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Nem toda reação antígeno/anticorpo gera uma manifestação secundária, então, eu vou ter um grupo de reações em que o antígeno e o anticorpo vão se ligar, mas eu não vou ter nem precipitado, nem grumo. Então, como que a gente vai enxergar? Eu vou ter que usar uma revelação. Na verdade, a gente compra kit fechado. Se a reação antígeno anticorpo não gera precipitado, você consegue enxergar algum grumo? Não. Se não gera grumo, você não enxerga ____. Então a indústria deu um jeito de fazer um kit com um “revelador”, entre aspas, uma molécula que vai revelar a interação antígeno anticorpo. Então até aqui eu só quero que vocês saibam isso, dai eu vou explicar cada detalhe.

Nós temos três tipos de reações que visualizam interação primária. O que que é isso? Da união antígeno anticorpo eu não tenho manifestação secundaria. Que reações são essas?

Imunofluorescência Radioimunoensaio Enzimaimunoensaio Qual que é a diferença? A diferença é que quando eu tiver uma reação de imunofluorescência eu vou revelar a interação

antígeno anticorpo usando uma molécula fluorescente, por isso que chama imunofluorescencia. Quando eu tiver uma reação radioimunoensaio, eu vou revelar a interação antígeno anticorpo usando um isótopo radioativo. Quando eu tiver uma enzimaimunoensaio, eu vou revelar a reação antígeno anticorpo usando um sistema enzimático. Nós vamos ver que os princípios, os mecanismos das reações são os mesmos; o que muda é a revelação. Porque que eu tenho que usar uma molécula que fluoresce, ou uma molécula que é radioativa, ou uma molécula que é uma

enzima? Porque se não eu não enxergo. Lembra oque eu falei? Nessas reações o antígeno e o anticorpo se unem, mas não geram nem grumo nem precipitado, então eu não enxergo.

Nós vamos começar com a imunofluorescência. A imunofluorescencia foi uma técnica muito usada. Até hoje muitos laboratórios utilizam a imunofluorescencia. Mas com o

tempo, é uma técnica que está caindo em desuso. Por quê? Porque basicamente.. Em que consiste a imunofluorescencia? Eu vou dar um exemplo pra vcs dai depois eu volto aqui pra explicar a revelação.

Vamos pegar o exemplo que ele perguntou lá.. Eu tenho um paciente, que vai fazer uma cirurgia, que tem um câncer de estômago, por exemplo. Dai o que vai acontecer... eu vou ter um pedaço de tecido, a hora que faz a cirurgia, não vou? O patologista pode pegar este tecido e grudar numa lâmina, fazer o corte histológico lá e grudar na lâmina. O Que que a gente pode fazer? Eu posso pesquisar proteínas especificas do tumor. Vocês já ouviram falar em marcador tumoral? O que que é isso? A célula maligna tem na membrana dela uma proteína que a nossa célula normal não tem. Se a célula maligna tem proteína que a nossa célula não tem, não quer dizer que elas têm epítopos diferentes? Se ela tem epítopo diferente eu posso revelar usando um anticorpo. Então, vamos imaginar que aqui é uma lâmina que eu tenho o tecido lá do tumor. Todo mundo entendeu a situação? Tem um paciente que tem um lá um câncer, faz uma cirurgia e um pedaço desse tecido eu grudo em cima da lâmina. Mas na verdade a patologia faz isso de rotina. Ai isso vai pro laboratório de imuno. Dai eu vou perguntar assim: Será que o câncer de estomago tem uma proteína “f” por exemplo? Que é uma proteína que não é expressa na célula normal. O que que eu vou fazer? Eu vou colocar em cima da lâmina que tem um tecido, um anticorpo especifico praquilo que eu to procurando. Se eu estiver procurando uma proteína “f” eu vou ter que por um anti-F, seu eu estiver procurando uma proteína “g” eu vou ter que por um anti-G, e assim por diante. Isso aqui a gente compra pronto. Você liga lá pra empresa e fala, eu quero um anti-G marcado. Só que se eu adicionar só anticorpo, e o antígeno ligar no anticorpo, eu vou ver alguma coisa? Não. Então quando eu compro este reagente eu falo lá que eu quero um anti-G marcado com uma partícula que emite luz, que a gente chama de fluorocromo. O que que é o fluorocromo? É uma partícula que a hora que eu incido luz sobre ela, ela brilha. Então, o que que vai acontecer.. Se esse antígeno, for o antígeno G e eu adicionar um anti-G o que que acontece? Liga o antígeno com o anticorpo. Dai eu pego essa lâmina que está com o anticorpo grudado, vou expor isso a uma luz. A hora que a luz incide no fluorocromo, ele brilha. Então, a hora que eu olho no microscópio, se brilhar é positivo, se não brilhar é negativo.

Eu vou dar um exemplo aqui pra você. Isso é uma fotografia de verdade tah.. Vocês estão enxergando que isso aqui fluoresce? Por que fluoresce? Porque o antígeno e o anticorpo estão ligados. Então a imunofluorescência nada mais é do que a reação antígeno anticorpo revelada por um fluorocromo. Só que essa técnica que eu mostrei pra vocês aqui ó, Só quem faz é o laboratório de patologia, porque a gente, na verdade, não faz esse tipo de teste. Nas análises clínicas, não vai chegar tecido pra você analisar marcador tumoral. Quem faz isso é o laboratório de patologia.

O Que que a gente pode fazer? Uma adaptação desta técnica. Por exemplo, eu quero saber se o paciente tem doença de chagas. Se ele tem doença de chagas, o que que eu vou procurar? Vou procurar um parasita? Só se tiver em fase aguda. Se tiver em fase crônica, você vai achar? Não. O que que eu posso procurar? O anticorpo. Então eu posso procurar no soro do paciente um anticorpo contra o Tripanossoma cruzi, não posso? Então o que que eu faço? Eu compro da indústria uma lâmina, que já vem grudado, já vem na lâmina isso, um epítopo do Tripanossoma cruzi. Se eu quiser procurar anticorpo contra HIV, que epítopo que eu tenho que grudar na lâmina? Um HIV. Se eu quiser procurar anticorpo contra o vírus do herpes, o que que eu tenho que grudar na lamina? O epítopo da herpes. Vocês entendem que isso aqui muda de acordo com o que eu quero?

Então, voltando ao meu exemplo. Eu quero saber se o paciente tem doença de chagas. Então eu comprei uma lâmina, a gente chama de lâmina sensibilizada, ou seja, uma lâmina que tem grudada o epítopo que eu quero. Ai eu pingo o soro do paciente. No soro do paciente, eu estou procurando o que? Eu quero saber se ele tem ou não tem o que? O anticorpo. Vamos fazer de conta que ele tem. A hora que o anticorpo reconhece o antígeno o que que acontece? Ligou antígeno anticorpo, mas eu enxergo? Não. Eu tenho que dar um jeito de revelar. Então, quando eu comprei esta lâmina, no mesmo kit, veio uma molécula, que é chamada de conjugada. O que que é o conjugado? O conjugado é um anticorpo que responde, que é feito, contra o anticorpo humano. Então, na verdade, é um anti imunoglobulina humana, marcada com um fluorocromo, isso eu compro, no comércio.

Dai vocês vão me perguntar, como que eu faço um anticorpo, contra o anticorpo humano? Isso aqui é feito, não é? Como será que a indústria produz um anticorpo, contra um anticorpo? Eu pego o anticorpo do homem, injeto num coelho, ou num ratinho, no que vocês quiserem, e a cobaia produz o que? Um anticorpo contra o anticorpo humano. Então isso aqui, na verdade é produzido em cobaia. Dai é só vocês saberem tah... Então, por que que eu preciso do conjugado? Se eu não tiver o conjugado eu vou saber se é positivo ou negativo? Não. Então eu preciso do conjugado para revelar. Qual que é a função do conjugado? Revelar a interação antígeno anticorpo. Sem o conjugado eu enxergo alguma coisa? Não, então, voltando.. Peguei a lâmina que tinha o epítopo do Tripanossoma, coloquei o soro do paciente, reagiu, reação antígeno anticorpo. Pra revelar eu coloco o conjugado. O conjugado não reage com o anticorpo? Então onde o anticorpo estiver grudado, ele liga. Se tiver só o epitopo, o conjugado não liga. Então este conjugado só vai ligar se o anticorpo estiver ligado. Se não tiver anticorpo no soro, o conjugado liga em algum lugar? Não. Então, se o conjugado ligar, fluoresce. Se o conjugado não ligar, não fluoresce.

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Esse método, por ser uma variação, a gente chama de método indireto. Eu não to revelando diretamente a presença do antígeno, eu estou revelando a presença do anticorpo contra ele. Esse método é o que a gente usa no dia a dia. Hoje a gente usa imunofluorescencia para chagas, para toxoplasmose, hiv, sífilis e mais um monte de outras coisas, mas principalmente essas quatro doenças.

Eu falei pra vocês assim, a imunofluorescencia já foi uma técnica muito utilizada, mas atualmente ela esta caindo em desuso. Por que será? Eu falo pra vocês que é uma técnica sensível, é uma técnica especifica, e de boa reprodutibilidade. Mas como que eu vou ver a fluorescência? Pra eu ver a fluorescência, eu vou pegar aquela lamina, vou colocar num microscópio, que é parecido com esse microscópio que vocês tem aqui, só que no lugar da lâmpada branca que vocês tem, na verdade é uma lâmpada de mercúrio. Por quê? Porque ela estimula o brilho. Eu coloco a lamina aqui e vou lendo. Se brilhar é positivo, se não brilhar é negativo. Aí, eu digo para vocês, é uma técnica especifica, é uma técnica sensível, então por que será que o povo esta parando de usar? Vamos fazer de conta que vocês estão lá no laboratório. Isso que eu trouxe pra vocês é um resultado excelente. Então eu vou lá ao laboratório, fiz a reação, e olhei, brilho aqui, presente. Se tivesse só o campo escuro eu ia dizer que é negativo. Agora, você já imaginou aquela pessoa que não tem prática? Se ela deixar de lavar nos passos em que ela tem que lavar, ou lavar mais ou menos, ou fizer uma reação meio desequilibrada, vai sobrar reagente na lâmina, e ai vai dar aquele brilho fraco. Isso é positivo ou negativo? Então, o grande problema da imunofluorescencia é a subjetividade da leitura. Depende do operador. Então eu vejo uma lâmina diferente de vocês. Eu tenho certeza que se eu trouxesse aqui dez lâminas de imunofluorescencia e passasse aqui pra todo mundo fazer o mesmo, o resultado ia ser diferente. Por quê? Porque depende só do olho de que está vendo. E isso, pra nós, no laboratório é ruim. Por que que é ruim? Porque induz o erro. Eu posso soltar positivo e você pode soltar negativo. Então a imunofluorescencia esta caindo em uso porque ela tem a inconveniência, a grade desvantagem, de ser subjetiva a leitura, ou seja, depende do operador.

(15:00) Radioimunoensaios eu nem vou dar mais pra vocês, por que não usa mais. Era uma técnica que no lugar do fluorocromo, era

um isótopo radioativo. Ai a gente tirava o raio-x e revelava. Por que que caiu em desuso? Por causa do risco. Então, pra trabalhar com radioimunoensaio você tinha que tem um laboratório com parede de chumbo, tinha que usar avental, uma serie de inconvenientes que inviável em um laboratório clinico. Então hoje a gente não usa mais.

Enzimaimunoensaio. O mais utilizado hoje. É o forte da imuno dentro do laboratório. Eu queria chamar muito a atenção de vocês pro seguinte, eu já vi profissionais do mercado falar que enzimaimunoensaio e ELISA é a mesma coisa, e não é. A enzimaimunoensaio é uma reação em que a revelação é enzimática. Todo mundo já viu aquele teste de gravidez que é duas tirinhas, que você põe e fica duas fitinhas colorida, ou uma fitinha, se não tiver gravida? Aquilo é um ensaio imunoenzimatico. Só que não é uma ELISA. Por que que a grande maioria das pessoas acha que enzimaimunoensaio e ELISA são sinônimos? Porque hoje, num laboratório clinico, eu posso dizer pra vcs, que 99% das reações de enzimaimunoensaio é ELISA. Então, quando a gente fala de enzimaimunoensaio nós temos dois tipos:

(17:22) Homogêneos Heterogêneos Então eu tenho dois tipos de reação de enzimaimunoensaio. Como que eu vou saber se ele é homogêneo ou se ele é

heterogêneo? Nós vamos fazer assim: Os homogêneos não tem etapa de lavagem, eles são mais rápidos. Os heterogêneos são aqueles que têm etapa de lavagem e por isso demandam mais tempo. Mas o principio é o mesmo da imunofluorescencia, mas ao invés de a gente usar uma marcação fluorescente, eu vou usar

uma marcação enzimática. Os homogêneos, nós vamos ter muito pouco num laboratório de analises clinicas. O homogêneo usa geralmente laboratório

de farmaco. Um laboratório de farmaco usa o ensaio enzimático pra detectar a concentração metabólito de medicamentos na corrente circulatória. Por exemplo, pra saber se um paciente está ou não tomando um medicamento, existem alguns testes que eu posso fazer pra detectar a presença daquele medicamento, e nessa caso eles são homogêneos, porque eles não dependem de lavagem.

Eu coloquei um exemplo aqui, por que quem for pra análises clínicas não vai ver, só vai ver quem for fazer pesquisa, quem for pra área de farmaco... Por exemplo, eu quero saber se o paciente está tomando determinada droga, ou seja, minha pergunta é, tem a droga ou o metabólito dela na corrente circulatório? O que que eu vou fazer...

Eu vou adicionar uma enzima, Tem o medicamento na corrente circulatória? Sim ou não? Ai qual que é o meu reagente? Eu vou adicionar a enzima que no seu sitio ativo, já vem grudado aqui, o mesmo medicamento, então, por exemplo, eu quero saber se o meu paciente toma gentamicina. Eu tenho que comprar um kit, que me de uma enzima, que tenha em sitio ativo uma molécula de gentamicina. Se eu quisesse dosar, por exemplo, o zovirax, aciclovir, tenho que ter uma enzima, que tenha no seu sitio ativo uma molécula do aciclovir. Eu tenho que comprar um kit correspondente ao que eu precisar. Dai, o que que vai acontecer.. eu vou adicionar um anticorpo anti- meu epítopo, ou seja, minha droga. Tudo isso aqui vem no kit. Então eu vou por no soro do paciente. Qual que é minha pergunta? Está tomando droga? Se tiver tomando a droga, o que que ele vai ter no plasma? O medicamento. Eu vou adicionar na lâmina uma enzima que tem o medicamento grudado no sítio ativo, e um anticorpo. O que que vai acontecer. Se o paciente tiver tomando medicamento, esse anticorpo aqui vai ser consumido, ou seja, ele vai ligar aqui! Se ele ligar aqui, isso aqui não fica livre? O sitio ativo enzimático não fica livre? Agora, se o paciente não tiver tomando medicamento, o que que acontece.. o anticorpo tem onde se ligar? Nao. Onde que ele vai ligar então? Então quando o paciente não toma medicamento o anticorpo faz isso... A hora que o anticorpo liga na enzima ele bloqueia o sitio ativo? Bloqueia, então essa enzima não tem função. Ai que que eu faço.. Eu adiciono o substrato na enzima. Quando o sitio ativo esta livre, o substrato encaixa, e muda de cor. Quando o anticorpo esta ocupando o sitio ativo tem como o substrato encaixar? Então aqui permanece inalterado. Então na verdade que que eu fiz... Eu usei uma reação catalisada por uma enzima pra detectar, neste exemplo, um antígeno, que é a minha droga. Mas, eu poderia, por outros métodos, pesquisar anticorpo também. Isso aqui gente, nós não vamos fazer em laboratório de analises clinicas.. Isso não da diagnostico.. Isso é um ensaio homogêneo, não depende de etapa de lavagem.. Agora, o que que é o grosso do laboratório, em termos de enzimaimunoensaio.. São os heterogêneos...

Os ensaios heterogêneos, eles são ensaios que dependem de etapa de lavagem.. estes ensaios são os chamados, ELISA, que significa (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay). Ensaio imobilizado em fase sólida. Cuidado ao escreverem isso, por que não é uma sigla? É tudo em maiúsculo. Então o nome já diz. Eu tenho que ter um suporte pra fazer, não posso ficar pingando tudo na lâmina. Esse suporte, antigamente era feito em placa, na microplaca, ou em p..... Hoje em dia a gente só usa microplaca. Então as

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reações de ELISA hoje são feitas em microplaca, uma plaquinha, só que a plaquinha vai funcionar como um suporte da reação. Então a plaquinha é essa daqui ó. Essa plaquinha vem numerado de A à H, e de 1 a 12. Então no poço A1 eu vou ter um paciente, no poço A2 eu vou ter outro paciente e assim por diante. Isso aqui é como se fossem vários tubos individuais. Então o que que tem nessa plaquinha. Faz de conta que isso daqui é um pocinho daquela plaquinha. Vamos fazer de conta que eu quero fazer um ELISA, que a gente faz muito, pra diagnostico de HIV. Todo mundo lembra que eu não vou conseguir pesquisar o vírus, eu vou ter que pesquisar o anticorpo. Então chega o paciente, este paciente tem HIV? Eu quero dizer, ele tem anticorpo contra esse vírus? Na minha plaquinha eu vou ter um antígeno grudado lá. Então a plaquinha da ELISA, ela é sensibilizada lá, com um epítopo, no meu exemplo, do HIV. Se eu colocar uma ELISA pro HCV pode ser o mesmo epítopo? Não, tem que ser outro. Se eu fizer uma ELISA pra toxoplasmose, pode ser o mesmo epítopo? Não, tem que ser outro. A placa que vocês vão comprar é de acordo com aquilo que vocês vão pesquisar. Então hoje a gente compra um kit, pra diagnostico de HIV. Já vem a placa sensibilizada, com o epítopo grudado, um revelador, e todos os meus reagentes. Então eu vou pegar aquela plaquinha, e em todos os pocinhos dela ela tem antígeno, ou seja, o epítopo, uma proteína do vírus. Ai eu pingo o soro do paciente. O que que eu to pesquisando no soro do paciente? Presença de anticorpo. Se ele tiver o vírus, ele tem o anticorpo, se ele não tiver o vírus, tem como ele ter o anticorpo? Então eu pinguei o soro do paciente. Ai eu deixo ele meia hora no banco. Pra que? Pro anticorpo conseguir achar o antígeno. Ai depois dessa fase aqui, o que que eu faço. Eu faço uma lavagem. Eu pego agua e lavo, lavo, lavo. Por que se o anticorpo estiver grudado ele vai sair? Não. Ele vai estar grudado aqui. Mas tudo o resto que esta no soro, eu não falei pra vocês que o soro tem sais, tem vitamina, tem proteínas, tudo o resto tal ah. Fica só o anticorpo. Se não tiver esse anticorpo o que que é que sobra? Sobra epítopo. Então se o paciente tiver o HIV, ele tem o anticorpo que gruda na proteína. Eu enxergo alguma coisa? Não. Ai eu vou adicionar meu conjugado. Meu conjugado é uma anti-imunoglobulina humana. Qual a diferença da imunofluorescencia? Ao invés de ela ser marcada por um fluorocromo, ela é marcada por uma enzima. Por isso que eu falei, o principio é o mesmo, só a revelação que muda. Se o anticorpo estiver grudado, o que que vai acontecer? O conjugado se liga. Por que o conjugado reconhece o que? O anticorpo. Agora, se o anticorpo não estiver ligado, o conjugado vai ligar? Não, porque ele só reconhece anticorpo. Ai nessa fase aqui, eu lavo também. Vocês imaginem assim, eu peguei o conjugado, ele ta ali, se eu não lavar, vai dar tudo positivo, então a lavagem certa... a hora que eu pingo conjugado e não tem anticorpo, ele gruda na placa? Ele vai embora na lavada. E ai? Ai eu revelo.. adiciono substrato, geralmente um substrato homogêneo, e muda de cor. Esse método é o método indireto, então eu to pesquisando o anticorpo, se o paciente for positivo ele tem o anticorpo, ligou no antígeno, se o anticorpo estiver presente, o conjugado liga, se o conjugado ligar, ele não tem uma enzima?

(30:12) A maior parte das enzimas que a gente usa ou é peroxidade ou é fosfatase alcalina. Quando eu uso o meu produto bas, o meu

substrato pra ela é o peroxido de hidrogenio. Então qo que que acontece. O que que a peroxidade faz?. Peroxido de hidrogênio é a mesma coisa que agua oxigenada. Quando a peroxidase age sobre o peroxido de hidrogênio, não gera uma reação química? Que produz agua e oxigênio? Isso aqui é incolor, eu não consigo enxergar. Por isso que eu tenho que usar um agente cromogêneo (?) na verdade, a gente usa um agente que chama DNB, se a enzima tiver lah, o que que acontece com o peroxido de hidrogênio? Ele é quebrado, eu oxido o oxigênio e oxida o ___. Na verdade, tudo isso aqui, só acontece pq eu tenho a enzima. Se o conjugado não estiver ligado, eu não tenho a enzima, o que que acontece quando eu adiciono o peroxido de hidrogênio no dnb? Vai pra amarelo? Não. Então na verdade é tudo por causa da enzima... Então ficou amarelo pq a enzima ligou.. Não fica amarelo pq a enzima naao liga... Esse é o método direto, mais usado hoje em dia, que é pra detectar anticorpo.

Ai eu tenho um ELISA especifico que chama método para captura de IgM, vocês lembram que quando eu comecei a dar aula pra vocês, eu falei pra vocês que é importante eu detectar separadamente a presença de anticorpo IgM e IgG. lembram disso? Por que será que é importante? Por três motivos. É importante saber se o paciente tem IgM? Sim. Primeiro: determina a fase do doente. Segundo: avalia risco de transmissão. E terceiro: é o único anticorpo que marca infecção na criança, porque não atravessa placenta. Tudo isso eu já dei, eu só to recapitulando. Então eu tenho que ter teste pra pegar só IgM. Na plaquinha de __________ eu não tenho antígeno, eu tenho na verdade um anticorpo que só liga na IgM. Vamos fazer de conta que é o mesmo paciente, um paciente que tem HIV, só que agora eu preciso saber se este anticorpo é IgM ou IgG. Ai eu pingo o soro dele. Se o soro dele tiver IgM, vai ligar. Só que vocês entendem que vai ligar se for IgM pra HIV mas vai ligar também se for IgM pra qualquer outra coisa. Então nessa fase aqui, o que tiver IgM liga. Ai o que que eu faço? Eu pipeto um antígeno específico do HIV. É aqui que esta a grande sacada desse método. Por que se este anticorpo for contra a Herpes, o antígeno vai ligar? Não. Esse antígeno só liga se esta IgM for anti-HIV. E ai? Ai eu ponho meu conjugado. Só que neste exemplo o meu conjugado é um anticorpo, marcado por uma enzima. E ai o resto é igual, o substrato promove ........ Agora vem minha pergunta... Se eu fizer um ELISA de captura pra IgM, e der negativo, exclui o risco de estar doente? Eu to lá no laboratório, eu fiz um ELISA de captura pra IgM, e não ficou amarelo, dai eu falo que é negativo, isso quer dizer que o paciente não tem a doença? Não, porque pode ser IgG. Entenderam a diferença? Isso aqui não vai dar diagnóstico, essa vai me dar diagnostico. (apontando para os exemplos)

A gente muita vezes tem a ideia que as reações imunológicas são só para pesquisar anticorpos, porque a maioria das reações são mesmo. Mas a gente pode pesquisar antígenos, por exemplo, todas as técnicas que vocês tem hoje em analises clínicas, para detectar hormônio é enzimática. Como que eu faço? É só inverter. Eu não quero pesquisar o antígeno agora? Então na minha plaquinha eu não vou ter mais o antígeno, eu vou ter o anticorpo. Então vamos imaginar que isso aqui é pra pesquisar TSH. Na plaquinha eu vou ter que ter um anti-TSH. Vou pipetar o soro do paciente. Se o hormônio estiver lá o que que vai acontecer? Vai se ligar. Só que eu não enxergo. Ai eu adiciono um conjugado. O que que é o conjugado? Um anti-TSH marcado com uma enzima. Ai ele gruda, por isso chama sanduiche. O antígeno fica no meio de dois anticorpos. Esse aqui é marcado por uma enzima, se ele é marcado por uma enzima, eu adiciono um substrato cromógeno ele........ Estes testes aqui a gente usa muito pra detectar hormônio. ..... E vocês vão ver que não é substrato cromogêneo.

Todos os testes que eu passei pra vocês até agora, vocês perceberam que o positivo é que tem cor? Então, até agora, a intensidade da cor que dá aqui, e diretamente proporcional à concentração, ou seja, quanto mais anticorpo eu tiver, mais amarelo fica. Esses métodos, a gente chama de métodos não competitivos. O que que é um método não competitivo? É aquele em que a intensidade da cor é diretamente proporcional a concentração. Então quanto mais anticorpo eu tiver, mais amarelo vai ficar. Por quê? A grande maioria dos métodos é desse tipo. No laboratório, a maioria dos testes que a gente ver é desse tipo.

Só qeu a gente tem alguns métodos competitivos. Eu vou dar um exemplo. Aqui, eu tenho um método de competição pra pesquisar antígeno, vamos dar o mesmo exemplo que eu dei lá em cima. Vocês querem detectar TSH no soro do paciente. Só que ao invés de eu sar este método, vocês escolheram no mercado, por que era mais barato, pq era mais sensível, por n motivos, comprar este kit. Este kit tem principio diferente. Ele não é não competitivo, ele é competitivo. Na placa eu tenho um TSH sintético. A hora que eu pingo o soro do paciente eu não tenho outro TSH? Ai eu adiciono o conjugado, o que que é o conjugado?

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É um anticorpo, marcado por uma enzima, qeu reage com o TSH. Vocês concordam que quando mais hormônio eu tiver no soro do paciente, mais anticorpo vai se ligar no hormônio do soro, que é o que esta livre? A hora que eu lavar o qeu que vai acontecer? Ele vai sair. Vocês concordam que quando mais hormônio eu tiver, mais hormônio fica na placa? E o que que vai acontecer? Menor intensidade da cor. Então no método competitivo, o antígeno da placa e o antígeno do soro competem com a ligação com o conjugado. Por isso que é competitivo. Quanto mais antígeno o soro tiver, ele não vai consumir o conjugado? Menos conjugado vai sobrar pra ligar na placa, menos intensidade de cor. A intensidade da cor é inversamente proporcional a concentração. Por que quanto mais ele ligar, oq eu esta no soro, mais vai embora, menososbra pra ligar, nesse caso, o antígeno da placa, e o antígeno do soro competem pela ligação do anticorpo quanto mais antígeno eu ligo aqui, ou seja, quanto mais TSH eu tiver, mais eu vou consumir o conjugado,menos conjugado vai sobrar pra ligar, ou seja, menor a intensidade da cor. A reação é a mesma, peroxido de hidrogênio, então minha pergunta: o positivo é o que sempre fica colorido? Não, depende do principio do método.

45.00 Vamos fazer de conta que você não tem TSH no seu soro. Quando você coloca o conjugado se eu não tenho aqui no soro, ele

vai ligar aonde? No que está na placa. A hora que você lavar ele vai sair? Não. Aqui da uma cor forte. Então quanto maior a cor, menos eu tinha, por isso é competitivo.

Existe no mercado um sistema, que na verdade, ele pode até dispensar o conjugado, que é um sistema químico, de duas moléculas, que chama biotina-avidina. Então ao invés de eu marcar com uma enzima, eu posso marcar... Então aqui eu tenho o meu antígeno, aqui eu tenho meu anticorpo, dai o conjugado, ao invés de eu marcar diretamente com a enzima, eu marco com uma molécula química que chama biotina. E a enzima, eu marco com uma molécula química que chama avidina. Todo lugar que eu tenho biotina avidina assim, ela se liga, igual um polo positivo e outro polo negativo. Qual que é o resultado disso? A única diferença é que a empresa que vende esse kit resolveu marcar o conjugado, uma molécula química, e a enzima o outro. Ela fez separado. Mas o resultado final vai ser o mesmo. O uso desse tipo de material esta crescendo agora, porque tem mais estabilidade. Se você não tem o conjugado com a enzima ligado diretamente ele dura mais tempo então o prazo de validade são mais longos. É a única diferença, mas o principio é igual. Tudo igual. Tem o antígeno, que liga o anticorpo, que liga o conjugado se deu cor é positivo, não deu cor é negativo. Só que eles usam uma outra estratégia. Aqui é um exemplo de como fica uma reação.. Nem todos os laboratórios fazem esse método, pq... pq a plaquinha, pra vcs terem uma ideia tem 96 poços, toda reação, pra eu validar, eu tenho que ter um controle positivo e um controle negativo. Então, quantas amostras eu posso fazer ao mesmo tempo? 94. Se a placa tem 96, e eu tenho que fazer um pos e um neg sobra 94. Só que será que todo laboratório entra 94 pra tirar HIV, por exemplo, todo dia? Então por exemplo.. Eu não posso demorar muito pra soltar resultado.. Eu não posso soltar resultado daqui 3 meses.. Se entrar 4 amostras, vcs concordam que eu vou 1,2,3,4, um pos e um neg? Todo mundo entendeu? Eu vou gastar aqui 6 poços. Dai amanha entra mais 4.. Só que vcs concordam que tem que por o pos e o neg de novo? Então eu perco dois..sempre... ou seja.. Quanto maior o numero de amostras, mais barato fica o teste, pq eu consigo fazer mais.. pq se eu for fazendo de pouquinho, eu vou gastando o pos e o neg todo dia.. Então eu vou perdendo este teste.. Então muitos laboratórios fazem a opção por não fazer, mas mandar pra fora pra outro laboratório fazer. O ELISA é tanto mais barato à medida que você faz um grande volume, pq vc economiza. O que que você pode fazer.. Eu não vou ficar falando assim.. Esse aqui é positivo, esse aqui é positivo, e esse aqui, o que será que é? Positivo ou negativo? Eu não vou ficar fazendo isso neh gente.. Tem que ter algum jeito de eu automatizar isso.. Então o que que a gente faz.. Isso não é cor? Cor, a gente lê no espectrofotômetro. Então eu leio lá no espectrofotômetro.. vcs lembram lá da curva que eu dei pra vcs.. De sensibilidade/especificidade? A gente define um cut off, fala assim, ABO que for acima, por exemplo, de 0,6 vai ser positivo, e ABO que for abaixo de 0,2 vai ser negativo. O que tiver entre 0,2 e 0,6 vai ser inconclusivo. Então na verdade, vcs não vão olhar a cor. Isso vai ser lido no espectrofotômetro. Hoje, o ELISA é tão usado, que as empresas que vendem o kit, se você comprar um quantidade “X” de kits por mês, eles colocam um equipamento pra leitura, chama leitor de ELISA, no seu laboratório, vc não paga por isso, a gente chama isso de regime de comodat (?). Então os grandes laboratórios, que tem grande rotina, a gente compra o kit, e a empresa, por exemplo, a Roche, todo mundo vende kit de ELISA hoje em dia. A hora que eu compro um kit da Roche, eles vão lá e instalam um aparelho pra mim. Ai eu posso me automatizar. A gente pode só fazer leitura automatizada, ou a gente pode automatizar todo o procedimento, onde eu coloco o soro e ele faz tudo sozinho e isso é uma grande vantagem.

51.00 Bom, nós temos, nesse exemplo que eu dei pra vocês, nos temos a cor, pq eu uso um cromógeno, um agente cromogênio,

lembram que eu marquei aqui? Mas, com o passar do tempo, começaram a aparecer diferentes tipos de revelação, o principio da reação é o mesmo, mas o que que acontece, ao invés de eu ter um substrato cromogêneo, ou seja, uma coisa que da cor, eu posso ter um substrato fluorigeneo, que fluoresce. O que que muda? Só aquele dnb lá. Ao invés de colocar um dNB, eu coloco uma substancia que eu posso ver no fluorimetro, num comprimento de onda. É a única diferença. Esse método aqui, usando um substrato fluorigeneo, não pegou muito, pq da muita dificuldade de interpretação.

O que que hoje esta sendo usado.. um substrato quimioluminescente, então ao invés de eu ver cor, eu vou medir luz. Ao invés do meu tnb mudar de incolor pra amarelo, se ele for oxidado, ele vai emitir luz. E ai o meu equipamento vai ler a intensidade de luz. Então qual que é a diferença? Um dá cor, e outro dá luz. Hoje gente, praticamente todos os laboratórios estão substituindo os substratos colorimétricos pelos quimioluminescentes. Quimioluminescencia não é outro método, é uma forma de leitura de ELISA, diferente. Por que? Eu só troco o substrato cromatogenico pelo substrato quimioluminescente. É a única diferença. Esse é inteirinho automatizado. É por isso que a gente está tentando substituir. E depois, quando eu tenho qualquer reação de ELISA, vocês percebem que lá no pocinho eu tenho um único epítopo? Todo mundo percebeu que em todos os exemplos que eu dei que lá no pocinho tem uma proteína só. Só que quando eu tenho o agente infeccioso, eu formo anticorpo só contra uma proteína desse vírus ou dessa bactéria? Não, eu tenho uma resposta policlonal, ou seja, eu tenho anticorpo contra tudo aquilo que este agente tem. O que que vai acontecer.. muitas vezes a gente fica como inconclusivo, ou seja, não consegue fechar diagnostico, então eu tenho que fazer um teste que tem maior o que.. Especificidade ou sensibilidade? Especificidade. O que que vai acontecer.. o que a gente elege é o immunoblot. O immunoblot é muito parecido com ELISA. Ele é uma tira de nitrocelulose, onde eu tenho todas as proteínas daquele agente infeccioso. Vou dar um exemplo bem fácil. Quando eu vou fazer ELISA pra HIV, na minha placa tem uma proteína, que chama GP120, GP143, depende do tipo de ELISA que eu compro. Aqui eu consigo ter a gp120, a gp 141, a gp 104, todas as proteínas do vírus. E não é diferente? É como se eu tivesse um monde de ELISA junto. Ai vamos fazer de conta que o meu ELISA deu inconclusivo. Deu inconclusivo pq? Provavelmente pq aquele epítopo que eu tenho na placa não ta sendo especifico pro que eu quero. A hora que eu faço a reação de ELISA em cima de uma tira que tem um monte de proteína, vocês concordam que esse paciente tiver HIV ele vai ter anticorpo contra essa proteína, anticorpo contra essa proteína, e assim por diante... Então o imunoblot ele consegue detectar diferentes anticorpos que aquele paciente produziu contra o mesmo vírus.

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E não eu consigo sair dessa questão de ........?? qual que é a diferença.. o ELISA pega um anticorpo único e exclusivamente. Mas nos dois se eu tiver uma ELISA não vai conjugação, agora, o immunoblot não, ele pega a resposta policlonal e aqui, acima de 2 ou 3 bandas ele já consegue positivo. Pq é muita coincidência neh eu ter dois vírus que tem 2, 3 4 proteínas iguais. Uma ate pode ser, tipo a p24, p24 é uma proteína que o HIV tem mas o vírus da herpes também tem. Então se eu fizer um ELISA pro p24, quem tiver herpes vai dar reação cruzada. Agora se eu puser uma dessa no immubobloc não. O ELISA é mais sensível mas immnobloc é mais especifico.

Pq que eu não uso direto o immunobloc, se ele é mais especifico? É pq ele é menos sensível. Lembra, aquele que é mais especifico é menos sensivel. Geralmente os testes de triagem são sensíveis, e os testes de confirmação são específicos. Hoje gente, o immunobloc a gente só ta fazendo pra HIV, e pra HTLV, antigamente a gente fazia pra hepatite C, pra um monte de coisa, hoje a gente não faz mais.

Esse último aqui, é um ensaio imunoenzimático também que é aquele teste de gravidez que vocês vem na farmácia. Na verdade, é um teste imumocromatogafico. O que que tem naquela fitinha? A gente não enxerga tem e que tem. Nessa região da fita a gente tem um anticorpo anti BHCG, de coelho, que já ta grudado no substrato de propósito. Na metade da fita a gente tem um anticorpo anti BHCG e nesse outra extremidade, eu que é +/- a faixa de controle, a gente tem uma antiimunoglobulina de coelho, ou seja, só vai grudar se tiver anticorpo de coelho. Ai eu coloco isso aqui na urina. Se a mulher tiver o BHCG por cromatografia, isso é como se fosse uma tirinha de papel, o hormônio vai subir. Então esse hormônio subiu. Passou por aqui, não é anti BHCG?, não liga no anti-bhcg, entao grudou. Grudou aqui. Dai isso aqui continua subindo. Esse aqui não é anti-BHCG? Entao ele vai ligar. Porque o anticorpo liga no antígeno. Ligou, formou a primeira fitinha aqui. Ai, o que que acontece, muitas vezes eu tenho excesso de anticorpo, anticorpo livre, sobra. Esse anticorpo não é do tipo M? a hora que eu chego aqui eu não tenho uma antiimunoglobulina tipo M? Então ela liga diretamente no anticorpo. Aqui eu tenho a tira do controle, e aqui eu tenho a tira teste. Então o que que acontece, essa faixa, só aparece se tiver o hormônio. Vocês concordam que se não tiver essa bolinha não tem como ligar? Agora, aqui, liga sempre. Por que que liga sempre? Porque é um anticorpo, e aqui um anti -anticorpo tipo M. Se não aparecer nenhum, tem que ir lá e fazer de novo tah. Por que pensa gente, tem que ter alguma coisa que apareça, mesmo na ausência do hormônio. Esse é o teste de farmácia, na verdade a ordem da tira controle e positivo varia de teste pra teste, de marca pra marca, mas o principio é esse, um teste que pinga o hormônio entre dois anticorpos, o controle é um anti anticorpo do tipo M, e o anticorpo tipo M não depende da presença de hormônio. Esse é o imunocromatrográfico, e o imunoenzimatico também.

Bom, com isso... aqui é só uma ilustração.. se vocês virem as duas tiras é positivo, se virem as duas tiras é negativo, se vocês não verem nada, o reagente desestabilizou, guardou errado, está invalido, tem que repetir.. é sempre assim gente.. quando eu faço um teste de laboratório eu sempre vou ler os controles. O controle positivo tem que ser positivo e o controle negativo tem que ser negativo. Só depois que eu posso validar o teste. Geralmente o controle é padronizado, a concentração, mas o hormônio da urina não né.. Tem mulher que vai ter mais e tem mulher que vai ter menos. O que pode acontecer é que a mulher está gravida há pouco tempo e tem uma quantidade pequena, dai o teste pode não ser sensível pra detectar. Ai você tem um falso negativo. Mas isso é pq ela tem pouco ainda.

01h03min00seg Gente, nós vimos todos os testes imunológicos que a gente tem por ai. Tudo, tudo, tudo. O que que falta eu dar pra vcs

agora.. só o fluxo das doenças.. Então o que que a gente vai ver.. Eu não vou mais falar em teste, pq teste, o princípio vcs já viram. Agora nós vamos estudar os fluxogramas. Então presta bastante atenção, pq a aula que eu dei há 2 anos atrás já é diferente dessa pq p fluxograma mudou o ano passado. Entao vcs tem que ficar espertos, pq o ministério muda os protocolos que a gente tem que seguir em cada caso.

Infecção pelo HIV. Quando eu vou fazer diagnostico de infecção pelo HIV. Pelo cronograma gente, eu tinha que dar tudo de diagnóstico, depois

tudo de banco de sangue, eu prefiro dar junto. Vou falar de HIV, já falo como que é pra diagnóstico e com oque é pra banco de sangue, pra não ter que repetir tudo de novo.

Todo teste de diagnóstico, de triagem, ele tem que ser mais sensível do que especifico. Todo teste confirmatório, ele tem que ser mais especifico do que sensível. Então os testes de triagem tem sensibilidade, enquanto os testes confirmatórios tem especificidade. Pra laudar, ou seja, no Brasil nós temos uma legislação, eu só posso emitir laudo de kit registrado na ANVISA. Então quando vcs forem comprar, vcs só vão comprar kit que tem registro na ANVISA, se não vocês não podem soltar laudo. Vocês podem ate usar pra fazer pesquisa, pra fazer o que vocês quiserem, mas pra laudar não pode. Existe uma portaria que rege diagnóstico do HIV, que é a portaria 151 de 2010, essa portaria revogou a portaria anterior, que era de 2003. Então hoje, todos os laboratórios que vão fazer diagnóstico, eles tem que triar a mostra, fazer a confirmação, sempre que necessário, e por ultimo, se for o caso, tem que fazer o immunoblot. Eu já vou destrinchar isso que eu falei pra voces. Até agora, o que que eu preciso que vocês saibam, triagem é um teste sensível, confirmatório é um teste especifico. Eu posso usar um teste confirmatório pra fazer triagem? Não. Pq não? Pq ele não é sensível. Bom, o que que fala na portaria.. esse ai é o fluxograma, mas nós não vamos ficar decorando fluxograma. Nós vamos fazer assim ó.. Pra diagnóstico.. Todo mundo entendeu? O que eu to falando de diagnóstico, não vale pra doador de sangue. Chega a amostra, pra diagnóstico do HIV. Qual que é o fluxo? O primeiro teste é o enzimaimunoensaio. é o ensaio imunoenzimatico, pode ser um ELISA, por exemplo. Então chegou a amostra, eu faço um ELISA. Se der negativo, eu solto esse laudo. Se der positivo, eu não posso liberar. Se der positivo eu tenho que fazer um segundo teste que não pode ter o mesmo principio, o que que eu quero dizer, não pode ser enzimaimunoensaio. Entao aqui, a gente pode usar imunofluorescencia indireta ou hemaglutinacao. Entao se o ELISA da positivo, eu não posso soltar, eu tenho que confirmar, tah. Ai qual que são as possibilidades? Quando eu faço o segundo teste. Positivo. Se der positivo, ele já não estava positivo? Ou qual que é o outro resultado? Negativo, ai você fica com um positivo e um negativo. O que que você solta? Nenhum. Ai você vai fazer o immunobloc, e é aqui que você vai laudar. Entao assim, o ELISA, só fecha diagnóstico se for negativo. Se for positivo, pela portaria voces tem que fazer um segundo teste, que tem que ter principio diferente, se confirmar voces soltam, se for discrepante ai você vai pro immunobloc. Dai aqui já entra o indeterminado, mas a gente sabe que se der indeterminado aqui, e aqui não adianta fazer o westernbloc que vai dar indeterminado também. Entao ó, pra HIV, vc faz um ELISA, na amostra, se der negativo você solta, amostra não reagente para anti-HIV. Se der positivo ou indeterminado você tem que confirmar. Comq eu teste você confirma? Você pode usar qualquer coisa, menos enzimaimunoensaio. Se bater o resultado, esse é positivo e esse é positivo, você solta. Se não bater, você vai fazer o immunobloc. Esse é o fluxo correto que a gente tem que seguir. Ai voces podem flar pra mim assim.. ó, se aqui deu negativo, ele pode estar na janela. Pode. Mas dai é o medico quem vai ter que pedir daqui 30 dias um novo exame.

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Gente, pra doador, não é a mesma portaria que a gente segue. To falando pra voces, hoje vale a portaria 153, mas vai mudar, pq já tem uma consulta publica pra mudar essa portaria. Entao vcs fiquem espertos pq pode ser que até o final do ano mude. Como que a gente faz hoje? Pra doador agora. Colheu a bolsa. Qual que é a grande diferença. Quando eu vou fazer diagnostico, na amostra eu faço uma ELISA, dependendo do resultado dele que eu sigo o fluxo, não é assim? Quando é doador, a gente faz ao mesmo tempo, dois ELISAS simultâneos, por metodos diferentes. Entao eu compro lá um EILSA comercializado pela ____ e outro ELISA comercializado pela Roche, e eu faço os dois testes na mesma amostra. O que que vai acontecer? Se os dois testes derem não reagentes, derem negativos, eu libero a bolsa. Se os dois testes derem positivo, eu bloqueio a bolsa, pra que? Pra não dar pra ninguém. Dai eu vou repetir. No doador, você só vai liberar a bolsa pra uso se os dois ELISA derem negativo. (...)Se tiver na janela não pega. (...) Se um dos dois der positivo ou indeterminado vc bloqueia, vc jah vai la no computador e diz não é pra usar essa bolsa. Pq na verdade gente, eu não sei se vcs tem essa ideia, qdo vcs tiverem hemato vcs vao ter essa ideia. A gente não transfunde sangue total, não é o sangue que a gente tira de vcs e transfunde, a gente faz transfusão só de de plasma, a egente faz transfusão só de plaquetas, entendeu? Não é o sangue total que a gente transfunde. Se discordou, ou se deu reagente em um aqui, vc jah bloqueou. Você repete o teste em duplicata. Entao você faz de novo o teste em duplicata, duas vezes cada um. Dai se eles concordarem, os dois testes derem negativo, você pega e libera aa bolsa. Dai se os dois derem positivo, ou indeterminado, você bloqueia e convoca o doador, pq o banco de sangue não para a hra que eu bloqueio a bolsa. (...) A hora que eu bloqueio a bolsa e falo assim eu não posso usar a bolsa desse paciente, desse doador, pq ele deu positivo no teste de HIV, eu não posso parar ai. Eu tenho que chamar essa pessoa pra ir triar. Pq que eu tenho que fazer isso? Voces lembram que eu falei que em banco de sangue a gente usa testes de alta sensibilidade? Ou seja, da muito falso positivo. Entao eu tenho que chamar essa pessoa, encaminhar ela pra ambulatório, e lá ela vai fazer um teste mais especifico, pra que, pra ver se esse positivo que eu peguei era positivo mesmo, e ai vai ser encaminhado pra serviço especializado, ou se é um falso positivo. Então tudo isso que eu falei tah ai nesses fluxogramas.

01h16min30seg Existe um outro vírus, que é parecido com o HIV, que chama HPLV, na verdade é muito raro, é um vírus que esta associado a

linfoma. É muito raro ele entrar pra diagnostico, mas ele faz parte da triagem do doador de sangue. Entao o que que nós vamos fazer.A gente vai fazer um teste de triagem, geralmente é ELISA, Por que gente? Porque quem faz ELISA pode implantar vários testes no mesmo tipo porque o equipamento é o mesmo. Só vai mudar o kit. E ai o que que vai acontecer? Não reagente eu libero. Reagente ou indeterminado eu vou repetir em duplicata. Se repetir em duplicata e deu não reagente nos dois, eu vou soltar. Se deu reagente ou indeterminado vai pro immunoblot. É o segundo caso que eu faço immunoblot. Hoje a gente só faz immunoblot pra HIV e pra HPL. Onde vcs vao ver bastante de HPL, em triagem de doador, pq faz parte do fluxograma. Pra diagnostico mesmo é muito pouco.

1h19min Hepatites Virais Hepatite é um termo muito genérico. Hepatite é um termo que a gente designa qualquer inflamação que eu tiver no fígado.

Por exemplo, eu posso ter hepatite alcoolica, quem bebe muito pode ter fibrose no fígado e ter hepatite. Eu posso ter hepatite medicamentosa. Quem toma muito medicamento pode levar a fibrose hepática e hepatite. E eu tenho as hepatites induzidas por vírus. O vírus vai lá, parasita o fígado causa um quadro de fibrose que pode evouluir pra degradação do fígado. Tem um monte de heptite, não é só mais até a E, tem a F, G, tem um monte. O que que interessa pra gente em termo de doença infecciosa? É a hepatite B e C. por que? Hepatite A e Hepatite E, é por transmissão oral. Então pega quando a gente come alimento qe esta contaminado, alguma coisa nesse sentido. É muito frequente em criança, pq criança tem habito de higiene precária.

Hoje, o problema de saúde publica é a hepatite B e C. porque B e C é transmitida via parenteral, por sangue, por relação, por compontens.. por contato com fluidos biológicos. Pra Hep B a gente tem vacina, embora a gente saiba que a vacina não é 100% eficaz. Pra hep C a gente não tem nada pra fazer em termo de profilaxia. Então por exemplo, se vcs forem trabalhar num laboratório, ou num hospital, e se por um acaso vcs sofrerem um acidente de trabalho, por exemplo, eu to lá colhendo sangue e espirra sange no meu olho. Vcs já viram alguém colhendo sangue de óculos? Então, a mucosa ocular e oral são o jeito mais fácil de pegar qualquer coisa pq ela é altamente vascularizada, caiu ali ta no sangue. Então o que que acontece. To la colhendo, tive um acidente e espirrou sangue no meu olho. O que que eu vou fazer.. primeira coisa que eu vou fazer.. eu, se eu sou profissional da saúde eu sou vacinada pra Hep B. não tem nenhum profissional de saúde hoje que não é vacinado. Certo? Todo mundo tem que ser vacinado. Pra Hep B tem vacina. Pra HIV, eu vou lá, passo pela Infecto, tem um protocolo pra seguir, e eles vao me dar oq eu a gente chama de profilaxia antirretroviral. Então eu vou tomar o medicamento. E pra Hep C? que que eu vou fazer? Esperar. Pra HEp C, eu vou chegar e vou acompanhar, vou fazer exames periódicos, e a única chance é que vc pegue antes. Pq o grande risco da Hep C hoje é, não tem profilaxia, dependendo do tipo de vírus a gente só tem 50% de eficiência terapêutica, dependendo do tipode vírus, tem vírus que é muito eficiente a terapêutica, e ela é assintomática, ouseja, tem um monte de gente que tem e não sabe que tem. E pra vcs terem uma ideia, o vírus da Hepatite vive até 7 dias no ambiente. O vírus da aids morre em horas. Então a hora que sofre um acidente, a gente ve pq chega lá no laboratório, o povo fica tudo desesperado por causa do HIV e a chance de vc pegar HIV é muito menor do que vc pegar hepatite. Então hoje a hepatite é considerada um problema de saúde publica, a gente ga vendo, a gente ta em região endêmica.

Então, no laboratório eu vou ter que fazer triagem pra hepatite B e Hepatite C. na verdade, o diagnostico sorológico pra hepatite B é um dos mais complexos que a gente tem hoje. Por que? Não é um anticorpo que eu pesquiso, mas sim um conjunto de marcadores. Entãoimaginem lá. Eu tenho um vírus, que entrou no meu organismo. Esse vírus, não vai la pro hepatócito, lá no fígado? Só que até ele chegar la tudo, a minha célula de defesa não vai querer destruir ele? Então logo que a gente se infecta eu começo a ter partícula viral circulante. Eu começo a ter pedaço de vírus circulante. Então o primeiro marcador que a gente consegue identificar é o AgHBs, que é o antígeno de superfície. Por que? Porque a hora que eu peguei o vírus eu já tenho partícula do vírus circulante. Ai aparece antes que o anticorpo. Com o passar do tempo, eu vou ter os anticorpos. Anti-HBc, aqui é o anticorpo contra o antígeno do core, que é aqui mais interno. Então o antígeno de superfície, o nome já diz, fica la fora, o antígeno do core, é esse aqui dentro. A gente não consegue detectar o antígeno do core, mas o anticorpo formado contra ele. Esse anticorpo ele pode ser da classe IgM ou da classe IgG, depende da fase da doença. Tudo bem até aqui?

Ai o que que vai acontecer.. com o tempo, eu vou evouluir pra cura, não vou? Então, o meu sistema imune vai ficando melhor, e ele vai produzindo um anticorpo contra esse antígeno, que é o Anti-HBs. Então que que eu posso fazerna hora de fazer diagnóstico... pra fazer diagnóstico eu vou fazer todos. Pra banco de sangue eu vou fazer só AgHBs e anti-HBc. Pra diagnostico eu tenho que fazer todos. Pq? Pra diagnostico não adianta eu dizer se tem ou não tem, pq eu posso dizer em que fase que tá, se esta evolindo pra cura ou se não ta... vou dar um exemplo. O individuo que tem AgHBs + (positivo) e todos os outros negativos, tem a

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doença? Tem. Eu posso dizer que tem a doença e ta na fase inicial. Pq nenhum anticorpo é detectável. A medida que esse individuo progride, ele não vai ficando assim? Ele tem o antígeno, ai ele tem o anticorpo na fase IgM, não é em fase aguda de doença? Se esse individuo progredir um pouquinho mais, ele começa a ter o anticorpo IgG. E ta transitando, da fase aguda pra fase crônica. Com o tempo vai acontecer isso... eu sei que é fase crônica pq não tem mais o IgM. Com o tempo espera-se que aconteça isso.. desapareça o antígeno e apareça o anticorpo que marca o ......... então o individuo que teve a doença e ta curado, ele só vai ter anti-HBc IgG e anti-HBs. Enquanto ele não tiver o anti_HBs positivo, eu não posso dizer que ele curou. E se esse individuo aqui, continuar se dando o antígeno positivo, significa que não ta evoluindo rpa cura. Uma hepatite B, evoluindo pra cura, o AgHBs tem que desaparecer. Então cada marcador indica uma coisa.

Agora, já não tem vacina? Sera que a vacina é igual? Não gente. Eu tenho que ter um jeito de diferenciar o paciente que teve hepatite e se curou, do paiente que só tomou vacina. Um paciente que só tomou a vacina, ele só tem Anti-HBs. O resto é tudo negativo. Pq a vacina é feita só com o antígeno de superfície. Então qual que é a diferença do individuo que é imunizado por vacina e daquele individuo que imunizado por doença? Aquele que teve a doença e se curou, ele tem o anti-HBc IgG. Aquele que só foi vacinado, ele não tem esse marcador. Ele só vai ter o anticorpo da vacina. Existe um outro antígeno que eu posso pesquisar, mas eu não pesquiso pra fazer diagnostico. Pra fazer diagnostico, eu fechei, eu procurei esses marcadores, dei o resultado e fechei diagnostico. Só que ai, por medico, ele vai começar a tratar, se o paciente for positivo. Ele trata, trata, trata, trata... como que o medico vai saber se o tratamento esta fazendo efeito. Na verdade, ele vai pedir um sorológico com pesquisa de AgHBe, que é um outro antígeno. Enquanto o AgHBe for positivo, significa replicação viral. Então eu posso dizer pra vcs assim, se o AgHBe for positivo o vírus ta em multiplicação, se eu fizer o teste e o AgHBe der negativo, o que que indica? Que o vírus não esta se multiplicando. Ou seja, o tratamento esta sendo efetivo. Então na verdade, esse marcador aqui ó, ele não é feito pra diagnostico. Ele só é feito pra acompanhar tratamento. Ele so marca atividade replicativa do vírus. Se o AgHBe for positivo, o vírus ta se replicando. A gente nunca faz AgHbe pra diagnostico, é so deposi. Pra doador de sangueeu já falei ne, ele faz AgHBs e Anti-HBc

Hepatite C é mais fácil. Pra hep C, na verdade, a gente só tem um ELISA, a gente pesquisa anti_HCV. Então, uma amostra suspeita pra hep C, que que o medico vai fazer? Ele vai solicitar um sorológico, que é nti-HCV total. Pra Hep C eu não vou pesquisar IgM e IgG separado, eu vou pesquisar total. Se der negativo, eu vou soltar esse resultado, mas o medico tem que ficar esperto pq a janela pra HepC é muito grande. Então depois de algum tempo ele tem que colher de novo e repetir o teste. Mas se der negativo a gente libera o resultado e depois o medico colhe nova amostra pq a janela imunológica é muito grande.(janela de 60 a 70 dias). Se der positivo, eu vou liberar o laudo positivo, só que o que que acontece...quando a gente libera aqui, positivo, esse positivo pode ser verdadeiro positivo, oui seja o paciente tem mesmo o vírus, e ai tem que tratar. Ou o paciente não tem o vírus e esse positivo aqui foi reação cruzada. Isso gente, o medico não vai saber nunca. Ele vai ter que ficar repetindo o exame. Só que toda vez que der positivo, o que que a gente faz.. a gente encaminha pra serviço especializado. O que que eles vao fazer.. ser positivo, não significa necessariamente que vai tratar. Eu só vou tratar o paciente que tiver HepC se esse vírus estiver em atividade. Pq se o vírus estiver quietinho lá no hpatocito eu não vou tratar meu paciente, pq ele não esta em atividade. Então a gente manda pra serviço especializado, o que que eles vao fazer.. eles vao procurar se tem material genético do vírus circulante. Pq o vírus não parasita o hepatócito? Se eu achar vírus no sangue, quer dizer que ele está se multiplicando... e se eu não achar vírus no sangue, quer dizer queele esta la quietinho no hepatócito. AgHBe é pra hepatite B, Hepatite C não tem isso!! Ai o que que vai acontecer.. se a gente achar vírus circulante no plasma, ele é positivo, ai vai tratar.. se a gente não achar vírus circulante no plasma, ele é negativo, ai eu não vou tratar. Só que vcs entendem que esse negativo aqui ó, no plasma, não quer dizer que não tenha a doença, pode não ter vírus no plasma e ele estar lá no hepatócito. Então esse paciente não vai poder doar sangue nunca. E esse positivo aqui eu não vou saber nunca se é reação cruzada ou se é positivo mesmo. Então a hepatite C tem todos esses pequenos problemas.

Além disso, não é nem da minha disciplina mas só por uma curiosidade, depois que a gente ve e fala que o vírus ta em atividade replicativa, o laboratório ainda tem que detectar qual tipo de vírus que é, pq no Brasil, de acordo com o diferente tipo de vírus, o tratamento é diferente, então antes do medico tratar ele tem que saber que tipo de vírus que é.