• QUESTÕES PARA AS PROVAS;

• CONTEÚDO DAS AULAS;

• HORÁRIO DE ATENDIMENTO ON-LINE;

Identificação de Bactérias Gram-negativas

blog do professor:

http://chicoteixeira.wordpress.com

Profa. Dra. Patrícia Orlandi

Profa. MSc. Carolinie Nobre

As Enterobacteriaceae

Constituem as bactérias isoladas com maior

freqüência de amostras clínicas;

Salmonella;

Shigella;

Klebsiella pneumoniae;

Escherichia coli;

Proteus;

LPS

As Enterobacteriaceae

Apesar da complexidade desta família, com

um total de mais 150 espécies, menos de 20

espécies são responsáveis por 95% das

infecções;

As Enterobacteriaceae

São microrganismos ubiquitários;

Encontram-se:

ÁGUA

VEGETAÇÃO

SOLO

MICROBIOTA

INTESTINAL

Enquanto outros são membros comensais e

causam infecções oportunistas, envolvendo

praticamente todas as partes do corpo:

Klebsiella pneumoniae;

Escherichia coli;

Proteus mirabilis;

MUITAS INFECÇÕES INTESTINAIS

30 a 35% DE TODAS

AS SEPSES

As Enterobacteriaceae

Causam diversas doenças humanas:

Alguns organismos estão sempre associados

a doenças:

Salmonella typhi

Espécies de Shigella

Yersinia pestis

MAIS DE 70% DAS INFECÇÕES

DO TRATO URINÁRIO

Está associado a diversas doenças, incluindo

sepse, meningite e gastroenterite;

Escherichia coli

As cepas de E. coli que causam gastroenterite

estão subdivididas em cinco patótipos:

Possui uma ampla quantidade de fatores de

virulência. Além dos fatores apresentados por

todos os membros da família;

E. coli é o bastonete Gram-negativo mais

comumente isolado em pacientes com sepse;

Escherichia coli

Pode colonizar praticamente todos os animais,

incluindo aves domésticas, répteis, gado,

roedores, animais domésticos, pássaros e

humanos;

Salmonella

Sorotipos como S typhi e S. paratyphi estão

altamente adaptados a humanos e não causam

doenças em outros hospedeiros;

Outras cepas de Salmonella (S. choleraesuis)

estão adaptadas a animais e, quando infectam

humanos, podem causar doenças graves;

Causa doenças através da invasão e

multiplicação em células que revestem a

mucosa do cólon;

Shigella

Mais de 22500 infecções por Shigella foram

relatadas nos Estados Unidos em 2009;

entretanto, estima-se que ocorram quase

450000 casos a cada ano;

A shiguelose é uma doença essencialmente

pediátrica: 70% das infecções ocorrem em

crianças com menos de 15 anos;

É um patógeno altamente virulento que causa

doença sistêmica com alta taxa de mortalidade;

Yersinia

Y. Enterocolitica e Y. pseudotuberculosis são

patógenos essencialmente entéricos raramente

isolados a partir do sangue;

Todas as infecções por Yersinia são zoonóticas

com humanos como hospedeiros acidentais.

Existem duas formas de infecção por Y. pestis,

a peste urbana, na qual ratos são o reservatório

natural e a peste silvestre (animais selvagens);

Apresentam uma cápsula proeminente que é

responsável pela aparência mucóide das

colônias isoladas e pela alta virulência dos

organismos in vivo;

Klebsiella

K granulomatis é o agente etiológico do

granuloma inguinal, uma doença que afeta a

genitália e a região inguinal. Esta doença é

chamada donovanose, em referência à origem

histórica do nome do gênero;

A infecção do trato urinário por P. mirabilis é a

doença mais comum provocada por este

gênero;

Proteus

P. mirabilis produz uma grande quantidade de

urease, que degrada a uréia em CO2 e amônia,

este processo aumenta o pH da urina e facilita

a formação de cálculos renais;

A alcalinidade aumentada da urina também é

tóxica ao uroepitélio;

As Enterobacteriaceae

Fisiologia e Estrutura:

São bastonetes Gram-negativos de tamanho

moderado:

Todas as enterobactérias podem crescer de

maneira aeróbia ou anaeróbia (anaeróbios

facultativos), em meios não seletivos (ágar

sangue) ou seletivos (ágar MacConkey);

A maioria são móveis, se movimentam

através de flagelos peritríquios e são não

esporulados:

As Enterobacteriaceae

Fisiologia e Estrutura:

Identificação Presuntiva

Apresentam necessidades nutricionais simples,

fermentam glicose, reduzem nitrato e são

catalase-positivas e oxidase-negativas;

A identificação presuntiva é baseada na

aparência das colônias em crescimento no meio

de isolamento primário e na avaliação de

determinadas reações bioquímicas. A coloração

de Gram apresenta bastonetes gram-negativos

arredondados e curtos;

Identificação Presuntiva

Na cultura mista mostrando crescimento após

24 horas em ágar sangue visualizamos dois

morfotipos de bastonetes gram-negativos e um

terceiro morfotipo de um microrganismo menor

que pode ser suspeito de ser uma espécie

gram-positiva;

Colônias rosas, brilhantes, mucóides, grandes,

no ágar MacConkey, típicas de muitas espécies

de Klebsiella e Enterobacter;

Identificação Presuntiva

Ágar MacConkey com colônias fermentadoras

de lactose e precipitação de sais biliares no

meio que circunda as colônias (ex. E. coli);

Superfície do ágar MacConkey mostrando

colônias vermelhas de ferment. de lactose e

colônias claras menores de não fermentadores

de lactose;

Placas de ágar EMB mostrando coloração

verde brilhante produzida pelos ferment.;

Culturas mistas de E. coli e Shigella spp.; A

maioria das espécies de Shigella não fermenta

lactose e, portanto, produz colônias

semitranslúcidas não-pigmentadas no ágar

EMB. Outras espécies não fermentadoras

produzem colônias que parecem semelhantes

àquelas ilustradas aqui;

Identificação Presuntiva

Três tubos de caldo de cultura de coloração

púrpura contendo tubos de Durham para

demonstrar a formação de gás. Os dois tubos à

direita mostram ácido proveniente da glicose

(cor amarela). O tubo na extrema direita mostra

a coleta de gases no tubo de Durham,

característica de um microrganismo que produz

ácido e gás a partir de glicose;

Identificação Presuntiva

Identificação Presuntiva

No teste de citocromo oxidase que revela uma

reação de cor púrpura positiva, qualquer

microrganismo que apresente uma reação

positiva pode ser excluído da família;

Meios para teste de nitrato contendo tubos de

Durham para mostrar a formação de gás N2, o

tubo à esquerda mostra uma reação positiva

(cor vermelha – nitritos que reagem formando

p-sulfobenzeno-azo-a-naftilamina). O tubo do

meio também é positivo (gás nitrogênio);

Identificação Presuntiva

As características das colônias de organismos

em diferentes meios são utilizadas para

identificar os membros comuns da família;

Por exemplo, a capacidade de fermentar

lactose é utilizada para diferenciar cepas

fermentadoras de lactose (Escherichia,

Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter e Serratia

spp.) de cepas que não fermentam lactose, ou

que o fazem lentamente (Proteus, Salmonella,

Shigella e Yersinia spp.);

Ágar Ferro de Kligler (KIA)

Série de tubos de KIA inclinado mostrando

vários padrões de reações. O tubo na extrema

esquerda mostra uma inclinação ácida (amar.) e

uma base ácida (amarelo), indicando tanto a

fermentação da glicose quanto da lactose.

Observe também o espaço na base do tubo e a

divisão no ágar no meio do tubo, que indicam

produção de gás (CO2) pelo microrganismo.

Estas quantidades de CO2, geralmente só são

produzidas pela tribo Klebsielleae;

O quarto tubo mostra inclinação alcalina

(vermelho) e base preta indicando produção de

sulfeto de hidrogênio (H2S);

O terceiro tubo mostra inclinação alcalina

(vermelho) e base ácida característica de um

microrganismo não fermentador de lactose;

Ágar Ferro de Kligler (KIA)

O segundo tubo a partir da esquerda mostra

uma reação ácido/ácido, mas sem a presença

de gás, típica da reação observada com E. coli;

Teste com o-nitrofenil-b-D-galactopiranosídio

(ONPG). Uma reação positiva indica capacidade

de produzir b-galactosidase, enzima necessária

para a degradação inicial de lactose;

Tubo com ágar semi-sólido (direita) para teste

de motilidade, produção de indol e sulfeto (SIM)

e ágar inclinado ferro de Kligler (KIA), diferença

na sensibilidade em detectar H2S. Em ambos

tubos temos S. typhi;

Características

Diferenciais de Identificação

A primeira figura mostra as reações para E. coli

(++--). A segunda figura mostra as reações para

Klebsiella/Enterobacter (- - + +);

Quatro tubos mostrando os testes do indol (I),

vermelho metila (VM), Voges-Proskauer (VP) e

citrato (C);

Características

Diferenciais de Identificação

Indol a partir de triptofano; queda no pH

(fermentação – ácidos); acetoína a partir de

piruvato; citrato de sódio como fonte de C;

ANÁLISES

FENOTÍPICAS E

GENOTÍPICAS

-ALIMENTOS FUNCIONAIS;

-CONTROLE DAS ESPÉCIES

PRESENTES;

-MÉTODOS DIFERENCIAIS DE

QUANTIFICAÇÃO E QUALIFICAÇÃO;

-AUMENTO DE PRODUTOS NO

MERCADO BRASILEIRO;

-MUDANÇAS DA NOMENCLATURA

OFICIAL;

Outros aspectos:

-Industria de Biotecnologia;

-Pesquisa;

-Biomedicina;

-Melhoramento genético

-Saúde Pública

DIAGNÓTICO BACTERIOLÓGICO

- DEMONSTRAÇÃO DIRETA DA BACTÉRIA

EXAME AO MICROSCÓPIO

COLORAÇÃO DE GRAM

COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN

- DEMONSTRAÇÃO DE ANTÍGENOS

(MÉTODOS IMUNOLÓGICOS- ELISA)

- DEMONSTRAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS

(CROMATOGRAFIA)

- DEMONSTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO

TAXONOMIA BACTERIANA

- CARACTERIZAÇÃO E DESIGNAÇÃO DOS MICRORGANISMOS - E ORGANIZAÇÃO DOS MO. EM GRUPOS - DIVIDIDO EM:

NOMENCLATURA (espécie, gênero ou família)

CLASSIFICAÇÃO (agrupamento das bactérias em Taxa)

IDENTIFICAÇÃO

TAXONOMIA POLIFÁSICA

- NÃO É MAIS SOMENTE BASEADA EM CRITÉRIOS FISIOLÓGICOS; - CRITÉRIOS FENOTÍPICOS E GENOTÍPICOS - COMBINAÇÃO

DEFINIÇÃO:

-Os métodos fenotípicos são aqueles que

caracterizam os produtos da expressão gênica

para a diferenciação das cepas.

- Em decorrência deles envolverem a expressão

do gene, estas propriedades podem variar,

baseado em mudanças das condições de

crescimento, fase de crescimento e mutações

espontâneas.

CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO

FENOTÍPICA - MÉTODOS TRADICIONAIS

DESVANTAGENS:

-Procedimentos podem ser longos

-Ambíguos;

-Afetados pelas condições do meio;

-Espécies filogeneticamente distintas;

-Problemas técnicos que dificultam a interpretação dos

resultados (crescimento não é suficiente para degradar o

substrato que se está testando, algumas características são

instáveis – meios de cultura utilizado)

-Culturas mistas não permitem a diferenciação de espécies

CARACTERES

FENOTÍPICOS

MAIS UTILIZADOS

1-Características morfológicas das colônias;

2-Forma, Coloração de Gram, Arranjo, Motilidade,

Catalase;

3-Modo de fermentação da glicose (carboidratos) e perfil

bioquímico;

4-Fatores de crescimento;

5-Disponibilidade de oxigênio;

6-Testes de produção de gás;

7-Tolerância ao sal, pH e bile;

8-Crescimento em determinadas temperaturas (máxima

e mínima);

9-Condições do ácido láctico produzido;

10-Tipos de bacteriófagos;

11-Hidrólise da Arginina;

12-Formação de Acetoina (Acetilmetilcarbinol);

13-Fermentação butilenoglicólica;

14-Tipo de hemólise;

15-Produção de polissacarídeos extracelulares;

16-Tipagem sorológica;

17-Presença de enzimas e antígenos na superfície

celular;

18-Perfil eletroforético de proteínas;

19-Atividade antimicrobiana;

20-Lipídeos e constituintes da parede celular

-Plaqueamento

(meios seletivos, diferenciais)

Meios seletivos (antibióticos, ingredientes e suplementos)

Meios diferenciais (características morfológicas das colônias)

-Características das colônias nestes meios

(tamanho, forma, brilho, cor, viragem de meio,

presença de halo e pontos centrais, borda, tempo de

incubação)

Figure 1: Single cell sort (

Nebe-von Caron et al., 2000) of

Salmonella culture results in

different colony morphology.

Forma, coloração de Gram, Arranjo,

Motilidade, Catalase;

Figure 2: Surface detail of

Salmonella cells obtained

by atomic force microscopy

3-Modo de fermentação da glicose

(carboidratos)

Bifidobacterium

Tube 1:Culture en WW (rose)

Tube 2:Lait

Tube 3:Type respiratoire

anaerobi (WW profond)

Tube 4:Glucose

Tube 5:Saccharose

Tube 6:Lactose

Tube 7:Glycerol

Tube 8:Mannitol

Tube 9:Amidon

Tube 10Indole

Tube 11:Nitrate

CARACTERES

GENOTÍPICOS

MAIS UTILIZADOS

DNA/RNA

DEFINIÇÃO

-MÉTODOS GENOTÍPICOS IDENTIFICAM ATRAVÉS DO GENOMA,

AO CONTRÁRIO DOS MÉTODOS BIOLÓGICOS E IMUNOLÓGICOS

(FENOTÍPICOS) QUE DETECTAM OS PRODUTOS CODIFICADOS

PELO GENOMA.

Ácidos nucléicos são universais em biologia celular, e a seqüência

de bases de nucleotídeos das moléculas não são influenciadas

pelas condições de cultivo. Análises dos ácidos nucléicos deste

modo, provem a base dos métodos de identificação e possuem a

vantagem da reprodutibilidade. Métodos genéticos são mais

promissores para uma rápida e acurada identificação.

Métodos capazes - Relação FILOGENÉTICAS

- Hibridização DNA-DNA;

- Seqüenciamento do gene codificador do rRNA 16S;

- Seqüenciamento da região espaçadora ITS (Internal

Transcribed Space) entre os genes do operon que

codificam o rRNA.

- Permitem detectar diferenças e similaridades entre

amostras bacterianas da mesma espécie, e

conseqüentemente, verificar se amostras isoladas de

diferentes pacientes ou locais possuem uma origem

comum.

•PCR • REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA

Publicação:

Mullis and Faloona, 1987

Saiki at al. 1988

1984 - PCR foi apresentada pela primeira

em um encontro científico

1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase

termoestável de Thermus aquaticus.

1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para

fazer PCR.

Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park”

PCR requer 7 componentes essenciais:

- DNA polimerase termoestável

- Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA

- Deoxinucleosídeos trifosfato (dNTPs)

- Cátion divalente : toda DNA polimerase requer cátion

divalente, usualmente Mg2+

- Tampão para manter o pH

- Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl)

- DNA molde

Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode

ser amplificada por PCR

A localização da seqüência alvo é feita pelos “primers”.

Oligonucleotídeos com 20 “mers” é usualmente

seletivo o suficiente para localizar um sítio único em

um genoma de alta complexidade, tal como o genoma

humano.

O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo na

template se faz pelo estabelecimento de pontes de

hidrogênio, segundo o pareamento convencional

descrito por Watson e Crick:

A T

C G

Especificidade dos iniciadores:

É possível calcular de ocorrência aleatória da seqüência:

n = 2NK

n = número de sítios complementares ao iniciador

N = tamanho do genoma (humano: 3 x 109)

K = [g/2]G+C x [1-g]A+T

g conteúdo relativo de G+C

Este cálculo mostra que um oligonucleotídeo de 15 nts está

representado uma única vez no genoma.

Devido às seqüências repetidas e às famílias de proteínas, menos de

85% do genoma de mamíferos pode ser encontrado com precisão,

mesmo com iniciadores de 20 nts ou mais.

PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos:

- Desnaturação da template por aquecimento

- Pareamento dos iníciadores à seqüência alvo fita única

- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável

A TÉCNICA DE PCR

Amplificação da região ITS em leveduras

Amplificação da região ITS em S. cerevisiae

841 bp

PCR (REAÇÃO DE POLIMERASE EM CADEIA)

- Permite a detecção de microrganismos isolados ou

diretamente em material clínico, mesmo se presente em

pequenas quantidades;

-Amplificação de seqüências nucleotídicas específicas

(segmento alvo);

-Amplificação – processo de síntese de DNA dirigida

(desnaturação, ligação de primers -seqüências pequenas

presentes nas extremidades que ladeiam o segmento-alvo e

a extensão dos primers, através da DNA polimerase, para

produzir cópias idênticas do segmento-alvo.

-Seqüência entre os dois primers é amplificada

• PCR – Polimerase Chain Reaction

- Polimerase termoestável;

- Deoxinucleotídeos (dNTP);

- Dois iniciadores (primers)

Etapas

1) Separação das hélices do DNA a ser amplificado;

2) Ligação complementar entre os primers e o DNA;

3) Síntese do DNA pela Taq polimerase.

•Multiplex-PCR

- A técnica de PCR na sua forma mais simples;

- Amplifica regiões específicas do DNA;

- Utiliza um conjunto de iniciadores diferentes;

- Mais regiões amplificadas mais confiável é a técnica;

- Conhecimento prévio das seqüências (ou seja, do gene/

região de interesse).

BAX SYSTEM

DETECÇÃO DE PATÓGENOS;

-Salmonella sp

-Listeria sp

-Listeria monocytogenes

-E. coli O157:H7;

-Enterobacter sakazakii

CARACTERÍSTICAS

- ANÁLISE DE PRESENÇA OU AUSÊNCIA;

- UTILIZA A TÉCNICA PCR

(POLYMERASE CHAIN REACTION);

- DETECÇÃO DO DNA BACTERIANO;

- TOTALMENTE AUTOMATIZADO

(AMPLIFICAÇÃO, DETECÇÃO E INTERPRETAÇÃO);

- ALTO VOLUME DE ANÁLISE (96 AMOSTRAS SIMULTÂNEAS PARA O

TARGET DE ESCOLHA);

- MUITO FÁCIL USO;

- OS REAGENTES ESTÃO EM TABLETES;

- 3 ½ PARA O ENRIQUECIMENTO;

- DETECÇÃO: 1UFC/25g DO ALIMENTO;

- ALTA ESPECIFICIDADE.

-(POLYMERASE CHAIN REACTION)

ETAPAS EXTERNAS

1 – PREPARAÇÃO DO DNA

ASPECTOS QUE DEVEM SER OBSERVADOS:

- 1º

-Salmonella:

Protocolo padrão (TSB, Água Peptonada, Caldo Lactosado) -

interferência química

Regrow: BHI

-E. coli:

Protocolo padrão

-L. monocytogenes ou sp:

1-Caldo LEB (24hs)

2-Mops Bleb (24hs)

- 2º (Lise celular) – Gram +

2 – AMPLIFICAÇÃO

ETAPAS INTERNAS

3 – DETECÇÃO

SONDAS

Sondas genéticas (PROBE)

-Segmentos específicos de DNA ou RNA (fita

simples) que reconhecem e anelam (hibridizam)

com seqüências complementares (pareamento de

bases complementares) formando moléculas

híbridas de fita dupla.

-As sondas são marcadas (radioisótopos,

enzimas ou moléculas quimioluminescentes);

-As amostras em teste são inoculadas sobre um

suporte sólido (filtro nitrocelulose) colocado na

superfície de um meio de cultura sólido.

- As colônias desenvolvidas sobre o filtro são

submetidas a um tratamento (lise), expondo e

desnaturando seu genoma;

- Para os testes de hibridização, os filtros são

incubados com uma solução contendo a sonda

marcada. Onde for homólogo ela hibridiza e é

detectada (cor ou luz);

- Praticamente todos os microrganismos contêm

alguma seqüência nucleotídica exclusiva que

pode ser usada como sonda (sondas podem ser

gênero, espécie ou mesmo amostra específica).

Sondas

Pequeno fragmento de DNA ou RNA usado para detectar

uma sequência complementar por hibridação com uma

amostra de ácido nucleico.

Cadeia dupla

DNA

DNA

desnaturado

aquecimento

DNA marcado

reactivamente

DNA marcado

por corantes

fluorescentes

Cadeia dupla de

DNA marcado hibridação

Sondas de DNA – Southern blot

Método para realçar o

resultado de uma electroforese em

gel de agarose, por marcação de

sequências específicas de DNA.

Adaptado de http://www.mun.ca/biology/scarr/Gr12-18.html

Sondas de RNA – Northern blot

Técnica usada para identificar e localizar as sequências

de mRNA complementares a uma sonda de DNA ou RNA

• Permite verificar se um determinado gene de um genoma

é ou não transcrito no RNA em estudo.

http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/6560/sg_ls_mb_nap_total_rna_gel2.jpg

RFLP

• RESTRICTION FRAGMENTE LENGHT

POLYMORFISM

RESTRICTION FRAGMENTE LENGHT POLYMORFISM

– RFLP - Polimorfismo observado no tamanho dos fragmentos

resultantes da restrição enzimática

-As bactérias apresentam em seu cromossomo

regiões que tendem a variar de amostra para

amostra, dentro de uma mesma espécie bacteriana,

embora essas regiões sejam constantes dentro de

uma mesma amostra.

-Quando o cromossomo é purificado e clivado com

endonucleases de restrição, em numerosos

fragmentos de fita dupla, essa variabilidade pode

ser observada.

-Os fragmentos devem ser separados em gel (poliacrilamida

ou agarose).

-Ao se comparar o DNA de duas amostras por esse método,

é freqüentemente possível distinguir diferenças no padrão

de bandeamento (devido as diferenças no tamanho dos

fragmentos).

-As diferenças podem ser sutis, e as vezes, para melhor

visualização podemos escolher sondas que hibridizam

especialmente com regiões altamente variáveis. Após a

hibridização, as diferenças na localização e no tamanho dos

fragmentos são acentuadas e facilmente identificadas.

ETAPAS - RFLP

1 – Isolamento do DNA cromossômico;

2 – Digestão com enzima (s) de restrição;

3 – Eletroforese em Gel de Campo Pulsante; – PFGE (Pulsed Fied Gel Electrophoferis)

4 – Coloração com Brometo de Etídio;

5 – Fotografia do perfil obtido.

Ação - E. R.

Purificação

Digestão com Eco R1

Digestão com Hind ll

Banda escolhida

ou probe

PFGE

• PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS

PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS - PFGE

-Eletroforese em gel de agarose mais utilizado;

-Entretanto este método não permite uma resolução eficiente

de fragmentos de DNA maiores do que 40Kb;

-Estes fragmentos são tão grandes que acabam apresentando

uma mesma taxa de migração no campo elétrico;

PFGE – as moléculas são submetidas a campos elétricos

aplicados alternadamente em duas direções; da mesma forma

de RFLP, o DNA é purificado e clivado com enzimas de

restrição, só que, no caso da PFGE, as enzimas utilizadas

cortam o DNA em número menor de fragmentos e, portanto,

maiores em tamanho.

PFGE de cepas de S.Typhi: nos. 1e10- marcador molecular,

2 a 7- surto, 8 e 9- esporádicos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kb

1135

668,9

78,2

216,9

PULSENET - AMERICA LATINA

PROVA PILOTO Resultados

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BRAL05.001c. tif ARIM04.002.tif

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BRAL05.001c. tif ARIM04.002.tif

- Contraste - banda / fundo : descoloração x sistema de imagem

- linha 2 Variações de DO

- Última banda do padrão

AMOSTRAS - Prova Piloto

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Eletroforese em CHEFFII - 20h

Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

PFGE-XbaI

10

0

90

80

70

60

PFGE-XbaI

ARcepa7

BRALcepa7

ARcepa6

BRALcepa6

ARcepa3

BRALcepa3

ARcepa1

BRALcepa1

ARcepa5

BRALcepa5

ARcepa4

BRALcepa4

ARcepa2

BRALcepa2

Comparação dos perfis eletroforéticos obtidos no

Brasil e Argentina

PULSENET - AMERICA LATINA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

E.coli O157:H7 - PFGE

Linhas 1,5,10 - Padrão de peso molecular; 2,3,4,6,7,8,9 : amostras O157:H7

PULSENET - AMERICA LATINA

S.Enteritidis -S.Typhimurium - PFGE Surtos - 2005

Linhas 1,5,10 : Padrão de PM; Linhas 2,3,4,6 : S.Typhimurium;7,8,9:S.Enteritidis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

RAPD

• Random Amplified Polymorphic DNA

RAPD RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC

DNA

É uma variação do protocolo de PCR, com duas características distintivas: utiliza um primer único, e o primer tem sequência arbitrária, isto é, sua sequência alvo é desconhecida

APLICAÇÕES DO RAPD:

•Obtenção de ´fingerprints´ genômicos de

indivíduos, variedades e populações;

•Análise da estrutura e diversidade genética em

populações naturais, de melhoramento e bancos

de germoplasma;

•Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos

em diferentes espécies;

•Construção de mapas genéticos e localização de

genes de interesse econômico.

RAPD usando o primer OPA-11 em linhagens de S. cerevisiae

RAPD de 3 linhagens de S. cerevisiae

Bolsista: Carolinie Batista Nobre da Cruz

Orientadora: Dra. Patrícia Puccinelli Orlandi Nogueira

• Construir sistemas de PCR para a detecção múltipla (multiplex) para a

amplificação simultânea de vários loci de identificação de E.coli

diarreiogênicas (DEC) emergentes na cidade de Manaus.

- Determinação dos genes para identificação das categorias de DEC;

- Isolamento das amostras de DEC padrões estocadas na bacterioteca do

Laboratório de Organismos Geneticamente Modificados (OGM) da FIOCRUZ;

- Extração do DNA das amostras;

- Padronização do sistema de PCR Multiplex;

- Caracterização genotípica de 93 amostras de DEC caracterizadas por

métodos fenotípicos de amostras fecais de coletadas de crianças de 5 a 14

anos internados em hospitais de Manaus.

MULTIPLEX 1 (Anelamento a 56°C)

GENE TAMANHO ORGANISMO Padrão ORIGEM AÇÃO REFERÊNCIA

invE 766 EIEC M90T Plasmídio Invasão Daniel Muller, 2007

bfpA 550 EPEC Atípica E2346 Plasmídio Pilin Donnenberg et al.,

1982

ent 518 EHEC 1731 - Enterotoxina Daniel Muller, 2007

EAF 397 EPEC E234869 Cromossomo Intimina Gomes-Duarte et al.

2009

stx2 324 STEC ST5 - Shiga toxina

bacterióf. Daniel Muller, 2007

M 1 2 3 4 5 6 7 8

1 – Multiplex 1

2 – invE

4 – bfpA

5 – ent

6 – EAF

7 – stx2

8 – C –

Anelamento a 56ºC

invE (766 pb)

bfpA (550 pb)

ent (518 pb) ent (518 pb)

MULTIPLEX 2 (Anelamento a 58°C)

GENE TAMANHO ORGANISMO Padrão ORIGEM AÇÃO REFERÊNCIA

uidA 1487 E. coli K12-3 - Beta-

glucorinidase Daniel Muller, 2007

EAE 917 EHEC e EPEC E234869 Cromossom

o Intimina

Gomes-Duarte et al.

2009

bfpB 910 EPEC Típica E234869 Plasmídio - Daniel Muller, 2007

escV 544 EPEC, ATEC e

STEC E234869 - Região Lee Daniel Muller, 2007

stx1 244 STEC ST8 ou ST5 - Shiga toxina

bacterióf. Daniel Muller, 2007

estlB 171 ETEC ST8 ou ST5 Plasmídio Toxina ST Daniel Muller, 2007

ast1 102 EAEC EAEC O42 Plasmídio Enterotoxina Daniel Muller, 2007

1 – Multiplex 2

2 – uidA

3 – EAE

4 – escV

5 – bfpB

6 – stx1

7 – estlb

8 – ast1

9 – C –

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

• 957 amostras de 0 a 14 anos;

• Triplicata (Colônia A, B e C)

• Totalizando 2.871 amostras genotipadas;

• Extração de DNA;

• Multiplex PCR;

• Simplex PCR;

• Invasão e aderância celular

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

invE bfpA ent EAF stx2

28% 27%

12%

29%

20%

30%

24%

11%

26%

16% Multiplex 1

Simplex 1

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

uidA EAE bfpB escV stx1 estlb ast1

95%

6%

29% 27%

13%

0%

11%

97%

9%

25% 27%

10% 9%

14%

Multiplex 2

Simplex 2

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30% 28%

23% 24%

2% 4%

8%

0%

6% 5%

26%

18% 19%

5% 6%

9% 9%

4% 3%

Multiplex

Simplex

• Neste estudo foram desenvolvidos dois sistemas de PCR multiplex de rápida otimização.

• Houve uma média de 2% de diferença entre a amplificação dos genes pelo multiplex e

simplex, exceto o gene estlb que foi apenas amplificado pelo simplex PCR.

• O método permitiu a identificação de sete categorias de DEC, pois ETEC apresentou

somente no simplex PCR. Müller et al 2007, Kimata et al. 2005, descrevem que os genes

ST e LT para a identificação de ETEC (ETEC-LT e ETEC-ST), sendo necessário modificar a

reação para que haja a identificação das oito categorias de DECs;

• Daniel Müller (2007) demonstra que amostras de E. coli clínica os isolados provenientes de

pacientes diarréia de várias regiões geográficas distintas, foram identificados cinco estirpes

não convencionais expressando perfis de fator de virulência diferentes.

• Estima-se que, no Brasil, diarréias sejam a causa de mais de 200.000 óbitos anuais de

crianças, nos quais EPEC se encontra entre as principais causas (Gomes et al., 1989;

Gomes et al., 1991; Mangia et al., 1993).

• Estima-se que, no Brasil, diarréias sejam a causa de mais de 200.000 óbitos anuais de

crianças, nos quais EPEC se encontra entre as principais causas (Gomes et al., 2001;

Gomes et al., 2005; Mangia et al., 2003).

• Nas crianças de 0-1 mês foram identificados 21% de EIEC nas amostras, esta cepa

tem um comportamento patológico muito semelhante a Shigella, resultando diarréia

com sangue, de alta gravidade para estes neonatos (Doyle e Cliver, 1990).

• Nestas crianças também foi identificado duas amostras positivas para os genes ent,

stx1 e stx2 sendo identificada como EHEC típicas, mais conhecida como O157:H7,

causadora da Síndrome Hemolítica Urêmica em crianças.

• A identificação de EIEC e EHEC tiveram um papel importante em nosso estudo, pois a

maioria dos estudos, mostrou que esse patógeno não é comumente isolado, porém,

Toledo e col. em estudo com crianças com diarréia que viviam em favelas na grande

São Paulo - SP, encontraram uma frequência de 15,9% de EIEC em crianças de 1 mês

a 5 anos (Martinez et al, 1998).

SALMONELLA SP. Padronização dos genes de virulência

• invA(a) – 244pb

• invA(b) – 450pb

• fimA – 571pb

• agfA – 700pb

• Flic(a) – 334pb

• spvC – 433pb

• sfdA – 299pb

• phoP – 244pb

• slyA – 450pb

• sfa – 571pb

• Flic(b) – 700pb

• aceK – 334pb

• sdf – 433pb

• Amostras:

• (9) Salmonella sp.

• (14) Salmonella choleraesuis

• (15) Salmonella paratyphi

invA(a)

invA(b)

slyA

sfa fliC(a)

sdf

fimA

agfA

phoP

aceK

16S

spvC

slyA

sfA

fliC(b)

sfdA

agfA

• aceK

• 70ºC

• slyA

• inv(a)

• inv(b)

• Sfa

• sfd

• 60ºC

– fimA

– phoP

• 63ºC

– spvC

– sdfA

– fliC

– agfA

• 68ºC

– aceK

BACTÉRIAS DE

BIOFILME E SALIVA

Padronização dos genes de virulência

Padronização

16S

Eykenella

corrodens

(192pb)

Tanerella

forsythenis

(641pb)

Prevotella nigreens

(804pb)

Prevotella intermedia

(575pb)

MULTIPLEX

SEQUENCIAMENTO DO

GENE 16S RNA

Amostras de água Rio Pardo

117

Resultados

• 57 amostras de água

• 371 colônias isoladas

• Extração de DNA

• PCR (16s rRNA – 530-F e 1492-R)

• Purificação – PEG

• Sequenciamento – ABI (Alfredo da Mata)

118

Resultados

0

10

20

30

40

50

10

7

1 2

7

1 1 1

32

4

21

27

9

3 1 2 1 1

24

7

19

1

5

36

6

1

119

Resultados

• Filogenia MEGA 5.1

120

Muito

Obrigada!!!