ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT -...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT
AVALIAÇÃO DOS FÁRMACOS VX-809 E VX-770 NA FUNÇÃO DA
CFTR E A FUNÇÃO DE CANAIS ALTERNATIVOS DE CLORETO EM
CÉLULAS PRIMÁRIAS EPITELIAIS DAS VIAS AÉREAS DE
PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA
CAMPINAS
2018
ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT
AVALIAÇÃO DOS FÁRMACOS VX-809 E VX-770 NA FUNÇÃO DA
CFTR E A FUNÇÃO DE CANAIS ALTERNATIVOS DE CLORETO EM
CÉLULAS PRIMÁRIAS EPITELIAIS DAS VIAS AÉREAS DE
PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em
Ciências Médicas, Área de Concentração Ciências
Biomédicas.
ORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª Margarida Sofia Pereira Duarte Amaral
CO-ORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª Carmen Sílvia Bertuzzo
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO
ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT, E
ORIENTADO PELA PROF.ª DR.ª MARGARIDA
SOFIA PEREIRA DUARTE AMARAL
CAMPINAS
2018
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT
ORIENTADOR: MARGARIDA SOFIA PEREIRA DUARTE AMARAL
COORIENTADOR: CARMEN SÍLVIA BERTUZZO
MEMBROS:
1. PROF. DR. MARGARIDA SOFIA PEREIRA DUARTE AMARAL
2. PROF. DR. JACKSON DE SOUZA MENEZES
3. PROF. DR. LUIZ VICENTE RIBEIRO FERREIRA DA SILVA FILHO
4. PROF. DR. CARLA BEATRIZ COLLARES BUZATO
5. PROF. DR. ANDRE ALMEIDA SCHENKA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: DATA DA DEFESA [20/02/2018]
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Luiz Carlos Kmit e Vania Aparecida Pezzo Kmit que dignamente
me apresentaram à importância da família e o caminho da honestidade e persistência.
À mulher da minha vida Cínthia Fernandes Kmit pelo apoio incondicional em
todos os momentos, principalmente nos de incerteza, muito comuns para quem tenta trilhar
novos caminhos.
Sem vocês nenhuma conquista valeria a pena.
E, a todos os pacientes fibrocísticos do mundo, em especial os do Brasil, este
trabalho é para vocês.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Luiz Carlos Kmit e Vania Aparecida Pezzo Kmit, meus primeiros
e maiores exemplos de amor, perseverança, bondade, honestidade e força. Por sempre me
ensinar a agir com respeito, simplicidade, dignidade, honestidade e amor ao próximo. A
minha melhor amiga, minha esposa Cínthia Fernandes Kmit, pelo amor, apoio, dedicação e,
especialmente, a paciência que você sempre teve por mim. A minha irmã, Maria Carolina
Pezzo Kmit, pelo carinho, apoio, união e companheirismo. E a toda minha família, sobrinho,
avós, tios, primos, sogro, sogra, cunhados pelo apoio e carinho demonstrando em todos os
momentos.
Em especial a minha orientadora Profa. Dra. Margarida Sofia Pereira Duarte
Amaral, pela oportunidade. Por ter me recebido tão prontamente em seu laboratório em
Lisboa – Portugal. Por aceitar minhas decisões, que nem sempre são fáceis. É uma grande
honra ter em minha história a sua presença de professora, guia científico e por despertar, em
mim, um senso crítico científico. Por ter proporcionado momentos de discussão, crescimento
e muito aprendizado em nossas conversas e reuniões. Admiro sua paixão pela ciência, em
especial pela fibrose cística, na busca de conhecimento, doação, entusiasmo e se importando
tanto com o bem estar dos pacientes e familiares. Deixo aqui uma pequena homenagem. Todo
o meu respeito e admiração.
A Profa. Dra. Carmen Sílvia Bertuzzo, minha co-orientadora. Agradeço por me
ajudar em todos os momentos difíceis que passei no decorrer desse doutorado. De me ensinar
a me portar, de me acalmar e ajudar em todos os momentos de maior estresse e
principalmente de nunca falar não e sempre apoiar minhas decisões. Obrigado por estar
sempre presente. Meus sinceros agradecimentos, respeito e admiração.
Ao Prof. Dr. Antônio Fernando Ribeiro, meu co-orientador. Agradeço por
disponibilizar o LAFIC para o desenvolvimento do meu trabalho. Por todas as conversas,
apoio, ensinamentos e discussões. Das conversas e risadas nas viagens para buscar os pulmões
em São Paulo, independente do horário e dia. Do auxilio com os pacientes no ambulatório
para a realização das coletas. De abrir novos horizontes para a pesquisa na fibrose cística no
Brasil. E principalmente pelo apoio e confiança em meu trabalho. Meus sinceros
agradecimentos, respeito e admiração.
Minha gratidão a minha amiga de trabalho, Dra. Adriana Mendes Vinagre, por
toda ajuda no desenvolvimento do meu trabalho, experimentos, coletas, protocolos, cultura de
células. Obrigado por todas as conversas, risadas, apoio e trabalho. Sem você esse trabalho
não seria realizado. A Dra. Juliana Moreira pela amizade e ajuda no início do meu doutorado.
A estagiária, agora aluna de mestrado, Gabriela da Silva Leite, pela ajuda no LAFIC, nos
experimentos e cultura de células, e por ter proporcionado a minha primeira coorientação de
TCC.
Agradeço ao biólogo Paulo César Alves pela ajuda, empréstimo de materiais,
disponibilização de equipamentos e disponibilidade sempre que necessária. À bióloga
Amanda Roberta Almeida pela ajuda e contribuições nas culturas de células no Laboratório
Multiusuário.
Agradeço ao Dr. Fernando Augusto Lima Marson, pela ajuda neste último ano de
doutorado. Muito obrigado por todas as correções, sugestões e ensinamentos na minha
formação de doutor.
Minha gratidão aos que fizeram parte desta trajetória, professores, doutores,
funcionários, alunos e colegas. Aos funcionários do CIPED e do ambulatório de fibrose
cística do HC. Em especial, Dra. Maria de Fátima Corrêa Pimenta Servidoni, Dra. Maíra
Assumpção, Dra. Aline Gonçalves, Ms. Stephanie Villa-Nova Pereira e Renata Guirau que
participaram e me ajudaram neste trabalho.
Aos professores Dr. José Dirceu Ribeiro, Dra. Adyléia Aparecida Dalbo Contrera
Toro, Dra. Carla Beatriz Collares Buzato pelas contribuições realizadas na qualificação deste
doutorado.
Aos professores Dr. Jackson Menezes, Dr. Luiz Vicente Ribeiro Ferreira da Silva
Filho, Dra. Carla Beatriz Collares Buzato, Dr. André Schenka por aceitarem serem membros
titulares da banca deste doutorado. Aos professores Dra. Marilda de Souza Gonçalves e Dr.
Paulo José Cauduro Marostica por aceitarem serem membros suplentes da banca deste
doutorado.
O meu muito obrigado a todos os pacientes que participaram dos estudos, doando
as suas células, sem vocês nunca seria possível à realização desse trabalho.
As agências de fomento, Fapesp, Capes, Faepex, Ciência sem Fronteiras, e outras que
participaram do financiamento desta pesquisa e da bolsa de estudos concedida na realização
do doutorado e a Universidade Estadual de Campinas – Unicamp.
RESUMO
Introdução: A fibrose cística (FC) é uma doença autossômica recessiva que afeta mais de 85 mil
pessoas em todo o mundo e pouco menos de 4 mil no Brasil, que é o 7º país com mais pacientes
registrados. Pacientes fibrocísticos sofrem com a complexidade e gravidade da doença, com uma
sobrevida média de 12 anos no Brasil e 30 anos em países desenvolvidos. A FC é consequência de
mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), que codifica uma
proteína transmembranar de mesmo nome, expressa na membrana apical de células epiteliais. Atuando
como um canal de cloreto e bicarbonato, a proteína CFTR é essencial para manutenção e equilíbrio
hidro salino do líquido superficial nos tecidos epiteliais. O déficit de sua função ou sua ausência
provoca a desidratação e acidificação deste líquido que gera diversas complicações nos órgãos
relacionados, principalmente no pulmão causando acumulo de muco e criando um ambiente favorável
para adesão e proliferação de patógenos, que leva a perda de função pulmonar e uma morte prematura
do paciente com FC. Atualmente, foram desenvolvidos fármacos moduladores da CFTR, que corrigem
a função deficiente na FC e promovem melhoras no fenótipo dos pacientes fibrocísticos. Fármacos
candidatos foram avaliados em estudos in vitro de células primárias de pacientes FC e apresentaram
eficácia para algumas mutações do gene CFTR, que seguido de testes clínicos, possibilitaram a
formulação dos medicamentos Ivacaftor® (VX-770), Lumacaftor
® (VX-809), Orkambi
® (VX-809 +
VX-770) Tezacaftor®
(VX-661) e Symdeko® (VX-661 + VX-770). Objetivo: Avaliar a função da
CFTR e a ação de fármacos moduladores da CFTR (VX-809 e VX-770), e a função de canais de
cloretos alternativos. Métodos: Foram isoladas e cultivas células HBE oriundas de 5 lóbulos
pulmonares, e células epiteliais traqueais (HTE) foram isoladas de um fragmento traqueal. Também
foram isoladas e cultivas células HNE de 23 pacientes. Após a manutenção dessas células em cultura,
elas foram cultivadas em filtros de membrana poliéster em interface ar-líquido (ALI) para
diferenciarem e polarizarem, formando monocamadas celulares confluentes. Os fármacos da CFTR,
corretor VX-809 e potenciador VX-770, foram analisados na Câmara de Ussing pelo protocolo de
quantificando a secreção de Cl- mediada pelo canal CFTR, nas células HNE e HBE dos pacientes
estudados. Resultados: A técnica da análise de função da CFTR em células HBE e HNE
diferenciaram estatisticamente a atividade da CFTR de pacientes não FC e FC. As análises nas células
HNE também diferenciaram pacientes não FC (wt/wt) de pacientes não FC portadores (fc/wt). A
avaliação da ação dos fármacos foi baseada nas funções basais da CFTR (100%) de pacientes não FC
(wt /wt). A ação do VX-809, VX-770 e dos dois combinados, VX809 + VX-770, foram positivas em
células HBE e HNE dos pacientes FC. Sendo assim, a função da CFTR basal e modulada pelos
fármacos, varia de paciente para paciente, mesmo aqueles que apresentavam a mesma mutação. No
presente trabalho, foi evidenciado que células HBE e HNE são ferramentas importantes para
quantificação individual da ação dos fármacos moduladores da CFTR. Baseadas nessas premissas
foram testadas as funções da CFTR em células HNE de 12 pacientes F508del / F508del em relação a
dois polimorfismos em dois genes, (SNP rs7512462 no gene SLC26A9 e o SNP rs3788766 no gene
SLC6A14). O SNP rs7512462 demonstrou modular positivamente a função da CFTR e a ação do VX-
809 e/ou VX-770 nas células HNE. Já no outro SNP, o rs3788766, demonstrou modular positivamente
a função basal da CFTR. Na investigação de alternativas na correção do defeito de transporte iônico no
epitélio FC, foi analisada a função da TMEM16A nas células HBE e HNE pela sua ativação com o
ATP, e foi comprovada a presença deste canal pela sua inibição com o uso do inibidor específico de
TMEM16s, o CaCCinh-AO1. A função da TMEM16A é independente da função da CFTR, e também
da ação dos fármacos moduladores, VX-809 e/ou VX-770, demonstrando ser um alvo potencial para
regular o transporte de Cl- nas vias aéreas de pacientes com FC, a ser somado com o tratamento dos
fármacos na FC. Conclusão: A cultura primária de células epiteliais brônquicas e nasais
demonstraram serem ferramentas importantes para a realização de estudos de função da CFTR, ação
de fármacos moduladores da CFTR, polimorfismos em genes moduladores da CFTR e/ou FC e de
canais alternativos para a correção do transporte iônico no epitélio da FC. Tal estratégia parece ser
relevante para aplicar a medicina personalizada.
Palavras-chave: CFTR; Fibrose Cística; Mutação; Genética; Vias aéreas; Fármacos moduladores;
VX-809; VX-770; ENaC; CaCC; Cloreto; Bicarbonato; TMEM16A; SLC26A9; Câmara de Ussing.
ABSTRACT
Introduction: Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease affecting more than 85,000
people worldwide and just under 4,000 in Brazil, which is the 7th country with the most registered
patients. Fibrocystic patients suffer from the complexity and severity of the disease, with an average
survival of 12 years in Brazil and 30 years in developed countries. CF is a consequence of mutations
in the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductivity Regulator) gene, which encodes a
transmembrane protein of the same name, expressed on the apical membrane of epithelial cells. Acting
as a chloride and bicarbonate channel, CFTR is essential for the maintenance and hydro saline balance
of surface fluid in epithelial tissues. The deficit of its function or its absence causes the dehydration
and acidification of this liquid that generates several complications in the related organs, mainly in the
lung causing accumulation of mucus and creating a favorable environment for adhesion and
proliferation of pathogens, which leads to loss of pulmonary function and a premature death of the CF
patient. Currently, CFTR modulating drugs have been developed that correct CF deficient function
and promote improvements in the phenotype of fibrocystic patients. Candidates drugs were evaluated
in in vitro studies of CF patients' primary cells and showed efficacy for some mutations of the CFTR
gene, which followed the clinical trials, allowing the formulation of the drugs Ivacaftor® (VX-770),
Lumacaftor® (VX-809) , Orkambi
® (VX-809 + VX-770) Tezacaftor
® (VX-661) and Symdeko
® (VX-
661 + VX-770). Objective: To evaluate the function of CFTR and the action of CFTR modulating
drugs (VX-809 and VX-770), and the function of alternative chloride channels. Methods: Bronchial
epithelial cells (HBE) from 5 lung lobes were isolated and cultured, and tracheal epithelial cells (HTE)
were isolated from a tracheal fragment. Nasal epithelial cells (HNE) cells from 23 patients were also
isolated and cultured. After maintenance of these cells in culture, they were grown on air-liquid
interface (ALI) polyester membrane filters to differentiate and polarize, forming confluent cell
monolayers. CFTR drugs, VX-809 and VX-770 were analyzed in the Ussing Chamber by the
quantification protocol of Cl-mediated by the CFTR channel in the HNE and HBE cells of the patients
studied. Results: The technique of CFTR function analysis in HBE and HNE cells statistically
differentiated CFTR activity from non-CF and CF patients. Analyzes in HNE cells also differentiated
non-CF patients (wt/wt) from non-CF patients (cf/wt). The evaluation of drug action was based on
baseline CFTR functions (100%) of non-CF patients (wt/wt). The action of VX-809, VX-770 and the
two combined, VX809+VX-770, were positive in HBE and HNE cells of FC patients. Thus, the
function of baseline and drug-modulated CFTRs varies from patient to patient, even those with the
same mutation. In the present work, it was evidenced that HBE and HNE cells are important tools for
individual quantification of the action of the CFTR modulating drugs. Based on these assumptions, the
functions of CFTR in HNE cells from 12 F508del/F508del patients were tested for two
polymorphisms in two genes (SNP rs7512462 in the SLC26A9 gene and SNP rs3788766 in the
SLC6A14 gene). SNP rs7512462 has been shown to modulate positively the function of CFTR and the
action of VX-809 and/or VX-770 on HNE cells. In the other SNP, rs3788766, it was shown to
modulate the basal function of CFTR. In the investigation of alternatives in the correction of the ionic
transport defect in the CF epithelium, the function of TMEM16A in HBE and HNE cells was analyzed
for its activation with ATP, and the presence of this channel was confirmed by its inhibition with the
use of the specific inhibitor of TMEM16s, CaCCinh-AO1. The function of TMEM16A is independent
of the function of CFTR and the action of modulating drugs, VX-809 and/or VX-770, proving to be a
potential target for regulating the transport of Cl- in the airways of CF patients, be added to the
treatment of CF drugs. Conclusion: The primary HBE and HNE cells has been shown to be important
tools for the study of CFTR function, CFTR modulating drugs, polymorphisms in CFTR and/or CF
modulating genes and alternative channels for the correction of ionic transport in the CF epithelium.
Such a strategy seems to be relevant in applying personalized medicine.
Keywords: CFTR; Cystic fibrosis; Mutation; Genetics; Airways; Modulating drugs; VX-809;
VX-770; ENaC; CaCC; Chloride; Bicarbonate; TMEM16A; SLC26A9; Ussing chamber..
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema representativo da estrutura da proteína CFTR. A. Estrutura linear. B. A
proteína CFTR expressa na membrana lipídica, composta de dois domínios de abrangência da
membrana (MSD1 e MSD2) compostos por seis segmentos transmembranares cada (TM1 a
TM12) e conectados a respectivo domínio de ligação dos nucleotídeos (NBD1 e NBD2). O
domínio R liga a primeira metade (MSD1 e NBD1) com a segunda metade (MSD2 e NBD2).
O canal abre quando o domínio R é fosforilado pela proteína quinase A (PKA) estimulada
pelo monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) e quando o ATP liga nos NBDs (Modificado
de: Ratjen, et al., 2015). ........................................................................................................... 31
Figura 2. Esquema representativo do ciclo da doença na FC em células brônquicas. CFTR:
Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; ENaC: Canais epiteliais de sódio;
Na+: Sódio; Cl
-: Cloreto (Modificado de: De Boeck, et al., 2016). .......................................... 32
Figura 3. Esquema representativo do ciclo de obstrução em glândulas na fibrose cística (FC).
A. Tecido normal e B. tecido FC. LSA: liquido superficial aerífero; HCO3-: Bicarbonato; Cl-:
Cloreto; Na+: Sódio (Modificado de: Ratjen, et al., 2015). ...................................................... 33
Figura 4. Modelagem molecular baseados em cristalografia da proteína CFTR indicando o
local que ocorre a mutação F508del. A. CFTR completo MSD1 (domínio de abrangência da
membrana 1), azul; MSD2 (domínio de abrangência da membrana 2), amarelo; NBD1
(domínio de ligação dos nucleotídeos 1), ciano; NBD2 (domínio de ligação dos nucleotídeos
2), laranja; Domínio R, verde; F508del, vermelho; B. Posição da F508 no NBD1 (Modificado
de: Molinski, et al., 2012)......................................................................................................... 34
Figura 5. Esquema representativo da classificação funcional, para uma melhor estratégia de
tratamento na fibrose cística, de sete diferentes classes funcionais do CFTR. Comparação da
célula com o CFTR normal, expresso na membrana apical de células epiteliais e a sua
condutividade de íons de cloreto (Cl-),
com as células de CFTR mutado, resumindo o defeito,
exemplo de mutações, terapia corretiva e fármaco (droga) utilizado (Modificado de: De
Boeck, et al., 2016). .................................................................................................................. 35
Figura 6. Modelos de estudos para uma medicina personalizada na terapêutica FC. Tecidos
coletados de diferentes órgãos, afetados pela FC, dos pacientes que são usados para gerar
culturas de células 2D e culturas esferoides 3D ou analisados como tecido montado. Foram
desenvolvidos protocolos para a geração de culturas esferoides dos epitélios nasais,
brônquicos e retais. As culturas 2D são estabelecidas para células humanas das vias aéreas e
os tecidos epiteliais intesteinais humano (Modificado de: Cholon & Gentzsch, 2017). .......... 41
Figura 7. Deficiência no transporte de íons epiteliais e a defesa prejudicada do hospedeiro nas
vias aéreas de FC. A. Vias aéreas não FC: a secreção coordenada de sal e água conduzida pelo
CFTR em conjunto com os canais alternativos de cloreto TMEM16A e SLC26A9 e a
absorção pelo canal epitelial de sódio ENaC, resultam na hidratação adequada da camada de
liquido superficial aerífero (LSA) essencial para uma limpeza mucociliar efetiva. Além disso,
a secreção de bicarbonato mediada pelo CFTR contribui para a regulação do pH. B. Vias
aéreas FC: o mau funcionamento da CFTR prejudica a secreção de Cl- / HCO3- levando a
desidratação e acidez do LSA e um muco hiperconcentrado. A desidratação da LSA é ainda
agravada pelo aumento da absorção de sódio / H2O mediada pelo ENaC. Como resultado, a
limpeza mucociliar e a morte bacteriana são prejudicadas, tornando as vias aéreas FC
vulneráveis para infecção e inflamação (Modificado de: Mall & Gallieta, 2015). .................. 44
Figura 8. Estratégias farmacológicas em canais iónicos na fibrose cística. A. Dependendo dos
mecanismos moleculares subjacentes, o resgate farmacológico de função da CFTR mutante
pode ser corrigido por potenciadores, corretores e agentes de leitura. Estratégias para
compensar o mau funcionamento da CFTR incluem a ativação dos canais alternativos de
cloreto B.TMEM16A e C. SLC26A9. Em princípio, esses alvos alternativos poderiam ser
ativados por moduladores de tráfico que aumentam o número de canais de cloreto e/ou por
ativadores que aumentam a probabilidade de abertura desses canais na membrana plasmática
apical. D. Além disso, a inibição da absorção de sódio / H2O mediada pelo ENaC, seja
inibindo a sua ativação proteolítica por inibidores de protease ou por inibição direta do canal
por bloqueadores de ENaC podem ser usadas como uma estratégia para neutralizar a
desidratação da superfície das vias aéreas FC (Modificado de: Mall & Gallieta, 2015). ........ 45
Figura 9. Transporte de L-arginina do líquido superficial aéreo (LSA) pela SLC6A14
contribui para a defesa do hospedeiro, reduzindo a ligação da P. aeruginosa (PA) à membrana
apical das células epiteliais das vias aéreas. O transportador de aminoácidos SLC6A14 (caixa
roxa sólida) medeia à absorção de L-arginina em células epiteliais ciliadas no pulmão.
Quando a SLC6A14 é disfuncional (caixa roxa tracejada) devido à variação genética (por
exemplo, polimorfismos), a L-arginina é acumulada no LSA e aumenta a fixação da P.
aeruginosa na superfície das células epiteliais (Modificado de: Di Paola, et al.,2017). .......... 47
Figura 10. Células Primárias Humanas Epiteliais Brônquicas – HBE. A. Lóbulo pulmonar B.
Arvore brônquica após a remoção das partes aderentes (limpo) C. Células primárias epiteliais
brônquicas em placas p-100 (Aumento de 20 vezes). D. Células epiteliais brônquicas com
100% de confluência em filtros de membrana porosa de poliéster Corning® Costar®
Snapwell (Aumento de 10 vezes). ............................................................................................ 51
Figura 11. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) em células primárias
epiteliais nasais e brônquicas humanas. A. Ilustração representativa da inserção do eletrodo
chopstick nos filtros de membrana porosa para a realização das medições TEER. B. Aparelho
Milicell® ERS-2, eletrodo chopstick e placa de 6 poços contendo os filtros de membrana
porosa de poliéster Corning® Costar
® Snapwell (Modificado de: Ebrary, 2018). ................... 52
Figura 12. Imagens em objetiva 10X da co-cultura das células primárias epiteliais nasais com
os fibroblastos NIH/3T3. Tripsinização diferenciada das células HNE e dos fibroblastos: A.
Células HNE mais os fibroblastos em co-cultura e B. após a adição da tripsina EDTA (1X)
por 90s à 37ºC, os fibroblastos foram descolados, restando apenas células HNE aderidas aos
frascos T25. .............................................................................................................................. 55
Figura 13. Câmara de Ussing de perfusão contínua micro modificada. .................................. 56
Figura 14. Duas Microcâmaras de Ussing com sistema de perfusão contínua comum,
montadas em gaiola de Faraday................................................................................................ 57
Figura 15. Circuito elétrico na Câmara de Ussing em condições de circuito-aberto. ............. 58
Figura 16. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células
HBE do paciente Pul3 (? / ?) . A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras
de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809.
Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE
incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=6–9). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de
Student bicaudal. p < 0,05. ....................................................................................................... 62
Figura 17. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células
HBE do paciente Pul4 (c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação
da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE),
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de
DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de
Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). ....................... 63
Figura 18. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células
HBE do paciente Pul5 (F508del / c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs)). A. ΔIsc-eq-FSK do
protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais
brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas
por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos,
analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-
809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de Student bicaudal. p < 0,05. ............. 64
Figura 19. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células
HBE do paciente Pul11 (F508del / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em
Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em
filtros Corning® Costar
® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-
809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células
HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T
de Student bicaudal. p < 0,05. .................................................................................................. 65
Figura 20. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células
HBE do paciente Pul12 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras
de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809.
Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE
incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de
Student bicaudal. p < 0,05. ....................................................................................................... 66
Figura 21. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células
HTE do paciente Traq4 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras
de Ussing, de células primárias epiteliais traqueais humanas (HTE), cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809.
Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE
incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3 – 6). .................................................................. 67
Figura 22. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes
sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais
brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5
e Pul11 (FC), incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-
FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR
com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-
809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto) e (n=3–9). Diferença significativa avaliada pelo
Teste T de Student p<0,05; #: Pul3 comparada com todos os outros grupos; *: VX-770 do
Pul4 comparada com o Pul5 e do Pul5 comparada com o Pul11; **: VX-809 do Pul4
comparada com os grupos Traq4, Pul5 e Pul11; ***: VX-809 do Pul5 comparada com os
grupos Traq4 e Pul12; $: Diferença significativa do VX-809 do Pul11 comparada com os
grupos Traq4 e Pul12. ............................................................................................................... 68
Figura 23. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas
das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK -
µA/cm2) avaliadas em células epiteliais brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes
Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11 (FC), incubadas por 48hs com DMSO
(0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da
CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de
Ussing. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770
(preto). (n=3–9). ....................................................................................................................... 68
Figura 24. Gráfico em barras das correntes de curto circuitos (ΔIsc-eq - µA/cm2) sensíveis a
Forscolina (FSK 2µM) em células primárias epiteliais nasais (HNE) dos pacientes da segunda
etapa (PX01 – F508del/F508del; PX02 – F508del/WT; PX03 – wt/wt; PX04 – wt/wt; PX05 –
F508del/R1066C), geradas pelo protocolo de ativação da função da CFTR, em Câmaras de
Ussing cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell. Filtros pré-incubados por 48hs
com DMSO (0,05%). n=3-6. #,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T
de student bicaudal (p<0,05). ................................................................................................... 73
Figura 25. Imagens das células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas nos filtros
Corning® Costar® Snapwell. A. Filtro sem muco. B. Presença do muco sob as células HNE.
Aumento com objetiva de 10X. ................................................................................................ 73
Figura 26. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes
sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais
nasais (HNE) de dois pacientes não FC (wt/wt), dois pacientes não FC heterozigotos
(wt/F508del) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou
VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela
forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. A.
Comparação dos ΔIsc-eq-FSK das HNE dos pacientes por grupo de genótipos: wt/wt; wt
F508del; F508del/F508del. B. Porcentagem de função da CFTR nas HNE dos pacientes por
grupo de genótipos: F508del/F508del e wt/F508del em relação ao grupo controle wt/wt
(100%). n=6-46. *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal
(p<0,05). ................................................................................................................................... 74
Figura 27. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes
sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais
nasais (HNE) de dois pacientes não FC (wt/wt) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas
por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do
protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770
(10µM), em Câmaras de Ussing. A. Comparação dos ΔIsc-eq-FSK das HNE dos pacientes por
grupo de genótipos: wt/wt; F508del/F508del. B. Porcentagem de função da CFTR nas HNE
dos pacientes F508del/F508del em relação ao grupo controle wt/wt (100%). DMSO (branco);
VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). n=6-46. #,##
,###
,####
,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student (p<0,05).
.................................................................................................................................................. 75
Figura 28. Análise dos valores de ΔIsc-eq em células epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell, de diferentes pacientes FC com diferentes
mutações, F508del/F508del (linha preta), F508del/c.1584+18672 bp A>G (linha vermelha),
F508del/R334W (linha azul) e F508del/I618T (linha verde) incubados por 48h a 37°C com
DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR em Câmaras de
Ussing. Células HNE tratadas com A. VX-770, B. VX-809 e C. VX-809 + VX-770. Linhas
tracejadas horizontais suplementares nos gráficos indicam 10% do valor médio dos ΔIsc-eq-FSK
da função da CFTR em culturas de pacientes wt / wt (100%). ................................................ 75
Figura 29. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas
das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK -
µA/cm2) avaliadas em células epiteliais nasais (HNE), A. de 2 pacientes heterozigotos não FC
(wt/F508del), 1 F508del/R334W, 1 F508del/I618T, 2 F508del/c.1584+18672 bp A>G e B. 12
pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM).
Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e
potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco);
VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=2–6). ............... 76
Figura 30. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em
filtros Corning® Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-
809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC
F508del/F508del classificados pelo SNP rs7512462 (SLC26A9). Análise da ação dos
fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na CFTR de células HNE
de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha
vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CT+CC (linha verde), CT (linha azul) e TT
(linha vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média
aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ................ 77
Figura 31. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del
agrupados em relação ao SNP rs7512462 (SLC26A9), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a
37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3 μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo
de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos fármacos nas
células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-
770 (preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student bicaudal; #,
##,
###: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student
bicaudal em comparação com o genótipo CT e grupo CT+CC (p<0,05). Linhas tracejadas
horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da CFTR em células
HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ............................................................................ 78
Figura 32. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del
agrupados em relação à presença do alelo C ou T no SNP rs7512462 (SLC26A9), incubadas
por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados
no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR resgatada pelo pelos
fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);
VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico
T de student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e
10% da função basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). 79
Figura 33. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em
filtros Corning® Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-
809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC
F508del/F508del classificados pelo SNP rs3788766 (SLC6A14). Análise da ação dos
fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na CFTR de células HNE
de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha
vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha
vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos
ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ....................................... 80
Figura 34. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del
agrupados em relação ao SNP rs3788766 (SLC6A14), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a
37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3 μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo
de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos fármacos nas
células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-
770 (preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10%
da função basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ........ 81
Figura 35. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del
agrupados em relação à presença do alelo C ou T no SNP rs3788766 (SLC6A14), incubadas
por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados
no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR resgatada pelo pelos
fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);
VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**,***,****: Diferente significativamente pelo teste
estatístico T de student bicaudal; #: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student bicaudal em comparação com o genótipo C e T (DMSO) (p<0,05). Linhas tracejadas
horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da CFTR em células
HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ............................................................................ 81
Figura 36. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em
filtros Corning® Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-
809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC
F508del/F508del classificados pelos SNPs rs7512462 (SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14).
Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na
CFTR de células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, C (linha verde) e T
(linha vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média
aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ................ 83
Figura 37. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del
agrupados em relação à presença do alelo C ou T nos SNPs rs7512462 (SLC26A9) e
rs3788766 (SLC6A14), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM).
Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de
função da CFTR resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770
(cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente
significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas
horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da CFTR em células
HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ............................................................................ 84
Figura 38. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o
corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por 48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de
quatro pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não FC heterozigotos (wt/F508del –
Cinza), 17 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul), 1
F508del/R1066C (Verde), 1 G542X/I618T (Amarelo) e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G
(Vermelho). n=2-6. ................................................................................................................... 85
Figura 39. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas com DMSO (0,05%) ou o
corretor da CFTR VX-809 (3µM) por 48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de dois
pacientes não FC (wt/wt - tracejado), um paciente não FC heterozigotos (wt/F508del – Cinza),
16 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul), 1 F508del/R1066C
(Verde), e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G (Vermelho). n=2-6. ........................................... 85
Figura 40. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o
corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por 48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de
dois pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não FC heterozigotos (wt/F508del –
Cinza) e 12 F508del/F508del (Preto). n=2-6. *,**: Diferente significativamente pelo teste
estatístico T de student bicaudal (p<0,05). ............................................................................... 87
Figura 41. Traçado original (Vte) da estimulação do ATP (100µM), apical, em células
primárias epiteliais brônquicas (HBE) do paciente não FC Pul12 (wt/wt), cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. ........................................ 88
Figura 42. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em células primárias epiteliais brônquicas
humanas (HBE) de pacientes não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell
e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-18. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste
estatístico T de student bicaudal; #: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student bicaudal em comparação com as células HBE dos Pul3, Pul4, Pul5, Pul11 e Pul12
(p<0,05). ................................................................................................................................... 88
Figura 43. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em relação à incubação com DMSO (0,05% –
branco) ou o corretor da CFTR VX-809 (3µM – preto) das células primárias epiteliais
brônquicas humanas (HBE) dos pacientes FC Pul3, Pul4, Pul5, Pul11 e não FC Pul12 e Traq4
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=3-
9. ............................................................................................................................................... 89
Figura 44. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-
AO1 (40µM), em células primárias epiteliais humanas brônquicas (HBE) e traqueais (HTE)
dos pacientes FC Pul3, Pul4 e Pul11 e não FC Pul12 e Traq4 cultivadas em filtros Corning®
Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-18. *: Diferente
significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05). ................................ 90
Figura 45. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em três aplicações de ATP (1: preto; +AO1: cinza
claro; 2: cinza escuro) e da sua inibição pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em
células primárias epiteliais humanas A. brônquicas (HBE) do paciente FC Pul3 e B. traqueias
do paciente não FC Traq4 cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em
Câmaras de Ussing. n=12-18. *,** Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student unicaudal (p<0,05). ...................................................................................................... 90
Figura 46. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em células primárias epiteliais nasais humanas
(HNE) de pacientes não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e
analisadas em Câmaras de Ussing. n=3-10. ............................................................................. 91
Figura 47. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em relação a incubação com DMSO (0,05%) ou o
corretor da CFTR VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos
pacientes controles P02 e P30 (wt/wt), controle heterozigoto PX02 (wt/F508del) e pacientes
FC P03 (F508del/R334W), P06 (G542X/I618T), P10 e P17 (F508del/ F508del/ c.1584+18672
bp A>G) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de
Ussing. n=2-4. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal
(p<0,05). ................................................................................................................................... 92
Figura 48. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em relação à incubação com DMSO (0,05%) ou o
corretor da CFTR VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos
pacientes FC F508del/F508del, cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e
analisadas em Câmaras de Ussing. n=2-6. ............................................................................... 92
Figura 49. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-
AO1 (40µM), em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de pacientes não FC e
FC (P30: wt / wt; PX02 – wt / F508del; P03 – F508del / R334W; PX01, P18, P19 e P25:
F508del / F508del) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em
Câmaras de Ussing. n=6-8. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student
bicaudal (p<0,05). ..................................................................................................................... 93
Figura 50. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) e de sua inibição pelo inibidor de CaCC,
CaCCinh-AO1 (40µM), em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) do A. paciente
não FC heterozigoto (PX02 – wt / F508del) e B. do paciente FC (PX01: F508del / F508del)
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6.
*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student (p<0,05). .............. 94
Figura 51. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) de quatro aplicações de ATP (100µM), com
lavagens de 15min entre cada aplicação, em células primárias epiteliais nasais humanas
(HNE) do paciente não FC (P02 – wt / wt) e sete pacientes FC F508del / F508del (P08, P09,
P12, P14, P15, P16 e P20) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em
Câmaras de Ussing. n=6-8. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student unicaudal (p<0,05). ...................................................................................................... 95
Figura 52. Cascata de ativação da TMEM16 em células epiteliais. Ativação dos receptores
purinérgicos membranares ativados pelo ATP, que ativam a fosfolipase C (PLC), ativando o
PIP2 que via IP3, libera cálcio (Ca2+
) intracelular, estocados no Reticulo endoplasmático,
ativando assim o TMEM16A (Modificado de: Guo, et al., 2015). ........................................ 103
Figura 53. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P02 não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da
CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);
Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ....................................................................... 123
Figura 54. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P30 não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da
CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);
Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ....................................................................... 123
Figura 55. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente PX02 não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise
de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172
(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 124
Figura 56. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P01 não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise
de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172
(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 124
Figura 57. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente PX01 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172
(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 124
Figura 58. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P08 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 125
Figura 59. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P09 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 125
Figura 60. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P12 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 125
Figura 61. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P14 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 126
Figura 62. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P15 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 126
Figura 63. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P16 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 126
Figura 64. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P18 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 127
Figura 65. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P19 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 127
Figura 66. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P20 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770
(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 127
Figura 67. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente P21 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de
função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172
(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 128
Figura 68. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente 25 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função
da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);
Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ....................................................................... 128
Figura 69. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente 03 FC (F508del/R334W). Protocolo de análise de função
da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);
Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ....................................................................... 128
Figura 70. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente 06 FC (G542X/I618T). Protocolo de análise de função da
CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);
Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ....................................................................... 129
Figura 71. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente 10 FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de
análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador
VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). .......................................... 129
Figura 72. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de
função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias
epiteliais nasais (HNE) do paciente 10 FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de
análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador
VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). .......................................... 129
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Listas de materiais utilizados na preparação dos meios de cultura de crescimento
epitelial brônquico (do inglês: Bronchial Epithelial Growth Media – BEGM) e meio para
diferenciação e polarização das células em interface ar-líquido (do inglês: Air Liquid Interface
– ALI). ...................................................................................................................................... 52
Tabela 2. Dados do isolamento das células primárias epiteliais brônquicas de lóbulos
pulmonares explantados no INCOR e no HC da Unicamp. ..................................................... 61
Tabela 3. Análise dos ΔIsc-eq em µA/cm2
do protocolo de função da CFTR nas células HBE e
HTE em Câmara de Ussing. ..................................................................................................... 67
Tabela 4. Porcentagens de função da CFTR nas células HBE e HTE, analisadas em Câmara
de Ussing, total, função basal (FSK 2µM) mais a ação dos fármacos VX-770 (10µM) e VX-
809 (3µM). Pul12 controle não FC 100% de função basal. ..................................................... 69
Tabela 5. Lista de pacientes com células primárias epiteliais nasais (HNE) coletadas,
analisadas a função da CFTR, Mutação dos pacientes e motivos da exclusão. Os pacientes
foram divididos em três etapas de estudo: a primeira (Piloto 1-3), fase em que foram
estabelecidos e validados os protocolos de estudo; a segunda (PX01-PX05) os estudos foram
realizados sem a presença do potenciador VX-770 e a última fase (P01-P30) com o protocolo
completo. .................................................................................................................................. 71
Tabela 6. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-eq,
em células primárias epiteliais nasais (HNE). .......................................................................... 72
Tabela 7. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-eq,
em de células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) em Câmara de Ussing, de pacientes
agrupados conforme o seu genótipo: wt/wt, wt / F508del e F508del / F508del. ..................... 73
Tabela 8. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl- em
células HNE de doze pacientes FC homozigotos para a F508del agrupados de acordo com o
SNP especifico: rs7512462 do gene SLC26A9 e rs3788766 do gene SLC6A14. A medida da
secreção de Cl- mediada pela CFTR foram quantificadas pela análise das médias e dos
desvios padrões dos deltas de correntes de curto-circuito equivalentes (ΔIsc-eq) determinadas
pela estimulação do AMPc pela FSK (2µM) sozinha (ΔIsc-eq-FSK) e pela adição do
potencializador VX-770 (10µM) (ΔIeq-sc-FSK+VX-770) nas células HNE incubadas por 48 horas
pelo corretor VX-809 (3µM) ou pelo veículo DMSO (0,05%). ............................................... 78
Tabela 9. Pacientes F508del/F508del e seus respectivos SPNs nos genes modificadores
analisados. ................................................................................................................................ 83
Tabela 10. Análise dos ΔIsc-eq da inibição do ENaC pela Amilorida (20µM) em células
primárias epiteliais nasais de pacientes FC e não FC, em Câmara de Ussing. ......................... 86
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A – Ampére;
ACTV – Coquetel de antibióticos: Anfotericina B, Ceftazidina, Tobramicina, Vancomicina;
ALI – Interface de ar líquido (do inglês: Air liquid interface);
Amil – Amilorida;
AO1 – Inibidor de canais de cloreto ativados pelo cálcio AO1;
ASL – Líquido superficial aerifico (do inglês: Air surface liquid);
ATP – Adenosina Trifosfato;
BSA – Albumina de soro bovino (do inglês: Bovine Serum Albumine);
BEGM – Meio de crescimento epitelial brônquico (do inglês: Bronchial Epithelium Growth
Media);
BPE – Extrato de Pituitária Bovina (do inglês: Bovine Pituitary Extract);
Ca2+
– Cálcio;
CaCC – Canal de cloreto ativado pelo cálcio (do inglês: Calcium Activated Chloride
Channel);
cAMP – Monofosfato cíclico de adenosina;
CFTR – Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator;
CFTRinh172 – Inibidor específico do canal CFTR;
Cl- – Cloreto;
CRC – Células condicionalmente reprogramadas;
DMSO – Dimetilsulfóxido;
DTT – DL-Dithiothreitol;
Dnase – Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino;
DPBS – Solução de tampão de fosfato salino Dulbecco;
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético;
EGF – Fator de crescimento epidérmico (do inglês: Epidermal Growth Factor);
ENaC – Canais epiteliais de sódio (do inglês: Epithelial Sodium Channel);
FBS – Soro fetal bovino (do inglês: Fetal Bovine Serum);
FC – Fibrose Cística;
FEV1 – Volume expiratório forçado no primeiro segundo da capacidade vital forçada;
FIS – Indução do inchaço por forscolina (do inglês: Forskolin Induced Swelling);
FRT – Células de tireoide de rato;
FSK – Forscolina;
GWAS – Genoma de ampla associação;
HBE – Células epiteliais primárias brônquicas humanas (do inglês: Human Bronchial
Epithelial);
HCO3- – Bicarbonato;
HNE – Células epiteliais primárias nasais humanas (do inglês: Human Nasal Epithelial);
HTE – Células epiteliais primárias traqueais humanas (do inglês: Human Tracheal
Epithelial);
HTS – Rastreio de alto rendimento (do inglês: Highthrouput Screening);
H2O – Água;
ICM – Medição de correntes no intestino (do inglês: Intesteinal Current Measurements);
IP3 – Inositol trifosfato;
IRT – Tripsinogênio imunorreativo;
Isc – Corrente de curto circuito;
Isc-eq – Correntes de curto circuito equivalentes;
mEq/L – mil equivalente por litro;
mRNA – RNA mensageiro;
MSD – Domínio de abrangência da membrana (do inglês: Membrane Spanning Domain);
mV – milivolts;
Na+ – Sódio;
NaCl – Cloreto de Sódio;
NBCS – Soro de bezerro recém-nascido (do inglês: Newborn Calf Serum);
NBD – Domínio de ligação dos nucleotídeos (do inglês: Nucleotide Bind Domain);
NBS – Rastreio de recém-nascidos (do inglês: Newborn Screening);
NMD – Decaimento do mRNA mediado por nonsense (do inglês: Nonsense-mediated mRNA
decay);
ORCC – Canal de cloreto de retificação externa (do inglês: Outwardly Rectifying Chloride
Channel);
P. aeruginosa – Pseudômonas aeruginosa;
PBS – Solução de tampão de fosfato salino;
Pen/Strep – Penicilina / Estreptomicina;
PIP2 – Fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato;
PKA – Proteína quinase A;
PLC – Fosfolipase C;
RE – Reticulo Endoplasmático;
Ringer – Solução tampão de uso nos experimentos na Câmara de Ussing;
ROCK – Inibidor da Rho quinase;
Rte – Resistência transepitelial;
SEM – desvio padrão da média aritmética;
SLC6A14 – Família transportadora de soluto 6 membro 14;
SLC26 – Família transportadora de soluto 26;
SLC26A9 – Família transportadora de soluto 26 membro 9;
SNP – Polimorfismo de nucleotídeo único;
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido;
TEER – Resistência elétrica transepitelial;
TM – Segmentos transmembranares;
TMEM16 – Família de proteínas transmembranar 16;
TMEM16A – Proteína transmembranar 16A;
TMEM16F – Proteína transmembranar 16F;
UTP – Trifosfato de uridina;
Vte – Voltagem transepitelial;
wt – Tipo selvagem (Wild type);
ΔIsc-eq – Delta das correntes de curto circuito equivalentes;
ΔIsc-eq-Amil – Delta das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis amilorida;
ΔIsc-eq-FSK – Delta das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina;
ΔIsc-eq-FSK+VX-770 – Delta das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina
mais o potenciador VX-770;
SUMÁRIO
1. Introdução ..................................................................................................................................... 30
1.1. CFTR – Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator .......................................... 30
1.2. Fibrose Cística........................................................................................................................ 30
1.3. Mutações no gene CFTR ........................................................................................................ 33
1.4. Técnicas para o diagnóstico na fibrose cística ...................................................................... 36
1.5. Fármacos moduladores da CFTR e testes in vitro para análise de eficácia ........................... 38
1.6. Correção da secreção do íon cloreto na fibrose cística por canais alternativos ................... 42
1.7. Polimorfismos em genes modificadores da CFTR e/ou FC .................................................... 45
2. Objetivo Geral ............................................................................................................................... 48
2.1. Objetivos Específicos ............................................................................................................. 48
3. Métodos ........................................................................................................................................ 49
3.1. Aspectos Éticos ...................................................................................................................... 49
3.2. Estudo em Células Primárias do Epitélio Brônquico Humano (HBE) ..................................... 49
3.2.1. Pacientes com fibrose cística atendidos pelo Serviço de Transplante Pulmonar do
Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. .................................................................... 49
3.2.2. Padronização do cultivo de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE) ... 50
3.3. Estudo em Células Primárias do Epitélio Nasal Humano (HNE ............................................. 53
3.3.1. Pacientes diagnosticados com FC atendidos pelo ambulatório de fibrose cística do
departamento de pediatria do hospital de clínicas da Unicamp .................................................. 53
3.3.2. Padronização da técnica de cultivo das células HNE ..................................................... 53
3.3.3. Análise dos polimorfismos SNP rs7512462 no gene SLC26A9 e rs3788766 no gene
SLC6A14 55
3.4. Câmara de Ussing .................................................................................................................. 55
3.4.1. Princípios gerais sobre a Câmara Ussing ....................................................................... 55
3.4.2. Tipos de Câmaras de Ussing .......................................................................................... 56
3.4.3. A Câmara de perfusão continua .................................................................................... 56
3.4.4. Medições transepiteliais em circuito aberto ................................................................. 57
3.5. Protocolos para a avaliação da função da CFTR e TMEM16A em células HBE e HNE em
Câmara de Ussing .............................................................................................................................. 58
3.6. Análise estatística .................................................................................................................. 60
4. Resultados ..................................................................................................................................... 61
4.1. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em células HBE de
pacientes FC ...................................................................................................................................... 61
4.2. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em células primárias
epiteliais nasais (HNE) ....................................................................................................................... 69
4.2.1. SNP rs7512462 (SLC26A9) modula a função e o resgate da CFTR (F508del / F508del)
pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770) ............................................................................ 76
4.2.2. Resgate da CFTR (F508del/F508del) pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770)
condicionada pelo SNP rs3788766 (SLC6A14) ............................................................................... 79
4.2.3. rs7512462*C e rs3788766*C agrupados modulam positivamente a função da CFTR e
melhoram a ação do Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770) .................................................. 82
4.2.4. Análise da função do canal epitelial de sódio, ENaC, pelos fármacos VX-809 e VX-770
em células primárias epiteliais nasais (HNE) ................................................................................. 84
4.3. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais brônquicas (HBE) de
pacientes FC e não FC........................................................................................................................ 87
4.3.1. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias
brônquicas humanas (HBE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-809 na
CFTR 88
4.3.2. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias
brônquicas humanas (HBE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1) .................. 89
4.4. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de
pacientes FC e não FC........................................................................................................................ 90
4.4.1. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias nasais
humanas (HNE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-809 na CFTR......... 91
4.4.2. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias nasais
humanas (HNE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1). ................................... 92
4.4.3. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias nasais
humanas (HNE) diminuem após múltiplas aplicações .................................................................. 94
5. Discussão ....................................................................................................................................... 96
5.1. Análise e Interpretação dos experimentos em Câmara de Ussing ....................................... 96
5.2. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em células primárias
epiteliais brônquicas humanas (HBE ................................................................................................. 96
5.3. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em células primárias
epiteliais nasais humanas (HNE). ...................................................................................................... 98
5.4. Modulação da função de CFTR e da ação dos fármacos VX-809 e VX-770 por polimorfismos
em genes associados à FC em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE). ........................ 100
5.5. Função do ENaC nas células HNE de pacientes FC e não FC ............................................... 102
5.6. Análise da função de TMEM16A nas células HNE e HBE de pacientes não FC e FC ........... 102
5.7. Relevância do Trabalho ....................................................................................................... 104
5.8. Perspectivas ........................................................................................................................ 105
5.9. Dificuldades na realização do estudo .................................................................................. 105
6. Considerações Finais ................................................................................................................... 109
6.1. Cultivo de células primárias epiteliais brônquicas (HBE) e nasais (HNE) humanas ............ 109
6.2. Ação dos fármacos moduladores da CFTR em células HBE e HNE ...................................... 109
6.3. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR em células
HBE 109
6.4. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR em células
HNE 110
6.6. Avaliação da função da TMEM16A em células HBE e HNE ................................................. 111
7. Conclusões................................................................................................................................... 112
8. Referências .................................................................................................................................. 113
9. Apêndice ...................................................................................................................................... 123
10. ANEXOS ................................................................................................................................... 130
30
1. Introdução
1.1. CFTR – Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
A fibrose cística (FC) é causada por mutações no gene CFTR (do inglês: Cystic
Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), que está localizado no braço longo do
cromossomo 7 e codifica uma proteína transmembranar de mesmo nome (Kerem et al., 1989;
Riordan, 1989; Rommens et al., 1989). A proteína CFTR está localizada na membrana apical
de células epiteliais e atua como um canal iônico que transporta cloreto (Cl-) e bicarbonato
(HCO3-). Este canal é regulado pela adenosina trifosfato (ATP) e fosforilação mediada por
proteína quinase A (PKA) quando estimulada pelo monofosfato cíclico de adenosina (cAMP)
(Riordan et al., 1989; Collins, 1992).
A proteína CFTR é composta por duas subunidades, contendo dois domínios de
abrangência da membrana (MSD1 e MSD2, do inglês: Membrane-Spanning Domains),
compostos por seis segmentos transmembranares cada (TM1 – TM12), que comunicam o
meio extracelular ao intracelular e são conectados aos domínios de ligação dos nucleotídeos
(NBD1 e NBD2, do inglês: Nucleotide Binding Domain), formando o poro do canal. Na
primeira metade da molécula, o NBD1 é seguido por um domínio citoplasmático conhecido
como "Domínio R" (Regulator Domain), contendo vários resíduos de serina que são
fosforilados pela PKA para regular a função do canal CFTR. O domínio R liga as duas
metades da proteína (MSD1 e NBD1 na MSD2 e NBD2) (Fig. 1) (Ratjen, et al., 2015;
Callebaut, et al., 2017; Meng, et al., 2017; Mijnders, et al. 2017).
1.2. Fibrose Cística
A FC é a doença autossômica recessiva mais frequente em populações caucasianas,
afetando mais de 85 mil pessoas em todo o mundo, incluindo aproximadamente 30 mil
indivíduos na América do Norte e mais 30 mil na Europa. As taxas de prevalência são
menores em populações não caucasianas, por exemplo, 1 em 4.000 a 10.000 latino-
americanos, 1 em 15.000 a 30.000 africanos e aproximadamente 1 em > 100.000 asiáticos. O
Brasil é o 7º país do mundo com mais pacientes registrados, até o ano de 2015 estavam
cadastrados 3.857 pacientes, com uma taxa de 1 em cada 75.000 nascidos vivos, e no estado
de São Paulo 1 em cada 12.195. Estes números podem estar subestimados, pois muitos
31
estados brasileiros não contam com centros de referência FC, impossibilitando o diagnóstico
preciso da doença (Rebrafc, 2015; Lopes-Pacheco, 2016; Jackson & Goss, 2017; Nunes, et
al., 2017).
Figura 1. Esquema representativo da estrutura da proteína CFTR. A. Estrutura linear. B. A proteína CFTR
expressa na membrana lipídica, composta de dois domínios de abrangência da membrana (MSD1 e MSD2)
contendo seis segmentos transmembranares cada (TM1 a TM12) e conectados ao respectivo domínio de ligação
dos nucleotídeos (NBD1 e NBD2). O domínio R liga a primeira metade (MSD1 e NBD1) com a segunda metade
(MSD2 e NBD2). O canal abre quando o domínio R é fosforilado pela proteína quinase A (PKA) estimulada
pelo monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) e quando o ATP liga nos NBDs (Modificado de: Ratjen, et al.,
2015).
A CFTR é essencial para controle do pH e equilíbrio hidro salino do fluido
superficial das células epiteliais, pela interação com um conjunto de outras proteínas, como
exemplo, o canal epitelial de sódio (ENaC, Na+). A má função ou ausência da CFTR leva a
não secreção de Cl- e HCO3-, um aumento na absorção de Na
+ e consequentemente a de água,
devido ao gradiente de concentração criado, determinando desidratação e acidificação do
líquido da superfície dos tecidos epiteliais (Tarran et al., 2001; Pezzulo et al., 2012; Veit, et
al., 2015; De Boeck & Davies, 2017).
As modificações no líquido superficial do epitélio desencadeada pelo mau
funcionamento ou ausência da CFTR geram diversas complicações nos tecidos epiteliais e
glândulas secretoras e prejudica funcionamento dos órgãos e sistemas envolvidos (Fig. 2). O
pulmão apresenta as piores complicações clínicas, sendo a maior causa de morte prematura na
FC. Destacam-se como principais complicações nas vias aéreas inferiores: sintomas
respiratórios agudos ou persistentes; tosse crônica e produção de escarro; muco hiperviscoso;
doença pulmonar obstrutiva; pneumonia recorrente ou infecção pulmonar; colonização
persistente com patógenos da FC, principalmente a Pseudomonas aeruginosa; baixo
32
desempenho nos testes de função pulmonar; anormalidades crônicas da radiografia de tórax
(bronquiectasia). Já nas vias aéreas superiores as complicações são: pólipos nasais e doença
nos sinus; doença sino-pulmonar supurativa crônica; pansinusite crônica (Gaspar, et al., 2013,
Amaral, 2015).
Figura 2. Esquema representativo do ciclo da doença na FC em células brônquicas. CFTR: Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator; ENaC: Canais epiteliais de sódio; Na+: Sódio; Cl
-: Cloreto
(Modificado de: De Boeck, et al., 2016).
O ambiente viscoso, seco e espesso no líquido da superfície epitelial dificulta ou
impede o transporte correto de substâncias secretadas por glândulas e excretadas pelos ductos,
como as enzimas pancreáticas, bile, saliva, suor, esperma, entre outras (Fig. 3). Essas
substâncias têm a suas composições alteradas ou ainda não são transportadas, levando a
complicações aos órgãos relacionados e desencadeando complicações sistêmicas. No trato
gastrointestinal podem causar: insuficiência pancreática com má absorção; desnutrição;
esteatorréia e fezes anormais; íleo meconial e obstrução intestinal; prolapso retal; doença
hepatobiliar; pancreatite recorrente; síndrome de obstrução intestinal distal. Já nas glândulas
sudoríparas ocorre elevada concentração de Cl- no suor e ausência de sudorese por estímulo ß-
adrenérgico. No sistema reprodutivo masculino ocorre ausência congênita bilateral e/ou
unilateral do canal deferente e azoospermia obstrutiva. Ainda, como alteração metabólica se
observa: hipoproteinemia; deficiência de vitaminas lipossolúveis; síndrome de depleção de
sal, com ou sem alcalose metabólica (Rosenstein & Cutting, 1998; Farrel, et al., 2008;
Ashlock & Olson, 2011; De Boeck, et al., 2011; Amaral, 2015).
33
Figura 3. Esquema representativo do ciclo de obstrução em glândulas na fibrose cística (FC). A. Tecido normal
e B. tecido FC. LSA: liquido superficial aerífero; HCO3-: Bicarbonato; Cl-: Cloreto; Na
+: Sódio (Modificado de:
Ratjen, et al., 2015).
1.3. Mutações no gene CFTR
Atualmente estão descritas mais de 2000 variantes no gene CFTR, e
aproximadamente 300 mutações com manifestação clinica da doença. A deleção do
aminoácido fenilalanina na posição 508, deste gene, gera a mutação mais frequente (F508del),
com uma prevalência de 90% em pelo menos um alelo (heterozigoto) nos pacientes FC dos
EUA e Europa e 60% de prevalência de homozigotos (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Veit,
et al., 2015; Mijnders, et al. 2017; De Boeck & Davies, 2017). No Brasil a prevalência de
heterozigotos e homozigotos para F508del é de 45% e 26%, respectivamente (REBRAFC,
2015) (Fig. 4).
Pela elevada quantidade de mutações no CFTR, foi atribuída uma classificação
funcional, para uma melhor estratégia de tratamento na FC, contendo sete diferentes classes
funcionais do CFTR. Na classe (I) estão as mutações (ex: Gly542X, Trp1282X) que
produzem um mRNA truncado, de “códon de paragem” (stop códon), não sendo possível a
tradução da proteína, e degradado pelo decaimento do mRNA mediado por nonsense (do
inglês: Nonsense-mediated mRNA decay – NMD). Para o foco de tratamento dessa classe de
mutações, é necessária resgatar a síntese de um mRNA completo, tendo como modelo de
34
mecanismo para fármacos os Read Through (lendo completamente), agentes que farão com
que o mRNA seja produzido por completo (Fig. 5) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting,
2015; Veit, et al., 2015; Bosch & De Boeck, 2016; Mijnders, et al. 2017; Boeck & Davies,
2017; Zainal Abidin, et al., 2017).
Figura 4. Modelagem molecular baseados em cristalografia da proteína CFTR indicando o local que ocorre a
mutação F508del. A. CFTR completo MSD1 (domínio de abrangência da membrana 1), azul; MSD2 (domínio
de abrangência da membrana 2), amarelo; NBD1 (domínio de ligação dos nucleotídeos 1), ciano; NBD2
(domínio de ligação dos nucleotídeos 2), laranja; Domínio R, verde; F508del, vermelho; B. Posição da F508 no
NBD1 (Modificado de: Molinski, et al., 2012).
A F508del é uma mutação de classe (II) e nesta classe ocorre o não enovelamento
correto da proteína, e assim é degradada no proteossoma. O foco de tratamento dessa classe
de mutações, é de corrigir o enovelamento da proteína ou enganar o “controle de qualidade”
celular, no reticulo endoplasmático (RE), para assim a proteína chegar até a membrana. Os
fármacos que podem ser utilizados para essa classe de mutação são os corretores, que
corrigem o enovelamento ou levam a proteína até a membrana plasmática, sem que essa seja
degradada (Fig. 5) (Clancy, et al,. 2012; Boyle et al., 2014; Wainwright et al., 2015; Amaral,
2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Mijnders, et al., 2017; Bosch & De
Boeck, 2016; De Boeck & Davies, 2017).
As mutações de classe (III) (Gly551Asp, Ser549Arg, Gly1349Asp), não
apresentam condutividade do canal, e as de classe (IV) (Arg117His, Arg334Trp, Ala455Glu),
possuem má condutância do canal, e ambas estão presente na membrana apical, mas não
funcionam corretamente. Os potenciadores da CFTR são um grupo de fármacos que corrigem
esse defeito, potencializando a abertura do canal e a condutância iônica normal (Fig. 5) (Char,
35
et al., 2014; Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Char, et al.,
2017; Mijnders, et al., 2017; De Boeck & Davies, 2017).
Na classe (V) estão contidas as mutações (Ala455Glu, 3272-26A → G, 3849+10
kg C→T) que geram uma CFTR normal, porém em menor número, com transporte iônico
reduzido. Isto ocorre devido ao Splicing alternativo, produzindo um mRNA anormal que não
é traduzido corretamente, e a proteína é degradada. Sendo assim, corrigir o Splicing é o alvo
de fármacos a serem produzidos, podendo utilizar a técnica de oligonucleotídeos anti-sense,
bem como corretores e/ou potenciadores, na tentativa de aumentar a expressão e função da
CFTR (Fig. 5) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Mijnders, et
al., 2017; De Boeck & Davies, 2017).
Figura 5. Esquema representativo da classificação funcional, para uma melhor estratégia de tratamento na
fibrose cística, de sete diferentes classes funcionais do CFTR. Comparação da célula com o CFTR normal,
expresso na membrana apical de células epiteliais e a sua condutividade de íons de cloreto (Cl-),
com as células
de CFTR mutado, resumindo o defeito, exemplo de mutações, terapia corretiva e fármaco (droga) utilizado
(Modificado de: De Boeck, et al., 2016).
Na classe (VI) (c. 120del23, rPhe508del) de mutações da CFTR está inserida a
F508del resgatada pelos corretores, pois após o resgate da proteína anormal, essa não
consegue permanecer ancorada na membrana plasmática, característica dessa classe, sendo
internalizada e degradada. Para corrigir esse defeito são necessários estabilizadores para
aumentar a permanência da proteína na membrana plasmática, inibindo sua internalização e
36
degradação (Fig. 5) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015;
Mijnders, et al., 2017; De Boeck & Davies, 2017).
Finalmente as mutações de classe (VII) (dele2,3(21kb), 1717-1G→A) são
caracterizadas por grandes deleções no gene CFTR e não produzem o mRNA, não ocorrendo
à produção da proteína. O alvo para o tratamento é a terapia gênica ou by-pass (canais
alternativos), pois não é possível resgatar um mRNA ou a proteína (Fig. 5) (Amaral, 2015;
Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Mijnders, et al., 2017; De Boeck &
Davies, 2017).
1.4. Técnicas para o diagnóstico na fibrose cística
A FC é uma doença multifatorial e multissistêmica, que apresenta diversos
desafios para o seu diagnóstico e prognóstico, sendo assim, mesmo com um quadro clínico
sugestivo, não é indicado diagnosticar um paciente apenas com a clínica, sendo necessária
uma ampla investigação e aplicação de testes diagnósticos. Recentemente muitos países
aderiram ao rastreio de recém-nascidos (teste do pezinho – New Born Screening – NBS),
inclusive o Brasil, desde 2009 (REBRAFC, 2015), pelo teste do tripsinogênio imunorreativo
(immunoreactive trypsinogen – IRT). No paciente FC a liberação de tripsinogênio no sangue é
elevada como resultado da obstrução causada por acúmulo de secreção nos ductos
pancreáticos. Entretanto, mesmo em lactentes com teste positivo de NBS, o diagnóstico de
FC, deve ser confirmado por outros testes, pois a presença de testes falso negativo/positivo
pode ocorrer (Athanazio, et al., 2017, 2016; De Boeck, et al., 2017; Faria, et al., 2017).
O teste do suor, desenvolvido em 1959, é o exame de diagnóstico padrão ouro até
hoje, o mais confiável, quando aplicado corretamente, e amplamente disponível para a FC no
mundo todo. Este teste analisa a concentração de eletrólitos no suor do paciente com o uso da
pilocarpina por iontoforese e deve ser realizada em pelo menos dois testes e em diferentes
tempos de coleta. As concentrações de cloreto no suor avaliadas distinguem os pacientes em
três grupos: para valores ≥ 60 mEq/L são considerados como FC clássico; valores de cloreto
entre 30 a 60 mEq/L os pacientes apresentam valores limítrofes, FC residual (mutações III,
VI, V) ou inconclusivos; e para valores ≤ 30 mEq/L os indivíduos são considerados sem FC.
Para indivíduos com valores limítrofes e superiores a 60, a avaliação das mutações no gene
CFTR é indicada (Gibson & Cooke, 1959; Athanazio, et al., 2017; De Boeck, et al., 2017;
Faria, et al., 2017).
37
A análise genética é uma ferramenta importante para o diagnóstico mais preciso
na FC, entretanto, ainda não é uma técnica muito acessível no Brasil. Contudo, as terapias de
precisão estão se tornando disponíveis e viáveis, e laboratórios de pesquisa em genética ou
laboratórios licenciados, terão que se adaptar para analisar os dados genéticos e identificar as
mutações de CFTR. O protocolo de análise de mutações de CFTR varia entre diferentes
grupos, no entanto, no geral, recomenda-se a análise de mutações por um painel padrão que
analisa as mutações mais comuns causadoras de doenças na população que está sendo
avaliada (cobrindo cerca de 80% a 85% das mutações na população). Quando duas mutações
de CFTR não são identificadas e o diagnóstico de FC é quase certo (concentração de cloreto
de suor acima de 60 mEq/L) ou altamente provável (quadro clínico sugestivo), o segundo
passo é o sequenciamento extensivo de todo o gene CFTR. No sequenciamento completo
podem não ser identificadas as mutações causadas por grandes deleções ou inserções, sendo
necessária, em alguns casos, a utilização de outros métodos de sequenciamento. Ainda assim,
a análise das mutações no CFTR não esclarece totalmente como a doença está manifestada no
paciente FC, pois o potencial patogênico de muitas mutações no CFTR ainda não está
elucidado (Athanazio, et al., 2017; De Boeck, et al., 2017; Faria, et al., 2017; National
Guideline Alliance (UK), 2017).
Outra ferramenta para o diagnóstico da FC é a medição de correntes no intestino
(Intesteinal Current Measurements – ICM), que analisa a função da CFTR, a partir de
medições de correntes de curto circuito de Cl- através do canal CFTR no intestino, pela
técnica de eletrofisiologia da Câmara de Ussing, em biopsias retais, de pacientes com um
quadro de FC inconclusivo. Capaz de classificar pacientes não-FC, FC clássico e FC com
função residual, a ICM apresenta elevada complexidade de execução, dificuldades de
interpretação dos resultados (Mall & Hirtz, 2004; Sousa, et al., 2012; Servidoni, et al., 2013).
Recentemente outra técnica foi desenvolvida para diagnóstico da FC pela
mensuração da taxa de suor β-adrenérgico, por um aparelho denominado evaporímetro. Neste
teste é aplicado um coquetel β-adrenérgico intradérmico no braço do paciente, que inclui
atropina para bloquear a função colinérgica dependente de CFTR. Do mesmo modo que a
técnica de ICM, a evaporimetria é uma técnica robusta com uma interpretação de resultados
complexa, caso não aplicada corretamente, o que dificulta a disseminação de seus resultados
como ferramenta de diagnóstico. A evaporimetria foi desenvolvida recentemente e necessita
de validação mais precisa, embora, tenha demonstrando grande eficácia em diferenciar
38
pacientes FC, não FC portadores de uma mutação de CFTR (wt / fc) e indivíduos não FC
(Quinton, et al., 2012; Kim, et al., 2016).
1.5. Fármacos moduladores da CFTR e testes in vitro para análise de eficácia
Há anos são utilizados fármacos para melhorar os sintomas da FC, como bronco
dilatador, antibióticos, enzimas digestivas, que aumentaram a qualidade e expectativa de vida
dos pacientes. Porém ainda não foi corrigido o defeito básico causador da FC, o transporte
alterado ou nulo de Cl- e HCO3- no epitélio dos pacientes com FC (Cohen-Cymberknoh, et
al., 2011). Nos últimos 10 anos, surgiram os fármacos para a correção do defeito básico da
FC, que atua a nível intracelular, modula e leva a CFTR até a membrana apical, ou caso esteja
inserido na membrana, fazendo com que ocorra a condutância iônica (Bell, et al., 2015;
Boeck & Davies, 2017).
A análise de vários compostos pela técnica de rastreio de alto rendimento (High
Throughput Screening - HTS) foi essencial para a descoberta dos fármacos moduladores da
CFTR (Galietta, et al., 2001; Pedemonte, et al., 2011; Pasyk, et al., 2012). Em 2005 foi
publicado um artigo descrevendo a análise positiva de pequenas moléculas que corrigiram a
função da CFTR em células de tireoide de rato (FRT) transfectadas com um CFTR normal
(wt/wt) e com o CFTR mutado (F508del/F508del) (Pedemonte, et al., 2005).
Além disso, em 2005 (Fulcher, et al.) foi padronizada a técnica de cultivo de
células epiteliais primárias brônquicas (HBE) de pacientes com FC isolados de pulmões
explantados, para análise da avaliação da função da CFTR e ação de fármacos moduladores
na CFTR. Em 2009 foi publicado pela primeira vez o resgate de função da CFTR pelo
fármaco potenciador VX-770 (Ivacaftor®, Kalydeco
®) em células HBE de pacientes FC com o
genótipo G551D/F508del (Van Goor, et al., 2009). O mesmo grupo em 2011 (Van Goor, et
al., 2011), mostraram que a utilização do fármaco VX-809 (Lumacaftor®) apresenta um
resgate de função da CFTR em células HBE de pacientes F508del/F508del.
Após a comprovação que essas pequenas moléculas, VX-770 e VX-809,
melhoram a função da CFTR, estudos clínicos foram realizados com o VX-770 e
comprovaram sua eficácia para a mutação G551D (Accurso, et al., 2010; Ramsey, et al.,
2011). Depois dessa comprovação, o VX-770, comercializado nas versões
Ivacaftor®/Kalydeco
® (VX-770), está hoje aprovado nos EUA e em alguns países europeus,
para utilização em um grupo de pacientes, acima de seis anos de idade, com as mutações de
39
classes III e IV (G551D, 1244E, G1349D, G178R, G551S, G970R, S1251N, S1255P, S549N,
S549R) (CADTH, 2015). Além disso, estudos na mutação R117H ou na mutação F508del
combinada com algumas das mutações citadas anteriormente estão sendo realizados (Char, et
al., 2014; Char, et al., 2017).
Outro fármaco, aprovado nos EUA e em alguns países europeus, para o uso na FC
foi o Lumacaftor® (VX-809), que após testes em células HBE F508del/F508del demonstrou
uma pequena recuperação de função da CFTR (Van Goor, et al., 2011; Awatade, et al., 2015).
Dessa forma, foi utilizada a associação de VX-809 e VX-770 (Orkambi®) em pacientes
homozigotos para a F508del e teve como desfecho uma melhora na função pulmonar, VEF1
(volume expiratório forçado no primeiro segundo da capacidade vital forçada), de 2% a 3%
(Wainwright, et al. 2015). O Orkambi®
também foi aprovado para uso de pacientes FC
homozigotos para a F508del, e alguns pacientes demonstraram um melhora significativa,
sendo essa resposta específica para cada indivíduo avaliada (Clancy, et al., 2012; Boyle et al.,
2014; Wainwright et al., 2015).
O Orkambi®
também foi associado à variabilidade da expressão fenotípica da
doença em outros órgãos afetados pela FC e, principalmente, na qualidade de vida
(Thomassen, et al., 2017; Graeber, et al., 2018). Esta combinação também está sendo
estudada em mutações menos frequentes no CFTR com o intuito de verificar sua viabilidade
na modulação positiva da CFTR (Bell, et al., 2015; Boeck & Davies, 2017).
Recentemente outro fármaco modulador da CFTR, VX-661 (Tezacaftor®
),
demostrou melhora fenotípica em pacientes com a mutação F508del, em homozigose ou
heterozigoze composta, superior ao VX-809, quando combinado ao VX-770, sendo finalizado
o estudo de fase três (Taylor-Cousar, et al., 2017; Rowe, et al., 2017). Outros fármacos estão
sendo produzidos e testados, individualmente ou combinados com os já aprovados, na
tentativa de encontrar melhoras nas funções da CFTR e nos fenótipos na FC (Harutyunyan, et
al., 2017; Oliver, et al., 2017; VRTX, 2018).
O cultivo e análise de células HBE foi o método de teste de fármacos in vitro para
a FC de maior viabilidade nos últimos anos. Recentemente, foi desenvolvida uma nova
técnica utilizando as biopsias retais para teste dos moduladores da CFTR – organoides
intestinais (Dekkers et al., 2013). A técnica isola criptas do epitélio intestinal (biópsia retal)
para a formação de mini intestinos, cultiváveis por muitas passagens, diferentemente das
células HBE, e são utilizados para a análise de função da CFTR pela técnica de indução do
inchaço por forscolina (Forskolin Induced Swelling - FIS). O FIS permite avaliar a ação dos
40
moduladores da CFTR em organoides intestinais de pacientes com FC (Dekkers et al., 2013;
Beekman, 2016; Noordhoek, et al., 2016; Boj, et al., 2017).
O método dos organoides intestinais é uma ótima técnica para análises
personalizadas de função da CFTR e avaliação da ação dos moduladores da CFTR.
Correlações positivas entre a eficácia dos moduladores da CFTR, avaliadas nos organoides
intestinas em diferentes genótipos do CFTR e comparadas pelo VEF1 apresentaram
correlações positivas, demonstrando ser uma técnica robusta para estudos farmacológicos na
FC. Dessa forma, o uso dos organoides intestinais viabiliza a aplicação da medicina
personalizada na FC pela seleção de tratamentos associados à função CFTR (Beekman, 2016;
Dekkers, et al., 2016; Noordhoek, et al., 2016).
As técnicas de cultivo de células HBE e organoides intestinais são
complementares, pois os tecidos estudados são oriundos de diferentes órgãos afetados na FC,
pulmão e intestino, e nesses órgãos, a expressão da CFTR é diferente (Kreda, et al., 2005;
Kreda & Gentzsch, 2011; Kreda, et al.,2012).
Os organoides intestinais supriram alguns dos problemas encontrado nas células
HBE, o de não poderem ser coletados rotineiramente, pois derivam de pulmões explantados, e
os organóides de biópsias retais. Outro diferencial é o da maior facilidade de coleta do
material biológico de pacientes com diferentes genótipos de CFTR, possibilitando um estudo
mais amplo de diferentes mutações (Sousa, et al., 2012; Dekkers et al., 2013; CFTR2, 2018).
No entanto, apesar da biópsia retal ser um exame de rotina hospitalar (colonoscopia), requer
especialização para realizar a coleta, que podem causar complicações para o paciente
(Servidoni, et al., 2013).
Apesar da importância do uso dos organoides intestinais, a células HBE ainda
apresentam relevância, pois são oriundas das vias aéreas, maior causa de morte prematura na
FC. Dessa forma, o estudo das vias aéreas e métodos de avaliação de função da CFTR nesse
tecido são necessários, e foram parcialmente supridos com a padronização do cultivo de
células epiteliais nasais (HNE) (Suprynowicz, et al., 2012; Pranke, et al., 2017).
A coleta das células HNE é acessível e de fácil realização através de um escovado
nasal simples, em ambas as narinas, e colocada em cultura para o crescimento. Está técnica de
coleta já era realizada há muitos anos, no entanto o baixo número de células era um desafio
para a viabilização dos estudos, então, recentemente foi desenvolvida a técnica de cultivo de
“células condicionalmente reprogramadas” (CRC). Está técnica tem as células HNE co-
cultivadas com fibroblastos de camundongo irradiadas, que são fontes de fatores de
41
crescimento para as células HNE, aumentando assim a taxa de crescimento, a aderência e
ainda mantém as características de diferenciação das células. Ainda é adicionado o inibidor da
Rho quinase (ROCK), que diminui a taxa de mortes celulares programadas (apoptose), assim
aumenta a proliferação celular (plasticidade) dessas células. Essa metodologia, da mesma
forma que as cédulas HBE, permite a quantificação do transporte de Cl- mediado pelo cAMP
como um marcador substituto da função da CFTR, e a análise dos moduladores da CFTR
(Suprynowicz, et al., 2012; Pranke, et al., 2017; McGarry, et al., 2017).
Com o cultivo das células HBE e HNE e a produção de organoides intestinais,
hoje estão sendo desenvolvidas técnicas do cultivo de organoides das vias aéreas, oriundos de
células bronquiais (Deslee, et al., 2007) e nasais (Brewington, et al., 2018). Uma diferença
notável da cultura dos organoides intestinais para os das vias aéreas é a camada ciliar presente
nessas células. Com isso, estão sendo produzidos dois tipos de organoides das vias aéreas, um
com a região apical voltada para dentro, cultivado em matrigel, como os organoides
intestinais, e outra voltada para fora, cultivada sem matrigel, sendo possível observar o
batimento ciliar nesses organoides (Fig. 6) (Cholon & Gentzsch, 2017).
Figura 6. Modelos de estudos para uma medicina personalizada na terapêutica FC. Tecidos coletados de
diferentes órgãos, afetados pela FC, dos pacientes que são usados para gerar culturas de células 2D e culturas
esferoides 3D ou analisados como tecido montado. Foram desenvolvidos protocolos para a geração de culturas
esferoides dos epitélios nasais, brônquicos e retais. As culturas 2D são estabelecidas para células humanas das
vias aéreas e os tecidos epiteliais intestinais humano (Modificado de: Cholon & Gentzsch, 2017).
O desenvolvimento de novas ferramentas de triagem capazes de prever a eficácia
da droga de forma individualizada justifica estudos in vitro da resposta a novas drogas para
essa doença, antes de seu uso, em razão do elevado custo e de possíveis efeitos colaterais
42
dessas substâncias. Ainda, a aplicação de uma medicina personalizada é necessária para
melhorar as estratégias de tratamento e identificar combinações farmacêuticas ótimas para
pacientes com FC com diferentes mutações no CFTR (Amaral & Balch, 2015; Amaral, 2015;
Beekman, 2016; Cholon & Gentzsch, 2017; Marson et al., 2017; Paranjape & Mogayzel,
2017).
1.6. Correção da secreção de íons de cloreto na fibrose cística por canais alternativos
A descoberta da existência de canais de cloreto alternativos nas células epiteliais
das vias aéreas foi feita pela estimulação de células in vitro, ou em epitélio nasal in vivo, com
agonistas de cálcio, por exemplo UTP (trifosfato de uridina) ou ATP. Este tratamento resulta
em uma grande estimulação do transporte de Cl- não dependente da CFTR, pois também
ocorrem em pacientes com FC. A partir dessa descoberta estudos focados nesses canais
alternativos de Cl- foram realizados. Estudos clínicos com o uso do aerossol de Denufosol,
fármaco análogo de UTP que induz a elevação do cálcio intracelular ao se ligar nos receptores
purinérgicos (P2Y2) localizados na membrana apical das células epiteliais. O Denufosol não
demonstrou melhora na função pulmonar ou reduziu as exacerbações em pacientes com FC
em testes clínicos de fase três. Os motivos da ineficácia desta droga não são claros, mas uma
possibilidade é a meia-vida curta da substância na superfície das vias aéreas. Porém esses
achados abriram portas de estudos nos canais alternativos de Cl- para suprir a deficiência da
secreção desse ânion pelas células epiteliais dos pacientes FC (Clunes & Boucher, 2008;
Ratjen, et al., 2012; Moss, et al., 2013; Mall & Gallieta, 2015).
Uma grande candidata para essa função são as TMEM16s (“Anoctamin”; ANO),
que constituem uma família de 10 proteínas transmembranares (ANO 1 a 10; ou TMEM16A à
TMEM16K, com exceção da I). A TMEM16A (ou ANO1) é um canal de cloreto ativado pelo
cálcio (CaCCs) que transporta, bidireccionalmente, Cl-, HCO3- e outros ânions através da
membrana apical do epitélio (Pedemonte & Galietta, 2014). A TMEM16F (ou ANO6) foi
descrita como um canal de cloreto de retificação externa (ORCC – Outwardly Rectifying
Chloride Channel), embaralhador de fosfolipídios dependente de cálcio (Ca2+
), CaCC e um
canal não seletivo para cátions (Kmit et al., 2013; Ousingsawat et al., 2015). As TMEM16
são compostas por dez hélices transmembranares, quatro subunidades alfa e as extremidades
NH2- (N-terminal) e COOH- (C-terminal) e o poro de condutância do Cl- é formado de
dímeros de proteínas (Brunner et al., 2014).
43
Fisiologicamente, a TMEM16A é ativada por estímulos que mobilizam Ca2+
intracelular através da ativação de agonistas purinérgicos (P2Y; P2X) pelo ATP. No epitélio
das vias aéreas, a ativação deste canal pode ser causada por estresse mecânico (por exemplo,
tosse) ou outros estímulos, que liberam ATP intracelular, levando à secreção de ânions
dependente de TMEM16A (Ousingsawat, et al., 2011; Mall & Gallieta, 2015; Benedetto, et
al., 2017; Li, et al., 2017). Curiosamente a atividade da TMEM16A aumenta sob condições
pró-inflamatórias (citocinas ou componentes bacterianos), que levam a hipersecreção de muco
(Caci, et al., 2015; Gorrieri., et al., 2016).
Estudos reportam que a CFTR e o TMEM16A são os dois principais canais de
ânions secretores no epitélio intestinal e das vias aéreas e, portanto, fornecem uma regulação
crítica da hidratação do muco nesses locais. A TMEM16A, no epitélio das vias aéreas, esta
mais abundantemente presente nas células caliciformes, que secretam muco, já a CFTR é
predominante em células ciliadas e ambos os tipos celulares compões as glândulas
submucosas dos brônquios (Fig. 7). Foram relatadas duas correlações distintas entre essas
duas proteínas, primeiro que a TMEM16A é inibida pela ativação da CFTR e segundo que
esses canais apresentam interação nas correntes de Cl- ativadas tanto pelo Ca
2+ quanto para o
cAMP. Ainda mais, a TMEM16A é necessária para a expressão adequada de CFTR na
membrana plasmática com a interação do domínio de ligação PDZ, proteína necessária para
ancoragem das proteínas na membrana celular (Ousingsawat, et al., 2011; Mall & Gallieta,
2015; Benedetto, et al., 2017; Li, et al., 2017).
A TMEM16A pode representar um alvo terapêutico alternativo para contornar a
disfunção da CFTR no epitélio das vias aéreas de pacientes com FC. A estimulação
farmacológica da TMEM16A pode ajudar a normalizar as propriedades do LSA (liquido
superficial aerífero) e do muco aumentando a secreção de cloreto e bicarbonato. Sendo assim,
a estimulação da TMEM16A pode ser usada como terapia adjuvante na FC, em combinação
com moduladores da CFTR. Essa terapia pode ser especialmente valiosa para os indivíduos
que apresentam mutações no CFTR de classe I ou VII, já que essas não respondem à terapia
de moduladores da CFTR (Fig. 8) (Li, et al., 2017).
Um membro da família de transportadores de ânions SLC26 (Solute Carrier
Family 26), o SLC26A9 (Member 9), recentemente foi identificado como um alvo promissor
para melhorar a disfunção causada no epitélio da FC. Ao contrário dos outros membros da
família SLC26, que funcionam como transportadores de Cl- e HCO3- e participam da
regulação do pH, o SLC26A9 funciona como um canal de Cl-
com mínima condutância de
44
HCO3-. Assim como o CFTR, o canal de Cl- SLC26A9 possui uma relação linear de corrente-
tensão (I-V) com uma baixa condutância de canal único, ao contrário da resposta transiente da
TMEM16A. Diferentemente da CFTR, que é regulada pela fosforilação dependente de cAMP,
e da TMEM16A, regulada pela concentração de Ca2+
livre intracelular, a SLC26A9, uma vez
inserida na membrana apical do epitélio, permanece ativa secretando continuamente Cl-. Esses
dados sugerem que a SLC26A9 é um alvo importante para a terapia da FC, independente de
mutação do CFTR (Avella, et al., 2011; Mall & Gallieta, 2015; Salomon, et al., 2016; Strug,
et al., 2016; Bertrand CA, et al., 2017; Li, et al., 2017).
Figura 7. Deficiência no transporte de íons epiteliais e a defesa prejudicada do hospedeiro nas vias aéreas de FC.
A. Vias aéreas não FC: a secreção coordenada de sal e água conduzida pelo CFTR em conjunto com os canais
alternativos de cloreto TMEM16A e SLC26A9 e a absorção pelo canal epitelial de sódio ENaC, resultam na
hidratação adequada da camada de liquido superficial aerífero (LSA) essencial para uma limpeza muco ciliar
efetiva. Além disso, a secreção de bicarbonato mediada pelo CFTR contribui para a regulação do pH. B. Vias
aéreas FC: o mau funcionamento da CFTR prejudica a secreção de Cl- / HCO3- levando a desidratação e acidez
do LSA e um muco hiperconcentrado. A desidratação da LSA é ainda agravada pelo aumento da absorção de
sódio / H2O mediada pelo ENaC. Como resultado, a limpeza muco ciliar e a morte bacteriana são prejudicadas,
tornando as vias aéreas FC vulneráveis para infecção e inflamação (Modificado de: Mall & Gallieta, 2015).
A estrutura molecular prevista da SLC26A9, que está em fase de cristalização
(Geertsma, et al., 2015), contém um sítio de ligação PDZ em sua cauda C-terminal, sendo
possível interagir com a CFTR, no caso de ambas as proteínas estarem presentes na mesma
célula. Consistente com esta ideia, a co-expressão da SLC26A9 com a CFTR normal (wt/wt)
em células aumentou a secreção de Cl-, enquanto a co-expressão da SLC26A9 com um FC
mutante F508del/F508del reduziu a função da SLC26A9 (Fig. 7) (Avella, et al., 2011; Strug,
et al., 2016; Bertrand CA, et al., 2017; Li, et al., 2017).
A SLC26A9 também surgiu como um alvo terapêutico promissor na tentativa de
melhorar a clínica de pacientes FC nas vias respiratórias, no trato gastrointestinal e no
pâncreas (Fig. 8). No entanto, o conhecimento atual do canal de Cl- SLC26A9 é limitado e é
45
necessária uma investigação considerável antes que este canal possa ser testado como alvo
terapêutico em pacientes FC e potencialmente outras doenças pulmonares obstrutivas crônicas
(Salomon, et al., 2016; Strug, et al., 2016; Bertrand CA, et al., 2017; Li, et al., 2017).
Figura 8. Estratégias farmacológicas em canais iónicos na fibrose cística. A. Dependendo dos mecanismos
moleculares subjacentes, o resgate farmacológico de função da CFTR mutante pode ser corrigido por
potenciadores, corretores e agentes de leitura. Estratégias para compensar o mau funcionamento da CFTR
incluem a ativação dos canais alternativos de cloreto B.TMEM16A e C. SLC26A9. Em princípio, esses alvos
alternativos poderiam ser ativados por moduladores de tráfico que aumentam o número de canais de cloreto e/ou
por ativadores que aumentam a probabilidade de abertura desses canais na membrana plasmática apical. D. Além
disso, a inibição da absorção de sódio/H2O mediada pelo ENaC, seja diminuindo a sua ativação proteolítica por
inibidores de protease ou por inibição direta do canal por bloqueadores de ENaC podem ser usadas como uma
estratégia para neutralizar a desidratação da superfície das vias aéreas FC (Modificado de: Mall & Gallieta,
2015).
1.7. Polimorfismos em genes modificadores da CFTR e/ou FC
Indivíduos que possuem o mesmo genótipo de CFTR apresentam fenótipos
distintos de FC, inclusive manifestações diferentes nos órgãos afetados. Alguns fatores
ambientais, heterogeneidade nas mutações e alguns genes modificadores ligados a FC
determinam, por exemplo, a gravidade em que a doença se desenvolve (Cutting, 2015;
Beekman, 2015; Strug, et al., 2016; Marson, et al., 2017).
Por essas razões, os tratamentos na FC passaram a ser baseados não apenas em
terapias que visam melhorar os sintomas, mas também, com moduladores da função do canal
CFTR. No entanto, as respostas aos fármacos moduladores de função da CFTR ainda
apresentam respostas variadas de um indivíduo para o outro, mesmo naqueles de mesmo
genótipo (Amaral, 2015; Bell et al., 2015; Cutting, 2015; Beekman, 2016; De Boeck &
46
Amaral, 2016; Marson et al., 2017). Além disso, o efeito desses fármacos em mutações raras
e órfãs da doença ainda permanece desconhecido (Beekman, 2016, Veit et al., 2016).
O potenciador VX-770 e o corretor VX-809, semelhante a outros moduladores da
CFTR, demonstram alta variabilidade de resultados para indivíduos de mesmo genótipo, razão
que ainda não está elucidada. Porém, alguns fatores podem nortear essas respostas: o
metabolismo das drogas em cada indivíduo, a gravidade da doença pulmonar no momento em
que o paciente iniciou o tratamento e o efeito dos genes modificadores (Clancy, et al. 2012;
Boyle et al., 2014; Wainwright et al., 2015; Beekman, 2016, Veit et al., 2016; Pranke, et al.,
2017).
Portanto, identificar fatores genéticos que expliquem tal variabilidade de
resultados é importante para o desenvolvimento de uma medicina personalizada, que
considere a variabilidade do organismo de cada indivíduo (Beekman, 2016, Veit et al., 2016).
Um polimorfismo de nucleotídeo único (Single Nucleotide Polimorphismo - SNP) intrônico
no gene SLC26A9, rs7512462, contribui para a alteração da gravidade da doença FC no
pâncreas e intestino. Trabalhos recentes argumentam que isso também ocorre nas vias aéreas
e a ação desse SNP sobre a função da CFTR pode ser verificada em células HBE e HNE,
contribuindo significativamente para o desenvolvimento da medicina personalizada (Strug, et
al., 2016; Salomon, et al., 2016 Bertrand, et al., 2017; Pereira, et al. 2017).
Recentemente foi demonstrado esse mesmo SNP, rs7512462, no gene SLC26A9
melhora a função da CFTR e a resposta ao VX-770 em células HBE de pacientes com a
mutação G551D/outra, e também, melhora a resposta do VX-809 em células HBE de
pacientes F508del/F508del. Este polimorfismo demonstrou melhoras no VEF1 em pacientes
que são tratados com o potenciador da CFTR, Ivacaftor® (Strug, et al., 2016).
Outro polimorfismo que demonstrou uma melhora em pacientes FC foi o
rs3788766 no gene SLC6A14 (Solute Carrier Family 6 Member 14), porém, este parece não
apresentar uma melhor na função da CFTR, mas em diminuir infecções bacterianas,
principalmente para a P. aeruginosa. No pulmão, o SLC6A14 pode regular a purificação de
proteínas e consequentemente reduzir os nutrientes para o crescimento bacteriano, com isso
este gene atua sobre a colonização/infecção, especialmente por P. aeruginosa, que está
associada ao declínio da função pulmonar e à redução da sobrevivência (Di Paola, et al.,2017;
Pereira, et al., 2017). Esta associação foi demonstrada em células HBE, que na expressão
funcional do SLC6A14 diminuiu a colonização, em estágios iniciais, das vias aéreas por P.
aeruginosa. Esta proteína transporta um metabólito (L-arginina) promotor de anexos
47
essenciais para as bactérias aderirem no LSA do hospedeiro, sendo assim, o SLC6A14 pode
modificar a doença pulmonar na FC (Fig. 9) (Di Paola, et al.,2017).
Figura 9. Transporte de L-arginina do líquido superficial aéreo (LSA) pela SLC6A14 contribui para a defesa do
hospedeiro, reduzindo a ligação da P. aeruginosa (PA) à membrana apical das células epiteliais das vias aéreas.
O transportador de aminoácidos SLC6A14 (caixa roxa sólida) medeia à absorção de L-arginina em células
epiteliais ciliadas no pulmão. Quando a SLC6A14 é disfuncional (caixa roxa tracejada) devido à variação
genética (por exemplo, polimorfismos), a L-arginina é acumulada no LSA e aumenta a fixação da P. aeruginosa
na superfície das células epiteliais (Modificado de: Di Paola, et al.,2017).
48
2. Objetivo Geral
Avaliar as funções da CFTR e de canais de cloreto alternativos em células
primarias epiteliais brônquicas e nasais oriundas de pacientes FC e não FC do estado de São
Paulo.
2.1. Objetivos Específicos
Padronizar as técnicas de cultivo de células primárias epiteliais brônquicas e nasais
humanas no Laboratório de Fibrose Cística (LAFIC);
Avaliar a ação dos fármacos, corretor VX-809 e potenciador VX-770, na modulação
da CFTR em células HBE e HNE de pacientes com fibrose cística (FC);
Analisar a função da CFTR e a respostas aos fármacos VX-809 e VX-770 em células
HNE de pacientes FC F508del / F508del com polimorfismos em genes moduladores da CFTR
e / ou fenótipo da FC, rs7512462 (SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14);
Analisar a função da TMEM16A em células HBE e HNE de pacientes com e sem
fibrose cística (FC).
49
3. Métodos
3.1. Aspectos Éticos
Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética da FCM – Unicamp através da
plataforma Brasil, CAAE: 42458415.8.0000.5404 e número do parecer: 1.041.317. Os
materiais biológicos utilizados durante este estudo foram coletados mediante assinatura do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) dos indivíduos participantes ou de seus
responsáveis legais.
3.2. Estudo em Células Primárias do Epitélio Brônquico Humano (HBE)
3.2.1. Pacientes com fibrose cística atendidos pelo Serviço de Transplante Pulmonar do
Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.
Foram convidados a participar deste trabalho indivíduos maiores de 14 anos, com
diagnóstico de FC e atendidos pelo Serviço de Transplante Pulmonar do Hospital das Clínicas
da Universidade de São Paulo, São Paulo/SP, coordenado pelo Prof. Paulo Manuel Pêgo
Fernandes, que foram submetidos a transplante de pulmão. Os pacientes que aceitaram
participar deste estudo doaram um lóbulo pulmonar, os quais foram colhidos após o
procedimento de transplante pulmonar de rotina. Estes fragmentos foram transportados em
condições adequadas, em solução tampão de fosfato salino (PBS) a 4º C, até a Universidade
do Estadual de Campinas – Unicamp, SP. No LAFIC foi aplicado o protocolo de isolamento
das células epiteliais brônquicas para estabelecimento de culturas celulares HBE.
As células epiteliais traqueais controle foram obtidas por meio de consentimento
da família do doador do pulmão saudável, a qual permitiu o uso de fragmentos traqueais
originados durante o procedimento de transplante deste órgão, devido à necessidade de
adequação de seu tamanho à caixa torácica do paciente receptor. Os fragmentos de traqueia
foram colhidos durante procedimentos de transplantes realizados no Hospital das Clínicas da
Universidade de São Paulo.
Também foi coletado um lóbulo pulmonar retirado de um paciente com discinesia
ciliar e doado para estudo, com o consentimento dos responsáveis. O lóbulo foi
cirurgicamente retirado no Centro Cirúrgico do Hospital de Clínicas da Unicamp.
50
3.2.2. Padronização do cultivo de células primárias epiteliais brônquicas humanas
(HBE)
As células HBE foram isoladas dos brônquios dissecados de pulmões
transplantados advindos do Instituto do Coração/ Hospital das Clínicas da USP e do Hospital
de Clínicas da Unicamp, seguindo a metodologia descrita por Fulcher et al. (2009). O lóbulo
pulmonar (Fig. 10A) foi dissecado, retirando as estruturas aderentes proximais e distais das
vias aéreas, com ajuda de pinças, tesouras e bisturis cirúrgicos estéreis até os brônquios
ficarem “limpos” (Fig. 10B). Os brônquios foram cortados em pequenos pedaços de 5-10 cm,
lavados e limpos com PBS, para retirar o máximo de muco possível, colocados em um tubo
de 50ml (Sarstedt - PPGWB) e foram lavados três vezes com o meio, pré-preparado, “Wash
Media” (Joklik’s MEM - Sigma-Aldrich/M8028; L-glutamine - Sigma-Aldrich/G7513;
Gentamicin - Sigma-Aldrich/G1397; Penicillin-Streptomycin - Sigma-Aldrich/P4333) mais o
coquetel de antibióticos ACTV (Anfotericina B: 1mg – Sigma-Aldrich / A2942; Ceftazidina:
139mg – Sigma-Aldrich / CDS020667; Tobramicina: 80mg – Sigma-Aldrich / T4014; e
Vancomicina: 100mg – Sigma-Aldrich / V2002). Após as lavagens, foram adicionados 30ml
Soak solution (Wash Media + DL-Dithiothreitol (DTT) - Sigma-Aldrich/D0632;
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) - Sigma-Aldrich/DN25) no tubo contendo
os brônquios e agitados, sob uma placa de agitação (Dragon Lab – SK-R1807-E), por 18 –
24hs a 4ºC. Após esse período, foi adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS - Sigma-
Aldrich/F6178), para inibir a ação enzimática, e o conteúdo do tubo foi colocado em placas de
Petri de 155-mm, para realizar a retirada das células HBE dos brônquios. Com auxílio de
bisturis e pinças cirúrgicas estéreis, os brônquios foram raspados, gentilmente do lado luminal
do tecido, para retirar as células epiteliais. Após a máxima retirada de células dos brônquios, o
meio com as células foi coletado das placas e colocado em novos tubos de 50 ml, que foram
centrifugados a 500g por 5min a 4ºC. Então o sobrenadante foi descartado e é possível ver
duas colorações no precipitado, uma branca, contendo as células HBE, e outra vermelha
contendo células sanguíneas (hemácias), com isso, as HBE foram ressuspendidas em 3 ml de
“tampão de lise de sangue vermelho” (Sigma-Aldrich - R7757), incubadas por 10 min a 4º C,
adicionado 10 ml de PBS, e centrifugado novamente a 500g por 5min a 4ºC. Caso o
precipitado ainda tivesse cor avermelhada, o procedimento foi repetido até obter um
precipitado “limpo” (branco). Com o precipitado branco, as células HBE foram
ressuspendidas em Declump Solution (DPBS; Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) -
51
Sigma-Aldrich/EDS; DL-Dithiothreitol (DTT) – Sigma-Aldrich/D0632; Colagenase de
Clostridium histolyticum - Sigma-Aldrich/C2674; Desoxirribonuclease I de pâncreas bovino
(Dnase) - Sigma-Aldrich/DN25) e incubadas por 30 minutos a 37ºC. Após a incubação foi
adicionado 10% de FBS e novamente centrifugadas a 500g por 5min a 4ºC. O sobrenadante
foi descartado e o precipitado ressuspendido em meio de cultura de crescimento epitelial
brônquico (do inglês: Bronchial Epithelial Growth Media – BEGM) (Tabela 1). As células
HBE foram contadas em câmera de NeuBauer (PROLAB /K5-0111) e plaqueadas em uma
taxa de 2-6*106 por placa de petri de 100mm (Corning Costar – 430167) (Fig. 10C) já com o
um pré-revestimento de um dia, utilizando solução de revestimento de fibronectina e colágeno
(100mL LHC – Gibco/12677; 10mL Bovine serum albumin - Sigma-Aldrich/A9647; 1mL
Collagen from rat tail tendon – Roche/11179179001; 1mL Human Fibronectin - BD
Biosciences/354008).
Figura 10. Células Primárias Humanas Epiteliais Brônquicas – HBE. A. Lóbulo pulmonar B. Arvore brônquica
após a remoção das partes aderentes (limpo) C. Células primárias epiteliais brônquicas em placas p-100
(Aumento de 20 vezes). D. Células epiteliais brônquicas com 100% de confluência em filtros de membrana
porosa de poliéster Corning® Costar® Snapwell (Aumento de 10 vezes).
As células HBE foram cultivadas em BEGM mais o coquetel de antibióticos
ACTV por cinco dias, e após esse período foi retirado o ACTV do meio e cultivado até
atingirem 70 a 90% de confluência, trocando o meio em dias alternados. Após a confluência
desejada as células foram tripsinizadas (EDTA 10x – Sigma-Aldrich/59418C) e transferidas
para filtros de membranas porosas de poliéster Corning®
Costar®
Snapwell (Sigma-Aldrich /
CLS3801) previamente tratadas com colágeno IV (Sigma-Aldrich / C7521), em meio para
diferenciação e polarização das células em interface ar-líquido (do inglês: Air Liquid Interface
52
– ALI) (Fig. 10D, Tabela 1). Finalmente as células foram cultivas por ~21 dias, e as
medições da resistência elétrica transepitelial (TEER) foram realizadas uma vez por semana,
com eletrodos chopsticki do aparelho o Milicell® ERS-2 (Fig. 11), e ao atingir uma resistência
transepitelial mínima de 600 Ω/cm2, esta monocamada de células HBE foram incubadas por
48hs com 3µM VX809 (Selleckchem / S1565) ou 0,05% de DMSO (Sigma-Aldrich / D2650)
e realizou-se o estudo eletrofisiológico deste material em Câmaras de Ussing.
Tabela 1. Listas de materiais utilizados na preparação dos meios de cultura de crescimento epitelial brônquico
(do inglês: Bronchial Epithelial Growth Media – BEGM) e meio para diferenciação e polarização das células em
interface ar-líquido (do inglês: Air Liquid Interface – ALI).
BEGM CHECKLIST ALI CHECKLIST
Quantidade para 1L Quantidade para 1L
LHC (Gibco 12677) LHC + DMEM (Sigma D6429) (50:50)
Aditivo Quantidade Aditivo Quantidade
Insulina 1,05mL Insulina 1,05mL
Transferina 1,05mL Transferina 1,05mL
Hidrocortisona 1,05mL Hidrocortisona 1,05mL
Triiodotironina 1,05mL Triiodotironina 1,05mL
Epinefrina 1,05mL Epinefrina 1,05mL
EGF 1mL EGF 20µL
Ácido retinóico 1,05mL Ácido retinóico 1,05mL
Fosforyletanolamina 1,05mL Fosforyletanolamina 1,05mL
Etanolamina 1,05mL Etanolamina 1,05mL
Stock 11 1,05mL Stock 11 1,05mL
Pen/Strep 1,05mL Pen/Strep 1,05mL
Gentamicina 1,05mL BPE 714µL
Anfotericina B 1,05mL BSA 3,4mL
BPE 714µL Elementos mínimos 1mL
BSA 3,4mL Stock 4 1mL
Elementos mínimos 1mL
Stock 4 1mL
Figura 11. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) em células primárias epiteliais nasais e
brônquicas humanas. A. Ilustração representativa da inserção do eletrodo chopstick nos filtros de membrana
porosa para a realização das medições TEER. B. Aparelho Milicell® ERS-2, eletrodo chopstick e placa de 6
poços contendo os filtros de membrana porosa de poliéster Corning® Costar
® Snapwell (Modificado de: Ebrary,
2018).
53
3.3. Estudo em Células Primárias do Epitélio Nasal Humano (HNE)
3.3.1. Pacientes diagnosticados com FC atendidos pelo ambulatório de fibrose cística do
departamento de pediatria do hospital de clínicas da Unicamp
Foram convidados a participar deste estudo indivíduos maiores de cinco anos de
idade, diagnosticados com FC e encaminhados ao Ambulatório de Fibrose Cística do
Departamento de Pediatria da Unicamp, coordenado pelo médico Prof. Dr. Antônio Fernando
Ribeiro. Indivíduos não FC, para o grupo controle, foram convidados para participar do
estudo após a confirmação de não terem FC por exames de diagnóstico, teste do suor e
evaporimetria, no Centro de Investigação Pediátrica (CIPED).
3.3.2. Padronização da técnica de cultivo das células HNE
Foram coletadas células HNE de 38 pacientes com uma micro escova interdental
(Interdental brush / 10028353), inserindo-a em ambas as narinas dos pacientes, após lavagem
com solução salina (NaCl – 0,9% – Samtec/L:SES), no Ambulatório de Pediatria do Hospital
de Clinicas – Unicamp, por um profissional qualificado. Após a coleta, a escova foi
transferida para tubos de 2 ml (Costar-3213) contendo uma ponteira de 200 µL (Exacta
Cruz/SC-222441) adaptada, para realizar a retirada das células das cerdas da escova, em meio
de cultura DMEM-F12 (Sigma-Aldrich/D9785) com 1% de L-Glutamina (Sigma-
Aldrich/G7513), 1% de penicilina e estreptomicina (Sigma-Aldrich/P4333), 10% de soro de
bezerro recém-nascido (NBCS – Sigma-Aldrich/N4637), 0,4% de anfotericina B (Sigma-
Aldrich/A2942), tobramicina 0,16µg/ml (Sigma-Aldrich/T4014) e vancomicina 0,1µg/ml
(Sigma-Aldrich/V2002).
O tubo contendo as células foi transportado à temperatura ambiente até o
Laboratório de Fibrose Cística (LAFIC), e foi centrifugado (Eppendrof 5804 R) a 500g, por 5
minutos à 4ºC, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspendido no meio DMEM-F12
novamente. Na sequência foi realizada a contagem das células utilizando a câmara de
Neubauer e após a contagem as células HNE foram cultivadas utilizando a técnica de cultura
de Células Reprogramadas Condicionalmente (CRC) (Suprynowicz, et al., 2012).
Para a realização da cultura das HNE-CRC, primeiro cultivou-se, por uma
semana, fibroblastos de linhagem de camundongo (NIH 3T3) em frascos T25 (Sarstedt / D-
54
51588) utilizando o meio de cultura DMEM-F12 aditivado com 1% de L-Glutamina, 1% de
pen/strep, e 10% de NBCS, trocados em dias alternados. O cultivo foi feito até a confluência
total (100% – ~1 semana), e os fibroblastos foram irradiados a 60 greys em um irradiador
localizado no Laboratório de Banco de Sangue do Hospital de Clínicas da Unicamp. Com os
fibroblastos prontos, pré-irradiados com 24h de antecedência, as HNE foram semeadas nas
garrafas de cultura T25 sobre os fibroblastos, para assim realizar a co-cultura. Nos primeiros
sete dias de cultura foram utilizados no meio DMEM-F12, além dos aditivos padrões listados
acima, foi adicionado o inibidor da Rho quinase (Sigma-Aldrich/Y0503) (10µM) e o coquetel
de antibióticos ATV (Anfotericina B 0,4%, Tobramicina 0,16µg/ml e Vancomicina
0,1µg/ml). Após esse período os antibióticos foram retirados do meio, e as células HNE foram
cultivadas até uma confluência de 80-90%, trocando os meios em dias alternados.
Após a confluência desejada ter sido atingida, foi realizada a tripsinização
diferenciada para separar as células nasais dos fibroblastos. Assim, retirou-se o meio de
cultura, lavaram-se as células com PBS (Sigma-Aldrich/372595) e foram colocados 3 ml de
tripsina EDTA 1X (Sigma-Aldrich/T2600000) na garrafa T25 e incubadas por 90 segundos à
37ºC, após esse tempo as células foram analisadas no microscópio invertido (OPTIKA-XDS-
3LT) para averiguar se os fibroblastos descolaram. Ao descolarem todos os fibroblastos,
descartamos e acrescentamos a tripsina EDTA 10X e incubamos, novamente, por 5 minutos à
37ºC. Adicionou-se 10 ml de meio de cultura para inibir a ação da tripsina e o conteúdo foi
transferido para um tubo de 15 ml (Sarstedt - PPGWB) e centrifugou-se por cinco minutos a
1800rpm a 4ºC. Descartou-se o sobrenadante e o precipitado foi ressuspendido com o meio de
cultura e as células foram contadas novamente (Fig. 12).
Depois da contagem, as células CRC-HNE foram transferidas para filtros de
membrana porosa de poliéster Corning® Costar
® Snapwell, a uma taxa de 3*10
5 células por
filtro, previamente tratadas com colágeno IV e mantidas em meio de cultura ALI (Tabela 1)
onde se diferenciaram e formaram um epitélio nasal polarizado com seu fenótipo diferenciado
original, incluindo células ciliadas e células secretoras de muco (Liu et al., 2012;
Suprynowicz et al., 2012). Finalmente foi aplicado o mesmo protocolo das células HBE em
cultura ALI, e após uma TEER de 1000Ω/cm2 as células CRC-HNE foram incubadas com 3
µM de VX-809 ou 0,05% de DMSO por 48hs e analisadas posteriormente em Câmara de
Ussing.
55
Figura 12. Imagens em objetiva 10X da co-cultura das células primárias epiteliais nasais com os fibroblastos
NIH/3T3. Tripsinização diferenciada das células HNE e dos fibroblastos: A. Células HNE mais os fibroblastos
em co-cultura e B. após a adição da tripsina EDTA (1X) por 90s à 37ºC, os fibroblastos foram descolados,
restando apenas células HNE aderidas aos frascos T25.
3.3.3. Análise dos polimorfismos SNP rs7512462 no gene SLC26A9 e rs3788766 no gene
SLC6A14
Foram coletadas alíquotas de sangues dos pacientes homozigotos para a F508del,
extraídos o DNA e analisados via PCR em tempo real, para avaliação do SNP rs7512462 do
gene SLC26A9 e rs3788766 no gene SLC6A14 como descrito anteriormente (Pereira, et al.,
2017).
3.4. Câmara de Ussing
3.4.1. Princípios gerais sobre a Câmara Ussing
A câmara de Ussing consiste em duas metades funcionais. Uma delas é a própria câmara
e a outra é o circuito elétrico. Uma infinidade de variações técnicas para ambas as subunidades tem
sido desenvolvida. Câmaras estão disponíveis em diferentes formas e tamanhos, enquanto o circuito
eletrônico permite não apenas a medição de resistência, corrente e voltagem, mas também os
parâmetros de impedância e capacitância (HUG, 2002).
Atualmente, todos os tipos de tecidos epiteliais e membranas celulares polarizadas têm
sido estudados com a câmara de Ussing. Duas abordagens tornaram isso possível: (i) concepção de
microcâmaras permitindo o estudo de até mesmo os menores fragmentos de tecido, que exigem
significativas técnicas de microcirurgia, para serem obtidos e (ii) a utilização de células cultivadas em
filtros de suporte membranoso permeável, que transformou a Câmara de Ussing amplamente utilizada
e bem-sucedida (HUG, 2002).
56
3.4.2. Tipos de Câmaras de Ussing
Atualmente existem dois tipos de câmaras de Ussing: câmara de circulação e a de
perfusão contínua. Enquanto o primeiro tem sido adotado pela maioria dos laboratórios por sua
simplicidade, o outro oferece várias vantagens distintas. Neste trabalho foi utilizada a câmara de
Ussing de perfusão contínua micro modificada.
3.4.3. A Câmara de perfusão continua
As duas metades das câmaras, feitas de teflon (Fig. 13) são projetadas para minimizar a
pressão hidrostática e, portanto, evitar danos graves ao tecido durante a perfusão. O banho de soluções
dos dois lados do tecido é entregue para a câmara de Ussing dos reservatórios montados 20-50 cm
acima da câmara através de tubos de polietileno para o interior da câmara, usando válvulas para
regular a vazão. A temperatura é regulada por meio de um sistema de aquecimento de água com tubos
de peças T, que cercam os tubos finos de polietileno com as soluções dos reservatórios. As
extremidades do tubo externo são seladas com tampas de borracha (Fig. 14) (HUG, 2002).
Figura 13. Câmara de Ussing de perfusão contínua micro modificada.
Para a utilização de amostras de tecido muito pequena, tais como as biopsias retais, um
pequeno disco circular mantém o tecido inserido (diâmetro <1 mm) entre as duas metades da câmara,
após tudo ser montado. O mesmo é realizado para as células polarizadas, entretanto o disco removível
é adaptado para acoplar as membranas de filtro porosas de poliéster contendo as células polarizadas
(Corning® Costar
® Snapwell). Ao olhar para as Câmaras de Ussing, podem ser observados pequenos
buracos perfurados ao redor da câmara. Estes furos permitem a inserção de quatro eletrodos (eletrodos
de Agar e eletrodos de Prata (Ag) / Cloreto de Prata – AgCl) e tubos para a entrada e saída de
soluções, em ambas as metades da câmara.
Entrada de Fluxo
Disco Removível
Eletrodos de Agar
Base aquecida
Saída de Fluxo
Parte da Câmara
Ag/AgCl Eletrodos
57
Figura 14. Duas Microcâmaras de Ussing com sistema de perfusão contínua comum, montadas em gaiola de
Faraday.
3.4.4. Medições transepiteliais em circuito aberto
3.4.4.1. Voltagem Transepitelial
Tecidos e células epiteliais transportam íons e, portanto, geram uma voltagem
transepitelial. Esta voltagem tem sido denominada como "potencial de transporte ativo". Um pré-
requisito para a geração do potencial de transporte é a distribuição assimétrica dos canais de íons nas
membranas apicais e basolaterais das células epiteliais polarizadas. O movimento líquido de cargas
positivas da região apical para a região basolateral gera uma voltagem que é igual à diferença da
voltagem entre as duas membranas (HUG, 2002).
3.4.4.2. Resistência transepitelial
O epitélio apresenta duas características que os distinguem de todos os outros
tecidos: polaridade e estancamento (do inglês tightness). A polaridade é gerada pela
distribuição assimétrica de proteínas, tanto nas membranas apicais como nas membranas
basolaterais. Um conjunto de proteínas chamadas "tight junctions" separa as duas membranas.
A formação e a permeabilidade das "tight junctions" determina a resistência e a integridade do
58
tecido. Voltagens podem ser relatadas pela resistência elétrica. Tanto o tratamento inadequado
do tecido como o design inadequado da câmara irá influenciar significativamente a resistência
transepitelial, eventualmente tornando impossíveis medições elétricas (HUG, 2002).
3.4.4.3. Circuito Aberto (Fig. 15)
Foram injetados pulsos curtos de corrente (0,5 µA - duração de 1s, período de 5s)
nas câmaras, através de um gerador de pulsos. A corrente passa através do tecido e cria um
desvio de voltagem breve, deixando a célula intacta na maior parte do tempo durante a
medição. O sinal medido é uma corrente internamente "traduzida" em uma voltagem pelo
gerador de pulsos, que é continuamente monitorado e gravado por um sistema de aquisição de
dados (Power Lab). Sob essas condições, quando Rte (resistência transepitelial) e Vte
(voltagem transepitelial) são conhecidos, a Isc (Corrente de Curto-Circuito) também pode ser
calculada a partir da Lei de Ohm: Isc = Vte / Rte.
Figura 15. Circuito elétrico na Câmara de Ussing em condições de circuito-aberto.
3.5. Protocolos para a avaliação da função da CFTR e TMEM16A em células HBE e
HNE em Câmara de Ussing
Para o protocolo do estudo de função do CFTR na Câmara de Ussing são usados
diversos compostos para a ativação ou inibição de canais iônicos, esses são dissolvidos em
solução tampão de Ringer (em mM: NaCl 145; KH2PO4 0,4; K2HPO4.3H2O 1,6; Glucose 5;
MgCl2.6H2O; Ca-Gluconat.1H2O 1,3) que foi complementado com a Indometacina (10 mM),
59
para bloquear a atividade de secreção basal de Cl- dependente de cAMP e o pH foi ajustado
para 7,4. As concentrações de Cl- apical e basal foram mantidas equivalentes. Após um
período de equilíbrio de 20 min, a amilorida (20μM) foi adicionada ao lado luminal para
bloquear o fluxo de Na+ mediado pelo ENaC, então o agonista de cAMP, forscolina (2 µM
FSK), potenciador VX-770 (10μM), e inibidor específico do canal CFTR (CFTInh172 –
30μM) foram adicionados sequencialmente (Moniz et al., 2013; Awatade et al., 2015)
(Protocolo 1). Ao término de cada protocolo do CFTR, foi adicionado o ATP (100µM) para
análise de Isc-eq geradas pelo ativo. Na tentativa de elucidar essa resposta, foi adicionado em
conjunto com o ATP o inibidor de CaCCs, específico para as TMEM16s, CaCCinh-AO1
(40µM) (Cabrita, et al., 2017; Benedetto, et al., 2017) (Protocolo 2).
Os sais e compostos utilizados foram obtidos da Sigma-Aldrich, exceto o VX-809
e VX-770 que foram adquiridos na SelleckChem.
Protocolo 1 – CFTR: Protocolo de análise da secreção de Cl- dependente da CFTR. Na região apical
das células foram adicionados os seguintes compostos dissolvidos em solução tampão de ringer mais
indometacina (Indo – 10µM), sempre em adição ao anterior: Amilorida (Amil – 20µM), inibidor do
ENaC; ativação da CFTR pela forscolina (FSK – 2µM); o potenciador da CFTR VX-770 (10µM); e o
inibidor específico da CFTR 172 (CFTRinh 172 – 10µM). Na região basolateral das células CRC-HNE
foram constantemente perfundido por ringer mais Indo.
Região apical das células HNE
Ringer + Indo
Amil (20µM)
Forscolina (2 µM)
VX-770 (10 µM)
CFTRinh172 (10 µM)
Disco de inserto com as células HNE
Ringer + Indo
Região basolateral das células HNE
Protocolo 2 – TMEM16A: Protocolo de função da TMEM16A pela determinação da secreção de
Cl- após a aplicação do protocolo da CFTR. Após a aplicação do protocolo de ativação da CFTR, as
células CRC-HNE foram lavadas por 20 min e foram adicionados os seguintes compostos
dissolvidos em solução tampão de ringer mais indometacina (Indo – 10µM): o ATP (100µM);
lavadas por 20 min; TMEM16A será inibida pelo CaCCinh-AO1 (AO1 - 20µM); ativada pelo ATP
(100µM); novamente a lavagem por 20 min; e finalmente a ativação da TMEM16A pelo ATP
(100µM) “sozinho”. Na região basolateral das células HNE foram constantemente perfundido por
ringer mais Indo.
Região apical das células HNE
Ringer + Indo
Amil (20µM)
Protocolo
da CFTR
20
min ATP (100 µM)
20
min AO1 (20 µM)
20
min ATP (100 µM)
ATP (100 µM)
Disco de inserto com as células HNE
Ringer + Indo
Região basolateral das células HNE
60
3.6. Análise estatística
Os resultados foram expressos em: 1) Delta da média aritmética das Isc-eq de cada
composto (ΔIsc-eq); 2) Erro padrão da média (SEM), dado pelo desvio padrão dos ΔIsc-eq dos
compostos referidos dividido pela raiz quadrada do número de experimentos.
O teste estatístico teste T de Student foi aplicado, unicaudal para calcular amostras
de uma mesma população de dados emparelhadas e bicaudal para calcular diferenças
significativas entre duas populações de dados emparelhadas, com um intervalo de confiança
de 95% e uma significância a partir de valor p <0,05.
61
4. Resultados
4.1. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em
células HBE de pacientes FC
Foram isoladas células HBE de lóbulos pulmonares de 11 pacientes FC, de um
paciente não FC e de uma traqueia de um paciente não FC transplantados no INCOR em São
Paulo e no HC da Unicamp. Dos 12 lóbulos, cinco tiveram células HBE extraídas e analisadas
com sucesso. Dentre os sete pulmões não avaliados neste estudo, dois (Pul2 e Pul10) tiveram
suas células lisadas durante o protocolo de isolamento das células HBE, em outros dois as
culturas apresentaram contaminação persistentes por fungos e bactérias (Pul1 e Pul6), um não
foi utilizado por apresentar insuficiência de células (Pul7) e finalmente, em outros dois
lóbulos as células não aderiram nas placas de cultura (Pul8 e Pul9). As células epiteliais
traqueais do paciente não FC foram também extraídas e analisadas com sucesso (Tabela 2).
Tabela 2. Dados do isolamento das células primárias epiteliais brônquicas de lóbulos pulmonares explantados no
INCOR e no HC da Unicamp.
Pulmões Data Situação Motivo Crio preservado
Pul1 Set / 2015 Descartado Contaminação Não
Pul2 Nov / 2015 Descartado Células Lisadas Não
Pul3 Dez / 2015 Analisado — Sim
Pul4 Dez / 2015 Analisado — Sim
Pul5 Fev / 2016 Analisado — Sim
Pul6 Abr / 2016 Descartado Contaminação Não
Pul7 Jun / 2016 Descartado Poucas Células Não
Pul8 Set / 2016 Descartado Não adesão em placas Não
Pul9 Nov / 2016 Descartado Não adesão em placas Não
Pul10
Pul 11
Dez / 2016
Fev/2017
Descartado
Analisado
Células Lisadas
—
Não
Sim
Pul 12 Ago/2017 Analisado — Sim
Traq 4 Dez / 2015 Analisado — Sim
As células HBE dos pulmões FC analisados, Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11 tiveram o
gene CFTR sequenciado pela técnica de sequenciamento de nova geração (NGS – New
Generation Sequencing) com painel da Illumina, e foram encontrados os seguintes genótipos
de mutações: Pul3 ? / ?; Pul4 c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?; Pul5 F508del /
c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs); e Pul11 F508del / ?. Os pontos de interrogação (?)
significam que não foi encontrada uma mutação no gene CFTR, porém não indica que não
seja FC, e outras análises genéticas devem ser feitas para encontrar a mutação de CFTR
desses pacientes.
62
A análise da função da CFTR nas células HBE do Pul3 apresentaram valores de
ΔIsc-eq-FSK basal e na adição do potenciador VX-770 próximas a zero, incubadas com o DMSO,
e negativas na presença do VX-809, demonstrando pouca e/ou nula função da CFTR. Os
valores de ΔIsc-eq-FSK foram estatisticamente maiores no grupo DMSO em comparação com o
VX-809 e VX-809 + VX-770, e ΔIsc-eq-FSK maiores com DMSO + VX-770 que o VX-809 +
VX-770 (Fig. 16, Tabela 3). A presença dos fármacos nessas células não demonstraram
melhoras na função da CFTR, ao contrário, diminuiu, o VX-770 teve 0,98% (±0,20) sendo
menor que a basal, 1,29% (±0,60), e o VX-809 apresentando números negativos, -0,99%
(±0,72), bem como a combinação dos dois VX-809 + VX-770, -1,39% (±0,89) de função da
CFTR em relação ao controle (Pul 12) (Fig. 23, Tabela 4).
Figura 16. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm
2) das células HBE do paciente
Pul3 (? / ?) . A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias
epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs
com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing
(mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=6–9). *: Estatisticamente diferente pelo teste
T de Student bicaudal. p < 0,05.
Nas células HBE do Pul4 (c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?) demonstraram uma
função basal, ΔIsc-eq-FSK (DMSO), acima do esperado para um paciente FC e teve um aumento
nos valores de ΔIsc-eq-FSK com VX-809 e VX-809 + VX-770, entretanto o VX-770 não
demonstrou potenciar a atividade da CFTR nessas células (Fig. 17, Tabela 3). As funções de
CFTR basais foram de 10,38% (±2,03) em relação ao controle (Pul 12), demonstrando uma
melhora pelo VX-809 de 15,31% (±1,58). Já na presença do VX-770 essa melhora também
63
foi inferior a basal, 9,91% (±2,26), e com o VX-809 + VX-770, 12,21% (±1,48) inferior ao
VX-809 sozinho (Fig. 23, Tabela 4).
Figura 17. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm
2) das células HBE do paciente
Pul4 (c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de
células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e
incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em
Câmara de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3).
Nas células HBE do Pul5 (F508del / c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs)), o
VX-770 demonstrou um efeito bem expressivo, tendo valores de ΔIsc-eq-FSK bem superiores
quando comparadas com os ΔIsc-eq-FSK basal. No grupo DMSO os valores de ΔIsc-eq-FSK com
VX-770 foram 3,6 vezes maiores que os ΔIsc-eq-FSK basal e no grupo VX-809 33 vezes maiores
do que os ΔIsc-eq-FSK basal, demonstrando um grande efeito desse fármaco nessas células. A
ação do VX-809 + VX-770 nos valores ΔIsc-eq-FSK gerados foram 2,5 vezes maiores que os nos
ΔIsc-eq-FSK no grupo DMSO + VX-770 (Fig. 18, Tabela 3). A função resgatada da CFTR pelo
VX-770 foi de 49,55% (±2,83) e da combinação dos dois fármacos, VX-809 + VX-770
apresentando uma função de 123,81% (±57,36), ou seja, superior ao grupo controle (Pul12).
Por outro lado, nessas células o VX-809 sozinho demonstrou um efeito negativo tendo valore
de ΔIsc-eq-FSK menores no grupo VX-809 comparado com o grupo DMSO, e apresentou um
resgate da CFTR de 3,72% (±1,54), sendo menor que a função basal de 13,57% (±6,44) (Fig.
23, Tabela 4).
64
Figura 18. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm
2) das células HBE do paciente
Pul5 (F508del / c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs)). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em
Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning®
Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos
experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809.
(n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de Student bicaudal. p < 0,05.
As análises das células HBE do Pul 11 (F508del / ?) demonstraram uma melhora
pelos fármacos na função da CFTR. O VX-809 resgatou quase o dobro da função basal da
CFTR nessas células. Os valores de ΔIsc-eq-FSK basal e com o VX-770 foram semelhantes,
porém, os ΔIsc-eq-FSK nos grupos incubados com o VX-809 e VX-809 + VX-770 foram
superiores em comparação ao grupo DMSO, sendo, estatisticamente diferentes, os valores de
ΔIsc-eq-FSK do grupo VX-809 + VX-770 em comparação com o DMSO (Fig. 19, Tabela 3). A
função basal da CFTR nessas células foi de 4,72% (±0,43), o VX-770 apresentou uma
pequena melhora, 4,86% (±0,60), o VX-809 teve uma função de 8,23% (±1,34) e a
combinação dos dois apresentou uma função de 8,82% (0,47±) quando comparadas ao normal
(Pul12) (Fig. 23, Tabela 4).
65
Figura 19. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células HBE do paciente
Pul11 (F508del / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células
primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar
® Snapwell e incubadas
por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara
de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente
pelo teste T de Student bicaudal. p < 0,05.
Na análise das células HBE do Pul12, um paciente não fibrocístico, com
discinesia ciliar, demonstrou valores de ΔIsc-eq-FSK de 11,649 (±4,72 – µA/cm2) e esse valor foi
considerado a função normal de CFTR (100%). A presença dos fármacos diminuiu essa
função basal, principalmente na combinação do VX-809 + VX-770, gerando ΔIsc-eq-FSK de
5,991 (±1,572 – µA/cm2), porém não foram estatisticamente diferentes (Fig. 20, Tabela 3). A
função basal dessas correntes foi considerada como 100% de função da CFTR, a incubação do
VX-809 diminuiu essa função para 63,77% (±14,99), o VX-770 para 67,33% (±19,96) e a
combinação de ambos, resultou em uma diminuição ainda maior para 51,42% (±13,49) (Fig.
23, Tabela 4).
66
Figura 20. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm
2) das células HBE do paciente
Pul12 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias
epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs
com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing
(mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T
de Student bicaudal. p < 0,05.
Finalmente, os ΔIsc-eq-FSK analisados das células HTE da Traq3, não FC, foram
inibidas pela ação do inibidor específico CFTR 172 (30µM) e não foi afetado pela presença
dos fármacos VX-770 e/ou VX-809. Ao contrário, uma diminuição nos valores de ΔIsc-eq-FSK,
o mesmo observado no Pul12 (Fig. 20, Tabela 3). Foi realizada uma análise comparativa em
relação às funções da CFTR entre as células HBE do Pul 12, não FC, e das células HTE da
Traq4, também não FC. Esses resultados demonstraram valores de ΔIsc-eq-FSK próximas
(Tabela 4) e também a mesma redução nos ΔIsc-eq-FSK na presença dos fármacos. Comparando
a função da CFTR, tendo os ΔIsc-eq-FSK do Pul12 como 100%, os ΔIsc-eq-FSK da Traq4 tiveram
funções de 102,79% (±34,12). Entretanto nas células HTE os fármacos reduziram ainda mais
a função do CFTR, com VX-770 uma função de 36,58% (±12,95), com o VX-809 de 44,69%
(±8,02) e a combinação VX-809 + VX-770 de 19,50% (±6,91) (Fig. 23, Tabela 4).
67
Figura 21. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm
2) das células HTE do paciente
Traq4 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias
epiteliais traqueais humanas (HTE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs
com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing
(mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3 – 6).
Tabela 3. Análise dos ΔIsc-eq em µA/cm2
do protocolo de função da CFTR nas células HBE e HTE em Câmara
de Ussing.
Paciente
ΔIsc-eq-FSK ± SEM
n
Valores de p (DMSO)*
DMSO
(0,05%)
VX-770
(10µM)
VX-809
(3µM)
VX-809 + VX-
770 VX-770 VX-809
VX-809 + VX-
770
Pul3 0,15
±0,023
0,115
±0,023
-0,115
±0,078
-0,161
±0,104 9 0,599 0,027 0,022
Pul4 1,209
±0,236
1,155
±0,263
1,784
±0,184
1,422
±0,172 3 0,690 0,128 0,507
Pul5 1,581
±0,751
5,772
±0,329
0,434
±0,18
14,423
±6,682 3 0,048 0,211 0,129
Pul11 0,550
±0,050
0,566
±0,070
0,959
±0,156
1,028
±0,055 3 0,888 0,067 0,003
Pul12 11,649
±4,720
7,844
±2,325
7,428
±1,747
5,991
±1,572 5 0,196 0,390 0,250
Traq3 11,975
±3,974
4,262
±1,508
5,206
±0,935
2,272
±0,805 6 0,452 0,128 0,141
Valores de p: comparação da incubação com as drogas em relação ao controles por DMSO
Analisando todas as células HBE dos pulmões, o Pul3 teve os menores valores de
ΔIsc-eq-FSK, DMSO, VX-770, VX-809 e VX-809 + VX-770, sendo estatisticamente menores
quando comparados com todos os outros Pulmões. Os valores de ΔIsc-eq-FSK das células HBE
do Pul4 incubados com VX-809 foram estaticamente maiores que as do Pul5 e Pul11 e
menores que as dos Traq4. Os valores de ΔIsc-eq-FSK das células HBE Pul5 e Pul11 incubados
com VX-809 foram estatisticamente menores comparados aos Pul12 e Traq4 e os ΔIsc-eq-FSK
68
com o VX-770 do Pul4 foram estaticamente menores que o Pul5, e esses foram
estatisticamente maiores que os do Pul11 incubados com DMSO (Fig. 22, Tabela 3)
Figura 22. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina
(FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos
pacientes Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11 (FC), incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou
VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e
potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco); VX-770 (cinza
claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto) e (n=3–9). Diferença significativa avaliada pelo Teste T
de Student p<0,05; #: Pul3 comparada com todos os outros grupos; *: VX-770 do Pul4 comparada com o Pul5 e
do Pul5 comparada com o Pul11; **: VX-809 do Pul4 comparada com os grupos Traq4, Pul5 e Pul11; ***: VX-
809 do Pul5 comparada com os grupos Traq4 e Pul12; $: Diferença significativa do VX-809 do Pul11
comparada com os grupos Traq4 e Pul12.
Figura 23. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas das correntes de
curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células
epiteliais brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11
(FC), incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo
de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing.
DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=3–9).
69
Tabela 4. Porcentagens de função da CFTR nas células HBE e HTE, analisadas em Câmara de Ussing,
total, função basal (FSK 2µM) mais a ação dos fármacos VX-770 (10µM) e VX-809 (3µM). Pul12
controle não FC 100% de função basal.
Paciente % / SEM
DMSO
% / SEM
VX-770
% / SEM
VX-809
% / SEM
VX-770 + VX-809
n
Pul3 1,29 ±0,60 0,98 ±0,20 -0,99 ±-0,72 -1,39 ±-0,89 9
Pul4 10,38 ±2,03 9,91 ±2,26 15,31 ±1,58 12,21 ±1,48 3
Pul5 13,57 ±6,44 49,55 ±2,83 3,72 ±1,54 123,81 ±57,36 3
Pul11 4,72 ±0,43 4,86 ±0,60 8,23 ±1,34 8,82 ±0,47 3
Pul12 100 ±40,52 67,33 ±19,66 63,77 ±14,99 51,42 ±13,49 5-6
Traq3 102,79 ±34,12 36,58 ±12,95 44,69 ±8,02 19,50 ±6,91 6
4.2. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em
células primárias epiteliais nasais (HNE)
As células HNE de 38 pacientes FC e não FC foram coletadas em diferentes
etapas (Tabela 5). Em 09/2015 foram coletadas células HNE de três pacientes FC para o
estudo piloto (Piloto 1-3). De março a abril de 2016 foram coletadas células HNE de cinco
pacientes, um paciente homozigoto para a F508del, PX01, três controles, sendo um
heterozigoto para a F508del, PX02 (wt/F508del), dois sem mutação para o gene do CFTR,
PX03 e PX04 (wt/wt), e um paciente com a mutação F508del/R1066C, PX05. Após a
validação de todos os resultados, foram iniciadas novamente as coletas em agosto de 2016,
quando foram coletadas células HNE de 30 pacientes (P01 – P30), que incluem dois controles
(wt/wt), dois controles heterozigoto F508del/wt, 19 F508del homozigotos, e sete pacientes de
outras mutações (Tabela 5). Alguns pacientes foram excluídos do estudo por contaminação
da cultura, descolamento da camada de fibroblastos ou poucas células coletadas (P04, P05,
P07, P11, P24, P26, P23, P27, P28 e P29), um por as células não polarizaram nos filtros (P22)
e outro por não respostas durante o experimento nas Câmaras de Ussing (P13).
Foram analisados três filtros com células HNE de cada paciente do estudo piloto
(piloto 1-3), incubados com ALI, DMSO e VX-809. Esses resultados validaram a técnica,
demonstrando que as células HNE poderiam ser analisadas da maneira que havíamos descrito,
pois possuíam boa resistência transepitelial e respondiam aos compostos do protocolo de
função da CFTR em Câmara de Ussing.
As células HNE dos pacientes da segunda etapa (PX01-05) foram analisadas em
Câmaras de Ussing com o protocolo de análise da função da CFTR, porém sem a adição do
corretor VX-770. As células HNE do paciente FC PX01 (F508del / F508del), e do paciente
controle portador PX02 (wt / F508del) foram incubadas com DMSO (0,05%) e VX-809
(3µM) por 48hs antes dos experimentos. As análises dos valores de ΔIsc-eq-FSK das células
70
HNE do PX01 demonstraram um aumento de função entre os grupos tratados com DMSO (-
0,025 ± -0,019 µA / cm2) em comparação com VX-809 (0,076 ± 0,08 µA / cm
2). O PX02 teve
os valores de ΔIsc-eq-FSK das células HNE estatisticamente maiores quando comparas ao PX01,
demonstrando atividade da CFTR, sendo os valores de ΔIsc-eq-FSK do grupo incubado com
DMSO (1,967 ± 0,158 µA / cm2) maiores que a do grupo incubado com VX-809 (1,073 ±
0,289 µA / cm2) (Fig. 24, Tabela 6).
As células HNE dos pacientes PX03 (wt / wt), PX04 (wt / wt) e PX05 (F508del /
R1066C) foram incubadas apenas com DMSO (0,05%) por 48hs antes dos experimentos. As
análises dos ΔIsc-eq-FSK mostraram a ativação da CFTR. Os ΔIsc-eq-FSK foram comparados entre
as células HNE dos cinco pacientes da segunda etapa demonstrando diferenças significativas
entre os grupos não FC, não FC portador e FC (Fig. 24).
Os pacientes PX03, PX04 e PX05 apresentaram uma camada de “muco” anormal
por cima da camada células HNE nos filtros de membrana porosa, o que não alterou a
polarização das mesmas, bem como a análise da função da CFTR na Câmara de Ussing.
Entretanto, os resultados dos pacientes controles foram bem distintos, por esse motivo, esses
pacientes não foram analisados em conjunto com os pacientes da 3ª etapa.
Na terceira etapa de coletas de células HNE foram analisados dois pacientes
controles (P02 e P30), um controle heterozigoto (P01 – F508del/wt) onze pacientes
F508del/F508del (P08, P09, P12, P14, P15, P16, P18, P19, P20, P21 e P25) e quatro pacientes
de outras mutações (P03: F508del/R334W; P06: G542X/I618T; P10 e P17: F508del/
c.1584+18672 bp A>G) (Tabela 6).
As células HNE desses pacientes foram incubadas 48hs com DMSO (0,05%) ou
VX-809 (3µM) e no protocolo de função da CFTR, foi adicionado o potenciador VX-770
(10µM) após a adição da Forscolina (3µM). As células HNE dos pacientes controles geraram
valores de ΔIsc-eq-FSK similares, incubadas com DMSO (P02 4,522 ± 0,417 e P30 3,984 ±
0,452) e VX-809 (P02 4,432 ± 0,975 e P30 3,905 ± 0,690) (Tabela 6). Os valores de ΔIsc-eq-
FSK incubados com DMSO nas células HNE desses dois pacientes foram agrupados e
calculados as média aritmética e desvio padrão da média (4,292 ± 0,301) e esse valor foi
considerado como um valor basal normal de função da CFTR (100%). Posteriormente, este
valor médio foi usado nos cálculos de função da CFTR dos outros experimentos realizados
em células HNE de pacientes não FC heterozigotos (F508del/wt) e pacientes FC (Tabela 7).
71
Tabela 5. Lista de pacientes com células primárias epiteliais nasais (HNE) coletadas, analisadas a função da
CFTR, Mutação dos pacientes e motivos da exclusão. Os pacientes foram divididos em três etapas de estudo: a
primeira (Piloto 1-3), fase em que foram estabelecidos e validados os protocolos de estudo; a segunda (PX01-
PX05) os estudos foram realizados sem a presença do potenciador VX-770 e a última fase (P01-P30) com o
protocolo completo.
Paciente Mutação Exclusão
Piloto 1 F508del/desconhecida –
Piloto 2 F508del/G542X –
Piloto 3 F508del/1812-1G>A –
PX01 F508del/F508del –
PX02 wt / F508del –
PX03 wt / wt –
PX04 wt / wt –
PX05 F508del/R1066C –
P01 wt / F508del –
P02 wt / wt –
P03 F508del/R334W –
P04 F508del/F508del Poucas células
P05 F508del/P205S Poucas células
P06 G542X/I618T –
P07 F508del/F508del Poucas células
P08 F508del/F508del –
P09 F508del/F508del –
P10 F508del/ c.1584+18672 bp A>G –
P11 F508del/R334W Contaminação (Bactéria)
P12 F508del/F508del –
P13 F508del/F508del Câmara de Ussing
P14 F508del/F508del –
P15 F508del/F508del –
P16 F508del/F508del –
P17 F508del/ c.1584+18672 bp A>G –
P18 F508del/F508del –
P19 F508del/F508del –
P20 F508del/F508del –
P21 F508del/F508del –
P22 F508del/F508del Células não Polarizaram
P23 F508del/F508del Fibroblastos Descolaram
P24 F508del/R334W Contaminação (Fungo)
P25 F508del/F508del –
P26 F508del/F508del Fibroblastos Descolaram
P27 F508del/F508del Fibroblastos Descolaram
P28 F508del/F508del Fibroblastos Descolaram
P29 wt / wt Contaminação (Bactéria)
P30 wt / wt –
72
Tabela 6. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-
eq, em células primárias epiteliais nasais (HNE).
ΔIsc-eq-FSK ± SEM
Paciente Genótipo DMSO VX-770 VX-809 VX-809+
VX-770 n
Valor
de p
PX01 F508del/F508del -0,025
±0,019#
– 0,076
±0,08#
– 3 0,462
PX02 wt / F508del 1,967
±0,158#
– 1,073
±0,289#
– 3
0,053
PX03 wt / wt 19,323
±3,095 – – – 6 –
PX04 wt / wt 6,483
±1,091 – – – 6 –
PX05 F508del/R1066C 0,396
±0,108 – – – 6 –
P01 wt / F508del 1,907
±0,416#
1,498
±0,297#
– – 6 0,085
P02 wt / wt 4,522
±0,417#
4,292
±0,179
4,432
±0,975
4,451
±0,883#
4 0,944
P03 F508del/R334W 0,198
±0,047#
0,306
±0,061
0,303
±0,088
0,936
±0,286#
4 0,044
P06 G542X/I618T 0,066
±0,291
0,402
±0,184
0,13
±0,266
1,114
±0,562
2-
3 –
P08 F508del/F508del 0,059
±0,111#
0,11
±0,043
0,149
±0,086
0,211
±0,049#
3-
4 0,223
P09 F508del/F508del 0,08
±0,078#
0,187
±0,078
0,565
±0,117
0,61
±0,092#
4 0,009
P10
F508del/
c.1584+18672 bp
A>G
0,232
±0,354#
0,444
±0,056
0,447
±0,085
0,660
±0,326#
3 0,424
P12 F508del/F508del 0,211
±0,054#
0,154
±0,05
0,442
±0,088
0,382
±0,082#
4 0,055
P14 F508del/F508del 0,274
±0,087
0,352
±0,135
0,803
±0,273
0,829
±0,244
2-
5 –
P15 F508del/F508del 0,15
±0,036#
0,199
±0,04
0,197
±0,009
0,365
±0,163#
3 0,267
P16 F508del/F508del 0,215
±0,056#
0,23
±0,086
0,491
±0,136
0,564
±0,011#
3 0,004
P17
F508del/
c.1584+18672 bp
A>G
-0,82
±0,146
0,425
±0,441
0,109
±0,054
0,186
±0,130
2-
3 –
P18 F508del/F508del 0,29
±0,167
0,4
±0,081
0,296
±0,137
0,437
±0,187
2-
3 –
P19 F508del/F508del 0,187
±0,127#
0,128
±0,06
0,348
±0,122
0,381
±0,09#
4-
6 0,233
P20 F508del/F508del 0,125
±0,012
0,145
±0,034
0,15
±0,077
0,129
±0,032 2 –
P21 F508del/F508del 0,185
±0,033 –
0,364
±0,022 –
2-
3 –
P25 F508del/F508del 0,452
±0,101#
0,626
±0,183
0,441
±0,077
0,487
±0,041#
3-
4 0,732
P30 wt / wt 3,984
±0,452#
3,069
±0,579
3,905
±0,690
2,792
±0,526#
3 0,161
#: Comparação entre os valores para análise estatística. Estatisticamente diferentes pelo teste de
Student. (p<0,05)
73
Figura 24. Gráfico em barras das correntes de curto circuitos (ΔIsc-eq - µA/cm
2)
sensíveis a Forscolina (FSK
2µM) em células primárias epiteliais nasais (HNE) dos pacientes da segunda etapa (PX01 – F508del/F508del;
PX02 – F508del/WT; PX03 – wt/wt; PX04 – wt/wt; PX05 – F508del/R1066C), geradas pelo protocolo de
ativação da função da CFTR, em Câmaras de Ussing cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell. Filtros
pré-incubados por 48hs com DMSO (0,05%). n=3-6. #,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste
estatístico T de student bicaudal (p<0,05).
Figura 25. Imagens das células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas nos filtros Corning® Costar®
Snapwell. A. Filtro sem muco. B. Presença do muco sob as células HNE. Aumento com objetiva de 10X.
As células HNE do P01, heterozigoto não FC, foi similar ao paciente PX02 da
segunda etapa, apresentando valores de ΔIsc-eq-FSK incubadas com DMSO (P01: 1,907 ±0,416 e
PX02: 1,967 ±0,158) menores que os controles wt/wt, próximos a 50% da função desses (P01:
Tabela 7. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-eq, em de
células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) em Câmara de Ussing, de pacientes agrupados
conforme o seu genótipo: wt/wt, wt / F508del e F508del / F508del.
Genótipo
ΔIsc-eq-FSK ± SEM
DMSO VX-770 VX-809 VX-809
+VX-770 n
Valor
de p
wt/wt 4,292 ±0,301# 3,768 ±0,344 4,206 ±0,592 3,740 ±0,612
# 2 0,969
wt/F508del 1,937 ±0,20# 1,498 ±0,297 1,073 ±0,289
# – 1-2 0,042
F508del/ F508del 0,186 ±0,028# 0,230 ±0,034 0,372 ±0,048 0,439 ±0,049
# 10-12 0,001
P value
wt/wt vs
wt/F508del < 0,001 0,004 0,011 –
wt/wt vs
F508del/F508del < 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001
wt/F508del vs
F508del/F508del < 0,001 < 0,001 < 0,001 –
#: Comparação entre os valores para análise estatística. Estatisticamente diferentes pelo teste de Student. (p<0,05)
74
44,43%; PX02: 45,83%). Esses agrupados tiveram valores de ΔIsc-eq-FSK, incubados com
DMSO, de 1,937 µA/cm2 (±0,2) e 45,13% (±4,65) de função da CFTR em relação aos
controles (Fig. 26, Tabela 7).
Figura 26. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina
(FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais nasais (HNE) de dois pacientes não FC
(wt/wt), dois pacientes não FC heterozigotos (wt/F508del) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs
com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela
forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. A. Comparação dos ΔIsc-
eq-FSK das HNE dos pacientes por grupo de genótipos: wt/wt; wt F508del; F508del/F508del. B. Porcentagem de
função da CFTR nas HNE dos pacientes por grupo de genótipos: F508del/F508del e wt/F508del em relação ao
grupo controle wt/wt (100%). n=6-46. *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student
bicaudal (p<0,05).
Na análise das células HNE dos 12 pacientes F508del/F508del agrupadas,
observamos que os valores de ΔIsc-eq-FSK, com o uso de VX-809 e/ou VX-770, foram
estatisticamente menores em comparação com o grupo de células HNE dos pacientes
controles e dos pacientes heterozigotos controles (p<0,05) (Fig. 26A, 27A, Tabela 7). Além
disso, as células HNE dos pacientes apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente
maiores com o uso do VX-809 e VX-809 + VX-770 em comparação ao DMSO e VX-770
(p<0,05) (Fig. 27A, Tabela 7). Na análise do resgate de função da CFTR nas células HNE
desses pacientes, em relação ao wt/wt (100%), observou-se uma função de 8,66% (±1,11%)
com o uso do VX-809 e 10,23% (±1,15%) com a combinação dos dois moduladores (VX-809
e VX-770) (Fig. 26B, 27B).
As células HNE de todos os pacientes FC quando analisadas separadamente,
apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK distintas para cada paciente, com o uso ou não das drogas,
inclusive entre pacientes com a mesma mutação. As células HNE analisadas apresentaram
melhora nos valores de ΔIsc-eq-FSK com o uso do VX-770, com exceção dos pacientes P12 e
P19, e os pacientes P06, P09 e P17 tiveram esses valores duplicados em relação ao DMSO
(Figura 28A). Já o VX-809 também apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK maiores em
comparação com as incubadas com DMSO, com exceções dos pacientes P18 e P23 que se
75
mantiveram praticamente inalterados (Figura 28B) e as células HNE dos pacientes P09 e P16
tiveram os valores de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores. Nos valores de ΔIsc-eq-FSK as células
HNE de todos os pacientes apresentaram uma melhora com o uso do VX-809 + VX-770 em
relação ao DMSO (Figura 28C). As células HNE dos pacientes P09 e P16 tiveram os valores
de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores na incubação com o VX-809 + VX-770 em comparação
com o DMSO. O paciente P21 não teve o VX-770 acrescentado no protocolo (Tabela 6).
Figura 27. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina
(FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais nasais (HNE) de dois pacientes não FC
(wt/wt) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de
ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-
770 (10µM), em Câmaras de Ussing. A. Comparação dos ΔIsc-eq-FSK das HNE dos pacientes por grupo de
genótipos: wt/wt; F508del/F508del. B. Porcentagem de função da CFTR nas HNE dos pacientes
F508del/F508del em relação ao grupo controle wt/wt (100%). DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809
(cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). n=6-46. #,##
,###
,####
,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste
estatístico T de student (p<0,05).
Figura 28. Análise dos valores de ΔIsc-eq em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell, de diferentes pacientes FC com diferentes mutações, F508del/F508del (linha
preta), F508del/c.1584+18672 bp A>G (linha vermelha), F508del/R334W (linha azul) e F508del/I618T (linha
verde) incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR
em Câmaras de Ussing. Células HNE tratadas com A. VX-770, B. VX-809 e C. VX-809 + VX-770. Linhas
tracejadas horizontais suplementares nos gráficos indicam 10% do valor médio dos ΔIsc-eq-FSK da função da
CFTR em culturas de pacientes wt / wt (100%).
O tratamento com o corretor VX-809 melhorou os valores de ΔIsc-eq-FSK acima de
10% dos valores de ΔIsc-eq-FSK do grupo controle wt/wt (P02 + P30), nas células HNE dos
76
pacientes P09 (F508del/F508del), P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G), P12
(F508del/F508del), P14 (F508del/F508del), P16 (F508del/F508del), P25 (F508del/F508del).
Já no tratamento com os fármacos VX-809 + VX-770 os valores de ΔIsc-eq-FSK foram acima
dos 10% dos valores controles nos pacientes P03 (F508del/I618T), P06 (F508del/R334W),
P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G), P09 (F508del/F508del), P14 (F508del/F508del), P16
(F508del/F508del), P18 (F508del/F508del), P25 (F508del/F508del) (Fig. 28B, C e 29). As
células HNE dos demais pacientes não apresentaram ΔIsc-eq acima dos 10% do grupo controle.
As células HNE do P23 foram às únicas que apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK,
basal (DMSO), acima dos 10% do ΔIsc-eq-FSK de função normal dos controles (Fig. 29A).
Ainda mais os ΔIsc-eq-FSK das células HNE, tratados com VX-809+VX-770, apresentaram
melhoras expressivas nos pacientes com as mutações F508del/R334W (P03: 21,82%),
F508del/I618T (P06: 25,95%) e um com a mutação F508del/c.1584+18672 bp A>G (P10:
15,38%) (Fig 29B).
Figura 29. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas das correntes de
curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células
epiteliais nasais (HNE), A. de 2 pacientes heterozigotos não FC (wt/F508del), 1 F508del/R334W, 1
F508del/I618T, 2 F508del/c.1584+18672 bp A>G e B. 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com
DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela
forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco); VX-770
(cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=2–6).
4.2.1. SNP rs7512462 (SLC26A9) modula a função e o resgate da CFTR (F508del /
F508del) pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770)
O SNP rs7512462 acarreta na troca de uma citosina por uma timina, tendo três
genótipos possíveis (CC, CT e TT). Os pacientes foram agrupados da seguinte maneira: 6 TT
(P08, P12, P15, P18, P19 e P20); 5 CT (PX01, P09, P14, P21, P25) e 1 CC (P16) (Fig. 30A,
B, C). Os valores de ΔIsc-eq-FSK e as funções do CFTR foram comparados entre: (i) TT versus
77
CT; (ii) TT versus CT + CC. O genótipo CT e o grupo CT + CC apresentaram valores de ΔIsc-
eq-FSK basais (DMSO) levemente maiores que o genótipo TT. Na análise da ação dos fármacos,
o VX-770, VX-809 e VX-809 + VX-770 o genótipo CT e o grupo CT + CC apresentaram
ΔIsc-eq-FSK significativamente maiores que no genótipo TT (Fig. 30, Tabela 8). Todos os
grupos apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK pelos fármacos VX-809 + VX-770 estatisticamente
maiores que o basal (DMSO). Já o genótipo CT e o grupo CT + CC apresentaram valores de
ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores também no uso do VX-809 em comparação com ao
DMSO. Ainda o genótipo TT e o grupo CT+CC tiveram ΔIsc-eq-FSK tratados com VX-809 +
VX-770 estatisticamente maiores em comparação com os ΔIsc-eq-FSK tratados apenas com o
VX-770 (Fig. 31A). O genótipo CT e o grupo CT + CC demonstraram funções da CFTR
resgatada pelo VX-809 e pela combinação de VX-809 + VX-770 superiores a 10% da função
do wt/wt (100%), o que não foi observado para o genótipo TT (Fig. 31B).
Figura 30. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros Corning®
Costar® Snapwell incubados por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de
ativação da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC F508del/F508del classificados pelo SNP
rs7512462 (SLC26A9). Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na
CFTR de células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT
(linha vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CT+CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha
vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das
células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt).
78
Figura 31. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação ao SNP rs7512462
(SLC26A9), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos
A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos
fármacos nas células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770
(preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal; #,
##,
###:
Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal em comparação com o genótipo CT e
grupo CT+CC (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total
da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).
Tabela 8. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl- em células
HNE de doze pacientes FC homozigotos para a F508del agrupados de acordo com o SNP
especifico: rs7512462 do gene SLC26A9 e rs3788766 do gene SLC6A14. A medida da secreção
de Cl- mediada pela CFTR foram quantificadas pela análise das médias e dos desvios padrões
dos deltas de correntes de curto-circuito equivalentes (ΔIsc-eq) determinadas pela estimulação do
AMPc pela FSK (2µM) sozinha (ΔIsc-eq-FSK) e pela adição do potencializador VX-770 (10µM)
(ΔIeq-sc-FSK+VX-770) nas células HNE incubadas por 48 horas pelo corretor VX-809 (3µM) ou pelo
veículo DMSO (0,05%).
Paciente ΔIsc-eq-FSK ± SEM
DMSO VX-770 VX-809 VX-809 + VX-770
SLC6A14 - rs3788766
CC 0,272 ± 0,049 0,325 ± 0,089 0,450 ± 0,108 0,490 ± 0,127
CT 0,167 ± 0,045 0,164 ± 0,035 0,349 ± 0,071 0,369 ± 0,054
TT 0,129 ± 0,046 0,206 ± 0,039 0,319 ± 0,060 0,446 ± 0,060
SLC26A9 - rs7512462
CT + CC 0,209 ± 0,047 0,329 ± 0,074 0,492 ± 0,080 0,639 ± 0,082
CT 0,208 ± 0,057 0,362 ± 0,094 0,493 ± 0,091 0,656 ± 0,101
TT 0,166 ± 0,035 0,171 ± 0,026 0,261 ± 0,046 0,306 ± 0,045
SLC6A14 - rs3788766 + SLC26A9 - rs7512462
CT + CC 0,308 ± 0,047 0,376 ± 0,091 0,556 ± 0,101 0,649 ± 0,107
TT + CT 0,134 ± 0,030 0,173 ± 0,024 0,282 ± 0,044 0,349 ± 0,045
79
O rs7512462*C (alelo C) demonstrou ser essencial na modulação positiva da
CFTR em comparação com o rs7512462*T (alelo T). Nas análises considerando os alelos, os
valores de ΔIsc-eq-FSK com a ação dos fármacos VX-809 e VX-809+VX-770 do alelo C foram
estatisticamente maiores comparado ao alelo T (Fig. 32A). Ainda alelo T teve os valores de
ΔIsc-eq-FSK na presença dos fármacos VX-809 e VX-809 + VX-770 significativamente maiores
comparados com o DMSO, e também o VX-809 + VX-770 significativamente maiores que o
VX-770 sozinho. Já o alelo T teve os valores de ΔIsc-eq-FSK com o VX-809 significativamente
maiores em comparação com o DMSO e o tratamento com o VX-809 + VX-770 apresentou
ΔIsc-eq-FSK significância quando comparado com todos os demais tratamentos, DMSO, VX-770
e VX-809 (Fig. 32A). Na função da CFTR nas células HNE de pacientes cm o alelo C o VX-
809 e VX-809 + VX-770 tiveram funções da CFTR superior a 10% (Fig. 32B).
Figura 32. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação à presença do alelo C
ou T no SNP rs7512462 (SLC26A9), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM).
Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR
resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);
VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student
bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da
CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).
4.2.2. Resgate da CFTR (F508del/F508del) pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-
770) condicionada pelo SNP rs3788766 (SLC6A14)
O SNP rs3788766, também, acarreta na troca de uma citosina por uma timina,
tendo três genótipos possíveis (CC, CT e TT). O genótipo CC (P14, P20, P21 e P25)
80
apresentou valores de ΔIsc-eq-FSK maiores quando comparado com o CT (P08 e P12) e TT
(PX01, P09, P15, P16, P18 e P19) em todos os tratamentos (DMSO, VX-770, VX-809 e VX-
809 + VX-770) (Fig. 33; Tabela 8). O genótipo TT teve valores de ΔIsc-eq-FSK quando tratados
com VX-809 e VX-809 + VX-770 estatisticamente maiores comparados com o DMSO, e
também na comparação VX-809 + VX-770 com o VX-770. Já o genótipo CT teve valores de
ΔIsc-eq-FSK na presença do VX-809 estatisticamente maiores cm relação ao DMSO. Não foi
observado valores de ΔIsc-eq-FSK significativamente maiores no genótipo CC (Fig. 34A, Tabela
8).
Figura 33. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros Corning®
Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação
da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC F508del/F508del classificados pelo SNP rs3788766
(SLC6A14). Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na CFTR de
células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha
vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha vermelha). Linhas
tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois
controles (P01 e P30 – wt/wt).
A função da CFTR nas células HNE desses pacientes classificados pelo SNP
rs3788766 (SLC6A14), em relação ao wt/wt (100%), apresentou funções superiores a 10% nos
genótipos CC e TT tratados com o VX809 + VX-770 e no genótipo CC tratado com o VX-
809 (Fig. 34B).
81
Figura 34. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação ao SNP rs3788766
(SLC6A14), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos
A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos
fármacos nas células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770
(preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05).
Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da CFTR em células
HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).
Figura 35. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação à presença do alelo C
ou T no SNP rs3788766 (SLC6A14), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM).
Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR
resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);
VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**,***,****: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student bicaudal; #: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal em comparação com
o genótipo C e T (DMSO) (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da
função basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).
Na análise alélica das células HNE dos pacientes, o alelo rs3788766*C apresentou
valores de ΔIsc-eq-FSK (DMSO) estatisticamente maiores comparadas ao alelo rs3788766*T. O
82
rs3788766*T teve valores de ΔIsc-eq-FSK, tratados com o VX-809 estatisticamente maiores
quando comparados com o DMSO e tratados com VX-809 + VX-770 estatisticamente
maiores quando comparados com o DMSO, VX-770 e VX-809. Já o alelo rs3788766*C teve
valores de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores no uso de VX-809 e do VX-809 + VX-770 em
relação ao DMSO. Ainda mais, ambos os alelos (rs3788766*C e rs3788766*T) tiveram
função de CFTR acima de 10% na combinação de VX-809 + VX-770 (Fig. 35).
4.2.3. rs7512462*C e rs3788766*C agrupados modulam positivamente a função da
CFTR e melhoram a ação do Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770)
As células HNE dos 12 pacientes (F508del/F508del) foram classificadas em 2
grupos em relação aos SNPs rs7512462 e rs3788766, sendo: (i) grupo C (P14, P21 e P25) –
pelo menos um alelo C em ambos os SNPs (CC/CC; CT/CT/ CC/CT e CT/CC); (ii) grupo T
(PX01, P08, P09, P12, P15, P16, P18, P19 e P20) – pacientes com outras combinações
(TT/TT; TT/CT; CT/TT; CC/TT e TT/CC) (Fig. 36, Tabela 9). O grupo C apresentou valores
de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores que o grupo T em todos os tratamentos DMSO, VX-
770, VX-809 e VX-809+VX-770, sendo esta função, aproximadamente, o dobro do
observado para o grupo T (Fig. 37ª, Tabela 9). Entretanto, o grupo T, apresentou melhora
estatísticas nos valores de ΔIsc-eq-FSK na incubação com VX-809 em comparação com a
incubação com o DMSO e VX-809 + VX-770 em comparação com todos os outros grupos de
tratamentos (DMSO, VX-770 e VX-809+VX-770), fato não observado no grupo C (Fig. 37A,
Tabela 8). Ao analisar a função da CFTR o grupo C apresentou funções superiores a 10% nos
tratamentos com os fármacos (VX-770, VX-809 e VX-809+VX-770) em relação ao wt/wt
(100%) (Fig. 37B).
83
Tabela 9. Pacientes F508del/F508del e seus
respectivos SPNs nos genes modificadores analisados.
SLC6A14 SLC26A9
Paciente rs3788766 rs7512462
PX01 TT CT
P08 CT TT
P09 TT CT
P12 CT TT
P14* CC CT
P15 TT TT
P16 TT CC
P18 TT TT
P19 TT TT
P20 CC TT
P21* CC CT
P25* CC CT *: Pacientes com a presença de pelo menos um alelo C em ambos
os SNPs.
Figura 36. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros Corning®
Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação
da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC F508del/F508del classificados pelos SNPs rs7512462
(SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14). Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809
+ VX-770 na CFTR de células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, C (linha verde) e T (linha
vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das
células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt).
84
Figura 37. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação à presença do alelo C
ou T nos SNPs rs7512462 (SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%)
ou VX-809 (3μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de
função da CFTR resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-
809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico
T de student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função
basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).
4.2.4. Análise da função do canal epitelial de sódio, ENaC, pelos fármacos VX-809 e
VX-770 em células primárias epiteliais nasais (HNE)
No protocolo de análise de função da CFTR em Câmara de Ussing foi utilizado o
composto amilorida (20µM), um inibidor do ENaC. Nas células HNE dos pacientes
analisados (FC ou não FC) essa inibição do ENaC é muito variável, oscilando muito entre os
experimentos, mesmo para as mesmas mutações de CFTR (Fig. 38, Tabela 10).
A função do ENaC, nas análises dos valores de ΔIsc-eq-Amil, nas células HNE de
cada paciente, os PX01, PX02, P06, P08, P09, P12, P14, P15, P16, P17, P19, P21, P25 e P30,
demonstraram valores de ΔIsc-eq-Amil maiores no tratamento com DMSO em comparação com
o VX-809. Nos demais pacientes os valores de ΔIsc-eq-Amil foram maiores no tratamento com o
VX-em relação ao DMSO. As células HNE dos pacientes PX01 e P19, ambos
F508del/F508del, tiveram diferenças estatísticas entra os valores de ΔIsc-eq-Amil incubadas com
VX-809 comparados com o DMSO (Fig. 39, Tabela 10).
85
Figura 38. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por
48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de quatro pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não
FC heterozigotos (wt/F508del – Cinza), 17 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul),
1 F508del/R1066C (Verde), 1 G542X/I618T (Amarelo) e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G (Vermelho). n=2-6.
Figura 39. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell e incubadas com DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR VX-809 (3µM) por 48hs
a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de dois pacientes não FC (wt/wt - tracejado), um paciente não FC
heterozigotos (wt/F508del – Cinza), 16 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul), 1
F508del/R1066C (Verde), e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G (Vermelho). n=2-6.
86
Tabela 10. Análise dos ΔIsc-eq da inibição do ENaC pela Amilorida (20µM) em células primárias
epiteliais nasais de pacientes FC e não FC, em Câmara de Ussing.
Paciente Genótipo Incubação ΔIsc-eq / SEM
Amilorida 20µM n
PX01 F508del/F508del DMSO -56,474 ±1,561 3
VX-809 -43,330 ±3,643* 3
PX02 wt / F508del DMSO -2,692 ±0,198 3
VX-809 -2,464 ±0,500 3
PX03 wt / wt DMSO -41,414 ±13,50 6
PX04 wt / wt DMSO -14,995 ±3,89 6
PX05 F508del/R1066C DMSO -7,481 ±1,037 6
P01 wt / F508del DMSO -3,134 ±0,680 3
P02 wt / wt DMSO -60,362 ±8,958 4
VX-809 -63,142 ±16,67 4
P03 F508del/R334W DMSO -19,259 ±0,047 4
VX-809 -20,253 ±4,112 4
P06 G542X/I618T DMSO -26,819 ±7,91 2
VX-809 -15,854 ±1,908 3
P08 F508del/F508del DMSO -59,915 ±9,072 3
VX-809 -47,663 ±9,563 4
P09 F508del/F508del DMSO -26,899 ±2,627 4
VX-809 -23,090 ±2,385 4
P10 F508del/ c.1584+18672 bp A>G DMSO -14,225 ±1,258 3
VX-809 -15,752 ±7,535 3
P12 F508del/F508del DMSO -31,952 ±2,171 4
VX-809 -26,230 ±2,135 4
P14 F508del/F508del DMSO -12,956 ±1,902 2
VX-809 -9,429 ±1,29 5
P15 F508del/F508del DMSO -31,081 ±8,577 3
VX-809 -28,071 ±1,98 3
P16 F508del/F508del DMSO -16,414 ±4,93 3
VX-809 -7,982 ±1,534 3
P17 F508del/ c.1584+18672 bp A>G DMSO -57,115 ±7,405 2
VX-809 -41,004 ±8,803 3
P18 F508del/F508del DMSO -29,156 ±1,854 2
VX-809 -33,23 ±2,188 3
P19 F508del/F508del DMSO -37,246 ±2,604 4
VX-809 -25,585 ±1,744* 6
P20 F508del/F508del DMSO -75,594 ±7,093 2
VX-809 -80,085 ±6,465 2
P21 F508del/F508del DMSO -10,004 ±0,623 2
VX-809 -9,039 ±2,322 3
P25 F508del/F508del DMSO -43,959 ±9,404 3
VX-809 -29,043 ±6,987 4
P30 wt / wt DMSO -30,267 ±10,883 3
VX-809 -19,581 ±9,629 3
*: Diferenças significativas entre os grupos DMSO e VX-809 do mesmo paciente, teste T de
Student. p<0,05.
87
Figura 40. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros
Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por
48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de dois pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não
FC heterozigotos (wt/F508del – Cinza) e 12 F508del/F508del (Preto). n=2-6. *,**: Diferente significativamente
pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05).
Agrupando os pacientes controles (P02 e P30 – wt/wt), controles heterozigotos
(PX02 e P01 – wt/F508del) e os 12 pacientes F508del homozigotos (F508del/F508del), os
valores de ΔIsc-eq-Amil analisados, em ambas as incubações de DMSO ou VX-809,
apresentaram diferenças estatísticas entre os controles heterozigotos comparados aos
pacientes homozigotos FC e controles, e essa diferença não foi observada na comparação
entre os pacientes homozigotos não FC e FC (Fig. 40, Tabela 10).
4.3. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais brônquicas
(HBE) de pacientes FC e não FC.
Após as análises de funções da CFTR (FSK, VX-770 e CFTRinh172), as células
HBE de todos os pacientes foram lavadas (Ringer + Amil) por 10 minutos e então foram
estimuladas pelo ATP (100 µM), na região apical, e geraram Vte transientes, com um pico de
ativação máximo e decaindo com o tempo até o atingirem a Vte basal (Fig. 41). O pico
máximo das células HBE e HTE analisadas foi bem variável, tendo o Pul5 os maiores valores
de ΔIsc-eq-ATP e o Pul4 e Pul11 os menores, e curiosamente os ΔIsc-eq-ATP nas células HTE
foram negativos (Fig. 42). Os valore de ΔIsc-eq-ATP das células HBE dos pacientes Pul4, Pul11
e Pul12 foram quantificados na segunda aplicação de ATP, após a análise da inibição dos ΔIsc-
eq-ATP pelo inibidor de canais de cálcio ativados pelo cálcio A01 (CaCCinhAO1 40µM).
88
Figura 41. Traçado original (Vte) da estimulação do ATP (100µM), apical, em células primárias epiteliais
brônquicas (HBE) do paciente não FC Pul12 (wt/wt), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e
analisadas em Câmaras de Ussing.
Figura 42. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) em células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE) de
pacientes não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing.
n=6-18. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal; #: Diferente
significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal em comparação com as células HBE dos Pul3,
Pul4, Pul5, Pul11 e Pul12 (p<0,05).
4.3.1. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias
brônquicas humanas (HBE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-
809 na CFTR
Células HBE de todos os pacientes FC e não FC incubados com DMSO (0,05%)
ou VX-809 (3µM) foram estimuladas pelo ATP, os ΔIsc-eq-ATP analisados, e demonstraram
respostas bem variáveis entre os pacientes, como citado anteriormente. Entretanto a ação do
corretor da CFTR, o VX-809, não mostrou efeito sobre essa resposta à estimulação do ATP,
pois os ΔIsc-eq-ATP das células HBE dos pacientes não apresentaram diferenças dos ΔIsc-eq-ATP
entre os grupos DMSO e VX-809 (Fig. 43).
89
Figura 43. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) em relação à incubação com DMSO (0,05% – branco) ou o corretor
da CFTR VX-809 (3µM – preto) das células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE) dos pacientes FC
Pul3, Pul4, Pul5, Pul11 e não FC Pul12 e Traq4 cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas
em Câmaras de Ussing. n=3-9.
4.3.2. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias
brônquicas humanas (HBE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1)
Na tentativa de elucidar os canais envolvidos nos ΔIsc-eq-ATP gerados pela
estimulação do ATP, foi utilizado o inibidor de CaCCinh-AO1 (AO1 – 40µM) nas células
HBE e HTE dos pacientes controle Pul12 e Traq4 e paciente FC Pul3, Pul4 e Pul11. Os
valores de ΔIsc-eq-ATP das células de todos esses pacientes, com exceção da Traq4, foram
estatisticamente inibidas pelo AO1 (Fig. 44). As células HBE do paciente Pul3 e células HTE
do paciente Traq4 foram estimuladas primeiro pelo ATP, depois pelo AO1 seguido pelo ATP
+ AO1 e novamente pelo ATP, com “lavagens” (Ringer + Amilorida) de 15 minutos entres as
aplicações do ATP, e demonstraram que, apesar dos ΔIsc-eq-ATP serem menores para cada
aplicação adicional do ATP, isso não interferiu nas análises da inibição dessas correntes pelo
AO1 (Fig. 45). As células HBE dos demais pacientes, após essa comprovação, foram
estimuladas pelo AO1, seguido pelo ATP + AO1, e após 15 minutos de lavagem, foi aplicado
o ATP novamente.
90
Figura 44. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em
células primárias epiteliais humanas brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes FC Pul3, Pul4 e Pul11 e
não FC Pul12 e Traq4 cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing.
n=6-18. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05).
Figura 45. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) em três aplicações de ATP (1: preto; +AO1: cinza claro; 2: cinza
escuro) e da sua inibição pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em células primárias epiteliais
humanas A. brônquicas (HBE) do paciente FC Pul3 e B. traqueias do paciente não FC Traq4 cultivadas em
filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=12-18. *,** Diferente
significativamente pelo teste estatístico T de student unicaudal (p<0,05).
4.4. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais nasais humanas
(HNE) de pacientes FC e não FC.
Os mesmos protocolos de ativação dos ΔIsc-eq-ATP aplicado nas células HBE foram
aplicados nas células HNE. Os ΔIsc-eq-ATP, de pico máximo, foram bem variáveis entre os
pacientes, tendo o paciente não FC PX03 (wt/wt – com muco sobre as células*) os maiores
ΔIsc-eq-ATP e o P16 (F508del/F508del) os menores ΔIsc-eq-ATP. Dentre os pacientes
F508del/F508del o PX01 foi o que apresentou maiores ΔIsc-eq-ATP. Curiosamente o paciente
P17 (F508del/ c.1584+18672 bp A>G) apresentou ΔIsc-eq-ATP negativas, o que não foi
observado em nenhum dos outros pacientes, inclusive para outro paciente com a mesma
mutação de CFTR (P10), apesar de ter ocorrido com as células traqueias da Traq4 (Fig. 46).
Os ΔIsc-eq-ATP das células HNE dos pacientes P30 (wt/wt), P03 (F508del/F508del), P18, P19 e
91
P25 (F508del/F508del) foram quantificados na segunda aplicação de ATP, após a análise da
inibição dos ΔIsc-eq-ATP pelo inibidor AO1 (40µM).
Figura 46. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de pacientes
não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=3-10.
4.4.1. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias
nasais humanas (HNE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-809
na CFTR.
Células HNE de todos os pacientes FC e não FC incubados com DMSO (0,05%)
ou VX-809 (3µM) foram estimuladas pelo ATP, foram analisados os ΔIsc-eq-ATP e tiveram
ativações bem variáveis entre os pacientes, como citado anteriormente. Entretanto a ação do
corretor da CFTR, o VX-809, não demonstrou efeito sobre essa resposta à estimulação do
ATP, pois os ΔIsc-eq-ATP dos pacientes não apresentaram diferenças dos ΔIsc-eq-ATP entre os
grupos DMSO e VX-809, demonstrando os mesmos achados das células HBE (Fig. 47, 48). O
paciente P17, que apresentou ΔIsc-eq-ATP negativas, teve diferença significativa, nos ΔIsc-eq-ATP,
na comparação entre as incubações com DMSO ou VX-809 (Fig. 48).
92
Figura 47. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) em relação à incubação com DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR
VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos pacientes controles P02 e P30
(wt/wt), controle heterozigoto PX02 (wt/F508del) e pacientes FC P03 (F508del/R334W), P06 (G542X/I618T),
P10 e P17 (F508del/ F508del/ c.1584+18672 bp A>G) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e
analisadas em Câmaras de Ussing. n=2-4. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student
bicaudal (p<0,05).
Figura 48. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) em relação à incubação com DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR
VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos pacientes FC F508del/F508del,
cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=2-6.
4.4.2. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias
nasais humanas (HNE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1).
Nas células HNE também foi aplicado o inibidor AO1 (40µM), da mesma forma
que foi aplicado nas células HBE. As células HNE dos pacientes controle (P30), controle
93
heterozigoto (PX02), FC F508del/F508del (PX01, P18, P19 e P25) e FC F508del/R334W
tiveram seus ΔIsc-eq-ATP inibidos estatisticamente pelo AO1 (Fig. 49). As células HNE dos
pacientes PX01 e PX02 foram estimuladas primeiro pelo ATP, depois pelo AO1 seguido pelo
ATP + AO1 e novamente pelo ATP, com “lavagens” (Ringer + Amilorida) de 15 minutos
entres as aplicações do ATP, e demonstraram que, apesar dos ΔIsc-eq-ATP serem menores para
cada aplicação adicional do ATP, isso não interferiu na inibição dessas correntes pelo AO1,
como realizado nas células HBE (Fig. 50). Os demais pacientes, após essa comprovação,
foram estimulados pelo AO1, seguido pelo ATP + AO1, e após 15 minutos de lavagem, foi
aplicado o ATP novamente (Fig. 49). Os outros pacientes não tiveram essa análise incluída no
protocolo.
Figura 49. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em
células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de pacientes não FC e FC (P30: wt / wt; PX02 – wt / F508del;
P03 – F508del / R334W; PX01, P18, P19 e P25: F508del / F508del) cultivadas em filtros Corning® Costar®
Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-8. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de
student bicaudal (p<0,05).
94
Figura 50. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) e de sua inibição pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em
células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) do A. paciente não FC heterozigoto (PX02 – wt / F508del) e
B. do paciente FC (PX01: F508del / F508del) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em
Câmaras de Ussing. n=6. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student (p<0,05).
4.4.3. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias
nasais humanas (HNE) diminuem após múltiplas aplicações
Foi testada a aplicação do ATP por quatro vezes, com lavagens de 15 minutos em
cada aplicação (Ringer + Amil) nas células HNE nos pacientes P02 (wt /wt), P08, P09, P12,
P14, P15, P16 e P20 (F508del / F508del) e os ΔIsc-eq-ATP demonstraram perder a ação dessas
ativações com múltiplas aplicações, sendo sempre a primeira aplicação de ATP gerado os
maiores ΔIsc-eq-ATP. Entretanto essas ativações foram variáveis entre as células HNE dos
pacientes, sendo o P16 o único que não demonstrou diferença estatística nos ΔIsc-eq-ATP da
primeira e a quarta aplicação do ATP e os pacientes P02, P08, P09, P12 e P15 tiveram os ΔIsc-
eq-ATP da primeira aplicação maiores significativamente entre as outras três aplicações (Fig.
51).
95
Figura 51. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm
2) de quatro aplicações de ATP (100µM), com lavagens de 15min entre
cada aplicação, em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) do paciente não FC (P02 – wt / wt) e sete
pacientes FC F508del / F508del (P08, P09, P12, P14, P15, P16 e P20) cultivadas em filtros Corning® Costar®
Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-8. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico
T de student unicaudal (p<0,05).
96
5. Discussão
5.1. Análise e Interpretação dos experimentos em Câmara de Ussing
Para evitar variações das respostas aos fármacos e compostos em células HBE e
HNE, os experimentos foram padronizados de maneira rigorosa e criteriosa, sendo as células
avaliadas na mesma passagem (1) e mostrando valores de TEER e Rte similares. Em contraste
com o presente trabalho estudos de outros grupos utilizaram gradientes de concentrações de
cloreto (Awatade et al., 2014; Pranke et al., 2017). Ou seja, a solução tampão de Ringer na
região apical teve concentrações de Cl- (0 ou ~30mM) menores em relação à região
basolateral, concentrações normais de Cl- (~145mM), criando assim um gradiente de
concentração, forçando o transporte de Cl- da região basolateral para a região apical. Este
protocolo é utilizado para melhorar as análises dos ΔIsc-eq, tendo correntes maiores, e
facilitando a interpretação dos resultados, mesmo que ocorra uma ativação de CFTR muito
baixa é possível analisa-la, porém essa atividade pode fornecer resultados equivocados. Desta
forma, o nosso grupo entende que essas medições, com gradiente de concentrações de Cl-, não
corresponde ao que acontece na fisiologia do paciente, e assim, neste estudo, foi utilizado
concentrações de Cl- simétricas nas regiões apical e basolateral (Strug et al., 2016).
5.2. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em
células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE).
Dos cinco pulmões analisados, o Pul3 não teve uma genética esclarecida, sendo
necessária à busca futura por grandes inserções ou deleções no gene CFTR para definir a
mutação (Athanazio, et al., 2017; De Boeck, et al., 2017; Faria, et al., 2017 National
Guideline Alliance (UK), 2017), entretanto, pelas analises de função de CFTR nas células
HBE, as mutações desse paciente devem pertencer as classe i ou vii, pois não demonstraram
funções de CFTR, tanto basais como na presença dos fármacos VX-809 e/ou VX-770 (Fig.
16, Tabela 3) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Bosch & De
Boeck, 2016; Mijnders, et al. 2017; Boeck & Davies, 2017; Zainal Abidin, et al., 2017). Já a
analise do Pul4 forneceu o achado de uma mutação em um alelo, c.1010T>A (p.Phe337Tyr) /
?, no outro, como no caso do Pul3, necessita-se fazer a busca por grandes inserções ou
deleções no gene CFTR. As análises de função de CFTR nas células HBE desse paciente,
97
demonstraram ter um função basal de 10,38%, sendo resgatado pelo VX-809 em mais de 5%
de função, com isso esse paciente se beneficiaria na utilização do Lumacaftor®
(Fig. 17,
Tabela 3) (Sousa et al., 2012; Cutting, 2015; Pranke et al., 2017). Ainda não foram
encontrados estudos demonstrando a função dessa mutação, bem como não está inserida no
banco de dados da CFTR2 (2018), sendo muito interessante a busca por informações dessa
mutação, que seriam de grande ajuda para o paciente.
Já o Pul5 teve a sua genética esclarecida, F508del / c.1234_1238delGCAAA
(p.Ala412Thrfs), mas também não foram encontrados estudos demonstrando a função dessa
mutação, bem como também não está inserida no banco de dados da CFTR2 (2018). Porém
pelo nosso estudo, foi demonstrado que essa mutação, p.Ala412Thrfs pareada com F508del,
teve uma potencialização grande da função da CFTR, que quando incubado com o VX-809 e
potencializado com VX-770 a função de CFTR chegou a níveis normais, 123,81% (±57,36), e
na presença apenas do VX-770 uma potencialização de 49,55% (±2,83), evidenciando
claramente que esse paciente seria beneficiado pelo uso Ivacaftor® ou Orkambi
® (Fig. 18,
Tabela 3) (Ramsey, et al., 2011; Harrison, et al., 2013).
No sequenciamento do CFTR para o Pul11, apenas foi encontrado a mutação
F508del em um alelo, no outro não teve resultados. Como demonstrado por muitos grupos, à
mutação F508del apresenta um função basal, nas células HBE do Pul11 foi de 4,72% (±0,43),
e o VX-809 tem efeito na correção da função da CFTR nessa mutação (8,23% ±1,34), bem
como o VX-809 + VX-770 (8,82% ±0,47). A função de CFTR nas células HBE deste paciente
não alcançou os 10% de funções do controle, com isso, para o uso dos fármacos por esse
paciente tem que ser aplicada um investigação mais ampla, uma vez que o ganho na melhora
do fenótipo pode ser mínimo ou nulo, o que pode não compensar pelos efeitos adversos dos
medicamentos. Por outro lado, ele poderia ter pequenos benefícios no uso do Lumacaftor® ou
Orkambi®, porque sua função de CFTR dobrou com a utilização do VX-809 e VX-809 + VX-
770 (Fig. 19, Tabela 3) (Van Goor, et al., 2011; Awatade, et al., 2015; Wainwright, et al.
2015; Pranke et al., 2017)
O Pul12, por ser originado de um paciente não FC, com outra doença pulmonar
grave, discinesia ciliar, foi o nosso controle de função de CFTR (100%). Curiosamente, as
células HTE do Traq4 tiveram funções basais de CFTR bem próximas ao Pul12 (102,79%
±34,12), demonstrando que essas células, oriundas do doador do pulmão para ser
transplantado, servem como células de controles para estudos de função da CFTR, mesmo
sendo oriundas de regiões fisiologicamente diferentes (Fig. 20, 23, Tabela 3).
98
5.3. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em
células primárias epiteliais nasais humanas (HNE).
Foi analisada a função da CFTR em células HNE de 23 pacientes. Os quatro
pacientes não FC (wt / wt – PX03, PX04, P02 e P30) mostraram ter uma função de CFTR,
através da análise dos ΔIsc-eq-FSK, superiores em comparação com todos os pacientes FC e
pacientes não FC portadores (wt / F508del) (Tabela 6). No cultivo das células HNE dos
pacientes PX03, PX04 e PX05, foi observada a presença de muco sobre a camada de células
HNE nos filtros (Fig. 25). Não se sabe se realmente foi por causa desse fator, mas nessas
células, os ΔIsc-eq-FSK foram altas, principalmente no PX03 (19,323 ±3,095), que foram
significativamente maiores comparadas com os ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos PX04 (6,483
±1,091), P02 (4,522 ±0,417) e P30 (3,984 ±0,452), e os ΔIsc-eq-FSK do PX04 foram maiores,
mas não significativas, na comparação com os ΔIsc-eq-FSK dos P02 e P30. As análises das
células HNE desses pacientes (PX03 e PX04) não foram comparadas com as demais células
HNE dos outros pacientes analisados, incluindo o PX05, que também teve a presença de
muco. A presença do muco nesses filtros não foi esclarecida, uma vez que não foi observado
este fato novamente nas demais culturas de células HNE.
Nos demais pacientes foram analisadas os ΔIsc-eq-FSK na presença do veículo
DMSO (0,05%) e dos fármacos VX-770 (10µM), VX-809 (3µM) e VX-809+VX-770. Nos
pacientes controles (wt/wt) P02 e P30, o VX-809 não teve efeito positivo nos ΔIsc-eq-FSK, pelo
contrário, reduziu levemente essas correntes (Tabela 6), principalmente na aplicação do VX-
770. Isso ocorre, provavelmente, porque pacientes não FC tem uma função de CFTR normal,
que com a estimulação da FSK, em nível de saturação para obter o máximo de função da
proteína possível, ocorre uma abertura total dos canais CFTR, não podendo gerar mais
correntes pelos fármacos moduladores, porque são proteínas normais, e a interação dos
fármacos não ocorre, ou ao contrário, pode competir com as proteínas, diminuindo levemente
sua expressão (Awatade, et al., 2014; Marigowda, et al., 2017; Molinski, et al., 2017).
Os nossos dados demonstraram que as células HNE dos pacientes controles P02 e
P30 (wt /wt), quando combinados, tiveram ΔIsc-eq-FSK estatisticamente superiores em relação à
combinação das análises nas células HNE dos 12 pacientes FC clássicos (F508del / F508del).
Também tiveram uma função de CFTR de 10% em relação aos controles, o que corroboram
outros estudos in vitro realizados para essas análises (Fig 26, 27, Tabela 7) (Awatade et al.,
99
2014; Strug et al., 2016; Pranke et al., 2017). Outro dado interessante foi observado que os
ΔIsc-eq-FSK nas células HNE dos pacientes heterozigotos (wt / F508del), apresentaram uma
função de CFTR próximo de 50% dos controles (wt / wt), dados que corroboram o estudo em
células HNE (Fig. 26, Tabela 7) (Pranke et al., 2017). Esses dados estão de acordo com os
achados de Strug et al., (2016) e Pranke et al., (2017), em células HBE e HNE, demonstrando,
que as células HNE são uma ferramenta robusta para estudo na FC e testes a novas drogas
moduladoras da CFTR.
Atualmente, estudos dos fármacos moduladores da CFTR vêm demonstrando
funções diferentes entre pacientes FC, apresentando efeitos positivos ou não, independente
das mutações do CFTR serem as mesmas, dados que foram achados no nosso estudo (Fig. 28,
29, Tabela 6). Na análise personalizada da ação dos fármacos moduladores da CFTR nas
células HNE dos pacientes FC os ΔIsc-eq-FSK gerados foram distintas para cada paciente,
entretanto todos apresentaram um aumento da função da CFTR incubados com o VX-809,
com exceção dos pacientes P18 e P25 que se mantiveram praticamente inalterados e dos
pacientes P20, P25 e P17 (Fig. 28) (Awatade et al., 2014; Amaral MD, 2015; Bell et al.,
2015; Cutting, 2015; Beekman, 2016; De Boeck & Amaral, 2016; Strug et al., 2016; Marson
et al., 2017; Pranke et al., 2017).
O tratamento com o VX-809 induzido melhora na função da CFTR, nas células
HNE dos pacientes P09 (F508del/F508del), P12 (F508del/F508del), P14 (F508del/F508del),
P16 (F508del/F508del), P25 (F508del/F508del), e P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G)
apresentando funções de CFTR, iguais ou maiores do que os 10% do controle (wt / wt) (Fig.
29A). O VX-770 nas células HNE dos pacientes P03 (F508del/R334W), P06
(F508del/I618T), P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G), P17 (F508del/c.1584+18672 bp
A>G) e P25(F508del/F508del) induziu melhoras na função da CFTR acima dos 10% do
controle. Adicionalmente, os pacientes P14 (F508del/F508del), P16 (F508del/F508del), P18
(F508del/F508del), P23 (F508del/F508del), P03 (F508del/R334W), P06 (F508del/I618T) e
P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G) mostraram melhoras na função da CFTR na
combinação do tratamento VX-809 e VX-770 (Fig. 29C).
Essas análises sugerem que esses pacientes avaliados, possivelmente, teriam
benefícios no uso do Lumacaftor® (VX-809), Ivacaftor
® (VX-809) + Lumacaftor® (VX-770)
ou Orkambi® (VX-809 + VX-770), pois foi demonstrado que esses pacientes atingiram um
resgate de função da CFTR acima de 10% da função da proteína normal, podendo obter
melhoras nos fenótipos FC, revertendo ou postergando, principalmente, a doença pulmonar,
100
dependendo do estágio da doença e do início da terapia (Sousa et al., 2012; Cutting, 2015;
Pranke et al., 2017). Os demais pacientes, por não apresentarem uma melhora significativa, ao
ponto de alcançar uma função de 10% do normal, seria recomendada uma investigação mais
ampla para utilização desses fármacos (Lumacaftor®, Ivacaftor
® e Orkambi
®), uma vez que o
ganho na melhora do fenótipo pode ser mínimo ou nulo, não justificaria o seu emprego de
efeitos adversos que esses medicamentos apresentam (Wainwright et al., 2015; Beekman,
2016, Veit et al., 2016; Pranke, et al., 2017).
5.4. Modulação da função de CFTR e da ação dos fármacos VX-809 e VX-770 por
polimorfismos em genes associados à FC em células primárias epiteliais nasais humanas
(HNE).
Na tentativa de elucidar as funções e respostas aos fármacos da CFTR, em
pacientes com FC e mesmo genótipo de CFTR, estudos tem avaliado genes modificadores e
sua expressão / variabilidade, e estas podem estar relacionadas à clínica da FC ou expressão
de CFTR (Wright et al., 2006; Guillot et al., 2014). A análise de variantes, em genes
modificadores, que possam modular a função da CFTR e sua expressão no epitélio dos
diferentes órgãos na FC deve ser ressaltada (Cutting et al., 2015), e neste estudo foi
demonstrada a ação de duas variantes, que demonstraram intervir na variabilidade clínica da
FC, e que são atuantes na expressão de canais iônicos alternativos (Pereira et al., 2017).
No presente estudo, observarmos que o rs7512462 (SLC26A9) modula a função da
proteína CFTR nas células HNE de pacientes F508del/F508del. A variante rs7512462*C teve
uma modulação positiva (maior função), e a rs7512462*T, menor modulação na função final
de CFTR (Fig. 32). Pacientes que apresentaram os genótipos rs7512462*CT ou
rs7512462*CC tiveram função da CFTR e resposta ao VX-809 e VX-770, nas células HNE,
maiores do que os com rs7512462*TT (Fig. 30, 31, Tabela 8). Os dados corroboram com os
achados de Strug et al. (2016), em células HBE, demonstrando, que as células HNE são uma
ferramenta para estudo na função da CFTR, análises de novas drogas e estudos de
polimorfismos de outros genes moduladores da FC. Além disso, pacientes com genótipo CT e
o agrupamento CT + CC, para o rs7512462, tiveram funções da CFTR totais, no uso de VX-
809 e VX-770, superior a 10% de função das células HNE do wt / wt. Os achados do estudo
indicam que os pacientes avaliados, possivelmente, teriam benefícios no uso de VX-809 e
VX-770 (Lumacaftor®
e/ou Orkambi®), com melhora do fenótipo da doença, principalmente
101
pulmonar. E seria indicativo, que o aumento da expressão de CFTR possa ser um desfecho
que leve o paciente do fenótipo clássico para o não clássico da doença (função da CFTR entre
os 10-60%) – revertendo ou postergando, principalmente, a doença pulmonar, dependendo do
estágio inicial do início da terapia (Sousa et al., 2012; Pranke et al., 2017).
O SNP rs3788766 (SLC6A14) modulou a função da CFTR nas HNE dos
pacientes, sendo que o rs3788766*CC apresentou funções basais maiores do que os demais
genótipos. No uso do VX-809, o rs3788766*CC atingiu uma função superior a 10% da função
normal da CFTR, e na combinação do VX-809 e VX-770, o rs3788766*CC e o
rs3788766*TT tiveram função superior a 10% (Fig. 33, 34, Tabela 8). Como demonstrado
por Di Paola, et al., (2017) o gene SLC6A14 está relacionado com a adesão da P. aeruginosa,
com isso a função da CFTR basal nas células HNE desses pacientes, demonstrou ser maior
nos pacientes com o SNP rs3788766*CC em comparação com o rs3788766*TT, sendo quase
significativo estatisticamente (p = 0,050344) (Fig. 33, 34). Entretanto esse SNP não
demonstrou diferença na função alcançada em ambos os alelos C ou T no resgate de função
pelos fármacos, provavelmente por que esse SNP não interfere na ação dos fármacos na
correção da função de CFTR, mas sim na função da CFTR basal, pela modulação da adesão
do patógeno P. aeruginosa (Fig. 35) (Stanton, et al., 2015).
As análises demonstram, que em pacientes F508del/F508del, o rs3788766*CC e
rs3788766*TT, irão obter melhores resultados ao tratamento com o Lumacaftor®
(rs3788766*CC) e Orkambi® (rs3788766*CC e rs3788766*TT), com possível melhora
fenotípica. Pacientes com o SNP rs3788766*TT podem ser favorecidos, para uma
recuperação basal da função de CFTR, analisada para o SNP rs3788766*CC, pelo uso dos
fármacos VX-809 e VX-770, pois recentemente foi demonstrado que esses fármacos
diminuem as respostas inflamatórias contra a P. aeruginosa em células HBE de pacientes FC
(Ruffin, et al., 2017).
Nossos achados, são pioneiros ao demonstrar que a presença de numerosos SNPs,
em diferentes genes, possa modular a CFTR, quando somados. Dessa forma, os efeitos
cumulativos das variantes ocasionam o efeito de resposta individual, como observado para os
SNPs rs7512462*C (SLC26A9) e rs3788766*C (SLC6A14), na função da CFTR basal e no
uso de VX-770, VX-809 e VX-809 + VX-770 (Fig. 36, 37, Tabela 9).
102
5.5. Função do ENaC nas células HNE de pacientes FC e não FC
Para a análise da função da CFTR o ENaC é inibido com a Amilorida (20µM), e a
inibição foi analisada medindo-se o ΔIsc-eq-amil. Essas análises demonstraram que os pacientes
FC e não FC controles (wt / wt) tiveram as maiores funções de ENaC, e não foram diferentes
estatisticamente entre elas, fato que contrasta com os resultados do estudo de Pranke, et al.,
(2017). Eles demonstraram que a função do ENaC é maior em pacientes FC, o que seria mais
previsível, pela interação dos canais CFTR e ENaC (Tarran et al., 2001; Pezzulo et al., 2012;
Veit, et al., 2015; De Boeck & Davies, 2017). Entretanto os achados nos pacientes não FC
carreadores (wt / F508del) mostraram os menores valores entre todos os pacientes estudados,
concordando com o estudo de Pranke, et al., (2017) (Fig. 40).
Ainda foi analisado se atividade do ENaC diminuía durante a correção da CFTR
pelo VX-809, e nossas análises sugerem a possibilidade de avaliar uma diminuição na função
do ENaC pelo VX-809, pois quase todas as células HNE dos pacientes FC tiveram um ΔIsc-eq-
amil reduzido com o VX-809, sendo significativo para os PX01 e P19 (Fig. 39, Tabela 10).
Nos pacientes não FC controles (wt / wt), o P02 teve um aumento dos ΔIsc-eq-amil com o VX-
809, o P30 uma diminuição e o paciente não FC heterozigoto (wt / F508del) PX02 uma
diminuição (Fig. 39, Tabela 10). Esses dados demonstram que a atividade do ENaC é muito
variável em relação à correção da CFTR pelos seus fármacos moduladores.
Em resumo, é possível analisar a atividade do ENaC em células HNE de pacientes
FC, e caso se desenvolva um fármacos em potencial para corrigir essa superatividade da
ENaC em tecidos FC, eles podem ser testados com o uso desse método (Fig 7D) (Mall &
Gallieta, 2015).
5.6. Análise da função de TMEM16A nas células HNE e HBE de
pacientes não FC e FC
Para a análise da atividade da TMEM16A, foi utilizado o ATP como ativador
dessas correntes e para comprovação que elas são deste canal, usou-se o inibidor específico de
TMEM16s o CaCC-inh AO1 (40µM) (Cabrita, et al., 2017; Benedetto, et al., 2017).
Nas células HNE e HBE os ΔIsc-eq-ATP tiveram ativações distintas dependendo do
grupo avaliado (Fig. 42, 46), não demonstrando efeito nessas correntes com o corretor da
103
CFTR o VX-809 (Fig. 43, 47, 48). Ao aplicar o inibidor AO1 (40 µM), os ΔIsc-eq-ATP foram
significativamente inibidos nas células HNE e HBE dos pacientes analisados (Fig. 44, 49).
Foi demonstrada uma diminuição dos Isc-eq-ATP após serem estimulados pelo ATP
múltiplas vezes em células HNE, sendo a primeira ativação sempre maior que as demais (Fig.
52). Não foram encontrados motivos para essa ação, entretanto, traz algumas sugestões
fisiológicas. O TMEM16A é ativado pelo Ca2+
que o ATP estimulou via receptores
purinérgicos transmembranares (P2Y e P2X). O P2Y2 é o principal receptor purinérigico
nessas células e sua ativação sequencial e repetitiva com ATP gera uma desensibilização do
receptor, assim liberando menos Ca2+
intracelular e como consequência, resultando em menor
ativação da TMEM16A (Gabl, et al., 2015; Xing, et al., 2017) (Fig. 52).
Figura 52. Cascata de ativação da TMEM16 em células epiteliais. Ativação dos receptores purinérgicos
membranares ativados pelo ATP, que ativam a fosfolipase C (PLC), ativando o PIP2 que via IP3, libera cálcio
(Ca2+
) intracelular, estocados no Reticulo endoplasmático, ativando assim o TMEM16A (Modificado de: Guo, et
al., 2015).
Outra hipótese é do esgotamento de Ca2+
no RE, sendo necessário um tempo
maior para o RE recrutar Ca2+
novamente, ou ainda outros mecanismos que não estão
envolvidos em nossos experimentos (Tojyo, et al., 2008; Thillaiappan, et al., 2017).
Esses dados demonstram que a TMEM16A está presente e é funcional nessas células,
e estudos sobre canais alternativos de cloreto relacionados à modulação da CFTR ou melhora
na secreção de Cl- podem ser realizados utilizando esta metodologia (Li, et al., 2017; Mall &
Gallieta, 2015). Contudo, mais pesquisas devem ser desenvolvidas nessas células e em relação
à ativação da TMEM16A. Assim como, a realização de investigações sobre a hipótese da
TMEM16A e a CFTR estarem co-localizadas, e apresenta atividades correlacionadas, e ainda,
descobrir ativadores mais específicos da TMEM16A (Li, et al., 2017; Mall & Gallieta, 2015).
Além disso, com esses métodos, ainda é possível investigar se a ativação da
CFTR e da TMEM16A está correlacionada, utilizando ambos os inibidores da CFTR
(CFTRinh 172) e das TMEM16 (AO1), separadamente, para inibir as correntes geradas pela
104
FSK e pelo ATP, em pacientes com função de CFTR. Assim poderá ser possível avaliar se a
ação da CFTR e da TMEM16A estão correlacionadas.
5.7. Relevância do Trabalho
Os nossos achados corroboram a prática da medicina personalizada, tendo como
modelo a FC e uso de fármacos moduladores da CFTR pode ser aplicada nas células HBE e
HNE, para indicar o melhor fármaco (ou combinação de fármacos), que demonstre o melhor
resgate de função da CFTR em determinado paciente (Clancy et al., 2012; Boyle et al., 2014;
Wainwright et al., 2015; Beekman, 2016, Veit et al., 2016; Pranke et al., 2017).
Devido à viabilidade técnica observada, o nosso protocolo pode ser de relevância
em estudos de modulação da função de CFTR, testes de novos fármacos moduladores da
CFTR, avaliação de canais alternativos de Cl- na tentativa de suprir a necessidade deste ânion
no epitélio de pacientes FC e estudo de polimorfismos em genes moduladores da CFTR ou de
agente relacionados à FC.
Ressalta-se a importância em se realizar estudos com essa temática e o uso de
outros fármacos na modulação da CFTR em outras mutações do CFTR, raras e órfãs,
existentes em nossa população miscigenada brasileira. Sendo assim, as células HNE são uma
ferramenta útil para a análise da função e resgate da CFTR pelos fármacos moduladores,
tendo resultado similar às células HBE, com a facilidade de coleta de diferentes pacientes e
em maior escala (Pranke et al., 2017).
O desenvolvimento de ferramentas de triagem e biomarcadores, menos invasivos
aos pacientes, capazes de prever a eficácia de fármacos de forma individualizada, é
imprescindível para uma avaliação personalizada. A realização de estudos in vitro para a
verificação da resposta a novas propostas terapêuticas para a FC, antes da aplicação nos
mesmos, é importante em razão do elevado custo e de possíveis efeitos colaterais, o que torna
as células HNE uma ferramenta adequada (Amaral & Balch, 2015; Amaral, 2015; Beekman,
2016; Cholon & Gentzsch, 2017; Marson et al., 2017; Paranjape & Mogayzel, 2017).
Com isso, em um futuro próximo, podemos aplicar a medicina personalizada /
precisa nos pacientes atendidos no ambulatório de FC do Hospital de Clinicas da Unicamp,
através das técnicas de análise dos fármacos em células HNE e/ou HBE dos pacientes com FC
que tenham diferentes mutações e genes modificadores (polimorfismos) da CFTR / FC. Tais
105
informações podem mensurar qual fármaco, ou combinação de fármacos, podem fazer uso e
obter a melhor resposta individual a esses pacientes.
5.8. Perspectivas
Perspectivas para avaliar a resposta à medicina personalizadas / precisão na FC,
incluem: (i) validar os achados em outros genótipos de CFTR, heterozigotos F508del, por
incluir um grande número de pacientes com possível efeito benéfico ao uso da droga; (ii)
validar os achados utilizando outras drogas moduladoras do CFTR, como exemplo o VX-661
(Tezacaftor®
), nos pacientes F508del/F508del ; (iii) validar os achados para células HNE em
outros biomarcadores, incluindo, organoides intestinais, nasoesferoides e esferoides
brônquicos, o que pode refletir a especificidade de cada órgão afetado na FC que apresenta
um fenótipo amplo e complexo; (iv) incluir múltiplos genes modificadores na análise da
função de CFTR e resposta a drogas, principalmente, associados aos canais iônicos
alternativos, tendo como base estudos de associação por abordagem genoma ampla associação
(GWAS); (v) buscar os mecanismos pelos quais alguns pacientes com FC, apresentam função
residual da proteína e incluir esses genes, e seus respectivos expressos, como possíveis
mecanismos para correção da função de CFTR em pacientes com a mesma classe e/ou
genótipo de CFTR; (vi) abordar outras mutações de CFTR, incluindo as diferentes classes, em
suas raridades para cada mutação; (vii) validar os achados laboratoriais com o uso desses
fármacos por pacientes com FC, longitudinalmente, tendo a aprovação após os experimentos
em HNE e/ou HBE.
5.9. Dificuldades na realização do estudo
As técnicas do cultivo de células primárias humanas são muito delicadas e
envolvem muita dedicação, trabalho e uma equipe multidisciplinar, para assim obter um
material viável, sem contaminação e reproduzível, que apresenta muitas etapas: (i) coleta dos
materiais biológicos, que devem ser feitos por pessoas especializadas; (ii) transporte desse
material em local adequado para minimizar perdas e contaminações; (iii) aplicação das
metodologias de isolamento e extração das células, que são complexas, detalhadas e
envolvem uma gama alta de equipamentos, materiais e compostos; (iv) o tempo gasto na
manipulação dos matérias biológicos, desde a coleta do material até a obtenção das células;
106
(v) e finalmente, o cultivo das células, que necessita de uma sala de cultura padronizada,
meios de culturas especializados, tempo para o crescimento e diferenciação das células, para
assim obter células viáveis e compatíveis para a realização dos experimentos (Yaghi, et al.,
2010; Müller, et al., 2013; Ulm, et al., 2016).
No cultivo de células epiteliais das vias aéreas oriundas de pacientes FC o método
é um tanto complicado, principalmente nas células HBE, pois o isolamento das células é
realizado em lóbulos pulmonares explantados de pacientes com FC que já tinham uma função
pulmonar baixa e com colonizações crônicas por patógenos resistentes, para assim haver a
necessidade de um transplante (Syed, et al., 2016; Burcham, et al., 2017; Cribbs & Beck,
2017; Dupont, 2017; Zeriouh, et al., 2017). Na aplicação do método é necessária a utilização
de coquetéis de antibióticos em alta concertações, e que muitas vezes não são o suficiente
para erradicar os patógenos resistentes presentes sem prejudicar o isolamento, crescimento e
viabilidade celular (Randell, et al., 2011).
Na aplicação do método de obtenção das células HBE houve sete perdas de
culturas: dois por contaminações que não puderam ser erradicadas pelo coquetel de
antibióticos sem prejudicar a viabilidade celular; dois por problemas na aplicação do
protocolo na etapa de adição de enzimas digestivas (DNase, Protease e Colagenase) nos
tecidos brônquicos (Pul2 – Dissociation Solution) e nas células isoladas (Pul10 – Declump
Solution); um por obtenção de poucas células (Pul7), pois o brônquio isolado estava muito
pequeno, com isso obtivemos menos células, sendo que, na expansão das células HBE em
cultura com o BEGM as células não cresceram e obtivemos poucas células viáveis, entretanto,
essas ainda foram colocadas em cultura utilizando o protocolo de cultivo das células HNE-
CRC, mas por motivo de manipulação, as células contaminaram durante o crescimento; outros
dois pulmões (Pul 8 e Pul9) as células não aderiram nas placas, por dois motivos solucionados
posteriormente: (i) foi preparada uma nova solução de revestimento, e tivemos problemas
durante o preparo, então uma nova solução foi preparada e assim foi solucionado o problema
para os outros pulmões; (ii) a placa de cultura P-100 acabou (Corning Costar – 430167) e
compramos outras, porém foram compradas de outra marca (Sarstedt – D-51588), o que foi
um erro, pois as células HBE não aderiram ao material destas placas, utilizando o mesmo
protocolo de revestimento. Nos dois pulmões seguintes (Pul11 e Pul12) esses problemas de
revestimento e placas foram solucionados.
Nos pulmões Pul4 e Pul11, durante a cultura das células HBE nas placas de
cultura P-100 com o BEGM, que contém gentamicina e anfotericina, não apresentaram
107
contaminações, no entanto, ao passá-las para os filtros e cultivados com meio ALI, sem a
adição desses dois antibióticos, as células contaminavam. Com isso foi aplicado o método de
cultivo das células HBE-CRC, utilizando o coquetel ATV (anfotericina, tobramicina e
vancomicina). Na primeira semana de co-cultura com os fibroblastos, e essas células HBE
foram analisadas. A aplicação da técnica de CRC em células HBE já foi realizada por outros
grupos, inclusive comparando os resultados entre HNE-CRC e HBE-CRC (Gentzsch, et al.,
2017; Pranke, et al., 2017)
Já nas células HNE, no início nós tivemos muitos problemas com contaminações,
que foram aprimorados com a realização de lavagens com salina (0,09%) na narina dos
pacientes antes da coleta, o acréscimo do coquetel de antibióticos ATV na primeira semana de
cultura, e também a não coleta de células HNE de pacientes com exacerbações ou que
estavam doentes. Apesar da melhora, erradicar 100% as contaminações das culturas de células
é extremamente difícil, pois a variação de patógenos de paciente para pacientes é muito
grande. Ainda um fato observado foi que, no Brasil, por ser um país tropical, a proliferação de
patógenos é maior, com isso a utilização da ATV, na primeira semana de cultura de células
HNE, foi essencial na diminuição de contaminações (Roberts, 2005; Patz, et al., 2005;
Collaco, et al., 2011). Ainda tivemos um problema na fase final de cultura de células HNE, os
fibroblastos descolaram das garrafas T25 em co-cultura, a razão de ter acontecido isso foi à
utilização de FBS (Sigma-Aldrich – F6178) como suplemento no meio, ao invés de NBCS
(Sigma-Aldrich – N4762), pois o NBCS havia acabado e o novo comprado não havia chego a
tempo, assim utilizamos o FBS, pois tínhamos coletas marcadas. Evento solucionado com a
chegada do NBCS.
O principal fator de problemas e perdas da cultura de células foi à utilização de
três salas de cultura de células na realização deste trabalho. Primeiro foi utilizada uma cultura
de células no prédio Centro de Investigação em Pediatria (CIPED – Unicamp), essa não era
muito estéril, e tivemos muitos problemas com contaminações. Passamos a usar outra cultura
de células no laboratório de Genética Humana da FCM, contudo, pela demanda de alunos do
professor coordenador da sala de cultura e pelo alto período de uso da sala por nós, este uso
ficou inviável, e tivemos que trocar de lugar novamente. O terceiro e último local, foi à
utilização de uma cultura de células multiusuário da FCM, disponível para alunos de pós-
graduação, entretanto, por ser multiusuário, alguns alunos de outros projetos utilizavam em
conjunto com a nossa equipe, e contaminações de terceiros acabaram por contaminar nossas
culturas. Com isso, um próximo passo essencial para novos estudos idealizados com base
108
neste trabalho, será a construção e adequação de uma sala de cultura de células do Laboratório
de Fibrose Cística – LAFIC.
109
6. Considerações Finais
6.1. Cultivo de células primárias epiteliais brônquicas (HBE) e nasais (HNE)
humanas
As técnicas de cultivo de células HBE e HNE foram padronizadas no Laboratório
de Fibrose Cística (LAFIC). Apesar dos problemas e perdas de matérias presentes, esses
foram devidamente solucionados.
As células HBE e HNE polarizadas em filtros de membrana porosa são materiais
muito valiosos e de importância para estudos de testes de fármacos moduladores da CFTR e
de outros canais da FC, uma vez que, muitas células HBE podem ser obtidas de uma amostra,
e serem utilizadas em diversos estudos. As células HNE podem ser coletadas mais
rotineiramente com foco em diferentes mutações de CFTR.
6.2. Ação dos fármacos moduladores da CFTR em células HBE e HNE
O nosso estudo, sugere que as análises dos moduladores da CFTR testados, VX-
809 e VX-770, in vitro pela técnica de eletrofisiologia de câmara de Ussing em células HNE e
HBE, podem ser utilizados para a aplicação de uma medicina personalizada em pacientes FC
com diferentes mutações, assim demonstrando se o paciente estudado pode vir a ter maiores
benefícios na utilização de determinado fármaco ou combinações de fármacos.
6.3. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR
em células HBE
A genotipagem desconhecida do Pul3 não elucidou a mutação, contudo, a análise
das células HBE desse paciente demonstrou que a CFTR não tem função e nem é modulada
pelos fármacos.
A mutação p.Phe337Tyr do Pul4 demonstrou ter uma atividade residual da CFTR
basal e uma melhora na utilização do corretor VX-809, com isso, pacientes com essa mutação
podem ser beneficiados com o uso do Lumacaftor®.
A mutação F508del / p.Ala412Thrfs do Pul5 demonstrou ter uma modificação
positiva para o potenciador VX-770 sozinho e em combinação com o corretor VX-809, com
110
isso pacientes com essa mutação podem ser beneficiados com o uso dos fármacos Ivacaftor®
e/ou Orkambi®.
A mutação F508del / desconhecida do Pul11 demonstrou ter uma modificação
positiva para o corretor VX-809 sozinho e em combinação com o potenciador VX-770, com
isso pacientes com essa mutação talvez possam ser beneficiados com o uso dos fármacos
Ivacaftor® e/ou Orkambi
®.
6.4. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR
em células HNE
Foi demonstrado que células HNE de pacientes F508del/F508del apresentam
funções da CFTR e modulações pelos fármacos VX-809 e VX-770 variadas, e que nem todos
os pacientes teriam efeitos benéficos com a utilização do Orkambi®.
A mutação F508del / R334W do P03 demonstrou ter uma modificação positiva
para o potenciador VX-770 ou o corretor VX-809 sozinhos, mas teve uma melhora expressiva
na combinação dos dois (VX-809 + VX-770), com isso, pacientes com essa mutação podem
ser beneficiados com o uso do fármaco Orkambi®.
A mutação G542X/ I618T do P06 demonstrou ter uma modificação positiva para
o potenciador VX-770 sozinho e em combinação com o corretor VX-809, com isso pacientes
com essa mutação podem ser beneficiados com o uso dos fármacos Ivacaftor® e/ou Orkambi
®.
Mais estudos devem ser feitos para a mutação F508del/ c.1584+18672 bp A>G,
pois um paciente P10 demonstrou uma modulação positiva para os fármacos VX-809 + VX-
770 porém outro paciente com a mesma mutação não demonstrou essa mesma modulação.
6.5. Modulação de função da CFTR por polimorfismo em genes moduladores do
fenótipo da FC
O polimorfismo rs7512462 (SLC26A9) demonstrou modular positivamente a
função da CFTR nas células HNE de pacientes FC homozigotos para a F508del, na presença
do alelo C, bem como uma melhora no resgate de função da CFTR pelos fármacos VX-809 e
VX-770. Já o polimorfismo rs3788766 (SLC6A14) parece modular positivamente a função
basal da CFTR nas células HNE de pacientes FC homozigotos para a F508del, na presença do
111
alelo C. E a combinação dos dois polimorfismos, com a presença do alelo C em ambos,
demonstrou modular positivamente as funções da CFTR basal.
6.6. Avaliação da função da TMEM16A em células HBE e HNE
A função da TMEM16A em células HNE e HBE foi demonstrada pela ativação e
inibição de suas correntes geradas pelo ATP e AO1 respectivamente. Portanto as técnicas
padronizadas nesse trabalho podem ser utilizadas para estudos mais detalhados desse canal e,
ainda, de outros canais alternativos de cloreto, visando terapias alternativas para a FC.
112
7. Conclusões
A função da CFTR e ação dos fármacos moduladores da CFTR avaliados em células
HBE e HNE demonstrou ser viável para análise individual dos pacientes (personalizada);
A função da CFTR avaliada em células HBE e HNE demonstrou ser variável em
diferentes e mesmas mutações do CFTR;
Os fármacos VX-809 e VX-770 apresentaram modulações positivas e variáveis na
função da CFTR em células HBE e HNE oriundas de diferentes pacientes com diferentes ou
mesmas mutações de CFTR;
A avaliação de polimorfismos em genes que possam modular a função da CFTR é
viável em células HNE;
O SNP rs7512462 no gene SLC26A9 demonstrou modular a função e modulação pelos
fármacos VX-809 e VX-770 da CFTR-F508del;
O SNP rs3788766 no gene SLC6A14 sugere uma interação na função basal da CFTR-
F508del;
A função da TMEM16A como um canal alternativo de cloreto pode ser avaliado em
células HBE e HNE;
A mutação da CFTR e sua modulação pelo VX-809 não interfere na ativação da
TMEM16A em células HBE e HNE.
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of taurolidine in lung transplantation for cystic fibrosis and impact on bacterial colonization.
Eur J Cardiothorac Surg. 2017 Oct 18.
123
9. Apêndice
Traçados originais do protocolo de função da CFTR pela análise de secreção de
Cl- em células primarias epiteliais nasais (HNE) dos pacientes FC e não FC analisados.
Figura 53. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P02
não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM);
Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 54. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P30
não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM);
Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
124
Figura 55. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente
PX02 não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM);
Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 56. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P01
não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina
(FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 57. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente
PX01 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina
(FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
125
Figura 58. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P08
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 59. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P09
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 60. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P12
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
126
Figura 61. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P14
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 62. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P15
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 63. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P16
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
127
Figura 64. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P18
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 65. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P19
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 66. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P20
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
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Figura 67. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P21
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 68. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente 25
FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 69. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente 03
FC (F508del/R334W). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK
2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
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Figura 70. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente 06
FC (G542X/I618T). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM);
Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 71. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente 10
FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM);
Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
Figura 72. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e
teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente 10
FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM);
Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).
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10. ANEXOS
Anexo 1. Certifica de apresentação oral do trabalho em congresso internacional e premiado na 1ª colocação.
Anexo 2. Certifica de apresentação oral do trabalho em congresso nacional.
131
Anexo 3. Certifica de apresentação oral do trabalho em congresso internacional.
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Anexo 4. Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa.
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