AVALIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO DA BOLA DE BICHAT …

UNIVERSIDADE POSITIVO

MESTRADO PROFISSIONAL EM ODONTOLOGIA CLÍNICA

AVALIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO DA BOLA DE BICHAT

ASSOCIADAS À BIOMATERIAL

BOVINO E FIBRINA RICA EM PLAQUETAS

GABRIELLE GOBBO AGNOLETTO

Projeto de pesquisa apresentado à Universidade

Positivo como requisito parcial para obtenção

do título de Mestre em Odontologia, pelo

programa de Mestrado Profissional em

Odontologia Clínica.

Orientadora: Tatiana Miranda Deliberador

CURITIBA

2019

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Biblioteca da Universidade Positivo - Curitiba – PR

Elaborado pela Bibliotecária Damaris Cardoso de Oliveira Vieira (CRB-9/201803/P)

A274 Agnoletto, Gabrielle Gobbo.

Avaliação de células-tronco da bola de bichat associadas à

biomaterial bovino e fibrina rica em plaquetas : avaliação in vitro

de células tronco mesenquimais da bola de bichat associadas

ou não a um substituto ósseo bovino e fibrina rica em plaquetas

(PRF) / Gabrielle Gobbo Agnoletto. ― Curitiba : Universidade

Positivo, 2019.

44 f. : il.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Positivo,

Programa de Pós-graduação em Odontologia, 2019.

Orientador: Profa. Dra. Tatiana Miranda Deliberador.

Co-orientador: Prof. Dr. João César Zielak.

1. Odontologia. 2. Células-tronco. 3. Materiais

biocompatíveis. I. Deliberador, Tatiana Miranda. II. Zielak,

João César. III. Título.

CDU

616.318:602.9(043.3)

Este trabalho de pesquisa foi realizado no Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento

em Odontologia (LPDO) da Universidade Positivo e no Centro de Tecnologia Celular

Curityba Biotech.

DEDICATÓRIA

Aos meus pais que me deram apoio e sempre me incentivaram a seguir em

frente, que foram meus maiores exemplos de determinação, coragem e perseverança, e

que durante todo esse percurso refletiram a mim o amor mais puro que existe no mundo.

A minha irmã amada que foi meu porto seguro e esteve sempre ao meu lado me

dando carinho, conselhos e apoio em todas as situações.

Dedico também este trabalho a Deus que iluminou meu caminho durante toda

esta caminhada e me concedeu sabedoria para que levasse meu estudo adiante.

A toda a minha família que torceu pelo meu sucesso e me ajudou a seguir em

frente me dando todo suporte, energia e força que precisei para completar essa árdua

jornada e aos meus amigos, pela capacidade de acreditar em mim, por entenderem a

minha ausência em determinados momentos, pelas alegrias e tristezas compartilhadas.

Com vocês esse caminho pareceu mais leve.

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Tatiana Miranda Deliberador que foi meu maior exemplo

dentro do mundo acadêmico, que me acolheu e me introduziu ao universo da pesquisa já

na graduação e me acompanha até hoje com muito carinho e atenção.

Ao Professor João Zielak que me auxiliou na padronização da metodologia e

confecção das análises, me mostrando soluções para facilitar os nossos experimentos,

trazendo mais leveza e tranquilidade durante o trabalho.

A Professora Moira que me introduziu ao mundo das células-tronco, me

orientando e me ensinando de maneira apaixonante como esse assunto é maravilhoso e

importante para o nosso futuro.

Ao Eduardo do Curityba Biotech que me recebeu no CTC com todo carinho e

atenção, me mostrando e auxiliando durante todo o processo de isolamento, sendo

extremamente importante para realização da pesquisa.

A Professora Cláudia Tenório que além de se tornar uma grande amiga, me

orientou em todos os assuntos relacionados à bichectomia.

A Janaina que me auxiliou durante a parte prática da pesquisa, tornando-se uma

grande amiga.

A todos os professores do curso, que foram tão importantes na minha vida

acadêmica e no desenvolvimento desta dissertação.

A todos os funcionários da Universidade Positivo que sempre me receberam

com muito carinho e dedicação.

EPÍGRAFE

O sucesso nada mais é que ir de fracasso em fracasso sem que se perca o entusiasmo

(Winston Churchill).

Agnoletto GG. Avaliação de células-tronco da bola de Bichat associadas à biomaterial

bovino e fibrina rica em plaquetas. Curitiba: Universidade Positivo, 2019.

RESUMO

O estudo das células-tronco tem demonstrado avanços muito importantes na área de

regeneração tecidual. Várias pesquisas tem confirmado que as células-tronco podem ser

eficazes para realizar regeneração de tecido muscular, de válvulas cardíacas, de

miocárdio e tecido ósseo. A viabilização de Células-Tronco Mesenquimais (CTMs) para

um posterior uso clínico regenerativo tem sido foco de muitos estudos. O objetivo do

presente estudo foi observar a influência de biomaterial bovino associado ou não a

Fibrina Rica em Plaquetas (PRF) no cultivo de CTMs, provenientes da Bola de Bichat.

Foram utilizados três pares da Bola de Bichat para isolamento e cultivo das CTMs.

Após a segunda passagem de células, foi realizada a Citometria de Fluxo e a o Teste In

Vitro com o biomaterial e com o PRF. A quantidade de 8 x 103

células foram

plaqueadas em placas de 24 poços, em triplicatas de 4 e divididas em 4 grupos, Grupo

Controle (CTMs apenas), Bio-Oss/CTMs (5 mg de Bio-Oss foi inserido no poço dentro

de um “transwell” com 3 µm de porosidade), Grupo Bio-Oss® + PRF/CTMs (5 mg de

Bio-Oss misturado com 5 mg de PRF fracionada foi inserido no poço dentro de um

“transwell” com 3 µm de porosidade) e Grupo PRF/CTMs (5 mg de PRF fracionada foi

inserido no poço dentro de um “transwell” com 3 µm de porosidade). A citometria de

fluxo mostrou resultado positivo para CTMs pela porcentagem positiva para os CD73,

CD29, CD10 e CD90, porém com alteração dos marcadores CD34 e vWF que tem

características de células endoteliais. A viabilidade celular evidenciou que houve morte

celular por apoptose, tendo uma variação média de 2,63% a 3,83%%. As análises in

vitro mostraram que as CTMs também se mantiveram vivas e em proliferação em todos

os grupos durante os 25 dias. Pode-se concluir que a Bola de Bichat possui CTMs

indiferenciadas e que sua associação com o substituto ósseo e/ou PRF foi viável.

Palavras-Chave: Células-Tronco, Engenharia Tecidual, Materiais

Biocompatíveis

ABSTRACT

The research of the stem cells has shown very important advances in the area of tissue

regeneration. Several research has confirmed that stem cells can be effective in

regenerating muscle tissue, heart valves, myocardium and bone tissue. The feasibility of

Mesenchymal Stem Cells (CTMs) for subsequent clinical regenerative use has been the

focus of many studies. The objective of the present study was to observe the influence

of bovine biomaterial associated or not to Rich Fibrin in Platelets (PRF) in the

cultivation of MSCs from the Bichat Bola. Three Bichat Ball pairs were used to isolate

and culture the CTMs. After the second cell pass, Flow Cytometry and In Vitro Test

were performed with the biomaterial and PRF. The amount of 8 x 103 cells were plated

in 24-well plates, triplicates of 4 and divided into 4 groups, Control Groups (CTMs

only), Bio-Oss / CTMs (5 mg Bio-Oss was inserted into the well within a transwell with

3 μm porosity), Bio-Oss® + PRF / CTMs Group (5 mg of Bio-Oss mixed with 5 mg of

fractionated PRF was inserted into the well within a transwell with 3 μm porosity) and

Group PRF / CTMs (5 mg fractional PRF was inserted into the well within a transwell

with 3 μm porosity). Flow cytometry showed a positive result for CTMs by CD73,

CD29, CD10 and CD90, but with alterations in CD34 and vWF markers that have

endothelial cell characteristics. Cell viability evidenced that there was cell death by

apoptosis, with an average variation of 2.63% to 3.83%. In vitro analyzes showed that

MSCs also remained alive and proliferating in all groups during the 25 days. It can be

concluded that Bichat's Ball has undifferentiated CTMs and that its association with the

bone substitute and / or PRF was feasible.

Keywords: Stem Cells, Tissue Engineering, Biocompatible Materials

SUMÁRIO

1.1 BOLA DE BICHAT ................................................................................................. 1

1.2 CÉLULAS-TRONCO ........................................................................................... 2

1.3 BIOMATERIAIS ÓSSEOS ................................................................................. 5

1.4 FIBRINA RICA EM PLAQUETAS ................................................................... 7

2. PROPOSIÇÃO ........................................................................................................... 9

3. MANUSCRITO ........................................................................................................ 10

3.1 RESUMO ............................................................................................................. 11

3.2 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 11

3.3 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 13

3.3.1 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS ............................................................. 14

3.3.2 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS ..................................................... 14

3.3.3 ANÁLISE IN VITRO DA ASSOCIAÇÃO DAS CTMs COM

BIOMATERIAL BOVINO E PRF ......................................................................... 17

3.3.4 OBTENÇÃO DA MEMBRANA DE PRF ..................................................... 19

3.4 RESULTADOS .................................................................................................. 20

3.5 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 26

3.6 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 29

4 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 30

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 BOLA DE BICHAT

Atualmente na Odontologia, a remoção da bola de Bichat (técnica da Bichectomia)

ganhou notoriedade por eliminar problemas de mordiscamento da mucosa jugal e levar

ao afinamento do rosto. Bichat (1802) foi quem apresentou a verdadeira morfologia do

corpo adiposo bucal. O primeiro relato sobre o uso dessa massa gordurosa para

reconstrução oral foi realizado por Egyedi (1977) utilizando-a na forma de enxerto

pediculado para fechamento de defeitos maxilares pós-cirúrgicos.

Dubin (1989) examinou a anatomia, inervação e vascularização do corpo adiposo

bucal e também estudaram a sua aplicação clínica na reconstrução de defeitos

orofaciais.

Esse tecido também tem sido muito utilizado como uma espécie de enxerto

autógeno para fechamento de fístulas ou comunicações bucosinusais durante

procedimentos cirúrgicos (Egyedi et al., 1977). A literatura também mostra sua

eficiência em situações em que se é necessário o recobrimento do enxerto ósseo no

aumento da crista alveolar (Baumann e Ewers, 2000).

A bola de bichat é basicamente uma massa de gordura composta por cinco partes,

uma porção central e mais quatro porções (pterigoideo, bucal, pterigopalatina e

temporal). Esse tecido pode ser encontrado em frente à margem anterior do músculo

masseter e ao longo da maxila, próxima as fibras superiores do músculo bucinador

(Singh et al., 2004). Esse tecido invade também a fossa infratemporal, relacionando-se

com a maxila e com os músculos pterigoideos e temporal (Singh et al., 2004).

A principal função da bola de bichat é de ação parecida como a de uma almofada

para auxiliar a movimentação muscular, contribuindo também na formação do contorno

2

da estrutura facial externa (Bichat, 1802; Kennedy, 1988; Singh et al., 2004).

Histologicamente, esse tecido não demonstra nenhuma diferenciação quando

comparado a outras amostras de tecido adiposo do organismo, porém a bola de bichat

não é consumida em casos de emagrecimento, como ocorre em outras regiões do corpo

(Bichat, 1802; Kennedy, 1988; Singh et al., 2004; Strauer et al., 2008), devido a taxa

lipolítica ser diferente da gordura subcutânea (Matarasso, 2006).

Estudos anteriores comprovaram a existência das células-tronco do tipo

mesenquimais em tecidos adiposos (Freese et al., 2016), entre eles o corpo adiposo

bucal (Broccaioli et al., 2013; Conti et al., 2018).

1.2 CÉLULAS-TRONCO

Nos últimos anos muitos pesquisadores têm buscado aumentar seus

conhecimentos na área de biologia celular, especialmente em relação ao potencial de

indução de diferenciação celular com o objetivo de viabilizar o uso das células-tronco

em terapias regenerativas, em locais ou órgãos que sofreram algum tipo de injúria

afetando sua estrutura tecidual (Ratnayake e Currie, 2017; Weber et al., 2012; Orlic et

al., 2002 ).

As células-tronco ficaram conhecidas por serem células indiferenciadas que com

o potencial de autorrenovação, tem a capacidade de diferenciar-se em mais de uma

linhagem celular e também, originar células funcionais de tecidos derivados de sua

mesma linhagem (Krause et al., 2001).

As células-tronco podem ser classificadas pelo seu potencial de diferenciação

em (i) totipotentes: quando são capazes de formar todos os tipos celulares incluindo os

anexos embrionários; (ii) pluripotentes: quando são capazes de dar origem a todos os

tipos de células do embrião, exceto os anexos embrionários e (iii) multipotentes: quando

3

possuem a capacidade de diferenciação limitada, podendo dar origem a um subconjunto

de linhagens de células (Carvalho e Goldenberg, 2012).

Dependendo da sua origem, as células-tronco podem ser classificadas como

embrionárias, adultas e pluripotentes induzidas (Evans e Kaufman., 1981; Martin, 1981;

Carvalho e Goldenberg, 2012).

As células-tronco embrionárias são derivadas da massa interna do blastocisto,

podendo proliferar-se indefinidamente e preservando sua pluripotência, porém, quando

implantadas em animais provaram serem capazes de dar origem a teratomas e

teratocarcinomas. Além disto, a obtenção de células a partir de um embrião congelado

ainda gera conflitos éticos (Carvalho e Goldenberg, 2012).

As células-tronco pluripotentes induzidas são geradas por meio da reprogramação

de células diferenciadas que passam a se comportar como células pluripotentes (Teixeira

et al., 2001).

As células-tronco adultas estão presentes em diversos tecidos do organismo adulto

como na medula óssea (Sordi et al., 2005), polpa dentária (Homayounfar et al., 2016;

Tattulo et al., 2014) e tecido adiposo (Gimble et al., 2007, Freese et al., 2016; Farré-

Guasch et al., 2010), e participam dos processos de reparo do tecido danificado. São

multipotentes, pois possuem uma menor capacidade de diferenciação e proliferação

comparativamente às embrionárias. Porém, são mais seguras para a utilização em

pacientes, uma vez que a possiblidade de formação de tumores é remota. Além disso, as

células-tronco adultas de origem autóloga podem ser usadas descartando a necessidade

de uso de imunossupressores (Strauer et al., 2008), representando, desta forma, uma

nova alternativa no tratamento de diversas doenças (Orlic, 2002). Esse tipo específico

de célula-tronco repõe as células que foram perdidas em algum tipo de dano,

4

envelhecimento ou em processo de maturação, mantendo dessa maneira o equilíbrio

tecidual (Barry e Murphy, 2004).

As células-tronco adultas podem ser classificadas em hematopoiéticas e células

mesenquimais. As células-tronco hematopoiéticas são derivadas dos tecidos sanguíneos,

sangue periférico e sangue de cordão umbilical, além da medula óssea. Já as células-

tronco mesenquimais estão presentes nos tecidos, tal qual o tecido muscular, neural,

adiposo, dentário, cordão umbilical e na pele, presas ao redor dos vasos sanguíneos em

regiões chamadas de pericitos.

As células-tronco mesenquimais (CTM) podem ser facilmente isoladas,

apresentam capacidade de propagação em cultura e são pouco imunogênicas, podendo

ser, teoricamente, empregadas em transplantes alógenos (Caplan, 2009).

Segundo a Sociedade Internacional de Terapias Celulares (ISCT), para que uma

célula seja definida e caracterizada como CTM, esta deve ser capaz de aderir à

superfície plástica quando em cultura, apresentar capacidade de diferenciação celular

em linhagens como osteoblastos, adipócitos e condrócitos quando estimuladas e

expressar marcadores de superfície específicos para células mesenquimais (CD105,

CD73, CD90) e negativo para marcadores de superfície de outras células mononucleares

(CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a, CD19 e HLA-DR) (Dominici et al., 2006).

As principais funções das CTMs são a manutenção e a renovação dos tecidos

mesenquimais adultos (Caplan, 2009). Estas células podem ser utilizadas

terapeuticamente uma vez que secretam fatores bioativos que protegem e reparam o

tecido danificado, além dos efeitos antiapoptóticos, inibitórios da cicatriz, estimuladores

da angiogênese e mitogênicos para células progenitoras intrínsecas do tecido (Caplan,

2006).

5

As CTM têm sido muito estudadas nos últimos anos, em terapia de regeneração

óssea (Yamada et al., 2003; Lendeckel et al., 2004), muscular (Ratnayake e Currie,

2017), cartilaginosa (Choi et al., 2017), cardíaca (Weber et al., 2012; Orlic et al., 2002)

obtendo-se novas informações que mudaram o rumo da utilização dessa linhagem

celular nas terapias regenerativas (Orlic et al., 2002). As CTM de tecido adiposo

também têm sido usadas com sucesso nestas terapias (Bunnell et al., 2008; Freese et al.,

2016; Zuk et al., 2001).

Contudo, a principal fonte destas células é a gordura subcutânea abdominal, que

é de difícil acesso por necessitar de uma remoção cirúrgica invasiva. A utilização do

corpo adiposo bucal, também conhecido por bola de bichat, se torna mais acessível já

que existe a possibilidade de remoção, de maneira relativamente simples, quando

comparada a outras técnicas de obtenção de células (Matarasso et al., 2006; Broccaioli

et al., 2013).

1.3 BIOMATERIAIS ÓSSEOS

Para que as CTM possam ser utilizadas em tratamentos terapêuticos é necessário

que seja transportada até o leito receptor por meio de alguma substancia compatível

com a necessidade do tratamento e que consiga comportar as células vivas (Gwon et al.,

2017; Gotze et al., 2017). Com esta finalidade o uso de enxertos ósseos vem sendo

testados em associação com CTM (Broccaioli et al., 2013).

Um dos enxertos ósseos mais pesquisados é o Bio-oss®, que é um biomaterial

composto de uma matriz óssea inorgânica que é incorporada no processo de modelagem

e remodelagem óssea ajudando a conduzir um bom reparo ósseo em longo prazo

(Dedigi et al., 2006). Esse produto é muito utilizado em casos onde existe um defeito

periimplantar, alvéolos pós-extração, levantamento de seio maxilar, preservação de

6

dentes em longo prazo (Hammerle e Lang, 2001; Zitzmann et al., 2001; Araujo et al.,

2009, Wallace et al., 2005, Aghaloo et al., 2007, Sculean et al., 2007).

Muitas pesquisas começaram a serem desenvolvidas na área de tecnologia celular

utilizando a associação dos substitutos ósseos associados as células. Em 2011, Liu

utilizou dois substitutos ósseos (Bio-Oss e NanoBone) para comparar a

biocompatibilidade com osteoblastos humanos. As análises utilizadas nesse estudo

comprovaram a baixa citotoxidade e boa biocompatibilidade de ambos os materiais,

tendo uma pequena variação no teste de proliferação de MTT que foi superior utilizando

Nanobone.

Em 2014, o pesquisador Han Yu realizou um estudo em que avaliou a regeneração

óssea em ratos utilizando Bio-Oss e Células-tronco Mesenquimais (obtidas do

ligamento periodontal e da medula óssea), comprovando que a combinação dos dois

produtos resulta em uma regeneração óssea melhor do que quando utilizados sozinhos.

Já Wang em 2017, realizou uma pesquisa em que buscava a regeneração óssea

maxilar em beagles utilizando Bio-Oss associado a fatores de crescimento (Grupo A) e

a células-tronco de mesenquimais originadas da medula óssea (Grupo B). Os resultados

obtidos mostraram que ambos os grupos obtiveram uma microdureza óssea e

neoformação é maior nos grupos A e B quando comparados ao grupo controle.

Outro estudo foi realizado associando Bio-Oss com células-tronco mesenquimais

obtidas a partir de tecido adiposo de coelhos (Maglione et al., 2018). Os resultados

foram promissores comprovando por meio de Micro-Ct que as amostras que eram

compostas pela associação dos produtos obtiveram uma maior quantidade de

neoformação óssea quando comparadas ao grupo que só recebeu o biomaterial.

7

1.4 FIBRINA RICA EM PLAQUETAS

Inicialmente os concentrados de plaquetas foram propostos como alternativa

em casos onde o paciente apresentava risco de hemorragia, sendo uma ótima medida

preventiva ou de tratamento (Ehrenfest et al., 2009).

A técnica da fibrina rica em plaquetas surgiu na França, apresentando uma

solução alternativa para casos onde anteriormente eram utilizados os adesivos de

fibrina, que causavam problemas pela complexidade de serem produzidos quando

adesivos autólogos, ou pelo risco de ocasionar infecções cruzadas quando adesivos

comerciais (Dohan et al., 2006).

Em 2006, Dohan citou a Fibrina Rica em Plaquetas (PRF) como um novo

conceito de concentrado em plaquetas (Marx et al 1998; Soffer et al., 2003; Choukroun

et al., 2006), que pode também caracterizar-se como um nódulo imunológico, já que os

mecanismos de defesa existentes no organismo humano podem ser estimulados por ele.

Dentro do cenário imunológico, sabe-se também que o PRF quando associado

em casos clínicos, tem um importante papel na parte de cicatrização tecidual acelerado,

já que desenvolve neovascularização efetiva, fechamento rápido da ferida e menor

indíce de infecções (Dohan et al., 2006; Choukroun et al., 2006).

O coágulo de fibrina formado durante o processo de cicatrização concentra

células-tronco circulantes que são trazidas ao local da lesão pela neovascularização

inicial e se diferenciam em diferentes tipos de células (Rustad e Gurtner, 2012;

Choukroun et al., 2006)

Estudos anteriores demonstraram que a matriz de fibrina é um suporte ideal para

células-tronco mesenquimais utilizadas para regeneração óssea (Yamada et al., 2003;

Bensaïd, 2003, Choukroun et al., 2006).

8

Em 2018, Nugraha afirmou que as células-tronco mesenquimais de origem

gengival cultivadas na PRF tem o potencial de acelerar a remodelação óssea in vitro

pelo aumento da expressão de Osteocalcina e Fosfatase Alcalina Óssea.

9

2. PROPOSIÇÃO

O objetivo do presente estudo foi observar a influência de biomaterial bovino

associado ou não ao PRF no cultivo de células-tronco mesenquimais, provenientes da

Bola de Bichat.

10

3. MANUSCRITO

AVALIAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DA BOLA

DE BICHAT ASSOCIADAS OU NÃO A UM SUBSTITUTO ÓSSEO BOVINO E

FIBRINA RICA EM PLAQUETAS (PRF)

Gabrielle Gobbo Agnoletto1

João César Zielak2,3

Moira Leão3

Tatiana Miranda Deliberador2

¹Aluna do Curso de Mestrado em Odontologia da Universidade Positivo, Curitiba,

Paraná, Brasil.

²Professor (a) Titular do Curso de Odontologia, Escola de Ciências da Saúde,

Universidade Positivo, Curitiba, Paraná, Brasil.

3Sócio (a) proprietário (a) Centro de Processamento Celular Curityba Biotech, Curitiba,

Paraná, Brasil.

Autor de correspondência: Tatiana Miranda Deliberador, Mestrado em Odontologia da

Universidade Positivo, Rua Prof. Pedro Viriato Parigot de Souza 5300 – CEP 81280-

330 – Campo Comprido – Curitiba, PR, Brazil Phone: + 55 41 999764948 E-mail:

[email protected]

mailto:[email protected]

11

3.1 RESUMO

A viabilização de Células-Tronco Mesenquimais (CTMs) para um posterior uso clínico

regenerativo tem sido foco de muitos estudos. O objetivo do presente estudo foi

observar a influência de biomaterial bovino associado ou não a Fibrina Rica em

Plaquetas (PRF) no cultivo de CTMs, provenientes da Bola de Bichat. Foram utilizados

três pares da Bola de Bichat para isolamento e cultivo das CTMs. Após a segunda

passagem de células, foi realizada a Citometria de Fluxo e a o Teste In Vitro com o

biomaterial e com o PRF. A quantidade de 8 x 103

células foram plaqueadas em placas

de 24 poços, em triplicatas de 4 e divididas em 4 grupos, Grupo Controle (CTMs

apenas), Bio-Oss/CTMs (5 mg de Bio-Oss foi inserido no poço dentro de um

“transwell” com 3 µm de porosidade), Grupo Bio-Oss® + PRF/CTMs (5 mg de Bio-Oss

misturado com 5 mg de PRF fracionada foi inserido no poço dentro de um “transwell”

com 3 µm de porosidade) e Grupo PRF/CTMs (5 mg de PRF fracionada foi inserido no

poço dentro de um “transwell” com 3 µm de porosidade). A citometria de fluxo mostrou

resultado positivo para CTMs pela porcentagem positiva para os CD73, CD29, CD10 e

CD90, porém com alteração dos marcadores CD34 e vWF que tem características de

células endoteliais. A viabilidade celular evidenciou que houve morte celular por

apoptose, tendo uma variação média de 2,63% a 3,83%%. As análises in vitro

mostraram que as CTMs também se mantiveram vivas e em proliferação em todos os

grupos durante os 25 dias. Pode-se concluir que a Bola de Bichat possui CTMs

indiferenciadas e que sua associação com o substituto ósseo e/ou PRF foi viável.

Palavras-Chave: Células-Tronco, Engenharia Tecidual, Materiais

Biocompatíveis

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3.2 INTRODUÇÃO

As Células Tronco Mesenquimais (CTMs) têm sido muito estudadas nos últimos

anos em terapia de regeneração óssea (Yamada et al., 2003; Lendeckel et al., 2004),

muscular (Ratnayake e Currie, 2017), cartilaginosa (Choi et al., 2017), cardíaca (Weber

et al., 2012; Orlic et al., 2002) obtendo-se novas informações que mudaram o rumo da

utilização dessa linhagem celular nas terapias regenerativas (Orlic et al., 2002).

Contudo, as principais fontes de obtenção dessa linhagem celular é a medula

óssea e a gordura subcutânea abdominal, a primeira tem a desvantagem de ser um

procedimento doloroso e desconfortável para o doador (Nishimori et al, 2002; Salehi-

Nik et al, 2017), já a segunda é um método de obtenção de difícil acesso por necessitar

de uma remoção cirúrgica invasiva.

A utilização do corpo adiposo bucal, também conhecido por bola de Bichat, se

torna mais acessível já que existe a possibilidade de remoção, de maneira relativamente

simples, quando comparada a outras técnicas de obtenção de células (Matarasso et al.,

2006; Broccaioli et al., 2013). Estudos anteriores comprovaram a existência das células-

tronco do tipo mesenquimais em tecidos adiposos (Freese et al., 2016), entre eles o

corpo adiposo bucal (Broccaioli et al., 2013; Conti et al., 2018).

Para que as CTM derivadas da bola de Bichat possam ser utilizadas em

tratamentos terapêuticos é necessário que seja transportada até o leito receptor por meio

de alguma substância compatível com a necessidade do tratamento e que consiga

comportar as células vivas (Gwon et al., 2017; Gotze et al., 2017). Com esta finalidade

o uso de enxertos ósseos vem sendo testados em associação com CTM (Broccaioli et

al., 2013). Em 2014, o pesquisador Han Yu realizou um estudo em que avaliou a

regeneração óssea em ratos, utilizando Bio-Oss e CTMs (obtidas do ligamento

13

periodontal e da medula óssea), comprovando que a combinação dos dois produtos

resulta em uma regeneração óssea melhor do que quando utilizados sozinhos.

Outra fonte que está sendo muito estudada é o PRF, já que estudos mostraram

que o coágulo de fibrina formado durante o processo de cicatrização concentra células-

tronco circulantes que são trazidas ao local da lesão pela neovascularização inicial e se

diferenciam em diferentes tipos de células (Rustad e Gurtner, 2012; Choukroun et al.,

2006). Além desse potencial, estudos anteriores demonstraram que a matriz de fibrina é

um suporte ideal para células-tronco mesenquimais utilizadas para regeneração óssea

(Yamada et al., 2003; Bensaïd, 2003, Choukroun et al., 2006).

O objetivo do presente estudo foi observar a influência de biomaterial bovino

associado ou não ao PRF no cultivo de CTMs, provenientes da Bola Bichat.

3.3 MATERIAIS E MÉTODOS

O Comite de Etica Plataforma Brasil aprovou este protocolo experimental e o termo

de consentimento, fornecendo Registro Brasileiro de Ensaios

(CAAE:93182518.5.0000.0093).

Foram utilizados três pares de descarte da Bola de Bichat, doadas por pacientes

submetidos ao procedimento cirúrgico de Bichectomia por razões funcionais, realizado

na Universidade Positivo, Curitiba/PR.

O isolamento e o cultivo celular foram feitos no Centro de Processamento Celular

Curityba Biotech, que se localiza dentro do campus Ecoville da Universidade Positivo.

O protocolo utilizado para este projeto foi baseado nos trabalhos de ZUK et al., 2001.

14

3.3.1 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS

Após a leitura e assinatura do TCLE, foram realizadas cirurgias de

bichectomia em três pacientes diferentes que fizeram doação da bola de Bichat para

realização da pesquisa.

O procedimento cirúrgico se inicia por meio de anestesia troncular do nervo

alveolar superior posterior e infiltrativa subperióstica na região de molares e pré-

molares superiores. Em seguida realizou-se uma incisão em fundo de vestíbulo da face

distal do segundo molar até a mesial do primeiro molar. A divulsão foi realizada do

tecido até a localização da porção bucal da bola de bichat, que foi pinçada e removida

delicadamente por meio de movimentos circulares. Após a remoção da bola de bichat

(Figura 1), o tecido mole foi suturado, e o paciente recebeu instruções e medicações

pós-operatórias.

Figura 1- Porção bucal da Bola de Bichat colocada em seringas removida de um dos pacientes.

3.3.2 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS

ISOLAMENTO E CULTIVO CELULAR

Após o procedimento cirúrgico, o tecido adiposo bucal (entre 8-10 ml) foi

acondicionado em tubo Falcon (50 ml) preenchido por DMEM (Gibco, Waltham,

15

Massachusetts-EUA), acrescida de penicilina (100 Ul/ml) e estreptomicina (100 mg/ml)

diluídas em 1% na cultura, mais anfotericina B (250 µg/ml)(Gibco, Waltham, EUA), a

1% (Figura 2). O frasco foi transportado do centro cirúrgico ao laboratório e foi

armazenado a 4ºC.

Figura 2 - Bola de Bichat acondicionada em Tubo Falcon de 50ml

Em seguida, o tecido adiposo bucal foi transferido à placa de Petri e lavado com

PBS (Gibco, Waltham, EUA). Para facilitar a lavagem (Figura 3), o tecido adiposo

bucal foi fracionado com auxílio de uma tesoura cirúrgica.

Figura 3 - Bola de Bichat fracionada na placa de Petri

16

Seguiu-se à digestão enzimática com colagenase do tipo-I a 0,075% (0,015 g)

(Gibco, Waltham, EUA). A colagenase do tipo-I foi diluída em DMEM 10% de SFB

(20 ml) e filtrada em uma membrana de 0,22 µm (Millex-Millipore, Billerica, EUA).

Após esse processo, o material em tubo foi colocado em banho-maria a 37 ºC, durante

30 minutos sob agitação constante.

Após esse período, sonicou-se o tubo em um vortex (Parsec AG0305, Curitiba,

Brasil) por 30 segundos. A colagenase tipo-I foi neutralizada com adição de DMEM

10% SFB, na proporção de 1:1. Foi realizada uma centrifugação a 1500 rpm (Hettich

ebba 200s, Kirclengern, Alemanha) durante 10 minutos. Após esse processo, o

sobrenadante foi descartado e ressuspendeu-se o pellet em 10 ml de cloreto de amônia

(NH4Cl) a 160 mM, durante 10 minutos, em temperatura ambiente, para lise das células

sanguíneas.

O NH4Cl foi filtrado novamente em uma membrana de 0,22 µm (Millex-Millipore,

Billerica, EUA) e centrifugado a 1500 rpm durante 10 minutos. Posteriormente,

descartou-se o sobrenadante e ressupendeu-se o pellet em DMEM 10% de SFB filtrando

a suspensão celular em uma membrana de 70 mm de poro (Easy Strainer, Greiner Bio-

One, Kremsmünster, Áustria). A suspensão celular foi transferida para uma garrafa de

cultivo de 75 cm² e incubada (MCO170AICUVL, Panasonic, Kadoma, Japão) por 48

horas a 37ºC e 5% de CO2.

Após este período, o meio de cultura foi removido e as células lavadas em PBS.

Após o procedimento de lavagem o PBS foi removido e acrescentou-se DMEM 10%

SFB com 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina). A substituição do meio de

cultura foi feita a cada 48 h.

17

CITOMETRIA DE FLUXO

Para a confirmação de que as células cultivadas pertenciam à linhagem de células-

tronco mesenquimais, as células passaram pela citometria de fluxo (Caracterização e

Viabilidade Celular) ao final da segunda passagem. Esse serviço foi realizado em

parceria com o Núcleo de Tecnologia Celular da PUC-PR. Foi utilizada uma amostra de

cada um dos pacientes que doaram a bola de Bichat. Para a realização dessa análise

foram adquiridas 100.000 células por tubo de citometria. Cada amostra foi passada uma

vez pelo citometro. Os anticorpos utilizados para a pesquisa foram anticorpos

monoclonais anti-human da marca BD Pharmingen™ (San Jose, Califórnia, USA) com

exceção do marcador intracelular vWF (Von Willebrand Factor) que foi utilizado da

marca Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha).

Além da utilização de anticorpos de controle positivo para CTM recomenda-se o

uso de anticorpos hematopoiéticos como critério adicional, já que a expressão seria

negativa.

3.3.3 ANÁLISE IN VITRO DA ASSOCIAÇÃO DAS CTMs COM

BIOMATERIAL BOVINO E PRF

Foram realizados testes em placas de 24 poços (Greiner, Alemanha), em

triplicatas de 4. Após confluência (70%), as células foram lavadas com PBS a 37 ºC,

desaderidas quimicamente, contadas em Câmara de Neubauer, sendo 8 x 103

células

plaqueadas por poço, de acordo com os seguintes grupos:

1) Grupo Controle (apenas CTMs): Nos poços do grupo controle as CTMs foram

plaqueadas somente em DMEM.

18

2) Grupo Bio-Oss®/CTMs: Já contendo as CTMs nos poços foi inserida dentro de um

“transwell” de 3 µm (Easy Strainer, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Áustria) a

quantidade de 5 mg de Bio-Oss (Geistlich, Wolhusen, Suiça) previamente pesado em

uma balança analítica, o “transwell” foi deixado em contato com o DMEM.

3) Grupo Bio-Oss® + PRF/CTMs: Contendo as CTMs nos poços foi inserida dentro de

um “transwell” de 3 µm (Easy Strainer, Greiner Bio-One, Kremsmünster, Áustria) a

quantidade de 5 mg de Bio-Oss (Geistlich, Wolhusen, Suiça) previamente pesado em

uma balança analítica. A membrana de PRF foi fragmentada para remoção dos coágulos

sanguíneos e padronização de fragmentos do mesmo tamanho para todos os

“transwells” e colocada sob o Bio-Oss (Geistlich, Wolhusen, Suiça). O “transwell” foi

deixado em contato com DMEM.

4) Grupo PRF/CTMs: Já com as CTM nos poços, a membrana de PRF foi fragmentada

em porções do mesmo tamanho e sem coágulos sanguíneos, foi colocada dentro dos

“transwells”, deixando-o em contato com DMEM.

Para a realização dos testes, o sangue para a obtenção da Fibrina Rica em Plaquetas foi

coletado de um único individuo doador no dia da confecção do teste, em coleta única.

Para a realização da coleta, o doador passou por uma anamnese, onde se constatou ser

um indivíduo saudável, com estado nutricional dentro do padrão e sem histórico de

doenças prévias.

19

3.3.4 OBTENÇÃO DA MEMBRANA DE PRF

Para a obtenção da membrana de PRF realiza-se uma coleta de sangue humano,

de um mesmo doador, com o auxilio de tubos de 9ml com sílica na parte interna do

tubo.

O sangue coletado é submetido à centrifugação a 400 g por 10 minutos. Após o

procedimento, a membrana foi removida do tubo (Figura 4) e fracionada com o auxilio

de uma tesoura. Esse procedimento é realizado para a remoção dos coágulos sanguíneos

existentes na membrana (Figura 5). Já limpas, elas são novamente fracionadas no

sentido vertical e horizontal para a obtenção de pedaços do mesmo tamanho.

Figura 4 - Ilustração do conteúdo do tubo após a centrifugação, a porção amarela é a fibrina

retirada para fazer o PRF.

20

Figura 5 - Procedimento de remoção dos coágulos remanescentes das membranas de PRF.

Todos os grupos foram subdivididos em mais três grupos para avaliação aos 7, 14 e 25

dias realizando as seguintes análises.

3.4 RESULTADOS

ISOLAMENTO E CULTIVO CELULAR:

As células-tronco mesenquimais foram levadas até a segunda passagem, quando

atingiram 70% de confluência. As células apresentaram-se aderentes, espraiadas, com

padrões morfológicos distintos. Com predomínio de células alongadas e fusiformes

(Figura 6).

21

Figura 6 – Imagem em microscópio invertido de CTMs com 70% de confluência. Células

aderentes, espraiadas, com padrões morfológicos distintos. Com predomínio de células

alongadas, fusiformes.

CITOMETRIA DE FLUXO

a) Caracterização Celular

Após a análise dos resultados da Citometria de Fluxo, observou-se que as três

amostras obtiveram a mesma porcentagem positiva de 100% para os CD73, e CD29, e

de 99,9% para o CD105. O CD90 teve uma pequena variação, mas que se manteve entre

94,4% e 98,7%, trazendo um resultado positivo para células-tronco mesenquimais

(Figura 7).

Os marcadores CD14, CD45 e CD19 mostrados na figura 7 tem uma pequena

variação entre si, de até 2% de diferença, o marcador HLA-DR teve a maior variação

entre os demais marcadores, que foi de 0,87% a 5,66%. Esses resultados também foram

coerentes, mantendo-se dentro do padrão de normalidade para a afirmação das CTM, já

que não passaram de 10%, resultando em negatividade (Figura 7).

O CD34 é um marcador de células tronco hematopoiéticas, células progenitoras

endoteliais e de células endoteliais adultas e apresentou uma característica não usual

para as CTM, apresentando um resultado que variou de 30,3% a 49,2% não se

22

enquadrando nem em positivo (acima de 70%) e nem em negativo (abaixo de 10%). Foi

então adicionado o marcador intracelular de Von Willebrand Factor (vWF) que encontra-

se presente em células endoteliais e megacariócitos que demonstrou um resultado

positivo que variou de 97,9% a 98,9% (Figura 7).

Com esse resultado dos CD34 e vWF sendo positivos, analisamos as imagens e

vimos um domínio de células endoteliais nas amostras (Figuras 8 e 9 A e B), o que

sugeriu-se que as células endoteliais acabaram se sobressaindo no meio de cultivo, com

relação as CTM. Supõe-se que a causa dessa proliferação de células endoteliais seja

causada pelo excesso de vascularização nas amostras de tecido adiposo utilizadas, e que

em uma próxima amostra sejam usadas amostras menores, com menos vascularização e

sem coágulos sanguíneos ao redor, aumentando também os cuidados para que não

ocorra nenhuma contaminação da amostra durante o armazenamento e transporte.

Figura 7 – Análise por Citometria de Fluxo. Empregaram-se os CD105, CD73, CD90,

CD29, CD14, CD45, CD19, HLA-DR, CD34 e vWF para a caracterização de células-tronco

mesenquimais, mostrando um resultado característico de células-tronco mesenquimais, porém

não usual pelo resultado atípico do CD34.

Observa-se nas Figuras 8 e 9 (A e B) o padrão morfológico de células endoteliais

fotografadas na terceira passagem, com uma câmera acoplada em um microscópio

invertido. Observam-se células com semelhante padrão morfológico, aderidas e

23

espraiadas por sobre o substrato, apresentando inibição de contato. Mesmo padrão

morfológico foi observado para células isoladas de dois pacientes diferentes.

.

b) Viabilidade Celular

Durante a Citometria de Fluxo também foi analisada a Viabilidade Celular que

variou entre 95,1% e 96,57%, estando de acordo com os critérios pré-estabelecidos

(acima de 70%) que consideram elegíveis a infusão dessas células nos pacientes em

casos de terapias (Figura 10).

Figura 9 – Padrão morfológico das células endoteliais observadas em

microscópio invertido. Células aderidas, espraiadas, fusiformes.

Figura 8 – Padrão morfológico das células endoteliais observadas em

microscópio invertido. Células aderidas, espraiadas, fusiformes.

24

Através do 7AAD (7-Aminoactinomycin D), observou-se através da coloração

das células a porcentagem de células mortas, que variou de 3,43% a 4,99% (Figura 10).

As células que obtiveram a membrana celular comprometida (células mortas)

são permeáveis e tornam-se coradas com o corante fluorescente, enquanto as células

vivas que possuem a membrana intacta, não absorvem o corante (Figura 10).

Realizou-se também a contagem de células que sofreram apoptose (morte celular

programada) pela ligação da proteína Anexina V em fosfolipídeos, que na presença de

íons de cálcio exibem alta afinidade para ligação fosfatidilserina, que está presente nas

células apoptóticas. A quantidade de células que sofreram a morte celular programada

foi baixa, tendo uma variação média de 2,63% a 3,83% nas três amostras (Figura 10).

Figura 10 – Viabilidade Celular das amostras I, II e III em Citometria de Fluxo empregando-se

Anexina V, 7AAD. Foram realizados 100.000 eventos por tubo de citometria em 3 amostras de

triplicatas biológicas.

ANÁLISE IN VITRO

No grupo Controle pode-se notar que as células adquiriram um formato

fusiformes, aderidas ao substrato e espraiadas, mantiveram-se subconfluentes durante

todos os períodos de tempo (Figura 11 A, B e C).

No grupo Bio-Oss®/CTMs notou-se que as células se proliferaram mais quando

comparadas ao grupo Controle. Nos tempos de 7 e 14 dias as células se mantiveram

25

subconfluentes e com aparência alongada. Já no tempo de 25 dias as células já estavam

menos subconfluentes que nos outros tempos e observou-se a presença de células

desaderidas com características arredondadas típicas de células mortas ou em processo

de proliferação celular, bem como debris celulares (Figura 11 D, E e F).

No grupo Bio-Oss® + PRF/CTMs (Figura 11 J, K e L), as células se

proliferaram em menor escala que nos outros grupos, tendo o seu maior pico de

proliferação no tempo de 14 dias.

No grupo PRF/CTMs as células tiveram uma proliferação grande em todos os

três tempos. Notou-se também a presença de células desaderidas com características

arredondadas típicas de células mortas ou em processo de proliferação celular, que

diminuiu conforme os tempos de estudo aumentando, chegando quase a não ser

observada no tempo de 25 dias (Figura 11 G, H e I).

Quando comparamos os grupos podemos perceber que na maioria dos tempos as

células se mantiveram subconfluentes de maneira organizada para que pudessem

continuar em crescimento, com exceção dos grupos Bio-Oss®/CTMs e PRF/CTMs

(ambos no tempo de 25 dias), que se proliferaram mais do que no grupo em que foram

associados.

Observou-se também uma diferença no número de células desaderidas com

características arredondadas típicas de células mortas ou em processo de proliferação

celular, que no grupo Bio-Oss®/CTMs se organizou de maneira crescente, aumentando

sua quantidade até o tempo de 25 dias, enquanto no grupo PRF/CTMs, organizou-se de

maneira decrescente, diminuindo sua quantidade até o tempo de 25 dias. Podemos notar

também, que em todos os grupos as células se mantiveram vivas e em crescimento

constante durante os 25 dias de observação.

26

Figura 11 – Análise morfológica de células controles, e expostas a diferentes biomateriais, em

microscópio invertido. As imagens A,D,G e J (7 dias), B, E, H e K (14 dias) e C, F, I, e L (25

dias) de cultivo celular. As imagens A,B e C células controles mantidas somente em presença de

meio de cultura. As imagens D,E e F células expostas ao Bio-Oss. As imagens G,H e I expostas

aos biomateriais Bio-Oss e PRF. E as imagens J,K e L expostas somente ao PRF. Este ensaio foi

realizado em triplicatas biológicas.

3.5 DISCUSSÃO

Atualmente com o avanço da tecnologia e o emprego de novas pesquisas na área

de tecnologia celular e engenharia tecidual são necessárias à padronização de técnicas

para que seja possível viabilizar as pesquisas ao um possível uso clínico futuramente.

Outros pesquisadores (Broccaioli et al., 2013, Conti et al., 2018) já citaram a utilização

da bola de Bichat como fonte de CTM, o que abre portas para a facilitação de mais

pesquisas na área. Anteriormente a forma de obtenção de tecidos adiposos era de maior

27

complexidade, já que era necessária a realização de um procedimento cirúrgico para

remoção de tecido adiposo abdominal subcutâneo (Freese et al., 2016).

As técnicas utilizadas para isolamento de células-tronco variam na literatura,

neste trabalho utilizamos a técnica de digestão enzimática, porém no ano de 2005 o

pesquisador Pierdomenico descreveu a técnica explant, que demora um pouco mais para

que ocorra o desprendimento das células, mas que também pode ser usada.

Durante as análises dos resultados, os laudos mostraram um resultado positivo

anormal e não usual para células-tronco mesenquimais do marcador CD34 que seria um

marcador mais típico em casos de células-tronco hematopoiéticas ou células endoteliais.

Porém, em 2011 Bakopoulou et al., tiveram resultados parecidos e afirmaram que

podem ser causados pela técnica de digestão enzimática, podendo ser a causa da

alteração dos resultados não usuais para a caracterização das células-tronco de origem

mesenquimais.

Outro fato que se deve levar em consideração para o aparecimento de inúmeras

células endoteliais nos resultados da citometria é que na Bola de Bichat que é muito

vascularizada contém células-tronco mesenquimais, células endoteliais, linfócitos T e

células-tronco hematopoiéticas, porém na primeira troca de meio, as únicas células

aderentes são CTM e células endoteliais, já que as CTM se soltam do tecido adiposo e

as células endoteliais se soltam dos vasos sanguíneos existentes no tecido conjuntivo. A

linhagem celular que domina ao final dos testes pode ser determinada por vários

aspectos externos, como a quantidade de vascularização e coágulos da fração de gordura

utilizada.

Neste estudo observou-se a existência de CTM com origem da bola de Bichat, o

que facilita os estudos de engenharia tecidual, já que a bichectomia se torna um método

28

de obtenção de células-tronco mais fácil e confortável do que a tradicional lipoaspiração

de gordura subcutânea abdominal, porém a presença dessas células não foram 100%

comprovadas por todos os marcadores da Citometria de Fluxo.

Com relação a influência do biomaterial bovino associado ou não ao PRF no

cultivo das CTM da Bola de Bichat, em outros estudos (Brocaioli et al., 2013, Conti et

al., 2018), percebeu-se que durante o teste in vitro a associação de biomateriais com as

células-tronco mesenquimais favoreceu a proliferação celular, mantendo as células

vivas e em desenvolvimento, assim como observado neste estudo. Ainda, apesar da

associação do biomaterial bovino e da membrana de PRF ter demonstrado uma

proliferação celular maior no tempo de 14 dias, quando utilizados separados,

favoreceram mais ainda a multiplicação celular.

Estes resultados sugerem que sejam realizados mais estudos na área,

acompanhando por mais tempo os grupos in vitro para observar as alterações e

estímulos que os biomateriais podem causar nas células, já que comprovamos que

durante 25 dias as células se mantém vivas na presença dos biomateriais testados.

Nessa circunstancia, com a evolução desse trabalho, será realizado um novo

Isolamento e Cultivo celular pela técnica de digestão enzimática com novas amostras de

Bola de Bichat . As células isoladas serão levadas novamente ao CTC para análise de

Citometria de Fluxo comparando as células na terceira passagem e na sétima passagem.

Posteriormente novos testes in vitro serão confeccionados com diferentes biomateriais

associados à CTM.

29

3.6 CONCLUSÃO

Neste estudo pode-se concluir que o biomaterial bovino associado ou não ao

PRF, permitiu a proliferação celular das CTM derivadas da Bola de Bichat, deixando as

células viáveis durante os 25 dias.

30

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4. ANEXO

AVALIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO DA BOLA DE BICHAT …

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