Avaliação de fármacos fotossensíveis derivados da … de Pós-Graduação em Química...

Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Química

Programa de Pós-Graduação em Química

“Avaliação de fármacos fotossensíveis derivados da cloro alumínio

ftalocianina no tratamento da progressão tumoral em modelo de

matriz tridimensional mista”

Versão Corrigida

Priscila da Costa Carvalho de Jesus

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de

São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do

título de Mestre em Ciências, Área: Química

RIBEIRÃO PRETO -SP

2012

Universidade de São Paulo

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

Departamento de Química

Programa de Pós-Graduação em Química

“Avaliação de fármacos fotossensíveis derivados da cloro alumínio


matriz tridimensional mista”

Versão Corrigida

Priscila da Costa Carvalho de Jesus

Dissertação apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de

São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do

título de Mestre em Ciências.

Área de conentração: Química

Orientador: Prof. Dr. Antonio Claudio Tedesco

RIBEIRÃO PRETO -SP

2012

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. A versão

original encontra-se disponível na Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto.

FICHA CATALOGRÁFICA

Jesus, Priscila da Costa Carvalho

Avaliação de fármacos fotossensíveis derivados da cloro alumínio


matriz tridimensional mista.

Ribeirão Preto, 2012.

85 f.; 30cm.

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências

e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área: Química.

Orientador: Tedesco, Antonio Claudio

1. Ftalocianina. 2. Progressão tumoral. 3. Pele.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome do aluno: Priscila da Costa Carvalho de Jesus

Título do trabalho: Avaliação de fármacos fotossensíveis derivados da cloro alumínio

ftalocianina no tratamento da progressão tumoral em modelo de matriz tridimensional mista.

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Química para

obtenção do Título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Química

Orientador: Prof. Dr. Antonio Claudio Tedesco

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição: _____________________________ Assinatura: __________________________

Prof. Dr. ___________________________________________________________________


Prof. Dr. ___________________________________________________________________


Aos que acreditam e persistem nas suas ideias.

Agradecimentos

Aos meus pais Silvana e José Ernesto e ao meu irmão Pedro Henrique por me apoiarem

incondicionalmente, dando não somente todo o suporte necessário para que eu pudesse viver

de estudar, mas também para que eu pudesse aproveitar essa vivência com todo conforto e

carinho.

Ao meu orientador Prof. Dr. Antonio Claudio Tedesco por sempre me guiar e dedicar o seu

tempo e sua atenção para a minha formação.

Aos amigos e amigas ICs, mestrandos, doutorandos, pós-doutorandos e outros membros do

Laboratório de Fotobiologia e Fotomedicina por estarem presentes no dia-a-dia e também nas

festividades, compartilhando vivências, conhecimentos e também momentos de alegria.

Agradeço especialmente à Olímpia por sempre ajudar em tudo que foi preciso e pela alegria

contagiante.

Às companheiras de experimento Sabrina e Dani Jardim, cuja ajuda, paciência e

companheirismo, dentro e fora do laboratório, foram imprescindíveis para a realização deste

trabalho.

À recém Profa. Dra. Andreza Simioni e ao Dr. Fernando Lucas Primo pelo apoio e paciência

em repassar seus conhecimentos sobre diversas técnicas, sem as quais não seria possível a

realização deste trabalho.

À técnica Vani Maria Alves do Laboratório de Histologia do Departamento de Biologia

Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

pelo excelente trabalho realizado e pela amizade.

Ao Prof. Dr. Herenilton Paulino Oliveira e à Dra. Aline Bolsoni por me proporcionarem toda

bagagem científica durante os anos de Iniciação Científica e também pelo incentivo para que

tudo isso se realizasse.

Aos amigos e amigas companheiros de faculdade, de almoços, de churrascos e de todas as

horas, aos amigos de longa e “pouca” data, agradeço a cada um pessoalmente por sempre

terem me acompanhado na minha jornada.

A todos os meus familiares.

À Universidade de São Paulo e à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto

por todo auxílio durante o curso de mestrado.

À Capes e ao CNPq pela concessão da bolsa de mestrado (148010/2010-5) e pelo suporte

financeiro para que a realização dessa pesquisa se tornasse viável.

“Querem que vos ensine o modo de

chegar à ciência verdadeira? Aquilo

que se sabe, saber que se sabe;

aquilo que não se sabe, saber que

não se sabe; na verdade é este o

saber.”

Confúcio

i

RESUMO

JESUS, P. C. C. Avaliação de fármacos fotossensíveis derivados da cloro alumínio

ftalocianina no tratamento da progressão tumoral em modelo de matriz tridimensional

mista. 2012. 85 f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de

Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.

O processo de cicatrização cutânea pode ser favorecido pela aplicação de laser de baixa

potência, sendo a matriz de colágeno e elastina um substituto dérmico no tratamento de

feridas descrita como um sistema adequado na engenharia tecidual em sistemas

tridimensionais da pele. Com este intuito, foi elaborado um estudo utilizando o sistema

nanoemulsão contendo cloro alumínio ftalocianina (ClAlPc) como o agente

fotossensibilizante em biópsias de explants de pele de pacientes saudáveis irradiadas por luz

proveniente de laser de baixa potência, visando estabelecer a melhor dose de luz para a

bioestimulação de colágeno tipo I e elastina neste tecido. O sistema de liberação de fármacos

foi sintetizado utilizando protocolos já conhecidos, cujas propriedades fotoquímicas e

fotofísicas foram confirmadas por espectrofotometria de absorção e fluorescência, além de

estudos de estabilidade medindo-se o tamanho das partículas, potencial Zeta e índice de

polidispersão. Uma vez caracterizado este sistema e conhecendo-se a sua faixa de absorção,

elaborou-se um protocolo para avaliar a ação do fármaco nos principais componentes da

matriz extracelular, como colágeno e elastina, e a sua ação combinada com luz laser de baixa

potência em três doses conhecidas distintas: 70, 140 e 700 mJ/cm2. Foi avaliada também a

ação somente da irradiação sobre as biópsias, nas mesmas doses, podendo-se assim observar

os seus efeitos. As estruturas morfológicas da pele foram estudadas por histologia, e

posteriormente foram comparadas quantitativamente as porções de colágeno e elastina da pele

tratada e irradiada com as amostras do controle, as quais não receberam nenhum tipo de

tratamento. Tanto a análise para colágeno tipo I quanto a análise para elastina apontaram um

aumento de quase 20% em relação às amostras não tratadas, utilizando a dose intermediária

de 140 mJ/cm2 nas amostras tratadas com o fármaco de ftalocianina, durante um período de

14 dias após a irradiação. Este efeito foi bastante significativo, ao ser comparado com a ação

somente da irradiação, que apresentou desempenho inferior. Outra técnica explorada neste

trabalho e utilizada na detecção da expressão das enzimas MMP-2 e MMP-9, participantes do

processo cicatricial, foi a zimografia de gelatina, utilizando o meio de cultivo de cada

amostra. As bandas relacionadas à degradação da gelatina para cada amostra no zimograma

foram quantificadas e os níveis de expressão de MMP-2 e MMP-9 comparados. Os resultados

obtidos confirmaram a análise histológica, apontando um maior nível de expressão dessas

enzimas nos grupos tratados com o fármaco fotossensibilizante e luz na dose intermediária

(140 mJ/cm2) sendo esta combinação a mais promissora para um estudo mais aprofundado.

Palavras chave: Ftalocianina; progressão tumoral; bioestimulação; colágeno; pele.

ii

ABSTRACT

JESUS, P. C. C. Evaluation of photosensitizers aluminum chloride phthalocyanine

derivatives in the treatment of tumor progression in three-dimensional matrix. 2012. 85

f. Dissertation (Master). Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto –

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.

Wound healing process can be favored by Low Level Laser Therapy, with the collagen

and elastin matrix a dermic substitute described as an appropriate system in tissue engineering

and in tridimensional skin systems. With this purpose, a study was elaborated using the

system nanoemulsion of aluminium-chloride phthalocyanine (ClAlPc) as photosensitizer in

skin biopsies obtained after plastic surgery and irradiated by a low level laser, to establish the

most appropriate dose of light for biostimulation of type I collagen and elastin fibers. The

drug delivering system was synthesized using a well-known protocol and its photophysical

and photochemical properties were confirmed by absorption and fluorescence

spectrophotometry, besides stability studies measuring particle size, zeta potential and

polidispersion index. Once characterized this system and known its absorption range in the

UV-Vis region of light spectrum, a protocol was elaborated for evaluating the effect of the

photosensitizer direct into extracellular matrix components, collagen and elastin, and the

combined effect with low level laser therapy using three different doses: 70, 140 and 700

mJ/cm2. Also, only the effect of irradiation was evaluated using the same doses.

Morphological structures of the skin were analyzed by histology, and portions of collagen and

elastin of skin biopsies after the photosensitizer and light treatment were quantified and

compared to the non-treated samples. The analysis for type I collagen and elastin pointed an

increase of more than 20% compared to the non-treated samples, for the samples treated with

the combination phosensitizer/light140 mJ/cm2 after 14 days of treatment. This effect was

significant when compared to the effect of the irradiation only. Another technique was used in

this work to detect the expression of MMP-2 and MMP-9, participant enzymes in various

processes including tumoral progression and wound healing. Samples of biopsies culture

medium were collected and analyzed by gelatin zymography, the bands related to gelatin

degradation were quantified and MMP-2 and MMP-9 expression levels compared. The

obtained results confirmed histological analysis, pointing a higher expression level of these

enzymes for the group treated with the photosensitizer and the intermediate dose of light (140

mJ/cm2), leading to a promising combination of treatment for future studies.

Key words: Phthalocyanine; nanoemulsion; biostimulation; collagen; skin.

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estruturas moleculares de alguns agentes fotossensibilizantes aprovados

clinicamente ou em andamento ................................................................................................ 10

Figura 2. Estrutura molecular da ftalocianina ......................................................................... 12

Figura 3. Esquema das camadas da pele e estruturas anexas .................................................. 17

Figura 4. Janela óptica no tecido. Espectros de absorção de importantes cromóforos do

tecido, como água, oxi e desoxihemoglobina e melanina, plotados em escala logarítmica. .... 18

Figura 5. Representação esquemática das camadas da pele e as suas propriedades ópticas.

As setas indicam o caminho da luz pelos tecidos da pele. ....................................................... 18

Figura 6. Propagação da luz pelos tecidos .............................................................................. 20

Figura 7. Corte da pele com o instrumento punch, evidenciando as suas três camadas:

epiderme, derme e hipoderme. ................................................................................................. 34

Figura 8. Principais etapas do experimento com biópsias de explants de pele: A)

Fragmento de pele humana mantido em meio DMEM para realização do corte das

biópsias; B) Biópsias de pele cortadas utilizando o punch e mantidas em meio DMEM; C)

Placas de Petri contendo o gel de colágeno e as biópsias de pele; D) Irradição das placas

com laser de 670 nm após tratamento com cloro alumínio ftalocianina. ................................. 37

Figura 9. Marcação (verde) da rede de elastina (vermelho) de uma amostra de imagem,

utilizando o software AxioVision Release 4.8.2 da Carl Zeiss acoplado ao microscópio

óptico. ....................................................................................................................................... 39

Figura 10. Etapas do processo de zimografia: A) Montagem dos géis; B) Amostras

aplicadas no gel inserido na cuba de corrida; C) Revelação dos géis com solução de Azul

de Coomassie; D) Gel finalizado.. ............................................................................................ 43

Figura 11. A) Imagem obtida de um gel de zimografia utilizando-se o sistema de

aquisição de imagens com câmara ultravioleta; B) Imagem com inversão de pixels. ............. 44

iv

Figura 12. Estudo de estabilidade físico-química monitorando-se o tamanho médio das

gotículas, o índice de polidispersão (A) e o potencial Zeta (B) em função do tempo para a

nanoemulsão contendo ClAlPc. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão ... 47

Figura 13. (A) Espectro de absorção na região do UV-Vis da solução de ClAlPc em

acetonitrila, (B) Curva de calibração da ClAlPc em acetonitrila, Absorbância = 0.3829 X

[ClAlPc, concentração em μg mL−1

] + 0.0126 (R = 0,9992) (SIQUEIRA-MOURA et al.,

2010) e (C) Espectro de fluorescência da solução de ClAlPc em acetonitrila (SIQUEIRA-

MOURA et al., 2010). .............................................................................................................. 49

Figura 14. Análise histológica da biópsia de explant de pele sem tratamento (controle) e

corada com Orceína, evidenciando as camadas da pele: epiderme e derme... ......................... 51

Figura 15. Molécula de Orceína... ........................................................................................... 52

Figura 16. Comparação entre as porcentagens de área de elastina das biópsias de pele

irradiadas por laser de diodo (670 nm) em diferentes doses de 70, 140 e 700 mJ/cm2 e

incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias; B) 14 dias. Os resultados são expressos

como média ± desvio padrão, sendo *** (P < 0,001), ** (P < 0,01) e * (P < 0,05)

estatisticamente significativos. ................................................................................................. 54


tratadas com a nanoemulsão contendo ClAlPc, irradiadas por laser de diodo (670 nm) em

diferentes doses de 70, 140 e 700 mJ/cm2 e incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias;

B) 14 dias. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão, sendo ***

(P < 0,001) estatisticamente significativos.. ............................................................................ 55

Figura 18. Molécula Direct Red 80 (Sirius Red, Picrosirius Red)... ....................................... 56

Figura 19. Rota biosintética para formação de fibras de colágeno tipo I, principal

componente estrutural da pele. ................................................................................................. 57

Figura 20. Análise histológica das biópsias de pele tratadas com ClAlPc, irradiadas pr

laser de diodo (670 nm) em diferentes doses, coradas por Picrosirius Red e visualizadas

por microscopia de campo claro (objetiva de 20x). A primeira sessão apresenta as

amostras tratadas por 7 dias e a segunda apresenta as amostras tratadas por 14 dias após a

irradiação. ................................................................................................................................. 58

v

Figura 21. Comparação entre as porcentagens de área de colágeno tipo I das biópsias de

pele irradiadas por laser de diodo (670 nm) em diferentes doses de 70, 140 e 700 mJ/cm2 e

incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias; B) 14 dias. Os resultados são expressos

como média ± desvio padrão, sendo * (P <0,05) estatisticamente significativo. ..................... 60

Figura 22. Comparação entre as porcentagens de área de colágeno tipo I das biópsias de

pele tratadas com ClAlPc, irradiadas por laser de diodo (670 nm) em diferentes doses de

70, 140 e 700 mJ/cm2 e incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias; B) 14 dias. Os

resultados são expressos como média ± desvio padrão ........................................................... 61

Figura 23. Comparação entre o aumento da porcentagem de área de colágeno tipo I em

relação ao controle, sendo G3, G4 e G5 as amostras tratadas com a cloro alumínio

ftalocianina e irradiadas com as respectivas doses 70, 140 e 700 mJ/cm2. A) 7 dias; B) 14

dias. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão .............................................. 62

Figura 24. Conjunto dos géis 1 e 4 de zimografia, respectivos às amostras tratadas por 7 e

14 dias. ...................................................................................................................................... 66


14 dias. ...................................................................................................................................... 67


14 dias. ...................................................................................................................................... 67

Figura 27. Atividade gelatinolítica detectada por zimografia dos meios de cultura

coletados após experimento com biópsias de explants de pele cultivadas em gel de

colágeno, expressa em porcentagem de expressão de MMP-9 em relação à amostra do

controle. A) 7 dias; B) 14 dias. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão. ... 69

Figura 28. Atividade gelatinolítica detectada por zimografia dos meios de cultura

coletados após experimento com biópsias de explants de pele cultivadas em gel de

colágeno, expressa em porcentagem de expressão de MMP-2 em relação à amostra do

controle. A) 7 dias; B) 14 dias. Os resultados são a média ± desvio padrão ............................ 71

Figura 29. Parte da cascata proteolítica mostrando a ativação da progelatinase B em

gelatinase B .............................................................................................................................. 72

vi

Figura 30. Estrutura esquemática da MMP-2 e da MMP-9, evidenciando os seus

principais domínios e a região catalítica................................................................................... 73

Figura 31. Gelatinases A e B (MMP-2 e MMP-9, respectivamente), mostrando alguns dos

seus domínios ........................................................................................................................... 73

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela I. Nomenclatura das amostras de meio de cultura recolhidas após o experimento

com biópsias de explants de pele e utilizadas nos estudos por zimografia .............................. 40

Tabela II. Ordem das amostras nos géis de zimografia segundo nomenclatura

estabelecida. .............................................................................................................................. 41

Tabela III. Parâmetros físico-químicos para a nanoemulsão contendo ClAlPc ...................... 45

viii

LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

ALA

5-ALA

Ácido aminolevulínico

Ácido 5-aminolevulínico

CT Controle

DMEM

EROs

“Dubleco Eagle’s Minimum Essential Medium”

Espécies reativas de oxigênio

He-Ne

HpD

Hélio-Neônio

Derivado da hematoporfirina

HT-1080

IPd

Linhagem de células de fibrossarcoma humano

Índice de polidispersão

LED

LLLT

MAL

“Light Emiting Diode”

Terapia com laser de baixa potência

Ácido aminolevulínico

MEC Matriz extracelular

MMP

MMP-a

MMP-p

NADH

Nd:YAG

NE

1O2

O2•

OH•

Metaloprotease

Metaloprotease ativa

Pró-metaloproease

Nicotinamida adenina dinucleotídeo

Neodínio dopado com “yttrium aluminum garnet (Y3Al5O12)”

Nanoemulsão

Oxigênio singlete

Oxigênio radicalar

Radical hidroxila

ix

PMN Leucócitos polimorfonucleares

PpIX Protoporfirina IX

Redox Redução-oxidação

Rpm

SDS

Rotações por minuto

Dodecil sulfato de sódio

TEMED N,N,N,N-tetrametil etileno diamina

TFD Terapia Fotodinâmica

UV-Vis Ultravioleta-visível

SUMÁRIO

RESUMO .................................................................................................................................... i

ABSTRACT .............................................................................................................................. ii

LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. iii

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ vii

LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................... viii

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1

1.1 A Laserterapia e os Processos Fotodinâmicos ...................................................................... 1

1.2 Estudos de bioestimulação tecidual ...................................................................................... 4

1.3 A escolha do agente fotossensibilizante: Cloro Alumínio Ftalocianina ............................... 9

1.4 O sistema de liberação de fármacos: nanoemulsão ............................................................ 12

1.5 A pele e a penetração da luz no tecido ............................................................................... 15

1.6 Colágeno e Elastina ............................................................................................................ 20

1.7 O Processo Cicatricial ........................................................................................................ 22

1.8 Zimografia .......................................................................................................................... 26

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 27

2.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 27

2.2 Objetivos específicos .......................................................................................................... 27

3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 28

3.1 Materiais ............................................................................................................................. 28

3.2 Equipamentos ..................................................................................................................... 29

3.3 Métodos .............................................................................................................................. 31

3.3.1 Preparação do sistema de liberação de fármacos: nanoemulsão ..................................... 31

3.3.2 Caracterização físico-química da nanoemulsão contendo ClAlPc .................................. 31

3.3.2.1 Determinação do tamanho das gotículas, índice de polidispersão e potencial Zeta ..... 31

3.3.2.2 Estudos de estabilidade ................................................................................................. 32

3.3.2.3 Doseamento da ClAlPc na nanoemulsão ...................................................................... 32

3.3.3 Extração de colágeno tipo I ............................................................................................. 33

3.3.4 Preparação das biópsias de explants de pele e dos géis de colágeno .............................. 33

3.3.5 Tratamento com a formulação de ftalocianina e irradiação das placas ........................... 36

3.3.6 Fixação das biópsias e análise histológica ....................................................................... 37

3.3.7 Doseamento de colágeno e elastina nas biópsias de explants de pele ............................. 39

3.3.8 Avaliação da expressão de enzimas MMP-2 e MMP-9 por zimografia .......................... 40

3.3.9 Quantificação dos géis de zimografia .............................................................................. 43

3.4. Análise estatística e softwares ........................................................................................... 44

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 45

4.1 Determinação do tamanho de gotículas, índice de polidispersão e potencial Zeta da

nanoemulsão contendo ClAlPc ................................................................................................. 45

4.2 Estudo de estabilidade termodinâmica da nanoemulsão contendo ClAlPc ........................ 46

4.3 Doseamento da ClAlPc na nanoemulsão ............................................................................ 48

4.4 Análise histológica ............................................................................................................. 50

4.4.1 Análise para elastina ........................................................................................................ 51

4.4.2 Análise para colágeno tipo I e tipo III ............................................................................. 56

4.5 Avaliação da expressão de enzimas MMP-2 e MMP-9 por zimografia ............................. 66

5. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 75

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 77


1 Introdução │

1 Introdução

1.1 A Laserterapia e os Processos Fotodinâmicos

Considerando o uso da luz em aplicações para diversas doenças, duas terapias têm sido

extensamente estudadas desde a descoberta dos benefícios da aplicação de luz no campo da

medicina: Terapia Fotodinâmica (TFD) e Terapia com laser de baixa potência (LLLT – do

inglês Low Level Laser Therapy) (AGOSTINIS et al., 2011; CASTANO , DEMIDOVA e

HAMBLIN, 2004; LAVI et al., 2003; LUBART et al., 2005; ZHANG et al., 2003). A TFD

tem sido utilizada para tratamento de diversas doenças oncológicas, dermatológicas e

oftálmicas (SIQUEIRA-MOURA et al., 2010). Além dessas aplicações, a TFD atua em outras

áreas clínicas, como tratamento alternativo de artrite reumatoide (TRAUNER e HASAN,

1996), degeneração macular (AHMAD et al., 2008) e aterosclerose (PARK et al., 2010).

Atualmente vem sendo muito explorada também nos tratamentos estéticos para

fotorejuvenescimento e acne (BISSONNETTE, 2011; COLIC et al., 2004).

Ela pode ser definida como a administração de uma droga ou corante não-tóxico,

conhecido como um fármaco fotossensibilizante, seguida pela irradiação com luz visível na

região que contém a lesão, que na presença de oxigênio leva à geração de espécies citotóxicas

e consequentemente à morte celular (AGOSTINIS et al., 2011; DOUGHERTY, 1984;

SIMIONI, A. R., 2009; TEDESCO , ROTTA e LUNARDI, 2003). A recente explosão de

interesse na TFD data da descoberta dos derivados da hematoporfirina (HpD) por Lipson e

Baldes em 1960 (LIPSON , BALDES e OLSEN, 1961).

O uso clínico da TFD em pacientes com câncer data do final da década de 1970,

quando foram publicados os primeiros estudos dos efeitos da HpD com luz em 5 pacientes

com câncer na bexiga. Em 1975, Dougherty et al (DOUGHERTY et al., 1975) relataram a


2 Introdução │

primeira série de estudos de pacientes tratados com sucesso pela TFD usando HpD. Da grande

variedade de tumores avaliados, todos manifestaram alguma resposta ao tratamento. Desde

esse trabalho, foram relatados mais de 200 ensaios clínicos para o uso da TFD, incluindo em

tumores na pele, cabeça e pescoço, sistema digestivo, sistema urinário (próstata e bexiga),

cérebro, entre outras aplicações (AGOSTINIS et al., 2011).

A TFD é um processo de basicamente dois estágios. Após a administração do agente

fotossensibilizante, os locais dos tumores são irradiados com luz num comprimento de onda

apropriado. A luz pode chegar virtualmente a qualquer órgão do corpo por meio de

dispositivos de fibra-óptica flexível. A seletividade é derivada da capacidade dos agentes

fotossensibilizantes de se localizarem nas lesões neoplásicas e do caminho da luz diretamente

sobre os locais afetados. Paradoxalmente, a natureza altamente localizada da TFD é uma das

suas limitações, pois o tratamento não é efetivo contra lesões metastáticas, as quais são as

causas mais frequentes de morte de pacientes com câncer (AGOSTINIS et al., 2011)

(BARBUGLI, P. A., 2010; NUNES, S. M. T., 2003; PRIMO, F. L., 2009; SIMIONI, A. R.,

2009; TAMIETTI et al., 2007; TEDESCO , ROTTA e LUNARDI, 2003).

O fármaco fotossensibilizante ou a luz isoladamente apresentam pouca ou até

nenhuma citotoxicidade para o tecido nas condições ideais. O mecanismo de regressão

fotoinduzida do tumor na TFD frequentemente está associado à participação do oxigênio

singlete gerado, aos processos fotoativados de transferência eletrônica e abstração de

hidrogênio do fármaco no estado excitado e à formação de outras espécies radicalares. As

espécies reativas de oxigênio (1O2, O2•, OH•, denominadas EROs), quando geradas no meio

biológico, agem nos centros específicos dos sistemas celulares, desencadeando a morte dos

tecidos por processos de necrose e/ou apoptose celular (SOBOLEV , JANS e

ROSENKRANZ, 2000) e a presença dos fotossensibilizadores neste meio é capaz de

potencializar a produção destas espécies reativas (FERREIRA, D. M., 2012).


3 Introdução │

O principal mecanismo possível para a fotossensibilização é a transferência de energia

para o oxigênio molecular a partir da configuração eletrônica triplete do fármaco, induzindo a

formação do oxigênio singlete (1O2). O oxigênio singlete é uma espécie altamente reativa que

interage de forma a oxidar vários substratos biológicos resultado da sua interação por difusão

molecular. Acredita-se que o oxigênio singlete seja o principal mediador dos efeitos

fotodinâmicos nos sistemas biológicos, pois reage rápida e indiscriminadamente com os mais

variados alvos eletrofílicos, como lipídios insaturados, proteínas, ácidos, entre outros

(PRIMO, F. L., 2009).

Quase uma década após a descoberta dos derivados da hematoporfirina, Mester et al

(MESTER et al., 1971) constataram que baixas doses de laser estimularam a regeneração de

não somente feridas induzidas mecanicamente, mas também de queimaduras. O mecanismo

de interação do laser a nível molecular foi descrito primeiramente por Karu em 1988 (KARU,

1988). Os incrementos de ATP mitocondrial que se produzem após a irradiação por laser

favorecem um grande número de reações que interferem no metabolismo celular. Em estados

patológicos, o laser interfere no processo de troca iônica, acelerando o incremento de ATP

(KARU, 1988). Desde então, LLLT vem sendo aplicada em diversas condições médicas, tais

como o reparo de feridas e outras doenças dermatológicas, dano neurológico, tratamento da

dor e inflamação, entre outras (ZHANG et al., 2003; LAVI et al., 2003; LUBART et al., 2005;

PAL et al., 2007; PRIMO, F. L., 2009; RIEKKI et al., 2000; SIMIONI, A. R., 2009;

ZANCANELA et al., 2011).

A terapia com laser de baixa potência (LLLT) envolve a interação de uma luz

monocromática de baixa potência com sistemas biológicos, com o intuito de iniciar efeitos

biomodulativos. A exposição a laser de baixa potência produziu ambos efeitos estimulante e

inibitório, in vitro e in vivo, dependendo da dose de energia (fluência). Para as aplicações in

vivo, efeitos da LLLT foram observados para o tratamento de feridas, regeneração do nervo


4 Introdução │

central e periférico, tratamento de úlceras do estômago e duodenais (DAMS et al., 2011;

JAYASREE et al., 2001). Nos estudos in vitro a nível celular, LLLT alterou a expressão

gênica, a proliferação celular, o balanço do pH intercelular, o potencial de membrana

mitocondrial, a geração de espécies reativas de oxigênio, nível de íons cálcio, gradiente de

prótons e consumo de oxigênio (ALEXANDRATOU et al., 2002; ZANCANELA et al., 2011;

LAVI et al., 2003). Por outro lado, um efeito inibitório foi observado em doses maiores de

energia. A irradiação de luz em comprimentos de onda de 630, 632,8 e 820 nm acelerou a

síntese de ATP em células de adenocarcinoma e em células de linfócitos periféricos

(JAYASREE et al., 2001).

Por atuarem por mecanismos diferentes, as aplicações dessas duas terapias (LLLT e

TFD) são diferentes, como foi relatado. Porém, considerando a seletividade e os ótimos

resultados relatados até o momento com o uso da TFD seria possível utilizar a TFD em

estudos de bioestimulção, buscando melhores efeitos do que os já alcançados com a LLLT. A

administração do agente fotossensibilizante, tanto topicamente quanto sistemicamente,

seguida da irradiação de feridas com luz visível em comprimentos de onda apropriados de

modo a excitar ao máximo o fármaco, podem oferecer um tratamento promissor para

promover a regeneração de tecidos, especialmente de feridas crônicas, como úlceras, por

também possuir uma ação antimicrobiana (PEPLOW , CHUNG e BAXTER, 2012).

1.2 Estudos de bioestimulação tecidual

A cicatrização de feridas é um processo natural para manter a integridade da pele e do

epitélio daqueles que se submeteram a cirurgia, ou que têm diabetes ou simplesmente que

sofreram uma lesão (COULOMB e DUBERTRET, 2002; GUNGORMUS e AKYOL, 2009).

Vários métodos foram adotados para aprimorar o processo de tratamento de feridas em


5 Introdução │

pacientes afetados por diferentes tipos de feridas. Houve inúmeros relatos indicando o uso

potencial da irradiação por laser de baixa potência no tratamento de feridas abertas tanto de

animais quanto em ensaios clínicos (JAYASREE et al., 2001).

Diversas teorias emergiram para explicar as mudanças bioquímicas transientes e

permanentes devido à ação de baixas doses de luz sobre a pele (ALEXANDRATOU et al.,

2002; LUBART et al., 2005; MESTER et al., 1971; PEPLOW , CHUNG e BAXTER, 2012).

Literatura abrangendo a ação estimulante e inibitória da luz azul e vermelha sobre células de

bactérias e de mamíferos foi revisada. Estudos sugeriram que um fotoaceptor para

estimulação do metabolismo celular é a enzima terminal da cadeia respiratória (citocromo-c

oxidase para células eucarióticas). Na região azul do espectro visível, flavoproteínas como as

NADH-dehidrogenase podem atuar também como fotoaceptores. A sugestão de que a

citocromo-c oxidase é uma molécula aceptora foi confirmada por experimentos com

neurônios primários funcionalmente inativados, propondo que a luz regula essa enzima

(KARU e KOLYAKOV, 2005).

Foi proposto que dois processos estão envolvidos durante a interação luz-célula. Um

deles é a aceleração da transferência de elétrons entre pares redox em algumas sessões da

cadeia respiratória (KARU e KOLYAKOV, 2005), e o outro a transferência de energia de

excitação para oxigênio molecular, resultando na formação de EROs (PRIMO, F. L., 2009).

Suspeita-se que o processo formador domina quando se utiliza doses baixas de energia,

produzindo bioestimulação, enquanto o dano fotodinâmico ocorre quando se utiliza doses

maiores de energia (PAL et al., 2007; PRIMO et al., 2011; SIMIONI, A. R., 2009).

Diversas fontes de luz têm sido avaliadas como um tratamento não invasivo em

feridas, como lasers, LEDs e a luz monocromática propriamente dita (HU et al., 2007;

PRIMO et al., 2008). Diferentes tipos de lasers foram identificados por produzirem efeitos

biológicos benéficos, incluindo os lasers de Argônio, Hélio-Neônio (He-Ne), Arseneto de


6 Introdução │

gálio e alumínio (GaAlAs), Arseneto de gálio (GaAs) e Nd:YAG. Esse efeito chamado de

“fotoestimulação” ou “bioestimulação” produz efeitos não destrutivos em tecidos no nível

celular. Bioestimulação tem sido usada para uma variedade de terapias médicas, como no

tratamento de feridas e no controle da dor, assim como em pesquisa científica básica. Os

resultados da bioestimulação mostraram aumentar a atividade celular durante o tratamento de

feridas. Alguns dos efeitos da bioestimulaçao que podem influenciar no tratamento de feridas

foram realizados por ensaios in vitro, incluindo a proliferação de fibroblastos, síntese de

colágeno, estimulação de macrógafos e uma maior taxa de produção da matriz extracelular

(GUNGORMUS e AKYOL, 2009).

Estudos evidenciaram que o tratamento com laser He-Ne em lesões cutâneas e

peritoneais iria acelerar o processo de cicatrização de feridas (HU et al., 2007). A irradiação

por laser em feridas abertas também pode estimular a replicação de fibroblastos. Foi sugerido

que a irradiação por laser de baixa potência estimula a regeneração da pele por induzir a

atividade mitótica das células epiteliais. Por não ser observado nenhum aumento de

temperatura durante a irradiação por laser de He-Ne, efeitos a nível celular são considerados

mais bioquímicos do que térmicos. Além disso, nenhum estresse é esperado durante a

irradiação (DAMS et al., 2011).

Um estudo (LUBART et al., 2005) sugeriu que diminuindo a dose de luz laser

suficientemente para aplicação da TFD poderia causar um efeito bioestimulatório nas células,

similar ao que acontece com a laserterapia a baixa potência. Além disso, células enriquecidas

com pequenas quantidades de fármaco podem proliferar melhor após a irradiação com laser,

devido às baixas concentrações de EROs geradas (PEPLOW , CHUNG e BAXTER, 2012).

Em um estudo (JAYASREE et al., 2001), o efeito da TFD no tratamento de feridas foi

avaliado utilizando lasers que mostraram ser efetivos para bioestimulação. Os resultados

sugeriram que a TFD acelera o processo de cicatrização de feridas em ratos, utilizando


7 Introdução │

combinações de fármaco e luz como ALA e laser de He-Ne e HpD e combinação dos lasers

He-Ne e Nd:YAG.

Estudos dos efeitos combinados do uso de um fármaco fotossensibilizante e irradiação

a laser em feridas causadas experimentalmente em ratos são importantes para o entendimento

do processo de cicatrização envolvido após a TFD. Quando TFD é usada para estimular a

cicatrização de feridas é importante minimizar o dano nos tecidos intactos, e isso pode ser

dependente da dose e da concentração do fármaco utilizado. Alguns estudos pré-clínicos

demonstraram que a fração do tumor para o tecido normal danificado após a TFD está

relacionada com a concentração do fármaco, irradiância do laser e intervalo de tempo entre a

administração da droga e a irradiação (SITNIK e HENDERSON, 1998; GARCIA et al.,

2010).

Um estudo de revisão (PEPLOW , CHUNG e BAXTER, 2012) apontou uma

variedade de fármacos utilizados em diversos estudos sobre modulação fotodinâmica,

publicados nos últimos 5 anos. Dentre os fármacos testados, em diferentes doses, incluem

feoforbídeo a, hematoporfirina, benzoporfirina, PpIX, “Photofrin”, 5-ALA, ácido

metilaminolevulínico (MAL), cloro alumínio ftalocianina (ClAlPc), cloro alumínio

ftalocianina sulfonada (CASPc), 8-bromo ftalocianina de zinco (ZnPcBr[8]), entre outros.

Outros estudos (PRIMO, F. L., 2009) indicaram que as células em cultura expostas à

TFD apresentaram, na maioria, efeito inibitório, refletido no decréscimo do crescimento e

viabilidade celular. Os modelos celulares mais apropriados incluíram fibroblastos de

diabéticos, fibroblastos de feridas e células cultivadas numa matriz sintetizada por outras

células. Em TFD, a irradiação das células com doses baixas de energia, ou irradiação das

células enriquecidas com pequenas quantidades de fármaco fotossensibilizante podem

estimular a sua proliferação. Constatou-se que a TFD em feridas cutâneas pode levar a uma

melhora nos resultados de tratamento, comparando-se aos efeitos do tratamento realizado


8 Introdução │

somente com luz. Apesar dos resultados promissores, outros estudos são requeridos utilizando

modelos animais mais sensíveis a alterações no processo de cicatrização de feridas, e que

mimetizem melhor o processo de cicatrização em humanos, o qual envolve principalmente os

processos de re-epitalização e granulação do tecido em formação (GARCIA et al., 2010;

PEPLOW , CHUNG e BAXTER, 2012).

Em outros estudos (SZEIMIES et al., 2012; BISSONNETTE, 2011), a TFD foi

examinada para tratamento de câncer do tipo não melanona e tratamento para o

fotoenvelhecimento em ensaios clínicos. Foram avaliados os efeitos clínicos da aplicação da

TFD utilizando o fármaco MAL no tratamento da pele severamente fotodanificada da face de

pacientes. Este tratamento demonstrou excelentes efeitos cosméticos, sustentando a indução

da formação de colágeno na derme.

Em trabalho prévio do grupo (SIMIONI, A. R., 2009) foram feitos estudos de

estimulação tecidual em pele humana. Foi testado o fármaco silício-naftalocianina em

formulação lipossomal e posterior irradiação com laser de 670 nm nas doses de 0,5, 1, 3 e

5 J/cm2 em biópsias de pele. Esses estudos deram início a uma nova vertente de estudos e

aplicações dos processos fotodinâmicos voltada especificamente para o uso dos processos de

fotobioestimulação aplicados aos processos de remodelagem cutânea.

O tratamento com TFD requer por definição que os parâmetros de luz e fármaco sejam

utilizados simultaneamente numa escala temporal definida. Para o primeiro, parâmetros

importantes para estudos in vivo incluem o tempo de aplicação da irradiação utilizada, número

de aplicações, o tempo de exposição, além da rota de administração e a dose utilizada. No

caso da irradiação com luz, parâmetros físicos importantes são: comprimento de onda, área

irradiada, potência, densidade de potência, energia, densidade de energia e frequência da

irradiação se o sistema laser utilizado for pulsado (AGOSTINIS et al., 2011). Contudo, a

relevância desses parâmetros nos efeitos de tratamento por TFD em feridas cutâneas e as suas


9 Introdução │

condições ainda permanecem incertas. A escolha do fármaco fotossensibilizante, da fonte de

luz e os parâmetros para o tratamento com TFD podem variar consideravelmente em

diferentes ensaios clínicos e experimentos com animais.

1.3 A escolha do agente fotossensibilizante: Cloro Alumínio Ftalocianina

As características de um fármaco fotossensibilizante ideal já foram discutidas em

diversos estudos, e incluem baixos níveis de toxicidade no escuro, tanto em humanos quanto

em animais experimentais, e baixa incidência de toxicidade administrativa (como hipotensão

e reação alérgica) (CHATTERJEE , FONG e ZHANG, 2008; MACAROFF et al., 2006). O

agente fotossensibilizante deve absorver luz em comprimentos de onda da região do vermelho

até comprimentos de onda mais longos com o intuito de penetrar no tecido. Ele deve possuir

coeficiente de absortividade molar relativamente alto para minimizar a dose de fármaco

necessária para alcançar os efeitos desejados. O fármaco fotossensibilizante deve ser um

composto puro, com uma composição constante e idealmente solúvel em água ou solúvel

numa mistura com solvente parcialmente miscível em água. Além disso, ele não deve agregar

em ambientes biológicos, já que isso reduz a sua eficiência fotoquímica (CASTANO ,

DEMIDOVA e HAMBLIN, 2004).

Os primeiros agentes fotossensibilizantes foram derivados da hematoporfirina e já

foram previamente descritos (LIPSON , BALDES e OLSEN, 1961). Muitos estudos foram

realizados utilizando um agente fotossensibilizante de primeira geração, como

hematoporfirina, 5-ALA, Photofrin, entre outros (DOUGHERTY et al., 1975). Agentes

fotossensibilizantes de segunda geração, como as ftalocianinas e as clorinas, foram

introduzidos na Terapia Fotodinâmica no âmbito da pesquisa e em ensaios clínicos (NUNES ,

SGUILLA e TEDESCO, 2004; PRIMO et al., 2007; SIQUEIRA-MOURA et al., 2010;


10 Introdução │

TEDESCO , ROTTA e LUNARDI, 2003; PARK et al., 2010; SILVA , SIMIONI e

TEDESCO, 2011). Até o momento, diversos sistemas com ftalocianina, como a ftalocianina

de silício e de zinco, já estiveram em alguns ensaios clínicos (LUNARDI , ROTTA e

TEDESCO, 2007; OLIVEIRA et al., 2005; PRIMO et al., 2008; YANIK et al., 2009). A

Figura 1 apresenta as estruturas moleculares de alguns agentes fotossensibilizantes estudados

clinicamente.

Figura 1. Estruturas moleculares de alguns agentes fotossensibilizantes aprovados

clinicamente (adaptado de CASTANO , DEMIDOVA e HAMBLIN, 2004).

Ftalocianinas possuem um importante papel na tecnologia moderna, com aplicações

em diversos campos, além de terem sido utilizadas como drogas fototóxicas na medicina. A

complexação de ftalocianinas com íons metálicos influencia nas suas propriedades fotofísicas.

Sabendo da sua forte absorção em comprimentos de onda longos, alta eficiência em gerar

Derivado da Hematoporfirina – “Photofrin” Derivado da Benzoporfirina

– BPDMA, “Verteporphin” 6-éter-pirofeorfobídeo – HPPH

SnEt2 – “Purlytin” m-Tetrahidróxifenil clorina – “Foscan” Bacterioclorina de paládio – “Tookad”

Ftalocianina de silício –

“PC4” Texafrin lutécio –

“Lutex”

Pirofeoforbídeo de índio –

MV6401 Monoaspartil clorina (e6) –

LS11, NPe6


11 Introdução │

espécies reativas de oxigênio e facilidade de modificação química, as ftalocianinas emergiram

como agentes fotossensibilizantes de segunda geração promissores para Terapia Fotodinâmica

(TFD). Durante a última década, um número substancial de agentes fotossensibilizantes

baseados em ftalocianinas foram preparados e foi avaliada a sua atividade fotodinâmica, com

foco nas análogas de silício, zinco e alumínio, como resultado das suas propriedades

fotofísicas desejadas (YANIK et al., 2009).

Estudos demonstraram que essa classe de agentes fotossensibilizantes possuem

propriedades fotoquímicas e fotofísicas melhores, como indicado pela ativação em

comprimentos de onda maiores (pico de absorção em 680 nm), quando comparados, por

exemplo, com derivados da hematoporfirina (PEPLOW , CHUNG e BAXTER, 2012). Além

disso, corantes baseados em ftalocianinas podem ser seletivamente acumulados e eliminados

do tecido alvo com maior eficiência.

Dentre o grupo das ftalocianinas, a cloro alumínio ftalocianina mereceu destaque, pois

as suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas já foram extensamente estudadas por diversos

autores (NUNES , SGUILLA e TEDESCO, 2004; PRIMO et al., 2007; SIQUEIRA-MOURA

et al., 2010; TEDESCO , ROTTA e LUNARDI, 2003) apresentando importantes parâmetros

favoráveis ao seu uso como fármaco fotossensibilizante, tais como tempos de vida

relativamente longos nos estados singlete e triplete, os quais são produzidos com rendimentos

quânticos altos permitindo assim um complexo mecanismo de transferência de energia para a

produção de EROs. A cloro alumínio ftalocianina (ClAlPc) é um macrociclo tetrapirrólico que

possui átomos de nitrogênio ligando as unidades pirrólicas e o íon metálico central (Al), como

mostra a Figura 2 (SIQUEIRA-MOURA et al., 2010).


12 Introdução │

Figura 2. Estrutura molecular da Cloro Alumínio Ftalocianina

Fonte: http://www.sigmaaldrich.com

O átomo halogênio substituído axialmente que se conecta ao metal central pode ser

responsável por diferentes propriedades das ftalocianinas, bem como o íon metálico central. O

átomo central de alumínio, por ser relativamente grande, fica deslocado da estrutura da

molécula, o que faz com que esta deixa de ser plana, como é o caso da ftalocianina de zinco.

Esta é uma informação importante na escolha do fármaco fotossensibilizante, visto que a

estrutura não-planar da ClAlPc dificulta a formação de agregados em ambiente fisiológico.

Assim, as propriedades fotoquímicas e fotofísicas das ftalocianinas podem ser

moduladas alterando os substituintes axiais e periféricos, metais centrais, assim como as

estruturas nos anéis macrocíclicos (CHEN et al., 2009).

1.4 O sistema de liberação de fármacos: nanoemulsão

A presença de quatro grupos fenil na estrutura das ftalocianinas pode causar problemas

de solubilidade e de agregação dessas moléculas (SIQUEIRA-MOURA et al., 2010). As

ftalocianinas são frequentemente preparadas com grupos sulfônicos ácidos a fim de promover

uma maior solubilidade em água quando átomos metálicos estão centralmente coordenados.

(CASTANO , DEMIDOVA e HAMBLIN, 2004). A introdução de grupos substituintes é uma


13 Introdução │

maneira de aumentar efetivamente a solubilidade das ftalocianinas, sendo que grupos

diferentes podem causar efeitos diferentes nas propriedades ópticas e fotofísicas das

ftalocianinas (CHEN et al., 2009).

Apesar dos esforços em melhorar as propriedades físicas das ftalocianinas, a

relativamente baixa solubilidade em água faz com que seja necessária a utilização de um

sistema de veiculação de fármacos anfifílico, ou seja, solúvel tanto em meio aquoso quanto

em solventes orgânicos. O desenvolvimento de um sistema de liberação de fármacos é de

suma importância para o uso da cloro alumínio ftalocianina em aplicações tópicas, como no

caso do tratamento com TFD em feridas, visto que o veiculador não só proporciona um

microambiente lipossolúvel ao fármaco, mas também mantém a sua concentração na faixa de

ação terapêutica por um tempo prolongado, utilizando-se de uma única dosagem (PRIMO, F.

L., 2009).

Vários tipos de sistemas de liberação de fármacos foram estudados e utilizados

clinicamente, como as vesículas lipossomais (NUNES, S. M. T., 2000), micropartículas

(GOMES, A. J., 2003), microemulsões (LENAERTS et al., 1995; SOPPIMATH et al., 2001),

proteínas de baixa densidade (LENAERTS et al., 1995; NUNES, S. M. T., 2003; TEDESCO ,

ROTTA e LUNARDI, 2003), sistemas dendriméricos (HUGHES, 2005; PATRI , MAJOROS

e BAKER, 2002), entre outros, com propriedades físico-químicas e biológicas favoráveis

(SHIM et al., 2004; JENNING , SCHAFER-KORTING e GOHLA, 2000; SARIKAYA et al.,

2003). Mais recentemente, os sistemas “nano” emergiram como uma opção mais interessante,

provendo o máximo de eficácia terapêutica. A característica mais importante desses

nanocarreadores é sua habilidade em aprimorar a interação e liberação do princípio ativo no

seu sítio alvo (célula, órgão ou microrganismo). Além disso, esses carreadores coloidais

podem apresentar as seguintes vantagens: prolongar a permanência do fármaco na corrente

sanguínea (comum aumento da meia-vida plasmática), proteger o princípio ativo da


14 Introdução │

degradação química ou enzimática após administração, diminuir os efeitos colaterais e

aumentar a biodisponibilidade (BECHET et al., 2008; CHEN et al., 2011; HAMIDI , AZADI

e RAFIEI, 2008; PASZKO et al., 2011). Assim, os novos sistemas propostos na literatura são

as nanopartículas poliméricas biodegradáveis (nanoesferas e nanocápsulas), nanoemulsão,

micelas poliméricas, lipossomas, dendrímeros, nanopartículas magnéticas e, mais

recentemente, nanopartículas de géis (CHATTERJEE , FONG e ZHANG, 2008; CHEN et al.,

2011; HAMIDI , AZADI e RAFIEI, 2008; KONAN , GURNY e ALLEMANN, 2002;

SOUSSAN et al., 2009; KIRILOV et al., 2008).

Considerando que as nanoemulsões são formadas por gotículas de óleo dispersas em

água, contendo tensoativo na interface óleo/água, estas possuem ótima capacidade de

solubilização de substâncias lipofílicas, como é o caso da cloro alumínio ftalocianina, e têm

sido utilizadas para aumentar a estabilidade, a solubilidade e a biodisponibilidade de

fármacos, pois permitem a incorporação de vários tipos de compostos na fase interna oleosa,

na região interfacial ou na fase externa aquosa (OLIVEIRA et al., 2003).

As nanoemulsões (NE) são sistemas coloidais, nos quais a fase interna constitui um

microambiente dimensionalmente restrito, com propriedades particulares, podendo ligar ou

associar moléculas com diferentes polaridades, atuando como agregados esféricos e com

diâmetros menores que 1000 Å (OLIVEIRA et al., 2003). As NE são, de forma geral,

definidas como sistemas termodinamicamente estáveis, isotrópicos, de dois líquidos

imiscíveis (usualmente água e óleo) estabilizados por um filme de compostos tensoativos,

localizados na interface óleo/água (PRIMO, F. L., 2009).

Vários tipos de veículos de liberação de fármacos foram estudados por membros do

grupo, como lipossomas, nanoemulsões, nanocápsulas, nanopartículas de organogel,

nanopartículas magnéticas, nanotubos de carbono, entre outros (BARBUGLI, P. A., 2010;

FERREIRA, D. M., 2012; PRIMO, F. L., 2009; SIMIONI et al., 2009; SIQUEIRA-MOURA,


15 Introdução │

M. P., 2011; FALQUEIRO, A. M., 2011). Ao se verificar as propriedades físico-químicas e

aplicações de cada um, a nanoemulsão pareceu ser a opção mais adequada como veiculador

para a ClAlPc, devido às suas características lipofílicas já mencionadas.

Em seu trabalho de doutorado, Primo (PRIMO, F. L., 2009) desenvolveu e

caracterizou esse sistema de veiculação de fármacos, o qual foi amplamente avaliado a partir

de testes físico-químicos e ensaios de citotoxidade in vitro em cultura de fibroblastos

humanos. Na sequência foram realizados estudos fotobiológicos combinando-se a aplicação

de luz laser de baixa potência e o fármaco (ClAlPc) em modelos teciduais, para avaliação da

resposta biológica ao fotoestímulo. Os resultados demonstraram que a formulação ClAlPc/NE

possui características fotofísicas no estado fundamental, de acordo com as exigências para

utilização de fármacos e princípios ativos fotossensibilizantes em processos fotodinâmicos e

laserterapia. O processo de incorporação do fármaco à nanoemulsão não suprimiu o potencial

fluorescente do mesmo, o que também confirma a afinidade química e solubilidade adequada

do ativo no ambiente nuclear lipofílico da nanopartícula coloidal. Além disso, o sistema

nanoemulsão contendo o fármaco fotossensibilizante mostrou uma boa estabilidade

termodinâmica, formulação relativamente simples de preparar e reprodutibilidade (PRIMO, F.

L., 2009).

1.5 A pele e a penetração da luz no tecido

A pele é o maior órgão do corpo humano, atingindo 16% do seu peso corporal. Assim

como outros órgãos, ela tem a habilidade de crescer, se desenvolver e de ser reparada

(regeneração). A pele recobre a superfície do corpo e apresenta-se constituída por uma porção

epitelial de origem ectodérmica, a epiderme, e uma porção conjuntiva de origem

mesodérmica, a derme. Dependendo da espessura da epiderme, variando de 50 a 150 µm,


16 Introdução │

distingue-se a pele fina e a espessa. A pele espessa é encontrada na palma das mãos e na

planta dos pés. O resto do corpo é protegido por pele fina (JUNQUEIRA e CARNEIRO,

2004).

A espessura da derme varia de 300 µm nas pálpebras até 3 mm nas costas. O principal

componente da derme é a matriz extracelular (MEC). Essa matriz consiste de proteínas

suportes complexas, tais como colágeno, elastina e proteoglicanas, as quais são sintetizadas

pelos fibroblastos dermais. A derme pode ser dividida em derme papilar, situada diretamente

abaixo da epiderme, e derme reticular, localizada entre a derme papilar e a hipoderme. A

hipoderme, também chamada de camada subcutânea, é um tecido conjuntivo frouxo composto

primariamente de células de gordura (DAMS et al., 2011).

A pele desempenha múltiplas funções. Graças à camada córnea da epiderme protege o

organismo contra a perda de água e contra o atrito. A junção entre a epiderme e a derme é

irregular. A derme possui projeções, as papilas dérmicas, que se encaixam em reentrâncias da

epiderme, aumentando a coesão entre essas duas camadas. Os pêlos, unhas e glândulas

sudoríparas e sebáceas são estruturas anexas da pele (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). A

Figura 3 é uma ilustração das camadas constituintes da pele mostrando também as suas

estruturas.


17 Introdução │

Figura 3. Esquema das camadas da pele e estruturas anexas.

Adaptado de: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/8912.htm

Na TFD é importante estar apto para prever a distribuição espacial da luz no tecido

alvo. A luz pode ser espalhada ou absorvida quando entra no tecido, e a extensão de ambos os

processos depende do tipo de tecido e do comprimento de onda da luz. Absorção é

principalmente devida a cromóforos endógenos, como hemoglobina, mioglobina e

citocromos. Espalhamento é geralmente o fator mais importante na determinação da

penetração da luz na maioria dos tecidos. A combinação da absorção de luz de menores

comprimentos de onda por importantes cromóforos do tecido (como oxi e desoxihemoglobina

e melanina) juntamente com espalhamento de luz reduzido em comprimentos de onda mais

longos e a ocorrência da absorção pela água em comprimentos de onda maiores do que

1300 nm levou ao conceito de “janela óptica” do tecido (Figura 4). Em termos de TFD, a

média efetiva de penetração pela luz no tecido é de aproximadamente 1-3 mm em 630 nm

(CASTANO , DEMIDOVA e HAMBLIN, 2004).


18 Introdução │

Figura 4. Janela óptica no tecido. Espectro de absorção de importantes cromóforos do tecido,

como água, oxi e desoxihemoglobina e melanina, plotados em escala logarítmica (adaptado de

CASTANO, DEMIDOVA e HAMBLIN, 2004).

A Figura 5 é uma ilustração das camadas da pele e o que ocorre com a luz em cada

uma delas.

Figura 5. Representação esquemática das camadas da pele e as suas propriedades ópticas. As

setas indicam o caminho da luz pelos tecidos da pele (adaptado de CLARIDGE et al., 2003).

Estrato córneo

Epiderme

Derme papilar

Derme reticular

Luz incidente Luz reemitida

Difusão

Absorção e espalhamento

frontal (forward scatter)

Absorção e espalhamento

lateral (backscatter)

Espalhamento frontal

(forward scatter)

Janela óptica

Comprimento de onda (nm)

água

Melanina

Ab

sorb

ân

cia


19 Introdução │

O estrato córneo é uma camada protetora que consiste de células impregnadas por

queratina e varia consideravelmente com a espessura. Exceto pela luz espalhada, ele é

oticamente neutro. Já na camada epidérmica existe um pequeno espalhamento de luz, com

uma pequena quantidade de luz que passa direto. O resultado é que se considera que toda luz

não absorvida pela melanina, principal pigmento, presente na epiderme pode passar para a

derme (CLARIDGE et al., 2003).

A derme é formada por fibras colágenas e, diferentemente da epiderme, ela contém

sensores, receptores, vasos sanguíneos e terminações nervosas. A hemoglobina, presente nos

vasos sanguíneos em toda a derme, atua como um absorvedor seletivo de luz. A derme

consiste de duas camadas estruturalmente diferentes, papilar e reticular, as quais diferem

principalmente no tamanho das fibras de colágeno. O pequeno tamanho das fibras colágenas

na derme papilar (diâmetro na ordem de magnitude menor do que a luz visível incidente) faz

com que ocorra nesta camada o “back-scattering”, no qual a luz é totalmente direcionada de

volta à superfície da pele (CLARIDGE et al., 2003).

A luz azul penetra menos eficientemente pelo tecido, enquanto radiação vermelha e

infravermelha penetram mais profundamente, como mostra a Figura 6. Assim como a Figura

5, a Figura 6 também apresenta o caminho percorrido pela luz no tecido, porém evidenciando

os diferentes tipos de luz. Nenhuma fonte de luz é ideal para todas as indicações de TFD,

mesmo para o mesmo agente fotossensibilizante. A escolha da fonte de luz deve ser baseada

na absorção do fármaco fotossensibilizante, tipo de doença a ser tratada (localização, tamanho

da lesão, acessibilidade e características do tecido), custo e tamanho (AGOSTINIS et al.,

2011).


20 Introdução │

Figura 6. Propagação da luz pelos tecidos (adaptado de AGOSTINIS et al., 2011)

1.6 Colágeno e Elastina

O colágeno constitui um tipo de família de proteínas selecionadas durante a evolução

para exercer diferentes funções (principalmente estruturais). Durante o processo de evolução

dos organismos, a família de um grupo de proteínas estruturais influenciada pelo meio

ambiente e pelas necessidades funcionais do organismo dos animais modificou-se e adquiriu

variáveis graus de rigidez, elasticidade, e força de tensão. Estas proteínas são conhecidas

coletivamente como colágeno, e os principais exemplos dos vários tipos de colágeno são

encontrados na pele, osso, cartilagem, músculo liso e lâmina basal (JUNQUEIRA e

CARNEIRO, 2004).

Feixe de luz

Reflexão

Espalhamento

Absorção


21 Introdução │

A síntese de colágeno foi inicialmente associada a um grupo restrito de células do

conjuntivo, como os fibroblastos, condroblastos e osteoblastos. Atualmente, entretanto,

existem suficientes evidências que mostram que vários tipos de células produzem esta

proteína. As fibrilas de colágeno são formadas pela polimerização de unidades moleculares

alongadas denominadas tropocolágeno, sendo que os vários tipos de colágeno resultam de

diferenças na estrutura química destas cadeias polipeptídicas. Nos colágenos tipo I, II e III as

moléculas de tropocolágeno se agregam em subunidades que se juntam para formar fibrilas.

Nos colágenos do tipo I e III estas fibrilas se associam para formar fibras. O colágeno tipo II,

presente na cartilagem, forma fibrilas, mas não forma fibras. O colágeno tipo IV, presente nas

lâminas basais, não forma fibrilas nem fibras (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004;

SHOULDERS e RAINES, 2009).

O colágeno é o tipo mais abundante de proteína do organismo, representando 30% do

seu peso seco. Os tipos de colágeno dos vertebrados constituem uma família de proteínas

produzidas por diferentes tipos de células e se distinguem por sua composição química,

características morfológicas, distribuição, funções e patologias. Como o colágeno é a

principal proteína estrutural e compõe de 70 a 80% do peso seco da pele, a modulação do

metabolismo do colágeno na pele por irradiação terapêutica possui muita importância clínica.

O colágeno da pele sintetizado por fibroblastos compromete de 80 a 85% de colágeno tipo I e

de 10 a 15% de colágeno tipo III (RIEKKI et al., 2000).

A mudança na constituição da matriz extracelular é um importante fator do

envelhecimento. Fibras de colágeno associadas com proteoglicanas são importantes

componentes da derme, e a pele saudável é dependente do balanço entre a síntese e

degradação de colágeno. A formação e degradação do colágeno são primariamente

controladas pela atividade de metaloproteases da matriz (MMPs), e a inativação das MMPs


22 Introdução │

reduz a formação de rugas (VALENTI et al., 2012; BISSONNETTE, 2011; SZEIMIES et al.,

2012).

A elastina é a principal proteína da matriz extracelular que fornece força e elasticidade

a vários tecidos flexíveis e mecanicamente ativos, incluindo pele, pulmões e cordas vocais.

(GRIESHABER et al., 2012). As principais células produtoras de elastina são os fibroblastos

e o músculo liso dos vasos sanguíneos. Antes da elastina madura forma-se a proelastina, uma

molécula globular de 70 kDa de massa, que, no espaço extracelular, polimeriza-se para formar

a elastina, uma glicoproteína com consistência de borracha que predomina nas fibras elásticas

maduras. A elastina é resistente à fervura, à extração com álcalis e com ácido e à digestão

com proteases usuais, mas é facilmente hidrolisada pela elastase pancreática (JUNQUEIRA e

CARNEIRO, 2004).

Como a proteína colágeno, a elastina é rica em glicina e em prolina. Além destes, a

elastina contém dois aminoácidos incomuns, a desmosina e a isodesmosina, formados por

ligações covalentes entre quatro resíduos de lisina. Estas ligações cruzadas parecem ser

responsáveis pela consistência elástica da elastina, que é cinco vezes mais extensível do que a

borracha (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).

1.7 O processo cicatricial

No Egito antigo, de uma perspectiva parafisiológica, uma ferida era considerada como

uma abertura no corpo pela qual seres infernais poderiam entrar ou sair (SIPOS et al., 2004).

Desde aquele tempo a medicina já estava sendo desenvolvida, e o tratamento de feridas

consistia da aplicação de bandagens contendo medicamento, no caso ervas com poder de cura,

sobre a lesão. Até não muito tempo atrás, cerca de 50 anos, este era método utilizado,

considerando os avanços dos medicamentos e das técnicas medicinais.


23 Introdução │

A regeneração da epiderme em mamíferos foi descrita convencionalmente por

histologistas por consistir de três fases: mitose, migração e diferenciação (ODLAND e ROSS,

1968). A cicatrização de feridas é um processo complexo, cujo desenvolvimento pode ser

resumido em três etapas: inicialmente um estágio inflamatório, seguido de proliferação e

finalizando com o reparo em um estágio de remodelação do tecido (AUKHIL, 2000).

A fase inflamatória depende, além de inúmeros mediadores químicos, das células

inflamatórias, como os leucócitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos e linfócitos. Os

PMN atuam no momento da injúria tecidual e ficam por um período que varia de três a cinco

dias e são eles os responsáveis pela fagocitose das bactérias. O macrófago é a célula mais

importante desta fase e este permanece na ferida do terceiro ao décimo dia. O macrófago

fagocita bactérias, desbrida corpos estranhos e direciona o desenvolvimento do tecido de

granulação. Os linfócitos aparecem na ferida em aproximadamente sete dias e seu papel ainda

não é bem definido, porém sabe-se que as linfocinas produzidas por estas células têm

importante influência sobre os macrófagos. Além das células e dos mediadores químicos, a

fase inflamatória conta com o importante papel da fibronectina, a qual é sintetizada por uma

variedade de células como os fibroblastos e as células endoteliais, funcionando como adesivo

para consolidar o coágulo de fibrina, as células e os componentes da matriz extracelular

(MOULIN et al., 2000).

A fase de proliferação celular é importante na formação do tecido de granulação

(coleção de elementos celulares, incluindo fibroblastos, células inflamatórias, endoteliais e

componentes da matriz extracelular, como a fibronectina, as glicosaminoglicanas e o

colágeno). A formação do tecido de granulação depende da ação dos fibroblastos que além de

produzirem o colágeno, produzem também elastina, fibronectina, glicosaminoglicanas e

proteases, estas responsáveis pelo desbridamento e remodelamento fisiológico. Durante a fase


24 Introdução │

de proliferação também ocorre a angiogênese, essencial para o suprimento de oxigênio e

nutrientes para a cicatrização (BALBINO , PEREIRA e CURI, 2005).

As duas últimas fases, de contração e de remodelação, são processos mais tardios,

responsáveis pela maturação das feridas. A primeira se dá com participação intensa dos

miofibroblastos e tem como consequência a redução do tamanho da lesão. A segunda,

decorrente da formação de pontes entre as fibras de colágeno, tem como resultado a formação

de cicatriz madura (CHAUSSAIN-MILLER et al., 2002; MOULIN et al., 2000).

Os fibroblastos exercem papel importante numa série de eventos fisiológicos, como é

o caso do processo cicatricial. Neste caso, os fibroblastos do tecido conjuntivo das margens

tornam-se ativados, proliferam, migram em direção ao coágulo em reabsorção e começam a

sintetizar os componentes da matriz extracelular, como colágeno e elastina (BALBINO ,

PEREIRA e CURI, 2005; PAZOS e NADER, 2007; ROCHA, 2004). Durante o processo

cicatricial, a quantidade de colágeno aumenta com o tempo e por volta de duas semanas suas

fibras passam a predominar na matriz extracelular. As células fagocitárias vão desaparecendo

e o tecido de granulação passa a ser constituído por um tecido conjuntivo progressivamente

mais denso e menos vascularizado, situado logo abaixo da epiderme já regenerada (ROCHA,

2004). A degradação do colágeno se inicia precocemente e é muito ativa durante o processo

inflamatório, portanto, a formação da matriz extracelular é resultante de um balanço entre a

deposição e degradação de colágeno (SIMIONI, A. R., 2009).

O processo de cicatrização envolve vários eventos celulares e macromoleculares que

acontecem nas diferentes fases da cicatrização. Esta sucessão implica em um elaborado

programa de síntese que permite variações qualitativas e quantitativas das matrizes

extracelulares necessárias não somente ao processo sequencial de cicatrização, mas também a

uma remodelagem intensa, na qual estão envolvidas várias famílias de proteases, dentre as

quais se destacam as metaloproteases (MMPs) (PRIMO, F. L., 2009).


25 Introdução │

As metaloproteases de matriz são denominadas como endopeptidases dependentes de

cálcio, que contêm zinco e são estrutural e funcionalmente relacionadas umas às outras

(BODE e MASKOS, 2003). A principal função das MMPs é atuar na degradação e formação

da matriz extracelular. Dessa forma, as MMPs podem influenciar diversas propriedades

celulares como crescimento, morte e migração (COUSSENS , FINGLETON e MATRISIAN,

2002). No processo cicatricial, as MMPs interferem diretamente em eventos celulares e

moleculares. Na fase inflamatória, as MMP-2 e MMP-9 atuam como mediadores químicos

nas etapas de estimulação na fase fagocitária. Na granulação (proliferação) as MMPs atuam

em conjunto com outras biomoléculas com atividade reguladora na formação da matriz

extracelular de colágeno e elastina, re-epitelização e vascularização (NELSON e

MELENDEZ, 2004; SHARWANI et al., 2006; STERNLICHT e WERB, 2001;

MCCAWLEY e MATRISIAN, 2001).

Diversas rotas de sinalização envolvidas no controle da transcrição das MMPs são

controladas por reações do tipo redox. Este raciocínio levou pesquisadores a proporem uma

relação entre a atividade das MMPs e espécies reativas de oxigênio. Sugere-se que as EROs

atuam na ativação ou desativação de algumas MMPs em nível transcricional, atuando em

rotas de sinalização redox-sensíveis (NELSON e MELENDEZ, 2004).

Dessa forma, para compreender os mecanismos de ação de um fármaco

fotossensibilizante seguido da irradiação por luz diretamente sobre a pele (em biópsias de

explants de pele) é preciso estudar a expressão e a ativação das MMPs no meio de cultura,

podendo assim fazer uma correlação com os níveis de EROs produzidos e expandir essa

compreensão para o processo cicatricial.


26 Introdução │

1.8 Zimografia

Os métodos eletroforéticos são a principal ferramenta no estudo de proteínas, como é o

caso das enzimas MMPs. A separação de misturas proteicas por eletroforese começou no

início do século vinte. O primeiro método, utilizando um complexo aparato com solução

Tiselius, foi substituído por géis de corrida, e até hoje géis de poliacrilamida têm se tornado

uma importante ferramenta em laboratórios que trabalham com proteínas e ácidos nucleicos

(PAGANO, 1999).

Um estudo (DAMODHARAN , GANESAN e RADHAKRISHNAN, 2011) utilizou

dois métodos baseados em eletroforese no estudo da expressão das enzimas MMP-2 e MMP-

9. No primeiro, a expressão gênica das MMPs foi detectada pela técnica de PCR-

Transcriptase reversa, e os produtos analisados por eletroforese em gel de agarose e as bandas

de DNA visualizadas. O outro método foi a técnica de zimografia eletroforética em gel de

gelatina e poliacrilamida, a qual detecta a atividade das enzimas MMP-2 e MMP-9

(Gelatinases A e B, respectivamente), uma vez que elas degradam o gel. Ambos os métodos

são eficientes, porém o segundo permite detectar diretamente a atividade das enzimas, sem a

necessidade de outro método, por isso é empregado especificamente para esse caso.

Dessa forma, a técnica de zimografia se baseia na capacidade das enzimas MMP-2 e

MMP-9 em degradarem a gelatina, podendo não somente detectar a presença dessas enzimas

nos meio de cultura, mas também quantificar as suas atividades de acordo com a intensidade

das bandas no gel. Essa é a principal diferença entre a técnica de zimografia e os outros

métodos eletroforéticos convencionais, como o método clássico em gel de agarose.


27 Objetivos │

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Verificar os efeitos da fototerapia, utilizando o fármaco fotossensibilizante cloro

alumínio ftalocianina, com o intuito de estimular a produção de colágeno e elastina, os quais

exercem papel importante no processo regenerativo da pele.

2.2 Objetivos específicos

a) Preparar e caracterizar a formulação ClAlPc nanoestruturada, através da determinação

de parâmetros farmacotécnicos como estabilidade, através de medidas de potencial

Zeta, tamanho médio das gotículas e homogeneidade da nanoemulsão, além das

características espectroscópicas, tais como absorção na região do UV-Vis e

rendimentos de fluorescência;

b) Avaliar a ação de diferentes doses de luz combinadas com o fármaco

fotossensibilizante em biópsias de explants de pele no processo de regeneração e

expressão proteica;

c) Analisar histomorfologicamente as biópsias coradas por Orceína e Picrosirus Red e

quantificar os seus componentes como elastina, colágeno tipo I e colágeno tipo III;

d) Avaliar a ação de enzimas como as metaloproteases (MMP-2 e MMP-9), importantes

no processo cicatricial, utilizando a técnica de zimografia eletroforética a partir dos

meios coletados após experimento com as biópsias de explants de pele.


28 Materiais e Métodos │

3 Materiais e Métodos

3.1 Materiais

Todas as soluções aquosas, incluindo tampões, meio de cultura, entre outras, foram

preparadas com água ultrapura, obtida através do sistema de filtração Direct-Q, com filtro de

0,22 µm, da Millipore (Molsheim, França).

O fármaco fotossensibilizante utilizado foi a cloro alumínio ftalocianina (fórmula

empírica C32H18AlClN8) procedente da Sigma-Aldrich Chem. Co. (Milwaukee, EUA), com

pureza de 85%. Todos os experimentos foram realizados a partir de um único lote do fármaco

(14154-42-8).

Para o cultivo da linhagem celular HT-1080, preparação dos equivalentes dermais,

bem como das biópsias de explants de pele foi utilizado o meio Dubleco Eagle’s Minimum

Essential Medium – DMEM (Gibco BRL, EUA) contendo 100 U/mL de penicilina, 100

µg/mL de estreptomicina (Gibco BRL, EUA), 2,5 µg/mL de anfotericina B (Gibco BRL,

EUA), 200 μM de glutamina (Gibco BRL, EUA), constituído de uma mistura de sais

enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para o crescimento

celular.

Nos estudos histopatológicos para fixação e coloração das biópsias foram utilizados os

seguintes materiais: formaldeído 37% estabilizado com 10-15% de metanol (ACROS,

Bélgica) para fixação das biópsias, Orceína (Sigma-Aldrich, EUA) para coloração da rede de

elastina e Picrosirus Red (Sigma-Aldrich, EUA) para a coloração da rede de colágeno.

O colágeno utilizado na preparação dos géis para incorporação das biópsias de pele foi

obtido conforme protocolo que será descrito posteriormente na sessão 3.3.3.



Nos experimentos de zimografia eletroforética utilizaram-se os seguintes reagentes para

preparo dos géis e das soluções tampões: bis/acrilamida 40% (Bio-Rad, EUA), SDS 20% (Bio-

Rad, EUA), azul de coomassie G250 (Bio-Rad, EUA), Tris (Bio-Rad, EUA), glicina (Bio-Rad,

EUA), persulfato de amônio – APS (Bio-Rad, EUA), N,N,N,N-tetrametil etileno diamina -

TEMED 5% (Bio-Rad, EUA), azul de bromofenol (Merck, Alemanha), Triton X-100 (Sigma-

Aldrich, EUA) e gelatina tipo A (Sigma-Aldrich, EUA).

3.2 Equipamentos

Nos estudos espectrofotométricos foi utilizado o espectrofotômetro de absorção

Lambda 20 da Perkin Elmer (Waltham, EUA), e nos estudos de emissão de fluorescência foi

utilizado o espectrofluorímetro Fluorolog-3 da Jobin Yvon-SPEX (Longjumeau, França).

Nos estudos de tamanho de partícula, índice de polidispersão e potencial zeta foi

utilizado o equipamento Zetasizer (Nano-ZS da Malvern- R.U.), o qual permite realizar

medidas não invasivas por “backscatter optics” (NIBS) e determinar partículas no intervalo de

2 nm a 3 μm.

O sistema laser utilizado nos ensaios de bioestimulação luminosa foi um diodo-laser

Eagle (Quantum Tech, São Carlos-SP, Brasil) com feixe de excitação em 670 nm,

trabalhando numa potência máxima 0,67 W acoplado a um feixe óptico de 1 cm de

comprimento.

As imagens obtidas após análise histológica foram registradas utilizando-se um

microscópio óptico modelo Axiovert 40-CFL da Carl Zeiss (Oberkochen, Alemanha),

acoplado a uma câmera digital Axio-Cam MRC de alta resolução, com conjunto de objetivas

para aumento de 10, 20, 40 e 100 X, calibradas para escalas micrométricas (contraste de fase,



plasdic e emissão de fluorescência). O software AxioVision Release 4.8.2.da Carl Zeiss

(Oberkochen, Alemanha) permitiu a quantificação das estruturas presentes nessas imagens.

Nos estudos de expressão das metaloproteases foi utilizado o aparato para zimografia

eletroforética vertical, modelo Protean® III da Bio-Rad (Hercules, EUA) com cuba para dois

géis alimentada por uma fonte Bio-Rad modelo PowerPac Basic® operando com voltagem

máxima de 300 V, corrente de 400 mA para uma potência máxima de 75 W. As placas

espaçadoras utilizadas foram de 1,0 mm para 10 poços.

Para a obtenção e digitalização das imagens dos géis de zimografia foi utilizado o

sistema de aquisição de imagens da UVITec Cambridge (R.U.), modelo UVIdoc HD2/20M,

com câmera de 1.4 megapixels e câmara ultravioleta. Já a quantificação das imagens foi

realizada por meio do software GeneTools da Syngene (Cambridge, R.U.) utilizado no

laboratório do Prof. Dr. Adalberto Luiz Rosa do Departamento de Cirurgia, Traumatologia

Buco-Maxilo-Facial e Periodontia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP.

Utilizaram-se também os seguintes equipamentos de rotina: balança analítica

eletrônica da Denver Instruments Company (Bohemia, EUA) modelo A-200 DS, agitador de

tubos Phoenix AP-56 (Araraquara – SP, Brasil), ultrassom Branson modelo 2210 da

Bransonic® Ultrasonic cleaner (Danbury, EUA), pH-metro de bancada Qualxtron, modelo

QX 1500 Plus da Hexis Científica (Indaiatuba-SP, Brasil).



3.3 Métodos

3.3.1 Preparo do sistema de liberação de fármacos: nanoemulsão

A nanoemulsão do tipo óleo em água foi preparada empregando-se a técnica de

emulsificação espontânea, como descrito por PRIMO,F.L., 2009. Primeiramente preparou-se

uma solução aquosa contendo o polímero da classe dos poloxamers. Consecutivamente, foi

preparada uma solução orgânica (em acetona) contendo a fosfatidilcolina de soja, sob agitação

magnética e aquecimento a 55°C. A esta fase adicionou-se um volume de óleo Miglyol numa

concentração final de 1 a 2,5%. Após homogeneização, a fase orgânica foi então adicionada

lentamente, com auxílio de uma seringa, diretamente à solução aquosa contendo o polímero.

A última etapa de preparo consistiu na extração total do solvente orgânico pós-emulsificação,

utilizando-se um rotaevaporador com banho a 85oC e pressão reduzida para se obter um

volume final de 10 mL.

A cloro alumínio ftalocianina (ClAlPc) foi incorporada ao sistema coloidal

nanoestruturado diretamente na fase oleosa, sob agitação vigorosa, numa concentração final

de 0,05 mg mL-1

. Esta fase orgânica foi então adicionada durante o processo de preparo de

nanoemulsões, como descrito anteriormente.

3.3.2 Caracterização físico-química da nanoemulsão contendo ClAlPc

3.3.2.1 Determinação do tamanho das gotículas, índice de polidispersão e potencial Zeta

Na determinação do tamanho das gotículas, índice de polidispersão e potencial Zeta da

nanoemulsão contendo ClAlPc utilizou-se o equipamento Zetasizer modelo Nano ZS90 da

Malvern (R.U.), conforme descrito no item 3.2.



O diâmetro médio das gotículas que formam a nanoemulsão e a distribuição de

tamanho (índice de polidispersão – IPd) foram determinados pela análise por espalhamento

dinâmico de luz (espectroscopia de correlação de fótons, PCS). As análises foram realizadas

em ângulo de varredura de 173° e após diluição de 30 μL da formulação em 3 mL de água

ultrapura. Já o potencial Zeta foi determinado pela mobilidade eletroforética das amostras

coloidais. Todas as determinações foram feitas em triplicata a 25°C com diluição idêntica à

descrita anteriormente. As leituras foram realizadas utilizando-se os conjuntos de cubetas de

acrílico padronizadas do próprio equipamento.

3.3.2.2 Estudos de estabilidade

A formulação contendo ClAlPc foi estocada a 4oC em frasco de vidro, selado e

protegido da luz durante um período de 3 meses. Foram realizadas medidas de diâmetro

médio das gotículas, índice de polidispersão e potencial Zeta (item 3.3.2.1) a cada 7 dias

durante este período de estocagem, podendo-se avaliar assim a estabilidade da formulação no

período de 3 meses. O monitoramento do comportamento termodinâmico é essencial para se

validar o método de preparação, além de delinear as condições de caracterização para estudos

posteriores.

3.3.2.3 Doseamento da ClAlPc na nanoemulsão

A determinação do conteúdo de ClAlPc na nanoemulsão foi realizada por

espectrofotometria de absorção na região do UV-Vis. Os espectros foram determinados no

estado estacionário e obtidos utilizando-se cubetas de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico.

Foi preparada uma solução diluindo 100 µL da nanoemulsão contendo o fármaco (solução



estoque) em 3 mL de acetonitrila, seguindo o método já validado descrito por SIQUEIRA-

MOURA et al., 2010.

3.3.3 Extração de colágeno tipo I

O colágeno utilizado na preparação dos géis foi proveniente de um material

anteriormente obtido, conforme citado em PRIMO, F.L., 2009. O protocolo experimental foi

revisado e aprovado pelo Comitê de Pesquisas em Humanos (protocolo 2007.1.487.58.7,

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil). O colágeno tipo I foi extraído a partir de

tendões de caudas de ratos Wistar machos com 10 semanas e com peso aproximado de 300 g.

Foram obtidas 10 caudas, as quais foram lavadas e colocadas em banho de álcool.

Posteriormente, as caudas foram dessecadas removendo-se a ponta de cada fio de tendão

exposto, que foi retirado com auxílio de uma pinça e imediatamente colocado sobre uma placa

de Petri contendo água destilada. Todos os tendões removidos foram recolhidos, pesados e

colocados em uma solução de ácido acético glacial 5%. A solução obtida permaneceu em

geladeira a 4oC por uma semana, sendo agitada diariamente para garantir uma boa extração.

Transferiu-se esta solução para garrafas de 250 mL estéreis, as quais foram centrifugadas por

2 h a 6.000 rpm em rotor Sorvall SLA 1500, a 4oC, para remoção de partículas suspensas.

Após esse processo, foram obtidos aproximadamente 1 L de colágeno, o qual foi armazenado

em geladeira a 4oC para uso posterior.

3.3.4 Preparação das biópsias de explants de pele e dos géis de colágeno

Neste trabalho de pesquisa, utilizou-se como matriz suporte para o cultivo das biópsias

explants de pele uma matriz formada por gel de colágeno. A escolha deste tipo de matriz se



deve ao fato de que o colágeno, além de ser um biopolímero, apresenta a vantagem de

estimular a migração e proliferação celular, auxiliando no processo regenerativo. Para o

cultivo celular em gel de colágeno, as biópsias de pele humana (explants de pele obtidos

durante cirurgia plástica de coxa de doadores saudáveis) foram primeiramente limpas pela

remoção da camada de gordura. A pele limpa foi lavada com meio de cultura DMEM na

presença de antibióticos e anfotericina B e na ausência de soro fetal bovino. Após a lavagem,

as peles foram cortadas em círculos com 4 mm de diâmetro, utilizando-se um instrumento

apropriado chamado punch, e mantidas em placas contendo meio DMEM 20%, conforme

previamente estabelecido por (NAVEAU et al., 2007). A Figura 7 ilustra como é feito o corte

das biópsias de pele, porém na situação real a camada de gordura (camada inferior) foi

removida.

Figura 7. Corte da pele com o instrumento punch evidenciando as suas três camadas:

epiderme, derme e hipoderme. Fonte: http://piel-l.org/libreria/item/917

Os géis de colágeno contendo as biópsias de pele foram preparados em placas de Petri

de 60 mm, de acordo com a seguinte composição: meio DMEM suplementado com 10% de

soro de fetal bovino, 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 2,5 µg/mL de

anfotericina B, solução de colágeno tipo I e NaOH 0,1 M para ajuste de pH para 7,4. Todo o

procedimento foi realizado com um controle rigoroso de temperatura evitando que o processo



de colagenização se iniciasse antes do tempo desejado. O sistema gel de colágeno associado

com a biópsia foi mantido a 37°C durante 3 h, a fim de induzir a polimerização do colágeno.

Ao todo foram preparadas 54 placas contendo o sistema gel de colágeno/biópsia de pele, as

quais foram nomeadas seguindo as condições escolhidas para o estudo, sendo: CT - Controle

(somente o gel de colágeno), G1 – Nanoemulsão sem o fármaco, G2 – Nanoemulsão ClAlPc

na ausência de estímulo luminoso, G3 – Nanoemulsão ClAlPc + luz (70 mJ/cm2), G4 –

Nanoemulsão ClAlPc + luz (140 mJ/cm2), G5 – Nanoemulsão ClAlPc + luz (700 mJ/cm

2),

G6 – Luz (70 mJ/cm2), G7 – Luz (140 mJ/cm

2) e G8 – Luz (700 mJ/cm

2).

A escolha das doses de luz, bem como a concentração do fármaco fotossensibilizante e

o tempo de incubação com o fármaco foi feita baseada em trabalhos prévios do grupo

(BARBUGLI, P. A., 2010; PRIMO, F. L., 2009; SIMIONI, A. R., 2009). Em trabalho prévio

(BARBUGLI, P. A., 2010), o fármaco fotossensibilizante ClAlPc foi encapsulado em

vesículas lipossomais. Foi determinada uma faixa de concentração do fármaco,

estabelecendo-se a concentração de 0,29 µg mL-1

(ou 0,5 µM) como a que não causou a morte

celular após 1 h de incubação com o fármaco ClAlPc em células metastáticas de melanoma

humano. Além disso, no mesmo trabalho foram montados modelos de cultura com

fibroblastos dermais em gel de colágeno, os quais foram submetidos a tratamentos com a

formulação ClAlPc lipossomal e irradiação com laser nas doses de 70, 140 e 700 mJ/cm2,

seguindo uma sequência de ações pré-estabelecidas



3.3.5 Tratamento com a formulação de ftalocianina e irradiação das placas

Após o período de polimerização, os géis de colágeno foram cobertos com meio

DMEM 10% e as placas mantidas em incubadora a 37oC, sendo posteriormente o meio

trocado para DMEM 3%, seguindo as condições pré-estabelecidas. Nas placas do grupo G1, o

meio adicionado continha 20% da nanoemulsão sem o fármaco. Somente nas placas

pertencentes aos grupos G2, G3, G4 e G5, a concentração de ftalocianina presente no meio foi

de 7,5 μM. Nas demais, o meio adicionado não continha o fármaco.

O tempo de incorporação do fármaco na incubadora foi de 20 a 40 min, a 37oC e fluxo

de 5% de CO2 (condições da incubadora). Em seguida, o meio foi trocado e as biópsias foram

irradiadas com laser de diodo (na potência de 0,67 W, comprimento de onda de 670 nm e

feixe óptico de 1 cm) nas diferentes doses de energia selecionadas. No final da irradiação,

retirou-se o meio de todas as placas e completou-as com 2 mL de meio DMEM 10%. Os géis

foram mantidos na incubadora, nas mesmas condições anteriores, por diferentes períodos de

incubação: a primeira metade foi retirada após 7 dias de tratamento e a segunda após 14 dias.

Dessa forma, pode-se observar a influência da TFD na produção e restauração da rede de

elastina e colágeno da pele em diferentes períodos de tratamento. As amostras de meio de

cultura aliquotadas de cada placa foram congeladas a -70ºC e as biópsias recolhidas ficaram

mantidas em solução de formaldeído 4% para fixação. A Figura 8 ilustra as principais etapas

desde o preparo dos géis de colágeno contendo as biópsias de pele até a irradiação com laser.



Figura 8. Principais etapas do experimento com biópsias de explants de pele: A) Fragmento

de pele humana mantido em meio DMEM para realização do corte das biópsias; B) Biópsias

de pele cortadas utilizando o punch e mantidas em meio DMEM; C) Placas de Petri contendo

o gel de colágeno e as biópsias de pele; D) Irradição das placas com laser de 670 nm após

tratamento com cloro alumínio ftalocianina.

3.3.6 Fixação das biópsias e análise histológica

No final de cada sequência de explants, as biópsias foram fixadas por 24 h em

formaldeído 4%, considerado como fixador universal. Tal procedimento teve como objetivo

preservar a biópsia e facilitar a posterior coloração. As biópsias foram mantidas no

refrigerador a 4°C até o processo de inclusão em parafina.

A inclusão em parafina tem como objetivo dar sustentação ao tecido mantendo juntas

as células e estruturas intercelulares. Ela ocorre em 4 etapas: desidratação, diafanização,

A B

C D



impregnação da parafina e inclusão. A desidratação deve ser gradual, sendo o álcool etílico o

agente mais comumente utilizado neste processo, empregado numa série crescente (70% -

80% - 90% - 100%) para se evitar a retração pronunciada do tecido ocasionando lesões

estruturais da célula de caráter irreversível. Na etapa de diafanização deve-se trocar o álcool

gradualmente por um solvente que solubiliza a parafina, no caso foi utilizado benzeno. Nesta

etapa o tecido se encontra translúcido, o que mostra que a etapa de desidratação foi eficiente.

Já no processo de impregnação pela parafina, as peças foram colocadas em recipientes de

alumínio contendo parafina a 60oC, sendo necessárias 2 trocas de recipiente até obter uma

parafina pura. Finalmente, as biópsias foram incluídas em parafina, formando blocos.

Para a montagem das lâminas, as biópsias foram seccionadas em micrótomo manual.

Duas seções de 5 μm foram obtidas de cada bloco, sendo posteriormente dispostas em lâminas

de vidro e coradas com Orceína (para a rede de elastina) e Picrosirius Red (rede de colágeno).

Para cada coloração histológica, as amostras foram submetidas ao processo de desidratação da

parafina, passando por banhos sucessivos de tolueno e etanol em concentrações decrescentes.

Após este processo as lâminas foram coradas utilizando protocolos clássicos para cada tipo de

coloração. Ao final das colorações, a parafina foi hidratada e as lâminas analisadas por

microscopia.

Todo este procedimento foi realizado com o auxílio da técnica Vani Maria Alves do

Laboratório de Histologia do Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes

Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, com o qual temos

colaboração.



3.3.7 Doseamento de colágeno e elastina nas de biópsias de explants de pele

As seções histológicas coradas (54 lâminas para cada coloração) foram analisadas em

microscópio óptico da Carl Zeiss (Oberkochen, Alemanha), como descrito anteriormente na

sessão 3.2. Para a análise de colágeno, as biópsias também foram visualizadas com luz

polarizada, permitindo diferenciar os tipos de colágeno existentes devido à birrefringência dos

mesmos.

Para a quantificação de colágeno e elastina foi utilizado o software AxioVision Release

4.8.2 da Carl Zeiss (Oberkochen, Alemanha), acoplado ao microscópio óptico. Este software

possibilita a marcação por cor e posterior quantificação das áreas marcadas, conforme a

estrutura de interesse, fornecendo parâmetros como "soma da área", "porcentagem de área",

entre outros, para cada imagem analisada. Assim, utilizando-se o parâmetro "soma da área"

foi possível relacionar e calcular o aumento ou redução percentual da quantidade de colágeno

e elastina presente em cada imagem em relação à imagem do controle.

A Figura 9 mostra um exemplo de imagem após a marcação das áreas a serem

quantificadas pelo software AxioVision Release 4.8.2.

Figura 9. Marcação (verde) da rede de elastina (vermelho) de uma amostra de imagem,

utilizando o software AxioVision Release 4.8.2 da Carl Zeiss acoplado ao microscópio óptico.



3.3.8 Avaliação da expressão das enzimas MMP-2 e MMP-9 por zimografia

O estudo da expressão das metaloproteases MMP-2 e MMP-9, presentes no processo

de cicatrização, foi realizado pela técnica de zimografia a partir dos meios coletados e

aliquotados após os diferentes tempos de tratamento das biópsias de explants de pele (7 e 14

dias).

Foi elaborado um roteiro experimental, de forma que cada gel pudesse conter no

mínimo uma amostra de cada condição avaliada no experimento. Assim, sabendo que cada

condição foi avaliada em triplicata, foi necessário realizar 3 géis para as amostras tratadas por

7 dias e mais 3 géis para aquelas tratadas durante 14 dias após a irradiação das placas. Os

meios recolhidos após o experimento foram nomeados, conforme mostra a Tabela I.

Tabela I. Nomenclatura das amostras de meio de cultura recolhidas após o experimento com

biópsias de explants de pele e utilizadas nos estudos por zimografia.

*Formulação que não contém o fármaco.

Grupo Condição Dia 7 Dia 14

CT Controle 28 29 30 82 83 84

G1 Formulação vazia* 31 32 33 85 86 87

G2 ClAlPc 34 35 36 88 89 90

G3 ClAlPc + 70 mJ/cm2 37 38 39 91 92 93

G4 ClAlPc + 140 mJ/cm2 40 41 42 94 95 96

G5 ClAlPc + 700 mJ/cm2 43 44 45 97 98 99

G6 70 mJ/cm2 46 47 48 100 101 102

G7 140 mJ/cm2 49 50 51 103 104 105

G8 700 mJ/cm2 52 53 54 106 107 108



Dessa forma, os géis foram elaborados seguindo a ordem proposta na Tabela II.

Tabela II. Ordem das amostras nos géis de zimografia segundo nomenclatura estabelecida

Gel Dia Ordem das amostras

1 7 Rainbow* HT

** 28 34 37 40 43 46 49 52

2 7 Rainbow HT 29 35 38 41 44 47 50 53

3 7 Rainbow HT 30 36 39 42 45 48 51 54

4 14 Rainbow HT 82 88 91 94 97 100 103 106

5 14 Rainbow HT 83 89 92 95 98 101 104 107

6 14 Rainbow HT 84 90 93 96 99 102 105 108

*Marcador de peso molecular utilizado;

** Linhagem celular HT-1080 (fibrossarcoma humano), utilizada como padrão.

Previamente ao experimento, foram preparadas todas as soluções e tampões utilizados.

Inicialmente foi feita a montagem do sistema Bio-rad do tipo Protean III, como descrito na

sessão 3.2, dentro das normas apresentadas pelo fabricante. Após montagem do sistema

iniciou-se a preparação do gel de corrida, permitindo obter 4 géis. Desta forma, 20 mg de

gelatina foram inicialmente dissolvidos em 9,7 mL de água destilada, em banho de água a

60oC. A esta mistura foi adicionado (na sequência) tampão Tris 1,5 M pH 8,8, SDS 10%,

Acrilamida/bis 40%, APS 10 % (Persulfato de amônio pré-aliquotado) e N,N,N,N-Tetrametil

etileno diamina (TEMED 5%). Depois de colocar o gel de corrida nas placas suportes (até 1

cm abaixo do nível superior), completou-as com água destilada e iniciou-se o processo de

polimerização. Após este processo, preparou-se o gel de aplicação de maneira análoga ao gel

de corrida, porém com proporções diferentes de cada solução. Após a remoção da água

colocada sobre as placas, foi adicionado o gel de aplicação, seguido imediatamente da



aplicação dos marcadores de canais de 1,0 mm de largura, contendo 10 aplicadores. O sistema

foi deixado polimerizar por mais 15 minutos.

As amostras a serem aplicadas foram preparadas pela mistura de proporções

equivalentes de tampão de amostra (SDS 10%, Tris-HCl pH 6,8 e corante azul de bromofenol

0,1%) e as amostras de meio isoladas, previamente aliquotadas, e estocadas durante cada

experimento. Desta mistura homogeneizada, aplicou-se 5 μL por poço em cada gel. Utilizou-

se uma suspensão de células de fibrossarcoma humano (HT-1080), para produção do meio de

cultura utilizado como padrão para as bandas de metaloproteases do tipo MMP-9 e MMP-2,

bem como um marcador de peso molecular numa ampla faixa (Rainbow).

Uma solução tampão pH 8,0 contendo Tris, glicina e SDS (tampão de corrida) foi

preparada em quantidade apropriada de maneira a cobrir as cubas até a borda superior. Após

polimerização completa, o marcador de canal foi retirado e as amostras aplicadas sobre o gel

imerso no meio de corrida. Uma vez completo o gel, iniciou-se a eletroforese com aplicação

inicial de 70 V por 30 min seguidos de 90 V por aproximadamente 2 h. Terminada a

eletroforese, os géis passaram por 2 lavagens seguidas de 30 min cada com solução de Triton-

X 100 2,5% para eliminar o SDS do gel e depois com água destilada em abundância para

remoção de qualquer traço de detergente. Ao final das lavagens, os géis foram incubados a

37°C com o tampão de incubação (pH 8,0; NaN3; CaCl2 5,0 mmol/L) por 24 h.

Após o período de aproximadamente 24 h, o meio de incubação foi trocado e

adicionou-se a solução de coloração (azul de Coomassie R250 a 0,5%; ácido acético a 10%;

isopropanol a 20%), seguida do meio de revelação (ácido acético a 10% e isopropanol a 20%).

Os géis foram deixados por 30 min em cada meio e finalmente armazenados nas placas

contendo água destilada. A Figura 10 representa um esquema de algumas etapas do processo

de zimografia, mostrando os equipamentos utilizados.



Figura 10. Etapas do processo de zimografia: A) Montagem dos géis; B) Amostras aplicadas

no gel inserido na cuba de corrida; C) Revelação dos géis com solução de Azul de

Coomassie; D) Gel finalizado.

3.3.9 Quantificação dos géis de zimografia

O registro fotográfico das bandas foi realizado utilizando o sistema de aquisição de

imagens da UVITec Cambridge, modelo UVIdoc HD2/20M, com câmera de 1.4 megapixels e

câmara ultravioleta. Já a quantificação das imagens foi feita através do software GeneTools da

Syngene, como descrito no item 3.2.

Para a quantificação das bandas, primeiramente, foi feita uma inversão de pixels da

imagem do gel, assim os pontos brancos tornaram-se pretos, o que facilitou a visualização e

quantificação da intensidade de cor (Figura 11). Em seguida, foi quantificada a intensidade

das bandas referentes aos diferentes grupos em relação à intensidade da banda referente ao

A B

C D



controle. Deste modo, sabendo-se que os géis foram feitos em triplicata, para cada condição

experimental, obteve-se 3 resultados de intensidade de banda para cada grupo analisado. A

média aritmética desses resultados foi realizada e aplicou-se o pós-teste Turkey, obtendo

assim o aumento na expressão das metaloproteases MMP-2 e MMP-9 após 7 e 14 dias das

biópsias de explants de pele submetidas ao tratamento com fármaco fotossensibilizante e

irradiação em diferentes doses de luz.

A)

B)

Figura 11. A) Imagem obtida de um gel de zimografia utilizando-se o sistema de aquisição de

imagens com câmara ultravioleta; B) Imagem com inversão de pixels.

3.4 Análise estatística e softwares

Os valores obtidos experimentalmente foram calculados empregando-se o programa

Excel Microsoft 2010 e as análises estatísticas foram realizadas no programa Prism 3.0

através dos testes de análise de variância (One-way Anova), sendo Turkey o pós-teste

aplicado. Todos os espectros obtidos foram plotados utilizando-se o software Igor-Pro®

Wavemetrics 3.16β01 (versão científica).


45 Resultados e Discussão │

4 Resultados e Discussão

4.1 Determinação do tamanho das gotículas, índice de polidispersão e potencial Zeta

da nanoemulsão contendo ClAlPc

As medidas do diâmetro médio das gotículas e do índice de polidispersão, obtidas por

espalhamento dinâmico de luz, e do potencial Zeta, como descrito no item 3.3.2.1, estão

contidas na Tabela III.

Tabela III. Parâmetros físico-químicos para a nanoemulsão contendo ClAlPc

Diâmetro

médio das

gotículas (nm)

IPd

Potencial

Zeta

(mV)

ClAlPc

(0,05 mg

mL-1

)

200,7±10,4 0,16±0,04 -45,4±6,8

Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão dos ensaios realizados.

O diâmetro médio encontrado para as gotículas que formam a nanoemulsão foi de

aproximadamente 200 nm. Há uma discussão que envolve faixas de tamanho de partícula

adequadas para determinados sistemas de liberação de fármacos. No caso da nanoemulsão, a

faixa de 200 nm é adequada, já que a via de administração dessa formulação é tópica, não

ocasionando problemas como obstrução de vasos sanguíneos, agregação das partículas, entre

outros.

O índice de polidispersão (IPd) é um indicativo da distribuição de tamanho de uma

formulação. Como é possível observar na Tabela III, a formulação apresentou um IPd abaixo



de 0,5, confirmando a capacidade do método de preparo de nanoemulsões em produzir

formulações homogêneas (SIQUEIRA-MOURA, 2011).

O potencial Zeta apresentou um valor médio de -45,4 mV. Este valor demonstrou um

potencial superficial predominantemente negativo, resultado do balanço das cargas

superficiais. Sabe-se que valores muito positivos ou muito negativos de potencial Zeta

(geralmente maiores que +30 mV ou menores que -30 mV) são indicadores de sistemas

termodinamicamente estáveis, pois quanto mais cargas somente positivas ou somente

negativas estiverem na superfície das partículas que compõem o sistema, maior é a repulsão

entre elas, ou seja, mais dispersas elas se encontram no sistema, evitando assim a formação de

agregados, ou aglomerados, que promovem a desestabilização desse sistema. Dessa forma, o

valor médio de -45,4 mV encontrado para o potencial Zeta está adequado para uma

formulação estável, e consequentemente para o seu posterior uso.

4.2 Estudo de estabilidade termodinâmica da nanoemulsão contendo ClAlPc

A estabilidade termodinâmica é um fator chave no desenvolvimento de um sistema de

liberação de fármacos. O monitoramento da estabilidade físico-química da formulação foi

investigado avaliando-se o tamanho das gotículas, potencial Zeta e índice de polidispersão da

formulação durante 3 meses, com estocagem a 4oC. A Figura 12 apresenta as medidas de

tamanho das gotículas, índice de polidispersão e potencial Zeta, mostrando o perfil obtido.



Figura 12. Estudo de estabilidade físico-química monitorando-se o tamanho médio das

gotículas, o índice de polidispersão (A) e o potencial Zeta (B) em função do tempo para a

nanoemulsão contendo ClAlPc. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Os resultados demonstraram que o sistema de liberação contendo o fármaco ClAlPc

apresentou uma estabilidade termodinâmica apropriada, com tamanho médio das gotículas de

200 nm, como mostra a Tabela III. O índice de polidispersão não apresentou grandes

variações durante o tempo avaliado, o que condiz com sistemas homogêneos monodispersos.

O mesmo ocorreu para o potencial Zeta, o que mostra que o sistema é estável durante o

A

B

Diâ

met

ro m

édio

das

gotí

cula

s (n

m)

Índ

ice de p

olid

ispersã

o (IP

d)

Pote

nci

al

Zet

a –

ζ (

mV

)



período avaliado, do ponto de vista que não houve variação significativa nas cargas

superficiais das gotículas.

4.3 Doseamento da ClAlPc na nanoemulsão

O doseamento da ClAlPc na nanoemulsão foi realizado seguindo um método validado

pelo trabalho do grupo descrito por SIQUEIRA-MOURA et al., 2010, através da

determinação dos espectros de absorção na região do UV-Vis e de fluorescência da ClAlPc,

como descrito no item 3.3.2.3.

As Figuras 13 A e C apresentam os espectros de absorção e de fluorescência da

ClAlPc, respectivamente. O espectro de absorção de ftalocianinas é composto por duas

principais bandas, as quais se encontram na região ultravioleta (300 – 350 nm), conhecida

como Banda-B ou Soret, e na região do visível (600 – 700 nm), conhecida como banda-Q

(SIQUEIRA-MOURA et al., 2010). Ambas as bandas estão associadas às transições π-π*

correspondentes a diversos modos vibracionais do anel. Fatores que influenciam a posição

dessas bandas para as diferentes ftalocianinas são o átomo central, o estado de oxidação do

metal, spin, substituintes do anel, entre outros. O espectro de absorção da ClAlPc mostrado na

Figura 13 A apresenta as típicas bandas Soret e banda-Q, características de

metaloftalocianinas, com máximo de absorção em 670 nm.

O espectro de fluorescência, obtido de SIQUEIRA-MOURA et al., 2010 e mostrado

na Figura 13 C, demonstrou uma alta intensidade de fluorescência, com comprimento de onda

de excitação em 615 nm, e emissão em 674 nm, como descrito na literatura (NUNES ,

SGUILLA e TEDESCO, 2004; TEDESCO , ROTTA e LUNARDI, 2003).



Figura 13. (A) Espectro de absorção na região do UV-Vis da solução de ClAlPc em

acetonitrila, (B) Curva de calibração da ClAlPc em acetonitrila, Absorbância = 0.3829 X

[ClAlPc, concentração em μg mL−1

] + 0.0126 (R = 0,9992) (SIQUEIRA-MOURA et al.,

2010) e (C) Espectro de fluorescência da solução de ClAlPc em acetonitrila com excitação em

615 nm (SIQUEIRA-MOURA et al., 2010).

Inte

nsi

dad

e d

e fl

uore

scên

cia (

u.a

.)

Comprimento de onda (nm) C

Comprimento de onda (nm)



O cálculo da quantidade de ClAlPc presente na formulação foi realizado utilizando-se

uma curva de calibração para este fármaco, Figura 13 B, obtida exatamente nas mesmas

condições e equipamentos os quais foi obtido o espectro de absorção da ftalocianina, como

mostrado em SIQUEIRA-MOURA et al., 2010. Os cálculos apontaram uma concentração

final de aproximadamente 25 µg mL-1

de cloro alumínio ftalocianina na solução estoque, os

quais condizem com o fator de diluição de 50% da concentração de ftalocianina que foi

adicionada durante o preparo da formulação, que se deve à diluição da fase orgânica, que

contém o fármaco, pela fase aquosa no processo de emulsificação.

4.4 Análise histológica

A pele consiste de um número de camadas com funções distintas e propriedades

ópticas distintas. Quando luz branca incide sobre a pele, ela penetra pelas camadas

superficiais e um pouco é absorvida, porém a maior parte é reemitida e pode ser registrada por

uma câmera (CLARIDGE et al., 2003).

O procedimento mais usado no estudo de tecidos é a preparação de cortes histológicos

que podem ser estudados com a ajuda de um microscópio, como é o caso do procedimento

escolhido para a análise das biópsias de explants de pele. No microscópio de luz (também

chamado de microscópio óptico) a imagem foi examinada pela passagem de um feixe de luz

transmitido através do corte. Considerando que tecidos e órgãos são normalmente espessos

demais para permitir a passagem de um feixe de luz, eles foram seccionados a fim de se obter

cortes delgados. Para isso, o tecido foi imerso numa solução fixadora, formaldeído a 4%, para

imobilizar as proteínas. Em seguida, água foi removida do tecido através de banhos com

álcool, o tecido foi posteriormente diafanizado com solvente orgânico. O tecido foi então

incluído em meio firme, parafina, para se obter cortes finos por meio de um instrumento



chamado micrótomo. Os cortes foram corados para permitir que se observassem os detalhes

dos tecidos. Desta maneira, é possível estudar essas estruturas por longos períodos sob

diversas condições fisiológicas ou experimentais (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004)

4.4.1 Análise para elastina

As imagens obtidas após as análises das lâminas contendo as biópsias de pele pós-

coloração, como descrito no item 3.3.7, foram agrupadas segundo o tipo de estrutura a ser

analisada. A Figura 14 apresenta a imagem obtida da amostra sem tratamento (controle)

corada com Orceína, com aumento de 10x. Através da Figura 14 é possível observar as

estruturas da pele, sendo a primeira camada distinguível a epiderme e logo após a derme.

Figura 14. Análise histológica da biópsia de explant de pele sem tratamento (controle) e

corada com Orceína, evidenciando as camadas da pele: epiderme e derme.

Derme Epiderme



A Orceína é um corante ácido com baixa solubilidade em água e principalmente

solúvel em etanol. Esse corante é tipicamente utilizado por histologistas e sua coloração

evidencia as redes de elastina presentes na derme. A Figura 15 apresenta a fórmula estrutural

da Orceína.

Figura 15. Molécula de Orceína Fonte: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Orcein.png

A elastina é formada após a polimerização de múltiplas moléculas precursoras

tropoelastina, sintetizadas por fibroblastos dérmicos, secretadas e depois polimerizadas na

elastina insolúvel. A elastina madura insolúvel, formada no corpo humano quase que

exclusivamente durante os períodos de gestação e infância, é metabolicamente inerte e o

elemento mais duradouro da matriz extracelular (GOLINSKI et al., 2011; GUNDIAH ,

RATCLIFFE e PRUITT, 2007; MITTS et al., 2010).

Assim como para a amostra sem tratamento, foram obtidas imagens de todas as

amostras de pele obtidas após o experimento, variando-se o tipo de tratamento (com fármaco

fotossensibilizante e luz ou somente com luz), a dosagem de luz (70, 140 e 700 mJ/cm2) e o

período de tratamento (7 e 14 dias). As imagens mais relevantes estão mostradas nas Figuras

16 e 17, porém em todas as imagens obtidas foram observadas as redes de elastina presentes

na derme, algumas em maior quantidade e mais intensidade do que outras, dependendo do

tipo de tratamento realizado. A fim de quantificar essa diferença na intensidade das fibras

elásticas foi realizada uma análise quantitativa delimitando as áreas onde predominavam as

fibras elásticas, conforme descrito no item 3.3.7. As Figuras 16 e 17 apresentam essa análise

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Orcein.png



quantitativa percentual das áreas onde estão presentes as fibras elásticas, para dois períodos de

tratamento distintos: 7 e 14 dias. Buscando um melhor entendimento, as figuras foram

agrupadas de acordo com o tipo de tratamento. Em ambas as figuras estão evidenciadas as

imagens das amostras cujos resultados foram mais relevantes, a fim de confirmar a análise

quantitativa.

A Figura 16 apresenta uma comparação entre os resultados das amostras que

receberam tratamento somente com luz, em diferentes doses. A análise histomorfológica

apontou um aumento na rede de elastina das amostras analisadas após 14 dias de tratamento, o

que não foi verificado após 7 dias de tratamento, sendo o grupo irradiado com luz na dose de

70 mJ/cm2 (G6) o que apresentou melhores resultados.

A Figura 17 mostra uma comparação entre os grupos que receberam tratamento com o

fármaco fotossensibilizante e luz, em diferentes doses. Assim como na Figura 16, observa-se

na Figura 17 que as amostras analisadas após 14 dias do tratamento apresentaram melhores

resultados, notando-se um aumento da rede de elastina em relação ao controle (amostra sem

tratamento), como pode ser visualizado. Dentre os grupos comparados, o que apresentou a

melhor combinação foi o grupo tratado com a cloro alumínio ftalocianina e irradiado com a

dose 140 mJ/cm2

(G4), após 14 dias de tratamento. Observou-se que doses maiores de

irradiação (ClAlPc + 700 mJ/cm2) provocaram a degradação da rede de elastina, como

evidenciado pelas imagens de microscopia das biópsias de pele.





incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias; B) 14 dias. Os resultados são expressos como

média ± desvio padrão, sendo *** (P <0,001), ** (P < 0,01) e * (P<0,05) estatisticamente

significativos.

A

B



Figura 17. Comparação entre as porcentagens de área de elastina das biópsias de pele tratadas

com a nanoemulsão contendo ClAlPc, irradiadas por laser de diodo (670 nm) em diferentes

doses de 70, 140 e 700 mJ/cm2 e incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias; B) 14 dias. Os

resultados são expressos como média ± desvio padrão, sendo *** (P <0,001) estatisticamente

significativos.

A

B



4.4.2 Análise para colágeno tipo I e tipo III

As fibras colágenas clássicas são as fibras mais numerosas no tecido conjuntivo. No

estado fresco estas fibras têm cor branca, conferindo esta cor aos tecidos nos quais

predominam. Estas fibras são birrefringentes, pois são constituídas por moléculas alongadas

arranjadas paralelamente umas às outras. Alguns corantes ácidos compostos por moléculas

alongadas, como o Picrosirius Red, são capazes de se ligar paralelamente a moléculas de

colágeno intensificando consideravelmente a sua birrefringência normal, produzindo uma cor

amarela forte. Devido a esta propriedade, o Picrosirius Red é usado como um método

específico para a detecção do colágeno, como foi o caso da metodologia escolhida para este

trabalho (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004). A coloração por Picrosirius Red é um método

histoquímico. Sendo um ânion forte, é capaz de reagir e tingir o colágeno, por meio do seu

grupamento sulfônico ácido com o grupamento básico presente na molécula do colágeno

(SIMIONI, 2009). A Figura 18 apresenta a fórmula estrutural do Picrosirius Red,

comercialmente conhecido como Direct Red 80 ou simplesmente Sirius Red.

Figura 18. Molécula Direct Red 80 (Sirius Red, Picrosirius Red) Fonte: http://www.sigmaaldrich.com

A análise histomorfológica das biópsias coradas por Picrosirius Red mostrou as redes

de colágeno presentes na derme, principalmente composta por colágeno do tipo I. O colágeno

tipo I é o mais comum; aparece nos tendões, na cartilagem fibrosa, no tecido conjuntivo

frouxo comum, no tecido conjuntivo denso (onde é predominante sobre os outros tipos),



sempre formando fibras e feixes nos ossos, tendões e pele (SIMIONI, A. R., 2009). O

colágeno tipo I é definido como colágeno antigo ou maduro, já o colágeno tipo III é definido

como colágeno novo ou imaturo (DAMS et al., 2011).

Existem muitas classes estruturais de colágeno na matriz extracelular, incluindo

fibrilas, redes e domínios de colágeno transmembrana. Fibrilas de colágeno tipo I em tendões

são de aproximadamente 1 cm de comprimento e até 500 nm de diâmetro. A tripla hélice no

colágeno do tipo I é menor do que 2 nm de diâmetro e 300 nm de comprimento. Uma

característica das fibrilas de colágeno tipo I é a sua periodicidade na estrutura, sendo repetidas

unidades (D = 67 nm), como mostra a Figura 19 (SHOULDERS e RAINES, 2009).

Figura 19. Rota biosintética para formação de fibras de colágeno tipo I, principal componente

estrutural da pele (adaptado de SHOULDERS e RAINES, 2009).

A Figura 20 ilustra as imagens obtidas por microscopia de campo claro (objetiva de

20x) das biópsias de pele coradas por Picrosirius Red. As imagens estão organizadas em dois

grupos, um relacionado às amostras tratadas por 7 dias e outro às amostras tratadas por 14

dias. De acordo com a Figura 20 é possível verificar as divergências quanto à quantidade de

fibras colágenas, bem como à intensidade dessas fibras, para cada amostra analisada. Alguns

grupos foram destacados por apresentarem maior quantidade de colágeno, como é mostrado

na Figura 20G, análise do grupo irradiado por 700 mJ/cm2 de luz e tratado por 7 dias, e na

Figura 20J, a qual aponta o grupo que recebeu tratamento com o fármaco fotossensibilizante e

luz na dose de 140 mJ/cm2 de luz e tratado por 14 dias.

Microfibrila de colágeno

fibra de colágeno

Lisil oxidase

“cross-linking”



A

Controle

B C D

ClAlPc + 70 mJ/cm2 ClAlPc + 140 mJ/cm

2 ClAlPc+ 700 mJ/cm

2

E F G

70 mJ/cm2 140 mJ/cm

2 700 mJ/cm

2

H

Controle

I J K

ClAlPc + 70 mJ/cm2 ClAlPc + 140 mJ/cm

2 ClAlPc+ 700 mJ/cm

2

L M N

70 mJ/cm2 140 mJ/cm

2 700 mJ/cm

2

Figura 20. Análise histológica das biópsias de pele tratadas com ClAlPc, irradiadas por laser

de diodo (670 nm) em diferentes doses, coradas por Picrosirius Red e visualizadas por

microscopia de campo claro (objetiva de 20x). A primeira sessão apresenta as amostras

tratadas por 7 dias e a segunda apresenta as amostras tratadas por 14 dias após a irradiação.

Dia 7

Dia 14



Pode-se identificar na Figura 20 a densa rede de colágeno formada por fibras

entrelaçadas, dispostas em feixes que não apresentam orientação fixa. Este tipo de tecido

conjuntivo é classificado como não-modelado. As fibras muito finas de colágeno que

caracterizam o tecido de granulação irão evoluir nesta fase para alcançar o diâmetro

equivalente às fibras recuperadas, presentes em uma derme intacta, enquanto que os espaços

inter-fibrilares irão diminuir. Este aumento do diâmetro das fibras está relacionado

diretamente à resistência final dos tecidos neo formados frente às forças de tração. Apesar da

pequena diferença na intensidade de coloração das lâminas, pode-se afirmar que a aplicação

da TFD evita que a rede de colágeno sofra degradação, fator de suma importância para que

ocorra o processo de cicatrização (SIMIONI, A. R., 2009).

Assim como na análise para elastina, inicialmente descrita no item 4.4.1, também foi

realizada uma análise quantitativa das áreas correspondentes ao colágeno tipo I, como descrito

no item 3.3.7. As Figuras 21 e 22 apresentam a análise quantitativa percentual das áreas onde

estão presentes as redes de colágeno tipo I. A Figura 21 apresenta uma comparação entre as

amostras que receberam tratamento somente com luz, em diferentes doses.



Figura 21. Comparação entre as porcentagens de área de colágeno tipo I das biópsias de pele


incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias; B) 14 dias. Os resultados são expressos como

média ± desvio padrão, sendo * (P <0,05) estatisticamente significativo.

A

B



A Figura 22 mostra uma comparação entre as amostras que receberam tratamento com

o fármaco fotossensibilizante e luz, em diferentes doses.

Figura 22. Comparação entre as porcentagens de área de colágeno tipo I das biópsias de pele

tratadas com ClAlPc, irradiadas por laser de diodo (670 nm) em diferentes doses de 70, 140 e

700 mJ/cm2 e incubadas por diferentes períodos: A) 7 dias; B) 14 dias. Os resultados são

expressos como média ± desvio padrão.

A

B



A diferença das porcentagens para cada grupo é mais evidente observando-se a Figura

23, a qual mostra uma comparação somente entre a diferença na porcentagem de área em

relação ao controle para cada grupo analisado.

Figura 23. Comparação entre o aumento da porcentagem de área de colágeno tipo I em

relação ao controle, sendo G3, G4 e G5 as amostras tratadas com a cloro alumínio ftalocianina

e irradiadas com as respectivas doses 70, 140 e 700 mJ/cm2. A) 7 dias; B) 14 dias. Os

resultados são expressos como média ± desvio padrão.

De acordo com a análise quantitativa apresentada na Figura 21, dos grupos

comparados o que apresentou maior efeito sobre o aumento da rede de colágeno,

estatisticamente significativo, foi o grupo G8, que corresponde às amostras irradiadas por luz

B

A



na dose de 700 mJ/cm2

tratadas por 7 dias. Esse efeito pode ser melhor visualizado na Figura

18 G. Já para o período de 14 dias não se observou diferença significativa entre os grupos,

porém houve um aumento em relação ao controle.

Constatou-se pela análise quantitativa apresentada nas Figuras 22 e 23 que não houve

diferença significativa nos resultados das amostras referentes aos diferentes tempos de

tratamento testados, porém em ambas as situações o grupo que se destacou foi o G4,

correspondente às amostras tratadas com o fármaco fotossensibilizante e irradiadas com luz

na dose de 140 mJ/cm2. A diferença na quantidade de colágeno tipo I presente nas amostras

deste grupo é evidente, como pode ser visto na Figura 20J.

Dessa forma, com relação à produção de colágeno tipo I, dentre os grupos analisados

as combinações que exerceram maior estímulo foram a do grupo G8 (com 7 dias de

tratamento) e G4 (com 14 dias de tratamento), que correspondem, respectivamente, à dose de

700 mJ/cm2 e à combinação ClAlPc + 140 mJ/cm

2.

Além da microscopia de campo claro, as lâminas coradas por Picrosirius Red também

foram visualizadas por luz polarizada, sendo possível observar não só o colágeno tipo I

(refringência avermelhada), mas também o colágeno tipo III (reticulina), o qual se apresenta

formado por fibras finas, pouco compactadas, corando do amarelo-esverdeado ao verde.

Quando raios de luz passam através de um filtro polarizador (como um filtro

Polaroid), eles saem vibrando em uma só direção. Um segundo filtro colocado com seu eixo

principal perpendicular ao primeiro bloqueará a passagem de luz. Se, porém, um tecido que

tiver estruturas formadas por átomos e moléculas com um alto grau de orientação (como

celulose, colágeno, cristais, microtúbulos e microfilamentos) for colocado entre os dois filtros,

a estrutura molecular repetitiva e orientada modifica o plano de vibração da luz que emerge

do primeiro filtro, fazendo com que essas estruturas apareçam luminosas contra um fundo



escuro após passarem pelo segundo filtro. A capacidade que estruturas têm de girar o plano de

vibração da luz polarizada é chamada de birrefringência (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).

As imagens obtidas utilizando-se luz polarizada apareceram nas Figuras 21 e 22,

evidenciando a formação de colágeno tipo III em alguns grupos, principalmente os que

receberam doses mais baixas de luz (70 mJ/cm2; observar marcação na Figura 21). Dessa

forma, embora houvesse a predominância de fibras vermelhas e mais longas de colágeno,

observou-se também a produção de colágeno novo, acelerando assim a deposição de colágeno

e auxiliando no processo regenerativo da pele.

Como o colágeno é a maior proteína estrutural e compõe de 70 a 80% do peso seco da

pele, a modulação do metabolismo do colágeno na pele por irradiação terapêutica tem muita

importância clínica. O colágeno, sintetizado por fibroblastos, compreende 80-85% de

colágeno tipo I e 10-15% de colágeno tipo III (RIEKKI et al., 2000).

Com base na análise histomorfológica das biópsias de pele, numa discussão geral

sobre o tratamento mais efetivo para estimular tanto elastina quanto colágeno realizado neste

trabalho, comparou-se todos os resultados apresentados. Este estudo mostrou que as biópsias

analisadas após 14 dias do tratamento apresentaram uma maior intensidade, tanto nas redes de

colágeno quanto nas de elastina, cujo efeito é mais pronunciado nas amostras que receberam

tratamento combinado de fármaco fotossensibilizante e luz na dose de 140 mJ/cm2. Após a

aplicação de doses maiores de irradiação (700 mJ/cm2) observou-se uma degradação das

fibras colágenas e de elastina comparada com a dose intermediária.

Portanto, o modelo de cultivo de biópsias de explants em gel de colágeno permitiu

avaliar o efeito de um estímulo externo, no caso a TFD, diretamente sobre a formação e

degradação da rede de elastina e de colágeno da pele por análise histológica clássica,

possibilitando analisar o comportamento de componentes celulares importantes, antes e



depois do tratamento com luz, auxiliando no processo cicatricial de feridas e outras doenças

cutâneas.

Até o momento existem poucos trabalhos na literatura relatando a aplicação da TFD

na cicatrização de feridas. Os poucos existentes relatam a utilização de fármacos

fotossensibilizantes de primeira geração, como é o caso do ALA e da hematoporfirina,

utilizando ratos como modelos animais nos estudos in vivo (JAYASREE et al., 2011;

PEPLOW , CHUNG e BAXTER, 2012). Os estudos em humanos já relatados consistem da

aplicação da TFD no tratamento da acne, manchas na pele e no fotorejuvenescimento

(BISSONNETTE, 2011, SZEIMIES et al., 2012). Dessa forma, é difícil comparar os

resultados obtidos neste trabalho com resultados já existentes na literatura, por consistir de um

fármaco de segunda geração, no caso a cloro alumínio ftalocianina, que possui propriedades

fotoquímicas e fotofísicas mais favoráveis para a utilização da TFD e também por utilizar

uma matriz complexa, como as biópsias de explants de pele. Além disso, as diferentes fontes

de luz possíveis de serem utilizadas na TFD fazem com que uma ampla variedade de

parâmetros como irradiância, comprimento de onda e doses de luz sejam estabelecidos de

modo a maximizar os efeitos do estímulo luminoso.

No entanto, alguns resultados envolvendo o tratamento de feridas em ratos utilizando

ALA como o agente fotossensibilizante e laser de He-Ne mostraram que o completo

fechamento das feridas provocadas nos ratos ocorreu após 14 dias do tratamento, podendo

variar até 19 dias (SZEIMIES et al., 2012). Dessa forma, os resultados apresentados neste

trabalho foram condizentes com o esperado, mostrando que 14 dias após o tratamento das

biópsias de explants de pele com a nanoemulsão contendo ClAlPc e irradiação com laser de

diodo foram adequados para evidenciar a produção de colágeno e elastina, caracterizando o

processo de remodelação que ocorre durante o processo cicatricial.



4.5 Avaliação da expressão das enzimas MMP-2 e MMP-9 por zimografia

A expressão das proteínas MMP-2 e MMP-9 foi detectada por zimografia de gelatina.

Uma vez que gelatinases são proteases secretadas (DAMODHARAN , GANESAN e

RADHAKRISHNAN, 2011), o sobrenadante do meio de cultura das biópsias de pele foi

recolhido para a análise. Foram analisados os meios de cultura recolhidos após 7 e 14 dias do

tratamento das biópsias de explants de pele utilizando a nanoemulsão contendo o fármaco

fotossensibilizante, irradiadas por diferentes doses de luz e cultivadas em gel de colágeno. São

apresentados três conjuntos de dados (Figuras 24, 25 e 26), respectivos às amostras que

receberam diferentes tempos de tratamento, que representam os ensaios realizados em

triplicata para cada condição estabelecida no experimento.

HT CT G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8

1.


4.

Figura 24. Conjunto dos géis 1 e 4 de zimografia, respectivos às amostras tratadas por 7 e 14

dias.

pro-MMP-9

a-MMP-9 pro-MMP-2

pro-MMP-9

a-MMP-9 pro-MMP-2




2.


5.


dias.


3.


6.


dias.

De acordo com os resultados apresentados nas Figuras 24, 25 e 26, não se observou

diferença entre os géis que representam o mesmo período de tratamento, o que mostra que

houve reprodutibilidade tanto no preparo das amostras para os ensaios de zimografia quanto

na parte experimental envolvendo as biópsias de pele.

Comparando-se a intensidade das bandas referentes às amostras com aquelas

referentes ao meio isolado da linhagem HT-1080 (linhagem celular utilizada como padrão

para expressão de MMP-2 e MMP-9) (CHAKRABARTI et al., 2006), foi observado em todos

os géis a presença das bandas pertencentes à pró-gelatinase A – MMP-2-p e à forma pró-

pro-MMP-9

a-MMP-9 pro-MMP-2

pro-MMP-9

a-MMP-9 pro-MMP-2

pro-MMP-9

a-MMP-9 pro-MMP-2

pro-MMP-9

a-MMP-9 pro-MMP-2



gelatinase B - MMP-9-p, além de uma banda fraca atribuída à forma ativa da gelatinase B –

MMP-9-a. Contudo, comparando-se os géis realizados em dias diferentes de tratamento,

notou-se uma maior intensidade das bandas nos grupos cujas amostras foram recolhidas no

14º dia de tratamento em relação àquelas recolhidas no 7º dia de tratamento. Estas

observações condizem com os resultados da análise histológica (item 4.4), o qual demonstrou

um aumento da produção de colágeno e elastina nas biópsias de pele, visto somente após 14

dias, como é mostrado nas Figuras 16, 17 e 20.

As bandas referentes aos diferentes grupos em cada gel (Figuras 24, 25 e 26) foram

quantificadas conforme descrito no item 3.3.9. Os resultados são apresentados em

porcentagem de expressão de MMP-9 e MMP-2 em relação ao controle e aparecem nas

Figuras 27 e 28. Este tratamento dos dados permite identificar as bandas e quantificar a

intensidade de cor de cada uma em relação à banda referente ao controle (amostra sem

tratamento), fornecendo os resultados em porcentagem.

Quanto à expressão das metaloproteases do tipo MMP-9, para o mesmo período de

análise, foi indicada uma atividade gelatinolítica característica com uma banda atribuída à

forma pró-gelatinase B e outra banda, de menor intensidade, atribuída à forma ativa da

gelatinase B. A quantificação dessas bandas, Figura 27, mostrou que durante o período inicial

não houve diferença significativa, quanto à expressão de MMP-9, entre o tratamento com

fármaco fotossensibilizante e irradiação com diferentes doses de luz e o tratamento aplicando

somente luz, nas mesmas doses. Por outro lado, para o período de 14 dias essa diferença foi

mais evidente, sendo que o grupo que foi tratado com a nanoemulsão de ClAlPc e irradiado

com luz na dose de 140 mJ/cm2 (G4) apresentou resultados que indicaram uma maior

expressão de MMP-9 em relação ao controle. Esta análise se mostrou condizente com a

análise histológica, a qual indicou essa condição de tratamento a mais apropriada, uma vez

que estimulou tanto a produção de elastina quanto a de colágeno (Figuras 16, 17 e 20).



Figura 27. Atividade gelatinolítica detectada por zimografia dos meios de cultura coletados

após experimento com biópsias de explants de pele cultivadas em gel de colágeno, expressa

em porcentagem de expressão de MMP-9 em relação à amostra do controle. A) 7 dias; B) 14

dias. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

A gelatinase B (MMP-9) é uma típica MMP, importante para a migração de diferentes

tipos celulares, como leucócitos e células tumorais, devido à sua habilidade de degradar

membranas basais e componentes da matriz extracelular, como colágeno e elastina. A

gelatinase B promove a migração de novos leucócitos formados a partir da medula óssea até

A

B



os vasos sanguíneos, e então dos vasos sanguíneos até os locais de infecção nos tecidos (VAN

DEN STEEN et al., 2001).

A expressão de MMP-9 é normalmente constante durante toda a fase de remodelagem

do tecido. Além disso, a expressão de MMP-9 está diretamente relacionada ao processo de

migração celular durante o processo de morfogênese e organogênese (LELONGT et al.,

1997), remodelagem da matriz extracelular (EL FAHIME et al., 2000), e cicatrização de

feridas (CLARK, 1993). Igualmente, a MMP-9 tem sido considerada uma metaloprotease

eficiente durante o processo de criação e desenvolvimento de rede fibrilar, associada à

produção da rede de elastina particularmente pela presença de fibrilina do tipo I (COULOMB

et al., 1983).

Quanto à expressão de MMP-2, foi evidenciada na análise dos géis de zimografia uma

maior expressão das metaloproteases do tipo MMP-2 do que do tipo MMP-9, visto pela maior

intensidade daquelas bandas em relação a estas. Foi observada somente a banda referente à

forma pró da gelatinase A, tornando-se evidente a ausência da sua forma ativa. Por meio da

quantificação dessas bandas (Figura 28), observou-se que mesmo no período inicial de 7 dias

foi possível evidenciar alguns grupos, como é o caso das amostras tratadas com o fármaco

fotossensibilizante e luz na dose de 140 mJ/cm2 (G4), além do grupo que recebeu tratamento

somente com luz na dose de 700 mJ/cm2 (G8), destacando-se o primeiro. Entretanto, para as

amostras analisadas mais tardiamente (14º dia) não foi observado um aumento evidente na

expressão de MMP-2 em relação às amostras analisadas após 7 dias, sendo o G8 o grupo que

apresentou melhores resultados.



Figura 28. Atividade gelatinolítica detectada por zimografia dos meios de cultura coletados

após experimento com biópsias de explants de pele cultivadas em gel de colágeno, expressa

em porcentagem de expressão de MMP-2 em relação à amostra do controle. A) 7 dias; B) 14

dias. Os resultados são a média ± desvio padrão.

De forma análoga ao descrito para a MMP-9, a expressão da MMP-2 na matriz

extracelular e no meio de cultura é observada após a fase de remodelagem da látice de

colágeno. Trabalhos prévios demonstraram que os fibroblastos dermais apresentam um

crescimento da expressão das formas MMP-2 entre o 1º e 21º dia de desenvolvimento

(CHAUSSAIN-MILLER et al., 2002).

Uma vez que as enzimas que degradam a matriz extracelular são sintetizadas por

células, existe um controle importante quanto à produção dessas enzimas, que é a latência. As

A

B



enzimas são sintetizadas como pró-enzimas, que são inativas até serem ativadas por

(auto)proteólise. Esse tipo de mecanismo dá início a uma cascata de eventos na qual cada

enzima é ativada por outra que a precede e ao mesmo tempo ativa a enzima que a sucede.

Assim, a conversão da pró-gelatinase B para a sua forma ativa é catalisada pela MMP-3,

enzima que a precede, ou pela gelatinase A (MMP-2) (VAN DEN STEEN et al., 2001), como

é mostrado na Figura 29.

Figura 29. Parte da cascata proteolítica mostrando a ativação da pró-gelatinase B em

gelatinase B (Adaptado de VAN DEN STEEN et al., 2001).

A ativação das MMPs, passando da sua forma latente para a forma ativa, é alcançada

pela saída do grupamento amino terminal dos resíduos de cisteína, cujo processo impõe

latência por um mecanismo conhecido como mudança de cisteína. Assim como a ativação, a

glicosilação é uma importante modificação pós-translacional das enzimas na cascata

proteolítica. As gelatinases também possuem um domínio composto por três unidades

repetidas de fibronectina, inserido entre o sítio ativo e o domínio com ligação de zinco, como

mostrado nas Figuras 30 e 31. Cada repetição de fibronectina contém uma parte hidrofófica

para ligação com gelatina, a qual constitui um sítio que permite ligação com substratos

colagenosos (VAN DEN STEEN et al., 2001).

Pró-gelatinase B Gelatinase B

Pró-gelatinase A Gelatinase A



Figura 30. Estrutura esquemática da MMP-2 e da MMP-9, evidenciando os principais

domínios e a região catalítica. Fonte: http://arthritis-research.com/content/10/6/229/figure/F1

Figura 31. Gelatinases A e B (MMP-2 e MMP-9, respectivamente), mostrando alguns dos

seus domínios (Adaptado de VAN DEN STEEN et al., 2001)

Sítio ativo

Sítio

ativo

Zn2+

Zn2+

Região catalítica

Sin

al p

eptí

deo

Do

mín

io

pro

pep

tíd

eo

Sít

io a

tivo

Do

mín

io

fibro

nec

tin

a

Sít

io l

igaç

ão

Zn

2+

Do

mín

io

colá

gen

o V

Mem

bra

na

anco

rad

a



Nelson e Melendez (NELSON e MELENDEZ, 2004) demonstraram que a expressão e

ativação das MMPs são reguladas via processos oxidativos a partir de reações do tipo redox

envolvendo espécies reativas de oxigênio (EROs) em organismos aeróbicos via mecanismos

mitocondriais e de modulação celular. A radiação monocromática e os mecanismos

fotodinâmicos alteram a concentração intra/intercelular de EROs, afetando o metabolismo

eletrofisiológico mitocondrial, o que pode levar a aceleração da transcrição e expressão de

MMPs além de outras biomoléculas presentes na matriz extracelular. O processo de

peroxidação também atua diretamente na ativação do sítio Zn/cisteína, presente nas moléculas

de MMPs, favorecendo a clivagem autocatalítca para liberação da forma ativa das

metaloproteases (PRIMO, F. L., 2009).

Um estudo (SZEIMIES et al., 2012) demonstrou que espécies reativas de oxigênio

geradas após a irradiação por luz UV dão início ao aumento da transcrição de

metaloproteinases da matriz por um complexo mecanismo de sinalização, diminuindo a

expressão dos genes procolágeno-I e procolágeno-III e culminando na redução da geração da

matriz dermal.

Alguns processos fisiológicos, como o envelhecimento e o processo cicatricial, podem

ser avaliados relacionando a síntese de colágeno com os níveis de expressão de MMPs. A

deficiência de colágeno devida ao envelhecimento natural pode derivar da sua síntese

reduzida com aumento da degradação e concomitante elevação da expressão de MMP. A

irradiação ultravioleta induz a síntese de MMP na pele humana in vivo, e a destruição de

colágeno mediada por MMP leva em conta, em grande parte, o dano provocado no tecido

conectivo que ocorre no fotoenvelhecimento (SHIN et al., 2005). Isso sugere que não somente

a síntese de proteína na matriz extracelular, mas também a degradação da MEC é elevada nas

peles irradiadas (RIEKKI et al., 2000).


75 Conclusões │

5 Conclusões

A nanoemulsão de cloro alumínio ftalocianina apresentou características adequadas

para a sua utilização nos estudos com pele humana, tais como boa estabilidade

termodinâmica, tamanho médio de gotículas nanométrico e homogeneidade, além de possuir

parâmetros importantes já conhecidos, como baixa agregação das moléculas em ambiente

fisiológico e absorção máxima em 670 nm, a qual coincide com a região espectral da “janela

óptica” do tecido. Partindo deste ponto, foi estipulado um roteiro experimental permitindo

avaliar três diferentes doses de luz, sendo elas 70, 140 e 700 mJ/cm2, e suas ações combinadas

com o fármaco fotossensibilizante em biópsias de explants de pele após diferentes tempos de

tratamento.

As análises histomorfológicas das biópsias coradas por Orceína e Picrosirius Red

mostraram a forma do tecido epitelial, delimitando estruturas como a derme e a epiderme,

sendo possível avaliar os principais componentes da matriz extracelular, como colágeno e

elastina. A quantificação desses componentes nas biópsias de pele submetidas ao tratamento

por diferentes doses de luz mostrou que a dose intermediária testada (140 mJ/cm2) foi a mais

apropriada, após 14 dias de tratamento, combinada com a ação do fármaco fotossensibilizante

ClAlPc, provocando um efeito bioestimulador. Doses mais elevadas de luz provocaram a

degradação das redes de colágeno e elastina, cujo efeito era esperado, considerando que altas

concentrações de EROs provocam um efeito inibitório na síntese de fibroblastos dermais,

reduzindo assim a síntese de colágeno e elastina.

Os estudos de zimografia mostraram a atividade gelatinolítica das enzimas Gelatinase

A (MMP-2) e Gelatinase B (MMP-9), principais metaloproteases participantes do processo

cicatricial de feridas. Os níveis de expressão de MMP-2 e MMP-9 condizem com os

resultados obtidos após a análise histomorfológica, apontando um maior nível de expressão


76 Conclusões │

para o grupo que recebeu o tratamento combinado com o fármaco fotossensibilizante e luz na

dose de 140 mJ/cm2, após 14 dias de tratamento. Com estes estudos, pôde-se demonstrar que

a expressão das MMPs foi afetada pela ação do fármaco fotossensibilizante e pela irradiação

luminosa visível na faixa de energia utilizada. Assim, o modelo de biópsias de explants de

pele não só pode ser usado como uma ferramenta útil para investigar mais profundamente os

mecanismos de expressão e inibição durante as diferentes fases do processo de cicatrização,

como também indica que a proposta de utilizar os princípios usualmente descritos para a

Terapia Fotodinâmica é perfeitamente factível e pode, dentro das condições ideais, auxiliar no

processo de cicatrização de feridas e outras doenças cutâneas.


77 Referências Bibliográficas │

6 Referências Bibliográficas

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