Clonagem de expressão

Tópicos

Significado da clonagem de expressão

Expressão heteróloga em E. coli

Tipos de vectores de expressão

Expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae

Vectores de clonagem em leveduras

Expressão heteróloga em células de mamífero

Vectores de clonagem em células de mamífero

Significado da clonagem de expressão

Muitas das manipulações em clonagem molecular (clonagem geral) não requerem a expressão do DNA clonado.

A clonagem de expressão permite obter o produto do gene clonado.

O produto é utilizado para diferentes fins:

• O transcrito da sequência clonada (transcrição in vitro) pode servir como sonda de hibridação.

• A proteína expressa pode servir para identificar o gene clonado, numa biblioteca de expressão, por hibridação com o anticorpo específico.

• O DNA recombinante pode servir para produzir proteínas de valor comercial.

Expressão heteróloga em E. coli (1)

• Objectivo – Produção de grande quantidade de proteína recombinante

• Factores de selecção do sistema de expressão

• Principais factores da expressão de genes clonados

• Expressão em E. coli- Vantagens e desvantagens- Razões da expressão não eficiente- Configuração de vectores eficientes- Regulação transcricional

Promotor Terminador

- Regulação traducionalIniciação da traduçãoEstimuladores traducionaisTerminação da tradução

Expressão heteróloga em E. coli (2)

- Promotores

- Frequência de utilização de codões

- Proteólise

- Expressão citoplasmática

- Expressão periplasmática

- Secreção extracelular

- Fusões transcricionais

- Fusões traducionais

Adição de tags

Adição de sinais de secreção (Protein targeting)

Factores de selecção do sistema de expressão

• Características do crescimento celular

• Níveis de expressão (intracelular e/ou extracelular)

• Modificações pós-traducionais

• Actividade biológica da proteína relevante

• Dificuldades, custos

Principais factores da expressão de genes clonados

Vantagens e desvantagens da expressão em E. coliVantagens Desvantagens

• Vasto conhecimento da genética e fisiologia de E. coli

• Diversidade de vectores de clonagem

• Fácil controlo da expressão génica

• Fácil crescimento com elevadas produções

• Secreção do produto no meio de cultura

• Não realiza modificações pós-traducionais e tem capacidade limitada de formar pontes dissulfídricas

• Actividade biológica e imunogenicidade podem diferir da proteína natural

• Elevado conteúdo de endotoxinas

• Falta de um mecanismo de secreção

Razões da expressão não eficiente em E. coli

• Características estruturais da sequência de nucleótidos do gene

• Instabilidade do mRNA

• Reduzida eficiência traducional

• Dificuldade de enrolamento da proteína

• Diferenças de utilização de codões

• Toxicidade da proteína para o hospedeiro

Configuração de vectores de expressão eficientes

MCS

Elevado nº de cópias, elevado nº de moldes de transcrição

Características do promotor (P)- Sequências -10, -35- Elemento UP (sequência a montante da box -35,

estimulador da transcrição)- Forte (eficientemente reconhecido pela polimerase de

RNA)- Regulação forte (baixo nível de expressão basal

devido ao gene regulador, R, presente no vector ou integrado no cromossoma de E. coli)

- Indução fácil (térmica ou química)- Posicionamento (10-100 pb da sequência de Shine-

Dalgarno - SD)

Funções do terminador da transcrição – TT- A jusante da sequência clonada impede a transcrição através de outro promotor, o que pode inibir a sua função, fenómeno conhecido por oclusão do promotor

- Aumenta a estabilidade do mRNA

UAA - codão stop mais frequenteUAAU - codão stop mais eficiente

Promotores utilizados em E. coli

Promotor (origem) Regulação Indução

Plac (E. coli) lacI, lacIq IPTG

Ptac, P híbrido (E. coli, box -35 do P do operão do lacI, lacIq IPTGtriptofano, box -10 do P do operão da lactose)

PL ( λ) λcIts857 Térmica

PT7 (T7) λcIts857 TérmicalacI, lacIq IPTG

Representação esquemática da repressão do promotor PL de λ

O repressor codificado pelo gene cI857 é sensível à temperatura.

Utilização do gene cI857 no sistema de expressão PT7

Sistema de expressão: Plasmídio com PL a montante do gene 1Vector com PT7 a montante do gene em estudo Genoma do hospedeiro com λcI857

O gene 1 codifica a polimerase de RNA T7 específica do promotor PT7

A polimerase de RNA de E. coli reconhece PL

A polimerase de RNA de E. coli é selectivamente inibida pela rifampicina

1º Indução – Síntese da polimerase de RNA T7 por elevação da temperatura de incubação de E. coli 2º Adição de rifampicina – Inibição da polimerase de RNA de E. coli

Nestas condições só ocorre síntese da proteína do gene em estudo.

Sistema de expressão PT7 sob controlo do Plac

Regulação lacI, lacIq

Indução por IPTG

Efeito da diferente utilização de codões na expressão génica

com baixa frequência de utilização em E. coli

Haverá baixa expressão proteica se o DNA clonado tiver codões pouco utilizados em E. coli.

Soluções: Mutagénese sítio-específica (alteração de nucleótidos sem alteração de aminoácidos)

Coexpressão do gene argU que codifica o tRNA Arg (AGG/AGA)

Tipos de vectores de expressão

Os vectores de expressão são de dois tipos:

Vectores de fusão transcricional – fornecem apenas o promotor

Vectores de fusão traducional – fornecem o promotor e os sinais de tradução (RBS e codão de iniciação da tradução)

Fusões transcricionais e traducionais (1)

Em ambos os vectores o inserto deve estar clonado na orientação correcta.

Fusões transcricionais e traducionais (2)

• Na fusão transcricional, o promotor e o gene constituem uma unidade transcricional, isto é, a transcrição iniciada a partir do promotor continua através do gene clonado.

O vector fornece o promotor.

O inserto contém os sinais de tradução – RBS e codão de iniciação da tradução.

É produzida proteína nativa.

• Na fusão traducional também se forma uma unidade transcricional.

O vector fornece o promotor e os sinais de tradução.

É produzida proteína de fusão ou proteína híbrida, em que parte do produto da tradução (proteína ou polipéptido) é derivado do inserto e parte do vector.

Requisitos da fusão traducional

• É preciso conhecer a sequência de nucleótidos do inserto e avaliar o resultado da clonagem num determinado local.

• O inserto deve estar na mesma grelha de leitura do ATG do vector.

• Pode ser necessário mudar de vector, ou modificar o vector ou o inserto (utilizando linkers ou adaptadores). Alternativamente, o inserto pode ser produzido por PCR, com primers que contêm um local de restrição que produz a grelha correcta.

• É fundamental testar por sequenciação o produto recombinante para confirmar a correcta inserção do fragmento de DNA. A perda de uma base durante a ligação resulta numa grelha de leitura incorrecta.

• As proteínas toleram uma variação considerável de aminoácidos na extremidade N, mas para fins terapêuticos em humanos devem ser utilizados produtos iguais aos naturais.

Exemplo de fusão traducional em fase

1.

2.

Em 1., fusão traducional em fase; em 2., fusão traducional incorrecta.

Clonagem num vector de expressão plasmídico

A sequência de DNA que codifica a proteína relevante é clonada num vector de expressão.

O vector de expressão tem um promotor forte, adjacente ao gene que codifica a proteína, que origina grandes quantidades de mRNA.

O DNA recombinante éintroduzido em bactérias, leveduras, células de insecto, ou células de mamífero, onde o gene clonado é transcrito e traduzido eficientemente.

lac

A clonagem de expressão permite a produção de grandes quantidades da proteína relevante.

Vectores de expressão em duas etapas

Expressão de genes letaisPT7 – promotor com um controlo muito apertado

Vector pET-3

O promotor do fago T7 permite elevado nível de expressão; a sequência líder do gene 10 (estimulador da tradução) do fago T7 assegura elevado nível de tradução; NdeI e BamHI são locais de clonagem. A clonagem em BamHI origina uma proteína de fusão contendo 13 aminoácidos N-terminal do gene 10 do fago T7.

NdeIBamHI

Clonagem num vector λ de expressão (1)

Vector λgt11

A identificação do DNA clonado é feita por hibridação com um anticorpo específico da proteína expressa.

Figure 7-21. [Adapted from J. D. Watson et al., 1992, Recombinant DNA,2d ed., Scientific American Books.]

Detecção de proteínas com anticorpos

Funções do tag

O tag é uma curta sequência de nucleótidos que codifica um péptido com poucos aminoácidos.

• Pode ser adicionado à extremidade N ou C do produto do gene clonado.

• Permite a detecção e purificação de proteínas.

• Péptidos de fusão específicos conferem vantagens à proteína alvo durante a expressão: aumentam a solubilidade, protegem da proteólise, melhoram a conformação, aumentam a produção.

• São vários os tags utilizados nos vectores de clonagem:His6 Glutationa-S-transferase (GST) Proteína de ligação a maltose (MBP)Proteína verde fluorescente (GFP)Epítopos

Tag adicionado ao inserto

Por engenharia genética, um tag (epítopo) pode ser adicionado ao inserto.Figure 8-48. © 2000 by W. H. Freeman and Company

Vectores com tag

Detecção de proteínas com tag

Purificação de proteínas com tag

As proteínas com tag são purificadas em colunas de cromatografia de afinidade.

Vectores de fusão génica pGEX-4T

A proteína de fusão éconstituída pela componente N-terminal de GST (tag) e pela componente C-terminal da proteína pretendida.

Pode ser purificada numa coluna de purificação de afinidade de glutationa (ex. sefarose 4B glutationa) e clivada com trombina.

A partir de EcoRI os locais múltiplos de clonagem de pEGX-4T-1, -2 e –3 configuram as três grelhas de leitura possíveis dos codões.

Purificação de complexos proteicos associados a proteínas de fusão com GST (1)

Figure 8-50. © 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Vectores de fusão génica pRSET

tag

EK – local de clivagem pela enterocinase para remoção do tag

Funções do péptido sinal

• A secreção de proteínas por bactérias depende normalmente da presença de um péptido sinal na extremidade N. As proteínas são reconhecidas pela maquinaria de secreção e transportadas através da membrana citoplasmática.

• A sequência de nucleótidos que codifica o péptido sinal existe no vector ou é incorporada no inserto. A secreção nem sempre acontece, dependendo da estrutura da proteína.

Gene repórter

Gene repórter é um gene que produz uma proteína que pode ser detectada e quantificada utilizando um teste simples.

Exemplos de genes repórter:GFP (Green fluorescent protein)lacZ (β-galactosidase)luc (luciferase)

Utilização de genes repórter na localização de proteínas recombinantesB) Ratinho transgénico com GFP em fusão

com uma proteína epitelial A) Proteína com tag GFP

A) O gene recombinante codifica uma proteína de fusão que contém GFP C-terminal.

B) O ratinho contém um transgene marcado com GFP expresso no corpo; o ratinho fluoresce quando iluminado com luz UV.Figure 19. 18 Genetics: From genes to Genomes, 2/e. (© McGraw-Hill Companies, 2004)

Vectores promoter-probe

Os vectores promoter-probe permitem detectar a existência de promotor no fragmento clonado, através da expressão do gene repórter (gene lacZ)

Avaliação do nível de expressão de promotores

Teste de detecção da β-galactosidase em que se utiliza o substrato ONPG

A análise dos dados revela:• A eficiência de tradução do gene lacZ é maior do que a do gene em estudo(por comparação entre fusões transcricionais e traducionais).

• Não há oclusão de promotor (por comparação entre resultados de diferentes fragmentos). A activação da transcrição do gene em estudo é maior quando os dois promotores estão presentes.

Expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae

Vantagens

• Organismo unicelular (altemativa eucariótica de E. coli)• Genética e fisiologia conhecidas• Crescimento rápido• Vários promotores fortes (CYC1, ADH1, GAL1O)• Plasmídio natural denominado 2-µm• Modificações pós-traducionais• Não patogénico• Elevada produção proteica• Produção industrial

Vectores de clonagem em levedurasNestes vectores, a função dos insertos é estudada por transfecção da estirpe de levedura de genótipo adequado.

São necessárias marcas de selecção para a detecção de clones recombinantes.

As origens de replicação são os locais necessários para as enzimas de replicação bacterianas e de levedura iniciarem o processo de replicação.

O DNA derivado do plasmídio natural de levedura, 2-µm, tem a sua própria origem de replicação.

ARS – Sequência de replicação autónoma

Representações simplificadas de quatro tipos diferentes de vectores de clonagem em leveduras.Figure 13-11. © 2000 by W. H. Freeman and Company.

Especificidades da clonagem em levedurasMétodos de transfecção em leveduras• Protoplastos• Acetato de lítio• Electroporação

Leveduras utilizadas como hospedeiros• Saccharomyces cerevisiae• Kluyveromyces lactis• Schizosaccharomyces pombe• Yarrowia lipolytica• Hansenula polymorpha • Pichia pastoris (Os vectores de expressão com o promotor AOX1- gene que codifica a enzima álcool oxidase - geram níveis elevados do produto pretendido (gramas/litro), com menores custos do que os sistemas de insectos e de mamíferos. Ao contrário dos sistemas bacterianos, os vectores de P. pastoris não são mantidos epissomicamente, mas são construídos para serem integrados num cromossoma da levedura. São vectores shuttle com origens de replicação em levedura e em E. coli.)

As leveduras utilizadas como hospedeiros são geralmente mutantes auxotróficos.Exemplos: TRP1, LEU2, URA3

A selecção das células transfectadas é feita por complementação de deficiências metabólicas.

Clonagem num plasmídio epissómico de leveduraHá menor número de antibióticos

disponíveis para os quais as leveduras são sensíveis (embora alguns fungicidas possam ser utilizados) e, por isso, a selecção baseia-se, frequentemente, na complementação de mutações auxotróficas da estirpe hospedeira.

Os vectores que replicam como plasmídios em S. cerevisiae são muitas vezes bastante instáveis, na medida em que tendem a ser perdidos na cultura devido à acumulação de células sem plasmídio. Isto é devido a uma partição errada durante a mitose.

Os vectores com ARS são muito instáveis, mas quando incluem o centrómero são mais estáveis.

Os vectores são, em geral, vectores de expressão porque expressar o gene clonado éuma das finalidades da utilização de leveduras como hospedeiro.

Clonagem num vector YAC

Características do vector YAC e do hospedeiroAs sequências do vector são:

CEN4 - sequência centroméricaTEL - sequências teloméricas ARS1 - sequência de replicação autónoma em leveduraAmp - gene que confere resistência à ampicilina para selecção em E. coliori - origem de replicação para propagação em E. coliSUP4 - gene que codifica o tRNA supressor da mutação ade-2 do hospedeiro e restaura a actividade selvagem, originando colónias brancasTRP1 e URA3 - genes envolvidos no metabolismo do triptofano e uracilo, respectivamente

Características do hospedeiro (estirpe AB1380 de levedura): ade-2 - mutação ocre no gene envolvido no metabolismo da adenina que resulta na acumulação de pigmento vermelho (colónias vermelhas). A clonagem de um fragmento de DNA exógeno no gene SUP4, inactiva a função supressora do gene, originando o fenótipo mutante.trp1 e ura3 - alelos complementados pelos alelos correspondentes do vector, constituindo um sistema de selecção para identificar as células que contêm o vector YAC.

Expressão heteróloga em células de mamífero

Realização de modificações pós-traducionais idênticas às naturais.

Expressão transitória – expressão obtida sem integração do vector

Expressão estável – expressão resultante da integração do vector de expressão num dos cromossomas do hospedeiro

Promotores utilizados na construção de vectores de células de mamífero:PSV40 (Simian Virus)PRSV-LTR (Rous Sarcoma Virus)PMSV-LTR (Murine Sarcoma Virus)PBPV-1 (Bovine Pappilomavirus Type 1)PCMV (Citomegalovirus)

Vector de expressão em células de mamífero, pcDNA3.1/myc-HIS

Características do vector pcDNA3.1/myc-HISVector shuttle que permite elevado nível de expressão constitutiva em células de

mamífero

PCMV – promotor forte de citomegalovírus que assegura elevado nível de expressão BGH pA – elemento da sequência de poliadenilação da hormona de crescimento bovino que permite a produção de uma extremidade 3’ definida no mRNA obtido a partir do inserto.neo – gene marcador, regulado por um promotor/estimulador e sequência poli A SV40, que permite a selecção por crescimento em G418 (geneticina)Polylinker – contém locais múltiplos de clonagem6xHis – sequência que especifica seis resíduos de histidina consecutivos que facilita a purificação da proteína recombinanteEpítopo myc – tag que permite a triagem com anticorpos da proteína recombinante utilizando um anticorpo específico para esta sequênciaTerm – sinais de terminação da traduçãoSV40 ori – origem de replicação em células de mamífero

Componentes de propagação em E. colipUC ori – origem de replicação derivada do plasmídio ColE1Amp – gene que confere resistência à ampicilinaf1 ori – origem de replicação do fago filamentoso f1 que permite produzir recombinantes de cadeia simples

Características das células COS

As células COS permitem que qualquer DNA circular com uma origem de replicação SV40 replique independentemente do DNA celular.

É uma linha estável de células de rim de macaco verde Aficano derivada da linha celular de macaco, CV1, permissiva de SV40. Quando as células CV1 são infectadas com SV40, ocorre o ciclo lítico normal do vírus.

As células CV1 foram transformadas por integração nos cromossomas de um fragmento de DNA genómico de SV40 contendo uma origem de replicação mutante.

As células COS resultantes (CV1 com origem defectiva de SV40) expressam constitutivamente (estavelmente) o antigénio T codificado por SV40, a única proteína viral que é necessária para activar a origem de replicação de SV40.

Vector pBK-CMV

Características do vector pBK-CMV