Aula 2-Fraccionamento celular
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Fraccionamento/Separação
Celular
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Células Sanguíneas
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MacrofagosMonócitos
NeutrófilosPMN
Eosinófilos
Basófilos
Linfócitos
T
B
NK
CD4
CD8
Células do Sistema Imune
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- Eritrocitos (RBC)
- Células sem núcleo ou outros organelos
- Sobrevivem em circulação ate 120 dias
- Constituídos por hemoglobina (90%) e de forma bicôncava
- Plaquetas (platelets)
- Células homeostáticas para a coagulação sanguínea, responsáveis pela libertação de substancias vaso constritoras
- Polimorfonucleados = Eosinofilos + basofilos + neutrofilos
- Formam-se na medula óssea
- têm uma vida de 3 a 4 h após a qual se fixam nos tecidos
- São atraídos para tecidos inflamados/infectados por factores quimiostáticos. Matam envolvendo o agente infeccioso e libertando os grânulos citoplasmáticos (mieloperoxidase)
- Importância destacada nas reacções alérgicas agudas e crónicas
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- Macrofago
- Célula fagocitaria derivada do monocito
- Exerce funções no sistema imunitário inato e adquirido
- Estão presentes nos pulmões, baço, fígado, e nódulos linfáticos onde, grosso modo, combatem bactérias, vírus, e protozoários intracelulares.
- NK - células natural killer - Sao linfócitos largos e granulares que não expressam IG ou receptores T mas são capazes de reconhecer e destruir células tumorais ou infectadas por vírus.
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Linfocitos
-Células especializadas no reconhecimento dos antigénios
- Dividem se em dois tipos:
- Células B – desenvolvem-se na medula óssea e diferenciam se em células produtoras de anticorpos, imunoglobulinas (IG) - imunidade humoral
- Células T - diferenciam-se no timo e nas suas funções incluem apoiar células B na produção de IG e actividade microbicida quer por contacto celular directo ou pela libertação de citoquinas - imunidade celular
• CD4 células helper (Th)
• CD8 citotóxicas (Tc)
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Separação de células sanguíneas
• Centrifugação
• Panning• Separação imunomagnética• Cromatografia de afinidade
• Citometria de fluxo• FACS (fluorescence-activated cell sorter)
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Centrifugação
A suspensão de células vai ter partículas com diferentes - tamanho - carga -
densidade
Separação pela aplicação de força centrifuga elevada (600 mil x g)
Aplicações:
• técnica preparativa para separar um dado componente para estudo
• técnica analítica para determinar propriedades físicas (pm; densidade, forma) ou pesquisar a presença de macro moléculas
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Centrifugação Diferencial
Envolve a separação do material solúvel entre o material celular insolúvel
A força centrífuga e o tempo de centrifugação são ajustadas de forma a assegurar que o material
insolúvel fica no pellet e o material solúvel (proteínas) fica no sobrenadante Ex:
sangue/plasmaCentrifugação em Gradiente
Envolve a separação de partículas com base na sua massa e forma mas numa solução de
densidade (de sacarose) e/ou de concentração (de sais) crescente
A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a centrifugação migram de acordo com a sua velocidade
de sedimentação
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Separação de linfócitos em gradiente de densidade
Numa centrifugação sedimentam primeiro as partículas mais densas, que por sua vez impedem as menos
densas de sedimentar
• EX: centrifugação de gradiente de Ficoll-HypaqueFicol: polisacarideo
– Agrega eritrócitos tornando-os mais densosMetrizamida (composto denso contendo iodo)
– Densidade ajustável em função da concentração
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density
Ficoll-hypaque
Célulasmononucleares
Soroplaquetas
Eritrócitos + leucócitos polimorfonucleares (granulócitos) – mais densos
Células mononucleares (linfócitos + monócitos) – menos densos - recuperados à superfície
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PANNING
• Aderência celular a uma superfície sólida
– Monócitos e macrófagos são naturalmente aderentes(medula óssea)
– Outras células podem aderir se a superfície estiver conjugada com anticorpos apropriados
(anti IG- separam B de T)
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Separação Imunomagnética
• forma rápida de separação de grandes quantidades de linfócitos
• acoplamento de esferas magnéticas a anticorpos monoclonais que reconhecem moléculas da superfície das células
• os anticorpos acoplados às esferas magnéticas, são misturados com as células a separar. A mistura passa por uma coluna magnética, que reterá as células ligadas ao anticorpo
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Separação Imunomagnética
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Cromatografia
Princípio:
As moléculas dissolvidas numa solução podem associar-se ou dissociar-se de uma superfície sólida.
Se a solução se mantiver em fluxo as moléculas podem-se separar de acordo com as interacções com
o suporte
Em coluna
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Cromatografia de afinidade
Baseada na capacidade de uma proteína/componente se ligar especificamente a
outra partícula (anticorpo)
• As colunas contêm esferas ligadas covalentemente a anticorpos específicos da
proteína de interesse – coluna de imunoafinidade
• As partículas são depois eluídas por ex. por uma solução concentrada de ligando, pH
diferente do de ligação.
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FACSFluorescence-activated cell sorter
• Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas dierentes proteínas expressas á superfície (B, TCD4, TCD8)
• Cada tipo celular é marcado com um anticorpo específico que se encontra acoplado a um corante fluorescente.
• O citómetro de fluxo detecta e conta individualmente as células que passam através do laser
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Purificação positiva e negativa
• Purificação Positiva (as células são separadas por apresentarem uma dada característica)
• Purificação Negativa– Panning– Imuno-separação magnética– Centrifugação gradiente densidade– Formação de rosetas (Linf T/B)– Citometria de Fluxo– Citotoxicidade mediada por Anticorpo/complemento
(Linf T CD4/CD8)– RIA (Radioimmunoassay)– ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
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Preservação
• Tecidos (sangue, medula ossea, outros tecidos linfoides)
- Criopreservação - 80 ºC (3 meses; perda progressiva das características)
• Células (culturas celulares, células previamente
separadas)
- Crioprotecção - 40 ºC (semanas) - 80 ºC (anos)
– No caso dos linfócitos ocorrem sempre algumas alterações ao nível das moléculas de superfície
(fenotipagem antes da utilização)