AURA MILENA VERA RODRIGUEZ - Uniandes
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1 ANÁLISIS MOLECULARES EN INSECTOS DE INTERÉS FORENSE AURA MILENA VERA RODRIGUEZ UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ, 2008
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ANÁLISIS MOLECULARES EN INSECTOS DE INTERÉS FORENSE
AURA MILENA VERA RODRIGUEZ
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ, 2008
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ANÁLISIS MOLECULARES EN INSECTOS DE INTERÉS FORENSE
AURA MILENA VERA RODRIGUEZ
Monografía presentada para optar al titulo de Biología
DIRECTOR: MANUEL PAREDES LÓPEZ PROFESOR CATEDRÁTICO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
CO-DIRECTOR: SILVIA RESTREPO
PROFESORA ASOCIADA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ, 2008
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AGRADECIMIENTOS
A Manuel Paredes por darme la oportunidad de hacer este trabajo; a Silvia
Restrepo por la colaboración y la paciencia; a Ginna Camacho por su ayuda; a
Jorge Noriega por brindarme información.
Al grupo de Forense Lorena, Luisa, Luz, Jorge, Erica y especialmente María
Andrea por la paciencia y la ayuda.
A mi hermana Tata, mi mamá y toda mi familia por apoyarme
incondicionalmente, por su cariño y por su respeto.
A todos los que me han brindado su amistad, especialmente a Ximena Olarte
que sido mi apoyo a lo largo del semestre.
Y a todos los que de alguna forma colaboraron con este proyecto.
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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN 7
2. JUSTIFICACIÓN 8
3. OBJETIVOS
3.1. Generales 8
3.2. Específicos 9
4. ENTOMOLOGÍA FORENSE 10
5. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DE LA ENTOMOLOGÍA FORENSE 10
5.1. Entomología forense en Suramérica 12
5.2. Entomología forense en Colombia 13
6. CATEGORÍAS ECOLÓGICAS DE ARTRÓPODOS EN LA
DESCOMPOSICIÓN CADAVÉRICA 14
7. INSECTOS DE INTERÉS FORENSE 15
7.1. ORDEN DÍPTERA 15
7.1.1. Familias de importancia forense 16
7.1.1.1. Familia Calliphoridae 16
7.1.1.2. Familia Sarcophagidae 17
7.1.1.3. Familia Muscidae 17
7.2. ORDEN COLEÓPTERA 18
7.2.1. Familias de importancia forense 19
7.2.1.1. Familia Silphidae 19
7.2.1.2. Familia Dermestidae 20
5
7.2.1.3. Familia Staphylinidae 20
7.2.1.4. Familia Histeridae 21
8. ESTUDIOS MOLECULARES 22
8.1. Orden Díptera 22
8.2. Orden Coleóptera 29
9. Bases de datos 31
9.1. National Center for Biotechnology Information (NCBI) 31
9.2. European Bioinformatics Institute (EBI) 32
9.3. The ITS2 DataBase 32
9.4. Barcode of life iniciative 33
10. DISCUSIÓN 33
11. CONCLUSIONES 37
12. REFERENCIAS 38
6
TABLA DE FIGURAS
Figura 1. Imágenes de moscas de “La fauna de los cadáveres” 11
Figura 2. Individuos de la familia Calliphoridae 16
Figura 3. Organismos de la familia Sarcophagidae 17
Figura 4. Imágenes de la familia Muscidae 18
Figura 5. Individuos de la familia Silphidae 19
Figura 6. Imágenes de individuos de la familia Dermestidae 20
Figura 7. Individuos de la familia Staphylinidae 21
Figura 8. Imágenes de la familia Histeridae 21
Figura 9. Árbol filogenético de la familia Calliphoridae 23
Figura 10. Gel de productos amplificados de diferentes estadios en machos de
la familia Calliphoridae 25
Figura 11. Gel de los marcadores de ISSR 26
Figura 12. Gel de la amplificación de los marcadores SCAR 26
Figura 13. Árbol filogenético del género Chrysomya 28
Figura 14. Árbol filogenético dl género Aleochara 30
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1. INTRODUCCIÓN
La entomología forense permite estudiar los insectos asociados a cadáveres,
no solo para responder algunas incógnitas acerca del cuerpo, sino también
para estimar el tiempo entre la muerte y el hallazgo de dicho cadáver, conocido
como intervalo post-mortem; que permite dirigir la investigación en un marco de
tiempo correcto; además de confirmar o refutar la coartada de un sospechoso
(Magaña, 2001). Al mismo tiempo, conociendo la diversidad de insectos en
regiones específicas, se puede determinar si el cuerpo ha sido movido del lugar
donde se encontró (Wolff et al. 2001).
Los insectos que llegan, se encuentran en el cuerpo de acuerdo a una sucesión
de especies que se da por el estado de descomposición del cadáver, ya sea
que esté fresco, hinchado, en fase colicuativa o en reducción esquelética (Byrd
& Castner, 2001).
Insectos del orden Díptera son por lo general los primeros colonizadores del
cadáver, ya que son necrófagos, que se alimentan del cuerpo como tal, como
las familias Calliphoridae, Sarcophagidae u Muscidae entre otras. Por su parte
los Coleópteros, Silphidae y Dermestidae, también necrófagas, y las familias
Staphylinidae y Carabidae, especies depredadoras, llegan al comienzo de la
descomposición y permanecen hasta las últimas etapas; y las familias
Dermestidae y Cleridae llegan ya sobre la fase seca (Magaña, 2001). Cuando
se recuperan los huesos en los últimos estados de descomposición, serán
estos organismos los que den la evidencia principal para determinar el intervalo
post-mortem (Kulshrestha & Satpathy, 2001).
El estudio tradicional se realiza de acuerdo a claves taxonómicas de rasgos
morfológicos que son representativos de los diferentes grupos de insectos. Sin
embargo, cuando se tienen insectos en estadios tempranos del desarrollo, es
8
difícil identificar la especie, por lo que se debe cultivar el organismo hasta que
sea adulto y se puedan observar las características necesarias para lograr su
clasificación. Además este análisis depende de la capacidad del investigador,
detectando las características.
2. JUSTIFICACIÓN
A lo largo de la historia, la entomología forense se ha consolidado como una
herramienta útil para resolver un crimen. A nivel taxonómico se ha tenido un
gran desarrollo, pero se tienen algunas limitantes: 1) Los caracteres
morfológicos en larvas no son muy claros, por lo que es necesario cultivarlas
hasta el adulto para realizar la clasificación, 2) Algunos individuos son muy
pequeños y no es posible llegar a identificación de género o especie; y 3) Los
especímenes de estudio pueden encontrarse fragmentados o deteriorados
(Camacho, 2008; Comunicación personal). Los análisis moleculares permiten
superar estas limitantes, pero la información disponible actualmente en esta
área es muy poca (Vanegas, 2006).
Esta investigación busca presentar algunos de los diferentes análisis
moleculares, realizados hasta el momento, en insectos de interés forense,
centrándose en individuos de los órdenes Díptera y Coleóptera, ya que estos
son los más importantes en la sucesión entomológica, necesaria para la
estimación del intervalo post-mortem.
3. OBJETIVOS
3.1. Generales
Establecer el estado del arte para los diferentes análisis moleculares que
pueden realizarse en individuos de los órdenes Díptera y Coleóptera para la
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identificación de especies, ya sea en muestras exclusivamente forenses o
estudios realizados con fines filogenéticos que puedan utilizarse en esta
identificación.
3.2. Específicos
• Hacer un análisis comparativo que permita ver las ventajas y
desventajas de las diferentes secuencias de ADN, utilizadas en los
estudios moleculares.
• Hacer un análisis comparativo entre los diferentes protocolos de
extracción y los distintos métodos moleculares utilizados.
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4. ENTOMOLOGÍA FORENSE
La entomología forense es la interacción entre el sistema judicial y la rama de
la zoología que estudia los insectos (Hall, 2001). Se puede dividir en: Urbana
que se concentra principalmente en insectos que afecten el entorno del ser
humano; De productos almacenados que involucra insectos o partes de estos
presentes en comida u otros productos; y Médico legal ó médico criminal que
usa los insectos como evidencia de un crimen (Hall, 2001).
Esta última subdivisión tiene como fin ayudar a resolver una investigación
criminal, ya sean homicidios, asaltos, estimando el tiempo entre la muerte y el
hallazgo del cadáver o intervalo post-mortem, el sitio donde ocurrió el hecho y
además sirve de apoyo a otros tipos de evidencia utilizada (Magaña, 2001).
Otra aplicación es la de estimar cómo y cuáles factores ambientales van a
intervenir en el tiempo de descomposición del cuerpo, el proceso de
colonización y el tiempo de desarrollo (Oliveira & Mello, 2004).
5. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DE LA ENTOMOLOGÍA FORENSE
La entomología forense nace en el siglo XIII, cuando Sung T´zu escribió el libro
“Instrucciones a los Jueces”, donde explica en detalle lo que se conocía hasta
el momento de la ciencia forense y resuelve el caso de un hombre que ha sido
degollado con una hoz, pidiéndole a todos los habitantes que traigan sus hoces
y las depositen en el suelo. Una de estas se llenó de moscas, por la sangre que
aún tenía en la hoja, y de esta forma determinaron quien era el culpable.
(Magaña, 2001; Goff 2001)
11
Durante los siglos XVIII y XIX, en exhumaciones masivas realizadas en Francia
y Alemania, se encontraban artrópodos de muchos tipos junto a los cuerpos
enterrados. Pero fue Orfila en 1831, quien entendió el papel tan importante que
cumplen las larvas en la descomposición del cuerpo y comenzó a reconocer
una sucesión de insectos (Benecke, 2001).
El primer caso donde se incluye una estimación del intervalo post-mortem lo
reporta Bergeret en 1855. En una casa en remodelación encontraron un niño
momificado, y el Doctor Bergeret realizó la autopsia, concluyendo que el niño
había muerto en 1848; esto por evidencia de actividad de Sarcophaga canaria.
Aunque el intervalo no era correcto, ya que malinterpretó la duración de los
ciclos de vida de los insectos relacionados, en esa época fue prueba suficiente
para que la policía arrestara a las personas que vivían en esa casa para la
época (Goff, 2001).
Fig 1. Imágenes de moscas de “La fauna de los cadáveres”.
Imagen superior: Pyophila petasionis. Imagen central: Sarcophage
carnaria. Imagen inferior: Lucilia caesar. (Benecke, 2001)
Mégnin, con sus publicaciones “La fauna de las tumbas” (1887) y “La fauna de
los cadáveres” (1894), propuso que un cuerpo al aire sufre cambios que se van
a caracterizar por ciertos artrópodos que aparecen en una sucesión regular. Así
mismo, habla de 8 etapas de descomposición en humanos con oleadas de
insectos, y describe 19 casos, incluyendo los propios. Inspirados por este
trabajo, en 1895, los canadienses Johnston y Villeneuve realizaron estudios
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sistemáticos entomológicos en cadáveres humanos, concluyendo que no había
datos para decir que Mégnin estuviera equivocado (Benecke, 2001; Goff,
2001).
En el siglo XX, Leclercq y Lambert, en 1976, encontraron que individuos de la
especie Calliphora vomitoria depositaban sus huevos en la sangre de un
cadáver, 6 horas después de la muerte. Para 1978, Leclercq publica
"Entomología y Medicina Legal: Datación de la Muerte" y en 1986, Smith
publica "Manual de Entomología Forense”, consolidando la entomología
forense como ciencia (Benecke, 2001).
5.1. Entomología forense en Suramérica
En Latinoamérica la información que se tiene es muy poca.
En Brasil, en Curitiba, Moura et al. (1997) realizaron un análisis preliminar de
insectos de interés médico-legal. En el 2000, Carvalho et al. Identificaron
artrópodos asociados a carroña de cerdo y cadáveres humanos en Campinas,
Sao Paulo. Carvalho et al. (2001) determinaron el efecto del Diazepam en el
crecimiento de moscas necrófagas del género Chrysomya. Para el 2004 ya hay
publicaciones acerca del uso de la entomología forense para la estimación del
intervalo post-mortem en casos de homicidio por parte de la policía de Rio de
Janeiro (Velásquez, 2008)
En Perú, en el 2003, Iannacone estudió, en un cerdo, los artrópodos asociados
de interés forense en la región de Callao. Es el primer informe de este tipo en la
región.
En Argentina, Oliva en el 2001, analizó los insectos de interés forense en carne
de vaca. En el 2002, Centeno et al. observaron los cambios en la sucesión de
13
insectos en cadáveres de cerdo, uno cubierto y otro sin cubrir, a lo largo de
cambios estacionales.
En Venezuela, Mávares-Cardoso et al. en el 2005, estudiaron insectos de
importancia forense asociados a pequeños cuerpos de mamíferos. En el 2006,
en Carabobo, Venezuela, Salazar estudió insectos en nueve cadáveres de rata
para determinar la composición de la entomofauna asociada. Finalmente en el
2007, Velásquez realizó un análisis preliminar de artrópodos asociados a
carroña de ratas en una región montañosa al norte de Venezuela.
5.2. Entomología forense en Colombia
El inicio de la entomología forense en Colombia se da con un estudio
sucesional realizado en dos cánidos, en Cali, por Olaya (2001). Luego,
Usaquén y Camacho en Bogotá (2000), estudiaron la presencia de Lucilia
sericata como la primera especie en colonizar el hígado humano.
Simultáneamente en Medellín, Wolff y Uribe (2000) hicieron un estudio
sucesional en Sus scrofa.
En 2001 Wolff et al. , realizaron un estudio sucesional en Sus scrofa, donde
concluyeron que predominaban las familias Calliphoridae, Sarcophagidae,
Muscidae y Silphidae. Otro estudio es de Barreto et al. del 2002, en el que
estudian estas mismas familias de insectos, asociadas a cadáveres humanos.
En la Sabana de Bogotá se ha caracterizado en Sus scrofa, los diferentes
estados de descomposición en condiciones naturales de temperatura y
humedad (Camacho, 2003) y de sol y sombra (Jiménez, 2003). Además, en el
2003, se observó el crecimiento de dípteros colonizadores, usando hígado
contaminado con cianuro y barbitúricos (Cañón, 2003). Otro estudio es el de
Martínez et al. (2007) donde realizaron un estudio sucesional en Páramo,
Colombia a 3035m sobre el nivel del mar.
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Entre las investigaciones de entomología forense en Colombia, cabe resaltar
los trabajos de Tesis que se están realizando en universidades como
Universidad de los Andes, Universidad Distrital Francisco José de Cáldas,
Pontificia Universidad Javeriana, Universidad de Antioquia, Universidad del
Valle, Universidad Nacional de Colombia, entre otras.
Uno de estos trabajos es el realizado por Hernández en el 2008 en la
Universidad de los Andes, donde trabajó con Citocromo Oxidasa I (COI) para la
identificación de individuos de la familia Calliphoridae.
6. CATEGORÍAS ECOLÓGICAS DE ARTRÓPODOS EN LA
DESCOMPOSICIÓN CADAVÉRICA
La sucesión entomológica sucede porque diferentes insectos son atraídos por
diferentes estadios de la descomposición, que les son útiles ya sea como
alimento o como extensión de su hábitat (Magaña, 2001; Benecke, 1998). Los
organismos se pueden dividir en diferentes categorías ecológicas como son:
• Necrófagos: Se alimentan del tejido en descomposición. Son los
primeros en llegar, y por lo tanto los más importantes para estimar el
intervalo post-mortem. En esta categoría se encuentran las familias
Calliphoridae y Sarcophagidae del orden Díptera y las familias Silphidae
y Dermestidae del orden Coleóptera (Magaña, 2001; Wolff et al. 2001).
• Necrófilos: Son especies predadoras o parásitas de los necrófagos. Son
el segundo grupo más importante en el cadáver. Hacen parte de este los
Dípteros Calliphoridae y Stratiomydae, y los Coleópteros Silphidae,
Staphylinidae e Histeridae (Magaña, 2001).
15
• Omnívoras: Se alimentan del cuerpo y de otros insectos. En esta
categoría se encuentran hormigas, avispas y otros Coleópteros (Goff,
2001).
• Accidentales: Son especies que no tienen relación con el cuerpo, solo lo
utilizan como extensión de su hábitat, como por ejemplo arañas
cazadoras o ciempiés (Magaña, 2001). También se incluyen animales
que caigan de vegetación cercana o aterricen sobre el cuerpo (Goff,
2001).
7. INSECTOS DE INTERÉS FORENSE
Es necesario identificar correctamente las especies de insectos de interés
forense, pues es esta clasificación la que permite establecer el tiempo de
desarrollo y obtener rangos de distribución, que puedan ayudar en la
investigación.
7.1. ORDEN DÍPTERA
Los Dípteros son de gran importancia forense, ya que hacen parte de la
primera oleada de necrófagos, y aportan gran información del entorno.
(Magaña, 2001)
Los organismos de este orden pueden encontrarse en casi cualquier lugar.
Poseen un solo par de alas, el segundo par está reducido a una pequeña
estructura llamada halterio, que les ayuda a estabilizar el vuelo (Byrd &
Castner, 2001).
Los huevos son de aproximadamente 2mm y tardan en pasar la siguiente
estadio entre 24 y 72 horas dependiendo de la especie y las condiciones
16
ambientales. Las larvas son de color cremoso, son suaves, apodas y no
poseen una cabeza visible (Byrd & Castner, 2001).
7.1.1. Familias de importancia forense
Las familias de mayor importancia forense son Calliphoridae, Sarcophagidae y
Muscidae, siendo las familias en las que se han centrado los estudios en
Dípteros.
7.1.1.1. Familia Calliphoridae
Las larvas maduras son blancas o de color cremoso, y miden entre 8 y 23mm
de largo. En el segmento terminal posee seis o más tubérculos con forma de
cono; además en este segmento se encuentra un espiráculo posterior, que
cumple la función de aparato respiratorio primario en la larva (Byrd & Castner,
2001). Cuando las larvas han terminado su crecimiento, dejan de comer y se
entierran para convertirse en pupas (Magaña, 2001)
El adulto tiene un tamaño entre los 6 y los 14mm de largo. La mayoría de las
especies tienen una apariencia metálica con colores como el verde, azul,
bronce y negro. Las antenas poseen tres segmentos con una arista plumosa
en el último segmento (Byrd & Castner, 2001).
Fig 2. Individuos de la familia Calliphoridae. A. Lucilia coeruleiviridis. (Stamper & Dalhem, 2006).
B. Lucilia Caesar. (Gómez, 2007)
A B
17
7.1.1.2. Familia Sarcophagidae
Se encuentran en todo el mundo, aunque la mayoría están en regiones
tropicales o templadas. Su tamaño varía entre los 2 y los 14 mm. El adulto
presenta unas franjas de color gris o negro en la región del tórax; nunca exhibe
la misma coloración metálica de la Familia Calliphoridae. Otra diferencia con
Calliphoridae es la antena, en la Familia Sarcophagidae es plumosa solo en la
base (Byrd & Castner, 2001).
Las especies de esta familia son similares entre ellas, tanto larvas como
adultos, lo que hace que sea difícil su identificación (Byrd & Castner, 2001).
Fig 3. Organismos de la familia Sarcophagidae. A) Sarcophaga aurifrons (Chew, 2007) B) Sarcophaga
aurifrons, (CSIRO, 2004) C) Sarcophaga cf. Carnaria (Zóralski, 2006)
7.1.1.3. Familia Muscidae
Tienen una relación muy cercana con el ser humano, lo que contribuye a su
importancia forense y médica (Byrd & Castner, 2001). Tienen un tamaño
medio, entre los 3 y los 10mm. Presentan una coloración oscura, grisácea o
amarilla, aunque algunos pueden presentar colores metálicos azul o verde. La
arista de la antena es plumosa, igual que en Calliphoridae (Byrd & Castner,
2001, Carvalho, 1997).
A B C
18
Fig 4. Imágenes de la familia Muscidae. A) No identificado (Wikipedia, 2002). B)
Stomoxys calcitrans (Novartis, 2007)
7.2. ORDEN COLEÓPTERA
Su importancia radica en que los individuos del orden Coleóptera permanecen
hasta las últimas etapas de la descomposición, siendo importantes a la hora de
estimar el tiempo de muerte (Magaña, 2001; Kulshrestha & Satpathy, 2001).
Los individuos de este orden se caracterizan por los élitros, alas anteriores
endurecidas que protegen las alas membranosas que les permiten volar. Otra
característica de este orden es que tienen una boca masticadora (Byrd &
Castner, 2001).
Las larvas poseen seis patas y una cabeza identificable; además su apariencia
varía de forma considerable en las diferentes familias. Pueden ser encontrados
en los mismos hábitats que cualquier otro insecto (Angulo, 2005; Byrd &
Castner, 2001)
A B
19
7.2.1. Familias de importancia forense
Entre las familias del orden Coleóptera que son de interés forense se
encuentran Silphidae, Dermestidae, Staphylinidae e Histeridae.
7.2.1.1. Familia Silphidae
Son de tamaño mediano, entre 10 y 35mm. Los adultos varían mucho en forma
y tamaño. Sin embargo, existen algunas características morfológicas que
comparten y pueden ser útiles a la hora de la clasificación. El cuerpo presenta
una coloración negra con parches naranjas, rojos o amarillos (Byrd & Castner,
2001).
Sus hábitos no son muy claros, algunos se alimentan de material vegetal, otros
son predadores; aunque la mayoría de las especies se alimentan de cadáveres
animales en descomposición (Ikeda et al. 2008).
Fig 5. Individuos de la familia Silphidae. Línea superior de izquierda a derecha: Ptomascopus zhangla
Hava, Eonecrophorus tenuicornis Kurosawa,
Nicrophorus chilensis Philippi, y Nicrophorus concolor
Kraatz. Línea inferior de izquierda a derecha: Necrophila
americana, Oxelytrum erythrurum , Oiceoptoma
subrufum, y Necrodes surinamensis . (Sikes, 2005)
20
7.2.1.2. Familia Dermestidae
Son Coleópteros pequeños, de entre 2 y 12mm de longitud de adulto, mientras
la larva mide entre 5 y 15mm. Redondos u ovalados, con antenas de 11
segmentos que finalizan en masas de 3 segmentos, aunque puede variar entre
especies. Algunos de estos individuos han sido usados en museos para
ayudar a limpiar los huesos que aún tienen restos adheridos al hueso
(Magaña, 2001).
Fig 6. Imágenes de individuos de la familia Dermestidae. A) Dermestes lardarius (Makarov, 2004). B)
Dermestes maculatus (Gross, 2006). C) Anthrenus sp. (Gompel & Gruber, 2006)
7.2.1.3. Familia Staphylinidae
Se encuentran en todo el mundo. Tienen un tamaño de 1 a 25mm, con una
forma característica, en la mayoría de los casos, que permite diferenciarlo
hasta el nivel de Familia. Las larvas son alargadas, con 2 a 4 segmentos. Son
de abdomen flexible y cada pata termina en una uña (Frank, 1997; Byrd &
Castner, 2001).
A B
A
C
A
21
Fig 7. Individuos de la familia Staphylinidae. A) Oxyporus sp.
(Newton & Thayer, 1995). B) Tachyporinae (Newton & Thayer,
1995). C) Algon bramlettorum (Schillhammer, 2005)
7.2.1.4. Familia Histeridae
Su tamaño varía entre 0.5 y 20mm. Son de cuerpo corto y compacto, y
presentan una coloración negra, a veces con manchas rojas o amarillas. Tanto
las larvas como los adultos son predadores y se alimentan de carroña
(Lawrence, 2001).
Fig 8. Imágenes de la familia Histeridae. A) Hister quadrimaculatus. B) Abraeus areolatus C)
Margarinotus bipustulatus (Makarov, 2006)
A B C
A B C
22
8. ESTUDIOS MOLECULARES
Con el fin de minimizar el tiempo de identificación y evitar los problemas de
tamaño del organismo, se han desarrollado métodos moleculares que
complementen la identificación taxonómica.
8.1. Orden Díptera
A nivel molecular, es este el orden del que más se encuentra información, ya
que es importante a la hora de estimar el intervalo post-mortem y por la
dificultad que se puede tener al clasificar las larvas de estos individuos.
En 1998, Benecke, extrajo ADN de adultos y juveniles de Díptera y Coleóptera ,
por medio de una digestión con proteinasa K, seguida de una extracción con
Fenol-Cloroformo. Trabajó con ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD).
Tomó larvas de Lucilia sp. y las comparó con adultos de Calliphora
erythrocephala de otro caso y un adulto de Silphidae. Como conclusión obtuvo
que este método es una herramienta útil cuando no se puede utilizar otro
medio, o cuando el caso es urgente y no se dispone del tiempo suficiente para
cultivar las larvas hasta el estadio de adulto. En el área médico legal, RAPD
pueden ser reportados solo para exclusiones, ya que cuando dos individuos
son similares, se necesita una base de datos para comparar el patrón. El
problema con este método, es que las bandas que se obtienen son de
diferentes tamaños y no es reproducible.
Malgorn & Coquoz (1999), trabajaron con entre 3 y 7 individuos por especie de
4 especies de Lucilia y una Calliphora vicina. El proceso de extracción
consistió en cortar las muestras en piezas pequeñas y colocarlas en un
microtubo con pistón, donde se agregó buffer de lisis y se colocó en incubación
23
a 56ºC durante la noche. El producto lisado se purificó por extracción con
Fenol-Cloroformo. A continuación amplificaron dos fragmentos de la secuencia
de Citocromo oxidasa I (COI), el primero de 297pb (2373-2075pb) y el segundo
de 305pb (2800-2495pb). Primero trabajaron solo con 3 de las 5 especies, y
los polimorfismos fueron suficientes para diferenciarlas. Una vez lograron
resultados positivos con 3 de las especies, procedieron a utilizarla en las 2
restantes; al usar todas las especies, notaron que Callihpora vicina era la que
presentaba más diferencias, como era lo esperado. Presentan este método
como fácil y rápido para identificar especies, especialmente en estadios
larvarios.
Fig 9. Árbol filogenético de la familia
Calliphoridae. Obtenido por Máxima parsimonia
con el soporte de bootstrap utilizando el gen
COI y COII. Wells & Sperling (2001)
En el 2001, Wells & Sperling, analizaron ADN mitocondrial en individuos de
Chrysomyinae, estudiando una secuencia de 2.3Kb (1467-3771 de Drosophila
yakuba) correspondiente a COI y COII, y la región de RNA de transferencia de
la leucina (tRNA-leu) en un individuo de cada una de las especies escogidas.
Utilizaron el kit QIAamp tissue columns para la extracción, realizaron una
24
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y análisis bioinformáticos, y
concluyeron que esta metodología es útil para identificar especímenes
asociados a cuerpos muertos en cualquier parte de Estados Unidos o Canadá,
con la posible excepción de algunas especies raras. En este mismo estudio se
realizó el análisis molecular en una larva no identificada tomada de un cuerpo.
Al obtener el árbol por máxima parsimonia con un soporte de bootstrap (Figura
9), se identificó la larva como un individuo del género Compsomyiops callipes,
con un soporte bootstrap de 98, demostrando así la utilidad de este método
para la identificación de especies.
Simultáneamente, Stevens y Wall estudiaron la relación genética entre
individuos de la familia Calliphoridae de interés forense, usando la subunidad
28S del RNA ribosomal. Tomaron músculo torácico de adultos y realizaron la
extracción por el método de bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB).
Obtuvieron que dentro de las sub-familias Luciliinae y Chrysomyinae, la
identificación a nivel de especie se logra en la mayoría de los casos usando un
fragmento corto de la secuencia, y en todos los casos usando la secuencia
completa. Calliphora sp. y Cynomya sp. requieren la secuencia completa para
su identificación. Regiones bien conservadas, como la 28S, pueden ser útiles
en la identificación de especies por su confiabilidad, bajo costo y rapidez.
Chen et al. en el 2004, en individuos adultos de la familia Calliphoridae,
realizaron una extracción con Fenol-Cloroformo, y finalmente PCR para la
amplificación de una secuencia de 1.6-Kilobases para lograr la identificación
molecular con COI. Lo que hacen es evaluar diferentes partes del cuerpo y
diferentes estadios de los organismos y obtuvieron resultados positivos.
Concluyen que el COI es informativo para un rango amplio de insectos. Por ser
una de las secuencias más largas del ADN mitocondrial, da mucha información
para análisis filogenéticos e identificación de especies. Además es importante
resaltar que, como se ve en la figura 10, esta metodología se puede trabajar en
organismos en estadios inmaduros diferentes. A nivel forense esto es muy
25
importante, ya que son estos estadios los que presentan una mayor dificultad a
la hora de la identificación.
Fig 10. Gel de productos amplificados de diferentes
estadios en machos de la familia Calliphoridae. Gel
obtenido por Chen et al. Pozos: 1) un huevo. 2) una
larva en instar 1. 3) una larva en instar 2. 4) una larva
en instar 3. 5) una pupa. 6) un pupario. 7) un adulto.
Chen et al. 2004.
En este mismo año, Junqueira et al. hicieron una secuenciación del ADN
mitocondrial (mtDNA) completo en Chrysomya chloropyga (15837pb). Para la
purificación del mtADN utilizan un gradiente de cloruro de cesio. Lo que
encontraron es que Chrysomya chloropyga posee una región duplicada con un
tRNA completo, siendo el primer díptero con 23 tRNA y no los 22 descritos para
artrópodos. Los mismos autores realizaron este mismo análisis en otros
géneros de la familia Calliphoridae y no encontraron el mismo patrón, pero
caracterizando otro Chrysomya si encontraron la región duplicada. De esta
forma determinan que esta región se puede utilizar como marcador molecular
para esta especie especialmente a la larva, que es difícil de identificar por
medio de claves morfológicas.
En el 2007, He et al. trabajaron con 5 especies de Dípteros de importancia
forense utilizando Inter Secuencias Simples Repetidas (ISSR) y Región
Amplificada Caracterizada por una Secuencia (SCAR). Realizaron la extracción
por el método de Fenol-Cloroformo. Encontraron que los ISSR prometen
mucho en la identificación molecular de especies, ya que es rápido, confiable,
26
conveniente y con una alta exactitud. Sin embargo, ISSR es útil solo si se
compara con una muestra de referencia. Este método trabaja bien en larvas,
como lo muestra la figura 11. Los pozos 1 a 6 corresponden a la misma
especie, Lucilia sericata, en tres de sus estadios (adulto, larva 2 instar, larva 3
instar), y se ve el mismo patrón de bandeo. Esta técnica puede ser de gran
utilidad en el área forense, pues permite una correcta identificación de especies
tanto en adultos como en estadios inmaduros.
Fig 11. Gel de los marcadores de ISSR. Amplificación del primer (CA)6GT obtenida por He
et al. (2007). 1y2: Lucilia sericata adulto. 3y4: L.sericata larva 2do instar. 5y6: L.sericata
larva 3er instar. 7y8: Aldrichina grahamani adulto. 9y10: Chrysomya megacephala adulto.
11y12: C.megacephala larva 3er instar. 13y14: Musca domestica adulto. 15y16:
Parasarcophaga crassipalpis adulto. He et al. 2007.
Fig 12. Gel de la amplificación de los marcadores
SCAR obtenidos por He et al. (2007). 1y2:
L.sericata adulto. 3y4: A.grahamani adulto. 5y6:
C.megacephala adulto. 7y8: P.crassipalpis adulto.
9y10: M.domestica adulto. A) Marcador SCAR
correspondiente a C.megacephala. B) Marcador
SCAR correspondiente a P.crassipalpis. C)
Marcador SCAR correspondiente a M.domestica.
He et al. 2007.
27
Por otro lado He et al. también encontraron que el método de SCAR es más
reproducible. El problema es que se obtiene un solo marcador por especie con
todos los amplicones de tamaños similares, luego el número de amplificaciones
necesarias dependerá del número de marcadores disponibles. En el caso de
los autores, trabajaron con 3 marcadores y por lo tanto, realizaron tres
amplificaciones como lo muestra la gráfica 12.
En otro estudio realizado en el 2007 es el de Smith y Baker. La extracción la
hicieron con tarjetas FTA® y con QIAamp tissue protocol, realizando la
amplificación con el kit ReddyMix™ PCR Master Mix 1X y finalmente trabajando
con polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción en productos
de PCR (PCR-RFLP) con COI, en secuencias de 524pb, para la identificación
de larvas de moscas en el Reino Unido. Encontraron 3 marcadores RFLP que
podrían arrojar un patrón diferente de bandeo en las 8 especies escogidas para
la investigación, y por lo tanto útiles en la identificación de especies. Aunque
los autores recomiendan tener en cuenta la posibilidad de variación intra-
especifica con esta metodología.
También en el 2007, Alessandrini et al., utilizaron el kit QIAamp DNA mini kit
para la extracción de ADN en larvas, pupas y adultos. Amplificaron las
secuencias de COI y COII (900pb aproximadamente), y al realizar el análisis
obtuvieron la identificación de 7 especies de Dípteros, además concluyen que
en Dípteros es más exacto identificar especies con fragmentos de COI y COII
que solo con fragmentos de COI.
Song et al. en el 2008, analizaron 63 secuencias completas del espaciador
interno transcrito 2 (ITS2) del ADN ribosomal en 29 especies de moscas
necrófagas comunes en la provincia Guangdong, al sur de China. La extracción
la realizaron por Fenol-Cloroformo en músculos torácicos de adultos. Como
resultado obtuvieron que el poder de resolución de esta región puede alcanzar
niveles profundos de la taxonomía, como Subgéneros. Aunque este estudio
muestra la región ITS2 como útil en la identificación de especies, la base de
28
datos que se desarrollaron en la investigación presenta cierto grado de riesgo
en el reconocimiento, debido a las secuencias de alta similaridad entre algunas
especies.
Utilizando un protocolo de extracción con Nal y PCR-RFLP para amplificar la
región ITS2 del rADN, Nelson et al. (2008), encontraron que una limitante de
este método es una mutación en un solo punto, pues puede introducir o
remover sitios de restricción, arrojando una identificación incorrecta.
Observando el árbol obtenido por el análisis de inferencia bayesiana (figura
13), se ven soportes de probabilidad a posteriori altos entre especies
hermanas, pero no tan altos entre grupos hermanos. También, comparando el
análisis que los autores realizaron con la región de ITS2 y los resultados
obtenidos por Wallman et al. con un fragmento de COI y COII, se puede
observar que el primero es menos exitoso a la hora de resolver problemas
filogenéticos a nivel de especie. Esto implica que la secuencia de ITS2 no va a
tener una buena resolución si se trabaja en identificación de especies.
Fig 13. Árbol filogenético del género Chrysomya. Basado en análisis
bayesiano de la secuencia ITS2 con los soportes de probabilidad a posteriori.
Nelson et al. 2008.
Otro trabajo realizado es el de Harvey et al. en el 2008. La extracción se realizó
utilizando el “DNEasy Tissue Kit” de Qiagen, y se procedió a la amplificación de
una secuencia de 1270pb del gen COI. Realizaron un análisis filogenético para
evaluar 27 especies de Calliphora en 119 especímenes de 22 países. A nivel
29
de especie, al realizar inferencia bayesiana, obtuvieron probabilidades
posteriores superiores a 94% en tres de las especies y comprobaron el gran
potencial que tiene esta secuencia en la identificación de especies.
Asimismo, en el 2008, Hernández amplificó el gen COI (440pb), en 12
individuos, 11 adultos y una larva, de la familia Calliphoridae que hacían parte
de la colección entomológica del Instituto Nacional de Medicina Legal y
Ciencias Forenses, Regional Bogotá. Primero trabajó diferentes protocolos de
extracción, como son las tarjetas FTA®, Chelex 100® al 15%, DNAzol® y
Fenol-Cloroformo. Sin embargo el método que arrojó los mejores resultados fue
el de Fenol-Cloroformo. Al comparar las secuencias con las reportadas en
NCBI se obtuvieron 3 géneros y 4 especies; además fueron comparadas con la
identificación que se tenía por morfología, encontrando una correspondencia
absoluta entre estos. Concluye que el COI es de gran utilidad en la
identificación de especies, y específicamente el análisis del fragmento C es
favorable, pues disminuye el tiempo de identificación de 45 a 2-3 días
aproximadamente.
8.2. Orden Coleóptera
En este orden los análisis moleculares que se han hecho son muy pocos; a
excepción del trabajo realizado por Benecke en 1998, en Díptera y Coleóptera,
la información disponible está más enfocada en aclarar problemas filogenéticos
que a la identificación de especies.
En el 2000, Dobler y Müller, investigaron la relación filogenética al nivel de
familia en Silphidae, con las secuencias de COI, COII y tRNA-leu (2094pb) , en
23 especies de 13 géneros. Utilizaron patas y antenas de los individuos de la
familia Silphidae, y organismos completos de los outgroups para realizar la
extracción, que se hizo con el QIAgen tissue kit, los cuales amplificaron y
secuenciaron. Como resultado obtuvieron la primera filogenia de Silphidae, con
árboles bien soportados en la mayoría de especies. Sin embargo, el estudio se
30
hizo a nivel de familia, por lo tanto se debe evaluar a qué nivel taxonómico el
resultado sigue siendo satisfactorio.
Maus et al., en el 2001, con la secuencia de 2022pb que corresponden a COI,
COII y tRNA de Leucina, realizaron una filogenia para 50 especies del género
Aleochara de la familia Silphidae. Tomaron adultos y les removieron el
abdomen y los genitales para evitar la contaminación con parásitos o restos de
comida, y para una posterior confirmación de la identificación con los genitales.
En la parte anterior del cuerpo se realizó la extracción con QIAgen tissue kit, y
realizaron amplificación por PCR. Una de las conclusiones es que las
secuencias de COI y COII son útiles para reconstrucciones filogenéticas en
este género; los árboles obtenidos, como el que se muestra en la figura 14,
presentan soportes de Bootstrap muy altos principalmente entre grupos
hermanos, y los análisis resultan consistentes con los árboles obtenidos por
características morfológicas. Sin embargo, a niveles taxonómicos mayores
(tribu), los valores de bootstrap no son muy altos.
Fig 14. Árbol filogenético dl género Aleochara. Obtenido por máxima verosimilitud con soportes de bootstrap en sus
ramas.
31
Basados en análisis de la región 18S, Caterino et al. (2005), realizan una
filogenia del infraorden Staphiliniformia. Tomaron muestras de 88 adultos, 1
huevo y 29 larvas; extrajeron ADN con Fenol-Cloroformo y con QIAgen tissue
kit. Además realizaron análisis morfológico de los mismos individuos. Los
árboles estaban bien soportados hasta superfamilia, pero a nivel de familia se
presentaban resultados ambiguos; esto debido a que el mínimo nivel
taxonómico al que 18S presenta una buena resolución es al de superfamilia.
Para los autores, en niveles inferiores se deben buscar genes que evolucionen
más rápido que el 18S.
En el 2008 Ikeda et al., explican la historia evolutiva de la pérdida del vuelo y su
relación con los hábitos alimenticios, número y tamaño de los huevos en la
familia Silphinae. El ADN fue extraído por dos métodos: Fenol-Cloroformo y
Chelex 100®, y amplificado por PCR para las secuencias de la subunidad 16S
de rADN, la subunidad 28S de rADN, Wingless (Wg) y phosphoenolpyruvate
carboxykinase (Pepck). Utilizaron 21 especies de 12 géneros. Los árboles
obtenidos mostraron a Silphinidae como grupo monofilético con soportes altos,
coherente con lo obtenido por Dobler y Müller (2000). Utilizan datos
morfológicos y moleculares para tener más características a evaluar y que los
resultados obtenidos sean más confiables.
9. Bases de datos
9.1. National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Creado en 1988 como una división del Instituto Nacional de la Salud (NIH) de
Estados Unidos. Funciona como base de datos pública, pero también trabaja
desarrollando software que permita analizar datos de genomas, y ayuda a
32
difundir información biomédica. Maneja la base de datos GenBank junto con
otras bases de datos de interés científico y médico (NCBI, 2004).
Dispone de un gran número de secuencias reportadas de las utilizadas en los
artículos aquí expuestos. El gen de la citocromo oxidasa presenta un mayor
número de secuencias reportadas respecto a las otras secuencias utilizadas,
tanto para Díptera como para Coleóptera.
9.2. European Bioinformatics Institute (EBI)
El Instituto Europeo de Bioinformática hace parte del Laboratorio Europeo de
Biología Molecular. Trabaja en asociación con entidades internacionales,
principalmente NCBI, tanto a nivel de fondos como a nivel de información. (EBI,
2008)
Tiene a disposición las secuencias tanto de NCBI como algunas propias del
laboratorio, por lo que se encuentra un número mayor de secuencias
reportadas.
9.3. The ITS2 DataBase
Esta base de datos es específica de la secuencia de ITS2 y tiene como función
principal modelar y ayudar a predecir la estructura secundaria de ITS2.
También trabaja asociada a NCBI, por lo que para obtener la estructura
secundaria se puede utilizar la secuencia específica o el número de acceso de
dicha base de datos (ITS2 DataBase, 2008).
33
9.4. Barcode of life iniciative
Esta base de datos trabaja con la secuencia del gen de la COI, y lo que busca
es lograr una identificación de especies con esta secuencia. Utiliza como fuente
secuencias disponibles en NCBI, la página de árbol de la vida (Tree of Life Web
Project), el Centro Canadiense para Código de Barras de ADN (Canadian
center for DNA barcoding) y el sistema integrado de información taxonómica
(ITIS) entre otros (BOLD, 2008).
10. DISCUSIÓN
La investigación en el área molecular de la entomología forense está en auge,
cada vez son más los investigadores que se preocupan por este tema. Y es
lógico, si se piensa en todo el tiempo que se puede economizar utilizando estos
métodos.
Hay una gran diversidad de metodologías, protocolos de extracción, y de
regiones o secuencias amplificadas. La herramienta que se use, dependerá de
las características del individuo a estudiar y de la disponibilidad de tiempo y de
recursos. De acuerdo a esto, habrá ventajas y desventajas de los procesos
elegidos.
Existen muchos protocolos de extracción, pero no todos funcionan con la
misma eficiencia. Como es el caso de las tarjetas FTA® y Chelex 100® que, a
pesar de que algunos de los artículos mencionados anteriormente logran
obtener buenas extracciones, el trabajo realizado por Hernández (2008) no
obtuvo una extracción eficiente, por lo que trabajó con Fenol-Cloroformo. En los
34
artículos aquí expuestos en los que se utilizaron estos métodos, se realizó un
paso extra de purificación con “Kit”. Es posible que tanto la tarjeta impregnada
de químicos como la resina quelante, no tengan la capacidad de liberar todo el
ADN unido a tejidos complejos como el músculo (Hernández, 2008), y
requieran este paso de purificación para obtener una eficiencia mayor.
Fenol-Cloroformo permite obtener un ADN más puro que otros protocolos, pero
requiere mucho tiempo para obtener el resultado, mientras que trabajar con
CTAB implica menos pasos y menos tiempo, lo que disminuye la cantidad de
posibles contaminaciones de la muestra, pero la pureza de la muestra es
menor que la de Fenol-Cloroformo (Fraga et al., 2004). Los “Kits” de QIAgen
son útiles y permiten obtener ADN puro, sin embargo en trabajos, por ejemplo
en las universidades, no están disponibles, por lo que Fenol-Cloroformo se
convierte en la mejor opción para la extracción.
Los “kits”, Fenol-Cloroformo y CTAB son los mejores protocolos para obtener
ADN, ya que tarjetas FTA y Chelex necesitan un paso de purificación adicional
para obtener una eficiencia suficiente para los análisis posteriores.
El método molecular más usado es PCR. Es rápido, fácil de usar, y no requiere
concentraciones muy altas de ADN. Entre las desventajas están la gran
cantidad de inhibidores. Si no se realiza una buena purificación, no se van a
obtener resultados; y como es tan sensible, existirá un alto riesgo de
contaminación, que arrojará datos incorrectos. Además, para realizar una
buena PCR se deben conocer las características de los primers, pues de estos
dependerá la temperatura a utilizar.
Otro método es el de RAPD, que poseen la ventaja del tiempo, pero tiene una
desventaja muy grande, y es la falta de reproducibilidad. Puede ser útil en
casos de exclusión, más no en casos de inclusión. Cuando dos individuos son
similares requiere una base de datos con la cual se pueda comparar, pero el
número de especies de insectos de interés forense es muy grande y se
35
necesitaría mucho tiempo. Sin embargo tiene la ventaja de generar resultados
con larvas.
En cuanto a los ISSR, pueden generar polimorfismos adicionales, arrojando un
perfil más complejo. Algunos de los fragmentos solo se dan en especies
particulares. Al convertir los marcadores ISSR a SCAR, como lo hicieron He et
al. (2007), se obtuvieron marcadores especie – específicos que tendrán un
gran potencial en la identificación forense. Los marcadores pueden requerir un
gasto de tiempo en su diseño (IPGRI, 2003). Además tanto ISSR como SCAR
permiten obtener buenos resultados con estadios inmaduros, por lo tanto son
herramientas útiles para la identificación de especies, especialmente en el área
forense, porque facilitan la correcta identificación de estos estadios, difíciles de
clasificar con claves taxonómicas morfológicas.
También pueden usarse métodos como PCR-RFLP, que puede ser útil, pero
una mutación en un solo punto puede cambiar los fragmentos de restricción,
puede aumentarlos o disminuirlos, mostrando un patrón diferente al que es.
Con lo anteriormente mencionado se puede decir que la mejor opción es
trabajar con PCR, con ISSR o con SCAR, son los métodos que dan resultados
favorables y no presentan desventajas tan significativas como PCR-RFLP y
RAPD, que no son reproducibles. Además PCR-RFLP con una sola mutación
puede cambiar el resultado.
En cuanto a las secuencias comúnmente utilizadas, la de Citocromo Oxidasa
es la que permite obtener mejores resultados. Es de gran utilidad en la
identificación forense en el mismo género, y para realizar análisis filogenéticos,
como se muestra en los estudios moleculares. Además de la gran cantidad de
información que se puede obtener con este gen, influye también el hecho de
ser el que más secuencias reportadas posee en las bases de. Así, cuando se
tenga un resultado, se tendrá un punto de comparación que permita ver que tan
real y coherente es lo que se está obteniendo.
36
Comparando los trabajos realizados con Citocromo Oxidasa, tanto en Díptera
como en Coleóptera, vemos que en este último las secuencias utilizadas son
de gran tamaño (Dobler & Müller 2094pb; Maus et al. 2022pb), mientras en
Díptera las secuencias son de diferentes tamaños, algunas de COI, COII y
tRNA-leu, otras solo de COI. Aunque ya se conoce la utilidad de CO para la
identificación de especies, es necesario realizar este tipo de investigaciones en
el orden Coleóptera para conocer que región de la citocromo oxidasa es más
útil en este orden.
Otra región utilizada es la ITS2 del rADN, cuya resolución llega hasta
Subgénero; sin embargo, al compararla con citocromo oxidasa, no es tan útil a
nivel de especie. También se puede usar la secuencia de la subunidad 28S del
rADN, una región conservada, y donde el proceso es rápido y confiable. En
cuanto a la 18S del rADN, al nivel de superfamilia se obtienen buenos
resultados, pero a nivel de familia arroja información ambigua, por lo tanto, no
es útil a niveles taxonómicos inferiores.
Los estudios entre órdenes no son comparables. En Díptera hay muchas
investigaciones enfocadas a la identificación de especies de interés forense, y
cada vez más, los investigadores se dedican a este tipo de trabajos; mientras
que en Coleóptera, uno de los problemas más importantes actualmente, es
aclarar las relaciones filogenéticas de los linajes mayores, que son muy poco
conocidos (Madisson, 2000), por lo que la mayoría de estudios se centran en
este tema.
A futuro se debe investigar qué regiones pueden ser útiles para la identificación
de especies en Coleóptera, para lograr unos buenos resultados, que
disminuyan el tiempo invertido en la clasificación de este orden. Existen
familias, como la Staphylinidae, donde solo se ha llegado hasta Tribu, pues el
tamaño no permite diferenciar más claves morfológicas, y no se tienen los
37
análisis moleculares para avanzar a niveles taxonómicos inferiores (Camacho,
comunicación personal).
Otro factor que se puede mejorar es el de las bases de datos, algunos genes
no tienen la información suficiente disponible para realizar los estudios, o
algunas metodologías que requieren una base de datos que les permita
comparar los resultados.
10. CONCLUSIONES
- Para la extracción los mejores resultados se obtiene con “Kits”, con el
protocolo de Fenol-Cloroformo o con CTAB.
- El uso de los métodos de PCR, ISSR y SCAR arrojará los mejores
resultados de identificación de especies, debido a su rapidez, su
confiabilidad y bajo costo.
- RADP no es útil para identificación forense porque no es reproducible.
Tampoco PCR-RFLP pues con pequeñas mutaciones cambia el patrón
de bandeo y da como resultado una identificación incorrecta.
- La secuencia más estudiada y más eficiente es la de citocromo oxidasa,
permite la identificación al nivel de género y se tiene una amplia base de
datos que permite su comparación.
- La región ITS2 tiene una buena resolución al nivel de subgénero, pero
no es tan buena al nivel de especie. La subunidad 18S es útil en niveles
taxonómicos superiores a familia.
- La información que se encuentra de Coleóptera, es principalmente para
análisis filogenéticos a niveles de familia o superiores. No son una base
para identificación de especies.
38
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