UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL

CAMILA BARBOSA AMARAL

AVALIAÇÃO CLÍNICA, RADIOGRÁFICA, HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-

HISTOQUÍMICA DE NEOPLASIAS ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris,

LINNAEUS, 1758)

NITERÓI 2013

CAMILA BARBOSA AMARAL

AVALIAÇÃO CLÍNICA, RADIOGRÁFICA, HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-

HISTOQUÍMICA DE NEOPLASIAS ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris,

LINNAEUS, 1758)

Orientadora: Profª.Dra. ANA MARIA REIS FERREIRA

Co-Orientador: Profº. Dr. MÁRIO ANTÔNIO PINTO ROMÃO

Niterói 2013

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária – Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Patologia e Diagnóstico por Imagem.

CAMILA BARBOSA AMARAL

AVALIAÇÃO CLÍNICA, RADIOGRÁFICA, HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-

HISTOQUÍMICA DE NEOPLASIAS ÓSSEAS EM CÃES (Canis familiaris,

LINNAEUS, 1758)

Aprovada em maio de 2013.

BANCA EXAMINADORA

Profª.Dra. ANA MARIA REIS FERREIRA – Orientadora Universidade Federal Fluminense

Profº Dr. JÚLIO LOPES SEQUEIRA – Membro Externo Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

Profº.Dr. RICARDO SIQUEIRA DA SILVA – Membro Externo Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

Profª. PhD. LOUISIANE DE CARVALHO NUNES– Membro Externo Universidade Federal do Espírito Santo

Profª Dra. JULIANA DA SILVA LEITE – Membro Interno Universidade Federal Fluminense

Niterói - 2013

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária – Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito final para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Patologia e Diagnóstico por Imagem.

A todos os cães; Os meus, os seus, os nossos; E a todos aqueles que se importam.

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Ana Maria Reis Ferreira, pelo auxílio mais uma vez

nessa empreitada mesmo frente à distância e às dificuldades encontradas.

Ao meu co-orientador, Mário A. P. Romão, pelo suporte e dedicação. É

sempre bom ter você por perto.

A todos os médicos veterinários e proprietários que confiaram seus cães a

mim estivessem eles vivos, mortos e, porque não dizer, em partes. Espero que este

trabalho ajude outros cães a não passarem pelo que eles passaram. Do contrário,

esse projeto não teria razão de existir. Muitíssimo obrigada.

Aos colegas do Setor de Anatomia Patológica, pela ajuda nesse vai e vem e

por muitas vezes otimizarem meu tempo na UFF. Fabiane C. Lopes, você é demais

também na Patologia!

A minha querida amiga Juliana da S. Leite, que sempre esteve ao meu lado

nessas aventuras desde a graduação e foi incansável na realização da imuno-

histoquímica. Não tenho palavras para expressar minha gratidão. Esse trabalho

também é seu!

Profª Ana Beatriz Monteiro, responsável pela análise estatística dos dados.

Muito obrigada pela ajuda e paciência e mais uma vez desculpe-me pela correria.

Às amigas Emanuele A. Alves, Lyvia C. R. Carvalho e Gabriela P. Passoss

pelo companheirismo e cumplicidade durante esse período ouvindo meus desabafos

e muitas vezes passando por coisa parecida.

A minha querida amiga e companheira no dia-a-dia alegrense, Andréia Weiss,

por ouvir meus resmusgos, meus gritos e até mesmo meu silêncio. Aprendo cada dia

mais contigo e não sei o que seria de mim em Alegre sem você. Tenho muito

orgulho de ti, loira!

Aos colegas de trabalho, de departamento ou não, pela acolhida em Alegre.

Às minhas “pestes”, também chamados de alunos, por me ensinarem cada

vez mais e me surpreenderem sempre, só me dando certeza da decisão que tomei.

Em especial aos meus criminals, pela ajuda no nosso Setor, por entenderem

“minhas crises” e por se mostrarem tão unidos a ponto de quase se detestarem!

Amo vocês demais!

Às minhas cadelas, as que já partiram e as que seguem comigo hoje, vocês

sempre foram a razão de tudo isso. Muito obrigada por esse amor incondicional.

Aos cães do CCA-UFES, pelo carinho (ou seria carência?), pela companhia,

pela bagunça nossa de todo dia. Vocês alegram a faculdade e nos divertem todo

dia. Afinal, apesar de alguns discordarem, CACHORRO É TUDO DE BOM!!!

Amarelo, sinto sua falta e conviverei para o resto da minha vida com o meu

arrependimento. Te amo, onde quer que você esteja.

Ao meu pai, Jorge Amaral, por ter se disponibilizado desde o início a me

acompanhar durante o período de coleta de material, mesmo quando eu achava que

não era preciso.

À minha mãe, Rosane B. Amaral, por todas as vezes em que, tão

altruistamente, deixou seus compromissos de lado para me disponibilizar o carro

falicitando e muito o translado Rio-Niterói-Rio.

Ao meu irmão, Bernardo B. Amaral, por manter a “sanidade mental” do meu

computador, peça de trabalho fundamental.

A Deus e aos meus anjos, pois como diria Julie Andrews em “A Noviça

Rebelde”: “nada vem do nada, e nem poderia, mas em algum momento da minha

infância ou juventude, eu devo ter feito algo de bom”. Aliás, de muito bom para

merecer tudo isso. Não tenho do que reclamar (mesmo que, de vezes em quando, o

faça).

“Words are, in my not so humble opinion, our most inexhaustible source of magic.”

Professor Albus Percival Wulfric Brian Dumbledore

SUMÁRIO

CAPA ____________________________________________________________________1

FOLHA DE ROSTO ________________________________________________________2

FOLHA DE APROVAÇÃO ___________________________________________________3

DEDICATÓRIA ____________________________________________________________4

AGRADECIMENTOS _______________________________________________________ 5

EPÍGRAFE_______________________________________________________________ 7

SUMÁRIO ________________________________________________________________ 8

LISTA DE ILUSTRAÇÕES _________________________________________________ 10

RESUMO ________________________________________________________________ 15

ABSTRACT ______________________________________________________________ 16

1 INTRODUÇÃO __________________________________________________________ 17

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ___________________________________________ 19

2.1 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E

CLÍNICOS. ___________________________________________________________________________ 20 2.1.1. Osteossarcoma _________________________________________________________________ 20 2.1.2. Condrossarcoma ________________________________________________________________ 22 2.1.3. Fibrossarcoma _________________________________________________________________ 23 2.1.4. Hemangiossarcoma _____________________________________________________________ 24 2.1.5. Tumor ósseo multilobular ________________________________________________________ 25 2.1.6. Outras considerações ____________________________________________________________ 26

2.2 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS RADIOGRÁFICOS,

MACROSCÓPICOS E MICROSCÓPICOS _________________________________________________ 26 2.2.1. Osteossarcoma _________________________________________________________________ 26 2.2.2. Condrossarcoma ________________________________________________________________ 29 2.2.3. Fibrossarcoma _________________________________________________________________ 30 2.2.4. Hemangiossarcoma _____________________________________________________________ 31 2.2.5. Tumor Ósseo Multilobular ________________________________________________________ 32

2.3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS _________________________________________________________ 32

2.4 IMUNO-HISTOQUÍMICA ___________________________________________________________ 34 2.4.1. Introdução ____________________________________________________________________ 34 2.4.2. Histórico e Aplicações Gerais _____________________________________________________ 34 2.4.3. Anticorpos Utilizados ____________________________________________________________ 36

9

2.4.4. Alvos antigênicos em Oncologia ___________________________________________________ 37 2.4.5. Limitações ____________________________________________________________________ 38 2.4.6. Vantagens _____________________________________________________________________ 39 2.4.7. Desvantagens __________________________________________________________________ 40 2.4.8. Interpretação de resultados _______________________________________________________ 40 2.4.9. Marcadores de interesse em Neoplasias Ósseas _______________________________________ 41

2.4.9.1.Marcadores de Linhagem Celular____________________________________________ 41 2.4.9.2. Marcadores ósseos proteicos ______________________________________________ 45

2.4.10. A imuno-histoquímica na Oncologia Veterinária _____________________________________ 50

3 OBJETIVOS ____________________________________________________________ 52

3.1 OBJETIVO GERAL _________________________________________________________________ 52

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS __________________________________________________________ 52

4 MATERIAIS E MÉTODOS ________________________________________________ 54

4.1 ANIMAIS _________________________________________________________________________ 54

4.2. METODOLOGIA __________________________________________________________________ 54 4.2.1. Avaliação clinica _______________________________________________________________ 54 4.2.2. Exames Radiográficos ___________________________________________________________ 55 4.2.3. Obtenção de Amostra ____________________________________________________________ 56

4.2.3.1. Biópsias _________________________________________________________________ 56 4.2.3.2. Peças cirúrgicas e necrópsias ______________________________________________ 57

4.2.4. Processamento histológico _______________________________________________________ 58 4.2.5. Processamento imuno-histoquímico ________________________________________________ 58 4.2.6. Avaliação Histopatológica e Imuno-Histoquímica _____________________________________ 59 4.2.7. Análise Estatística ______________________________________________________________ 60

5 RESULTADOS __________________________________________________________ 61

5.1 ANIMAIS _________________________________________________________________________ 61 5.1.1 Avaliação clínica _______________________________________________________________ 61 5.1.2 Exame radiográfico _____________________________________________________________ 62 5.1.3 Avaliação Anatomo-Histopatológica ________________________________________________ 65 5.1.5 Avaliação Imuno-Histoquímica ____________________________________________________ 72

6 DISCUSSÃO ____________________________________________________________ 77

7 CONCLUSÃO ___________________________________________________________ 89

8 OBRAS CITADAS _______________________________________________________ 91

9 ANEXOS _______________________________________________________________ 99

9.1 Autorização para posse de cadáver canino. ______________________________________________ 100

9.2 Autorização para realização de procedimento em canino. ___________________________________ 101

9.3 Certificado do Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF. _________________________________ 102

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Quadro 1: Protocolo imuno-histoquímico utilizado para os anticorpos vimentina,

osteonectina (SPARC) e osteocalcina em neoplasias ósseas caninas, f. 59.

Tabela 1: Distribuição de valores relativos a idade e peso dos 22 cães avaliados, f.

61.

Figura 1: Frequencia de distribuição das lesões sugestivas de neoplasia óssea

primária ao exame radiográfico dos cães avaliados (n=22), f. 62.

Figura 2A: Radiografia: Caso nº. 20, canino, fibrossarcoma. Radiografia simples,

lateral oblíqua esquerda, mandíbula: lise e perda de opacidade óssea em corpo

mandibular esquerdo na altura do segundo pré-molar (seta), f. 64.

Figura 2B: Radiografia: Caso nº. 6, canino, osteossarcoma. Radiografia simples,

latero-lateral, membro pélvico esquerdo: proliferação óssea acentuada em metáfise

e diáfise proximal de fêmur esquerdo, f. 64.

Figura 2C: Radiografia: Caso nº. 13, canino, osteossarcoma. Radiografia simples,

médio-lateral, membro torácico direito: proliferação óssea discreta em diáfise

média e distal e metáfise distal radial direita, f. 64.

11

Figura 2D: Radiografia: Caso nº. 14, canino, fêmea, osteossarcoma. Radiografia

simples, médio-lateral, membro torácico direito: lise óssea em metáfise proximal de

úmero direito, alterando o padrão trabecular, f. 64.

Figura 2E: Radiografia: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma. Radiografia simples,

médio-lateral, membro torácico direito: áreas de lise e proliferação óssea com

destruição de cortical em metáfise proximal de úmero direito, f. 64.

Quadro 2: Avaliação das neoplasias ósseas nos cães analisados segundo sexo,

idade, raça, local biopsiado e resultado histopatológico (n=22), f. 66.

Figura 3: Frequencia de distribuição dos tipos histológicos diagnosticados em cães

avaliados com neoplasia óssea (n=22)., f. 67.

Figura 4: Frequencia de órgãos acometidos por metástase nos animais portadores

de osteossarcoma avaliados por meio de necropsia, f. 69.

Figura 5A: Fotomacrografia: Caso nº 2, canino, osteossarcoma. Membro pélvico

direito: aumento de volume em região distal de membro torácico direito (região

cárpica), com vasculatura evidente e coloração avermelhada, f. 70.

Figura 5B: Fotomacrografia: Caso nº 8, canino, osteossarcoma. Necropsia: cavidade

torácica revelando líquido sanguinolento e coração (asterisco), pulmões (p) e pleura

(pl) com focos metastáticos, f. 70.

Figura 5C: Fotomacrografia: Caso nº 10, canino, osteossarcoma. Peça cirúrgica,

membro torácico direito (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise

umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e

necrose (arco), f. 70.

Figura 5D: Fotomacrografia: Caso nº 8, canino, osteossarcoma. Peça cirúrgica,

membro pélvico esquerdo (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise

umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e

atrofia de musculatura (seta), f. 70.

12

Figura 6A: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº. 10, canino,

osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça cirúrgica, membro torácico direito:

material osteóide mineralizado formando trabéculas desorganizadas entremeadas

por células neoplásicas. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D – 400x

original; barra: 50 µm), f. 71.

Figura 6B: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº. 10, canino,

osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça cirúrgica, membro torácico direito:

trabéculas desorganizadas entremeadas por células neoplásicas, revelando

anisocitose e nucléolos evidentes. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D

– 400x original; barra: 50 µm), f. 71.

Figura 6C: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº. 7, canino,

condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: ilhas de cartilagem

neoplásica com tecido conjuntivo ao redor. Observa-se processo de ossificação

central da ilha. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D – 400x original;

barra: 50 µm), f. 71.

Figura 6D: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. Caso nº 20, canino,

fibrossarcoma. Peça cirúrgica, mandíbula esquerda: células fusiformes dispostas em

feixe, com moderado pleomorfismo e nucleolação evidente. (A-F – HE; A,C – 40x

original; barra: 200 µm; B,D – 400x original; barra: 50 µm), f. 71.

Tabela 2: Distribuição de valores relativos ao percentual de marcação para

vimentina, SPARC e osteocalcina nos gupos de cães avaliados, f. 73.

Figura 7A: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº.

18, canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo. Peça cirúrgica,

membro torácico direito: intensa marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos

malignos. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm.

Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.

13

Figura 7B: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº.

8, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça de necropsia, membro

pélvico esquerdo: moderada marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos

malignos. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm.

Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.

Figura 7C: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº

7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: condrócitos

malignos marcados (asterisco) (+++) em transição para formação de cartilagem

madura (jogo da velha). (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original;

barra: 200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.

Figura 7D: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº

7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação de

condrócitos em cartilagem madura (+++). (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E

– 40x original; barra: 200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.

Figura 7E: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº

7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação em

nicho cartilaginoso e em vasculatura periférica intensa (+++). (A,B,C,D,F – 400x

original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm. Contra-coloração:

hematoxilina de Meyer), f. 75.

Figura 7F: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. Caso nº.

9, canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo. Peça cirúrgica,

membro pélvico direito: osteoblasto maligno em divisão celular atípica (detalhe).

Observa-se marcação exclusivamente citoplasmática e de menor intensidade nas

demais (++) células. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra:

200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 75.

14

Figura 8A: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-

osteocalcina. Caso nº. 18, canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente

produtivo. Peça cirúrgica, membro torácico direito: marcação discreta (+) anti-

SPARC citoplasmática em osteoblastos malignos. (A-F – 400x original; barra: 50 µm.

Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.

Figura 8B: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-

osteocalcina. Caso nº 20, canino, fibrossarcoma. Peça cirúrgica, mandíbula

esquerda: marcação acentuada (++) anti-SPARC citoplasmática em células

fusiformes. (A-F – 400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de

Meyer), f. 76.

Figura 8C: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-

osteocalcina. Caso nº 7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico

esquerdo: marcação discreta (+) anti-SPARC em condrócitos malignos. (A-F – 400x

original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.

Figura 8D: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-

osteocalcina. Caso nº. 4, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo. Peça de

necropsia, membro torácico direito: moderada marcação (++) anti-osteocalcina

citoplasmática em osteoblastos malignos. Observa-se célula gigante central. (A-F –

400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.

Figura 8E: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-

osteocalcina. Caso nº 7, canino, condrossarcoma. Peça cirúrgica, membro pélvico

esquerdo: marcação discreta (+) anti-osteocalcina em condrócitos malignos. (A-F –

400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.

Figura 8F: Fotomicrografia – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-

osteocalcina. Caso nº 20, canino, fibrossarcoma. Peça cirúrgica, mandíbula

esquerda: ausência de marcação (-) anti-osteocalcina em células fusiformes. (A-F –

400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer), f. 76.

RESUMO

Os tumores ósseos primários em cães apresentam características radiográficas e histopatológicas marcantes. Em alguns casos, o diagnóstico pode ser complicado pela ausência dessas características. A utilização de anticorpos contra proteínas que caracterizam essas neoplasias pode auxiliar na elucidação destes casos. O presente trabalho teve por objetivo avaliar neoplasias ósseas primárias por meio da istopatologia e da imuno-histoquímica associada à análise clínica e radiográfica, auxiliando na classificação dos tipos neoplásicos e determinação de subtipos. Foram coletadas amostras de em 22 cães da cidade do Rio de Janeiro e Niterói, sendo sete machos e 15 fêmeas. O diagnóstico histopatológico foi realizado a partir de amostras coletadas com agulha Jamshidi calibre 11 ou de fragmentos de peças de amputação ou cadáveres com até seis horas pós-óbito. As amostras coletadas foram fixadas em formol. Após descalcificação foram processadas, incluídas em parafina, coradas por HE e realizada a imuno-histoquímica com anticorpos anti-vimentina, anti-SPARC e anti-osteocalcina. Foi realizada análise estatística descritiva dos parâmetros clínicos e histopatológicos. Os cães pertenciam às raças Rottweiler, Dobermann Pinscher, Husky Siberiano, Bulldog Inglês, Pastor Alemão, Boxer, Akita, Golden Retriever além de cães sem raça definida (SRD); tinham peso variando de 15 a 58kg (média: 36,59kg) e idade de 3 a 18 anos (média: 8,59 anos). Os principais sinais clínicos apresentados foram claudicação, dor e aumento de volume local. Noventa e um por cento das lesões acometeram esqueleto apendicular. Os ossos úmero e rádio foram os mais acometidos. Todas as lesões foram monostóticas. Os membros torácicos foram mais afetados que os pélvicos e a metáfise foi a área mais atingida. O osteossarcoma foi o tumor mais frequente, com quase oitenta e dois por cento dos casos. Houve ainda dois casos de condrossarcoma, um hemangiossarcoma e um fibrossarcoma. Os percentuais de marcação nas amostras positivas dos anticorpos anti-vimentina, anti-SPARC e anti-osteocalcina foram: 87,9%, 98,0% e 99,9%. Um osteossarcoma não apresentou marcação positiva para vimentina e das amostras submetidas a marcação com osteocalcina, três casos de osteossarcoma e um de fibrossarcoma não marcaram positivamente. A avaliação imuno-histoquímica mostrou resultados relevantes no auxílio diagnóstico e prognóstico nas neoplasias ósseas em cães. Palavras-chave: neoplasias ósseas, cães, radiografia, histopatologia, imuno-histoquímica.

ABSTRACT

Primary bone tumors in dogs have remarkable radiographic and histopathological features. In some cases, diagnosis can be complicated by the absence of these features. The use of antibodies against proteins that characterize these neoplasms can help elucidating such cases. This experiment objective was to evaluate canine primary bone neoplasms histopathologically and with immunohistochemically to diagnose neoplasms types and to help determining their subtypes, associating its results with clinical and radiological findings. Samples from radiographically detected neoplastic bone lesions were collected from 23 dogs from Rio de Janeiro and Niteroi being eight males and fifteen females. Histopathological diagnosis were establish from Jamshidi needle collected samples, fragments of amputated pieces or six-hour post mortem corpses. Samples were collected and formalin-fixed. After descalcification, they were routinately processed, paraffin-embbebed, stained with HE and imunohistochemistry was performed using antibodies anti-vimetin, anti-SPARC and anti-osteocalcin. Descriptive statistic analyses of clinical and histopathological parameters were performed. Dogs belonged to Rottweiler, Dobermann Pinscher, Siberian Husky, English Bulldog, German Shepard, Boxer, Golden Retriever breeds and no-specific-breed dogs with weight average of 33,61 kg and age average of 8,35 years. The main symptoms were lameness, pain and local swelling. Ninety one percent of the lesions occurred in the apendicular skeleton. Umerus and femur were the most affected bones followed by the radium. Only one dog had two simultaneous lesions. Thoracic limbs were more affected than pelvic limbs and the metaphysis area the main location. Osteosarcoma was the most frequent primary bone tumor with almost eighty two percent of the cases. There were also two chondrosarcomas, one haemangiosarcoma and one fibrosarcoma. Antibodies used for immunohistochemistry evaluation were anti-vimentin, anti-SPARC and anti-osteocalcin. Respective percentuals for positive immunostaining were 87,9%, 98,0% and 99,9%. One osteosarcoma showned negative immunostain for vimentin and of samples submitted to anti-osteocalcin immunostaining, three osteosarcomas and one fibrosarcoma had negative staining. Immunohistochemistry evaluation showed relevant results concerning diagnosis and prognosis of bone neoplasms in dogs. Keywords: bone neoplasms, dogs, radiography, histopathology, immunohistochemistry.

1 INTRODUÇÃO

O sistema esquelético, seja dos cães ou dos seres humanos, é

frequentemente acometido por doenças metabólicas, infecciosas e neoplásicas. Em

muitos casos, há uma lesão radiográfica visível, mas não conclusiva. Nestes casos,

para se obter o diagnóstico, a biópsia é o único método (PRAMESH et al., 2001;

JELINEK et al., 2002; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).

Toda e qualquer lesão óssea que apresente uma imagem radiográfica

agressiva, supostamente maligna que gere margem para diversos diagnósticos

diferenciais ou que não se possa correlacionar com alguma doença frequentemente

conhecida deve ser submetida à confirmação histopatológica (PRAMESH et al.,

2001; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).

Apesar de o diagnóstico de tumor ósseo primário maligno em cães ser

frequentemente sugerido apenas radiograficamente, a biópsia é necessária para

confirmação diagnóstica, além de permitir uma classificação específica do tipo

tumoral. Com o desenvolvimento de técnicas de preservação do membro e a

utilização de drogas quimioterápicas, é crucial o conhecimento do tipo tumoral ósseo

para que seja adotado o protocolo terapêutico adequado. Com relação a outros tipos

de lesões ósseas, é necessário diferenciá-los entre tumores primários malignos,

tumores primários benignos, tumores originados da medula óssea, tumores

metastáticos, osteomielite, fraturas e lesões degenerativas (POWERS et al., 1988;

MEHL et al., 2001; CHUN, 2005; DONATO et al., 2005; AMARAL, 2008; BOSTON;

BARRY; O’SULLIVAN, 2011; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).

Os tumores ósseos primários em cães, na maioria das vezes, são

caracterizados histopatologicamente pelo tipo celular envolvido e tipo de matriz

18

extracelular produzida. Entretanto, nem sempre este material é facilmente

identificado nos subtipos tumorais e em diversas ocasiões uma única lesão

apresentará heterogeneicidade tanto celular como de matriz, devido às

diferenciações mesenquimais que podem ocorrer. Isto é particularmente verdadeiro

em casos de neoplasias atípicas tanto clínica quanto radiograficamente, tumores

anaplásicos ou em casos de análise de fragmentos pequenos, como os oriundos de

biópsia óssea (POWERS et al., 1988; SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI;

MERTENS, 2002; AMARAL, 2008).

Para elucidar tais casos, em Medicina Humana, tem-se utilizado marcadores

de linhagem celular com o objetivo de identificar a origem da célula neoplásica em

questão e ainda marcadores de matriz extracelular, que identificam componentes

presentes na matriz produzida pelas células, relacionando-as a determinado tipo

celular. Outra utilização destes marcadores está na identificação de produtos de

genes de proliferação celular e apoptose alterados. Muitos desses produtos já foram

identificados e relacionados ao prognóstico e sucesso do tratamento em diversos

tipos tumorais, ósseos ou não-ósseos em pacientes humanos (HAINES; WEST,

2005; WERNER et al., 2005; DE MATOS et al., 2010).

A utilização de marcadores para determinadas proteínas de matriz assim

como linhagens celulares não é utilizada com frequência na Medicina Veterinária, ao

contrário do que acontece na Medicina Humana. A literatura descreve apenas casos

isolados de neoplasias ósseas não-características em que estes marcadores foram

utilizados com a intenção de auxiliar no esclarecimento do diagnóstico

(HOENERHOFF et al., 2004, BARGER et al., 2005; AMORIM, 2009). É possível que

a identificação de determinados marcadores celulares permita não só a reavaliação

do tipo histopatológico mas principalmente das opções de tratamento e prognóstico

do paciente.

Assim sendo, este projeto visa realizar estudos imuno-histoquímicos de

potenciais marcadores das neoplasias ósseas em cães após sua caracterização

radiográfica e sua possível implicação no prognóstico dos pacientes desta área da

Oncologia Ortopédica Veterinária de Pequenos Animais.

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

As neoplasias ósseas malignas representam menos de 2% do total das

neoplasias em cães. Apesar disso, são sempre um dilema clínico. Muitas vezes, os

sinais clínicos não são específicos e, além de não serem reconhecidos pelo

proprietário no início da doença, na maioria dos casos, geram uma suspeita clínica

equivocada, sendo confundido com outras afecções ortopédicas (DONATO et al.,

2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008).

Em contraste com os tumores humanos, onde as metástases ósseas de

carcinomas, em particular, são comuns, os tumores ósseos caninos são primários

(LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003). O principal deles é o

osteosssarcoma, seguido do condrossarcoma, fibrossarcoma, hemangiossarcoma e

o tumor ósseo multilobular (LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;

CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; KEALY; MCALLISTER, 2012).

Outras neoplasias ósseas primárias incluem o tumor de células gigantes e os

tumores metastáticos como linfoma e mieloma múltiplo. No entanto, sua frequencia

em Medicina Veterinária é muito baixa, sendo as informações pertinentes a cada um

deles oriundas de relatos de casos (ERDEM; PEAD, 2000; DHALIWAL; REED;

KITCHELL, 2001; THOMAS; PRESSLER; ROBERTSON, 2001; CHUN, 2005;

HIDAKA et al., 2006; PAKHRIN et al., 2006).

20

2.1 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS E CLÍNICOS.

2.1.1. Osteossarcoma

Em Medicina Veterinária, o osteossarcoma é o tumor ósseo primário mais

frequente, representando 85% de todos os tumores ósseos (SLAYTER et al., 1994;

ERDEM; PEAD, 2000; THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al.,

2007; AMARAL, 2008; THRALL, 2010; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY;

MCALLISTER, 2012). É uma neoplasia progressiva e rápida com alta mortalidade. É

mais frequente em cães de meia idade a idosos com pico aos sete anos

(THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL;

BOSTON, 2011). As raças mais afetadas são o São Bernardo, Setter Irlandês,

Dobermann Pinscher, Pastor Alemão, Rottweiler, Golden Retriever e Dog Alemão

(DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY;

MCALLISTER, 2012). Os machos parecem ser pouco mais afetados que as fêmeas

com relação ao osteossarcoma apendicular, com exceção da raça Rottweiler, São

Bernardo e Dog Alemão (DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008). Segundo estudo

realizado, o aumento do peso e principalmente da altura predispõem o aparecimento

do tumor (RU; TERRACINI; GLICKMAN, 1998). De modo semelhante, cães de raças

gigantes tendem a apresentar a lesão mais cedo que cães de raças menores

(THOMPSON; POOL, 2002).

Os sinais clínicos demonstrados pelos cães não diferem muito dos pacientes

humanos. Considerando que 75% dos casos de osteossarcoma atingem

principalmente o esqueleto apendicular, não é surpreendente que a claudicação

associada a dor seja o sinal clínico principal e na maioria das vezes, o primeiro a ser

notado pelo proprietário (PHILLIPS et al., 1986; ERDEM; PEAD, 2000; LUCROY;

PECK; BERRY, 2001; MEHL et al., 2001; THOMPSON; POOL, 2002; HIDAKA et al.,

2006; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011). A

duração da claudicação pode variar de duas semanas até três meses para que o

proprietário encaminhe o animal ao veterinário e pode ainda ser complicado por uma

fratura patológica embora esta esteja presente em menos de 3% dos casos

(PHILLIPS et al., 1986; THOMPSON; POOL, 2002; BHANDAL; BOSTON, 2011). O

grau de dor pode variar de leve a torturante, dependendo do avanço e grau de

21

destruição óssea da lesão. Os membros torácicos costumam ser duas vezes mais

afetados que os pélvicos e o esqueleto apendicular é de três a quatro vezes mais

afetado que o axial (THOMPSON; POOL, 2002; DONATO et al., 2005; DERNELL et

al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011). Dernell et al. (2007),

Bhandal e Boston (2011) e Kealy e McAllister (2012) afirmam que é comum o relato

de um trauma prévio, o que pode levar a uma suspeita ortopédica equivocada,

entretanto, Phillips et al. (1986) não relataram este achado.

O desenvolvimento de osteossarcoma apendicular pode estar associado a

casos de osteomielite crônica, utilização de implantes metálicos, locais de fratura

prévia e possivelmente infartos ósseos (MARCELLIN-LITTLE et al., 1999;

THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al., 2007; THRALL, 2010). Outros sinais

associados a neoplasias ósseas são: aumento de volume local por edema,

proliferação de tecido ósseo ou por invasão de tecidos adjacentes pela massa

tumoral, relutância e dor à manipulação (ERDEM; PEAD, 2000; LUCROY; PECK;

BERRY, 2001; MEHL et al., 2001), atrofia muscular local e linfonodo satélite

aumentado de tamanho e firme (ERDEM; PEAD, 2000; THOMPSON; POOL, 2002).

Raramente há mais de um local acometido. O osteossarcoma multicêntrico

representa menos de 15% dos casos no diagnóstico inicial (LARUE; WITHROW;

WRIGLEY, 1986, DERNELL et al., 2007).

Sinais como retenção urinária e fecal, paraparesia e alterações neurológicas

tendem a estar relacionadas com casos de osteossarcoma e outras neoplasias em

esqueleto axial e são local-dependente já tendo sido descritos em mandíbula,

maxila, vértebras lombares e torácicas, crânio, costela, cavidade nasal e pelve

(THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; KEALY;

MCALLISTER, 2012). Cerca de 50% dos osteossarcomas axiais acometem os ossos

da cabeça e o Boxer é a raça mais afetada por ele. Pode-se observar disfagia,

exoftalmia, dor ao abrir a boca, deformidade facial e descarga nasal (THOMPSON;

POOL, 2002; DERNELL et al., 2007).

Sinais respiratórios são a primeira evidência clínica de metástase pulmonar

que pode se desenvolver rapidamente podendo estar associada a anorexia e

osteoartropatia hipertrófica pulmonar já descrita em alguns casos (DERNELL et al.,

2007). A maioria dos cães morre ou são eutanasiados, em média, seis meses após

o diagnóstico devido às lesões metastáticas principalmente para os pulmões, sendo

que a maioria deles não apresentam lesões radiograficamente visíveis no momento

22

do diagnóstico (THOMPSON; POOL, 2002, LOUKOPOULOS; THORNTON;

ROBINSON, 2003; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008;

KIRPENSTEIJN et al, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; EBERLE et al., 2011).

Metástases para outros ossos e linfonodo regional são descritas embora sejam

incomuns. O tempo de sobre-vida costuma ser maior nos animais com lesões axiais

que apendiculares devido a velocidade de metástase (THOMPSON; POOL, 2002).

2.1.2. Condrossarcoma

Além do osteossarcoma, outros tumores ósseos primários têm sido relatados

na literatura porém abrangem cerca de 5 a 12% do total dos tumores ósseos. O

condrossarcoma é o segundo tumor ósseo primário mais comum em cães com até

10% de prevalência e pode surgir a partir de lesões exostosas cartilaginosas ou

osteocondromas, mas não há relatos de seu surgimento a partir de osteomas. As

raças grandes como Golden Retriever, Boxer e Pastor Alemão são as mais afetadas,

sendo raro em raças gigantes e pequenas, com pico de idade por volta dos oito

anos. Não há predileção por sexo (HAMERSLAG; EVANS; DUBIELZIG, 1980;

SLAYTER et al., 1994; MADARAME et al., 1998; CHUN, 2005; DERNELL et al.,

2007; KIM et al., 2007; AMARAL, 2008; FARESE et al., 2009; AEFFNER et al., 2012;

KEALY; MCALLISTER, 2012).

A maioria dos tumores (61%) surge em ossos chatos como costela, escápula,

pelve, ossos do crânio e cavidade nasal (HAMERSLAG; EVANS; DUBIELZIG, 1980,

SLAYTER et al., 1994; MADARAME et al., 1998; CHUN, 2005; DERNELL et al.,

2007; KIM et al., 2007; AMARAL, 2008; FARESE et al., 2009; KEALY;

MCALLISTER, 2012). O condrossarcoma apendicular é frequentemente citado na

literatura sendo a tíbia o osso mais acometido, na metáfise proximal, seguida do

fêmur e úmero, diferentemente do que ocorre no osteossarcoma (CHUN, 2005; KIM

et al., 2007; FARESE et al., 2009). Há ainda relatos de ocorrência em locais menos

comuns como dígitos, osso peniano e sítios extra-esqueléticos como glândula

mamária. Os sinais clínicos serão derivados da sua localização (MADARAME et al.,

1998; THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; KIM et al.,

2007; AMARAL, 2008; FARESE et al., 2009; KEALY; MCALLISTER, 2012).

23

Os animais podem apresentar sobrevida de até dois anos e meio. As lesões

costumam apresentar crescimento mais lento que os osteossarcomas assim como

taxa de metástase menor, porém podem formar grandes massas. Normalmente uma

ressecção cirúrgica agressiva, como a amputação, resulta em controle satisfatório

por longo período ou mesmo cura. Caso isso não seja possível, como no caso dos

seios nasais, a recorrência é frequente. Há relatos de metástases porém em menor

número (variação entre 0% e 60%, com média em torno de 25%) e mais tardiamente

quando comparados aos osteossarcomas. Os órgãos mais comumente

comprometidos são: pulmões, rins, fígado, coração, linfonodos, pleura e outros

ossos, porém, na maioria das vezes as metástases localizam-se somente no pulmão

(HAMERSLAG; EVANS; DUBIELZIG, 1980; THOMPSON; POOL, 2002; CHUN,

2005; DERNELL et al., 2007; KIM et al., 2007; WALTMAN et al., 2007; AMARAL,

2008; FARESE et al., 2009; KEALY; MCALLISTER, 2012).

2.1.3. Fibrossarcoma

O fibrossarcoma é um tumor frequentemente relatado ocorrendo em tecidos

moles de cães e gatos, no entanto, como tumor ósseo primário é considerado

menos frequente. Nestes casos, produz uma matriz colagenosa e muitas vezes é

confundido com o osteossarcoma fibroblástico pouco produtivo em amostras

pequenas e exames citológicos (SLAYTER et al., 1994; THOMPSON; POOL, 2002;

CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007). Essa neoplasia é observada em cães adultos

machos de raças de médio e grande porte, embora haja relatos da ocorrência em

fêmeas, não sendo possível determinar a real predileção racial (CHAUVET et al.,

1999; SCHERRER et al., 2005). O principal sinal clínico é a claudicação

especialmente em casos de rápido desenvolvimento (CHUN, 2005).

Quando localizados em maxila apresentam distorção da face, perda de

dentes, erosão do osso maxilar e em casos mais avançados invasão da cavidade

nasal, palato duro e órbita, apesar de serem histologicamente considerados como de

baixo grau. Foi relatado por Chauvet et al. (1999) um fibrossarcoma vertebral de

grau intermediário. Muitos cães são eutanasiados devido a possibilidade de sarcoma

anaplásico porém, na necropsia nem sempre se observa metástases (CHAUVET et

al., 1999). Chauvet et al. (1999) não relataram recorrência local ou ocorrência de

24

metástase dois anos após realização de vertebrectomia e vacinação antitumoral em

uma cadela. Essa informação contrasta com o observado em fibrossarcomas de

tecidos moles, principalmente subcutâneo, relacionados a locais de injeção, em cães

e gatos (VASCELLARI et al., 2003; CHUN, 2005). Nesses, a exérese tumoral

completa é um desafio devido à característica infiltrativa do tumor e as recidivas são

frequentes (GOLDSCHMIDT; HENDRICK, 2002; VASCELLARI et al., 2003; CHUN,

2005; LIPTAK; FORREST, 2007). No caso do fibrossarcoma ósseo, a obtenção de

margem cirúrgica limpa é dada pela amputação alta e a exérese cirúrgica agressiva

deve ser considerada independente do caso já que não se tem dados estatísticos

suficientes a respeito da sobrevida após a cirurgia (THOMPSON; POOL, 2002;

CHUN, 2005; SCHERRER et al., 2005).

Em relação às metástases, Chauvet et al. (1999) não as relataram em seu

trabalho. Nos fibrossarcomas subcutâneos, o potencial metastático é baixo

inicialmente porém este aumenta de acordo com a sobrevida do paciente

(GOLDSCHMIDT; HENDRICK, 2002), com taxa em torno de 20% no momento do

diagnóstico (CHUN, 2005; LIPTAK; FORREST, 2007). Ainda, é relatada por Speltz

et al. (2007) a presença de metástase pulmonar derivada de um fibrossarcoma

primário cardíaco em um Retriever de Labrador.

2.1.4. Hemangiossarcoma

O hemangiossarcoma ósseo primário é raro e surge a partir do endotélio

vascular do osso. Pode ocorrer em cães de qualquer tamanho porém alguns estudos

ressaltam cães de médio e grande porte como Boxer, Dog Alemão e Pastor Alemão.

Não parece haver predileção sexual. É um tumor bastante agressivo causando dor,

claudicação, aumento de volume de tecidos moles e destruição óssea. Entretanto,

tende a ficar confinado na cavidade medular e pode abranger uma grande área do

osso antes mesmo dos sinais clínicos surgirem, normalmente após uma fratura

patológica (THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; NORTON; DRENEN; EMMS,

2006). Erdem e Pead (2000), Hidaka et al. (2006) e Norton, Drenen e Emms (2006)

relataram casos de cães que apresentaram claudicação e dor decorrentes de lesões

em escápula e úmero devido ao hemangiossarcoma ósseo primário, entre outros

tumores. Já Reed, Payne e Aronson (1994) e Mackenzie, Bellah e Threatte (2003)

relataram casos de hemangiossarcoma vertebral. Este tipo de neoplasia é altamente

25

metastática podendo atingir diversos órgãos como pulmão, fígado, baço, coração,

cérebro e outros ossos (CHUN, 2005; NORTON; DRENEN; EMMS, 2006; DERNELL

et al., 2007). Alterações não específicas podem ocorrer e até mesmo morte súbita

por hemorragia devido a ruptura do tumor (ERDEM; PEAD, 2000). O tempo de

sobrevida varia de 2 a 3 e de 7 a 8 meses nos casos de micro e macrometástases

respectivamente (CHUN, 2005).

2.1.5. Tumor ósseo multilobular

O tumor ósseo multilobular é um tumor de crescimento lento, progressivo e

invasivo localmente porém potencialmente maligno. Outras denominações como

osteocondrossarcoma multilobular, condroma rodens ou osteoma não se aplicam

mais. Atinge ossos chatos, principalmente no crânio, mandíbula e maxila, a área

temporo-ocipital podendo envolver órbita, bulha timpânica e arco zigomático

(FORREST, 2010; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; PSYCHAS et al., 2009).

Acomete cães de meia idade a idosos e raças médias e grandes sendo raras em

raças gigantes (THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007;

PSYCHAS et al., 2009). Há relatos em caninos da raça Husky Siberiano, Rodhesian

Ridgeback, Golden Retriever e cães sem raça definida (STOLL; ROUSH; MOISAN,

2001; BANKS; STRAW, 2004; PSYCHAS et al., 2009; EUBANKS et al., 2010).

Os cães apresentam massas palpáveis, sésseis e firmes surgindo a partir de

ossos da cabeça. O crescimento é simétrico e excêntrico, exceto no caso relatado

por Psychas et al. (2009) onde o crescimento foi internalizado e levou a compressão

cerebral e cerebelar acompanhada de sinais clínicos graves. Alterações de

comportamento podem estar incluídas devido a compressão de estruturas

adjacentes. Outros sinais incluem: exoftalmia, obstrução nasal, perda de dente ou

dificuldade de mastigação. A recorrência pós-cirúrgica pode chegar a 50% se a

ressecção cirúrgica não for agressiva (FORREST, 2010; CHUN, 2005), no entanto

demora até dois anos devido a baixa taxa de crescimento. Metástases pulmonares

ocorrem em menos de 60% dos casos e o animal pode permanecer bem

clinicamente por vários meses (THOMPSON; POOL, 2002; CHUN, 2005). Banks e

Straw (2004) e Eubanks et al. (2010) relatam sobrevida de 14 meses em casos onde

houve ressecção cirúrgica da lesão em palato duro e mandíbula. Já em casos de

26

remoção mais complexa com localização vertebral ou cranial a eutanásia é

considerada (STOLL; ROUSH; MOISAN, 2001; PSYCHAS et al., 2009).

2.1.6. Outras considerações

Sinais menos específicos relacionados às neoplasias ósseas incluem apatia,

anorexia, perda de peso e caquexia podendo esta ser devido a síndrome

paraneoplásica. As síndromes paraneoplásicas são alterações associadas a

neoplasia mas que ocorrem em estruturas do corpo distantes ao tumor e muitas

vezes podem ser o primeiro sinal da malignidade ou até característica de um

determinado tumor (DERNELL et al., 2007). A caquexia paraneoplásica é fator

prognóstico negativo para muitas neoplasias, principalmente o linfoma e pode

ocorrer mesmo nos casos onde há envolvimento ósseo. A febre não está presente

na maioria dos casos. As alterações laboratoriais são mínimas e na maioria das

vezes inespecíficas, podendo-se ressaltar em alguns casos o aumento sérico dos

valores de fosfatase alcalina (THOMPSON; POOL, 2002, HIDAKA et al., 2006;

DERNELL et al., 2007) e do cálcio sérico em cães com neoplasias ósseas. Os sinais

de hipercalcemia são: constipação, uremia, hipertensão, fraqueza, depressão,

bradicardia, estupor, coma e morte (DERNELL et al., 2007).

2.2 NEOPLASIAS ÓSSEAS PRIMÁRIAS MALIGNAS EM CÃES: ASPECTOS RADIOGRÁFICOS, MACROSCÓPICOS E MICROSCÓPICOS

2.2.1. Osteossarcoma

As três principais neoplasias ósseas raramente são passíveis de serem

diferenciadas entre si somente através da imagem radiográfica tanto em humanos

(JELINEK et al., 2002; ROZEMAN; CLETON-JANSEN; HOGENDOORN, 2006) como

em animais (CHUN, 2005; AMARAL, 2008; KEALY; MCALLISTER, 2012).

A avaliação inicial deve ser feita sempre em duas projeções ortogonais

(DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; THRALL, 2010; KEALY; MCALLISTER,

2012). Os locais mais frequentemente acometidos pela forma medular ou central do

osteossarcoma são a região metafisária de ossos longos principalmente a região

distal de rádio e proximal de úmero em membros torácicos e distal de fêmur e tíbia e

proximal de tíbia em membros pélvicos (THOMPSON; POOL, 2002; HOENERHOFF

27

et al., 2004; BARGER et al., 2005; CHUN, 2005; DERNELL et al., 2007; THRALL,

2010; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY; MCALLISTER, 2012). Observa-se

inicialmente perda do padrão trabecular metafisário, alteração de radiopacidade da

cavidade medular e pequenas áreas pontuais de lise óssea que progridem para

destruição da cortical óssea, neoformação periosteal irregular e que quando se

desenvolve sob o periósteo elevado forma uma massa óssea triangular

característica denominada triângulo de Codman na periferia do tumor (PHILLIPS et

al., 1986; LUCROY; PECK; BERRY, 2001; MEHL et al., 2001 THOMPSON; POOL,

2002; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; BHANDAL;

BOSTON, 2011; KEALY; MCALLISTER, 2012). Pode haver fratura patológica

associada (PHILLIPS et al., 1986; THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al.,

2007; AMARAL, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; KEALY; MCALLISTER, 2012).

Nota-se aumento de volume de tecidos moles periféricos (DERNELL et al., 2007;

KEALY; MCALLISTER, 2012) e não há indícios de invasão do osso subcondral

adjacente ou da cartilagem articular (LUCROY; PECK; BERRY, 2001; THOMPSON;

POOL, 2002; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008). Na

maioria das vezes a lesão é monostótica (THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et

al., 2007; AMARAL, 2008). Os osteossarcomas do esqueleto axial apresentam

alterações radiográficas semelhantes ao apendicular.

Os osteossarcomas são lesões dinâmicas e pode-se observar alterações

significativas na imagem em sete a 10 dias que servirão de base para o radiologista

durante uma avaliação seriada do paciente. O diagnóstico final é dado através da

histopatologia já que que não há padrões radiográficos patognomônicos

(THOMPSON; POOL, 2002, CHUN, 2005; AMARAL, 2008). Alguns autores relatam

que a alteração da arquitetura trabecular pode ser uma das primeiras alterações que

indiquem o surgimento de uma lesão óssea (KEALY; MCALLISTER, 2012).

Em cães, a imagem radiográfica pode apresentar certo grau de

heterogeneicidade, podendo variar desde predominantemente lítica passando por

mista até predominantemente esclerótica (AMARAL, 2008; THRALL, 2010; KEALY;

MCALLISTER, 2012) sendo o padrão misto mais freqüente nos casos de

osteossarcoma (AMARAL, 2008). Tal fato pode estar relacionado ao percentual de

material osteóide produzido ou do grau de mineralização deste. Isto tem relação

direta com os subtipos que o osteossarcoma apresenta ou ainda a

28

heterogeneicidade das lesões já que o osteossarcoma não é um tipo de tumor

considerado homogêneo.

O osteossarcoma pode ser classificado nos seus subtipos histológicos, com

base na quantidade e qualidade da matriz extracelular produzida e predominante

nas seções observadas segundo a Classificação Histológica dos Tumores Ósseos e

Articulares dos Animais Domésticos, da Organização Mundial de Saúde (SCHULZ et

al., 1988; SLAYTER et al., 1994; LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;

HOENERHOFF et al., 2004), tendo-se:

Osteossarcoma pouco diferenciado ou anaplásico: com células malignas

que podem apresentar variado pleomorfismo, se assemelhando a células

mesenquimais primitivas e que produzem pequenas quantidades de

matriz osteóide.

Osteossarcoma osteoblástico: apresenta osteoblastos anaplásicos e pode

ainda, de acordo com a quantidade de material osteóide produzido, ser

subclassificado em osteossarcoma osteoblástico produtivo e minimamente

produtivo. Em humanos este subtipo representa 50% dos casos

(HOENERHOFF et al., 2004) e em cães pode chegar a quase 90%

(BARGER et al., 2005; AMARAL, 2008).

Osteossarcoma condroblástico: produz matriz osteóide e condróide que

na maioria das vezes encontram-se entremeadas. Quando separadas, a

coleta de uma amostra da área condróide pode levar ao falso diagnóstico

de condrossarcoma.

Osteossarcoma fibroblástico: a formação de material osteóide acontece

conforme as células aumentam a sua capacidade de formar a matriz

mineral. Inicialmente uma população de células alongadas irá predominar.

Apresenta melhor prognóstico que os demais.

Osteossarcoma telangectásico: apresenta lesões císticas dominantes

contendo sangue circundadas por células neoplásicas podendo ser difícil

a visualização do material osteóide. Apresenta pior prognóstico que os

demais com taxa metastática de 100%.

Osteossarcoma de células gigantes: apresenta áreas onde células

gigantes predominam em meio ao material osteóide. Deve ser

diferenciado do tumor ósseo de células gigantes.

29

Podem ainda ser classificados como simples, quando o material osteóide é o

único encontrado, ou composto se há mais de um tipo de material de matriz

extracelular produzidas pelas células cancerígenas (SCHULZ et al., 1988;

LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003; HOENERHOFF et al., 2004).

Essa característica multipotencial do ostessarcoma pode ser explicada pelo fato de o

tecido mesenquimal possuir alto potencial de diferenciação (HOENERHOFF et al.,

2004). O critério decisivo para seu diagnóstico é a observação do material osteóide

tumoral mesmo que em um pequeno foco (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN et

al. 1995; FANBURG et al., 1997; BARGER et al., 2005).

Hoje sabe-se que os subtipos histológicos do osteossarcoma representam

entidades clínico-patológicas diferentes tanto para cães quanto para humanos

(GRUNDMANN et al, 1995; LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;

HOENERHOFF et al., 2004). Se determinados subtipos estão associados a maior ou

menor tempo de sobrevida ainda não está claro. No entanto, a familiaridade com

estes subtipos auxilia no diagnóstico acurado e consequentemente uma melhor

abordagem terapêutica o que se reflete indiretamente no tempo de sobrevida

(HAUBEN et al., 2002; LOUKOPOULOS; THORNTON; ROBINSON, 2003;

HOENERHOFF et al., 2004).

2.2.2. Condrossarcoma

Radiograficamente é impossível a distinção entre osteossarcoma e

condrossarcoma. Os condrossarcomas podem ser radiopacos com áreas mais

intensas correspondendo aos locais de ossificação. Nas costelas tendem a se

localizar próximo a junção costo-condral e formar massas grandes. Na cavidade

nasal deslocam o septo nasal e substituem o padrão turbinado normal por padrão

radiográfico amorfo com densidade de tecidos moles. Tumores vertebrais tendem a

ser menores e osteolíticos. Os condrossarcomas escapulares tendem a ser

volumosos e pouco mais radiodensos que os tecidos moles periféricos.

Condrossarcomas de ossos longos são menores e menos produtivos que os

osteossarcomas e podem ser muito osteolíticos destruindo a arquitetura óssea

esponjosa e cortical sem produzir uma matriz radiodensa ou resposta periosteal

marcante. Apresentam crescimento consideravelmente lento a partir da superfície de

30

ossos chatos preferencialmente com mínimo poder de invasão (THOMPSON; POOL,

2002).

Os condrossarcomas produzem abundante matriz condróide e nunca

osteóide, o que lhe dá um aspecto cinza-azulado à macroscopia. A cartilagem

neoplásica forma lobulos irregulares entremeados por tecido fibroso ou ainda

invadindo a trabécula óssea. Ossificações centrais às ilhas de cartilagem neoplásica

podem ser observadas. Tal achado pode ser derivado de processos metaplásicos

(SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002, AMARAL, 2008).

Os condrossarcomas são hipercelulares. Os condrócitos atípicos variam em

tamanho e formato e possuem núcleo grande e hipercromático. A binucleação é

frequentemente observada assim como necrose e mitose em lesões de alto grau. A

classificação pelo grau é importante no prognóstico do condrossarcoma. A escala

varia de 1 a 3 e abrange fatores como: índice de mitose, índice de celularidade, grau

de pleomorfismo e hipercromasia nuclear e grau de necrose tumoral (SLAYTER et

al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002; LOUKOPOULOS; THORNTON;

ROBINSON, 2003).

2.2.3. Fibrossarcoma

O fibrossarcoma pode apresentar basicamente dois tipos de comportamento:

comumente provoca destruição óssea por um período de meses até um ano e é

mais lento em gerar metástase que o osteossarcoma ou tem comportamento

agressivo, anaplásico, mais lítico (KEALY; MCALLISTER, 2012) causando rápida e

maciça destruição do osso, podendo causar metástases.

Os casos em Medicina Veterinária de fibrossarcoma ósseo de origem medular

sugerem uma predileção pelas metáfises dos ossos longos, mas pode acontecer em

mandíbula e vértebra. Quando originado a partir do periósteo, tende a ocorrer nos

ossos da cabeça. Dependendo do tempo de curso da lesão, muitas vezes não é

possível distinguir o fibrossarcoma ósseo periosteal das formas gengival, labial ou

da mucosa oral. O material fibroso pode se infiltrar nos espaços trabeculares da

metáfise mantendo as trabéculas intactas. Em lesões mais agressivas, o osso é

destruído e substituído por tecido neoplásico. A destruição do osso subcondral

permite a extensão para a cavidade articular através das fraturas na cartilagem. O

31

tecido tumoral pode invadir a camada fibrosa da cápsula articular e atingir o próximo

osso. A invasão dos tecidos periféricos é parcialmente contida pelo periósteo.

Quando há resposta perióstica, esta tende a ser moderada embora o aumento de

volume seja notável (THOMPSON; POOL, 2002).

O fibrossarcoma tende a formar uma lesão radiográfica lítica, sendo difícil de

diferenciá-lo de outros tumores ósseos que também assumem este padrão.

Radiografias seqüenciais podem ter valor diagnóstico uma vez que a progressão é

mais lenta que nos osteossarcomas e outros tumores ósseos altamente malignos

(SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002; THOMPSON; POOL,

2002).

O tumor surge a partir de elementos do estroma da cavidade medular e

produz células fusiformes típicas dos fibrossarcomas de tecidos moles com variável

quantidade de matriz colágena. Não há produção de cartilagem ou osso. Áreas de

necrose e mitoses atípicas podem estar presentes (SLAYTER et al., 1994;

FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002).

2.2.4. Hemangiossarcoma

O hemangiossarcoma tem predileção pelo terço distal e proximal dos ossos

longos podendo acometer pelve, esterno, costela, maxila e coluna vertebral. O

hemangiossarcoma de tecidos moles pode metastatizar para os ossos produzindo

lesões semelhantes. O hemangiossarcoma ósseo primário destrói grande área de

osso normal incluindo a esponjosa e a cortical sendo comum fratura patológica

porém, normalmente a reação periosteal não acontece ou é mínima. Tal observação

pode ser decorrente da isquemia local provocada pela hemorragia do tumor que

evita a osteogênese. Não costumam invadir os tecidos periféricos como outros

sarcomas (SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002;

THOMPSON; POOL, 2002).

Pode-se observar lesões múltiplas, o que torna impossível distingui-las como

primária ou secundária (THOMPSON; POOL, 2002; DERNELL et al., 2007). Hidaka

et al. (2006) relatam que no hemangiossarcoma ósseo primário descrito por eles, a

lesão radiográfica em úmero se caracterizava por áreas semelhantes a “roído de

traça” havendo crescimento expansivo em forma de bolhas associado a destruição

32

óssea maciça (ERDEM; PEAD, 2000; DERNELL et al., 2007) e fratura patológica.

Nos casos de hemangiossarcoma ósseo primário em escápula, o posicionamento

crânio-caudal da escápula permite melhor investigação diagnóstica deste tipo de

tumor (ERDEM; PEAD, 2000). Independente disso, os autores relatam ser difícil a

diferenciação radiográfica entre este tumor e o osteossarcoma sendo o diagnóstico

definitivo dado pela histopatologia.

O estroma do hemangiossarcoma não forma matriz calcificada o que torna a

diferenciação entre ele e um osteossarcoma telangectásico com baixo potencial

osteoblástico difícil em alguns casos mesmo para a histopatologia (DERNELL et al.,

2007).

O hemangiossarcoma se assemelha ao seu equivalente de tecidos moles.

Apresenta canais vasculares sustentados por um estroma variável de colágeno.

Pode ser consideravelmente anaplásico com atipia nuclear proeminente e alto

número de figuras de mitose atípicas (SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI;

MERTENS, 2002; THOMPSON; POOL, 2002).

2.2.5. Tumor Ósseo Multilobular

O tumor ósseo multilobular é comumente uma lesão solitária, apresenta como

característica bordas bem demarcadas com lise limitada do osso adjacente e

observa-se uma densidade mineral granular grosseira. Sinais como reação óssea

marcante nas bordas tumorais e grandes áreas de lise podem sugerir alteração

maligna (THOMPSON; POOL, 2002).

É caracterizado por ilhas de diferenciação variável, podendo ser cartilagem

e/ou osso separadas por septos de células fusiformes. A malignidade é dada pela

superexpressão de um dos elementos, atividade mitótica aumentada, perda da

arquitetura e diferenciação e invasão de tecidos adjacentes (SLAYTER et al., 1994;

FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002; THOMPSON; POOL, 2002).

2.3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

A confirmação por outros meios que não apenas a imagem, seja ela

radiográfica ou tomográfica, é mandatória para o estabelecimento do diagnóstico

das neoplasias ósseas primárias já que informações específicas são necessárias

33

antes da instituição da terapia mais adequada. Além disso, o diagnóstico final é dado

pela histopatologia já que o osteossarcoma e outros tumores ósseos como

condrossarcoma e fibrossarcoma não produzem padrões radiográficos

patognomônicos. Não necessariamente os tumores ósseos serão a suspeita

principal, sendo igualmente importante identificar histologicamente lesões benignas,

inflamatórias e infecciosas, até mesmo para se fazer o diagnóstico diferencial

(HAUBEN et al., 2002; JELINEK et al., 2002; AMARAL et al., 2006; AMARAL, 2008;

AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013).

A determinação histopatológica pode ser obtida através de biópsia incisional,

obtida por agulhas específicas, ou excisional, realizada após a exérese da lesão

como nos casos de amputação de membro. Neste último caso, a quantidade de

material obtida é comumente maior mas nem sempre implica em maior pencentual

de acerto (AMARAL et al., 2006; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA,

2013).

Em todos os casos de obtenção de material, o patologista deve estar

familiarizado com os tipos de lesões observadas em sistema locomotor e a

integração entre as áreas envolvidas aumenta as chances de se obter um

diagnóstico final acurado (PRAMESH et al., 2001; AMARAL et al., 2006; AMARAL,

2008; AMARAL; ROMÃO; FERREIRA, 2013). A biópsia incisional permite a

obtenção de quantidade ideal de tecido e maior precisão do resultado quando

comparado com as técnicas citológicas, porém essa técnica apresenta como

desvantagens o envolvimento de procedimento cirúrgico, risco de complicações pós-

cirúrgicas como formação de hematoma, infecção, disseminação do tumor e fratura

patológica (BARGER et al., 2005; DALECK et al., 2006) principalmente quando a

técnica é realizada com o bisturi, sendo mais invasiva. A incidência dessas

complicações são consideravelmente reduzidas quando se realiza a biópsia óssea

percutânea por agulha (AMARAL et al., 2006; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO;

FERREIRA, 2013).

Em Medicina Veterinária as principais indicações para a realização da biópsia

óssea por agulha atualmente são a confirmação do tipo de neoplasia em questão, as

lesões suspeitas de serem infecciosas, mas apresentando características agressivas

de malignidade e lesões primárias radiograficamente típicas, no entanto

apresentando-se em faixas etárias e locais pouco comuns (POWERS et al., 1988;

34

BREUR; SLOCOMBE; BRADEN, 1988; AMARAL, 2008; AMARAL; ROMÃO;

FERREIRA, 2013).

Mehl et al. (2001), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) enfatizam que o

diagnóstico de tumores ósseos, principalmente o osteossarcoma devido a sua

heterogeneicidade, tem seu percentual de acerto aumentado com biópsias

adicionais, ou seja, a coleta de múltiplas amostras aumenta a chance de fechar o

diagnóstico corretamente.

O diagnóstico histopatológico das lesões ósseas em cães não apresenta a

mesma diversidade dos casos humanos, sendo o osteossarcoma e suas

subclassificações a principal neoplasia causadora de lesões ósseas primárias,

seguido do condrossarcoma (ERDEM; PEAD, 2000; DERNELL et al., 2007;

AMARAL, 2008).

Em alguns casos, a identificação do osteossarcoma pode ser dificultada pelo

fato de suas variantes histológicas mimetizarem outros tumores ósseos primários ou

metastáticos, o osso neoplásico pode não estar presente em espécimes de biópsia e

que o tecido conjuntivo denso hialino pode parecer com o osso neoplásico quando

examinado na microscopia ótica (FANBURG et al., 1997; AMARAL; ROMÃO;

FERREIRA, 2013).

2.4 IMUNO-HISTOQUÍMICA

2.4.1. Introdução

Imuno-histoquímica é uma técnica que permite a observação da quantidade,

distribuição tecidual e localização celular de antígenos in situ, isto é, em cortes

histológicos. Baseia-se no uso de anticorpos primários direcionados contra o

antígeno a ser pesquisado e, posteriomente, a aplicação de um anticorpo secundário

acoplado a um sistema de revelação (HAINES; WEST, 2005; AMORIM, 2009; DE

MATOS et al., 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

2.4.2. Histórico e Aplicações Gerais

A técnica surgiu na década de 40, quando o médico Albert Coons demonstrou

ser possível localizar microrganismos em cortes histológicos de tecidos usando

35

anticorpos específicos contra Streptococcus pneumoniae corado com fluoresceína e

visualizado sob luz ultra-violeta (HAINES; WEST, 2005; DE MATOS et al., 2010;

LEONG; COOPER; LEONG, 2010). Na década de 60, Nakane desenvolveu

anticorpos marcados com enzimas, tornando possível a visualização da reação sob

microscopia ótica. Isso aumentou o número de laboratórios capazes de realizar a

técnica (HAINES; WEST, 2005; DE MATOS et al., 2010). As descobertas seguintes

dos sistemas da peroxidase e da fosfatase alcalina expandiram a aplicação da

técnica. No mesmo período, passou-se a utilizar a molécula de diaminobenzidina

(DAB) como agente cromógeno para a peroxidase que produz um precipitado

eletrodenso passível de ser utilizado na microscopia eletrônica (DE MATOS et al.,

2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

No entanto, a técnica só foi aceita como método diagnóstico de rotina na

anatomia patológica a partir de 1974. Isso só ocorreu após a descoberta dos

métodos de recuperação antigênica e da aplicação dos sistemas de anticorpos

secundários que permitiu a utilização da imuno-histoquímica não só em espécimes

frescas mas também em formolizadas (HAINES; WEST, 2005; WERNER et al.,

2005; DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010; CATALDO;

FICARRA; MACII, 2012).

Os primeiros tecidos-alvo foram as lesões auto-imunes que, a partir de uma

mesma peça, tiveram sua aparência histológica determinada e a demonstração da

presença e do padrão da deposição das imunoglobulinas usadas. Em muitos casos,

dependendo da molécula em questão, tornou-se possível inferir considerações a

respeito da patogênese dessas além da confirmação diagnóstica. Outra aplicação

está nos casos onde a lesão histológica gerada pelo patógeno não é patognomônica

e na ligação de agentes já conhecidos a novas manifestações da doença em

hospedeiros já conhecidos ou não (HAINES; WEST, 2005).

Atualmente, em medicina, a aplicação primária da técnica de imuno-

histoquímica, além das doenças auto-imunes, é a demonstração de antígenos

associados a neoplasias para melhor diagnosticar e determinar o prognóstico de

pacientes com câncer. O objetivo é determinar a origem celular da população

tumoral (HAINES; WEST, 2005; WERNER et al., 2005). Os principais alvos são

proteínas filamentares intermediárias especialmente em casos de tumores

anaplásicos onde não se pode determinar a origem mesenquimal ou epitelial das

células. Os anticorpos utilizados contra essas proteínas podem ser utilizados em

36

medicina veterinária pois as mesmas são altamente conservadas entre as espécies.

(HAINES; WEST, 2005).

Nos últimos dez anos, observou-se um crescimento logarítmo do número de

publicações envolvendo técnicas imuno-histoquímicas tanto na medicina quanto na

veterinária, o que reflete a posição ocupada pela técnica nos laboratórios de

patologia como complementar na elucidação de diagnóstico diferencial que não é

obtido por análises convencionais coradas com hematoxilina-eosina (HE) (WERNER

et al., 2005; DE MATOS et al., 2010).

2.4.3. Anticorpos Utilizados

Os anticorpos primários podem ser monoclonais ou policlonais. Os anticorpos

monoclonais são aqueles capazes de identificar um único epítopo antigênico e são

produzidos normalmente em camundongos pela técnica do hibridoma. Os anticorpos

policlonais reagem contra diferentes epítopos antigênicos num mesmo antígeno e

são produzidos em imunizações em coelhos ou outro animal. Os anticorpos

policlonais possuem maior sensibilidade. Os anticorpos monoclonais são mais

específicos que os policlonais e a chance de reação cruzada entre as espécies é

bem menor. Isso pode prejudicar a utilização de anticorpos monoclonais,

comumente humanos, em medicina veterinária, salvo casos onde há homologia

entre os epítopos humano e da espécie estudada (regiões conservadas) (AMORIM,

2009; DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

Os anticorpos secundários devem se direcionados contra a espécie para qual

foi feito o anticorpo primário e deve ser produzido em outra espécie animal. Esses

anticorpos costumam apresentar moléculas acopladas a eles que servem de

substrato para uma enzima e o produto gerado apresenta coloração específica,

sendo então observado nos tecidos. Exemplos destas moléculas são o complexo

estreptavidina-biotina e substratos da peroxidase (AMORIM, 2009).

Atualmente, devido ao processo de recuperação antigênica, um grande

número de anticorpos passou a ser utilizado em tecidos processados rotineiramente.

Isto só foi possível pois a recuperação antigênica libera os antígenos ligados às

moléculas de formol, permitindo a sua identificação pelo anticorpo. Anteriormente a

isso, somente eram utilizados cortes de tecidos congelados, o que na maioria das

vezes tinha seu uso limitado (AMORIM, 2009; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

37

2.4.4. Alvos antigênicos em Oncologia

Nos casos de neoplasias indiferenciadas, utiliza-se um painel de anticorpos

primários que tem por função identificar antígenos característicos de determinado

tipo celular (AMORIM, 2009; LEONG; COOPER; LEONG, 2010). Neste caso, a

experiência do patologista é fundamental para que o número de anticorpos usados

seja o menor possível devido ao custo (AMORIM, 2009).

Muitas neoplasias e suas metástases preservam a expressão de filamentos

intermediários, as proteínas da rede de sustentação celular. Existem quatro tipos: a

vimentina, presente na maioria das células mesenquimais; a desmina, presente nas

células musculares; a proteína ácida fibrilar glial (GFAP – glial fibrillary acidic protein)

dos astrócitos e as citoqueratinas das células epiteliais. Elas auxiliam na

identificação da origem das células avaliadas (AMORIM, 2009).

Marcadores de proteínas envolvidas na gênese tumoral, como marcadores do

ciclo celular, da apoptose, da adesão celular, da angiogênese, da expressão de

proto-oncogenes e genes supressores de tumor podem ser identificados no tecido

neoplásico para avaliação de prognóstico e resposta a terapia. São exemplos, a p53,

o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e Ki-67 (MIB-1) (AMORIM, 2009;

LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

A cinética do crescimento tumoral envolve a taxa de proliferação celular e a

proporção de células que sofrerão morte celular. A apoptose é importante no

controle populacional celular e a perda desse mecanismo confere pior prognóstico

às neoplasias, que se tornam resistentes à morte celular programada. Pela imuno-

histoquímica, pode-se avaliar o percentual de células em apoptose com o uso de

marcadores específicos com a caspase-3 e o bcl-2 (WERNER et al., 2005; LEONG;

COOPER; LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

São alvos ainda da imunistoquímica moléculas envolvidas na formação de

vasos como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF – vascular endothelial

growth factor) e enzimas de importantes rotas metabólicas celulares como a tirosina

quinase e a cicloxigenase-2 (WERNER et al., 2005; LEONG; COOPER; LEONG,

2010).

O número de marcadores utilizados varia de acordo com o estudo em

questão. Casos mais simples requerem menor número de anticorpos enquanto que

diagnósticos diferenciais mais complexos como no caso de neoplasias malignas

38

indiferenciadas solicitam um maior número de anticorpos. Este número pode variar

de um a 15, sendo a média de anticorpos utilizados em torno de 4-5 tipos (WERNER

et al., 2005). O uso de um único anticorpo para a prática diagnóstica deve ser

desencorajado (LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

É importante ressaltar que, apesar de o número de casos avaliados

rotineiramente ser pequeno, a imuno-histoquímica contribui positivamente na

balança custo/benefício nesta pequena parcela de casos, e consolida a sua posição

de ferramenta complementar e não essencial para o exercício da patologia cirúrgica

de um modo geral (WERNER et al., 2005; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

2.4.5. Limitações

A imuno-histoquímica pode não contribuir para o diagnóstico das neoplasias

principalmente em casos de exiguidade de amostras onde o tecido obtido não é

quantitativamente suficente para a realização das reações necessárias, presença de

necrose extensa provocando coloração inespecífica além de o pouco tecido viável

ser insuficiente para a interpretação das reações e indiferenciação extrema de

algumas neoplasias quando todos os marcadores são negativos. Além disso, a

fixação inadequada, utilizando formol é um fator complicador (WERNER et al., 2005;

LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

Apesar destas considerações, a quantidade de material utilizado tem sido

questionada pois cada vez mais os patologistas são impelidos a realizar um

diagnóstico preciso em pequenas amostras. Na maioria das vezes um bloco é

suficiente mas este deve conter um fragmento representativo da lesão e com parte

do parênquima da interface da lesão, devendo-se excluir áreas de necrose e

hemorragia já na análise macroscópica (DE MATOS et al., 2010, LEONG; COOPER;

LEONG, 2010).

A aquisição, manuseio, fixação e chegada do material no laboratório e a

recuperação antigênica são fatores críticos. Espécimes frescas fixadas

inadvertidamente por períodos longos podem levar a perda de antigenicidade. A

fixação em formaldeído e a consequente inclusão em parafina são os procedimentos

de processamento histológico mais usados internacionalmente. Alguns especialistas

propõem que este método deve ser padrão para comparação diagnóstica frente a

39

imuno-histoquímica. No entanto, a fixação em formol resulta em perda variavelmente

reversível de imunorreatividade seja mascarando ou danificando locais de ligação do

anticorpo (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

Apesar de muitos epítopos serem desmascarados através de métodos de

recuperação antigênica, o sistema de detecção imuno-histoquímico ainda deve ser

sensível o suficiente para produzir um sinal forte. Para alguns epítopos, o tempo de

duração da fixação em formol pode ser crucial. Já em outros casos, dependendo da

resistência do epítopo-alvo às alterações autolíticas, a demora na fixação pode levar

a perda da imunorreatividade (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG,

2010).

É importante enfatizar que a utilização de temperaturas altas (acima de 60° C)

durante o processo de inclusão em parafina pode comprometer a antigenicidade

através da desnaturação dos epítopos. A preparação dos cortes deve ser realizada

entre 3 e 7 µm e estes devem ser depositados em lâminas previamente preparadas

com algum sistema adesivo. Entre eles pode-se citar o silane e a polilisina. Cortes

abaixo de 3 µm resultam em fraca coloração enquanto que acima de 7 µm pode

levar a perda de tecido na lâmina (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER;

LEONG, 2010).

2.4.6. Vantagens

A vantagem da imuno-histoquímica está não só na identificação do antígeno

mas também na associação com a sua localização no tecido, permitindo relacionar

sua expressão com determinado tipo celular (AMORIM, 2009; LEONG; COOPER;

LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

Apresenta ampla viabilidade, facilidade de execução e manutenção das

lâminas coradas por longos períodos (CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

Em 95% dos casos nos quais o patologista humano está diante de um caso

de diagnóstico difícil nas lâminas coradas com HE, a imuno-histoquímica pode

ajudá-lo a firmar se não o diagnóstico correto pelo menos um diagnóstico apropriado

(WERNER et al., 2005).

Diversos relatos de neoplasias são encontrados na literatura onde o

diagnóstico e determinação da origem do tumor se deu graças a utilização da imuno-

histoquímica (HOENERHOFF et al., 2004, WERNER et al., 2005). Em medicina,

40

vastos são os trabalhos que pesquisam moléculas específicas em determinados

tipos de neoplasias para estabelecimento de prognóstico (LEONG; COOPER;

LEONG, 2010).

A princípio, o custo de aquisição dos anticorpos constituiria uma desvantagem

(AMORIM, 2009). Apesar disso, alguns trabalhos citam-na como de baixo custo, e

que, mesmo que o custo da técnica aumentasse cinco vezes, ainda assim seria

vantajosa (WERNER et al., 2005; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

2.4.7. Desvantagens

A experiência do patologista que escolhe os anticorpos e interpreta os

resultados imuno-histoquímicos é o fator mais importante para a eficiência da imuno-

histoquímica no diagnóstico de tumores, devendo-se integrar os resultados obtidos

na imuno-histoquímica com o diagnóstico suspeitado nas lâminas coradas com HE

(WERNER et al., 2005; DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

É relatado que a má seleção do painel de anticorpos pode ser responsável em até

40% pelas discrepâncias diagnósticas. Outro ponto a ser considerado é a

característica dos anticorpos utilizados incluindo a titulação e os controles positivo e

negativo (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010).

Tecidos submetidos a análise por congelação devem ser evitados (DE

MATOS et al., 2010) embora, segundo Hosoya et al. (2005), a utilização de cortes

frescos congelados é indicada para tecidos calcificados, onde a imunorreatividade

das proteínas é preservada assim como sua localização.

2.4.8. Interpretação de resultados

A interpretação dos dados imuno-histoquímicos em muitos casos é qualitativa

sendo a quantificação colocada como de menor importância uma vez que sua

reprodutibilidade é baixa (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER; LEONG,

2010).

Ainda assim, alguns autores discordam sobre o que considerar como um

resultado positivo. Para muitos, a simples coloração castanha já é suficiente

enquanto que para outros, a localização desta marcação tem importância no

julgamento. É fundamental então conhecer as funções e os fenômenos biológicos

41

nos quais a molécula estudada está envolvida (DE MATOS et al., 2010; LEONG;

COOPER; LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

Atenção deve ser dada em casos onde a coloração do anticorpo, de função

documentada e conhecida, não se manifesta conforme esperado e o pesquisador

pode considerar este um resultado falso positivo. No entanto, é importante

considerar que pode-se estar diante de outra função biológica daquela molécula,

ainda não descrita na literatura. Nos casos onde a natureza do antígeno ou sua

função não foi completamente elucidada, tal determinação pode ser mais trabalhosa

(DE MATOS et al., 2010).

Algumas questões devem ser consideradas na interpretação dos resultados.

Sabe-se que a quantificação da marcação imuno-histoquímica está diretamente

relacionada a concentração tissular daquele antígeno. As colorações biológicas,

entretanto, são difíceis de controlar em termos de intensidade o que pode dificultar o

estudo comparativo. Essa dificuldade tende a diminuir com a utilização de técnicas

de automação e microscopia digital (DE MATOS et al., 2010; LEONG; COOPER;

LEONG, 2010; CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

As análises semi-quantitativas, baseadas em categorias (ou scores) variam

de acordo com a experiência do analisador sendo dependentes do mesmo e

portanto são inadequadas. As técnicas de análise quantitativa assistida por

computador tem sido superior, representando uma solução frente a reproducibilidade

e aplicabilidade dos métodos semi-quantitativos (DE MATOS et al., 2010;

CATALDO; FICARRA; MACII, 2012).

2.4.9. Marcadores de interesse em Neoplasias Ósseas

2.4.9.1.Marcadores de Linhagem Celular

2.4.9.1.1. Vimentina

A vimentina é uma proteína de 57 kDa pertencente ao grande grupo de

filamentos intermediários. Os filamentos intermediários, juntamente com os

microfilamentos e microtúbulos, compreendem os três grandes grupos das principais

proteínas do citoesqueleto de céluas eucarióticas não-musculares. A família dos

filamentos intermediários possui seis grandes classes, estando a vimentina

classificada como tipo III. É a mais expressada e conservada proteína do grupo,

42

ainda composto pela desmina, periferina e proteína ácida de filamento glial (MININ;

MOLDAVER, 2008; PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011).

A vimentina possui 466 aminoácidos, com uma estrutra central de -hélice

altamente conservada de duas extremidades N- e C-terminais. É codificada por um

gene único localizado no cromossomo 10p13 (MININ; MOLDAVER, 2008; SATELLI;

LI, 2011).

Em indivíduos adultos, a expressão da vimentina está limitada às células do

tecido conjuntivo mesenquimal, do sistema nervoso central e do músculo. É

expressa numa variedade de células incluindo precursores celulares pancreáticos e

neurais, células de Sertoli, células gigantes trofoblásticas, fibroblastos, células

endoteliais que delimitam vasos, células tubulares renais, macrófagos, neutrófilos,

células mesangiais e do estroma renal (MININ; MOLDAVER, 2008; SATELLI; LI,

2011).

Sendo uma proteína estrutural de citoesqueleto, é esperado que sua

localização seja restrita ao citossol, no entanto, sua presença já foi demonstrada no

núcleo assim como extracelularmente. Em ambos os casos, ainda não se definiu seu

papel exatamente (SATELLI; LI, 2011).

A principal função da vimentina está relacionada a manutenção da arquitetura

celular e integridade tecidual. Ela interage com várias proteínas e participa de

diversos processos celulares (MININ; MOLDAVER, 2008; MENDEZ; KOJIMA;

GOLDMAN, 2010; PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011). Sua interação com as

mitocôndrias, através do grupamento N-terminal já foi comprovada (NEKRASOVA et

al., 2011). Ela ainda está implicada diretamente na distribuição intracelular das

organelas e proteínas, influenciando suas funções. Os filamentos polimerizados de

vimentina apresentam considerável mobilidade celular, ligadas a poteínas motoras

como a cinesina e dineína. Os filamentos ainda se ligam a proteínas acopladoras de

filamentos como a plectina previnindo a mobilidade do citoesqueleto, necessário

para estabilizar regiões especiais do citoplasma que sofra por stress mecânico ou

deformação (MININ; MOLDAVER, 2008; PAN et al., 2010; MENDEZ; KOJIMA;

GOLDMAN, 2010).

Algum grau de regulação da vimentina é dado através de reações de

fosforilação da molécula (MININ & MOLDAVER, 2008; PAN et al., 2010; MENDEZ;

KOJIMA; GOLDMAN, 2010).

43

A vimentina é utilizada na identificação de linhagem de origem mesenquimal,

tendo importante valor diagnóstico principalmente em casos de neoplasias

anaplásicas tanto em humanos quanto em animais (THOMAS; PRESSLER;

ROBERTSON, 2001; HOENERHOFF et al., 2004; BARGER et al., 2005; MININ &

MOLDAVER, 2008; WIERSMA et al., 2010; PALMIERI et al., 2011; SATELLI; LI,

2011). Segundo Hoenerhoff et al. (2004), é comumente expressa em

osteossarcomas caninos.

A vimentina tem ganho destaque recentemente devido ao seu envolvimento

com a transformação epitelial-mesenquimal, um processo de reprogramação celular

onde células epiteliais adquirem fenótipo mesenquimal, o que altera drasticamente

seu formato e aumenta sua motilidade (LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA;

GOLDMAN, 2010; PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011). Essa transformação é

caracterizada pela expressão de vimentina nas células epiteliais, que normalmente

expressam apenas citoqueratinas, filamentos intermediários pretencentes ao tipo I e

II (AMORIM, 2009; LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; PAN et al.,

2010; SATELLI; LI, 2011). O processo inverso, transformação mesenquimal-epitelial

também acontece, e neste, as células mesenquimais adquirem fenótipo epitelial,

reduzem a expressão de vimentina e apresentam menores taxas de motilidade

(MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011).

Aumento na expressão de vimentina já foi observado em várias linhagens

tumorais em seres humanos (LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010;

SATELLI; LI, 2011).

No câncer de próstata, a expressão da vimentina é detectada principalmente

nos casos pouco diferenciados e nas metástases ósseas mas é praticamente

indetectável nos casos mais diferenciados. Especula-se que a expressão da

vimentina contribua para o desenvolvimento do fenótipo invasivo em conjunção com

outros elementos (MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011).

Em seres humanos, a expressão da vimentina nos cânceres gástricos está

associada a carcinoma de fenótipo invasivo e parece ter papel nas metástases do

mesmo, servindo como fator prognóstico (SATELLI; LI, 2011). Observação

semelhante ocorre em linhagens agressivas de neoplasias mamárias (MENDEZ;

KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011). No carcinoma de células

escamosas esofágico, células que expressam vimentina exibem maior incidência de

metástases em linfonodos. Já nos tumores colon-retais, a vimentia está restrita aos

44

fibroblastos do estroma, células endoteliais permeando vasose linfócitos infiltrativos

(SATELLI; LI, 2011).

A superexpressão de vimentina em melanomas primários não apenas serve

como marcador diagnóstico mas também como prognosticador de metástases

hematogênicas o que se reflete no resultado clínico, conduzindo estratégias de

tratamento de forma individual (LI et al, 2010).

Em meningiomas, a forma fosforilada da vimentina está associada a tumores

não-infiltrativos quando comparado com os invasivos (SATELLI; LI, 2011).

A quinase AKT se liga a vimentina fosforilada e a protege da proteólise

induzida pela caspase o que leva a um aumento da motilidade celular e da invasão

nas células de sarcomas de tecidos moles (SATELLI; LI, 2011). Scrib, uma proteína

envolvida na migração celular, é protegida da degradação proteossomal através de

interação com a vimentina sugerindo a possibilidade de a regulação positiva da

vimentina na transformação epitelial-mesenquimal leva a estabilização da Scrib,

promovendo diretamente a migração celular para aumentar a capacidade invasiva

das células. A vimentina ainda atua como um freio na diferenciação de osteoblastos

imaturos. (MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SATELLI; LI, 2011).

Em relação às metástases, Schoumacher et al. (2010) relatam sua

participação na formação da invadopodia, o prolongamento celular das células

tumorais responsáveis pela degradação da membrana basal e consequente invasão

tecidual. A formação do invadopodia é primariamente dependente dos filamentos de

actina porém, seu alongamento, uma vez rompida a membrana basal, requer a

formação da rede de microtúbulos e filamentos intermediários, incluindo a vimentina.

Assim sendo, a vimentina atua não só como ferramenta diagnóstica mas

também tem papel no desenvolvimento e progressão do câncer. Apesar de sua

maior ênfase ser na transformação epitelial-mesenquimal, parece estar envolvida em

outros eventos da gênese tumoral uma vez que diversos estudos demonstram

relação positiva entre sua expressão e a migração e invasão celular (LI et al, 2010;

PAN et al., 2010; SATELLI, LI, 2011).

Sendo isso verdade, a vimentina torna-se alvo da terapia anticancerígena

(PAN et al., 2010; SATELLI; LI, 2011). A silibinina, um flavonolignano, e principal

constituinte da silimarina isolada do cardo leiteiro (Silybum marianum), demonstrou

atividades anticancerígenas e quimioprotetoras fortes por inibir a invasão, motilidade

e migração de células prostáticas via regulação negativa da vimentina. De forma

45

semelhante, o antibiótico salinomicina diminui drasticamente os níveis de vimentina

em células de câncer colon-retal. Os mecanismos pelos quais isso acontece ainda

não forma elucidados (SATELLI; LI, 2011).

2.4.9.2. Marcadores ósseos proteicos

2.4.9.2.1. Osteocalcina

É a principal proteína não-colágena da matriz óssea, abrangendo entre 10 e

20% do material orgânico não-colágeno. A molécula precursora possui 100

aminoácidos enquanto que o peptídeo maduro consiste de 47-50 resíduos de

aminoácidos, com peso molecular variando entre 5,2 e 5,9 kDa, dependendo da

espécie (VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; CHEN et al., 2012). É

codificada pelo gene BGLAP em humanos (CHEN et al., 2011; CHEN et al., 2012).

Produzida por osteoblastos, odontoblastos e condrócitos hipertróficos, possui três

resíduos de ácido ɣ-carboxiglutâmico cuja formação ocorre pós-transicionalmente

num processo dependente de vitamina K e estimulado pela vitamina D3. Estes

resíduos se ligam ao cálcio e promovem uma mudança na conformação da proteína

que parece então funcionar como um sítio de localização para os cristais de

hidroxiapatita durante a síntese da matriz óssea (VERMEULEN; VERMEER;

BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al., 1995; FANBURG et al., 1997;

PULLIG et al., 2000; HOENERHOFF et al., 2004; KIM et al., 2010; CHEN et al.,

2011; CHEN et al., 2012). Os índices de osteocalcina aumentam no osso conforme a

mineralização ocorre (PARK et al., 1995; CHEN et al., 2011) e a distribuição da

molécula no osso em humanos varia conforme sexo e idade (INGRAM et al., 1994).

Tanto a osteólise quanto a osteogênese liberam osteocalcina no sangue, que é

eliminada pelo clearence renal e degradação. Por isso, os níveis de osteocalcina

refletem o metabolismo ósseo em geral e não apenas a osteogênese. Somado a

isso, a detecção de osteocalcina plasmática ou sérica pode ser comprometida pelo

nível de lipídeos no sangue devido a capacidade da osteocalcina se ligar a eles. Há

múltiplas isoformas na circulação e os exames tem capacidade limitada de identificar

todas elas. (HOENERHOFF et al., 2004; KIM et al., 2010).

A fixação do tecido tem pouca influência sobre a imunorreatividade da

osteocalcina mas agentes descalcificadores como o EDTA podem reduzir

46

consideravelmente o percentual de imunorreatividade da mesma através da

extração da proteína durante o processo de calcificação. Quanto mais rápido for

este, como o que ocorre com o uso de ácidos, maior a imunorreatividade

encontrada, desde que não haja desnaturação da proteína (VERMEULEN;

VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PULLIG et al., 2000). Para evitar

tais alterações, pode-se utilizar espécimes não-descalcificados embebidos em glicol-

metilmetacrilato (INGRAM et al., 1994).

A presença da osteocalcina já foi demonstrada em linhagens celulares de

osteossarcoma. Em tecido ósseo normal, foi detectada em osteócitos, sendo

proporcional ao tamanho dessas células: quanto maior a célula, mais intensa a

marcação. A imunorreatividade da osteocalcina também foi detectada nas margens

das lacunas ósseas e junto ao colágeno lamelar da matriz óssea sob a forma de

depósitos granulares. Em áreas de deposição óssea, o material osteóide

praticamente não se cora, diferente das trabéculas ósseas pré-existentes mas já se

observa marcações de osteocalcina em focos recém-mineralizados. A partir dessas

observações conclue-se que a deposição da osteocalcina na matriz óssea é uma

característica de tecido ósseo maduro, metabolicamente inativo (VERMEULEN;

VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al., 1995; CHEN et al.,

2011; CHEN et al., 2012).

A osteocalcina é regulada positivamente pela proteína p53, estando este

envolvido na diferenciação dos osteoblastos e remodelamento ósseo (CHEN et al.,

2011). Sugere-se ainda o envolvimento do gene Mdm2 e do receptor de vitamina D

que se liga ao elemento VDR no promotor da osteocalcina (CHEN et al., 2012).

O anticorpo monoclonal bovino tipo IgG anti-osteocalcina tem a capacidade

de reconhecer tanto a osteocalcina bovina quanto a humana (VERMEULEN;

VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al., 1995).

A osteocalcina parece ser exclusiva de osteossarcomas (GRUNDMANN et al.,

1995; CHEN et al., 2011). Observa-se marcação positiva para osteocalcina no

citoplasma dos osteoblastos independente do subtipo de osteossarcoma em

humanos. A marcação também é observada nas células gigantes dos diversos tipos

de osteossarcoma mas não no tumor ósseo de células gigantes. Condrócitos

normais não se coram para osteocalcina (PARK et al., 1995). Nos osteossarcomas,

o índice de marcação varia entre 70-80% (sensibilidade), havendo ausência de

marcação em alguns casos de osteossarcomas de células pequenas. É ainda

47

relatado que, em osteossarcomas que sofrem rearranjos do gene p53 e perdem a

sua expressão, a expressão de osteocalcina também é perdida (CHEN et al., 2012).

Tumores que não formam osso (condrossarcoma, lipossarcoma, tumor de células

gigantes, carcinomas, linfomas, etc) não reagem com a osteocalcina. Portanto, sua

especificidade para neoplasias formadoras de tecido ósseo é de 100%, mesmo em

amostras sem evidências de tecido ósseo (FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF

et al., 2004; CHEN et al., 2012).

2.4.9.2.2. SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine)

É uma glicoproteína fosforilada de 32 kDa e representa aproximadamente um

quarto das proteínas não-colágenas do osso (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN

et al., 1995; PORTER et al., 1995; DELANY et al., 2003; McKNIGHT et al., 2006;

TAI; TANG, 2008). Quando relacionada a membrana basal, é denominada BM-40 e

se liga ao colágeno tipo IV (YAN; SAGE, 1999; DELANY et al., 2003; McKNIGHT et

al., 2006; TAI; TANG, 2008). É uma proteína secretada e uma marcação granular,

perinuclear evidencia sua localização no complexo de Golgi intracelularmente. Há

vários questionamentos relacionados às suas potenciais funções no citoplasma e no

núcleo (YAN; SAGE, 1999).

É uma proteína de matriz extracelular codificada por um único gene e

altamente preservada entre as espécies, havendo mais de 70% de aminoácidos

idênticos entre mamíferos e aves (PORTER et al., 1995; FANBURG et al., 1997;

YAN; SAGE, 1999; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).

Inicialmente apresenta 303 resíduos de aminoácidos, os primeiros 17 sendo

uma sequência sinalizadora, posteriormente clivada. A proteína humana madura

apresenta 286 resíduos de aminoácidos divididos em três domínios distintos e está

localizada no gene 5q31-q33. O domínio I se liga a íons cálcio com baixa afinidade e

interage com a hidroxiapatita. Parece estar implicado na mineralização de cartilagem

e osso e possui os principais epítopos imunológicos da SPARC. Devido a presença

de cistina, pode formar pontes dissulfeto entre moléculas e com outras proteínas.

Essa modificação pós-tradução contribuiria para a sua diversidade de funções. O

domínio II é rico em cistina e é semelhante a folistatina. Possui dois sítios de ligação

com o cobre e um deles, a sequência KGHK (resíduos 119-122) estimula a

48

proliferação celular e a angiogênese. O domínio III tem estrutura helicoidal e sítios

de ligação de alta afinidade com o cálcio (YAN; SAGE, 1999; TAI; TANG, 2008;

CHLENSKI; COHN, 2010).

Inicialmente denominada osteonectina, foi primeiramente isolada como o

principal componente não-colágeno do osso. Sua função e estrutura é modulada por

íons cálcio e a ligação entre eles aumenta a afinidade pelo colágeno. Sua ligação

com diversos tipos de colágeno (I, II, III, IV, V e VIII) já foi demonstrada e parece

influenciar o remodelamento da matriz extracelular (YAN; SAGE, 1999; McKNIGHT

et al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).

Porém, sua potente habilidade em retardar a formação dos cristais de

hidroxiapatita sugere seu papel na prevenção da mineralização da matriz óssea. É

encontrada em osteoblastos ativos e osteócitos jovens e está envolvida nas

primeiras etapas da mineralização do tecido ósseo, sendo um marcador de

diferenciação de células osteogênicas normais (YAN; SAGE, 1999; HOENERHOFF

et al., 2004; CHLENSKI; COHN, 2010). Fibroblastos e macrófagos começam a

expressar SPARC em feridas em cicatrização, onde esta também é liberada pela

degranulação plaquetária. Sua expressão também aumenta em célula sob stress.

Não foi identificada em osteócitos quiescentes nem em células inativas da superfície

endosteal (SCHULZ et al., 1988; YAN; SAGE, 1999; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI;

COHN, 2010).

Fisiologicamente, tem propriedades anti-adesivas promovendo o

arredondamento celular, inibindo o espalhamento celular, estimulando a síntese de

enzimas (metaloproteinases) que degradam a membrana basal e o interstício e

retardando o ciclo celular de diversas células em G1. Tal característica pode estar

implicada na invasão tecidual por células neoplásicas (PORTER et al., 1995;

FANBURG et al., 1997; YAN; SAGE, 1999; DELANY et al., 2003; HOENERHOFF et

al., 2004; McKNIGHT et al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010). É

sabido que sua propriedade anti-adesiva se dá em parte pela dissolução de

complexos focais de adesão e reorganização das fibras de actina (YAN; SAGE,

1999; TAI; TANG, 2008). Esta ação produz um estado “intermediário” de adesão que

favorece a motilidade celular porém mantendo a ligação de integrinas com a matriz

(McKNIGHT et al., 2006).

49

Em relação ao ciclo celular, compõe a matriz nuclear na intérfase, forte

marcação imuno-histoquímica é detectada na metáfase e anáfase mas não em

células em telófase (YAN; SAGE, 1999).

A SPARC está implicada ainda na formação de novos vasos. Ela é capaz de

se ligar a fatores de crescimento como o VEGF (vascular endothelial growth factor –

fator de crescimento de endotélio vascular) e PDGF (platelet derived growth factor –

fator de crescimento derivado de plaquetas) inibindo a proliferação celular e

modulando a angiogênese (YAN; SAGE, 1999; CHLENSKI; COHN, 2010). Isso

relaciona suas funções a processos cicatriciais e ao desenvolvimento de metástases

(PORTER et al., 1995; FANBURG et al., 1997; YAN; SAGE, 1999; HOENERHOFF et

al., 2004; TAI; TANG, 2008).

Não é considerada específica para o material osteóide produzido por tumores

ósseos malígnos como o osteossarcoma uma vez que é produzida por diversos tipos

celulares, normais ou neoplásicos. No entanto, a imunorreatividade da SPARC é

citoplasmática e consideravelmente maior em células neoplásicas do que em células

normais na maioria dos casos (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN et al., 1995;

PORTER et al., 1995; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010) como observado

em carcinomas invasivos de mama e células de câncer de próstata (McKNIGHT et

al., 2006). Neste último, há regulação positiva com as metástases ósseas embora,

no carcinoma de mama, a SPARC não tenha sido identificada como um fator quimio-

atrativo (McKNIGHT et al., 2006). Também já foi observado que células neoplásicas

com baixa expressão de SPARC estão relacionadas a fenótipos tumorais mais

agressivos (McKNIGHT et al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).

Seu papel na gênese tumoral parece depender de suas diversas funções num dado

microambiente não sendo absoluta entre os tipos tumorais (CHLENSKI; COHN,

2010).

Assim como os anticorpos bovinos produzidos contra osteocalcina, os

anticorpos bovinos produzidos contra a osteonectina também apresentam reação

cruzada entre as proteínas bovina e humana. A osteonectina já foi identificada

intracelularmente em osteoblastos ativos normais e em neoplasias formadoras de

tecido ósseo mas não em condrossarcomas e neoplasias de tecido mole. A

osteonectina também foi identificada em osteossarcomas fibroblásticos e

anaplásicos, que apresentam raro material mineral. Tal achado é importante pois

demonstra que as células formadoras do tumor pertencem a linhagem óssea,

50

aprimorando o diagnóstico destes subtipos tumorais (SCHULZ et al., 1988). Nos

osteossarcomas, o índice de marcação pela osteonectina pode chegar a quase 90%

(sensibilidade), havendo ausência de marcação em alguns casos de

osteossarcomas de células pequenas. Em tumores ósseos benignos, observa-se

100% de imunorreatividade mas observa-se marcação também em tumores

benignos não-formadores de tecido ósseo, neoplasias de tecidos moles,

melanomas, carcinomas e linfomas, o que a descarta como marcador celular ósseo

específico, reduzindo sua especificidade em 50%. Quando associada a osteocalcina,

pode auxiliar na identificação da matriz neoplásica óssea em detrimento ao colágeno

denso (FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004).

Já foi demonstrado em alguns tumores que a SPARC é capaz de aumentar a

sensibilidade das células aos quimioterápicos ou ainda inibir a taxa de proliferação e

aumentar a de apoptose, conferindo-lhe potencial terapêutico embora mais estudos

ainda sejam necessários (TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010).

2.4.10. A imuno-histoquímica na Oncologia Veterinária

A medicina veterinária inicialmente se beneficiou desse método na distinção

acurada de doenças como os diversos tipos de pênfigos e o lupus eritematoso

sistêmico. Ainda hoje, a medicina veterinária faz intenso uso da técnica na detecção

de patógenos de doenças infecto-contagiosas, principalmente nos casos onde o

isolamento clássico do agente em questão é difícil, caro ou envolve períodos muito

longos (HAINES; WEST, 2005).

As aplicações da imuno-histoquímica na oncologia veterinária são

semelhantes à medicina: diagnóstico de neoplasias indiferenciadas, determinação

do imunofenótipo das células neoplásicas e subtipagem de neoplasias,

determinação da origem do tumor primário e de metástases, avaliação de fator

prognóstico e avaliação da terapia instituída e identificação de estruturas, produtos e

organismos produzidos pelas células. (HAINES; WEST, 2005; WERNER et al., 2005;

AMORIM, 2009; DE MATOS et al., 2010). Isto se deve a evolução e sofisticação do

tratamento das neoplasias em animais, o que incentiva a melhor determinação das

características de uma pupolação tumoral em questão. Tal fato é particularmente

verdade nas neoplasias linfóides e nos tumores de células redondas que ocorrem

como massas na pele dos animais (HAINES; WEST, 2005).

51

O uso frequente da imuno-histoquímica ainda não é uma realidade na

medicina veterinária devido ao custo, possibilidade de obtenção da peça cirúrgica e

principalmente conhecimento acerca destes marcadores nas neoplasias animais

(AMORIM, 2009).

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar neoplasias ósseas em cães por meio da histopatologia e da imuno-

histoquímica associada à análise clínica e radiográfica, auxiliando na

classificação dos tipos neoplásicos e determinação de subtipos.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Descrever os achados clínicos dos cães com neoplasias ósseas.

Descrever os achados radiográficos de caninos com neoplasias ósseas.

Identificar e descrever macroscopicamente e microscopicamente os diferentes

processos neoplásicos ósseos observados nos caninos analisados.

Avaliar por meio de imuno-histoquímica utilizando marcadores específicos de

linhagem mesenquimal (vimentina) e marcadores ósseos proteicos

(osteocalcina e osteonectina) as neoplasias ósseas nos caninos analisados,

visando a diferenciação dos tipos neoplásicos e identificação de subtipos e

variantes tumorais.

53

Relacionar os achados da avaliação clínica, radiográfica, histopatológica e

imuno-histoquímica em caninos com neoplasia óssea primária.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANIMAIS

O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais

(CEUA) da Universidade Federal Fluminense (UFF) sob o número 140 (Anexo 9.3).

Foram utilizados vinte e dois cães. Todos os animais apresentavam lesão

sugestiva de neoplasia óssea primária radiograficamente detectável. Foram

utilizados caninos independente de sexo, castrados ou não, raça, com idade acima

de dois anos (adultos) e de porte médio a gigante.

Os animais eram provenientes do Hospital Universitário de Medicina

Veterinária Profº Firmino Mársico Filho e de clínicas e centros diagnósticos privados

da cidade do Rio de Janeiro e de Niterói.

4.2. METODOLOGIA

4.2.1. Avaliação clinica

Todos os pacientes incluídos neste estudo foram utilizados após assinatura

de termo de consentimento e esclarecimento pelos responsáveis (Anexo 9.1 e 9.2).

Foi analisada a ficha clínica destes animais dando-se ênfase aos problemas

ortopédicos prévios concernentes a traumas que resultaram em fraturas, episódios

de claudicação, dificuldade de deambulação, paresia ou paralisia de membros e

possíveis doenças infecciosas.

55

Todos os animais foram submetidos ao exame clínico e os sinais relacionados

ao local da lesão como aumento de volume, integridade de pele (presença ou não

de fístulas), edema ou atrofia de membro foram registrados. Foi avaliado

subjetivamente a temperatura local da lesão.

Em casos de animais que vieram à óbito, foi considerada a possível causa

mortis e, naqueles submetidos à eutanásia, a realização do procedimento.

4.2.2. Exames Radiográficos

As imagens radiográficas foram obtidas a partir do local indicado pelo clínico

como suspeito de lesão baseando-se em sinais e sintomas clínicos como aumento

de volume, alteração estrutural (deformidade) quando comparado contra-

lateralmente e incapacidade de sustentação do peso principalmente em casos de

membros, dor local, indícios de lambedura e alteração de pelagem e pele.

Amostras de lesões radiográficas que após exame histopatológico revelaram

não se tratar de neoplasia óssea foram excluídas deste estudo.

De cada local suspeito realizaram-se duas incidências complementares; nos

casos de lesões mais extensas foram abrangidas também as articulações proximal e

distal adjacentes e se necessário, áreas mais distais. As tomadas radiográficas

foram nas posições lateral, crânio-caudal (ou caudo-cranial) e dorso-plantar ou

dorso-palmar se tratando de membros e lateral, oblíquas e dorso-ventral ou ventro-

dorsal em casos do esqueleto axial. Sempre que possível foram realizadas

incidências torácicas nas posições lateral e ventro-dorsal para investigação de

metástase pulmonar.

Foram utilizados filmes radiográficos nos tamanhos compatíveis com o porte

do animal alojados em chassis forrados com écran intensificadores de terras raras e

conversão verde nos tamanhos correspondentes aos filmes. Utilizou-se técnica

adequada para cada região e de acordo com cada aparelho. Os sistemas de

revelação utilizados foram o manual e o automático, dependendo do local em

questão.

56

4.2.3. Obtenção de Amostra

As amostras ósseas foram coletadas em animais vivos submetidos à

anestesia geral, em cadáveres de animais que tiveram morte natural ou que foram

submetidos a eutanásia com até seis horas pós-óbito e de peças cirúrgicas. Sempre

que possível, foi realizada a necropsia completa para investigação de outras lesões

relacionadas ou não à lesão óssea observada.

4.2.3.1. Biópsias

Os animais submetidos à biópsia óssea in vivo foram anestesiados para a

realização do procedimento, de acordo com o seguinte protocolo: acepromazina

como medicação pré-anestésica (dose 0,1 mg/kg) ou diazepam (dose 0,2 mg/kg),

propofol para indução anestésica (dose 6 mg/kg), e isofluorano em mistura com

oxigênio em circuito semi-aberto para manutenção anestésica.

Nestes animais foi utilizada a agulha Jamshidi calibre 11, obtendo-se

espécimes de dois milímetros de largura por comprimentos variando de 0,3 a 2,5 cm.

O número de fragmentos obtidos por procedimento variou entre uma a seis amostras

em função do tamanho da lesão e facilidade de obtenção das amostras. Em lesões

discretas, abrangendo até 3,0 cm de comprimento do osso afetado, obteve-se no

máximo dois espécimes; lesões bem desenvolvidas, abrangendo entre 3,0 e 8,0 cm

obteve-se entre dois e quatro espécimes, devendo-se considerar os aspectos

proximal e distal da lesão e, lesões com mais de 8,0 cm de comprimento, pode-se

coletar até seis amostras das regiões proximal, média e distal da área lesionada.

A área a ser biopsiada foi examinada por meio de projeções radiográficas de

forma a se obter a morfologia e profundidade da lesão nos animais acometidos.

Decidido o local da biópsia, o animal era colocado na posição mais vantajosa

para se obter o menor trajeto possível para a agulha atingir a lesão. A trajetória

proposta para a agulha levou em consideração a anatomia subjacente para evitar

estruturas vasculares e neurais principais. Em alguns casos foi possível contar com

o auxílio da sonda ultrassonográfica ou radiográfica. Após localizar o ponto de

entrada, a região era tricotomizada e a pele limpa com solução anti-séptica como

Povidine ou Clorexidine num raio de cinco centímetros partindo do ponto de entrada.

57

Uma pequena incisão (cerca de três milímetros) foi feita com lâmina de bisturi de

Bard-Parker para facilitar a entrada da agulha e evitar contaminação com células

epidérmicas. A agulha era introduzida perpendicularmente à pele e depois

profundamente a área da anormalidade com o mandril posicionado.

A entrada na cavidade medular foi comumente detectada como uma queda na

resistência. O mandril era então removido e a cânula avançada lenta e

delicadamente com movimentos horário e anti-horário. Depois, a agulha era

rotacionada completamente diversas vezes ao longo do seu eixo e lentamente

removida com movimentos de rotação alternada. O espécime obtido era

delicadamente removido com a sonda longa ou o próprio mandril introduzido pelo

orifício de corte e a amostra foi expelida facilmente pelo orifício proximal. Em

algumas situações, a entrada da agulha se deu obliquamente em relação a cortical

óssea, facilitando a aquisição de espécimes de comprimento maior.

Como medicação pós-procedimento foram utilizados cloridrato de tramadol

(dose: 5mg/kg, SID, PO) e cefalexina (dose: 30mg/kg, BID, PO) para controle da dor

e profilaxia antibacteriana.

Os materiais biopsiados foram colocados em solução de formol a 10% por,

pelo menos, 24 horas visando promover a fixação do mesmo.

4.2.3.2. Peças cirúrgicas e necrópsias

Foram recebidas peças cirúrgicas contendo também os linfonodos satélites.

Em seguida, o osso afetado foi clivado em duas ou três partes dependendo de seu

tamanho e da extensão da lesão e os segmentos acondicionados em formol a 10%

para melhor fixação juntamente com o(s) linfonodo(s) satélite(s).

Nos animais necropsiados realizou-se a inspeção externa e a abertura das

cavidades torácica e abdominal. Num primeiro momento os órgãos foram

inspecionados in situ. A retirada destes seguiu o padrão técnico adotado pelo Setor

de Anatomia Patológica Veterinária da Universidade Federal Fluminense. Os órgãos

foram inspecionados individualmente, coletadas amostras de regiões significativas

com ou sem lesão e estas acondicionadas em formol a 10%. Os principais órgãos

avaliados foram: coração, pulmões, linfonodos traqueo-brônquicos, fígado, baço,

rins, estômago, intestinos, pâncreas, bexiga e gônadas. Os ossos lesionados e o(s)

58

linfonodo(s) satélite(s) provenientes destes cadáveres receberam tratamento

semelhante ao das peças cirúrgicas.

4.2.4. Processamento histológico

Depois de fixadas em solução de formol a 10%, algumas amostras de biópsia

necessitaram ser transferidas para solução de formol contendo EDTA a 10% para

descalcificação da porção mineral permitindo assim o corte em micrótomo. O tempo

de descalcificação foi controlado e variou dependendo do tamanho e espessura da

peça em questão. Procedimento semelhante foi realizado nas peças cirúrgicas após

clivagem das áreas-alvo. Fragmentos com alta rigidez foram colocados em solução

de ácido nítrico a 5% para aceleração da descalcificação, porém sem danos ao

material.

Após descalcificação, as peças foram lavadas em água corrente por pelo

menos duas horas para melhor eliminação das soluções descalcificantes e do

formol. Posteriormente foram processadas em seis baterias de álcool sendo imersas

inicialmente em álcool a 80% (duas baterias) e as quatro restantes em álcool

absoluto, permanecendo por pelo menos 40 minutos em cada uma para

desidratação. Na etapa seguinte foram diafanizadas em solução de xilol em duas

baterias por no mínimo 60 minutos em cada uma e a seguir foram imersas por 90

minutos em parafina a 60ºC (dois banhos) para posterior emblocamento.

A partir dos blocos, foram realizados cortes de 5 micra de espessura,

dispostos em lâmina de vidro e corados pelo método de hematoxilina e eosina (HE).

4.2.5. Processamento imuno-histoquímico

Das amostras processadas, parte dos cortes obtidos foi direcionada a análise

imuno-histoquímica. Seções de cinco micrômetros de espessura foram dispostas em

lâminas cobertas por silano. As secções de tecido foram desparafinizadas em xilol e

re-hidratadas com álcool etílico e tratadas com solução de peróxido de hidrogênio a

3% por 30 minutos para bloqueio da peroxidase endógena (fase de inibição I) antes

da recuperação antigênica induzida pelo calor (banho-maria a 96-98°C, em solução

59

de recuperação - Target Retrieval Solution 10X concentrated - (DAKO Corporation,

Carpinteria, CA, USA)). Após a recuperação antigênica, as secções foram incubadas

com uma solução de leite e albumina bovina, para inibição de ligações inespecíficas

(fase de inibição II), seguido por tratamento com os seguintes anticorpos primários:

anticorpo monoclonal de camundongo anti-vimentina humana DAKO (para

identificação de linhagem mesenquimal), anticorpo monoclonal de camundongo anti-

osteocalcina humana Abcam e anticorpo policlonal de coelho anti-osteonectina

(SPARC) humana Abcam (para identificação de linhagem osteogênica), nas

diluições e tempos especificados pelo fabricante em questão (Quadro 1).

As secções foram lavadas com tampão TBS (tris-buffered saline – salina tris-

tamponada), antes do tratamento com seus respectivos sistemas reveladores à

temperatura ambiente (anticorpo secundário – fase de revelação). Depois de nova

lavagem com tampão TBS, as secções foram tratadas com solução de DAB (3,3-

diaminobenzidina tetrahidroclorídrico) (DAKO Corporation, Carpinteria, CA, USA),

cromógeno usado para a marcação castanha das células positivas (etapa de

revelação).

Todas as secções foram contra-coradas com hematoxilina. Secções

histológicas de ossos sadios dos cadáveres obtidos foram usados como controles

positivos e para controles negativos, o anticorpo primário foi omitido.

O protocolo utilizado foi padronizado pelo grupo de pesquisa do Setor de

Anatomia Patológica da Faculdade de Veterinária da UFF.

Anticorpo

primário Diluição Inibição I

Recuperação

antigênica Inibição II Sistema de revelação

Vimentina 1:150 30 min 30 min 30 min LSAB da DAKO.

SPARC 1:1000

30 min 30 min 30 min Envision Anti-rabbit

Osteocalcina 1:200 30 min 45 min 30 min Envision Anti-mouse

Quadro 1: Protocolo imuno-histoquímico utilizado para os anticorpos vimentina, osteonectina (SPARC) e osteocalcina em neoplasias ósseas caninas.

4.2.6. Avaliação Histopatológica e Imuno-Histoquímica

As lesões neoplásicas tiveram seu diagnóstico firmado seguindo a

Classificação Histológica dos Tumores Ósseos e Articulares dos Animais

60

Domésticos, da Organização Mundial de Saúde (SLAYTER et al., 1994) apoiada

pela Classificação dos Tumores Ósseos, da Organização Mundial de Saúde

(FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002).

Na avaliação imuno-histoquímica, a imunorreatividade foi classificada de

acordo com o percentual de células marcadas. Para isso, selecionou-se cinco

campos seguindo o modelo da barra grega e fez-se a contagem diferencial de todas

as células de cada campo sob objetiva de 40 vezes. O percentual de células

marcadas naquela lâmina foi dado pela média dos cinco campos contados.

Em relação a intensidade de marcação, independente do percentual de

células marcadas, os cortes foram classificados como tendo marcação intensa

(+++), média (+) ou fraca(+).

4.2.7. Análise Estatística

Para as análises estatísticas foram utilizadas ferramentas de estatística

descritiva baseadas em média, desvio padrão e percentual dos parâmetros clínicos,

histológicos e imuno-histoquímicos considerados, uma vez que tratou-se de um

único grupo.

5 RESULTADOS

5.1 ANIMAIS

5.1.1 Avaliação clínica

Foram avaliados vinte e dois cães com neoplasias ósseas sendo sete machos

(31,8%) e quinze fêmeas (68,2%) com idade média de 8,59 ± 2,92 anos e peso

médio de 36,59 ± 11,24 quilos (Tabela 1).

Tabela 1: Distribuição de valores relativos a idade e peso dos 22 cães avaliados.

Parâmetros Média Desvio Padrão Mínimo Máximo

Idade (anos) 8,59 ± 2,92 3 18

Peso (quilos) 36,59 ± 11,24 15 58

Dos cães analisados, observou-se a seguinte distribuição racial: seis cães

sem raça definida (SRD) (27,3%), nove Rottweilers (40,9%), além de Boxer, Husky

Siberiano, Dobermann Pinscher, Bulldog Inglês, Akita, Pastor Alemão e Golden

Retriever com um representante cada (4,5%). Dos seis animais sem raça definida,

quatro deles tinham sabidamente um dos progenitores da raça Labrador, da raça

São Bernardo, da raça Poodle e da raça Rottweiler respectivamente.

62

Todos os cães com lesão relacionadas a membro apresentaram claudicação.

Com exceção de dois cães, esta ocorreu sempre associada a aumento de volume

do local afetado (Figura 5A) cuja consistência variou de firme no caso das

neoplasias mais desenvolvidas a macia por edema ou ambos e dor. Três animais

apresentaram atrofia muscular cranialmente ao local afetado.

De 18 cães com histórico completo, quatro apresentavam algum grau de

emagrecimento embora nenhum animal apresentasse caquexia nestes casos, a

maioria dos animais tinha um mês ou mais de progressão da lesão.

Somente um animal apresentou dispnéia no momento da realização da

biópsia.

5.1.2 Exame radiográfico

Todos os animais apresentavam algum tipo de lesão óssea radiográfica

sugestiva de neoplasia óssea primária.

Dois cães (9,1%) apresentaram lesão em esqueleto axial enquanto os demais

(90,9%) apresentaram em esqueleto apendicular.

Os achados radiográficos tiveram como localização os seguintes ossos:

úmero, fêmur, rádio, tíbia, ílio, escápula e mandíbula. O úmero seguido do rádio

foram os locais mais acometidos, com sete e cinco animais respectivamente. (Figura

1).

Figura 1: Frequencia de distribuição das lesões sugestivas de neoplasia óssea

primária ao exame radiográfico dos cães avaliados (n=22).

31%

18%22%

14%

5%

5% 5%

Úmero

Fêmur

Rádio

Tíbia

Ílio

Escápula

Mandíbula

63

Das lesões em membros, treze (65%) foram em membros torácicos (Figura

5A) e sete (35%) em membros pélvicos.

Dos 22 animais avaliados, obteve-se imagem radiográfica torácica de onze e

em nenhuma das imagens houve indício de doença metastática.

As imagens radiográficas nas quais se basearam os diagnósticos de

neoplasias apresentaram processos escleróticos e líticos associados. Em seis, lise e

esclerose apresentaram-se igualmente distribuídas (Figura 2E); em onze

predominou a lise (Figura 2A e 2D) e em quatro a esclerose (Figura 2B e 2C).

Nos ossos longos, no esqueleto apendicular, as metáfises foram as áreas

mais atingidas, havendo algumas vezes extensão da lesão para a epífise e/ou terço

diafisário.

64

Figura 2: Radiografias. A: Caso nº. 20, canino, fibrossarcoma: radiografia simples, lateral oblíqua esquerda,

mandíbula: lise e perda de opacidade óssea em corpo mandibular esquerdo na altura do segundo pré-molar (seta). B: Caso nº. 6, canino, osteossarcoma: radiografia simples, latero-lateral, membro pélvico esquerdo: proliferação óssea acentuada em metáfise e diáfise proximal de fêmur esquerdo. C: Caso nº. 13, canino,

osteossarcoma: radiografia simples, médio-lateral, membro torácico direito: proliferação óssea discreta em diáfise média e distal e metáfise distal radial direita. D: Caso nº. 14, canino, fêmea, osteossarcoma: radiografia

simples, médio-lateral, membro torácico direito: lise óssea em metáfise proximal de úmero direito, alterando o padrão trabecular. E: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma: radiografia simples, médio-lateral, membro torácico

direito: áreas de lise e proliferação óssea com destruição de cortical em metáfise proximal de úmero direito.

A

C D E

B

65

5.1.3 Avaliação Anatomo-Histopatológica

Das amostras obtidas, seis foram coletadas com a agulha Jamshidi (27,3%),

nove de peças cirúrgicas de amputação (40,9%) e cinco por meio de necropsia

(22,7%). Em dois animais, sendo um da raça Golden Retriever e um da raça Boxer,

a amostra foi obtida por biópsia incisional (9,1%).

As amostras avaliadas a partir de peças cirúrgicas ou de necrópsia não

apresentaram heterogeneicidade tumoral significativa exceto com relação às áreas

de necrose, cujo percentual nas amostras foi variável, de acordo com o fragmento

clivado.

O Quadro 2 resume os locais biopsiados e o resultado anatomo-

histopatológico.

66

Quadro 2: Avaliação das neoplasias ósseas nos cães analisados segundo sexo, idade, raça,

local biopsiado e resultado histopatológico (n=22).

Nº animal Sexo Idade Raça Local Biopsiado Resultado Anatomo-

Histopatológico

1 F 8 anos Rottweiler Metáfise distal de fêmur

direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

2 F 3 anos SRD Metáfise distal de rádio

direito Osteossarcoma osteoblástico

minimamente produtivo

3 M 10 anos SRD Metáfise proximal de tíbia

direita Condrossarcoma

4 F 8 anos Rottweiler Metáfise proximal de

úmero direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

5 M 6 anos Bulldog Inglês

Asa ilíaca direita Osteossarcoma osteoblástico

minimamente produtivo

6 F 18 anos Pastor Alemão

Metáfise proximal de fêmur esquerdo

Osteossarcoma osteoblástico produtivo

7 F 6 anos Husky

Siberiano Metáfise proximal de tíbia

direita Condrossarcoma

8 F 9 anos SRD Metáfise distal de tíbia

esquerda Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

9 F 9 anos Dobermann Metáfise distal de fêmur

direito Osteossarcoma osteoblástico

minimamente produtivo

10 F 7 anos Rottweiler Metáfise proximal de

úmero direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

11 F 7 anos SRD Metáfise proximal de

úmero esquerdo Osteossarcoma osteoblástico

minimamente produtivo

12 M 12 anos Rottweiler Metáfise proximal de

úmero direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

13 M 8 anos Rottweiler Metáfise distal de rádio

direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

14 F 8 anos Rottweiler Metáfise proximal de

úmero direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

15 M 7 anos Boxer Metáfise proximal de fêmur

esquerdo Osteossarcoma osteoblástico

minimamente produtivo

16 F 11 anos Rottweiler Metáfise distal de rádio

esquerdo Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

17 F 7 anos SRD Metáfise proximal de

úmero direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

18 F 12 anos SRD Metáfise distal de rádio

direito Osteossarcoma osteoblástico

minimamente produtivo

19 F 9 anos Golden

Retriever Escápula Hemangiossarcoma

20 F 9 anos Rottweiler Mandíbula esquerda Fibrossarcoma

21 M 7 anos Rottweiler Metáfise proximal de

úmero direito Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

22 M 8 anos Akita Metáfise distal de rádio

esquerdo Osteossarcoma osteoblástico

produtivo

67

Todos os casos avaliados tiveram diagnóstico estabelecido sendo 18

osteossarcomas (81,8%), dois condrossarcomas (9,1%), um fibrossarcoma e um

hemangiossarcoma (4,5%) (Figura 3).

As médias de idade dos cães com osteossarcoma foi 8,61 ± 3,16 anos e a

média de peso foi de 37,28 ± 11,0 quilos. Dos 18 cães diagnosticados com

osteossarcoma, oito (44,4%) eram da raça Rottweiler, sendo cinco fêmeas (62,5%).

Ambos os condrossarcomas, diagnosticados em um cão SRD e em uma

cadela da raça Husky Siberiano, tiveram localização apendicular.

O único fibrossarcoma teve localização em esqueleto axial, na mandíbula de

uma cadela da raça Rottweiler e o único hemangiossarcoma acometeu a escápula

de um cão da raça Golden Retriever.

Figura 3: Frequencia de distribuição dos tipos histológicos diagnosticados em cães

avaliados com neoplasia óssea (n=22).

As peças de osteossarcomas apresentaram consistência firme ao corte, de

coloração amarelo-palha, com notável proliferação de tecido mineralizado

perifericamente a diáfise e áreas de necrose de tamanhos variados (Figuras 5C e

5D). Em três casos (nº 1, 9 e 15) observou-se fratura patológica do osso afetado,

sendo o fêmur em todos os casos. Os casos de osteossarcoma osteoblástico

minimamente produtivo apresentaram mínima quantidade de material mineralizado,

localizado primariamente na cavidade medular, e uma extensa área de necrose

associada.

81,8%

9,1%

4,5%4,5%

Osteossarcoma

Condrossarcoma

Hemangiossarcoma

Fibrossarcoma

68

Na análise microscópica, os dezoito osteossarcomas foram classificados de

acordo com SLAYTER et al. (1994). O único subtipo encontrado foi o osteoblástico.

Observou-se desde células mesenquimais anaplásicas com escasso material

eosinofílico filiforme entremeando-as até franca produção de material osteóide

mineralizado e desorganizado. Os primeiros foram classificados como minimamente

produtivo e os outros produtivos (Figura 6A e 6B). No caso nº 9, observou-se

mitoses atípicas em diversos campos.

A peça de condrossarcoma (caso nº 7) apresentou macroscopicamente

consistência amolecida, sendo possível o corte com faca do componente extra-

ósseo que circundava a diáfise tibial. Ao corte, este era esbranquiçado e brilhante

com uma pequena área de necrose . Na microscopia observou-se diversas ilhas de

cartilagem composta por condrócitos de moderado pleomorfismo, algumas com

centros de ossificação, e uma delgada matriz extracelular entre elas (Figura 6C).

A peça de fibrossarcoma (caso nº 20) apresentou superfície externa

multinodular castanho-pardacenta, de consistência firme ao corte e superfície de

corte compacta ora brancacenta, ora acinzentada ou acastanhada. A microscopia

revelou células alongadas, fusiformes, com pleomorfimo acentuado, na maior parte

das vezes dispostas ora em feixes, ora entrelaçadas. Notou-se anisocariose,

cromatina dispersa, nucleolação evidente e figuras de mitose típicas e atípicas

(Figura 6D).

O fragmento de hemangiossarcoma apresentava superfície externa de

tonalidade ora enegrecida, ora amarelada ou pardacenta. A consistência ao corte

era de macia à friável com superfície de corte compacta. À microscopia, havia

proliferação de células fusiformes com pleomorfismo celular discreto a moderado;

núcleo ovóide a fusiforme e hipercromático. As células estavam organizadas

formando vasos sanguíneos irregulares e de diferentes tamanhos, contendo no seu

interior hemácias.

Em cinco animais com suspeita de osteossarcoma (casos nº 1, 4, 6, 8 e 11),

após autorização dos proprietários, realizou-se a necropsia completa com o objetivo

de identificar outras lesões relacionadas ou não a lesão óssea avaliada.

Observaram-se lesões metastáticas em pulmão (100% dos casos) (Figura 5B), rim

(60% dos casos), fígado e pleura (40% dos casos), baço e coração (20% dos casos)

(Figura 4). Em todos os casos, macroscopicamente as lesões eram arredondadas,

com tamanhos variando de 0,2 cm a 3,0 cm de diâmetro, sendo a menor lesão

69

encontrada na pleura parietal e a maior no baço, de aspecto amarelado e

consistência pétrea, inseridas em meio ao tecido normal, conforme observado em

musculatura atrial esquerda. Na microscopia ótica, em todas elas observou-se focos

de notável produção de material osteóide mineralizado e desorganizado entremeado

por células neoplásicas em meio ao tecido normal.

Figura 4: Frequência de órgãos acometidos por metástase nos animais portadores

de osteossarcoma avaliados por meio de necropsia.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

Pulmão Rim Fígado Pleura

Parietal

Baço Coração

70

Figura 5: Fotomacrografia. A: Caso nº 2, canino, osteossarcoma: membro pélvico direito: aumento de volume

em região distal de membro torácico direito (região cárpica) com vasculatura evidente e coloração avermelhada. B: Caso nº 8, canino, osteossarcoma, necropsia: cavidade torácica revelando líquido sanguinolento e coração (asterisco), pulmões (p) e pleura (pl) com focos metastáticos. C: Caso nº 10, canino, osteossarcoma: peça

cirúrgica, membro torácico direito (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e necrose (arco). D: Caso nº 8, canino,

osteossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo (corte transversal): formação tumoral envolvendo diáfise umeral (asterisco) com extensa área de componente extra-ósseo proliferativo e atrofia de musculatura (seta).

A

C

*

*

D

B

p

pl

*

71

Figura 6: Fotomicrografia – Hematoxilina e Eosina. A: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma osteoblástico

produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: material osteóide mineralizado formando trabéculas desorganizadas entremeadas por células neoplásicas. B: Caso nº. 10, canino, osteossarcoma osteoblástico

produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: trabéculas desorganizadas entremeadas por células neoplásicas, revelando anisocitose e nucléolos evidentes C: Caso nº. 7, canino, condrossarcoma: peça cirúrgica,

membro pélvico esquerdo: ilhas de cartilagem neoplásica com tecido conjuntivo ao redor. Observa-se processo de ossificação central da ilha. D: Caso nº 20, canino, fibrossarcoma: peça cirúrgica, mandíbula esquerda: células

fusiformes dispostas em feixe, com moderado pleomorfismo e nucleolação evidente. (A-F – HE; A,C – 40x original; barra: 200 µm; B,D – 400x original; barra: 50 µm)

AA BB

CC DD

72

5.1.5 Avaliação Imuno-Histoquímica

As três proteínas avaliadas por meio da imuno-histoquímica nas células

neoplásicas apresentaram localização citoplasmática, de coloração amarronzada

(Figuras 7A e 7B), embora tenha-se observado marcação perinuclear intensa em

diversas amostras com marcação anti-vimentina e anti-SPARC e em poucos casos

uma aparente marcação nuclear anti-vimentina. Na marcação imuno-histoquímica

contra todas as três proteínas foi possível verificar nos osteossarcomas,

fibrossarcoma e hemangiossarcoma prolongamentos citoplasmáticos marcados. Não

se observou tal fato nos condrossarcomas, que eram constituídos basicamente de

células arredondadas (Figuras 7B e 7F).

Em todas as neoplasias ósseas caninas analisadas, tanto na avaliação da

vimentina quanto da osteocalcina, a marcação foi uniforme (Figuras 7A e 8D),

enquanto que na avaliação de SPARC, observou-se uma marcação granulada

(Figura 8B).

Não foi observado marcação em estroma ou matriz osteóide em nenhuma

amostra das neoplasias ósseas caninas para qualquer um dos anticorpos.

Foram observadas diferenças de intensidade de marcação entre as amostras

das neoplasias ósseas caninas analisadas, para todos os anticorpos (Figuras 7A e

7B). Em muitos casos, dentro de uma mesma amostra, algumas áreas da neoplasia

óssea tiveram intensa marcação enquanto que em outras, isso não foi observado.

Essa observação foi mais frequente nas amostras marcadas pelos anticorpos anti-

vimentina.

Em algumas neoplasias que apresentavam células em mitoses atípicas

(Figura 7F), a intensidade de marcação anti-vimentina nessas células era menos

evidente que nas demais células adjacentes.

A avaliação anti-osteocalcina foi realizada somente nos casos de neoplasias

ósseas nº 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 20, 21 e 22.

A Tabela 2 demonstra o percentual médio de marcação de cada um dos

anticorpos utilizados, sua variação e valores mínimo e máximo nas neoplasias

ósseas caninas analisadas. O percentual de marcação para osteocalcina inclui

somente os osteossarcomas marcados (10 amostras).

73

Tabela 2: Distribuição de valores relativos ao percentual de marcação para

vimentina, SPARC e osteocalcina nos gupos de cães avaliados.

Parâmetros n Média (%) Desvio Padrão Mínimo Máximo

Vimentina 21 87,93 11,77 64,65 100

SPARC 22 98,03 3,37 84,60 100

Osteocalcina* 10 99,91 0,18 99,44 100

n: número de animais. *:somente osteossarcomas.

Em todos os tipos neoplásicos avaliados, a marcação das células avaliados

foi semelhante, não havendo características específicas relativas a algum tipo

tumoral. No entanto, foi possível observar uma intensa (+++) marcação de vasos

sanguíneos em duas amostras de osteossarcoma osteoblástico sendo um produtivo

e um minimamente produtivo, um condrossarcoma e um fibrossarcoma, avaliados

com anticorpos anti-vimentina mas não com anti-SPARC e anti-osteocalcina.

Foi possível observar que, em três casos de osteossarcoma osteoblástico

produtivo, a marcação com anticorpo anti-vimentina apresentou-se mais discreta

(++) quando comparado aos demais, inclusive aos casos de osteossarcoma

minimamente produtivos. Em dois desses casos de osteossarcoma osteoblástico

produtivo, observou-se baixo percentual de marcação positiva com anticorpo anti-

vimentina (65%). Além desses dois casos, com um dos mais baixos percentuais de

positividade para vimentina, há somente um caso de osteossarcoma osteoblástico

minimamente positivo com percentual semelhante.

Somente em um osteossarcoma osteoblástico produtivo não se observou

marcação para vimentina (caso nº 10).

Em todas as amostras de neoplasias ósseas caninas foi observado marcação

do anticorpo anti-SPARC. Neste caso, a marcação se apresentou menos intensa

(++) quando comparado com a marcação do anticorpo anti-vimentina porém com

maior uniformidade entre as amostras de neoplasias ósseas caninas, não sendo

frequentes a visualização de áreas marcadas e não marcadas dentro de uma

mesma amostra. Os percentuais de positividade de marcação do anticorpo anti-

SPARC foram altos sendo o mais baixo deles, 85%, pertencente a um

osteossarcoma osteoblástico produtivo.

Na marcação do anticorpo anti-osteocalcina, foram avaliados 14 casos e

destes, somente em 10 observou-se marcação positiva. Dos quatro casos onde não

74

se observou marcação (-), teve-se dois osteossarcomas osteoblásticos minimamente

produtivos, um osteossarcoma osteoblástico produtivo e um fibrossarcoma (Figura

8F). Destes, somente o osteossarcoma osteoblástico produtivo não apresentava

padrão radiográfico lítico. Observou-se que, na marcação anti-osteocalcina, a

coloração amarronzada apresentou-se consideravelmente mais fraca (+) quando

comparada com a marcação anti-SPARC e ainda mais em relação a anti-vimentina.

Não foi possível observar marcação positiva do anticorpo anti-osteocalcina nas

lacunas ósseas porém em dois osteossarcomas osteoblásticos produtivos,

observou-se marcação pouco mais intensa nos osteoblastos aprisionados nas

lacunas ósseas.

Foi possível observar a relação entre a avaliação imuno-histoquímica e os

achados histopatológicos. Em alguns casos, os achados de marcação de anticorpo

anti-osteocalcina justificam o diagnóstico histopatológico assim como os achados

radiográficos onde observa-se lise óssea, como ocorreu no fibrossarcoma e em

alguns osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo.

75

Figura 7: Fotomicrografias – Marcação imuno-histoquímica anti-vimentina. A: Caso nº. 18, canino, osteossarcoma

osteoblástico minimamente produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: intensa marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos malignos. B: Caso nº. 8, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo: peça de necropsia, membro pélvico esquerdo: moderada marcação citoplasmática (+++) em osteoblastos malignos. C, D e E: Caso nº 7, canino,

condrossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: (C) condrócitos malignos marcados (asterisco) (+++) em transição para formação de cartilagem madura (jogo da velha); (D) marcação de condrócitos em cartilagem madura (+++); (E) marcação em nicho cartilaginoso e em vasculatura periférica intensa (+++). F: Caso nº. 9, canino,

osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo: peça cirúrgica, membro pélvico direito: osteoblasto maligno em divisão celular atípica (detalhe). Observa-se marcação exclusivamente citoplasmática e de menor intensidade nas demais (++) células. (A,B,C,D,F – 400x original; barra: 50 µm; E – 40x original; barra: 200 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer)

AA BB

CC DD

EE FF

*

#

76

Figura 8: Fotomicrografias – Marcação imuno-histoquímica anti-SPARC e anti-osteocalcina. A: Caso nº. 18,

canino, osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo: peça cirúrgica, membro torácico direito: marcação discreta (+) anti-SPARC citoplasmática em osteoblastos malignos. B: Caso nº 20, canino, fibrossarcoma: peça cirúrgica, mandíbula esquerda: marcação acentuada (++) anti-SPARC citoplasmática em células fusiformes. C: Caso nº 7, canino,

condrossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação discreta (+) anti-SPARC em condrócitos malignos. D: Caso nº. 4, canino, osteossarcoma osteoblástico produtivo: peça de necropsia, membro torácico direito:

moderada marcação (++) anti-osteocalcina citoplasmática em osteoblastos malignos. Observa-se célula gigante central. E: Caso nº 7, canino, condrossarcoma: peça cirúrgica, membro pélvico esquerdo: marcação discreta (+) anti-osteocalcina em condrócitos malignos. F: Caso nº 20, canino, fibrossarcoma: peça cirúrgica, mandíbula esquerda:

ausência de marcação (-) anti-osteocalcina em células fusiformes. (A-F – 400x original; barra: 50 µm. Contra-coloração: hematoxilina de Meyer)

AA BB

CC DD

EE FF

6 DISCUSSÃO

Com relação às neoplasias ósseas, na literatura consultada não se tem

relatos quanto a predileção por sexo que possa explicar o número duas vezes maior

de fêmeas em relação aos machos na presente casuística. No entanto, com relação

ao osteossarcoma, Dernell et al. (2007) relatam que os machos são pouco mais

afetados que as fêmeas com exceção das raças Rottweiler, São Bernardo e Dog

Alemão. Dos sete machos avaliados, somente um deles apresentava

condrossarcoma (caso nº 3) enquanto os seis restantes apresentavam

osteossarcoma (casos nº 5, 12, 13, 15, 21 e 22). Em contraste, no grupo de fêmeas,

dos quinze animais avaliados, somente três apresentaram diagnóstico diferente de

osteossarcoma, sendo um fibrossarcoma, um hemangiossarcoma e um

condrossarcoma. Tal observação vai contra os autores previamente citados mas ao

encontro dos achados de Amaral (2008), que relatou um maior número de fêmeas

do que machos acometidas por lesões ósseas neoplásicas ou não. Todos os autores

supracitados relatam ser o osteossarcoma a neoplasia óssea primária mais

frequente.

Dos doze casos de osteossarcoma em fêmeas, observa-se que cinco delas

eram da raça Rottweiler, uma da raça Pastor Alemão, uma da raça Dobermann e

cinco não tinham raça definida. Destes casos, dois animais apresentavam

progenitores sabidamente das raças Labrador, Rottweiler e São Bernardo

respectivamente, todas raças de grande porte. Estes dados vão ao encontro dos

relatos de Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) em que as fêmeas da raça Rottweiler

são mais acometidas pelo osteossarcoma do que os machos, fato semelhante

ocorrendo com a raça São Bernardo. Nesta raça, Dernell et al (2007) admitem que a

78

predisposição para desenvolvimento de osteossarcoma pode ter um componente

hereditário. Recentemente, Thomas et al. (2009) relataram a presença de

desequilíbrios genômicos graves em cães da raça Rottweiler que estão implicados

no desenvolvimento do osteossarcoma nessa raça, independente de sexo ou idade.

Tal achado justifica o elevado número de animais acometidos dessa raça na

amostra e presume que o elevado número de fêmeas da raça Rottweiler acometidas

esteja relacionado a aleatoriedade da amostra, que apresenta quase o dobro de

fêmeas em relação aos machos, e não a uma tendência.

Os animais sem raça definida não formam maioria entre os animais avaliados,

estando a raça Rottweiler em primeiro lugar, com nove exemplares enquanto os

SRD somam seis animais. Além destes dois casos, teve-se cães das raças Husky

Siberiano, Dobermann Pinschers, Boxer, Bulldog Inglês, Pastor Alemão e Golden

Retriever com um representante cada. As raças Rottweiler, Pastor Alemão e

Dobermann Pinscher são largamente citadas como predispostas ao

desenvolvimento de osteossarcoma (DALECK et al., 2006; DERNELL et al., 2007;

AMARAL, 2008; THOMAS et al., 2009; KEALY; MCALLISTER, 2012) ao contrário do

Bulldog e do Husky Siberiano, não comumente citados. Os caninos Husky Siberiano,

Boxer e Golden Retriever podem ser incluídos na lista de animais predispostos, já

que, segundo Ru, Terracini e Glickman (1998), o aumento do peso e principalmente

da altura predispõem o aparecimento do tumor principalmente em membros.

A média de idade dos animais avaliados foi de 8,59 ± 2,92 anos. A média de

idade dos cães com osteossarcoma é bastante semelhante, 8,61 ± 3,16 anos, pouco

acima da média descrita na literatura. Thompson e Pool (2002), Donato et al. (2005),

Daleck et al. (2006), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) relatam ser o

osteossarcoma mais freqüente em cães de meia idade a idosos com pico aos sete

anos. A média de peso dos animais acometidos por lesões ósseas neoplásicas

primárias foi 36,59 ± 11,24 quilos e osteossarcoma foi 37,28 ± 11,0 quilos

respectivamente, sendo este o peso de raças consideradas de grande porte, o que

concorda com as observações de Thompson e Pool (2002), Donato et al. (2005),

Daleck et al. (2006), Dernell et al. (2007), Amaral (2008) e Kealy e Mcallister (2012).

Considerando que a grande maioria das lesões ocorreu em esqueleto

apendicular (90,9%), é de se esperar que a claudicação seja o sinal clínico

predominante, o que também é citado por Erdem e Pead (2000), Lucroy; Peck e

Berry (2001), Mehl et al. (2001), Thompson e Pool (2002), Donato et al. (2005),

79

Hidaka et al. (2006), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008). Dois cães apresentaram

lesão em ossos do esqueleto axial sendo um caso de osteossarcoma em asa ilíaca

direita e um caso de fibrossarcoma em corpo mandibular esquerdo. O canino

portador da lesão neoplásica na asa ilíaca apresentou claudicação, esta

possivelmente devido a extensão do tumor para a musculatura da coxa, interferindo

com a movimentação do membro. Foi possível observar ao corte, nos planos

superficiais, extensa necrose da musculatura adjacente a asa ilíaca afetada que

corrobora tal afirmação. Já a cadela com fibrossarcoma mandibular apresentou

aumento de volume local e discreto comprometimento da apreensão de alimentos.

Todos os cães com neoplasia óssea primária manifestaram dor. Tal fato é

esperado uma vez que no crescimento neoplásico ocorre não só a elevação do

periósteo (KEALY; MCALLISTER, 2012) como muitas vezes há ruptura da cortical

óssea e necrose causando dor extrema.

O aumento de volume regional foi observado em quase todos os cães

portadores de neoplasia óssea podendo ser devido a proliferação de tecido ósseo

associado a algum grau de edema inflamatório ou ainda por interferência na

drenagem venosa principalmente no caso de membros, conforme descrito por

Erdem e Pead (2000), Lucroy; Peck e Berry (2001), Mehl et al. (2001), Donato et al.

(2005), Hidaka et al. (2006), Dernell et al. (2007), Amaral (2008) e Kealy e Mcallister

(2012). Somente uma cadela da raça Rottweiler portadora de osteossarcoma (caso

nº 14) não apresentou aumento de volume local uma vez que as alterações ósseas

eram bem iniciais, não havendo grande proliferação óssea nem componente extra-

ósseo notável.

O emagrecimento foi observado em apenas quatro cães. Sabe-se que a

perda de peso pode ser devido a síndrome paraneoplásica (DERNELL et al., 2007)

ou ainda, derivada de anorexia por dor intensa. Todos os cães nessa situação

apresentaram tempo de lesão acima de 45 dias, o que pode justificar este achado.

Embora trauma seja amplamente associado as neoplasias ósseas (DERNELL

et al., 2007; KEALY; MCALLISTER, 2012) nenhum animal com neoplasia óssea

apresentou histórico prévio.

Somente em uma cadela com neoplasia óssea houve relato de dispnéia no

momento da coleta de material em função do tempo decorrido da neoplasia, cerca

de três meses, ter sido suficiente para o desenvolvimento de lesões metastáticas

observadas à necropsia em pleura parietal e parênquima pulmonar pois não havia

80

imagem radiográfica do mesmo. Dos outros quatro animais, o tempo decorrido

desde a observação da lesão radiográfica sugestiva de neoplasia óssea até a

necropsia foi semelhante e havia lesões metastáticas nos pulmões de tamanhos

similares, porém em número consideravelmente menor, o que pode não ter

interferido tanto na capacidade respiratória destes até o momento da necropsia.

Em todas as neoplasias em esqueleto apendicular, a metáfise foi o local mais

acometido, concordando com os achados de Thompson e Pool (2002), Dernell et al.

(2007), Amaral (2008), Thrall (2010) e Kealy e Mcallister (2012). O elevado

percentual de pacientes portadores de osteossarcoma apendicular assim como a

alta frequência de acometimento de úmero e rádio concordam com os trabalhos de

Thompson e Pool (2002), Dernell et al. (2007), Amaral (2008), Thrall (2010) e Kealy

e Mcallister (2012).

Os dois casos de condrossarcoma localizaram-se em metáfise proximal de

tíbia (Quadro 1) discordando de Thompson e Pool (2002) que citam ter como

localização predominante os ossos chatos. Entretanto, estes mesmos autores

afirmam que a imagem radiográfica nos casos apendiculares é predominantemente

lítica, de baixa radiodensidade, com pouca ou nenhuma reação periosteal,

compatível com as imagens observadas nestes casos.

Todas as neoplasias ósseas foram lesões únicas, o que está de acordo com o

descrito por Thompson e Pool (2002), Dernell et al. (2007) e Amaral (2008) que

relatam serem as lesões de osteossarcomas monostóticas na grande maioria dos

casos.

Os membros torácicos foram mais afetados que os pélvicos, inclusive

considerando-se somente os osteossarcomas apendiculares, concordando com os

relatos de Thompson e Pool (2002) e Dernell et al. (2007) que afirmaram ser os

membros torácicos duas vezes mais afetados que os pélvicos. No entanto, tal

achado é contrário ao relatado por Amaral (2008) que encontrou maior número de

lesões neoplásicas e não-neoplásicas em membros pélvicos do que em membros

torácicos em 20 cães avaliados.

Dos 22 animais portadores de neoplasia óssea, onze realizaram radiografia

de tórax no momento da descoberta da lesão óssea, não havendo imagem sugestiva

de metástase em nenhum caso. Apesar de não se observar radiograficamente

indícios de metástase, em dois animais (casos nº 1 e 12) observou-se nódulos tanto

na macro como na microscopia. Além deste, outros três animais (casos nº 4,6 e 8)

81

que não tiveram o tórax radiografado apresentavam nódulos metastáticos em

pulmão à necropsia e contrariamente a descrição de Kealy e McAllister (2012),

apresentavam dimensões pequenas, da ordem de milímetros enquanto as

metástases “em bala de canhão”, da ordem de centímetros, são consideradas

diretamente relacionadas com osteossarcoma. Recentemente, Eberle et al. (2011)

observaram que a detecção de metástases pulmonares em cães com

osteossarcoma apendicular é significativamente maior quando examinada através

da tomografia computadorizada em comparação com radiografias, comprovado

através da avaliação macroscópica. Tal observação reforça o fato de a grande

maioria dos cães terem desenvolvido doença metastática pulmonar embora esta não

tivesse sido detectada no momento do diagnóstico ósseo. Provavelmente, as lesões

já estavam presentes no parênquima pulmonar embora não tivessem tamanho

suficiente para imprimir imagem no filme radiográfico. É sabido que a tomografia

computadorizada é uma técnica mais acurada que a radiografia. Apesar disso,

Waters et al. (1998) afirmam que lesões pulmonares abaixo de 1 mm de diâmetro

não são detectadas pela tomografia helicoidal.

Segundo Amaral (2008), Thrall (2010) e Kealy e McAllister (2012), as lesões

neoplásicas apresentam heterogeneicidade, ora com predomínio lítico ora

esclerótico. Das lesões radiográficas consideradas mistas, cinco foram

diagnosticadas como osteossarcomas sendo quatro osteossarcomas osteoblásticos

produtivos e um osteossarcomas osteoblásticos minimamente produtivos. Um

condrossarcoma apresentou padrão misto. Naquelas com predomínio esclerótico,

quatro eram osteossarcoma osteoblástico produtivo. Lesões com predomínio lítico

incluíram um condrossarcoma, o hemangiossarcoma, o fibrossarcoma e nove

osteossarcomas sendo quatro subclassificado como osteoblástico produtivo e cinco

como não produtivo. Segundo Thompson e Pool (2002), o padrão misto não está

associado ao osteossarcoma osteoblástico minimamente produtivo, diferente ao

observado no presente trabalho.

É interessante ressaltar que todos os quatro osteossarcomas com padrão

radiográfico esclerótico foram subclassificados como osteoblásticos produtivos. Isto

é esperado uma vez que a produção de material osteóide é franca, o que gera uma

imagem radiográfica de produção óssea. Já os subtipos minimamente produtivos

apresentaram somente padrão radiográfico misto ou lítico.

82

De forma semelhante, era de se esperar que o fibrossarcoma (Figura 2A) e o

hemangiossarcoma apresentassem padrão radiográfico lítico uma vez que são

neoplasias que não produzem material osteóide ou osso e são caracterizadas pela

substituição do tecido ósseo sadio pelas células neoplásicas fibroblásticas e

vasculares (SLAYTER et al., 1994; FLETCHER; UNNI; MERTENS, 2002;

THOMPSON; POOL, 2002).

Três osteossarcomas apresentaram fratura patológica associada a imagem

radiográfica sendo dois deles com padrão radiográfico lítico e um misto. Este fato é

esperado uma vez que nestes dois padrões, observa-se perda de integridade de

cortical óssea levando ao enfraquecimento e consequente fratura do osso (KEALY;

MCALLISTER, 2012). Nenhuma das neoplasias classificadas radiograficamente

como esclerótica, onde há aumento da proliferação óssea, apresentaram fratura

patológica, o que pode estar relacionado ao aumento da ddensidade óssea local.

Em cinco neoplasias observou-se a formação de componente extra-ósseo,

isto é, uma proliferação tumoral que se expande para fora do limite do osso (AHRAR

et al., 2004). O componente extra-ósseo foi observado em quatro osteossarcomas e

no fibrossarcoma, em todos os três padrões radiográficos.

As metáfises foram as áreas atingidas na maioria dos casos, excetuando-se

as lesões da escápula e do esqueleto axial. Algumas lesões muitas vezes se

estenderam para a epífise e o terço diafisário distal e médio. Tal achado vai ao

encontro aos relatos de Thompson e Pool (2002), Dernell et al. (2007), Amaral

(2008), Thrall (2010) e Kealy e McAllister (2012).

Todas as formas de coleta forneceram material diagnóstico, semelhante ao

descrito por Amaral (2008).

Vale ressaltar que, ao contrário do que acontece em pacientes humanos, a

anestesia geral é sempre recomendada não apenas para contenção do paciente

veterinário durante o procedimento, mas principalmente pelo conforto e analgesia

segundo orientação do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

Assim sendo, em medicina veterinária, seja na biópsia fechada ou na aberta, a

obrigatoriedade do emprego da anestesia geral pode ser considerada uma

desvantagem devido aos riscos anestésicos e aumento do custo de realização do

exame, diferente do que ocorre em medicina conforme citado por Logan et al.

(1996), Pramesh et al. (2001) e Jelinek et al. (2002).

83

A maioria dos trabalhos consultados relata ser o pulmão o local mais atingido

por metástases, semelhante aos achados deste estudo, onde o pulmão foi o órgão

mais atingido por metástases, presentes em 100% dos casos avaliados na

necropsia. No entanto, com relação aos demais órgãos, não há dados de frequência

relatados (DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008; KEALY; MCALLISTER, 2012).

A ocorrência de metástase principalmente nos casos de osteossarcoma é um

importante fator a ser considerado. Nenhum cão apresentou lesão pulmonar

radiograficamente visível no momento do diagnóstico radiográfico da lesão óssea,

porém quatro animais biopsiados e sem a peça para comparação evoluiram para

quadros graves de metástase pulmonar alguns meses após o diagnóstico ósseo.

Isso reforça a importância do acompanhamento clínico em casos onde a biópsia foi

inconclusiva ou não foi capaz de identificar o exato tipo tumoral.

Todas as marcações encontradas para os três anticorpos foram

citoplasmáticas, o que concorda com avaliações semelhantes em Medicina

(VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994; PARK et al.,

1995; YAN; SAGE, 1999; SATELLI; LI, 2011).

Em relação aos achados de marcação anti-vimentina, segundo Minin e

Moldaver (2008), a formação da rede de filamentos intermediários começa próxima

ao núcleo e já foi demonstrado que filamentos de vimentina podem se mover no

citoplasma em direção ao núcleo ou a membrana plasmática. Ainda, já foi

demonstrado a presença da proteína no núcleo. Isso concorda com o observado na

leitura de praticamente todas as lâminas de vimentina, onde havia marcação

perinuclear notável e eventualmente nuclear mesmo que neste último caso, ainda

não se saiba exatamente a função dela (SATELLI; LI, 2011).

Observou-se diferença na intensidade de marcação anti-vimentina entre as

lâminas avaliadas. Tal achado apresenta algumas possibilidades de ocorrência. A

primeira delas seria a diferença quantitativa na expressão de vimentina entre os

tipos celulares avaliados. Sabe-se que a vimentina é superexpressa em diversos

tipos celulares tumorais e está diretamente implicada na transformação epitelial-

mesenquimal (LI et al, 2010; MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; PAN et al.,

2010; SATELLI; LI, 2011). As neoplasias avaliadas foram todas de origem

mesenquimal. Assim sendo, é possível que, durante a carcinogênese, o gene da

vimentina sofra alterações que levem a uma superexpressão da mesma. Observou-

se diferenças de intensidade de marcação e até mesmo ausência desta dentro de

84

uma mesma amostra. Em muitos casos não se observou marcação anti-vimentina

em áreas que continham células neoplásicas. A ausência de marcação dentro de um

mesmo corte pode ser explicada pela maior ou menor expressão da proteína entre

as diferentes células.

Seria esperado também que células anaplásicas apresentassem menor

intensidade de marcação pela proteína indicando perda de semelhança com a célula

original, entretanto isso não foi observado. Algumas neoplasias mais bem

diferenciadas, com produção marcante de matriz osteóide tiveram menor

intensidade de marcação anti-vimentina assim como o percentual de positividade.

Esse foi o caso de dois osteossarcomas osteoblásticos produtivos. A produção de

osteóide é característica dos osteoblastos e nos osteossarcomas osteoblásticos

produtivos, ela se mantém, o que indica uma proximidade maior com as funções

originais da célula quando comparado com os minimamente produtivos (CHEN et al.,

2011). Assim sendo, é possível que, nos osteossarcomas caninos, o aumento da

expressão de vimentina esteja relacionado a fenótipos tumorais mais agressivos,

mais anaplásicos e menos semelhantes às células originais, e portanto a menor

expressão de vimentina nestas neoplasias pode ser justificada como algo positivo

em termos de prognóstico.

A segunda possibilidade para uma redução na intensidade de marcação seria

a interferência dos processos de fixação e descalcificação que alguns cortes

sofreram principalmente em se tratando de regiões mais internas do corte onde a

fixação pode não ser tão eficiente ou demorar mais a acontecer (DE MATOS et al.,

2010; LEONG; COOPER; LEONG, 2010). Apesar disso, houve cortes do mesmo

animal, fixados e descalcificados da mesma forma que tiveram intensidade de

marcação diferente, não justificando a interferência desses fatores, pelo menos não

neste caso. Entretanto, é possível que a não marcação do anticorpo anti-vimentina

observada no caso nº 10 esteja relacionada a estes fatores.

Nos casos de mitoses atípicas, a marcação do anticorpo anti-vimentina foi

mais suave em várias lâminas. Duas explicações são possíveis. A primeira é que

durante a mitose, a relação núcleo:citoplasma se altera e com isso, a porção

citoplasmática tornaria-se menos visível à microscopia, daí a marcação menos

evidente. Outra possibilidade é que, durante a mitose das células neoplásicas, a

expressão de vimentina seja reduzida em detrimento a outros tipos de proteínas de

citoesqueleto mais necessárias ao evento com por exemplo, os microtúbulos.

85

Autores relacionam a superexpressão da vimentina com a motilidade e a

invasão celular e consequentemente sua implicação nas metástases (LI et al, 2010;

MENDEZ; KOJIMA; GOLDMAN, 2010; SCHOUMACHER et al., 2010; SATELLI; LI,

2011). Essa relação pode ser verdadeira também nas neoplasias caninas,

especialmente os osteossarcomas. Nestas neoplasias, o percentual de pacientes

que apresentam metástases pulmonares radiograficamente detectáveis no momento

do diagnóstico é baixo, no entanto, a maioria deles vem a óbito ou são eutanasiados

devido a elas (THOMPSON; POOL, 2002, LOUKOPOULOS; THORNTON;

ROBINSON, 2003; DONATO et al., 2005; DERNELL et al., 2007; AMARAL, 2008;

KIRPENSTEIJN et al, 2008; BHANDAL; BOSTON, 2011; EBERLE et al., 2011).

No presente estudo e em estudos anteriores (AMARAL, 2008), observou-se a

presença de micrometástases pulmonares em um pequeno número de pacientes

portadores de osteossarcoma e eutanasiados em intervalo menor que um mês após

o diagnóstico da lesão apendicular. Essa observação suporta a idéia de que a

disseminação tumoral ocorre logo nos primários estágios da doença, mesmo quando

a lesão óssea ainda é discreta e não há sinais pulmonares, semelhante ao

observado por Barger et. al (2005) que relata um percentual de aproximadamente

90% de cães acometidos por micrometástases no momento do diagnóstico. É

possível que a vimentina, estando superexpressa nessas células, impulsione a

capacidade que elas tem de motilidade e invasão. Caso essa capacidade consiga

ser demonstrada nos osteossarcoma caninos, a utilização de drogas anti-vimentina

poderiam alterar e auxiliar consideravelmente o prognóstico dessas neoplasias em

cães.

Outra observação importante é a identificação de células endoteliais

marcadas com anticorpo anti-vimentina. Sabe-se que estas células normalmente

expressam vimentina (MININ; MOLDAVER, 2008; SATELLI; LI, 2011). Neste caso,

essa marcação pode ser importante na avaliação da vasculatura tumoral. O aumento

da vasculatura pode estar diretamente implicado na possibilidade de disseminação

metastática por via hematógena. Vasculatura evidente foi observada em quatro

casos, sendo dois osteossarcomas, um condrossarcoma e um fibrossarcoma. Com

exceção do canino portador do fibrossarcoma, sobre o qual não se tem essa

informação, os outros três animais desenvolveram metástases. Sabe-se que as

neoplasias malignas tem a capacidade de induzir a neoangiogênese não apenas

para suprimento da massa tumoral mas também para disseminação (THOMPSON;

86

POOL, 2002; DERNELL et al., 2007). É importante ressaltar que a visualização dos

vasos se deu em peças de necropsia e amputação e que sua identificação pode não

ser possível em amostras de biópsia devido ao tamanho das mesmas. A utilização

de anticorpos anti-vimentina para identificação de neoplasias mesenquiais pode

também fornecer informação a respeito da vasculatura tumoral como função

adicional.

Todas as amostras apresentaram marcação positiva para o anticorpo anti-

SPARC de aparência granular, conforme previamente descrito (YAN; SAGE, 1999).

A SPARC é encontrada em osteoblastos ativos e osteócitos jovens normais (YAN;

SAGE, 1999; HOENERHOFF et al., 2004; CHLENSKI; COHN, 2010) e sua

expressão é maior em células neoplásicas na maioria dos casos, apesar de não ser

exclusiva dos osteossarcomas (SCHULZ et al., 1988; GRUNDMANN et al., 1995;

PORTER et al., 1995; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010), o que concorda

com os resultados aqui observados.

O percentual de positividade encontrado nas neoplasias avaliadas foi

semelhante aos relatos de literatura médica, principalmente em relação ao

osteossarcoma (FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004), confirmando

sua alta sensibilidade.

O envolvimento da SPARC em eventos celulares como inibição do

espalhamento celular, estímulo a síntese de metaloproteinases que degradam

membrana basal e neoangiogênese (PORTER et al., 1995; FANBURG et al., 1997;

YAN; SAGE, 1999; DELANY et al., 2003; HOENERHOFF et al., 2004; McKNIGHT et

al., 2006; TAI; TANG, 2008; CHLENSKI; COHN, 2010) a correlacionam com a

invasão tecidual por céulas neoplásicas, ou seja, as metástases. Com isso, a

imunorreatividade positiva desta proteína em neoplasias ósseas caninas pode ter

implicação prognóstica negativa, semelhante ao observado em humanos.

Apesar de presente em todas as amostras, a marcação anti-SPARC se

apresentou menos intensa quando comparado com a marcação anti-vimentina

porém com maior uniformidade entre as amostras, não sendo frequentes a

observação de áreas marcadas e não marcadas dentro de uma mesma amostra. Os

percentuais de positividade foram altos sendo o mais baixo deles, quase 85%,

pertencente a um osteossarcoma osteoblástico produtivo.

Não foi possível identificar a razão da fraca marcação do anticorpo anti-

osteocalcina. Alguns autores relatam que, o processo de osmificação após a

87

revelação produz uma cor marrom enegrecido mais marcante e efeito semelhante

pode ser atingido após tratamento com sulfato de níquel ou cloreto de cobalto

(LEONG; COOPER; LEONG, 2010). É provável que tal procedimento produzisse

uma melhor marcação pelos anticorpos anti-osteocalcina e aprimorasse a

observação.

Os percentuais de positividade do anticorpo anti-osteocalcina nas amostras

positivas foi extremamente alto entretanto, a marcação não ocorreu em todas as

amostras avaliadas. Isso pode estar relacionado aos processos de descalcificação,

uma vez que a fixação tem pouca influência sobre a imunorreatividade da

osteocalcina (VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; INGRAM et al., 1994;

PULLIG et al., 2000). Outra possibilidade para a fraca marcação ou ausência desta

pode estar relacionada a própria expressão da proteína nos osteossarcomas, que é

relatada como sendo baixa naqueles que se originam de osteoblastos (CHEN et al.,

2012). Entretanto, destes casos, a ausência de marcação no fibrossarcoma era

esperada uma vez que esta neoplasia não se caracteriza pela produção desta

proteína, sendo muitas vezes considerada exclusiva dos osteossarcomas

(GRUNDMANN et al., 1995; FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004). A

identificação dessa proteína pode ser importante na diferenciação entre o

fibrossarcoma e o osteossarcoma fibroblástico uma vez que, apesar da semelhança

histopatológica, principalmente em amostras de biópsia, somente o segundo produz

a osteocalcina (GRUNDMANN et al., 1995; FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF

et al., 2004).

Outra colocação importante é que, das três amostras de osteossarcoma que

não apresentaram marcação positiva, duas eram do tipo osteoblástico minimamente

produtivo, coerente com o padrão radiográfico lítico. Estas amostras são

caracterizadas pela mínima produção de material osteíde e não apresentam lacunas

mineralizadas. Sendo a osteocalcina uma proteína sintetizada conforme a

mineralização ocorre (PARK et al., 1995, CHEN et al., 2011; CHEN et al., 2012),

seria esperado que este subtipo tumoral não apresentasse marcação para

osteocalcina. No entanto, sua especificidade para neoplasias formadoras de tecido

ósseo é citada como de 100%, mesmo em amostras sem evidências de tecido ósseo

(FANBURG et al., 1997; HOENERHOFF et al., 2004) o que traz uma oposição

interessante.

88

O percentual de positividade encontrado (99,9%) nos osteossarcomas

caninos foi acima dos observados em osteossarcomas humanos cuja a ausência de

marcação nestes casos seja devido a osteossarcomas de células pequenas

(VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989; PARK et al., 1995; FANBURG et al.,

1997), um subtipo raramente encontrado em osteossarcomas caninos. No presente

estudo, a ausência de marcação foi observada em osteossarcomas osteoblásticos,

semelhante ao citado por Chen et al. (2012).

Sabe-se que agentes descalcificadores como o EDTA podem reduzir

consideravelmente o percentual de imunorreatividade da osteocalcina

(VERMEULEN; VERMEER; BOSMAN, 1989) porém, este não foi usado nos casos

onde não foi detectada marcação. .

Mesmo sendo passível de detecção nas lacunas ósseas (VERMEULEN;

VERMEER; BOSMAN, 1989; PARK et al., 1995), não se observou marcação positiva

para o anticorpo anti-osteocalcina nas lacunas ósseas das amostras avaliadas.

Porém, observou-se marcação pouco mais intensa nos osteoblastos aprisionados

nas lacunas ósseas, em dois osteossarcomas osteoblásticos produtivos. Tal

observação pode estar relacionada ao processo de mineralização e deposição de

hidroxiapatita nestes locais.

Condrócitos normais não apresentam marcação para osteocalcina (PARK et

al., 1995) assim como condrócitos neoplásicos (FANBURG et al., 1997;

HOENERHOFF et al., 2004). Ainda assim, observou-se marcação positiva no

condrossarcoma avaliado (caso nº 7). O mesmo apresentava alguns nichos com

centros de ossificação, o que pode justificar a presença desta proteína.

7 CONCLUSÃO

As fêmeas caninas foram mais afetadas por neoplasias ósseas que os

machos.

A raça Rottweiler apresentou o maior número de cães acometidos por

neoplasias ósseas.

Os animais acometidos por neoplasias ósseas primárias apresentaram faixa

de idade acima de sete anos e foram de porte grande a gigante.

A claudicação associada a dor e o aumento de volume foram os sinais

clínicos mais freqüentemente observados em caninos com lesão óssea

apendicular.

A maioria das neoplasias ósseas ocorreu em esqueleto apendicular e os

ossos com maior freqüência de lesão foram úmero e rádio, sendo a região

metafisária a mais acometida.

A maioria das lesões ósseas foram monostóticas.

O padrão radiográfico mais frequente nas neoplasias ósseas primárias foi o

misto.

Dos animais com neoplasia óssea primária que realizaram radiografia torácica

no momento do diagnóstico da lesão óssea, nenhum deles apresentou

imagem metastática, caracterizando o método como inadequado para

identificação precoce de metástases.

O osteossarcoma foi a neoplasia óssea mais frequentemente encontrada,

seguida do condrossarcoma.

A maioria dos animais desenvolveu metástases pulmonares posteriormente,

sendo este o principal motivo da indicação da eutanásia.

90

A imunorreatividade da vimentina, SPARC e osteocalcina nas neoplasias

ósseas caninas foi alta, semelhante ao observado em neoplasias ósseas

humanas.

A marcação positiva dos anticorpos anti-vimentina e anti-SPARC pode ter

implicação prognóstica nas neoplasias ósseas caninas, sendo o prognóstico

desfavorável em casos de imunorreatividade alta e vice-versa.

A identificação da osteocalcina auxilia no diagnóstico definitivo.

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9 ANEXOS

100

9.1 Autorização para posse de cadáver canino.

AUTORIZAÇÃO

Eu, ______________________________________________________,

identidade nº ________________________, expedida por _______________,

CPF _______________________, residindo em ________________________

_______________________________________________________________,

telefone _______________, proprietário do animal ______________________, da

espécie _____________________, da raça _____________________, pelagem

________________________, porte ____________________, idade

________________ e sexo __________________, autorizo a médica veterinária

Camila Barbosa Amaral (CRMV-RJ 7661) a obter a posse do CORPO do animal

acima citado para experimentação científica de sua inteira responsabilidade e

utilização em aula prática, nada podendo contestar a respeito posteriormente.

Rio de Janeiro, / / .

_________________________________________

Assinatura do Proprietário

101

9.2 Autorização para realização de procedimento em canino.

AUTORIZAÇÃO

Eu, ______________________________________________________,

identidade nº ________________________, expedida por _______________,

CPF _______________________, residindo em ________________________

_______________________________________________________________,

telefone _______________, proprietário do animal ______________________, da

espécie _____________________, da raça _____________________, pelagem

________________________, porte ____________________, idade

________________ e sexo __________________, autorizo a médica veterinária

Camila Barbosa Amaral (CRMV-RJ 7661) a realizar o procedimento

_______________________________________________________________

do animal acima citado, tendo sido esclarecido dos riscos anestésicos e do

procedimento, nada podendo contestar a respeito posteriormente.

Rio de Janeiro, / / .

_________________________________________

Assinatura do Proprietário

102

9.3 Certificado do Comitê de Ética no Uso de Animais da UFF.