dará origem a uma molécula chamada QUIMÉRICA (DNA recombinante).

• DNA Recombinante será trasnfectado para dentro de uma célula onde se reproduzirá independente ou não da reprodução do próprio material genético. Essa célula será dita CÉLULA TRANSFORMADA.

CLONAGEM

CLONAGEM

ARTIGO

DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA SEMI-QUANTITATIVA UTILIZANDO PLASMÍDIO CLONADO COM PARTE DO GENE Gb DE CITOMEGALOVÍRUS

Descrição de métodos, técnicas e instrumentais

Medicina, Ribeirão Preto-2002

Lauro J Marin, Aldo A Cunha, Victor H Aquino e Luiz TM Figueredo.

INTRODUÇÃO

Importância do diagnóstico do CMV- Grande incidência – 100%

• Grande variedade de Síndromes Clínicas- Doenças agudas, transmissões verticais e sangue, imunodeficiência. Pneumonias e pneumonites,retinites,meningoencefalites,mielites, polirradiculopatia, úlceras gastrointestinais etc...

• Atualmente: RN/Transplantados e HIV/AIDS

CITOMEGALOVIRUS

Genoma: 240kb,envelope de bicamada proteica- 8 proteínas –glicoproteínas gB e gH- Sítios antigênicos para Ac neutralizantes.

LACUNAS

1. Prevalência alta- Presença do vírus ocasionando a doença?

2. Latente- PMN OU replicação viral ativa?

3.Detecção de doença: PCR-Tempo Real- Oneroso.

4. Assintomatologia ou baixa clínica- 90% dos casos!!!!!!!!!!!!

MATERIAIS E MÉTODOS

• Explicação do método Semi-quantitativo-PCR: É uma medida indireta por comparação pareada da medida dos plasmídeos clonados com os teores virais da amostra obtida dos pacientes.

CLONAGEM PLASMIDIAL

1. Plasmídio bacteriano pCRII (Invitrogen-USA)

Gene gB com 296 pb- 81874-82176, cepa 169

Dois primers- gB 1 e gB2

PCR convencional: 35 ciclos (Tecne-England)

Eletroforese em gel de Agarose 2%, azul de bromofenol 0,25% em sacarose 40%. Brometo de etídio

Bandas com tamanho de 100pb de peso molecular

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CLONAGEM

MATERIAIS E MÉTODOS

• Sequenciamento- Comparando o genoma do CMV ao plasmidio-inserto - PCR de sequenciamneto –Thermo sequenase (Amersham Pharmacia- USA). Armazenada em computador utilizando o programa SEQ 4x4 Basecaller (Amersham Pharmacia-Canadá) e WinDNAsis (Hitachi-Japan)- gene gB CMV 169.

• Quantificação dos plasmídios- Espectofotômetro-absorbância de 290nm.

Diluições decimais variadas.

RESULTADOS

RESULTADOS-

SEQUENCIAMENTO

CÁLCULO DO NÚMERO DE PLASMÍDIOS

• Após purificado o plasmídio: 200 mcl-176 mcg DNA/ml

• Verificação do número de plasmídios no lote: PM médio de um par de bases nitrogenadas 660 e multiplicou-se esse valor por n. de pares de bases do mesmo: 1400190.

• PM do plasmídio: 1400190 g- 6,02 x 10 23 mol plasmidiais ( N. de Avogadro)

• Número de plasmídio da amostra de DNA 176 mcg/ml-3,83 x 1018.

• Amostras aliquotadas em 50mcl.

SENSIBILIDADE DA PCR DAS ALÍQUOTAS

CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS

• Cálculo para determinar a CV das amostras feito a partir das densidades das bandas das soluções decimais.

Ex. Material clínico com banda de 50991 que fica entre 30307 (8670) – 61177 (86700): 30870

• Intervalo entre banda amostral (50991) e banda plasmidial mais diluída (30307): 20684

• Regra de 3: Intervalo da banda amostral 3870-100% e 20640 x: 67%

CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS

DISCUSSÃO

1. Plasmídio clonado mostrou alta homologia com a cepa de CMV (98%).

2. Leitura das bandas ponto-chave e manter as concentrações das soluções.

3. Sequenciamneto e diluições lógicas.

Diliução até 867 plasmídios por mcg de DNA mostrou-se adequada aos graus de infecções agudas..

Baixo custo e rápida.

OBRIGADA!