Aulas II - Prof Flavio - Controle de Qualidade Microbiológico - 2013
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TESTE DE ESTERILIDADE
Mtodos do teste de esterilidade Direto: inoculao direta no meio de cultura
Mtodo mais simples.
Indicado para suturas cirrgicas, algodo e
gaze estril e dispositivos parenterais.
Indireto: mtodo de filtrao em membrana
Utiliza sistema de filtrao.
Indicado para parenterais de maior volume.
TESTE DE ESTERILIDADE
Mtodos Indireto Utiliza fluidos de diluio e lavagem.
Utiliza membranas com dimetro de 50 mm e
porosidade 0,45 m (geralmente 0,2 m).
Filtro de nitrato de celulose: indicado para
solues aquosas, oleosas e fracamente
alcolicas. Filtro de acetato de celulose: indicado para
solues fortemente alcolicas.
Filtro de PTFE e PVDF: indicado para produtos
oncolgicos e com solventes agressivos.
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REALIZADO EM CMARA DE FLUXO LAMINAR
Classe I ar horizontal;Classe II ar vertical;
Classe III hermeticamente fechada com luvas acopladas.
Tipo A recicla 70% e expulsa 30% do ar para a sala;Tipo B1 recicla 30% e expulsa 70% do ar para o exterior;
Tipo B2 expulsa 100% do ar;
Tipo B3 recicla 70% e expulsa 30% do ar para o exterior.
TESTE DE ESTERILIDADE
Filtros HEPA (High Efficiency
ParticulateAir Filter)
Eficincia de 99,7%
Estrutura fsica projetada
Ligar 30 min antes.
Limpeza do interior
com lcool 70%
Velocidade do ar =
0,35 a 0,55m/s
TESTE DE ESTERILIDADE
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EQUIPAMENTOS DE PROTEOEPI macaco, gorro, mscara, luva e
sapatilha
Tcnica de manipulao e descarte
TESTE DE ESTERILIDADE
TESTE DE ESTERILIDADE
Meios de culturaMeio fluido de tioglicolato
Colorao rsea em 1/3 do tubo
Usado para cultura de bactrias anaerbicas
Temperatura de incubao: 32,5 2,5C
Tempo: 14 dias
Caldo de casena-soja Usado para cultura de bactrias aerbicas,
fungos e leveduras.
Temperatura de incubao: 22,5 2,5C
Tempo: 14 dias
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TESTE DE ESTERILIDADE
Teste de adequao dos meios
Teste de esterilidade dos meios (14 dias de
incubao).
Promoo de crescimento (inocular microrganismo
teste).
Padronizao do microrganismo teste (inculo)
No mais que 100 UFC por frasco de meio de
cultura.
TESTE DE ESTERILIDADE
Teste para penicilinas e cefalosporinas
Mtodo direto: acrescentar -lactamase nos meios
de cultura.
Mtodo indireto: acrescentar -lactamase nos
fluidos de lavagem.
Controle negativo: sem amostra.
Controle positivo: com microrganismo teste. Teste de validao para bacteriostase e fungistase
Promoo de crescimento com amostra e
microrganismo teste deve ser idntica ao controle
(sem amostra).
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TESTE DE ESTERILIDADE
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Disponvel em: www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htmVolume 1 item 5.5.3.2.1 Teste de esterilidade
LEITURA RECOMENDADA
Qualquer substncia capaz de induzirelevaes trmicas em animais e humanos,em resposta a injeo ou infeco.
Os pirognios dividem-se em duas classes:
PIROGNIOS
Exgeno
Endgeno
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So aqueles que se originam fora do corpo einduzem elevaes trmicas quando injetados.
Incluem os pirognios de origem microbiana(endotoxinas) e no microbianos, que incluemalguns frmacos, esterides e fraes doplasma.
PIROGNIOS EXGENOS
considerado omediador primrio dafebre.
Tambm chamado depirogniogranuloctico.
PIROGNIO ENDGENO
produzido internamente pelo hospedeiro emresposta ao estmulo de pirognios exgenos.
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As endotoxinas so complexos de alto pesomolecular associados membrana externa debactrias Gram-negativas.
ENDOTOXINAS
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So atribudas diversas atividades biolgicas unidade lipdeo A da endotoxina:
TOXICIDADE LETAL
LEUCOPENIA
NECROSE DA MEDULA SSEA
REABSORO DO OSSO EMBRIONRIO
QUEDA DE PRESSO SANGUNEA
AGREGAO PLAQUETRIA
REATIVIDADE DRMICA AUMENTADA EPINEFRINA
AES BIOLGICAS DAS ENDOTOXINAS
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Os nveis de endotoxinas so cruciais na liberao deprodutos farmacuticos.
InjetveisAcessrios
detransfuso
Dispositivos
implantveis
Terapia
parenteral
CONTROLE DE QUALIDADE
Limites para produtos farmacuticos:
Produtos farmacuticos e biolgicos: 5 UE/Kg
Radiomarcadores: 2,5 UE/Kg
Parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL
gua para injeo: 0,25 UE/mL
Drogas intratecais: 0,2 UE/mL Correlatos: 0,5 UE/mL
Correlatos intratecais: 0,06 UE/mL
NVEIS DE ENDOTOXINAS
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MTODOS DE DESPIROGENIZAO
Inativao daendotoxina
Remoo daendotoxina
Um produto estril nem sempre est apirognico. Osmtodos de despirogenizao podem ser de 2 tipos.
MTODOS DE INATIVAO
Hidrlise cido-base
HCl 0,05N 30min 100C ou NaOH 0,25N 1h 50C
Alquilao
xido de etileno
Oxidao Perxido de hidrognio (gua para injeo)
Processo trmico
Calor seco 30min 250C
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MTODOS DE REMOO
Lavagem
Usa gua estril para injeo
Destilao
Indicada para parenterais de grande volume
Ultrafiltrao
Usada em vrios frmacos, incluindo antibiticos.
Osmose reversa Produo de gua estril para injeo
TESTE DE PIROGNIO
Teste
in vivo
Teste
in vitro
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Medida do aumento da temperatura corporal decoelhos aps injeo intravenosa da amostra aser testada.
Coelhos do mesmo sexo, raa, adultos, sadios,pesando 1,5kg no mnimo e com temperaturacorporal 39,8C.
Manter os animais em gaiolas individuais, livre deperturbaes e temperatura ambiente entre 20 e23C.
Usar termmetro calibrado no reto do animal.
TESTE DE PIROGNIO IN VIVO
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Injetar na veia marginal da orelha de 3 coelhosno menos de 0,5mL e nem mais que 10mL/kg.
Registrar a temperatura em intervalos de 30mindurante 3h.
Nenhum dos 3 coelhos deve apresentar aumentode temperatura 0,5C.
Caso apresente, repetir o teste com outros 5animais. Nesse caso, no mximo 3 dos 8 coelhospodem apresentar aumento de temperaturacorporal 0,5C. A soma dos aumentos de todosos coelhos no deve exceder 3,3C.
TESTE DE PIROGNIO IN VIVO
Usado para detectar ou quantificar endotoxinasbacterianas.
Utiliza o extrato aquoso dos amebcitoscirculantes do Limulus polyphemus, caracterizadocomo reagente LAL.
O reagente LAL um extrato aquoso dosamebcitos, que so as clulas sanguneas dahemolinfa azul da espcie de caranguejoferradura, composto de enzimas que reagem empresena de pequenas quantidades deendotoxina.
TESTE DE ENDOTOXINA IN VITRO
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TESTE DE ENDOTOXINA IN VITRO
Semi-quantitativo
Baseado na formaode cogulo
Mtodo decoagulao
em gel
Quantitativo
Mtodo turbidimtrico
Mtodo cromognico
Mtodo
fotomtrico
o procedimento mais simples e amplamenteusado para deteco de endotoxinas.
Volumes iguais de reagente LAL e da soluo aser analisada so transferidos a tubos de ensaio.
A mistura homogeneizada incubada em banhode gua a 37oC por uma hora. O ponto final da
reao facilmente verificado pela remoo dostubos e inverso a 180.
A presena do gel que se mantm slido durantea inverso considerada positiva paraendotoxinas.
MTODO DA COAGULAO EM GEL
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MTODO DA COAGULAO EM GEL
Proenzima Enzimaativada
Coagulognio Coagulina
Formao degel
Endotoxina
MTODO TURBIDIMTRICO
Proenzima Enzimaativada
Coagulognio Coagulina(turbidez)
Leitura em340nm
Endotoxina
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MTODO CROMOGNICO
Proenzima Enzimaativada
Coagulognio+ substrato
Coagulina +p-nitroanilina
Leitura em405nm
Endotoxina
Os testes para endotoxinas devem incluirincubao de vrias concentraes deendotoxina padro para obter uma curva decalibrao.
TESTE DE ENDOTOXINA IN VITRO
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O ensaio de pirognio em coelhos tem a seufavor a situao do envolvimento de toda areao fisiolgica do animal, constituindo umteste de segurana para os produtosinjetveis, lquidos para infuso e perfuso,materiais cirrgicos e descartveis em geral.
A desvantagem do teste in vivo ser maissusceptvel a interferncias, principalmente
dos animais.
TESTE IN VIVO x TESTE IN VITRO
O teste in vitro especfico paraendotoxinas bacterianas, mas no avalia osdemais pirognios exgenos, tais como algunsfrmacos, esterides e fraes do plasma.
A principal vantagem do teste in vitro permitir a quantificao ou estabelecimento
de limites para as endotoxinas, podendo serempregado na avaliao dos processos dedespirogenizao da indstria farmacutica.
TESTE IN VIVO x TESTE IN VITRO
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PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A.F.
Controle Biolgico de Qualidade de Produtos
Farmacuticos, Correlatos e Cosmticos. SoPaulo: Atheneu, 3 ed., 2010.
Captulo IX Pirognio e Endotoxina Bacteriana.
LEITURA RECOMENDADA
Disponvel em: www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm
Volume 1 item 5.5.2.1 (Pirognios) e 5.5.2.2 (Endotoxinas)
LEITURA RECOMENDADA
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