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Aplicao de mtodos alternativos

para anlise microbiolgica de

alimentos

Profa. Msc. Leila Larisa Medeiros Marques

Mtodos utilizados em

microbiologia de alimentos

Mtodos tradicionais ou convencionais;

Mtodos rpidos ou alternativos.

Mtodos tradicionais ou

convencionais

Pouco elaborados;

Trabalhosos;

Demorados;

Muito material de laboratrio;

Requer pessoal treinado;

Sujeito a falhas humanas.


convencionais

Sensibilidade insuficiente: capacidade de detectar o que o mtodo prope;

Especificidade: detecta s microrganismos procurados nem sempre ocorre;

Repetitividade: se o operador fizer 50 vezes ele obtm o mesmo resultado - no ocorre;

Reprodutibilidade: gera resultados estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!

Mtodos convencionais

Foram desenvolvidos h muitos anos e vm sendoempregados como mtodos oficias na maioria doslaboratrios brasileiros e outros pases;

Esses mtodos esto descritos em publicaes consideradasde referncia, internacionalmente aceitas:

-Bacteriological analitical manual (ed. 1992) - (FDA) e (AOAC);

-Compendium of methods for the microbiological examinationof foods (APHA) (ed. 1992);

-Microorganisms in foods (ed. 1978) (ICMSF);

-ISO - International Organization for Standardization;

-IDF - International Dairy Federation.


convencionais

1. ANLISE QUANTITATIVA - MTODOS DE CONTAGEM DE

MICRORGANISMOS

A) Contagem de colnias de microrganismos em placas de petri

- Em profundidade " pour - plate"

- Na superfcie do meio

B) Tcnica de contagem por membrana filtrante

C) Tcnica da determinao do nmero mais provvel (NMP)

2. ANLISE QUALITATIVA

-Tcnica de presena/ausncia

Anlise quantitativa -

mtodos de contagem de

microrganismos

Contagem de colnias de microrganismos em placas

de petri

1-Tcnica de semeadura em superfcie;

2-Tcnica de Pour-Plate ou de profundidade;

3-Tcnica de sobrecamada.

Vantagem: Rapidez Resultados

em 24 ou 48 Horas?

Objetivos dos mtodos rpidos

em anlises microbiolgicas

1. Melhorar a eficincia dos laboratrios,

simplificando trabalhos, reduzindo o custo no

geral, aumentando a capacidade analtica;

2. Aumentar confiabilidade dos resultados, pois

no preparado pelo analista, o kit vem pronto;

3.Aumentar a preciso dos resultados.

***Importante: ter um microbiologista treinado

para interpretao

Mtodos rpidos ou alternativos

1) Automao laboratorial;

2) Mtodos rpidos para avaliar a

qualidade;

3) Mtodos rpidos para avaliar

inocuidade.

1. Automao industrial

A) Pesagem ("Diluter");

B) Homogeneizao ("stomacher-

homogeneizador de pisto");

C) Semeadura ("Spiral plater");

D) Plaqueamento (uso de meios

cromognicos).

1.Automao laboratorial

A. Preparo de meios de cultura = masterclave

Bioscan -Dispenser em placas de Petri -750

placas/hora;

B. Pesagem de amostras-por ex: atravs de um

aparelho chamado DILUTER -ajustado que ao

colocar a amostra, pesa a alquota desejada, e j

dilui acrescentando a gua necessria para a

diluio!

1.Automao laboratorial

C. Homogeneizao - Uso do stomacher -

homogeneizador de pisto no mais os

liquidificadores que cortam as clulas

microbianas injuriando-as na anlise!!!

D. Semeadura - Utilizao de um aparelho

chamado spiral plater - a amostra semeada

na placa, atravs de uma cnula, que verte o

inculo, e a placa fica numa superfcie que gira.

2. Mtodos para avaliao da

qualidade

Microrganismos

deteriorantes/Indicadores

Mtodos de contagem-direta e

indireta

Contagem Direta

1. Membrana filtrante: utilizada para lquidos onde grande

quantidade necessitada para amostra: utilizada em gua,

refrigerantes.

2. Mtodos de contagem fluorognicos: como LST MUG-

baseado na propriedade da E. coli de emitir fluorescncia na

presena deste composto, o indicador procurado, adiciona-se MUG

(u-metil umbeliferil beta-d-glicorondeo) ao caldo da cultura

(presuntivo). O nmero de tubos com gs e fluorescentes aps 24h,

ou 48h, sob luz ultra-violeta visvel, d o nmero mais provvel de

E.coli por grama.

*Meios cromognicos prontos:exploso em 2007

Contagem direta- Meio

cromognico: gar Rambach

Contagem direta- Petrifilme

Contagem direta- Petrifilme: tcnica para anlise

de Escherichia coli

1 2 3

4 5

Contagem direta- Petrifilme: tcnica para

anlise de Enterobacteriaceae

Contagem direta- Petrifilme: tcnica para

anlise de bolores e leveduras

Contagem direta- Petrifilme: tcnica

para anlise de S. aureus

Petrifilm: cuidados Armazenar os pacotes fechados na geladeira;

Antes de abrir aguardar para que o pacote esteja a temperatura

ambiente;

Depois de aberto deixar a temperatura ambiente por no mximo 30

dias;

No usar placas que estejam laranja ou marrom;

Verificar a data de vencimento;

Para descartar, esterilizar;

Contagem :

Contar placas com mais de 250 colnias;

Contar um ou mais quadros, fazer a mdia e multiplicar por 20;

As colnias podem ser tiradas para identificao;

Congelar a < - 15C at 1 semana.

Contagem direta: outros mtodos

LST MUG: Colilert; sistemas prontos para

uso (placas de simplate);

placas de Petrifilme - 3 M;

placas de compact dry -Versus- Madasa.

Contagem indireta

1. Bioluminescncia;

2. Impedncia/Condutncia.

Contagem indireta: tcnica de

bioluminescncia

Princpio: quantidade de ATP detectada a partir de

clulas metabolicamente ativas (resduos orgnicos,

inclusive microrganismos). Em ambiente de produo,

monitoramento microbiolgico;

Mecanismo: Reao de enzima luciferina-luciferase

(cauda do vaga-lume);

ATP -Reage com a enzima produzindo luz, medida em

um luminmetro.


bioluminescncia Aplicao comum: monitoramento

de higienizao em plantas

processadoras de alimentos;

Equipamentos comercializados

base de bioluminescncia: Lightning e

Hi-Lyte;

Consistem em um swab aplicado a

superfcie a ser checada: introduz

num tubo com os reagentes

necessrios e o coloca no

luminmetro que mede a

intensidade da luz: quanto mais sujo,

+ luz!

Existem vrios fabricantes desse tipo

de equipamento.


bioluminescncia

Contagem Indireta:

IMPEDNCIA/CONDUTNCI

A

Princpio: microrganismos alteram a corrente eltrica de um meio

de cultura devido s atividades metablicas na multiplicao.

Molculas grandes (protenas, lipdeos) so transformadas em

molculas menores; aminocidos, ac. graxos, etc., que so

quimicamente mais ativas. O acmulo destes compostos produz

alteraes mensurveis.

Ex.: BACTOMETER-Bio Mrieux. A quantidade de microrganismos

presentes definida pela determinao do TEMPO DE

DETECO

Deteco ocorre quando a [ ] atinge 106-107microrg./ml.

3. Mtodos Rpidos Para

Avaliao De Inocuidade

Kits completos de identificao:

A. BIOQUMICOS

B. IMUNOLGICOS

C. MOLECULARES



A. Bioqumicos:

Mtodos que a partir de uma cepa obtida por algum mtodo de

deteco - inoculada em kits -e so observadas para capacidade

de realizar determinadas reaes bioqumicas;

Entram na fase final da anlise objetivo de identificar. Ex: Galerias

API, Bio-Mrieux

Testes complementares de identificao. Ex: Microgen Listeria ID, da

Bioscan.



Imunolgicos:

Imunoenzimticos;

Imunocaptura;

Imunoimobilizao;

Coaglutinao.

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: imunoenzimticos

O tipo mais empregado: sandwich;

O patgeno PROCURADO capturado da amostra por

anticorpos adsorvidos superfcie de uma matriz slida (esferas de

polietileno, placas de micro-titulao, papel, etc.);

O complexo antgeno-anticorpo reage com o conjugado, forma

novo anti-corpo especfico p/ o microrganismo em teste. Ligada

enzima cromognica (fosfatase alcalina/peroxidase), o sandwich

reage com o substrato da enzima cromognica e mostra cor: teste

positivo.

Ex. Unique,Vidas -Bio Mrieux-automatizado


Inocuidade: imunocaptura

Princpio: capacidade dos microrganismos aderirem superfcie de

partculas metlicas revestidas de anticorpos especficos;

Ligando os antgenos bacterianos + anticorpos: o sistema tem um

suporte com m que atrai as partculas metlicas, e o que fica um

concentrado de microrganismos procurados.

Enriquecimento e plaqueamento!

Sorologia: deve ser feita em colnias suspeitas, dando assim

resultado imediato.


Inocuidade: Imunoimobilizao

Princpio: bactrias mveis cultivadas em meios semi-slidos tem

sua mobilidade bloqueada pela adio de anticorpos flagelares

especficos;

Forma uma banda de precipitao visvel na interface

ANTICORPO/BACTRIA;

Aplicvel a qualquer microrganismo flagelado (mvel);

Ex.Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella.


Inocuidade: coaglutinao

Conhecido como aglutinao de ltex (passiva reversa);

Uso em toxinas microbianas;

Aglutinao de partculas de ltex sensibilizadas com

anticorpos anti-toxinas.;

Ex.: RPLA kits_OXOID p/ pesquisa de enterotoxinas

estafiloccicas.


Inocuidade: mtodos moleculares

Sondas genticas -pouco usadas: Separa

fita de DNA-sonda reage marcador cor

que lida no colormetro;

PCR -Tradicional e automatizado -Ex:

BAX SYSTEM -Dupont-Qualicom-

Patgenos alvo: Salmonella, Listeria

monocytogenes e Listeria sp, Enterobacter

sakazakii, Escherichia coli O157:H7, Bolores

e Leveduras;

Ribotipagem-Ribotipo-Sofisticao em

anlises -Riboprinter-Dupont-Qualicom-

RG .


Inocuidade: PCR tradicional


Inocuidade: ribotipagem

Referncias bibliogrficas

FRANCO, B. D. G. M. Mtodos rpidos em microbiologia de

alimentos - Curso Mtodos de Anlise em Microbiologia de

Alimentos -ITAL, 2006.

SILVA, N.; JUNQUEIRA,V. C. A.; SILVEIRA, N.;TANIWAKI, M.H.;

SANTOS, R. F. S.; GOMES, R. A. R. Manual de mtodos de

anlise microbiolgica de alimentos. 3ed. So Paulo: Varela,

2007.

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