“ASPECTOS MOLECULARES DO CHC NA DHGNA:

O QUE SABEMOS?”

José Tadeu Stefano

Laboratório de Gastroenterologia Clínica e Experimental

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

Taxas de Incidência do CHC

Llovet et al., Nature Reviews, 2016

Estimativa de novos casos e de mortes por cânceres nos EUA em 2018

Siegel, Miller, Jemal; CA Cancer J Clin; 2018

O CHC representará 4% dos casos de novos canceres em homens. E será o responsável por 6% dos casos de morte por câncer em homens e 3% em mulheres

GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012. (2012). URL consulted on March 15, 2017: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx.

Incidência do CHC de acordo com a região e sexo

Dyson et al., J Hepatol. 2014

Etiologias das Doenças Hepáticas Associadas ao CHC

Fassio et al., Annals of Hepatology, 2010

Distribuição do CHC na América Latina

www.cancer.org/cancer/liver-cancer/causes-risks-prevention/risk-factors.html (consulted on May 05, 2018)

Fatores de Risco para CHC - Sociedade Americana de Câncer

Gênero

Raça/ etnia

Hepatite viral crônica (B ou C)

Cirrose

Doença hepática gordurosa não alcoólica

Cirrose biliar primária

Doenças metabólicas hereditárias (hemocromatose hereditária)

Alcoolismo

Obesidade

Diabetes tipo 2

Doenças raras:

Aflatoxinas

Cloreto de vinila e Dióxido de tório

Esteroides anabolizantes

Arsênico

Infecção por parasitas (esquistossomose)

Tabaco

Pílulas anticoncepcionais (efeitos pouco claros)

- Tirosinemia

- Deficiência de alfa1-antitripsina

- Porfiria cutânea tardia

- Doenças de armazenamento de glicogênio

- Doença de Wilson

Sobrepeso, Obesidade e Risco para CHC

Rosmorduc & Fartoux, Clin Res Hepatol Gastroenterol. , 2012

Diabetes Mellitus Tipo 2 e Risco para CHC

Rosmorduc & Fartoux, Clin Res Hepatol Gastroenterol., 2012

Risco Relativo de Morte por Câncer na Presença de Sobrepeso e Obesidade

El-Serag HB & Rudolph K L, Gastroenterology, 2007

Fígado Normal

Esteato-hepatite

CHC

OBESIDADE

Acúmulo de lipídios Resistência à

insulina

EROS

Lesão DNA

Resposta Inflamatória

IL-6 TNF

STAT NF-kB

Sinais Oncogênicos

Adipocitocinas

Dieta com alto teor de frutose/lipídios

DesordensEndócrinas

Fatores hereditários

Sedentarismo

Adaptado de: Sun & Karin, Journal of Hepatology, 2011

Toffanin, Friedman, Llovet, Cancer Cell, 2010

PNPLA3TM6SF2

Fatores Metabólicos Implicados na Transição da

DHGNA para o CHC

Agosti, Sabbà, Mazzocca, BBA - Molecular Basis, 2018

AUTOR ANO N POPULAÇÃO ESTUDADA PREVALÊNCIA

Bugianesi et al 2002 641 Cirróticos com CHC 3,6%

Hashimoto et al 2009 382 População com EHNA 8,9%

Takuma et al 2010 445 CHC com tratamento curativo 2,5%

Hai et al 2006 481 CHC ressecado 0,5%

Maeda et al 2008 242 CHC ressecado 0,8%

Kawada et al 2009 1168 CHC ressecado 0,7%

Malik et al 2009 98 Transplantados por CH-EHNA 17%

Chagas et al 2009 394 CHC visto por USG 1,8%

Zoller & Tilg, Metabolism, 2016

Prevalência do CHC na DHGNA

Variabilidade População + Métodos Diagnósticos

Wong, Cheung, Ahmed, Hepatology, 2014 Hernandez-Alejandro et al., World J Gastroenterol. 2012

Diagnósticos de Pacientes Submetidos a Transplante Hepático

Estudo retrospectivo

42 pacientes com CHC (Janeiro 2010 - Dezembro 2012) de 2 centros do Brasil

71% - relacionados à DHGNA e 29% - CC

Idade média: 66 anos

Sexo masculino: 62%

Síndrome Metabólica: 81%

Cirrose estava presente em 83.3% dos casos; (16.7%) 3 pacientes eram F2 e 2 pacientes eram F3

American Journal of Clinical Oncology, 2014

CONCLUSIONS:

The BCLC system is applied in most cases of NAFLD-related HCC cases. Deviation of BCLC is found

more frequently in BCLC C stage patients

Características clínicas dos pacientes CHC/ NASH (n=110)

Diagnóstico histológico dos pacientes CHC/ NASH (n=52) Diagnóstico baseado em exames de imagem dos pacientes CHC/ NASH (n=58)

CLINICS 2016;71(5):281-284

Principais e mais recentes estudos sobre a associação entre DHGNA/ NASH e CHC

Younes & Bugianesi; Journal of Hepatology; 2018

Obesidade Diabetes

Resistência Insulínica

IGF-1 Ativação de IRS-1

(por fosforilação de JNK-1)

Hiperinsulinemia

Ácidos Graxos

Proliferação Celular Apoptose

Esteatose Inflamação

Cirrose - TNF- - IL-6 - NFkB - Leptina - Resistina

Adiponectina

Supressão de p53 Mutações em Nrf-1 Ativação de JNK-1

EROS

CHC

Adaptado de Starley BQ, Calcagno CJ , Harrison SA; Hepatology, 2010

Mecanismos Moleculares que Associam a DHGNA ao Desenvolvimento do CHC

Mecanismos Moleculares que Associam a DHGNA ao Desenvolvimento do CHC

Stickel F & Hellerbrand C, Gut, 2010

OBJETIVOS: Avaliar o papel da via do mTOR na cirrose secundária à NASH, na tentativa

de caracterizar o envolvimento desta via na fisiopatogênese da doença.

CONCLUSÕES:

1. Estes dados corroboram a participação da via mTOR na cirrose secundária à NASH;

2. Sugere-se que avaliação da proteína mTOR fosforilada pode ser de útil na prática clínica como um potencial

marcador na identificação da NASH em casos considerados equivocadamente como cirrose criptogênica,

devido à escassez de dados clínicos.

phospho 4E-BP1 phospho mTOR

Kubrusly et al., Histol & Histopathol., 2010

IDENTIFICATION OF COMMON GENE MARKERS IN THE WHOLE SPECTRUM OF

NONALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE (NAFLD) PATIENTS: SINCE SIMPLE STEATOSIS TO

NASH-RELATED HEPATOCELLULAR CARCINOMA (HCC)

STEFANO JT1, OLIVEIRA CPMS1, CORREA-GIANNELLA ML, KUBRUSLY MS1, BELLODI-PRIVATO M1,

LIMA VMR1, ALVES VAF3, CARRILHO FJ1

1. Department of Gastroenterology LIM-07 - University of Sao Paulo School of Medicine, Sao Paulo, Brazil

2. Laboratory for Cellular and Molecular Endocrinology LIM-25 - University of Sao Paulo School of Medicine, Sao Paulo, Brazil

3. Department of Pathology LIM-14, University of Sao Paulo School of Medicine, Sao Paulo, Brazil

EASL, 2008 and ILCA, 2008

UniGene Symbol Gene NameFold change

ST x CTRL

Fold change

NASH x CTRL

Fold change

CIR x CTRL

Fold change

HCC x CTRL

metabolic process

Hs.551747 NEU4 Sialidase 4 -2,800 -3,127 -3,234 -3,715

cell cycle

Hs.93002 UBE2C Ubiquitin-conjugating enzyme E2C -4,004 -3,006 -2,027 -2,096

apoptosis

Hs.514527 BIRC5 Baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin) -3,287 -2,701 -2,658 -2,507

lipid transport

Hs.513075 STARD5 StAR-related lipid transfer (START) domain containing 5 -3,228 -4,285 -2,553 -3,586

protein folding

Hs.507080 APCS Amyloid P component, serum -3,960 -3,982 -2,538 -5,562

lipid catabolic process

Hs.170904 GRTP1 Growth hormone regulated TBC protein 1 -2,608 -2,679 -2,003 -3,936

vesicle-mediated transport

Hs.508958 STXBP6 Syntaxin binding protein 6 (amisyn) -4,310 -3,548 -3,080 -3,726

DNA replication

Hs.515122 TK1 Thymidine kinase 1, soluble -3,178 -3,754 -2,771 -3,290

RNA processing

Hs.416755 LARP6 La ribonucleoprotein domain family, member 6 -3,490 -3,740 -2,418 -4,070

small GTPase mediated signal transduction

Hs.379414 MFHAS1 Malignant fibrous histiocytoma amplified sequence 1 -3,746 -3,699 -2,001 -3,163

transport

Hs.546482 NHEDC2 Na+/H+ exchanger domain containing 2 -4,195 -3,961 -2,292 -4,670

Genes Comuns com Expressão Diminuída nas Fases de Evolução da DHGNA

EASL, 2008 and ILCA, 2008

UniGene Symbol Gene NameFold change

ST x CTRL

Fold change

NASH x CTRL

Fold change

CIR x CTRL

Fold change

HCC x CTRL

protein amino acid phosphorylation

Hs.474596 LIMK2 LIM domain kinase 2 3,733 5,083 3,871 4,247

Hs.524625 GRK5 G protein-coupled receptor kinase 5 2,825 3,079 2,485 3,995

Hs.123074 GUCY2F Guanylate cyclase 2F, retinal 2,612 2,918 2,165 3,856

nervous system development

Hs.502182 BDNF Brain-derived neurotrophic factor 2,465 3,351 2,604 2,603

MAPKKK cascade

Hs.143674 RASGRP3 RAS guanyl releasing protein 3 2,053 2,164 2,220 2,299

Hs.269059 JARID2 jumonji, AT rich interactive domain 2 2,979 2,958 2,360 3,850

Hs.407636 FIGLA Folliculogenesis specific basic helix-loop-helix 2,979 2,958 2,360 3,850

regulation of transcription, DNA-dependent

Hs.128279 L3MBTL4 l(3)mbt-like 4 (Drosophila) 3,140 3,777 2,100 3,560

muscle development

Hs.133135 UTRN utrophin 2,710 3,492 2,301 3,888

metabolic process

Hs.175905 AUH AU RNA binding protein/enoyl-Coenzyme A hydratase 2,632 2,710 2,334 2,919

Genes Comuns com Expressão Aumentada nas Fases de Evolução da DHGNA

EASL, 2008 and ILCA, 2008

CONCLUSÃO:

A modulação de genes relacionados à carcinogênese nas fases iniciais do espectro DHGNA sugere

uma predisposição a estados hiperproliferativos na progressão da DHGNA.

RNA cDNA cRNA

Cy5 biotina

IVT

http://www.imgenex.com

Apoptosis Pathways

18 Esteatoses

21 NASH

10 Cirroses secundárias à NASH

6 CHC secundários à NASH

71 CHC relacionados a outras causas

12 Tecidos Hepáticos livres de doença

Imunohistoquímica

(Tissue Microarray – TMA)

Casuística e Métodos

*

A

B A B

Stefano et al., Liver Int., 2011

Eslam, Valenti, Romeo, Journal of Hepatology 2018

Variantes Genéticas Associadas ao Desenvolvimento e/ou Progressão da DHGNA

miRNAs Específicos Associados ao Desenvolvimento e Progressão da DHGNA

HYPERINSULINEMIA

CELLULAR MECHANISMS

GENETIC POLYMORPHISM

HEPATOCELLULAR CARCINOMA

Mecanismos Propostos de Hepatocarcinogênese na DHGNA

Wong, Nguyen, Lim, World J Gastroenterol 2016

Zucman-Rossi et al; Gastroenterology, 2015

ClassificaçãoMolecular

do CHC

21 PACIENTES CHC/ NASH

35 NÓDULOS DE CHC

423 Pacientes com CHC

EASL 2016

Steatohepatitis HCC subtype

Intratumoral ballooning

Mallory Denk bodies

Intratumoral fibrosis

Intratumoral inflammation

35 nodules 25 HCC nodules (70%)

EASL 2016

Focal or extensive

Salomão et al, 2011

A B

C D

A - HCC, grade 2, NASH subtype [microvacuolar steatosis, ballooning, Mallory bodies) (HE, x200) B,C - HCC, grade 1, NASH subtype [ballooning and Mallory bodies, intratumoral fibrosis and moderate inflammation] (HE, x100) (C. HEx200) D - HCC, grade 2, NASH subtype. Mallory bodies (HE, x400).

EASL 2016

Steatohepatitis HCC subtype

Edmondson & Steiner Classification 35 NASH HCC nodules

EASL 2016

Avaliação IHQ dos Marcadores de Proliferação/ Propriedades de Células Progenitoras

EASL 2016

Expressão de marcadores Ck19 e Ki67

15% apenas CK19 +

15% apenas Ki67 +

6 % CK19+ e Ki67+ambospositivos

64% marcadores negativos

Reações de IHQ Representativas de Ck19 e Ki67

A) Expressão < 1% de K19 (x200). B) Expressão <1% K19 (x400). C). Expressão 70% de K19 em CHC

esteatohepatitico (x100) D). Expressão 70% em CHC esteatohepatitico (x200). E) Expressão 3% de Ki67

(x200) F) Expressão 3% de Ki67 (x400) G) Expressão 74% de Ki67 (x200) H). Expressão 74% de Ki67 (x400)

EASL 2016

Ck19 Ki-67

• Promotor TERT (60%) - Estabilidade telômero

• TP53 (20-30%) - Integridade genômica

• CTNNB1 (15-25%) - Via WNT

• ARIDIA (10-16%) - Remodelamento cromatina

• JAK1 (0-9%) - Via JAK/STAT

Oncogenes frequentementemutados no CHC

• IDH1 e 2

• EGFR

• KRAS

• PIK3CA

• PTEN

Oncogenes raramente

mutados no CHC

• FGF19 (5-10%) - Via do Fator de Crescimento de Fibroblasto

• CCND1 (5-10%) - Ciclo celular

• VEGFA (7-10%) - Angiogênese

Oncogenes com carga alta de

amplificação no CHC

Zoller H & Tilg H, 2016 Bruix J, 2015

Mesmo com sequenciamento do exoma tumoral não foi possível identificar

um padrão molecular distinto para CHC secundário a DHGNA pela

heterogeneidade dos resultados.

OBRIGADO!

José Tadeu Stefano

jose.tadeu@fm.usp.br