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9/12/12 1 Métodos da Biologia Estrutural RPA-B RPA-AB RPA-A Fluorescence Intensity Ratio of T-ag/RPA Expressão/ Mutações Análises Bio=sicas Cristalografia NMR Computação Biologia Estrutural de alta resolução – técnicas clássicas Cristalografia de raios X e RMN – técnicas experimentais de alta resolução determinação de posições atômicas Cristalografia de Raios X Raios X Padrão de difração Detecção direta das posições atômicas Cristais NMR RF Sinais de RF H0 Detecção indireta das distâncias HH Em solução Biologia Estrutural de alta resolução – técnicas clássicas Clonagem do gene Expressão e purificação do produto gênico Cristalização e difração de raios X Aquisição de dados de RMN Determinação estrutural e refinamento do modelo refinamento do modelo por restrições espaciais. Cristalografia de raios X vs. RMN: compeOdores ou complementares? Cristalografia de raios X NMR Vantagens Desvantagens Sem limite de tamanho Proteínas menores que aproximadamente 40 kDa Estruturas podem ser muito precisas Estruturas Opicamente menos precisas que as de cristal Rápido Demorado Desvantagens Vantagens Necessário cristais Proteína em solução Densidade eletrônica é uma média de todas as moléculas no cristal – imagem estáOca Possibilidade de acompanhar processos dinâmicos Possível influência estrutural devido à rede cristalina Estrutura determinada da proteína naOva em solução – possibilidade de detectar diferentes conformações Juntamente com métodos computacionais, cristalografia e RMN são métodos complementares NMR Cristalografia Computação Cada técnica fornece uma contribuição única e complementares para a compreensão dos fenômenos biológicos estudados Outras técnicas bio=sicas fornecem importantes informações complementares • IdenOficação de elementos de estrutura secundária – enovelamento • Mudanças conformacionais • Estabilidade protéica • etc... Dicroísmo Circular (CD)
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Métodos da Biologia Estrutural
RPA-B
RPA-AB
RPA-A
Fluo
resc
ence
Inte
nsity
Ratio of T-ag/RPA
Expressão/Mutações
Análises Bio=sicas Cristalografia
NMR Computação
Biologia Estrutural de alta resolução – técnicas clássicas
Cristalografia de raios X e RMN – técnicas experimentais de alta resolução determinação de posições atômicas
Cristalografia de Raios X
Raios X Padrão de difração
Ø Detecção direta das posições atômicas Ø Cristais
NMR
RF Sinais de RF
H0
Ø Detecção indireta das distâncias H-‐H
Ø Em solução
Biologia Estrutural de alta resolução – técnicas clássicas
Clonagem do gene
Expressão e purificação do produto gênico
Cristalização e difração de raios X
Aquisição de dados de RMN
Determinação estrutural e refinamento do modelo
refinamento do modelo por restrições espaciais.
Cristalografia de raios X vs. RMN: compeOdores ou complementares?
Cristalografia de raios X NMR
Vantagens Desvantagens -‐ Sem limite de tamanho -‐ Proteínas menores que
aproximadamente 40 kDa
-‐ Estruturas podem ser muito precisas -‐ Estruturas Opicamente menos precisas que as de cristal
-‐ Rápido -‐ Demorado
Desvantagens Vantagens
-‐ Necessário cristais -‐ Proteína em solução
-‐ Densidade eletrônica é uma média de todas as moléculas no cristal – imagem estáOca
-‐ Possibilidade de acompanhar processos dinâmicos
-‐ Possível influência estrutural devido à rede cristalina
-‐ Estrutura determinada da proteína naOva em solução – possibilidade de detectar diferentes conformações
Juntamente com métodos computacionais, cristalografia e RMN são métodos complementares
NMR Cristalografia
Computação
Cada técnica fornece uma contribuição única e complementares para a compreensão dos fenômenos biológicos estudados
Outras técnicas bio=sicas fornecem importantes informações complementares
• IdenOficação de elementos de estrutura secundária – enovelamento • Mudanças conformacionais • Estabilidade protéica • etc...
Dicroísmo Circular (CD)
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Outras técnicas bio=sicas fornecem importantes informações complementares
• Proteína em solução – testar diferentes condições • Distribuição de distâncias inter-‐moleculares • Modelo 3D ab ini&o de baixa resolução – envelope molecular • Mudanças conformacionais
Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS)
Outras técnicas bio=sicas fornecem importantes informações complementares
• Mesmo príncipio do NMR – ve elétrons desemparelhados • Muito poderosa para estudos de centros metálicos em proteínas • Técnica de marcação com spin label – interação com membranas, dinâmica... • Medidas de distâncias entre dois marcadores -‐ DEER
Ressonância ParamagnéOca eletrônica (EPR)
Outras técnicas bio=sicas fornecem importantes informações complementares
• Medidas de estados oligoméricos de proteínas em solução • Constantes de dissociação • Parâmetros energéOcos
Ultracentrifugação analíOca (AUC)
Outras técnicas bio=sicas fornecem importantes informações complementares
• Medidas de parâmetros energéOcos e constantes de afinidade entre proteína-‐ligante e proteína-‐proteína • Ensaio enzimáOco • Número de síOos de ligantes
Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC)
Outras técnicas bio=sicas fornecem importantes informações complementares
• Medidas de massa absoluta de pareculas em solução • Estado oligomérico • Rápida e fácil
Espalhamento de luz a múlOplos ângulos acoplado a cromatografia de exclusão
molecular (SEC-‐MALS) Cristalografia de proteínas na práOca
• Obtenção da amostra – expressão heteróloga • Cristalização • Coleta e processamento dos dados de difração • Resolução da estrutra – problema das fases • Construção do modelo e refinamento • Avaliação da estrutura
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Produção heteróloga de proteínas
-‐ O que é?
Por que é importante produzir proteínas heterólogas?
Primeira etapa – clonagem do gene de interesse
CaracterísOcas de um vetor de expressão
Crescimento da cultura transformada -‐ expressão
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Como controlar a expressão? Indução química IPTG
Análise e acompanhamento da expressão protéica SDS-‐PAGE
Purificação – métodos cromatográficos
• Separação devido a propriedades diferentes das proteínas -‐ Tamanho (SEC) -‐ Carga superficial (troca iônica) -‐ Hidrofobicidade
Expressão heteróloga – possibilidade de produzir proteína modificada (fusão)
Cristalização de proteínas
Fatos históricos
Friedrich Ludwig Hünefeld
“I have occasionally seen in almost dried blood… rectangular crystalline structures which under the microscope had sharp edges and were bright red.”
(1840 – foi o 1º relator de um cristal proteico) John H. Northrop James B. Sumner Wendell M. Stanley
Cristalização proteica: Nobel em 1946
1a. Est. Crist. Biomolecular (B12; 1957): Nobel em 1964
Max Perutz John Kendrew Nobel em 1962. Hemoglobina/Mioglobina
122 anos!
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Modelo original da molécula de mioglobina de Kendrew Princípios da Cristalização de Proteínas:
1. Proteína pura e homogênea 2. Solubilidade proteica e precipitação
• Contatos hidrofóbicos; san&ng in e sal&ng out 3. Supersaturação
• Nucleação 4. Crescimento do cristal 5. Qualidade cristalina
• padrão de difração e limite de resolução
Proteína Pura e Homogênea
Fontes mais comuns de heterogeneidade
• Contaminadas por DNA ou proteínas não relacionadas • Oxidação das cisteínas • Modificações pós-‐traducionais • Estados de oligomerização • Isoformas • População de moléculas mal enoveladas • Flexibilidade estrutural
Mas o que significa cristalização? É um fenômeno de transição de fase!
Proteína sai da solução para uma fase cristalina, através da indução de supersaturação (depende da solubilidade da proteína). Como? • Adição de agente precipitante (batch) • Remoção de água (difusão de vapor) • Troca de solvente (diálise) • Difusão livre por uma interface • Mudança de pH • Combinaçao
Remover água da camada de solvatação Diagrama de Fase para a Solubilização
Referência: Biomolecular Crystallography – Bernhard Rupp (Capítulo 3)
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Parâmetros que afetam solubilidade proteica
• pH • Temperatura • Força iônica • Solventes orgânicos • Polímeros orgânicos
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros -‐ pH
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros -‐ pH
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros -‐ Temperatura
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros -‐ Sais
Forca ionica = ! = 12 ! !!!!2!
!=1
Log(S) = β – Ks(I)
Dependência da solubilidade proteica em relação à alguns parâmetros – Polímeros Orgânicos (PEGs)
Log(S) = β – KscPEG • Não existe pegging in • Compe&ção pelas
moléculas de água
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Nucleação e Crescimento
A colisão entre moléculas podem induzir a formação de agregados cristalinos
Distância (Å)
supersaturação
Tamanho
méd
io da agregação
Nucleação críOca
Metaestável è zona de nucleação
Crescimento cooperaOvo
Separação (centro)
Separação média
Diâmetro molecular médio de 40 Å
A formação de uma massa críOca que permita o crescimento cristalino
Concentração de lisozima (mg/mL)
O processo de cristalização procede em duas fases: Nucleação e Crescimento
Termodinâmica da Cristalização
Métodos de Cristalização Difusão de vapor: gota sentada
[ppt]gota = [ppt]reservatório 2
A concentração no reservatório mantem-‐se praOcamente a mesma
[ppt]gota = [ppt]reservatório
Reservatório
Reservatório
O equilíbrio acontece com a difusão de vapor
O volume da gota diminui, aumentando a concentração de ambos precipitante e proteína
Gota contém: proteína + sol. reservatório + adiOvos + ligantes + etc...
Reservatório contém: agente precipitante + solução tamponante + adiOvos, etc...
Proteína + sol. reservatório: normalmente 1:1, 2:1 e 1:2
§
§ Exceção para os precipitantes voláteis
Ao final do processo (na gota): a) Aumento na [ppt] b) Aumento na [proteína]
Energia de aOvação para vencer a barreira da nucleação
Equilíbrio da solução
Na maioria das vezes é um processo rápido
horas dias (3 a 5)
Independente do precipitante, o processo inicia-‐se rapidamente e desacelera de acordo com a diferença de concentração de precipitante entre a gota e o reservatório
O equilíbrio é dependente da temperatura
Tempo (horas)
% equ
ilíbrio
Dados experimentais + 4˚C ∆ 25˚C
Adaptado de Fowlis et al 1988. J. Cryst. Growth 90:117.
O equilíbrio cessa no momento em que a pressão osmóOca das duas soluções se igualam
Diagrama de Cristalização para Difusão de Vapor
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Diagrama de Cristalização para Difusão de Vapor
Matriz Esparsa
• Condições de cristalização são baseadas em um número limitado de soluções e agentes precipitantes (screens), escolhidos de acordo relatos cieneficos de sucesso na cristalização de macromoléculas
• Muitos diferentes Opos de screenings são disponíveis no mercado
• Os screenings cobrem uma vasta gama de soluções tamponantes, pH, adiObos e agentes precipitantes
• Nota: screenings do Opo “matrizes esparsas” envolvem um “erro” intencional no tocante às possíveis combinações de condições que funcionaram anteriormente
Exemplo do espaço 3D de Cristalização Propensão para cristalização de alguns reagentes
OOmização da Condição de Cristalização
hit
hit
Sal contra PEG screen
Sal contra PEG screen
pH contra PEG screen
pH contra PEG screen
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Materiais usados em cristalização de Proteínas
mosquito
HoneyBee
Cristalização em larga escala
Cristalização manual
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ALGUNS EXEMPLOS DE CRISTAIS DE PROTEÍNAS:
