AULA Nº 8 – Metabolismo BiossintéticoAULA Nº 8 – Metabolismo Biossintético

O anabolismo é a síntese de moléculas complexas a partir dos produtos

provenientes do catabolismo. Envolve uma série de passos. Basicamente, primeiramente

formam-se pequenas moléculas que são chamadas de metabolitos percursores. Depois,

dá-se a síntese dos monómeros (exemplo: aminoácidos, nucleótidos, carbohidratos

simples e lípidos simples), que vão dar origem às moléculas complexas, a partir dos

metabolitos percursores. De seguida, dá-se a síntese das macromoléculas (exemplo:

proteínas, ácidos nucleicos, etc.) e a reunião destas mesmas nas estruturas celulares.

Este processo requer energia e ela aparece-nos sob a forma de ATP. Além de

energia, o anabolismo requer uma fonte de electrões reservada, pois o anabolismo é um

processo redutivo e os electrões são adicionados às pequenas moléculas enquanto estas

são usadas para formar as macromoléculas.

Resumindo…

Etapas da biossíntese das macromoléculas:

Produção de unidades moleculares;

Activação desses monómeros com dispêndio de ATP;

Polimerização dos monómeros activados.

Uma das macromoléculas sintetizadas nos procariotas é o peptidoglicano.

A Síntese do Peptidoglicano tem três fases:

1. Fase citoplasmática

2. Fase membranar

3. Fase parietal

Fig 8.1: Síntese do peptidoglicano

Esta síntese envolve dois “carriers”. O primeiro, uridina difosfafo (UDP)

funciona nas reacções citoplasmáticas. No primeiro passo da síntese do peptidoglicano,

derivados de UDP do N-acetilmurárico e da N-acetilglucosamina são formados. De

seguida, há uma adição sequencial de aminoácidos ao UDP-NAM, de modo a formar o

pentapéptido UDP – NAM, sendo que o ATP é necessário neste passo. Este produto é a

primeira unidade importante sintetizada no citoplasma.

De seguida, este péptido liga-se através de uma ligação fosfato ao bactoprenol

que é considerado o segundo “carrier”, localizado no lado citoplasmático da membrana

plasmática. O intermediário resultante é um álcool com 55 carbonos. Depois, UDP

transfere NAG para o complexo bactoprenol-NAM-pentapéptido de modo a gerar o

NAM-NAG-pentapéptido. Este último está ligado ao bactoprenol, que vai transportar o

péptido pela membrana, desde a parte interna da membrana para a parte externa da

membrana, onde vai ser sintetizado o peptidoglicano em si.

Após isto, o NAM-NAG-pentapéptido, liga-se, já na parte externa da membrana,

a uma cadeia de peptidoglicano. É esta unidade que vai ser libertada para o espaço

periplasmático, sendo que o bactoprenol é desfosforilado (ficando apenas com um

fosfato ligado a si) e volta para o lado citoplasmático, onde poderá participar numa nova

síntese. (ver figura 8.1 para síntese esquematizada)

Alguns antibióticos actuam a este nível, de modo a interferirem na síntese do

peptidoglicano. Por exemplo, a bacitracina impede que haja a desfosforilação do

bactoprenol.

O último passo na síntese do peptidoglicano é a transpeptidação, onde se criam

ligações peptídicas entre as cadeias de peptidoglicano. Antes de acontecer a

transpeptidação propriamente dita, há que haver uma descarboxilação do terminal D-

alanina, que vai fornecer a energia necessária para que a transpeptidação aconteça.

Fig 8.2: Transpeptidação – Reacções de transpeptidação na formação de

peptidoglicano em E. coli e S. aureus.

Na transpeptidação estão envolvidas também as enzimas PBP – Penicillin

Binding Proteins, que existem no folheto externo da membrana. Quando existem

mutações nestas, as bactérias ficam sujeitas a alterações por parte da penicilina e da

vancomicina.

Além do mais, a penicilina liga-se às PBP, alterando-as. Não há transpeptidação

e a célula morre porque para a célula crescer tem que haver biossíntese e corte (por

parte das lisinas). O corte, neste caso, continua a funcionar, mas a biossíntese não e

portanto o citoplasma sai pelos “buracos” formados pela diferença de pressão osmótica,

e a célula morre.

Já a vancomicina despromove a descarboxilação do terminal D-alanina, não

havendo também transpeptidação.

Síntese do DNA

Outra síntese que estudamos nos procariotas é a síntese do DNA. Esta síntese é

mais normalmente chamada de Replicação do DNA, e é importante para a duplicação

do material genético. É semiconservativa, ou seja, as moléculas filhas contêm uma

cadeia igual à molécula mãe e uma cadeia nova. O DNA na E. coli é circular e a

replicação começa num único local, a origem (ver figura 8.3). Daí se dizer que o

genoma bacteriano é um replicão. Quando se dá a conjugação da E. coli, observa-se um

diferente tipo de mecanismo chamado “rolling-circle replication”, que é também

observado quando há replicação de plasmídeos e reprodução de alguns vírus. Durante

este processo, a extremidade 3’-OH livre cresce por obra das enzimas da replicação. À

medida que esta extremidade cresce, enquanto o growing point anda à volta do molde

circular, a extremidade 5’ é retirada (do inglês, “displaced”) e forma uma cauda que está

constantemente a crescer. Este mecanismo é particularmente útil para os vírus porque

permite uma produção rápida e contínua de muitas cópias do genoma a partir de um

único evento de iniciação.

As enzimas que catalisam a síntese do DNA são as chamadas DNA

polimerases. A E. coli possui três: a I, que está envolvida em mecanismos de reparação

de DNA, a II e a III, que está mais envolvida na replicação do DNA, mas para funcionar

tem existir um primer, uma molécula iniciadora, que possui sequências curtas de ácidos

nucleicos, com a extremidade 3’-OH livre, que se vai ligar à cadeia complementar.

Todas as DNA polimerases conhecidas catalisam a síntese de DNA na direcção 5’ para

3’.

Para que as DNA polimerases catalizem uma cadeia complementar de DNA, são

necessárias três coisas: (1) um molde, que se leia na direcção 3’ para 5’, (2) um primer e

(3) dNTPs.

Na E. coli, a replicação começa quando um conjunto de proteínas DnaA se liga

a sequências de nucleótidos específicas no sítio de origem da replicação (o locus oriC).

Estas proteínas hidrolisam ATP de modo a que as ligações de hidrogénio que ligam as

duas cadeias de DNA se partam e o molde seja de apenas uma cadeia. Mas não só estas

proteínas conseguem manter esta única cadeia funcional. Outras proteínas, como as

helicases, as single-stranded DNA binding proteins (SSBs) e as topoisomerases ajudam-

nas.

As helicases são responsáveis por desenrolar as cadeias de DNA. As SSBs

mantêm as cadeias longe umas das outras assim que elas são separadas e as

topoisomerases aliviam a tensão gerada pelo rápido desenrolamento da dupla hélice.

Isto é importante porque por causa deste rápido desenrolamento, pode haver formação

de superenrolamentos positivos na hélice e estes podem impedir a replicação se não

forem removidos. A enzima DNA girase (uma topoisomerase) desfaz os

superenrolamentos positivos que ocorrem à frente da bifurcação de elongação durante a

síntese do DNA.

Assim que o molde estiver preparado, o primer que é necessário para a DNA

polimerase III pode ser sintetizado. Este é sintetizado por uma primase, com a ajuda de

outras proteínas – formando um complexo chamado primossoma.

Como a DNA polimerase deve sintetizar DNA na direcção 5’ para 3’, apenas

uma das cadeias, chamada cadeia líder ou primária, pode ser sintetizada

continuamente na sua terminação 3’, à medida que o DNA desenrola. A outra cadeia,

chamada de cadeia secundária, não se pode formar na mesma direcção pois não há

nenhuma extremidade 3’-OH livre onde os nucleótidos possam ser ligados. Então, esta

cadeia é sintetizada descontinuamente na direcção 5’ para 3’ como uma série de

fragmentos, chamados de fragmentos Okazaki (que são pequenos fragmentos de

cadeias de DNA simples que se emparelham com a cadeia complementar, que se ligam

covalentemente na extremidade 5’ a um primer).

Ou seja; enquanto a cadeia primária precisa apenas de um primer (e apenas um

primossoma) para iniciar a síntese, a cadeia secundária precisa de vários primers e

vários primossomas, que serão, depois, eventualmente retirados. Quando isso acontece,

os fragmentos Okazaki são ligados pela enzima DNA ligase, que forma uma ligação

fosfodiéster entre a extremidade 3’-hidroxil da cadeia que está a crescer e a extremidade

5’-fosfato do fragmento de Okazaki.

Fig 8.3: Genoma bacteriano é circular. Na figura maior, síntese do DNA

resumida.

A replicação pára quando o replissoma reconhece um local de terminação no

DNA. Quando a replicação de um genoma circular está completa, as duas cadeias filhas

podem permanecer entrelaçadas – formando catenanos. Isto traz obviamente

problemas. Porém, as topoisomerases resolvem o problema, fazendo com que as

moléculas de DNA sejam temporariamente cortadas, de modo a que cada cadeia seja

separada (ver Figura 8.4).

Fig 8.4: Mecanismos de acção das topoisomerases (Catenação e Decatenação).

Quando a antibióticos que inibam a síntese do DNA temos como exemplos as

quinolonas. Isto porque afectam a actividade das topoisomerases II (girases) gyrA,

gyrB e das topoisomerases IV (parC; parE) e logo, há uma paragem na síntese do DNA.

Síntese do RNA

A síntese do RNA a partir do DNA é chamada de transcrição. Esta é feita através

da RNA polimerase e gera três tipos de RNA: mRNA (RNA mensageiro), rRNA (RNA

ribossomal), tRNA (RNA de transferência) e os pequenos RNAs reguladores. A reacção

é bastante similar à que é catalizada pela DNA polimerase. ATP, GTP, CTP e UTP são

usados para produzir um RNA complementar a partir do molde de DNA. Porém, estes

nucleótidos contêm ribose e não desoxirribose (ver Figura 8.5).

Fig 8.5: Fenómeno de transcrição.

Esta síntese é feita, tal como a do DNA, na direcção 5’ -> 3’, com os nucleótidos

a serem adicionados à terminação 3’ da cadeia que cresce. É produzido pirofosfato que

é depois hidrolisado a ortofosfato. Esta reacção faz com que a síntese do DNA e RNA

seja irreversível.

A transcrição envolve três processos distintos: iniciação, elongação e

terminação. Apenas uma pequeno segmento de DNA é transcrito (enquanto que na

replicação do DNA é preciso que todo o molde seja copiado) e a iniciação começa

quando a RNA polimerase se liga à região promotora do gene. É nesta altura que o

factor sigma entra. Ele vai reconhecer a região promotora do gene e vai fazer com que

se dê o início da transcrição. É de notar que o factor sigma serve apenas para reconhecer

a região promotora e fazer com que a RNA polimerase se ligue lá, de modo a começar a

transcrição. Ele sai dessa zona mesmo antes da transcrição em si começar.

Essas regiões promotoras onde se vai iniciar a transcrição têm, nas bactérias,

duas características: uma sequência de seis bases (muitas vezes TTGACA) que se situa

35 pares de bases antes do local de iniciação da transcrição, e uma sequência TATAAT

que se situa 10 pares de bases abaixo do mesmo local. Estas regiões são chamadas -35 e

-10 sites. É entre eles (e até ao local +1, onde se inicia a transcrição) que se situa a

região promotora, onde a RNA polimerase se liga. Assim que estiver ligada, a RNA

polimerase começa a desenrolar o DNA sem a ajuda de helicases. O sítio -10 é rico em

adeninas e timinas, o que faz com que as ligações de hidrogénio que mantém a dupla

hélice do DNA enrolada sejam mais fáceis de serem “partidas”. Quando o DNA é

desenrolado nesta zona, forma-se o “open complex”, que se move com a RNA

polimerase à medida que esta procede à transcrição de mRNA a partir do DNA, durante

a elongação. É também durante a elongação que mRNA’s com uma única cadeia são

libertados e as duas cadeias de DNA ficam de novo com a sua estrutura de dupla hélice.

A terminação da transcrição dá-se quando a RNA polimerase se dissocia do

molde de DNA. Isso acontece quando a enzima encontra no gene sequências de

nucleótidos que a “mandam” parar de sintetizar mRNA – sequências terminadoras.

Forma-se então mRNA com dois genes (formam operão – conjunto de genes

transcritos pelo mesmo DNA e dependentes do mesmo promotor).

Fig 8.6: Outra imagem relativa à transcrição: aqui pode ver-se as três fases desta

síntese.

ATENÇÃO: A RNA polimerase progride na direcção 3’ para 5’ aquando da

transcrição. Porém, o mRNA é sintetizado na direcção 5’ para 3’, de modo a ser

complementar e anti-paralelo ao molde de DNA.

Síntese Proteica nos Procariontes

A última síntese de que falamos é a Síntese Proteica nos procariontes. Esta dá-se

por interacção entre os ribossomas e o mRNA. O ribossoma procariótico é constituído

por duas subunidades, 30S e 50S, sendo que quando juntas, perfazem um valor de

sedimentação de 70S (ver Fig 8.7). Estas subunidades são construídas a partir de uma

ou duas moléculas de rRNA e muitos polipéptidos. A região do ribossoma directamente

responsável pela tradução é chamada de domínio da tradução. Ambas as subunidades

contribuem para este domínio.

Fig 8.7: Ribossoma procariótico.

O RNA ribossomal tem três papéis. Obviamente, contribui para a estrutura do

ribossoma. A parte rRNA 16S da subunidade 30S é necessária para a iniciação da

síntese proteica nas bactérias, pois é a extremidade 3’ desta parte do rRNA que se

complexa num local do mRNA, chamada sequência Shine-Dalgarno, que se situa no

ribosome-binding site (RBS). Isto ajuda o mRNA a posicionar-se no ribossoma. O

rRNA 16S também contém uma proteína necessária ao início da tradução, entre outros.

Finalmente, parece que o rRNA 23S tem um papel catalítico na síntese proteica.

Iniciação da Síntese Proteica

E. coli e a maioria das bactérias começam a síntese proteica usando um

aminoacil-tRNA modificado, o N-formilmetionil-tRNA, que só pode ser usado para

iniciação. Quando este se liga à subunidade 30S do ribossoma, dá-se a iniciação. Como

já foi dito, esta subunidade tem uma molécula de rRNA 16S com sequências de

nucleótidos que são complementares da sequência Shine-Dalgarno na sequência líder do

mRNA. Esta sequência líder não é traduzida, apenas transcrita. Isto porque o papel da

sequência líder é alinhar o mRNA com as bases complementares do rRNA 16S, de

modo a que o codão para o iniciador fMet-tRNA seja traduzido primeiro. Os mRNA’s

têm um codão iniciador (normalmente AUG) que se liga especificamente ao anticodão

fMet-tRNA. Finalmente, a subunidade 50S liga-se à estrutura formada pela subunidade

30S + mRNA, formando um complexo activo ribossoma-mRNA.

Nas bactérias, são necessários três factores iniciadores: IF-3, que previne que a

subunidade 30S se ligue somente à subunidade 50S e promove a ligação correcta entre o

mRNA e a subunidade 30S; IF-2, que liga GTP ao fMet-tRNA e promove a ligação do

fMet-tRNA iniciador ao sítio P da subunidade 30S (GTP é hidrolisado quando se dá a

associação da subunidade 50S à subunidade 30S); IF-1, que parece ser requerido para a

libertação de IF-2 e GDP, e para ajudar a associação da subunidade 50S à subunidade

30S.

Elongação da Cadeia Polipeptídica

Toda a adição de aminoácidos a uma cadeia polipeptídica a crescer é resultado

de um ciclo de elongação composto por três fases: Ligação do aminoacil-tRNA,

reacção de transpeptidação e translocação.

O ribossoma tem três locais onde os tRNAs se podem ligar: “site” P (local

doador), “site” A (aminoacil ou aceitador site) e um “site” E (local de saída, do inglês

“exit site”).

A primeira fase do ciclo de elongação é a fase de ligação do aminoacil-tRNA.

Este é inserido no “site” A de modo a que o seu anticodão esteja alinhado com o codão

do mRNA. Esta ligação inicia a segunda fase do ciclo de elongação, a reacção de

transpeptidação. Esta é catalisada pela peptidil transferase, que é uma ribozima existente

no interior do rRNA 23S. O grupo alfa-amino do “site” A ataca nucleofilicamente o

grupo alfa-carboxilo do C-terminal do aminoácido do “site” P do tRNA. A cadeia

peptídica ligada ao tRNA é transferida para o “site” A, à medida que se forma uma

ligação peptídica entre a cadeia e o aminoácido. A última fase é a translocação. Três

coisas acontecem simultaneamente: (1) o peptidil-tRNA move-se do “site” A para o

“site” P; (2) o ribossoma move um codão com o mRNA de modo a que um novo codão

seja posicionado no “site” A; e (3) o tRNA livre deixa o “site” P e é movido para o

“site” E, de onde sai do ribossoma.

Terminação da Síntese Proteica

A síntese proteica pára assim que o ribossoma chega a um destes três codões –

UAA, UAG e UGA. Estes são encontrados no mRNA.

Antibióticos Inibidores da Síntese Proteica

Muitos antibióticos são inibidores da síntese proteica por se ligarem ao

ribossoma procariótico. São exemplos desses antibióticos:

- Aminoglicosidas – Liga-se à subunidade 30S do ribossoma, não deixando que

a 30S se reúna com a 50S. Interfere na síntese proteica porque inibe directamente o

processo de síntese e também por causar uma má leitura do mRNA. São mais efectivos

contra bactérias Gram Negativo. Pode ser tóxico, causar náusea, perda de equilíbrio e

respostas alérgicas. Ex: Streptomicina, canamicina, gentamicina.

- Tetraciclinas – Liga-se também à subunidade 30 S do ribossoma. Impede que

as moléculas aminoacil-tRNA se liguem ao A site do ribossoma. São activos contra

bactérias tanto Gram negativo como Gram positivo. Doses altas podem resultar em

diarreia, náusea, entre outros.

- Macrolidas – Liga-se ao rRNA 23S da subunidade 50 S do ribossoma,

inibindo assim a elongação da síntese proteica. Funciona muito bem contra bactérias

Gram positivo e algumas Gram negativo. Costumam ser usadas em pacientes que são

alérgicos a penicilina.

- Lincosamidas

- Oxazolidinonas

- Everninomicinas

- Streptogaminas

Bibliografia usada para a aula nº 8:

Slides das Teóricas e Apontamentos

Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY , de Joanne M. Willey, Linda M.

Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill,

Cap. 11 e 34