AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA DOS GENES PR …
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INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA DOS GENES PR-1RK NA TRANSFORMAÇÃO DE TOMATEIRO MICRO-TOM NATÁLIA DE AGUIAR PRAVATTA Orientador: Prof. Dr. Jorge Mauricio Costa Mondego Co-orientadora: Dra. Renata Moro Baroni Campinas, SP 2021
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INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO AGRICULTURA TROPICAL
E SUBTROPICAL
AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA
DOS GENES PR-1RK NA TRANSFORMAÇÃO DE
TOMATEIRO MICRO-TOM
NATÁLIA DE AGUIAR PRAVATTA
Orientador: Prof. Dr. Jorge Mauricio Costa Mondego
Co-orientadora: Dra. Renata Moro Baroni
Campinas, SP
2021
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INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO AGRICULTURA TROPICAL
E SUBTROPICAL
AVALIAÇÃO DE MUTAGÊNESE SÍTIO DIRIGIDA
DOS GENES PR-1RK NA TRANSFORMAÇÃO DE
TOMATEIRO MICRO-TOM
NATÁLIA DE AGUIAR PRAVATTA
Orientador: Prof. Dr. Jorge Mauricio Costa Mondego
Co-orientadora: Dra. Renata Moro Baroni
Dissertação apresentada como requisito
para a obtenção do título de Mestre em
Agricultura Tropical e Subtropical, Área de
Concentração em Genética, Melhoramento
e Biotecnologia Vegetal.
Campinas, SP
2021
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SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA
PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO AGRONÔMICO
Pós-Graduação Agricultura Tropical e Subtropical Fone: (19) 2137.0659/2137.0601
Avenida Barão de Itapura, 1.481 - Caixa postal 28 13020-902 -
Campinas, SP
Ata da reunião da Comissão Examinadora da defesa de dissertação de mestrado de Natália de Aguiar Pravatta, discente do Programa de Pós-Graduação em Agricultura Tropical e Subtropical do Instituto Agronômico - IAC, sob a presidência do Dr. Jorge Maurício Costa Mondego, realizada em sessão pública por videoconferência, aos 27 do mês de maio de 2021, às 14 horas, visando à obtenção do título de "Mestra". Iniciados os trabalhos, a candidata submeteu-se ao exame de sua dissertação, intitulada “Avaliação de
mutagênese sítio dirigida dos genes PR-1RK na transformação de tomateiro micro-tom”. Terminado o exame, procedeu-se ao julgamento, cujo resultado foi o seguinte: A Comissão Julgadora foi constituída pelos seguintes doutores (as):
Titulares: Dr. Jorge Maurício Costa Mondego (IAC) aprovada (x) reprovada ( )
Drª. Daniela de Argollo Marques (IAC) aprovada ( X ) reprovada ( ) Drª. Mirian Perez Maluf (IAC) aprovada ( X ) reprovada ( )
Apurados os resultados, constatou-se que a candidata foi habilitada, fazendo jus, portanto, ao título de “MESTRA EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL”, na área de concentração: GENÉTICA, MELHORAMENTO VEGETAL E BIOTECNOLOGIA , do que, para constar, lavrou-se a presente ata, que após lida e aprovada, foi assinada pelos membros da Comissão Examinadora.
Dr. Jorge Maurício Costa Mondego – IAC
Drª. Daniela de Argollo Marques - IAC
Drª. Mirian Perez Maluf – IAC
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“Lembra-te:
Tudo o que chega, chega sempre por alguma razão.“
Fernando Pessoa
À minha família e amigos queridos,
Dedico.
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AGRADECIMENTOS
À minha família, em especial ao meu pai Marcos, minha mãe Ana, irmã Aninha, pelo
amor, e apoio incondicional em todas as decisões.
Ao meu orientador Prof. Dr. Jorge Mondego, pela oportunidade de orientação à mim
dada, pela confiança e pelos ensinamentos.
À minha co orientadora Dra. Renata Baroni pelos conhecimentos compartilhados.
Ao Instituto Agronômico de Campinas (IAC), pela oportunidade de realização do
mestrado.
Aos Professores do PPG-AIC, que compõem a área de concentração Genética,
Melhoramento Vegetal e Biotecnologia e aos Professores das disciplinas cursadas pelo
conhecimento compartilhado.
Aos colegas da Pós-graduação, Geovani Oliveira, Isabela Laporte, Gustavo Souza, pelo
convívio e aprendizado mútuo ao longo das disciplinas.
Ao Prof. Dr. Antonio Figueira, pela oportunidade de realização dos experimentos de
transformação no Laboratório de Melhoramento de Plantas.
À Dra. Danielle Scotton por todas as dicas, orientações, amizade e horas de bom papo
compartilhadas.
À minha amiga e mestre egressa do programa de Genética, Melhoramento e
Biotecnologia Vegetal, Giullia Forti por todo conhecimento dividido, amizade, carinho
e ajuda essencial para execução deste trabalho.
Ao Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) pela concessão do subsídio e estrutura
cedida para os experimentos iniciais.
À liderança de Agustina Gentile e Thaís Helena Ferreira pelo incentivo.
Aos grandes amigos do CTC, Valter Alessio, Isabela Ascencio, Marcela Notini, Geraldo
Silva, Antonio Kaupert, Ellen Andrade, Bianca Melo, Camila Lopes, Ana Lorandi,
Natália Spagnol, Ana Carolina Zakir, Daiane Silva, Filipe Garcia e Mari Girio pelos
anos de convívio em equipe, pela constante ajuda, sugestões, críticas, encorajamento,
momentos de apoio e conselhos.
Aos amigos de Campinas, em especial, Isabella Iannaconi e Lucas Conde por todas as
estadias cedidas, companheirismo ao longo dessa jornada e por terem se tornado minha
família na nova cidade.
vii
Aos meus queridos amigos de infância, Adriano Pechio, André Pechio, Izabel Magno,
Murilo Sanz, Guilherme Mello, Camila Falcini, Mariane Galvão, Iago Peres, Juliane
Garufi, por estarem presentes em todos os momentos da minha vida, por todo apoio,
pelos os encontros, reuniões, conversas e churrascos feitos para aliviar as tensões
trazidas ao longo desse período.
As minhas amigas e amigos de graduação, e vida, Talyta Torezzan, Camila Geraldo,
Luisa Mondoni, Marília Dorsa, Marina Uhle, Matheus Souza e Farid Saad pela amizade
e pelos inúmeros momentos de alegrias, conselhos e apoio.
À Luana Bertochi, pelas sábias palavras, pelos apontamentos e conselhos durante os
momentos mais decisivos de minha vida.
E a todos não citados, que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desta
dissertação, agradeço de coração.
Esse trabalho só foi possível graças ao apoio de vocês!
Muito obrigada!!!
viii
SUMÁRIO
RESUMO xv
ABSTRACT xvi
2.1 Mecanismos de interação planta – patógeno 20
2.2 Proteínas relacionadas à patogênese (PR-Proteínas) 21
2.3 Proteínas PR-1 e suas propriedades 23
2.3.1 Proteínas do tipo PR-1 em Cacaueiro 26
2.4 Transformação genética 29
2.5 O tomateiro Micro-Tom como planta modelo 30
2.6 Mutagênese sítio dirigida 311
2.7 Propriedades dos aminonácidos Ala, Leu e Asp 322
3 MATERIAL E MÉTODOS 355
3.1 Desenho dos iniciadores para mutagênese sítio dirigida dos genes TcPR-1f e
TcPR- 1g 357
3.2 Reação de mutagênese sítio dirigida e transformação de células
eletrocompetentes de Escherichia coli 37
3.3 Confirmação da mutagênese sítio dirigida 3838
3.4 Clonagem via enzima de restrição em vetor de pCAMBIA2201 400
3.5 Introdução das construções em Agrobacterium tumefaciens 41
3.6 Transformação genética de tomateiro Micro-Tom 422
3.6.1 Condições de cultura de A. tumefaciens 43
3.6.2 Inoculação e co-cultura 433
3.6 3 Regeneração de plântulas de tomateiro 444
3.6.4 Confirmação das plantas transformadas 444
3.7 Análises estatísticas 455
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 466
ix
4.1 Construções contendo mutagênese sítio dirigida e validação 466
4.2 Ensaios de transformação genética em tomateiro Micro – Tom 544
4.3 Confirmação das plantas transformadas 555
4.3.1 Análise dos eventos obtidos 590
5. CONCLUSÕES 645
6. ANEXOS 656
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 667
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Organização e domínios das proteínas PR-1RK de T. cacao (Tc). O peptideo
sinal é indicado na extrema esquerda da figura, seguido do domínio SCP/TAPS; seguido
da porção transmembranar hidrofóbica e domínio serina/ treonina quinase a direita. Os
números em romano indicam as regiões do domínio quinase envolvidas em atividade
fosforilativa. (TEIXEIRA et al., 2013) ........................................................................... 26
Figura 2: Diâmetro médio do caule (mm) no controle e linhas transgênicas inoculado
com o fungo M. perniciosa, 35 dias após a inoculação. Colunas seguidas da mesma letra
não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05) ......................................................... 28
Figura 3: Área média da lesão (cm²) no controle e linhas transgênicas inoculados com P.
parasitica, 4 dias após a inoculação. Colunas seguidas da mesma letra não diferem entre
si pelo teste de Tukey (p<0,05) ...................................................................................... 28
Figura 4: Esquema de reação para obtenção da troca de bases via mutagênese sítio
dirigida por PCR. Adaptado de ZHENG et al., 2004. .................................................... 32
Figura 5: Estrutura geral de um aminoácido. Cada aminoácido apresenta um carbono
central (C), um grupo funcional ácido carboxílico (COO-), um grupo amino (-NH2), um
hidrogênio (-H) e cadeira lateral variável (R). Adaptado de NELSON et al., 2002.........
33
Figura 6: Estrutura dos aminoácidos Alanina, Leucina e Ácido Aspártico. As fórmulas
estruturais mostram o estado das moléculas em pH neutro. A parte sombreada destaca a
cadeia lateal variável (R) de cada um destes aminoácidos. Adaptado de NELSON et al.,
2002. ............................................................................................................................... 34
Figura 7: Representação da sequência nativa do gene TcPR-1f e a substituição de
códons realizada na posição 155, via mutagênese sítio - dirigida para obtenção do vetor
mutado, denominado TcPR-1fL155D ................................................................................. 36
Figura 8: Esquema da dinâmica de reação de mutagênese dirigida via PCR ao longo dos
ciclos de amplificação na reação de PCR, exemplificando que o DNA utilizado como
molde permanece com a sequência original e que o produto da amplificação apresentará
a troca de bases desejada (adaptado de SHENOY, 2003) .............................................. 37
Figura 9: Esquema das construções preparadas para os estudos funcionais in vitro. A)
Gene TcPR-1fL155D contendo a troca do aminoácido Leucina para Ácido aspártico no
domínio SCP. B) Gene TcPR-1gL107D contendo a troca do aminoácido Leucina para
Ácido aspártico no domínio SCP. C) Gene TcPR-1f com todos os domínios íntegros,
sem troca de aminoácidos (Controle selvagem). D) Gene TcPR-1g com todos os
domínios íntegros, sem troca de aminoácidos (Controle selvagem). E) Controle
pCAMBIA2201 (vetor vazio) sem os genes alvo. .......................................................... 42
xi
Figura 10: Imagem do software CLC evidenciando a eficácia da mutagênese sítio
dirigida para o gene TcPR-1f. No topo da imagem, está apresentada a sequência original
do gene (referência), os cromatogramas abaixo representam o resultado do
sequenciamento de uma amostra positiva para a mutação. Os nucleotídeos substituídos
estão em destaque. A) Domínio SCP. Em evidência a troca de TTG para GAC na
posição L155D. B) Domínio Quinase 1. Em evidência a troca de AAG para GCG na
posição K337A. C) Domínio Quinase 2. Em evidência a troca de AAA para GCT na
posição K434A ............................................................................................................... 47
Figura 11: Imagem do software CLC evidenciando a eficácia da mutagênese sítio
dirigida para o gene TcPR-1g. No topo da imagem, está apresentada a sequência
original do gene (referência), os cromatogramas abaixo representam o resultado do
sequenciamento de uma amostra positiva para a mutação. Os nucleotídeos substituídos
estão em destaque. A) Domínio SCP. Em evidência a troca de TTG para GAC na
posição L107D. B) Domínio Quinase 1. Em evidência a troca de AAA para GCT na
posição K298A. C) Domínio Quinase 2. Em evidência a troca de AAA para GCT na
posição K395A ............................................................................................................... 48
Figura 12: Verificação via enzimas de restrição das transformações em E. coli. A)
Padrão teórico da digestão do vetor pCAMBIA 2201 contendo o cassete do gene TcPR-
1fL155D com as enzimas EcoRV, NcoI, PvuII B) Validação em gel de agarose 1% dos
plasmídeos com os domínios SCP, Quinase 1 (Kn1) e Quinase 2 (Kn2) mutados. Na
parte superior indicando as enzimas utilizadas e o marcador e na parte inferior, a
indicação dos domínios e numeração da colônia. O marcador utilizado foi o Generuler 1
Kb Dna Ladder (Thermo Scientific). C) Padrão teórico da digestão do vetor pCAMBIA
2201 com as enzimas EcoRV, NcoI, SphI do gene TcPR-1gL107D. D) Validação em gel
de agarose 1% dos domínios SCP, Quinase 1 (Kn1) e Quinase 2 (Kn2) do gene TcPR1-
g em pCAMBIA 2201. Na parte superior indicando as enzimas utilizadas e o marcador
e na parte inferior, a indicação dos domínios e numeração da colônia. O marcador
utilizado foi o Generuler 1 Kb DNA Ladder (Thermo Scientific). E) Tamanhos
esperados de bandas com as respectivas enzimas para cada gene analisado. ................. 52
Figura 13: Imagens dos eventos putativos em frasco na fase de enraizamento antes da
coleta de material foliar para confirmação da transgenia por PCR convencional. A)
Eventos 1, 2, 3, 4, 5, 6 putativos do gene TcPR-1fL155D. O evento 4 não foi coletado. B)
Evento 1 putativos de TcPR-1gL107D C) Evento 1 e 2 putativos do controle
pCAMBIA2201. Apenas o número 1 foi coletado. D) Eventos 1, 2 e 3 putativos do
controle TcPR-1g. E) Tomateiro Micro-Tom (Wild Type) Controle do experimento de
transformação. ................................................................................................................ 57
Figura 14: Resultado da PCR para confirmação dos eventos obtidos nos experimentos 3
e 4 de transformação. O marcador utilizado foi de 100pb (Invitrogen). Ev: Evento.).MT
C-: Controle negativo, tomateiro Micro-Tom. Agro C+: Controle positivo, DNA de
Agrobacterium utilizado para transformação genética. A) Confirmação dos eventos 1, 2
e 3 de TcPR-1fL155D. B) Confirmação do evento 5 de TcPR-1fL155D ............................... 58
Figura 15: Resultado da PCR para confirmação do eventos obtidos nos experimento 3
de transformação do gene TcPR-1gL107D. O marcador utilizado foi de 100 pb
xii
(Invitrogen). Ev: Evento. MT C-: Controle negativo, tomateiro Micro-Tom. Agro C+:
Controle positivo, DNA de Agrobacterium utilizado para transformação genética........59
Figura 16: Resultado da PCR para confirmação dos eventos obtidos no experimento 3
de transformação do gene TcPR-1g. O marcador utilizado foi de 100 pb (Invitrogen).
Ev: Evento. MT C-: Controle negativo, Tomateiro Micro-Tom. Agro C+: Controle
positivo, DNA de Agrobacterium utilizado para transformação genética ..................... 59
Figura 17: Comparação das taxas de regeneração obtidas nos tratamentos. Colunas
seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05) ................. 61
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Famílias de proteínas relacionadas à patogênese já descritas em literatura... 22
Tabela 2: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para mutagênese sítio dirigida dos genes alvo TcPR-1f e TcPR-1g em seus domínios SCP e Quinase. As regiões em cinza
representam os códons no quais foram induzidas as mutações ...................................... 35
Tabela 3: Iniciadores Forward e Reverse utilizados no sequenciamento das mutagêneses
sítio dirigidas dos genes TcPR-1f e TcPR-1g em seus respectivos domínios. SCP:
domínio SCP/TAPS. Kn: Domínio Quinase ................................................................... 39
Tabela 4: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para sequenciamento completo dos
genes TcPR-1f e TcPR-1g. ............................................................................................. 41
Tabela 5: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para amplificação dos genes alvo na PCR de confirmação ....................................................................................................... 45
Tabela 6: Resumo dos resultados obtidos via mutagêneses sítio-dirigida nos domínios SCP, Quinase 1 e Quinase 2 para os genes TcPR1-f e TcPR1-g. ................................... 53
Tabela 7: Resumo das informações dos experimentos de transformação genética em
modelo de Tomateiro Micro-Tom dos genes TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D, TcPR-1f,
TcPR-1g (referência) e controle. .................................................................................... 55
Tabela 8: Resumo das taxas de regeneração obtidas nos experimentos de transformação genética de tomateiro Micro-Tom realizados ................................................................. 60
Tabela 9: Resumo das taxas de transformação obtidas nos experimentos de transformação genética de tomateiro Micro-Tom realizados ......................................... 63
Tabela 10: ANOVA obtida no software SPEED Stat 2.4. utilizando como varíavel a
taxa de regeneração obtida considerando 3 tratamentos (TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D e
pCAMBIA2201). O delineamento utilizado foi inteiramente ao acaso. GL: Graus de
Liberdade. SQ: Soma de Quadrados. QM: Quadrados Médios. F: Teste de variabilidade.
Ns: Não significativo. ..................................................................................................... 66
Tabela 11: Resumo da ANOVA obtida no software SPEED Stat 2.4. utilizando como
varíavel a taxa de regeneração obtida considerando 3 tratamentos (TcPR-1fL155D, TcPR-
1gL107D e pCAMBIA2201). O delineamento utilizado foi inteiramente ao acaso. C.V.:
Coeficiênte de variação. Ns: Não significativo. ............................................................. 66
xiv
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ANA: Ácido α-naftaleno acético
Asp: Aminoácido Ácido Aspartico
BAP: Benzilaminopurina
CBM: Do inglês, Caveolin Binding Motif
HR: Reposta Hipersensível
ISR: Resistência Sistêmica Induzida
Kn1: Domínio Quinase 1
Kn2: Domínio Quinase 2
Leu: Aminoácido Leucina
MT: Tomateiro Micro-Tom
PR: Proteínas Relacionadas à patogênese
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase
RLK: Receptor do Tipo Quinase
SAR: Resistência Sistêmica Adquirida
SCP: Domínio SCP/TAPS
Tm: Temperatura de ‘Melting’
xv
Avaliação de mutagênese sítio dirigida dos genes PR-1RK na transformação de
tomateiro micro-tom
RESUMO
As plantas desenvolveram mecanismos de defesa em resposta a estresses bióticos.
Dentre os genes de defesa vegetal mais estudados estão aqueles que codificam proteínas
relacionadas à patogênese do tipo PR (Pathogenesis Related). O estudo do papel dessas
proteínas no ataque por fitopatógenos faz-se importante para uma maior caracterização
dos mecanismos de defesa vegetal. Estudos in vitro demonstram que proteínas da
superfamília de proteínas SCP/TAPS, da qual as proteínas vegetais PR-1 fazem parte,
possuem capacidade de inibir o crescimento de oomicetos e fungos, além de se ligar e
exportar esteróis das células e possivelmente influenciar na sinalização da resposta de
defesa. Em estudos anteriores obtivemos tomateiros Micro-Tom transformados com os
genes TcPR-1f e TcPR-1g; porém com baixa taxa de transformação e regeneração. O
objetivo deste estudo foi obter mutantes dos genes PR-1RK através de mutagênese sítio-
dirigida dos domínios SCP/TAPS (ligação a esterol) e quinase (fosforilação), a fim de
verificar se tais funções desses genes alterariam o desenvolvimento in vitro dos
explantes. Os mutantes SCP/TAPS foram testados quanto a sua capacidade de interferir
nas taxas de transformação e regeneração in vitro de explantes de tomateiro Micro-Tom
transformados via Agrobacterium tumefaciens quando comparados aos genes selvagens
TcPR-1f e TcPR- 1g. A troca de aminoácidos em domínios das proteínas codificadas
foi realizada a fim de permitir a realização de estudos funcionais relacionados à perda
de função em plantas transgênicas no modelo vegetal Micro-Tom. Versões mutadas nos
sítios quinase e SCP/TAPS de cada gene foram obtidas por mutagênese sítio dirigida via
PCR e cada um dos genes mutados foi clonado no vetor binário pCAMBIA2201. Os
vetores finais foram validados por perfil de restrição e sequenciamento e transformados
em A. tumefaciens GV3101. Foram obtidos 4 eventos transgênicos de TcPR-1fL155D , 1
evento de TcPR- 1gL107D, 1 evento de TcPR-1g e 1 evento de pCAMBA2201. Os
fenótipos observados apresentaram lento desenvolvimento e baixa taxa de regeneração
in vitro. Com os dados obtidos, é possível supor que as interações membranares podem
ter sido afetadas com a troca de códons realizada. Porém, se faz necessário a realização
de mais estudos para essa comprovação e para otimização do protocolo de
transformação.
Palavras-chave: Proteínas PR-1, mutagênese sítio-dirigida, transformação vegetal,
esteróis, Solanum lycopersicum.
xvi
Appraisal of site directed mutagenesis on PR-1RK genes in Micro Tom tomato
genetic transformation
ABSTRACT
Plants have developed defense mechanisms in response to biotic stresses. Among the
most studied plant defense genes are those that encode proteins related to pathogenesis of
the type PR (Pathogenesis Related). The study of the role of these proteins in the attack
by phytopathogens is important for a wider characterization of plant defense
mechanisms. In vitro studies demonstrate that proteins from the SCP / TAPS protein
superfamily, of which plant proteins PR-1 are part, have the ability to inhibit the growth
of oomycetes and fungi, in addition to binding and exporting cellular sterols, and possibly
binding in signaling defense response. In previous studies, we obtained transformed
Micro-Tom tomatoes transformed with cacao PR-1RK genes TcPR-1f and TcPR-1g;
however, with low transformation and regeneration. The objective of this study was to
obtain PR-1RK mutant genes through site-directed mutants of SCP/TAPS (sterol binding)
and kinase (phosphorilation), to verify whether the function of these genes could alter the
development of the explants. The aim of this study is to relate the sterol binding of cacao
PR-1RK (PR-1 like receptor-like kinase) proteins to the resistance mechanism against
pathogens, through site-directed mutagenesis and if its changes could interfere in the
explants regeneration tax transformed by Agrobacterium tumefaciens. The changes of
amino acids in protein domains encoded by the genes identified in the cacao TcPR-1f and
TcPR-1g were carried out in order to allow a loss of function study in tomato Micro-Tom
plants. Mutated versions at the kinase and SCP/TAPS sites of each gene were achieved by
PCR site-directed mutagenesis and each of the genes was cloned into the binary vector
pCAMBIA2201. The final vectors were validated by restriction and sequencing and
transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101. We obtained 4 TcPR-1fL155D
transgenic events, 1 TcPR-1gL107D transgenic event, 1 TcPR-1g control event and 1
pCAMBA2201 control event. The observed phenotypes showed slow development and
low rate of in vitro regeneration. With the data obtained, we suggest that the membrane
interactions may have been affected by the exchange of codons performed; however, it is
necessary to carry out further studies to confirm this hypothesis and for the optimization
of genetic transformation protocol.
Keywords: PR-1 proteins, site-directed mutagenesis, genetic transformation, Solanum
lycopersicum.
17
1 INTRODUÇÃO
A produtividade agrícola está relacionada à resistência a patógenos, pragas e a outros
fatores de estresses bióticos e abióticos que limitam o desenvolvimento das cultivares
(OERKE, 2005). Os organismos vegetais não possuem resposta imune mediada por
anticorpos (adquirida), como os animais. Entretanto, os vegetais desenvolveram
mecanismos de defesa inata similares aos encontrados em outros grupos taxonômicos que,
quando acionados, liberam sinais responsáveis por desencadear mecanismos de defesa em
busca de resistência à infecção (LARCHER, 2006; WIT, 2007). Em geral, as plantas se
recuperam do ataque devido a efetividade dos sinais enviados que se transformam em
indução de resistência (SILVA et al., 2008).
A indução de resistência a doenças ocasionadas por patógenos durante o
desenvolvimento das plantas é comum no reino vegetal e pode acontecer em diferentes
estádios do desenvolvimento do hospedeiro e variar de acordo com o tipo de tecido
infectado, idade da planta, interação planta - patógeno e condições ambientais (WHALEN,
2005; DEVELEY-RIVIÈRE, 2007). Os fitopatógenos invasores ou seus elicitores podem
ativar respostas de defesa na planta e ocasionar uma reprogramação transcricional (WEN et
al., 2017).
A resistência a determinado agente é definida como a capacidade de evitar a entrada
ou atrasar a subsequente atividade do fitopatógeno nos tecidos (NOJOSA et al., 2005). O
mecanismo inicial de defesa é composto pelas barreiras físicas, ou seja, cutícula, estômatos
e tricomas (GONZÁLEZ-LAMOTHE et al., 2009). A partir da superação pelo patógeno
destas barreiras primárias, é acionado um sistema de defesa de amplo espectro comum em
monocotiledôneas e dicotiledôneas (HEATH, 2000a). A primeira etapa da resposta de
defesa da planta é conhecida por resposta hipersensitiva (HR) ou reação de
hipersensibilidade caracterizada por ocorrer de maneira rápida no sítio de infecção do
patógeno (HARTMAN et al., 2016).
Outro tipo de resposta secundária que pode ser manifestada pelo organismo após a
formação de lesões necróticas é denominada Resistência Sistêmica Adquirida (SAR do
inglês, “Systemic Acquired Resistance”) definida pela ativação de mecanismo de defesa
em áreas distantes do local de infecção pelo fitopatógeno na planta (RYALS et al. 1996;
HARTMAN et al., 2016). Sugere-se que compostos como o etileno, ácido jasmônico e
ácido salicílico atuam como sinalizadores para esse tipo de resistência. Além disso,
durante o estado de SAR, o grupo de proteínas relacionadas à patogênese (PRs, do inglês
18
“Pathogenesis Related Proteins”) é expresso (BROEAKAERT et al., 2000; VAN LOON et
al., 2006). O mecanismo de Resistência Sistêmica Induzida (ISR), relacionado à presença
de endofíticos ou microorganismos potencializadores de defesa, também é ativado por
elicitores químicos, semelhante à SAR, porém durante a ISR não há envolvimento do ácido
salicílico como sinalizador (PIETERSE, 2015).
As proteínas PR foram descritas pela primeira vez em folhas de tabaco (Nicotiana
tabacum L.) (VAN LOON et al, 1985) sendo, em seguida, identificadas em outras espécies
de plantas pertencentes a várias famílias. Atualmente, as proteínas PR são agrupadas em 17
famílias de acordo com suas características bioquímicas e atividade funcional (VAN
LOON et al., 2006). Dentre essas proteínas, as do tipo PR-1 são altamente conservadas em
plantas e tem participação na sua resposta ao estresse biótico (LINCOLN et al., 2018).
Alguns estudos recentes demonstram que o nível de transcrição e tradução de PR-1
aumenta em plantas sob condições de estresse biótico (SHI et al. 2019; YANG et al. 2019).
Além disso, quando os genes PR-1 foram superexpressos em plantas transgênicas, essas
geralmente exibiram maior resistência a doenças causadas por bactérias, fungos e vírus. O
contrário foi observado nas plantas que tiverem os genes PR-1 silenciados, as quais
mostraram maior suscetibilidade do que o controle na infecção de patógenos
(PEČENKOVÁ et al., 2017). A função biológica exata e o modo de ação das proteínas PR-
1 vem sendo elucidada. Gamir e colaboradores (2017) verificaram que essas proteínas
possuem capacidade antimicrobiana inibindo o crescimento de fungos e oomicetos.
As proteínas PR-1 apresentam domínio comum conservado com quatro α-hélices e
quatro folhas–β, arranjadas em paralelo, característico da superfamília SCP/TAPS
(‘Sperm- coating protein-Tpx-1/Ag5/PR-1/Sc7’) que possui membros em todo o reino
eucarioto (TEIXEIRA et al., 2012). Enquanto muitas das proteínas englobadas pela
superfamília SCP/TAPS apresentam domínio CAP, além de outros domínios funcionais
adicionais, as proteínas PR-1 apresentam apenas o domínio CAP com extensões N e C-
terminais curtas, sugerindo que esse domínio determina seu papel nas plantas (BREEN et
al., 2017).
A atividade bioquímica das proteínas da superfamília SCP/TAPS foi relatada pela
primeira vez nas proteínas de levedura PRY1 e PRY2 e na proteína humana CRISP2
devido a sua capacidade de ligação esterol e ácidos graxos (CHOUDHARY E
SCHNEITER, 2012). Estudos de modelagem computacional da levedura PRY1
identificaram uma região com semelhança de sequência ao motivo de ligação à caveolina,
no qual haveria a ligação ao esterol acontecendo por aminoácidos hidrofóbicos presentes
nesta região (BREEN et al., 2017; DARWICHE et al., 2018).
19
Recentemente, genes que codificam domínios PR-1 extracelulares fundidos aos
domínios transmembrana e quinase, característico de receptores do tipo quinase (RLKs)
foram encontrados em cacau (TEIXEIRA et al., 2013), em trigo e em arroz (LU et al.,
2017). Nos organismos vegetais em que foram identificados os genes PR-1-RLK (PR-1
receptores do tipo quinase) estavam expressos em condições de estresse biótico (infecção
de patógenos) e abiótico (TEIXEIRA et al., 2013; LU et al., 2017). A função exata que os
PR- 1-RLKs desempenham no reconhecimento e na indução de respostas de defesa nas
plantas ainda não foi plenamente elucidada. Acredita-se que podem desempenhar papel de
reconhecimento ou detecção de esteróis (BREEN et al., 2017).
Devido à novidade da descoberta dos genes com características de RLKs com domínio
extracelular do tipo PR-1 (denominados anteriormente de PR-1-RLK), esses genes (TcPR-
1f e TcPR1-g) foram o foco dos estudos de Teixeira e colaboradores (TEIXEIRA et al.,
2013). Foram avaliados os dados de RNAseq de cinco réplicas biológicas de plantas de
cacau infectadas com vassoura de bruxa no seu estágio de “vassoura verde” e cinco
réplicas de amostras controles, não infectadas. Os dados mostraram que uma das PR-1-
RLK de cacau codificada pelo gene TcPR-1g teve maior expressão durante a interação com
Moniliophthora perniciosa. Por outro lado, TcPR-1f não teve sua expressão
significativamente alterada durante o ataque (TEIXEIRA et al. 2013). Posteriormente,
foram realizados os primeiros experimentos de transformação genética de tomate Micro-
Tom com ambos os genes, TcPR-1f e TcPR-1g, seguidos da inoculação dos patógenos
Moniliophthora perniciosa e Phytophthora parasitica com o objetivo de caracterizar a
atividade das duas proteínas PR-1 receptoras quinase de cacaueiro. Verificou-se que a
superexpressão de TcPR-1f aumentou a tolerância ao fungo e ao oomiceto testados,
confirmando o possível papel deste gene na resistência contra esses patógenos. Por outro
lado, os dados para TcPR- 1g não foram plenamente conclusivos (FORTI, 2018). Um dos
maiores problemas durante os experimentos realizados por Forti (2008) foi a baixa taxa de
regeneração in vitro dos explantes transformados com os genes TcPR-1 f e TcPR-1g. Uma
das hipóteses geradas durante a discussão da dissertação de Forti (2008) foi de que a
própria atividade dos genes seria a responsável pela baixa regeneração. Para testar a
hipótese de que os sítios de ligação ao esterol dos genes TcPR-1f e TcPR-1g estão
efetivamente envolvidos dificuldade de regeneração dos explantes, o objetivo desse
trabalho foi realizar a mutagênese sítio dirigida nos sítios SCP/TAPS e Quinase e avaliar,
após a transformação genética em tomateiro Micro-Tom, o padrão de taxas de regeneração
in vitro dos brotos.
20
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Mecanismos de interação planta – patógeno
Os mecanismos de defesa nas plantas podem ser atribuídos às barreiras físicas ou
morfológicas, tais como pilosidade, serosidade, lignina e cutículas, sendo denominados
fatores de resistência estruturais ou barreiras químicas, como a produção de compostos
que induzem modificações na parede celular ou formação de papilas e compostos
antimicrobianos, sendo denominados fatores de resistência bioquímicos (VAN LOON et
al., 2006; SELS et al., 2008).
Ao atacar uma planta hospedeira, os genes do patógeno são ativados para liberar as
enzimas ou toxinas na planta em forma de infecção. A planta, por sua vez, com a ajuda dos
fatores de resistência bioquímicos também acumula substâncias tóxicas e sintetiza
proteínas de defesa, dentre elas, as PR proteínas, relacionadas à patogênese (BERTINI et
al., 2009; AGRIOS, 2005). Após o ataque, o organismo vegetal pode não desenvolver
nenhuma doença ou desenvolver doença moderada ou grave dependendo das condições
de infecção, do desenvolvimento da planta e da composição genética dos organismos
envolvidos (planta e patógeno) (DANGL et al., 2001).
Nas interações onde a planta consegue resistir ao ataque do patógeno, o hospedeiro
carrega um grupo de genes de resistência (R) e o patógeno carrega genes correspondentes
para avirulência (AVR) (HEAT, 2000b). Em geral, a maquinaria de defesa induzida das
plantas é desencadeada pela infecção do patógeno (LIU et al., 2005; BLBK et al., 2009).
Os mecanismos de defesa são ativados pelo reconhecimento das proteínas de avirulência
que por sua vez ativam mecanismos de resistência no hospedeiro. O mecanismo de
resposta hipersensível (HR) é uma resposta rápida, inicialmente das células infectadas
próximas à lesão que liberam compostos tóxicos, os quais podem atuar contra o patógeno e
em alguns casos, ocasior apoptose celular (AGRIOS, 2004). Outras respostas à infecção
incluem o aumento da expressão da enzima fenilalanina amônialiase (PAL), enzima
envolvida na biossíntese de compostos fenólicos dentre eles o ácido salicílico (SA)
envolvido na resistência sistêmica devido sua capacidade de induzir PR-proteínas,
deposição de lignina e aumento dos níveis de compostos que atuam na ativação de sinais
para expressão de proteínas de defesa e ácido salicílico (SA), óxido nítrico e oxigênio
(THATCHER et al. 2005; AGRIOS, 2004; VERBENE et al. 2000).
A HR também pode ativar uma cascata de sinalização e ocasionar um estado
aprimorado de resistência nas regiões próximas a lesão ou em toda a planta conhecido
21
como Resistência Sistêmica Adquirida (Systemic Acquired Resistance, SAR). Observa-se
que organismos que apresentam SAR possuem diminuição da suscetibilidade a patógenos
no geral e não apenas ao patógeno que originou a resposta hipersensível (NAYLOR, et al.,
1998; BLBK et al., 2009). A SAR promove uma diminuição dos sintomas da doença após
infecções com patógenos na região próxima a lesão, na tentativa de minimizar o ataque.
Com o passar do tempo, se percebe a ocorrência da ativação de mecanismos de defesa em
locais distantes da lesão (AGRIOS, 2004; MARTINEZ, 2000). A indução da SAR é
caracterizada pelo acúmulo de ácido salicílico (SA) para estimular os mecanismos de
defesa e distribuição dos sinais (DOREY et al., 1997; DURNER et al., 1997). O SA é
proposto como o primeiro sinal químico para indução de genes relacionados a patogêneses
(PR), especialmente os genes PR-1 (FU et al. 2013; HARTMAN, 2016). Foi sugerido que
a SAR é mais eficaz contra os patógenos biotróficos e hemibiotrofóicos (HARTMAN,
2016).
Outro mecanismo induzido após o ataque de patógenos ou elicitores químicos é o
de Resistência Sistêmica Induzida (Induced Systemic Resistance, ISR) que desencadeia
sinais de maneira semelhante à SAR, mas está relacionado à rizobactérias que promovem
crescimento de plantas (PIETERSE et al., 2015). A ISR difere da SAR por ser dependente
de ácido jasmônico (JA) e etileno (ET) e ser independente da via do SA. Além disso, não
há ativação dos genes PR, além de não apresentar uma resposta de HR. Entretanto, em
alguns casos poder estimular a produção de ácido salicílico e ser confundido com a SAR
(PIETERSE et al., 2015; HARTMAN, 2016). A indução da ISR é mais eficaz contra
patógenos necrotróficos do que patógenos biotróficos ou hemibiotróficos uma vez que não
envolve resposta hipersensível (VAN LOON, et al, 1998).
2.2 Proteínas relacionadas à patogênese (PR-Proteínas)
Os genes PR codificam proteínas como as quitinases e β-1,3- glucanases, capazes
de degradar polissacarídeos estruturais de parede celular, prejudicando o desenvolvimento
do microorganismo e desempenhando papel de prevenção e/ou redução da colonização de
patógenos no hospedeiro (SUDISHA et al., 2012; ZAREIE, 2002). Inicialmente, o termo
“proteínas relacionadas à patogênese” ou “PR- proteínas” foi utilizado para descrever
proteínas extracelulares que se acumulavam em plantas Nicotiana tabacum infectadas com
22
o vírus do mosaico do tabaco (TMV; VAN LOON et.al, 1970). Ao longo do tempo, esta
definição passou a incluir o acúmulo de proteínas localizadas intra e extracelularmente em
tecidos vegetais ou em cultura de células após o tratamento com elicitores ou ataque de
patógenos (BOWLES et al., 1990).
As proteínas PR apresentam aumento de concentração em condições de estresse
abiótico ou sob ataque de fungos, oomicetos, bactérias, vírus (VAN LOON et al., 1999;
ROBERT et al., 2001; FERREIRA et al., 2007; SELS et al.,2008). A indução dessas
proteínas é mediada pela ação de sinalizadores de acordo com a origem dos elicitores,
endógenos (da planta) ou exógenos (do patógeno) (CHRISTENSEN et al., 2002).
A maioria das PRs apresenta baixo peso molecular (6 - 43KDa) (TAIZ et al., 2017)
e são induzidas pela ação dos compostos sinalizadores: ácido salicílico (SA), ácido
jasmônico (JA) ou etileno (ET) (HAMMOND-KOSACK et al., 2000; VAN LOON et al.,
2006). Estas apresentam propriedades físico-químicas que permitem resistir a pH ácido e
clivagem proteolítica nos espaços intercelulares, além de características físico-químicas
comuns (VAN LOON et al., 1985; NIDERMAN, 1995). Muitas proteínas PR possuem
atividade antifúngica e atividade antibacteriana in vitro como, por exemplo, quitinases,
glucanases e proteínas que se ligam à quitina (ZAREIE et al., 2002). Por serem induzidas
em associação à respostas de resistência, estudar essas proteínas é muito importante para
compreender os mecanismos de defesa (VAN LOON et al., 2006).
Essas proteínas estão divididas em 17 famílias de acordo com suas características
bioquímicas e biológicas, e foram numeradas por ordem de descoberta (VAN LOON et al.,
2006), como exemplificado na tabela 1.
Tabela 1: Famílias de proteínas relacionadas à patogênese já descritas em literatura
(Continua)
Família Membro Propriedade
PR-1 Tabaco PR-1 Antifúngica, antioomicetos, ligação
a esterol
PR-2 Tabaco PR-2 β-1,3-glucanase
PR-3
Tabaco P, Q Quitinase do tipo I, II, IV, V, VI,
VII
PR-4 Tabaco 'R' Quitinase do tipo I, II
23
Tabela 1: Famílias de proteínas relacionadas à patogênese já descritas em
literatura (Continuação)
PR-5
Tabaco 'S'
Thaumatina-like
PR-6 Tomate Inibidor I Inibidor de protease
PR-7 Tomate P69 Endoproteinase
PR-8 Pepino Quitinase Quitinase do tipo III
PR-9 Tabaco "peroxidase formadora de
lignina"
Peroxidase
PR-10 Salsinha PR-1 Ribonuclease-like
PR-11 Tabaco "classe V" Quitinase do tipo I
PR-12 Rabanete Rs-AFP3 Antifúngica
PR-13 Arabidopsis THI2.1 Tioninas
PR-14 Cevada LTP4 Proteína transferência de lipídíos
PR-15 Cevada OxOa Oxalato oxidase
PR-16 Cevada OxOLP Oxalato oxidase-like
PR-17 Tabaco PRp27 Desconhecida
Adaptado de VAN LOON, 2006.
A conservação evolutiva de proteínas semelhantes relacionadas à defesa em
monocotiledôneas e dicotiledôneas sugere que essas proteínas descritas na tabela
desempenhem funções essenciais na vida das plantas em quaisquer mecanismos que
estejam relacionadas (VAN LOON et al., 2006).
2.3 Proteínas PR-1 e suas propriedades
A família PR-1 faz parte da super-família SCP/TAPS (CANTACESSI et al., 2009),
é altamente conservada e está presente em todas as espécies de plantas investigadas até o
momento (BREEN et al., 2017). Foram encontrados homólogos em fungos, insetos e
vertebrados (VAN LOON et al., 1999).
Nas plantas, as proteínas PR-1 são produzidas em abundância durante a resposta de
defesa, chegando a constituir cerca de 2% das proteínas totais presentes em folhas de
tabaco infectadas com patógenos (ALEXANDER et al., 1993). A maioria das PR-1 é
secretada e se acumula no apoplasto (espaço extracelular) e nos vacúolos (TAIZ et al.,
2017), o que é facilitado pelo peptídeo N-terminal (BREEN et al., 2017).
As proteínas PR-1 não estão apenas associadas a respostas contra patógenos, pois
24
respondem também a estímulos abióticos, sugerindo papéis importantes nas respostas a
esse tipo de estresse (PINHEIRO et al., 1999; SNIDER et al. 2000; LIU et al. 2013;
KOTHARI et al. 2016). Além disso, foi demonstrado que essa família de proteínas se
acumula em folhas senescentes de plantas adultas e também em sépalas em
desenvolvimento (LOTAN, 1989) sugerindo também o seu envolvimento na floração e no
desenvolvimento das plantas. Contudo, essas funções permanecem desconhecidas (BREEN
et al., 2017).
A regulação positiva nas respostas de defesa sinalizadas pelo SA, o excesso de
proteínas PR-1 durante a infecção e sua localização apontam o papel dessas proteínas na
defesa do hospedeiro (LEAH et al. 1991; DURRAN et al., 2004). Proteínas PR-1 também
possuem capacidade antimicrobiana, inibindo crescimento de fungos e de oomicetos
(GAMIR et al, 2017). Todas as proteínas da família PR-1 são estruturalmente similares e
possuem quatro α-hélices e quatro folhas–β, arranjadas em paralelo (VAN LOON e
STRIEN, 1999). Apresentam domínio funcional SCP/ TAPS (Sperm-Coating Protein/Tpx-
1/Ag5/PR-1/Sc7) (CANTACESSI, 2009; TEIXEIRA, et.al, 2012) também descrito na
família das CAP proteínas (cysteine-rich secretory proteins (CRISP), antigen 5 (Ag5), and
pathogenesis-related protein 1 (PR-1) (SCHNEITER, 2013; CANTACESSI, 2009). As
proteínas da família CAP apresentam domínio comum de 150 aminoácidos formando uma
estrutura α-β-α exclusiva. A conservação do domínio CAP sugere que as proteínas dessa
família exerçam funções semelhantes. Porém, o modo de ação delas permaneceu por muito
tempo desconhecido (GIBBS, 2008; DARWICHE, et al, 2017). Os membros da família
CAP são majoritariamente proteínas secretadas estáveis em fluidos extracelulares
(CANTACESSI, 2012). Estudos realizados por Darwiche e colaboradores (2017)
demonstraram a capacidade das proteínas CAP de se ligarem a esteróis e ácidos graxos
possibilitando o transporte desses compostos e seu transporte para o meio extracelular.
Os esteróis compõem a classe de lipídios presentes nas membranas celulares de
todos os seres eucariotos sendo responsáveis por regular a permeabilidade e fluidez da
membrana (TANRET, 1889). As células animais apresentam colesterol na membrana
enquanto que as células vegetais apresentam fitoesteróis (MOREAU et al., 2018). A
molécula de esterol também compõe a membrana de muitos fungos patogênicos de plantas
sendo essencial para o crescimento desses microorganismos (KANZAN et al., 2017).
Especula-se que os patógenos auxotróficos de colesterol, como os oomicetos, adquiram
esteróis externamente das membranas do hospedeiro durante a patogênese (GAULIN et
al., 2010; GAMIR et al., 2017).
Nos últimos anos foi verificado que proteínas PR-1 apresentam capacidade de
25
ligação a esterol e que esta ligação acontece por aminoácidos hidrofóbicos presentes numa
região proteica chamada ‘Caveolin Binding Motif’ (CBM), (DARWICHE et al., 2017,
DARWICHE et al., 2018; GAMIR et al., 2017). O CBM é caracterizado pela presença de
aminoácidos aromáticos nas posições 1, 3 e 8 do motivo, sendo que a posição 3 seria
crucial para a ligação (DARWICHE et al., 2017; CHOUDHARY et al., 2014). As
proteínas que se ligam a esteróis apresentam CBM conservado e mutações pontuais nesse
motivo caracterizam a perda da função de ligação ao esterol (DARWICHE et al., 2017).
Sugere-se que a defesa contra patógenos desempenhada pelas proteínas PR-1
envolva o mecanismo de ligação e sequestro de moléculas de esteróis (SCHNEITER,
2013). Em busca dessa confirmação, alguns estudos têm sido realizados com proteínas PR-
1 de plantas e de outros organismos. As proteínas Pry1 e Pry2 da levedura Saccharomyces
cerevisiae, pertencentes à superfamília SCP/TAPS, apresentam capacidade de ligação ao
colesterol e a acetato de colesterol conhecidas. Mutações no CBM foram inseridas
alterando um aminoácido hidrofóbico localizado nessa região e se observou que a
função de ligação e exportação de esterol foram bloqueadas (SCHNEITER, 2013; GAMIR
et al., 2017; DARWICHE et al., 2017). Em seguida, foi verificado que a proteína humana
CRISP2 (também da superfamília SCP/TAPS) foi capaz de complementar essa atividade de
exportação de esterol, indicando que a função de ligação e exportação de lipídios das
proteínas Pry é conservada entre os membros desta superfamília (CHOUDHARY et al.,
2012). Além disso, dados indicam que as proteínas Pry apresentam atividade comparável à
de outras proteínas que se ligam a esterol e são capazes de se ligar ao eugenol (composto
antimicrobiano presente no óleo de cravo da Índia). Isso indica mais uma vez que essas
proteínas são possivelmente responsáveis pela ligação e exportação de esteróis, e pelo viés
antimicrobiano que essas funções têm (CHOUDHARY et al., 2012; DARWICHE et al.,
2017).
26
2.3.1 Proteínas do tipo PR-1 em Cacaueiro
A partir das evidências apontadas de que as proteínas PR-1 estão relacionados com
a resposta de defesa em plantas, Teixeira e colaboradores buscaram estes genes no genoma
do cacau utilizando a sequência de PR-1 do tomate cereja P14 (FERNÁNDEZ et al., 1997).
Os autores encontraram treze genes com significativa similaridade à sequência que foram
nomeados de TcPR-1a a TcPR-1m (TEIXEIRA et al., 2013). Análises proteicas
identificaram a existência de modelos de peptídeos sinal hidrofóbicos e domínios SCP /
TAPS completos nessas treze proteínas. Duas dessas proteínas, TcPR-1f e TcPR1-g, se
destacaram por apresentar mais de 580 aminoácidos e uma região altamente hidrofóbica
entre o domínio SCP/TAPS e um domínio quinase. Essa arquitetura proteica é
característica de receptores do tipo quinase (RLKs) (TEIXEIRA et al., 2013). Os RLKs são
um grupo de receptores transmembranares que percebem sinais extracelulares e
desencadeiam fosforilação como respostas intracelulares (WALKER, 1994) e que já foram
caracterizados como maquinaria de defesa contra patógenos (GREEFF et al., 2012).
Figura 1: Organização e domínios das proteínas PR-1RK de T. cacao (Tc). O peptideo
sinal é indicado na extrema esquerda da figura, seguido do domínio SCP/TAPS;
seguido da porção transmembranar hidrofóbica e domínio serina/ treonina quinase a
direita. Os números em romano indicam as regiões do domínio quinase envolvidas em
atividade fosforilativa. (TEIXEIRA et al., 2013).
Os RLKs estão envolvidos em processos de desenvolvimento (JINN et al., 2000),
reprodução (ESCOBAR-RESTREPO et al., 2007) ou na imunidade vegetal (JONES et
al.,2006). Quando envolvidos na imunidade do organismo vegetal, são chamados de
27
receptores de reconhecimento de padrões (PRRS) e detectam padrões de moléculas
associados a patógenos (PAMPs) iniciando um conjunto de respostas de defesa que
incluem produção de espécies reativas de oxigênio, expressão de genes de defesa,
deposição calosa (JONES et al., 2006; GREEFF et al., 2012; ZIPFEL, 2014). Estudos
demonstraram que a perda da função de RLKs aumenta a suscetibilidade a patógenos
(ZIPFEL et al., 2004).
Baseado em dados de RNAseq da interação do fungo M. perniciosa e T. cacao
foram detectados quatro genes PR-1 (TcPR-1c, d, g e l) expressos durante a infecção.
Todos os outros nove genes não tiveram expressão detectada nesta etapa. Em seguida,
foram avaliados os dados de RNAseq de cinco réplicas biológicas de M. perniciosa e cinco
réplicas de amostras controles (não infectadas), sendo que o TcPR-1f não teve sua
expressão significativamente alterada durante a infecção por M. perniciosa e o gene TcPR-
1g foi mais expresso em vassoura-de-bruxa do que em plantas não infectadas (TEIXEIRA
et al., 2013). TcPR-1g foi induzido durante a doença, no estágio onde o fenótipo das
plantas de cacaueiro é fortemente afetado e onde o fungo está em sua etapa biotrófica
(MEINHARDT et al., 2008). Este dado indica que esse gene possa exercer um papel na
defesa do cacaueiro contra M. perniciosa. Porém vale ressaltar que não houve eliminação
da doença, o que indica que apesar de TcPR-1g ser expresso, essa expressão não foi
determinante na eliminação do patógeno (FORTI, 2018).
Em 2018, Forti (2018) realizou os primeiros experimentos de transformação
genética de tomateiro Micro-Tom com os genes TcPR-1f e TcPR-1g. Dezoito
experimentos de transformação genética de tomateiro foram realizados e somente um
obteve evento transgênico correspondente a cada gene. Para caracterizar os transgênicos
obtidos, estes foram inoculados com patógenos M. perniciosa (Figura 2) e
Phytophthora parasitica (Figura 3) para avaliação dos perfis de dano causado e de
resistência para o melhor entendimento das proteínas PR-1RK.
28
Figura 2: Diâmetro médio do caule (mm) no controle e linhas transgênicas inoculado
com o fungo M. perniciosa, 35 dias após a inoculação. Colunas seguidas da
mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Figura 3: Área média da lesão (cm²) no controle e linhas transgênicas inoculados com
P. parasitica, 4 dias após a inoculação. Colunas seguidas da mesma letra não diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Foi observado que TcPR1-f apresentou um aumento de tolerância à infecção de M.
perniciosa (aumento do diâmetro do caule é um indicativo de infecção; Figura 2) e do
oomiceto P. parasitica (Figura 3). Tais resultados permitem inferir a capacidade deste gene
de inibir oomiceto e fungo hemibiotrófico indicando sua propriedade como possível gene
relacionado à resistência contra esses patógenos.
Os dados para TcPR-1g foram estastiticamene iguais ao controle não transgênico.
No entanto, os dados brutos indicam um pouco mais de severidade nas doenças no
transgênico. S endo assim, os dados obtidos não foram plenamente conclusivos para
esse gene. Apesar disso, acredita-se que TcPR-1g pode ser um gene que não atue
conferindo tolerância a patógenos mas talvez sim como um gene que afete o
29
desenvolvimento da planta (FORTI, 2018). Forti indica que são necessários mais estudos
desses genes in vitro e in vivo para correlacionar os resultados obtidos, mas que se pode
inferir que pelo menos uma conformação PR-1-RK de cacaueiro, confere tolerância na
interação com patógenos.
Em paralelo, foi avaliado se os domínios quinases das proteínas PR-1RK teriam
capacidade fosforilativa, o que foi confirmado através de experimentos de espectrometira
de massas (TOSARINI, 2018, dados não mostrados). Além disso, experimentos de
complementação de levedura evidenciaram que os domínios extracelulares de TcPR-1f e
TcPR-1g se ligam a colesterol (DARWICHE, 2018, comunicação pessoal). Esses dados
evidenciam que essas proteínas são funcionais, exercendo tanto a atividade PR-1 like de
ligação a esterol quanto a de quinase se autofosforilando.
2.4 Transformação genética
A biotecnologia é utilizada como ferramenta para viabilizar e acelerar programas de
melhoramento de plantas. Envolve técnicas como a cultura de tecidos, clonagem gênica,
uso de marcadores moleculares e transformação genética (SHARMA et al., 2009). A
transformação genética consiste na introdução controlada de um ou mais genes no genoma
de outro organismo e sua posterior expressão possibilitando a obtenção de organismos
geneticamente modificados (OGM). Assim, é possível gerar plantas transgênicas com
caracterísitcas de interesse agronômico, tais como maior produtividade, redução do uso de
agrotóxicos, resistência contra patógenos e melhor qualidade nutricional do fruto
(GAMBINO et al., 2012; SARTORETTO et al., 2008). Plantas transgênicas também são
geradas com o intuito de estudar a função e expressão gênica e o desenvolvimento vegetal
(HANSEN et al., 1999).
Os métodos de transformação genética são dependentes das técnicas de cultura de
tecidos in vitro, uma vez que após a inserção e expressão do transgene em uma célula
vegetal é necessário o adequado manuseio desta célula para que ela se torne competente e
possa se diferenciar e multiplicar dando origem a um indivíduo completo (regeneração in
vitro). A expressão da totipotência da célula vegetal é influenciada por vários fatores tais
como: o genótipo da planta matriz, o estado fisiológico, sanitário e nutricional da planta
matriz, o tipo de explante inicial, os componentes nutricionais e os reguladores de
crescimento adicionados ao meio de cultura, as condições micro e macroambientais
durante a incubação (GAMBINO et al., 2012; GIRI et al., 2004). Assim é necessário o
estabelecimento de um protocolo específico e eficiente de regeneração in vitro para um
30
determinado genótipo antes da escolha e aplicação de um método de transformação
genética. O sucesso da transformação genética é medido pela taxa de transformação que
relaciona a quantidade de eventos transgênicos obtidos com o número de explantes
inoculados. Vários fatores podem afetar a eficiência de transformação dentre eles a cepa de
Agrobacterium, a complexidade da construção genética, os genes marcadores de seleção in
vitro e genes repórter utilizados, antibióticos utilizados no meio seletivo, componentes
nutricionais do meio de cultura e tipo de explante (CHETTY et al., 2013)
Os métodos de transformação genética são divididas em duas categorias: o indireto
que utiliza vetor biológico intermediário (bactéria Agrobacterium tumefaciens e A.
rhizogenes) e o direto que dispensa vetor biológico intermediário (ANDRADE, 2003).
Estes últimos são métodos químicos (PEG e PVA) e físicos (Biobalística e Eletroporação)
para a introdução do DNA no interior de uma célula competente (embriões
zigóticos/meristemas) pela quebra da barreira da parede celular e membrana plasmática.
A transferência de DNA pelo método indireto é um dos mais utilizaados na
obtenção de plantas transgênicas dicotiledôneas (CANHOTO, 2010) . A Agrobacterium
tumefaciens é uma bactéria gram-negativa que possui um plasmídeo (DNA
extracromossomal) denominado pTi (indutor de tumor) que apresenta a habilidade de
transferir uma parte de seu DNA para a célula vegetal. Esse DNA é chamado de T-DNA e
contém genes envolvidos na produção de opinas e de reguladores de crescimento vegetais
(LACROIX et al., 2013a). Em condições naturais, quando o T-DNA é transferido para a
célula vegetal, ele é integrado no genoma da planta e passa a ser expresso de forma
estável. Este processo ocasiona a multiplicação celular formando um aglomerado de
células denominado de tumores ou calos (LACROIX et al., 2013b), sintoma este
característico da infecção pela bactéria (doença coroa-de-galha).
2.5 O tomateiro Micro-Tom como planta modelo
As plantas modelo são comumente utilizadas em estudos genéticos e de fisiologia
vegetal visto que auxiliam na compreensão do desenvolvimento das plantas, função gênica,
processos biológicos, determinação do perfil de sinalização, perfil de metabólitos
secundários e investigação no padrão de defesa (RICROCH, et al., 2014; VAN NORMAN
et al., 2009). A versatilidade perante aspectos celulares e em experimentos de cultura de
tecidos também são características importantes das plantas modelo (GANAPATHI, et al.,
2004).
O uso de plantas modelos, como Arabidopsis thaliana e Nicotiana tabacum, foi
31
estabelecido inicialmente devido à necessidade de padronização de experimentos e para o
ensino das ferramentas de biologia molecular (KOORNNEEF et al., 2010). As suas
utilizações como plantas modelos perduraram na pesquisa devido ao ciclo de vida curto,
porte pequeno, grande número de descendentes e genoma sequenciado disponível
(KOORNNEEF et al., 2010; XIONG et al., 1999; VAECK et al. 1987).
O tomateiro é uma cultura economicamente importante. Teve seu genoma
sequenciado em 2012 pelo grupo “The Tomato Genome Consortium”. O tomateiro cv.
Micro Tom (Solanum lycopersicum MT) é diplóide, apresenta ciclo de vida curto levando
cerca de 100 dias após transformação genética de cotilédones para a colheita de frutos
transgênicos, permitindo a triagem de até quatro gerações por ano (QIU et al., 2007;
PINO et al., 2010). Apresentando o desenvolvimento de fruto como característica mais
notável, o tomateiro abre espaço para discussões e pesquisas relacionadas a frutos,
amadurecimento, sinalização e perfil de metabólitos secundários (SHIKATA et al., 2016).
O tomateiro Micro-Tom é utilizado como modelo visando compreender a função de genes
de interesse agronômico (VAN ECK et al., 2019) e também no estudo da interação com o
fungo Moniliophtora perniciosa (MARELLI, 2009). Esse fungo possui dois biótipos, C e
S, sendo que o primeiro infecta o cacaueiro e o segundo solanáceas como o tomateiro.
Devido à dificuldade da manipulação genética do cacaueiro (tempo de regeneração,
dificuldade de transformação) para comprovar a função de genes de resistência ou
suscetibilidade do cacaueiro, utiliza-se o Micro-Tom como planta modelo de análise
funcional. Os estudos e pesquisas realizados com plantas modelo geralmente apresentam
correlação positiva entre os resultados obtidos e à espécie alvo, porém, vale ressaltar que
esses estudos podem não garantir o bom desempenho do transgene na espécie alvo
(XIONG et al., 1999).
2.6 Mutagênese sítio dirigida
A técnica de mutagênese sítio dirigida baseada em oligonucleotídeos tornou-se uma
ferramenta fundamental da biologia molecular moderna. É utilizada para estudos de
estrutura e função gênica, já que permite a realização de deleções, inserções ou
substituições de base ao longo da sequência (BARIK,1996; SHENOY, 2003; LI, 2002). Os
ensaios se baseiam na propriedade de hibridização de moléculas de DNA por similaridade
no pareamento de bases que permite que pequenas diferenças na complementaridade do
molde possam ser sintetizadas (WATSON, 2006).
O método de mutagênese sítio dirigida utilizando PCR de duas etapas, anelamento
32
e extensão, permite a obtenção de DNA mutante em curto período partindo-se do desenho
de primers com 25-45 pb contendo as modificações que se deseja incorporar ao gene
alvo (WANG, 1999; LIU, 2008).
O produto da amplificação apresentará a troca de bases desejada, entretanto, o
DNA utilizado como molde permanece com a sequência original, que não contém a
mutagênese. Como o DNA molde é metilado nos organismos e a cadeia mutante não, a
realização do tratamento com endonuclease que cliva os sítios metilados favorece a seleção
do produto mutante da amplificação para clonagem em vetor (Figura 4) (LI et al, 1997;
LIU, 2008).
Figura 4: Esquema de reação para obtenção da troca de bases via mutagênese sítio dirigida
por PCR. Adaptado de ZHENG et al., 2004.
2.7 Propriedades dos aminonácidos Ala, Leu e Asp
Os aminoácidos são moléculas orgânicas que constituem a base elementar dos
peptídeos e proteínas. Estes formam cadeias e estruturalmente apresentam um grupo
funcional ácido carboxílico (-COOH) um grupo amino (-NH2), um átomo de hidrogênio (-
H) e uma cadeia lateral variável (R) (BARRET et al., 2004). Devido à cadeia lateral
variável, os aminoácidos apresentam diferentes tamanhos, carga elétrica e solubilidade em
água (BARRET et al., 2004) A estrutura comum a todos os aminoácidos pode ser
observada na figura 5. A síntese dessas moléculas é controlada por replicação do DNA e
transcrição do RNA (NELSON et al., 2002).
33
Figura 5: Estrutura geral de um aminoácido. Cada aminoácido apresenta um carbono
central (C), um grupo funcional ácido carboxílico (COO-), um grupo amino (-NH2),
um hidrogênio (-H) e cadeira lateral variável (R). Adaptado de NELSON et al., 2002.
Os 20 aminoácidos existentes apresentam um grupo carboxila e um grupo amino
ligados ao mesmo átomo de carbono e diferem entre si apenas pela estrutura da cadeia
lateral. Estes aminoácidos se unem em combinações diversas formando proteínas com
diferentes tamanhos e estruturas. Esta união é do tipo covalente e ocorre entre um grupo
amina de um aminoácido e o grupo carboxila de outro formando as cadeias polipeptídicas
(NELSON et al., 2002). Aos aminoácidos foram atribuidas abreviações de três letras e
símbolos de uma letra como nomenclatura (LEHNINGER, 1976).
De acordo com a composição da cadeia lateral e sua polaridade, os aminoácidos são
agrupados em quatro grupos: aminoácidos com grupamento R apolar ou hidrofóbicos
(grupo 1), aminoácidos com grupamento R polar não carregado (grupo 2), aminoácidos
com grupamento R polar carregado positivamente (grupo 3) e aminoácidos com
grupamento R polar carregado negativamente (grupo 4) (NELSON et al., 2002; WU,
2013). Os aminoácidos Leucina (Leu) e Alanina (Ala) pertencem ao grupo 1, ou seja, não
interagem com a água. Também apresentam localização mais interna na molécula proteíca,
pois as cadeias laterais tendem a se agrupar no interior das proteínas estabilizando a
estrutura por interações hidrofóbicas. Já o Ácido Aspártico (Asp) pertence ao grupo 4 e
apresenta capacidade de interagir com água localizando-se na superfície da molécula
(MARZZOCO & TORRES, 1999). As estruturas desses aminoácidos podem ser
observadas na figura 6.
34
Figura 6: Estrutura dos aminoácidos Alanina, Leucina e Ácido Aspártico. As fórmulas
estruturais mostram o estado das moléculas em pH neutro. A parte sombreada destaca
a cadeia lateal variável (R) de cada um destes aminoácidos. Adaptado de NELSON et
al., 2002.
OBJETIVOS
- Obtenção de mutantes dos genes PR-1RK através de mutagênese sítio dirigida;
-Verificação da alteração das taxas de transformação e regeneração in vitro dos
mutantes obtidos de perda de função.
35
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Caracterização Molecular do
Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), Piracicaba, SP e Laboratório de Melhoramento de
Plantas do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP), Piracicaba, SP.
3.1 Desenho dos iniciadores para mutagênese sítio dirigida dos genes TcPR-1f e TcPr-
1g
Foram utilizadas as sequências dos genes TcPR-1f e TcPR-1g obtidas através de
biblioteca de RNAseq (TEIXEIRA et al., 2013) como base para o desenho dos iniciadores.
Para cada mutagênese em estudo foram desenhados e sintetizados pares de primers com até
49 bases de oligonucleotídeos auto-complementares contendo a troca de bases desejada no
meio do iniciador. Estes continham cerca de 40% de bases CG, Tm de 75°C e a sequência
reversa oposta complementar descrita na tabela 2. As regiões apresentadas em cinza nas
sequências da tabela representam os códons nos quais foram induzidas as mutações.
Tabela 2: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para mutagênese sítio dirigida dos
genes alvo TcPR-1f e TcPR-1g em seus domínios SCP e Quinase. As regiões em cinza
representam os códons no quais foram induzidas as mutações. (Continua)
Gene
alvo_Domínio
Sequência 5’ – 3’ Orienta-
ção
Nomencla-
tura
TcPR1-f_ SCP CGATGAGAAAACCGATTATGACGACA
AATCTAATACCTGTGCTTCAGGC
Forward TcPR1-
F_L155D_F
TcPR1-f_ SCP
GCCTGAAGCACAGGTATTAGATTTGT
CGTCATAATCGGTTTTCTCATCG
Reverse
TcPR1-
F_L155D_R
TcPR1-f_ Quinase
1
GAGTTGGATACCTATGTTGCTGTTGCG
AGGGTTTCAAAGGCCTCTAAGC
Forward
TcPR1-
F_K337A_F
TcPR1-f_ Quinase
1
GCTTAGAGGCCTTTGAAACCCTCGCA
ACAGCAACATAGGTATCCAACTC
Reverse
TcPR1-
F_K337A_R
TcPR1-f_ Quinase
2
GTGTGCTACACAGGGATATAGCTACT
AGCAACGTTATGTTAGATTC
Forward TcPR1-
F_K434A_F
36
Tabela 2: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para mutagênese sítio dirigida dos genes alvo TcPR-1f e TcPR-1g em seus domínios SCP e Quinase. As regiões em cinza representam os códons no quais foram induzidas as mutações
(Continuação).
TcPR1-f_ Quinase
2
GAATCTAACATAACGTTGCTAGTAGC
TATATCCCTGTGTAGCACAC
Reverse TcPR1-
F_K434A_R
TcPR1-g_ SCP
GAGGAGAAGGCGGATTATGACGACGA
ATCTGGTGTTTGTGCTACAGG
Forward
TcPR1-
G_L107D_F
TcPR1-g_ SCP CCTGTAGCACAAACACCAGATTCGTC
GTCATAATCCGCCTTCTCCTC
Reverse TcPR1-
G_L107D_R
TcPR1-g_
Quinase 1
CGGATACCTACATCGCTGTTGCTAAG
GTTTCAAGGGCATCTAAGC
Forward TcPR1-
G_K298A_F
TcPR1-g_
Quinase 1
GCTTAGATGCCCTTGAAACCTTAGCAACA
GCGATGTAGGTATCCG
Reverse
TcPR1-
G_K298A_R
TcPR1-g_
Quinase 2
CATTGTGTGCTACACAGGGACATCGC
TACTAGCAACATCATGTTGGATTC
Forward TcPR1-
G_K395A_F
TcPR1-g_
Quinase 2
GAATCCAACATGATGTTGCTAGTAGC
GATGTCCCTGTGTAGCACACAATG
Reverse TcPR1-
G_K395A_R
A figura 7 exemplifica a dinâmica. No exemplo, observa-se a sequência nativa do
gene TcPR-1f utilizada como molde para a reação, tendo na posição 155 o códon TTG
(Leucina) que foi substituído, na mesma posição, pelo códon GAC (Ácido Aspártico).
Figura 7: Representação da sequência nativa do gene TcPR-1f e a substituição de códons
realizada na posição 155, via mutagênese sítio - dirigida para obtenção do vetor
mutado, denominado TcPR-1fL155D.
37
As demais reações de mutagênese sítio-dirigida obtidas seguem o mesmo racional
da representação acima.
3.2 Reação de mutagênese sítio dirigida e transformação de células eletrocompetentes
de Escherichia coli
A técnica de PCR 2 steps com enzima de alta fidelidade foi utilizada para a troca de
códon na sequência dos genes TcPR-1f e TcPR-1g clonados no vetor pRT104. A reação foi
realizada no equipamento Veriti (Applied Biosystems) utilizando 10 µL de tampão 5X
Phusion HF, 1 µL de dNTPs (10 mM), 2,5 µL de primer forward e 2,5 µL de primer
reverse (10 µM), 1 µL de DNA molde (25 ng µL-1), 0,5 µL Phusion DNA polimerase
(New England Biolabs) e água MiliQ estéril para completar 50 µL de reação. As
condições da reação foram 98°C por 30 segundos; 35 ciclos de 98°C por 10 segundos,
72°C por 30 segundos e 72°C por 10 minutos, finalizando a 10°C. Após a PCR, as
amostras foram tratadas com 10 U da endonucelase DpnI (Thermo Scientific) que
degradou o DNA plasmidial metilado. A incubação aconteceu a 37°C por 3 horas e 80°C
por 20 minutos para inativação da enzima no equipamento Veriti (Applied Biosystems). As
reações aconteceram conforme o esquema da figura 8.
Figura 8: Esquema da dinâmica de reação de mutagênese dirigida via PCR ao longo
dos ciclos de amplificação na reação de PCR, exemplificando que o DNA utilizado
como molde permanece com a sequência original e que o produto da amplificação
apresentará a troca de bases desejada (adaptado de SHENOY, 2003).
38
Em seguida, foi realizada diálise de 20 minutos em membrana 0.05 µm VMWP
(Merck Millipore - Lot#R5CA7340) de todo produto tratado com endonuclease para
transformação em células competentes One Shot TOP10 Electrocomp E. coli (Invitrogen -
Lot#1637949). Foi adicionado 10 ng de DNA em cada tubo eppendorf de células
competentes, cepa DH5α (descongelada em gelo) e, em outro tubo, 10 pg de pUC19 como
controle positivo. Todo volume de células foi transferido para as cubetas de eletroporação
Gene Pulser/MicroPulser 0.2 cm gap (Bio Rad), previamente resfriadas em gelo. Os
parâmetros de tensão, capacitância, resistência aplicados foram ajustados para 2500 V, 25
µF e 200 Ω, respectivamente e pulsos foram aplicados no equipamento Gene Pulser Xcell
(Bio Rad). Imediamamente após o pulso, foi adicionado 1 mL de meio SOC (2 % triptona;
0,5 % extrato de levedura; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4
filtro-esterilizados; 20 mM glicose filtro esterilizada; pH 7,0). Em seguida, todo volume da
eletroporação foi transferido para um tubo estéril de 15 mL e incubado à 37°C por 1 hora,
sob agitação de 200 rpm em agitador orbital. Em seguida, foi plaqueado todo volume das
células em meio sólido LB (Sigma) contendo ampicilina (100 mg L-1) e as placas foram
incubadas em estufa a 37ºC durante 16 horas para o crescimento de colônias.
3.3 Confirmação da mutagênese sítio dirigida
Todas as colônias obtidas via transformação foram selecionadas e passaram por
extração de DNA plasmidial utilizando o Kit QIAprep Spin MiniPrep (QIAGEN),
quantifidas via Nanodrop (Thermo Scientific ) e foram enviadas para facility de
sequenciamento do Laboratório de Melhoramento de Plantas do Centro de Energia Nuclear
na Agricultura (CENA/USP), para sequenciamento, utilizando o conjunto de primers
descrito na tabela 3.
O sequenciamento foi realizado no equipamento 3500 Genetic Analyzer da Applied
Biosystems com a reação de PCR BigDye v3.1 utilizando: 1 uL de Tampão 5X, 1 µL de
BigDye v3.1, 1 µL do primer específico (5 µM), 500 ng de DNA plasmidial e água para
completar o volume de 10 µL. A ciclagem foi de 95°C por 1 minuto; 35 ciclos de 95°C por
15 segundos, 50°C por 15 segundos e 60°C por 2 minutos, finalizando a 10°C.
Posteriormente as amostras foram precipitadas com EDTA/Acetato de Sódio (1V de
EDTA 0,5 M pH 8,0 + 1V de Acetato de Sódio 3 M pH 9,0) e lavadas com Etanol 100 % e
70 % sucessivamente. Na última etapa, foram adicionados 10 µl de formamida para
incubação a 95°C por 5 minutos em termociclador, e aplicado choque térmico em gelo para
39
provocar a desnaturação das moléculas de DNA a serem sequenciadas.
Os dados de sequenciamento foram analisados alinhando os reads produzidos
contra a sequência de referência utilizando o software CLC Main Workbench (QIAGEN).
O gene TcPR-1f que continha as mutações sítio-dirigidas corretas foram denominados
TcPR-1fL155D, TcPR-1fK337A e TcPR-1fK434A correspondendo ao domínio SCP, Quinase1
(Kn1) e Quinase2 (Kn2), respectivamente. O gene TcPR-1g que apresentou as mutações
sítio-dirigidas esperadas, foram denominados TcPR-1gL107D, TcPR-1gK298A e TcPR-1gK395A
correspondente ao domínio SCP, Quinase1 (Kn1) e Quinase2 (Kn2), respectivamente.
Tabela 3: Iniciadores Forward e Reverse utilizados no sequenciamento das mutagêneses
sítio dirigidas dos genes TcPR-1f e TcPR-1g em seus respectivos domínios. SCP: domínio
SCP/TAPS. Kn: Domínio Quinase.
Gene
alvo_Domínio
Sequência 5’ – 3’ Orientação Nomenclatura
TcPR1-f_SCP ATGGAAATGGAGTTAAGAAATATTTC Forward PCR8/GW/TOPO
TcPR1-F
TcPR1-f_SCP CCAAACCCTCCCTCTCC Reverse TcPR1-f B2
TcPR1-f_Kn 1 GTGCTTCAGGCCATACGTG Forward TcPR1-f A1
TcPR1-f_Kn 1 CCATGATCGACTAACCTAGC Reverse TcPR1-f C2
TcPR1-f_Kn 2 GGAGAGGGAGGGTTTGG Forward TcPR1-f B1
TcPR1-g
_SCP
ATGAAGTTGTTCGAGATTTCATC Forward PCR8/GW/TOPO
TcPR1-G
TcPR1-g
_SCP
CCAAACCCTCCCTCTCC Reverse TcPR1-f B2
TcPR1-g_Kn
1
GGATTGAATCTGTTATTGGAGTAG Forward TcPR1-g D1
TcPR1-g_Kn1 CTAGCCTAGCTAACCCGAAG Reverse TcPR1-g F2
TcPR1-g_Kn2 GGATTCGGATACCTACATCG Forward TcPR1-g E1
40
3.4 Clonagem via enzima de restrição em vetor de pCAMBIA2201
Os cassetes de expressão dos genes TcPR-1fL155D, TcPR-1fK337A,TcPR-1fK434A,
TcPR-1gL107D, TcPR-1gK298A e TcPR-1gK395A com promotor CaMV35S e terminador foram
subclonados de pRT104 no vetor pCAMBIA2201 usando a enzima de restrição PstI. Para
isso, foi utilizado 1 μg de DNA plasmidial (vetor doador e receptor), 1 U de enzima de
restrição nas reações de restrição contendo o tampão da enzima na concentração de 1x. As
digestões foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TBE 1X
(Tris-HCl 0,1 M, EDTA 0,5 M e Ácido Bórico 1 M) e visualizadas por ultravioleta através
do fotodocumentador E-box CX5 (Vilber). Os fragmentos correspondentes ao tamanho
esperado (aproximadamente 1800 pb) foram recortados do gel e purificados utilizando kit
Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up (Promega). A ligação dos elementos foi realizada por
reação contendo a enzima T4 DNA ligase (Invitrogen) utilizando duas proporções de
vetor/inserto (1:4 e 1:8), de acordo com o manual do fabricante.
A orientação do inserto foi confirmada através da digestão enzimática utilizando as
enzimas EcoRV, NcoI e PvuII para o vetor do gene TcPR-1f e EcoRV, NcoI e SphI para o
vetor do TcPR-1g. As digestões foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1%
em tampão TBE 1X. O vetor final continha o cassete do gene de interesse, o cassete de
seleção com o gene nptII controlado pelo promotor CaMV35S e o gene repórter GUS
(uidA) controlado pelo mesmo promotor.
As colônias foram crescidas em placas em meio sólido LB (Sigma) contendo 25 mg
L-1 de Cloranfenicol. As amostras tiveram o DNA plasmidial extraído utilizando o Kit
QIAprep Spin MiniPrep (QIAGEN) e quantificados via aparelho Nanodrop (Thermo). Em
seguida foi realizado o sequenciamento dos genes de interesse usando os iniciadores da
tabela 4.
41
Tabela 4: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para sequenciamento completo dos
genes TcPR-1f e TcPR-1g.
Nomenclatura Sequência 5’ – 3’ Orientação
PCR8/GW/TOPO
TcPR1-F
ATGGAAATGGAGTTAAGAAATATTTC Forward
PCR8/GW/TOPO
TcPR1-G
ATGAAGTTGTTCGAGATTTCATC
Forward
TcPR1-f A1 GTGCTTCAGGCCATACGTG Forward
TcPR1-f A2 CACGTATGGCCTGAAGCAC Reverse
TcPR1-f B1 GGAGAGGGAGGGTTTGG Forward
TcPR1-f B2 CCAAACCCTCCCTCTCC Reverse
TcPR1-f C1 GCTAGGTTAGTCGATCATGG Forward
TcPR1-g D1 GGATTGAATCTGTTATTGGAGTAG Forward
TcPR1-g D2 CTACTCCAATAACAGATTCAATCC Reverse
TcPR1-g E1 GGATTCGGATACCTACATCG Forward
TcPR1-g F1 CTTCGGGTTAGCTAGGCTAG Forward
P-35S GCACAATCCCACTATCCTTC Forward
O sequenciamento foi realizado no equipamento 3500 Genetic Analyzer da Applied
Biosystems com a reação de PCR BigDye v3.1 conforme descrito anteriormente.
3.5 Introdução das construções em Agrobacterium tumefaciens
As construções contendo os genes de interesse validadas em E. coli foram
transformadas por eletroporação na cepa GV3101 de A. tumefaciens visando a posterior
transformação genética dos tomateiros MT. Em um tubo contendo 40 µL de células
eletrocompetentes, foram adicionados 100 ng de plasmídeo contendo as construções e, em
seguida, transferidos para cubetas de eletroporação Gene Pulser/MicroPulser 0.2 cm gap
(Bio Rad), previamente resfriadas em gelo. A eletroporação foi realizada no equipamento
Gene Pulser Xcell (Bio Rad) ajustado com os parâmetros 1800 V (tensão), 25 µF
(capacitância) e 400 Ω (resistência). Imediatamente após o pulso, 1 mL de meio SOC
(Thermo Cat# 15544034) foi adicionado na cubeta. Todo volume da eletroporação foi
transferido para um tubo estéril de 15 mL e incubado à 28°C por 2 horas, sob agitação de
120 rpm. Foi retirado um volume de 50 µL do inóculo e plaqueado em meio LB (Sigma)
sólido contendo rifampicina (50 mg L-1) e cloranfenicol (25 mg L- 1). As placas foram
incubadas durante dois dias a 28 ºC. Após esse período, quatro colônias isoladas de cada
42
construção foram selecionadas e crescidas em 20 mL de meio LB líquido com os
mesmos antibióticos por 40 horas na velocidade de 180 rpm a 28ºC. Para confirmar a
presença dos genes de interesse nas colônias selecionadas foi realizada extração de DNA
plasmidial e reação de digestão com as enzimas EcoRV, NcoI e PvuII para o vetor dos
genes TcPR-1fL155D, TcPR- 1fK337A,TcPR-1fK434A e EcoRV, NcoI e SphI para o vetor dos
genes TcPR-1gL107D, TcPR- 1gK298A e TcPR-1gK395A. Os produtos das reações de digestão
foram separados por eletroforese em gel de 1% agarose e tampão TBE 1X.
3.6 Transformação genética de tomateiro Micro-Tom
A metodologia utilizada para os experimentos de transformação genética via A.
tumefaciens em tomateiro foi realizada de acordo com Pino et al. (2010) utilizando a cepa
GV3101 contendo os vetores apresentados na figura 9 . O vetor original pCAMBIA 2201
sem os genes alvo (vetor vazio), também foi submetido a experimentos de transformação
genética como controle.
Figura 9: Esquema das construções preparadas para os estudos funcionais in vitro. A)
Gene TcPR-1fL155D contendo a troca do aminoácido Leucina para Ácido aspártico no
domínio SCP. B) Gene TcPR-1gL107D contendo a troca do aminoácido Leucina para
Ácido aspártico no domínio SCP. C) Gene TcPR-1f com todos os domínios íntegros,
sem troca de aminoácidos (Controle selvagem). D) Gene TcPR-1g com todos os
domínios íntegros, sem troca de aminoácidos (Controle selvagem). E) Controle
pCAMBIA2201 (vetor vazio) sem os genes alvo.
43
As sementes de tomateiro do tipo Micro-Tom (Solanum lycopersicum cv. Micro
Tom) utilizadas para obtenção de explantes foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de
Melhoramento de Plantas (CENA/USP) supervisionado pelo Prof. Dr. Antonio Vargas de
Oliveira Figueira.
3.6.1 Condições de cultura de A. tumefaciens
Colônias de A. tumefaciens, contendo as construções (Figura 6) foram crescidas
por 48 horas em placas de Petri contendo meio LB sólido acrescido de cloranfenicol (25
mg.L-1) e rifampicina (50 mg.L-1). Uma única colônia foi inoculada em Erlenmeyer estéril
contendo 50 mL de meio LB líquido suplementado com os mesmos antibióticos e
crescidas sob agitação de 120 rpm, a 28ºC e por 16 horas. Após esse período, a suspensão
foi colocada em tubo estéril de centrífuga e sedimentada por centrifugação a 1.900 rpm, a
20ºC por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e a Agrobacterium
ressuspendida em meio MS líquido (Phytotech), suplementado com sacarose (30 g.L-1). A
OD600nm foi ajustada para 0,2-0,3 e então foram adicionados 100 μM de acetoseringona,
dez minutos antes do co-cultivo com os explantes de tomateiro.
3.6.2 Inoculação e co-cultura
As sementes de tomateiro MT foram desinfestadas em hipoclorito de sódio
comercial a 20% (v/v) com duas gotas de detergente comercial, durante 20 minutos. Em
seguida, as sementes foram enxaguadas em água ultrapura estéril por três vezes e
acomodadas (dez sementes por frasco) em meio de germinação constituído de meiosólido
MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) meia força (metade da concentração de sais),
Vitamina B5 (GAMBORG, 1968); sacarose (15 g.L-1), Ágar e pH 5,8.
Os frascos contendo as sementes foram armazenados no escuro por quatro dias a
25°C, e, posteriormente, transferidos para sala de luz sob fotoperíodo controlado de 16 h
luz/8h escuro por mais quatro dias a 25°C. Oito dias após a germinação, os explantes
cotiledonares foram utilizados nos experimentos de transformação genética.
Explantes de proximadamente 6 mm (folhas cotiledonares com as extremidades
retiradas foram posicionados com a face abaxial em contato com o meio MS suplementado
com vitamina B5, sacarose (30 g.L-1); 0,4 μM de ANA e 100 μM de acetoseringona e Ágar.
Cada experimento de transformação foi constituído por 20 placas contendo 20 explantes
cada totalizando 400 explantes que foram expostos a cada construção genética. O controle
positivo foi composto por 3 placas contendo o mesmo meio de cultura com ausência de
44
antibióticos e acetoseringona e 20 explantes por placa totalizando 60 explantes que não
entraram em contato com a solução de Agrobacterium. O controle negativo foi composto
por 3 placas em meio de cultura com os antibióticos correspondentes e acetoseringona
contendo 20 explantes cada, totalizando 60 explantes que não entraram em contato com a
solução de Agrobacterium.
Com o auxílio de uma pipeta Pasteur descartável, uma gota da suspensão
bacteriana (OD 0,2-0,3) correspondente foi depositada sobre cada segmento cotiledonar.
Após 10 minutos de contato, a suspensão foi removida com auxílio da pipeta, seguida da
absorção com de papel filtro sobre os explantes para retirada do excesso de Agrobacterium.
Essas placas contendo o meio de co-cultivo (acima descrito) com os explantes foram
transferidos para incubadora BOD sob escuro total e a 25ºC por 2 dias.
3.6.3 Regeneração de plântulas de tomateiro
Após o período de co-cultivo de 2 dias, os explantes foram transferidos para meio
de regeneração composto por meio MS acrescido de vitaminas B5; sacarose (30 g L-1); 5
μM de BAP e antibióticos (Timentim 300 mg L-1, para controle da Agrobacterium, e
Canamicina 100 mg L-1, para seleção das plantas). O material foi mantido em sala com
fotoperíodo controlado de 16 h luz/8h escuro a 25ºC e transferido para o mesmo meio
fresco a cada duas semanas.
Para o enraizamento, os brotos que atingiram um tamanho de aproximadamente 5
cm foram transferidos isoladamente para frascos contendo meio MS acrescido de
Timentim 300 mg L-1 e Canamicina 100 mg L-1. O material foi mantido em sala de luz sob
fotoperíodo controlado de 16 h luz/8h escuro por 3 semanas. Após esse período, as
plântulas foram transferidas para o mesmo meio fresco e assim mantidas in vitro por 5
meses até que formassem raízes.
3.6.4 Confirmação das plantas transformadas
Para a confirmação da transgenia, folhas dos brotos regenerados in vitro foram
coletadas uma folha dos brotos para extração de DNA e confirmação da inserção do T-
DNA por PCR. O DNA do tecido foliar foi extraído com Kit NucleoSpin® Plant II
(Macherey- Nagel) de acordo com as instruções do fabricante. A quantificação de
concentração foi realizada em Nanodrop e a reação de PCR foi realizada com o conjunto
de iniciadores P-35S e A2 para TcPR-1fL155D e P-35S e D2 para TcPR-1gL107D e TcPR-1g.
A sequência e tamanho esperado do amplicon estão descritas na tabela 5.
45
Tabela 5: Iniciadores Forward e Reverse utilizados para amplificação dos genes alvo na
PCR de confirmação
Gene Sequência 5’-3’ Orientação Amplicon
(pb) Nomenclatura
GCACAATCCCACTATCCTTC Forward P-35S
TcPR-1fL155D CACGTATGGCCTGAAGCAC Reverse
579 Rv TcPR1- f A2
TcPR-1gL107D
e TcPR-1g
GCACAATCCCACTATCCTTC Forward P-35S
CTACTCCAATAACAGATTCAATCC Reverse
613 Rv TcPR1- g D2
A reação de amplificação ocorreu no equipamento Veriti (Applied Biosystems)
com 25 µL de volume final de reação, sendo 12,5 µL de DreamTaq Green PCR Master
Mix (Thermo Scientific), 0,5 µL de iniciadores forward e reverse (10 µM), 2 µL de DNA
(~20 ng) e 9,5 µL de água ultrapura. A ciclagem foi de 94°C por 5 minutos; 35 ciclos de
94°C por 1 segundo, 57°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto; 72°C por 7 minutos,
finalizando a 4°C. As reações foram analisadas por eletroforese em gel de 1% agarose em
tampão TBE 1X e visualizadas por ultravioleta no fotodocumentador E-box CX5 (Vilber).
3.7 Análises estatísticas
Os dados obtidos nos ensaios de transformação genética em tomateiro foram
submetidos à análise estatística. A análise de variância (ANOVA) foi conduzida em nível
de significância de 5%, utilizando o programa SPEED Stat 2.4 (CARVALHO et al., 2020).
As médias dos tratamentos foram agrupadas aplicando o teste de Tukey, com nível de
significância de 5% (p < 0,05).
46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Construções contendo mutagênese sítio dirigida e validação
Com o objetivo de se estudar o papel da atividade de ligação ao esterol das
proteínas PR-1 e a influência dos genes mutados nas taxas de regeneração in vitro quando
inseridos no genoma de tomateiros MT via A. tumefaciens foram escolhidas as posições
mutadas nos vetores de transformação
A primeira mutação, que compreende o domínio SCP do gene TcPR-1f, a
substituição da Leucina por Ácido Aspártico na posição 155 (L155D) altera pontualmente
a polaridade da região (DARWICHE et al., 2017). O mutante foi proposto nessa posição
por estar presente no domínio SCP/TAPS, mais especificamente na posição 3 do caveolin
binding motif e por se alinhar aos aminoácidos hidrofóbicos característicos como sendo
responsáveis à ligação ao esterol (DARWICHE et al., 2017). Desse modo, essa alteração
visa à mudança de polaridade do sítio e a provável anulação da interação nessa região. A
segunda mutação escolhida para este gene compreende a região central do domínio
Quinase (sítio Kn1), Lisina 337 (K337), avaliado como possivelmente atuante no processo
de fosforilação (TOSARINI et al., 2018), trocando-o por uma Alanina (K337A), ou seja,
um aminoácido de característica polar carregado positivamente, por um aminoácido com
característica apolar hidrofóbico. A terceira mutação escolhida para o vetor do gene TcPR-
1f, também compreende a região do domínio Quinase (sitio Kn2), mas na posição Lisina
434 (K434A) trocando-o por uma alanina.
A escolha das mutações para o vetor do gene TcPR-1g foram os mesmos descritos
acima, relacionados a alterações pontuais da característica bioquímica da região. Na
primeira mutação, que compreende a região do domínio SCP/TAPS, mais especificamente
no caveolin binding motif, o aminoácido Leucina foi substituído por Ácido Aspártico
(K107D). Na segunda mutação escolhida, o mutante K298A foi proposto para a região do
domínio quinase (Kn1) havendo a troca na posição 298, do aminoácido Lisina por Alanina.
Numa outra região de TcPR-1g, que também pertence ao domínio Quinase (Kn2), a
terceira houve a troca na posição 395 do aminoácido Lisina por Alanina (K395A).
As figuras 10 e 11 mostram o resultado do sequenciamento dos genes TcPR-1f e
TcPR1-g, respectivamente. Conforme evidenciado, houve a troca dos códons conforme
esperado em todos os sítios.
47
Figura 10: Imagem do software CLC evidenciando a eficácia da mutagênese sítio dirigida
para o gene TcPR-1f. No topo da imagem, está apresentada a sequência original do
gene (referência), os cromatogramas abaixo representam o resultado do
sequenciamento de uma amostra positiva para a mutação. Os nucleotídeos substituídos
estão em destaque. A) Domínio SCP. Em evidência a troca de TTG para GAC na
posição L155D. B) Domínio Quinase 1. Em evidência a troca de AAG para GCG na
posição K337A. C) Domínio Quinase 2. Em evidência a troca de AAA para GCT na
posição K434A.
48
Figura 11: Imagem do software CLC evidenciando a eficácia da mutagênese sítio dirigida
para o gene TcPR-1g. No topo da imagem, está apresentada a sequência original do
gene (referência), os cromatogramas abaixo representam o resultado do
sequenciamento de uma amostra positiva para a mutação. Os nucleotídeos substituídos
49
estão em destaque. A) Domínio SCP. Em evidência a troca de TTG para GAC na
posição L107D. B) Domínio Quinase 1. Em evidência a troca de AAA para GCT na
posição K298A. C) Domínio Quinase 2. Em evidência a troca de AAA para GCT na
posição K395A.
A figura 10A destaca na sequência original do gene TcPR-1f (utilizada como
referência) o códon TTG, responsável por codificar o aminoácido Leucina. Sobre o pico do
cromatograma está destacado o códon GAC que codifica o aminoácido Ácido Aspártico
na mesma posição, o que indica que ocorreu a modificação desejada no domínio
SCP/TAPS. A figura 10B mostra na sequência original do gene, o códon AAG que
codifica o aminoácido Lisina e, na sequência consenso, se observa o códon GCG
responsável por codificar o aminoácido Alanina na mesma posição indicando que a troca
de códons aconteceu no domínio quinase. A figura 10C mostra o códon AAA (domínio
quinase), responsável por codificar Lisina, em evidência na sequência original do gene e na
sequência consenso, o códon GCT que corresponde a Alanina, na mesma posição,
representando a eficácia da reação de mutagênese sítio dirigida.
As Figuras 11 A, B e C referem-se às mutações no gene TcPR-1g. Na primeira
figura (11 A) pode-se observar a substituição do códon TTG (que codifica Leucina) pelo
códon GAC (que codifica Ácido Aspártico, na mesma posição) confirmando a modificação
desejada no domínio SCP/TAPS. A Figura 11B mostra a troca do códon AAA (Lisina)
pelo códon GCT (Alanina) ocorrida na posição K298A do domínio quinase e a Figura 11C
também troca Lisina (AAA) por Alanina (GCT), porém em outra posição do domínio
quinase. Não foi observada nenhuma outra mutação além das esperadas nas sequências dos
genes analisados.
Apesar de terem sido obtidas três construções (domínio SCP/TAPS, Kn1 e Kn2)
para cada gene referência, vale ressaltar que os experimentos de transformação genética
aconteceram apenas com as construções referentes ao domínio SCP/TAPS. As construções
com os domínios Kn1 e Kn2 mutados serão utilizadas em estudos futuros.
A próxima etapa foi retirar os cassetes de expressão (promotores 35S, genes e
terminador) e dos vetores pRT104 e inserí-los no vetor pCAMBIA2201, o qual contém
o s genes de seleção ( nptII-resistência a canamicina) e reporter (GUS com íntrons)
ambos regulados pelo promotor 35S.
O promotor é o processador central da regulação de um gene visto que contém os
sítios de ligação para RNA polimerases, responsável pela transcrição gênica (WATSON et
50
al., 2006). Atualmente, o promotor constitutivo comumente utilizado para a obtenção de
plantas dicotiledôneas geneticamente modificadas é o CaMV 35S do vírus do mosaico
da couve flor (ODELL et al., 1985; KISHI-KABOSHI et al., 2019). Este é considerado um
promotor forte que apresenta expressão constitutiva na maioria dos órgãos/tecidos de
plantas transgênicas (OW et al., 1987).
O vetor pCAMBIA2201, derivado do vetor pPZP (HAJDUKIEWICZ et al., 1994),
possui como características: origens de replicação em E. coli e A. tumefaciens para elevado
número de cópias no microorganismo hospedeiro e sítio de clonagem múltipla, marcador
seletivo em bactérias,gene repórter (GUS) e marcador de seleção (nptII) em plantas para
seleção dos eventos transformados (KOMORI et al., 2007).
Para os alvos em estudo, os genes mutados TcPR-1fL155D e TcPR-1gL107D , foram
escolhidas 4 colônias obtidas via transformação em E. coli para verificação (com enzimas
de restrição) da orientação do inserto e comparação com o padrão teórico gerado pelo
software ApE (v2.0.61) (Figura 12).
51
continua
52
E)
Gene
analisado
EcoRV NcoI PvuII SphI
TcPR-
1fL155D
9073pb,
2852pb, 1270pb,
881pb,
231 pb
9914pb,
2855pb, 1538pb
6856pb,
1997pb, 1956pb,
1534pb,
1117pb, 847pb
Não se
aplica
TcPR-
1gL107D
9073pb,
2758pb,
1270pb,
881pb,
231pb
9914pb,
2761pb,
1538pb
Não se
aplica
6918pb,
3742pb,
3230pb, 323pb
continua
Figura 12: Verificação via enzimas de restrição das transformações em E. coli. A) Padrão
teórico da digestão do vetor pCAMBIA 2201 contendo o cassete do gene TcPR-1fL155D
com as enzimas EcoRV, NcoI, PvuII B) Validação em gel de agarose 1% dos
53
plasmídeos com os domínios SCP, Quinase 1 (Kn1) e Quinase 2 (Kn2) mutados. Na
parte superior indicando as enzimas utilizadas e o marcador e na parte inferior, a
indicação dos domínios e numeração da colônia. O marcador utilizado foi o Generuler
1 Kb Dna Ladder (Thermo Scientific). C) Padrão teórico da digestão do vetor
pCAMBIA 2201 com as enzimas EcoRV, NcoI, SphI do gene TcPR-1gL107D. D)
Validação em gel de agarose 1% dos domínios SCP, Quinase 1 (Kn1) e Quinase 2
(Kn2) do gene TcPR1-g em pCAMBIA 2201. Na parte superior indicando as enzimas
utilizadas e o marcador e na parte inferior, a indicação dos domínios e numeração da
colônia. O marcador utilizado foi o Generuler 1 Kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
E) Tamanhos esperados de bandas com as respectivas enzimas para cada gene
analisado.
Para o gene TcPR-1fL155D foi validada apenas a colônia #1 (domínio SCP) que
seguiu para transformação na cepa GV3101 de Agrobacterium e posterior obtenção de
plantas de tomateiro MT transgênicas. No domínio Kn1 foram validadas as colônias #1 e
#3 e os experimentos seguiram com a #3. No domínio Kn2 foram validadas as colônias #2
e #3 e a #2 foi selecionaada para obtenção de cepas de Agrobacterium. Para o gene TcPR-
1gL107D, foram validadas todas as colônias e os experimentos seguiram com a #4 (domínio
SCP) para transformação do Agrobacterium e obtenção dos tomateiros geneticamente
transformados. No domínio Kn1 foram validadas todas as colônias e a #3 foi selecionada.
Para o domínio Kn2 foi validada apenas a #2 que foi selecionada para obtenção de cepas de
Agrobacterium. A tabela 6 resume as informações obtidas.
Tabela 6: Resumo dos resultados obtidos via mutagêneses sítio-dirigida nos domínios
SCP, Quinase 1 e Quinase 2 para os genes TcPR1-f e TcPR1-g.
Gene
Domínio
Mutagênese sítio-
dirigida
# Colônias
validadas
Colônia que
seguiu
TcPR-1fL155D SCP TTG p/ GAC #1 #1
TcPR-1fK337A Quinase 1 AAG p/ GCG #1 e #3 #3
TcPR-1fK434A Quinase 2 AAA p/ GCT #2 e #3 #2
TcPR-1gL107D SCP TTG p/ GAC #1, #2, #3 e #4 #4
TcPR-1gK298A Quinase 1 AAA p/ GCT #1, #2, #3 e #4 #3
TcPR-1gK395A Quinase 2 AAA p/ GCT #2 #2
A sequência dos genes de interesse foi novamente confirmada por sequenciamento
nos vetores binários selecionados para obtenção das cepas de A. tumefaciens utilizadas nos
experimentos de transformação.
54
4.2 Ensaios de transformação genética em tomateiro Micro – Tom
Foram realizados quatro experimentos de transformação genética em tomateiro
Micro – Tom. Estes experimentos utilizaram os vetores para superexpressão dos genes
mutados TcPR-1fL155D e TcPR-1gL107D (ambos com domínio SCP) bem como o vetor
pCAMBIA2201 sem os genes de interesse (mas com os genes para seleção canamicina e
o reporter). Todas as construções foram transformadas com a cepa GV3101 de A.
tumefaciens, pois há relatos de transformações genéticas em tomateiro Micro – Tom
(CHETTY et al., 2013) que obtiveram 65% de eficiência de transformação utilizando essa
estirpe, comparado com a estirpe EHA105 (40%), estirpe AGL1 (35%) e MP90 (15%) de
eficiência de transformação. A taxa de mortalidade de cotilédones observada devido ao
supercrescimento de Agrobacterium também foi menor com a linhagem GV3101
(CHETTY et al., 2013).
Em geral, a eficiência de transformação obtida foi muito baixa. Foi necessária a
introdução de pouco mais de três mil explantes que resultaram em menos de 10 plantas
PCR positivas que não avançaram para a fase de enraizamento e também não alongaram. A
porcentagem de plantas obtidas foi baixa em relação a trabalhos anteriores envolvendo o
tomateiro Micro – Tom (CRUZ–MENDÍVIL et al., 2011; CHETTY et al., 2013). Houve
contaminações por bactérias e fungos em explantes durante o cultivo in vitro, fato que pode
ter colaborado para o baixo valor da eficiência de transformação obtida neste trabalho.
Devido as observações realizadas por CHETTY et al. (2013), a cepa utilizada foi
descartada como responsável pelo baixo índice de regeneração observado. As
transformações genéticas com o vetor pCAMBIA2201, TcPR-1f e TcPR-1g foram
realizadas para controle dos experimentos de transformação realizados com os genes de
interesse que apresentavam domínio SCP/TAPS mutado.
Em fase de regeneração a maioria dos explantes apresentaram desvios de
coloração, tanto clorose variegada como aspecto necrótico, outras foram capazes de
desenvolver calos compactos e poucos formaram pequenos brotos, com desenvolvimento
extremamente lento, a ponto de não formarem raízes in vitro mesmo após 5 meses de
permanência em meio de regeneração.
55
Tabela 7: Resumo das informações dos experimentos de transformação genética em
modelo de Tomateiro Micro-Tom dos genes TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D, TcPR-1f, TcPR-
1g (referência) e controle.
# Experi-
mento
Data
Construção
OD
infec
ção
Explantes
introduzi
dos
#
Regene-
rações
#
PCR
Positi
Vas
1 30/11/2019 TcPR-1fL155D 0,33 200 6 0
1 30/11/2019 TcPR-1gL107D 0,35 200 4 0
1 30/11/2019 pCAMBIA2201 0,31 100 16 0
2 22/01/2019 TcPR-1fL155D 0,23 400 0 0
2 22/01/2019 TcPR-1gL107D 0,22 400 0 0
2 22/01/2019 pCAMBIA2201 0,25 110 0 0
3 17/02/2020 TcPR-1fL155D 0,21 400 12 3
3 17/02/2020 TcPR-1gL107D 0,21 400 10 1
3 17/02/2020 pCAMBIA2201 0,22 90 5 1
4 13/08/2020 TcPR-1fL155D 0,29 200 6 1
4 13/08/2020 TcPR-1gL107D 0,255 200 17 0
4 13/08/2020 TcPR-1f 0,3 200 9 0
4 13/08/2020 TcPR-1g 0,311 200 21 1
4 13/08/2020 pCAMBIA2201 0,39 60 15 0
Em 2018, Forti realizou os primeiros experimentos de transformação genética com
genes TcPR-1f e TcPR-1g com os domínios originais (sem mutação) utilizando a cepa
GV3101 de A. tumefaciens (FORTI, 2018) para caracterização das PR-1-RK de cacaueiro
utilizando o sistema modelo do tomateiro Micro – Tom (FORTI, 2018). As construções
apresentavam cassete de seleção com o gene nptII controlado pelo promotor CaMV35S e o
gene repórter GUS (uidA) controlado pelo mesmo promotor, igualmente utilizado neste
trabalho. Foram realizados dezoito experimentos de transformação com OD de infecção
média de 0,32. A taxa de regeneração observada foi de 1,6% para o gene TcPR-1f e de
0,59% para o gene TcPR-1g enquanto que a taxa de transformação foi 0,03% para o gene
TcPR-1f e 0,02% para o gene TcPR-1g. Além de baixas taxas, os experimentos
apresentaram elevado número de escapes de eventos.
4.3 Confirmação das plantas transformadas
Foram analisadas folhas de cinco brotos em frascos individualizados referentes a
eventos putativos de TcPR-1fL155D e folhas de quatro eventos putativo de TcPR-1gL107D, folhas
de um evento putativo do vetor vazio (controle, pCAMBIA 2201) e folhas de tomateiro
Micro-Tom não transformado utilizado como controle negativo (Figura 13). O controle
positivo utilizado na reação de PCR foi o DNA plasmidial dos vetores binários utilizados
56
na transformação de Agrobacterium (Figura 14, 15 e 16).
Figura 13: Imagens dos eventos putativos em frasco na fase de enraizamento antes da
coleta de material foliar para confirmação da transgenia por PCR convencional. A)
Eventos 1, 2, 3, 4, 5, 6 putativos do gene TcPR-1fL155D. O evento 4 não foi coletado. B)
Evento 1 putativos de TcPR-1gL107D C) Evento 1 e 2 putativos do controle
pCAMBIA2201. Apenas o número 1 foi coletado. D) Eventos 1, 2 e 3 putativos do
controle TcPR-1g. E) Tomateiro Micro-Tom (Wild Type) Controle do experimento de
transformação.
57
O conjunto de iniciadores utilizados para essa validação anelava no promotor 35S
(Forward) e no interior no gene de interesse (Reverse). O tamanho esperado para
amplificação do gene TcPR-1fL155D era de 579 pb, para os gene TcPR-1gL107D e TcPR-1g
eram de 613 pb. A amplificação por PCR confirmou a transgenia dos eventos #1, 2, 3 e 6
de TcPR-1fL155D (Figura 14), do evento #1 de TcPR-1gL107D (Figura 15) e do evento #3
TcPR-1g (Figura 16) devido a presença da banda de interesse na altura esperada.
Figura 14: Resultado da PCR para confirmação dos eventos obtidos nos experimentos 3 e
4 de transformação. O marcador utilizado foi de 100pb (Invitrogen). Ev: Evento.). MT
C-: Controle negativo, tomateiro Micro-Tom. Agro C+: Controle positivo, DNA de
Agrobacterium utilizado para transformação genética. A) Confirmação dos eventos 1,
2 e 3 de TcPR-1fL155D. B) Confirmação do evento 5 de TcPR-1fL155D.
58
Figura 15: Resultado da PCR para confirmação do eventos obtidos nos experimento 3 de
transformação do gene TcPR-1gL107D. O marcador utilizado foi de 100 pb (Invitrogen).
Ev: Evento. MT C-: Controle negativo, tomateiro Micro-Tom. Agro C+: Controle
positivo, DNA de Agrobacterium utilizado para transformação genética.
Figura 16: Resultado da PCR para confirmação dos eventos obtidos no experimento 3 de
transformação do gene TcPR-1g. O marcador utilizado foi de 100 pb (Invitrogen). Ev:
Evento. MT C-: Controle negativo, Tomateiro Micro-Tom. Agro C+: Controle
positivo, DNA de Agrobacterium utilizado para transformação genética.
Os eventos putativos que foram submetidos a PCR de confirmação e não
apresentaram amplificação foram considerados escapes de brotos regenerados a partir de
explantes transformados, e não foram relacionados com o vetor utilizado para
transformação.
59
4.3.1 Análise dos eventos obtidos
Visulamente, analisando a Figura 13, observamos que as plantas transformadas
com os genes mutados apresentaram padrão extremamente tardio de desenvolvimento
quando comparado ao controle (Figura 13) sugerindo que na presença destes genes, suas
vias de desenvolvimento podem ter sido afetadas.
Para avaliação quantitativa dos brotos putativos obtidos quanto ao seu padrão de
desenvolvimento foram calculadas as taxas de regeneração e, posteriormente, a eficiência
de transformação. As taxas alcançadas apresentaram-se baixas, porém, as plantas
transformadas com o gene TcPR-1fL155D apresentaram menor regeneração que as
transformadas com o gene TcPR-1gL107D. As taxas de regeneração foram determinadas
matematicamente dividindo o número de plantas regeneradas (identificadas por contagem
manual) pelo número de explantes inoculados e, em seguida, multiplicados por 100 (Tabela
8).
Tabela 8: Resumo das taxas de regeneração obtidas nos experimentos de transformação
genética de tomateiro Micro-Tom realizados.
Gene Taxa de regeneração
TcPR-1fL155D 2%
TcPR-1gL107D 3%
TcPR-1f 4,5%
TcPR-1g 10,5%
pCAMBIA2201 10%
A porcentagem total observada de regeneração, considerando todos os experimentos
realizados neste trabalho, foi de 2% para o gene TcPR-1fL155D, de 3% para o gene TcPR-
1gL107D, 10% para o controle pCAMBIA2201 (vetor vazio), 4,5% para o controle TcPR-1f
e 10,5% para o controle TcPR1-g. É importante ressaltar que os controles selvagem TcPR-
1f e TcPR1-g (maior taxa de regeneração) estão presentes apenas no experimento 4
indicando que se fossem realizados outros experimentos esses valores poderiam ser
alterados, tanto para baixo como para cima. A porcentagem total de regeneração dos
dezoito experimentos de transformação genética realizados por FORTI (2018) foi de 1,6%
para o gene TcPR-1f e de 0,59% para o gene TcPR-1g enquanto que foi observado taxa de
regeneração de 38% em experimentos com essa cepa de Agrobacterium em tomateiro
Micro – Tom (CHETTY et al., 2013).
60
Pelos dados observamos indícios de que as mutagêneses sítio-dirigidas realizadas
no domínio SCP/TAPS, presentes nas contruções utilizadas para transformação de A.
tumefaciens não foram suficientes para alterar os padrões de regeneração observados
anteriormente. Portanto, foram realizadas análises de variância (ANOVA) para comparar
esses grupos como amostras independentes. A análise levava em consideração cada
construção transformada como um tratamento TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D e
pCAMBIA2201, totalizando então 3 tratamentos e 4 repetições (número de experimentos
realizados); a variável resposta (Y) considerada foi a taxa de regeneração observada
(Figura 17). O delineamento utilizado foi inteiramente ao acaso.
Figura 17: Comparação das taxas de regeneração obtidas nos tratamentos. Colunas
seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
A ANOVA e o teste Tukey (p<0,05) indicam que apesar dos tratamentos
apresentarem diferentes taxas de regeneração, não há evidencias suficientes de que eles
diferem entre si, visto que a diferença entre as médias não foram estatisticamente
significativas.
Outra análise de variância não pôde ser realizada para comparar os tratamentos
TcPR- 1f, TcPR-1g, com TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D e pCAMBIA2201 (experimento 4),
pois só foi realizado um experimento com todos os tratamentos presentes; ou seja, temos
apenas uma repetição, e estatisticamente não é possível estimar os erros e rodar análise de
variância com essa disposição de dados. Portanto, para realizar essa comparação, será
necessária a realização de mais repetições de experimentos. Sendo assim, as
mutagêneses sítio-dirigidas realizadas no domínio SCP/TAPS das construções utilizadas
para transformação de A. tumefaciens não foram suficientes para compararmos
61
significativamente o padrão de regeneração.
Ao tratamos de experimentos de transformação genética, diversos fatores podem
ser apontados por afetarem a eficiência de obtenção de plantas transgênicas, sendo eles, o
genótipo, composição do meio de cultura, tipo e face e idade do explante voltada para o
meio de cultura e hormônio vegetal utilizado (LEE et al., 2020); bem como cepa de
Agrobacterium utilizada, OD, método de co-cultura, antibióticos (modo de adição, tipo e
concentração). Neste trabalho foi utilizado BAP na composição do meio de cultura ao
invés de Zeatina (1 mg L-1) na etapa de regeneração. Alguns estudos que utilizaram Zeatina
(1 a 1,5 mg L-1) na composição do meio de cultura observaram taxas de regeneração de
40% (SUN et al., 2006; GARCIA et al., 2014) e formação de raízes em cerca de 70% (LEE
et al., 2020). Estudos em cultivar IPA-5 de tomateiro industrial (Lycopersicon esculentum
Mill) que utilizou BAP para indução de gemas e Zeatina durante a etapa de regeneração e
nos subcultivos seguintes obtiveram alongamento de 4,4 brotos por explante (FARI et al.,
2000). A utilização desta citocinina poderia ter aumentado a divisão celular e
consequentemente o número de regenerações observadas. Segundo Sun et al. (2006), para
observar mutagêneses nos fenótipos de tomateiro, o protocolo de transformação deveria ser
otimizado para obtenção de maiores rendimentos.
Experimentos em Arabidopsis revelaram que a estrutura do calo embrionário se
origina dos primórdios da raíz lateral (ATTA et al., 2009) e que a formação do calo e
regeneração dos brotos acontecem em duas etapas reguladas pelos genes PLETHORA
(KAREEM et al., 2015). Inicialmente, a totipotência celular é ativada, sinalizando a
proliferação celular, levando a formação dos calos (quando a regeneração é indireta), que
são regulados positivamente por carboidratos. O número de receptores na superfície celular
para essa molécula aumenta, e em seguida, na segunda etapa, a regulação iniciada é para
formação de brotos. Embora a regulação gênica seja a principal responsável pela transição
de desenvolvimento, essas transições também estão associadas à mudança nos níveis de
expressão de metabólitos e sensibilidade aos hormônios adicionados no meio de cultura
(KUMARI et al., 2017).
A baixa taxa de regeneração observada neste trabalho pode estar relacionada às
dinâmicas transcricionais induzidas a partir do momento em que a secção do explante é
realizada, seguida da rápida resposta para morte de células vegetais após a infecção por
Agrobacterium. Isso pode ser um fator limitante na transformação genética de plantas, visto
que, após a infecção, é desencadeado uma resposta de defesa que envolve a expressão de
muitos genes na célula hospedeira, sinalizando uma HR, que desencadeia sinalização
de apoptose celular, limita a transferência de T-DNA, e causa impacto negativos na
62
eficiência de regeneração e consequentemente, de transformação (HANSEN, 2000;
KHANNA et al., 2007; CHETTY et al., 2013; IKEUCHI et al., 2017).
A razão da baixa regeneração também pode ser estar relacionada aos genes isolados
do cacau, pois não há nenhum histórico anterior relacionando a produção de transgênicos
com esses genes, e nem relacionados à mutagênese-sítio dirigida neste domínio. Foi
observado em Arabidopsis que mutagêneses que ocasionaram perda de função alteraram a
taxa de regeneração in vitro das plantas (IWASE et al., 2017), porém não há embasamento
suficiente que indique que essa foi a razão da regeneração observada neste trabalho.
Por outro lado, esse problema pode também estar relacionado com a presença de
muitos promotores constitutivos no cassete de expressão, ocasionando o aumento da
expressão de genes em tecidos nos quais normalmente não são expressos, ou elevados
níveis de expressão do transgene de interesse, causando padrões de desenvolvimento
inesperados (POTENZA et al., 2004), ou até mesmo devido a ocorrência de silenciamento
gênico, mecanismo que ocorre naturalmente como uma forma de proteger os organismos
contra infecções (VOINNET, 2001). Molecularmente, o silenciamento pode ocorrer devido
à homologia de sequências entre o T-DNA introduzido e as sequências endógenas, que por
meio de mecanismos de reconhecimento celular, ocasionam o silenciamento de genes com
sequências homólogas (BHULLAR et al. 2003). Porém, para confirmar essa possibilidade
se faz necessária a realização de estudos de expressão gênica e do número de cópias
inseridas.
O sucesso dos experimentos também pode ser medido pela eficiência (taxa) de
transformação. Esses valores foram obtidos pela divisão do número de eventos
confirmados via PCR pelo número de explantes introduzidos e multiplicados por 100, os
dados estão resumidos na tabela 9.
Tabela 9: Resumo das taxas de transformação obtidas nos experimentos de
transformação genética de tomateiro Micro-Tom realizados.
Gene Taxa de transformação
TcPR-1fL155D 0,33%
TcPR-1gL107D 0,083%
TcPR-1f 0%
TcPR-1g 0,5%
pCAMBIA2201 0,28%
63
A eficiência de transformação alcançada foi de 0,33% para o gene TcPR-1fL155D, de
0,083% para o gene TcPR-1gL107D; 0,28% para o controle pCAMBIA2201 (vetor vazio),
0% para o controle TcPR-1f e 0,5% para o controle TcPR1-g. É importante ressaltar que os
controles selvagem TcPR-1f e TcPR1-g estão presentes apenas no experimento 4,
indicando que se fossem realizados outros experimentos, esses valores podem ser
alterados.
Em outros estudos, a eficiência de transformação observada está em torno de 6 a
37% em experimentos de transformação em tomateiro (CRUZ-MENDIVIL et al., 2011;
DAN et al., 2006; SUN et al., 2006; QIU et al., 2007; PARK et al., 2003), indicando que os
resultados obtidos neste trabalho estão muito abaixo da faixa esperada.
Ao buscar padrões fenotípicos de mutantes de esterol em plantas modelo, foi
observado em Arabidopsis, que a composição de esteróis da membrana vegetal afeta o
crescimento, transporte hormonal e sinalização de auxina, indicando dificuldade na
formação de raízes dos brotos (WANG et al., 2021). A composição alterada de esterol em
mutantes parece afetar vários outros processos biológicos relevantes para o crescimento e
padronização do broto. Outros autores afirmam que alterações na membrana afetam sua
solubilidade, organização, formação de calos, deposição anormal de lignina e ainda
compromete o envio de sinais de resposta mediante o ataque de patógenos, muitas vezes,
tornando o organismo vegetal mais suscetível a eles. Posto que a via de sinalização está
comprometida, o sinal não chega da maneira correta para o organismo (CASSIM et al.,
2018; SCHRICK et al., 2004).
O comprometimento da região de ligação ao esterol através de mutagênese sítio -
dirigida está de fato relacionado com diversas alterações estruturais. Porém para identificar
qual fenômeno definiu o atraso no desenvolvimento e baixas taxas de regeneração
observada são necessários maiores estudos. A alteração dos códons no domínio SCP/TAPS
pode ter ocasionado alterações nos padrões de sinalização de citocininas, ocasionando
menor eficiência na regeneração e formação de calos.
64
5. CONCLUSÕES
Foram obtidas seis construções contendo mutagênese sítio-dirigida em
Agrobacterium para os genes TcPR-1f e TcPR-1g. Destas, duas referentes ao domínio
SCP/TAPS foram transformadas com êxito em tomateiro Micro-Tom, porém apresentaram
taxa de regeneração e eficicência de transformação baixas. Apesar disso, no geral, foram
obtidos 4 eventos transgênicos de TcPR-1fL155D , 1 evento de TcPR-1gL107D, 1 evento de
TcPR-1g e 1 evento de pCAMBA2201.
Os dados obtidos não apresentaram diferença estatística entre si; portanto, não foi
possível estabelecer um padrão de relação concreta entre os resultados obtidos e o papel da
mutagênese na região do domínio SCP/TAPS.
Entretanto, podemos supor que as interações na membrana podem ter sido afetadas
com a troca de códons realizada, pois esta promove mudança de polaridade do sítio e
anulação da interação nessa região, o que poderia ter provocado atraso no desenvolvimento
das plantas avaliadas neste trabalho
São necessários mais estudos para verificar se as mutações nos sítios SCP/TAPS
causam alterações evidentes no desenvolvimento dos calos (coloração diferencial de tecido
e análise por microscopia ótica, quantificação da produção de esterol, etc.) Além disso,
acreditamos também que seja necessária a alteração do hormônio utilizado na etapa de
regeneração na tentativa de estabelecer um protocolo de transformação mais eficiente.
Outra possibilidade é a troca dos promotores 35S a fim de verificar se aumentamos os
índices de transformação e regeneração.
65
6. ANEXOS
Tabela 10: ANOVA obtida no software SPEED Stat 2.4. utilizando como varíavel a taxa
de regeneração obtida considerando 3 tratamentos (TcPR-1fL155D, TcPR-1gL107D e
pCAMBIA2201). O delineamento utilizado foi inteiramente ao acaso. GL: Graus de
Liberdade. SQ: Soma de Quadrados. QM: Quadrados Médios. F: Teste de variabilidade.
Ns: Não significativo.
Análise de Variância (ANOVA)
Y taxa de regenerações
DIC-(3 tratamentos)
F.V. GL SQ QM F p-valor
Experimentos
de
transformação
genética em
tomateiro
Micro - Tom
2,0
0,02127
0,010634979
2,30
ᴺˢ
0,157
Resíduo 9,0 0,0417009 0,004633436
Total 11,0 0,0629709
Tabela 11: Resumo da ANOVA obtida no software SPEED Stat 2.4. utilizando como
varíavel a taxa de regeneração obtida considerando 3 tratamentos (TcPR-1fL155D, TcPR-
1gL107D e pCAMBIA2201). O delineamento utilizado foi inteiramente ao acaso. C.V.:
Coeficiênte de variação. Ns: Não significativo.
Resumo da ANOVA
Y taxa de regenerações
FV p-
valor
Média geral 0,06
Experimentos de
transformação
genética em
tomateiro Micro - Tom
2,3
C.V.(%) 119,15
66
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALEXANDER, D.; GOODMAN, R.M.; GUT-RELLA, M.; GLASCOCK, C.;
WEYMANN, K., FRIEDRICH; L., MADDOX; D., AHL-GOY, P.; LUNTZ, T.; WARD,
E. Increased tolerance to two oomycete pathogens in transgenic tobacco expressing
pathogenesis-related protein 1a. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Aug 1;90(15):7327-31.
doi: 10.1073/pnas.90.15.7327. PMID: 8346252; PMCID: PMC47130.
ANDRADE, S. R. M. Transformação de plantas. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados,. 2003.
(Embrapa Cerrados. Documentos, 102). 8 - 21p.
AGRIOS, G. N. Plant Pathol. 5. Ed. San Diego, Califórnia: Elsevier Academic Press,
2004. 922p.
AGRIOS, G. N. Plant Pathol.. 5. Ed. San Diego, Califórnia: Elsevier Academic Press,
2005. Chapter Six 207-245p.
BARIK, S.;Site-directed mutagenesis in vitro by megaprimer PCR, Methods Mol. Biol. 57
(1996) 203–215.
ATTA, R.; LAURENS, L.; BOUCHERON-DUBUISSON, E.; GUIVARC’H, A.;
CARNERO, E.; GIRAUDAT-PAUTOT, V.; Pluripotency of Arabidopsis xylem pericycle
underlies shoot regeneration from root and hypocotyl explants grown in vitro. The Plant
Journal. 2009; 57(4):626–44. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2008.03715.x
BERTINI, L.; CAPORALE, C.; TESTA, M.; PROIETTI, S.; CARUSO, C. Structural basis
of the antifungal activity of wheat PR4 proteins. Febs letters, v. 583, n. 3, p. 2865-2871.
2009.
BHULLAR S, CHAKRAVARTHY S, ADVANI S, DATTA S, PENTAL D, BURMA PK.
Strategies for development of functionally equivalent promoters with minimum sequence
homology for transgene expression in plants: cis-elements in a novel DNA context versus
domain swapping. Plant Physiol. 2003;132(2):988-998. doi:10.1104/pp.103.020602
BLBK, P., AUGUST, P., COUNT, C., & PARKER, J. (2009). Annual Plant Reviews
Annual Plant Reviews. Volume 34. Mol Aspects of Plant (Vol. 34).
BREEN, S.; WILLIAMS, SJ.; OUTRAM, M.; KOBE, B.; SOLOMON, PS. Emerging Insights into the Functions of Pathogenesis-Related Protein 1. Trends Plant Sci. 2017
Oct;22(10):871-879. doi: 10.1016/j.tplants.2017.06.013. Epub 2017 Jul 22. PMID:
28743380
BOWLES, D. J. Defense-related proteins in higher plants. Annual Review of
Biochemistry, Palo Alto, v. 59, p. 873- 907, 1990.
CANHOTO, J. (2010). Biotecnologia vegetal: da clonagem de plantas à transformação genética. Coimbra, Portugal: Imprensa da Universidade de Coimbra.
CANTACESSI, C., CAMPBELL, B. E., VISSER, A., GELDHOF, P., NOLAN, M. J.,
NISBET, A. J., GASSER, R. B. (2009). A portrait of the “SCP/TAPS” proteins of eukaryotes - Developing a framework for fundamental research and biotechnological
outcomes. Biotechnology Advances, 7(4), 376–388.
67
CANTACESSI, C; GASSER, R.B. (2012) SCP/TAPS proteins in helminths – where to from now? Mol Cell Probes 26, 54–59.
CARVALHO, A.M.X.; MENDES, F.Q.; MENDES, F.Q.; TAVARES, L.F. SPEED Stat: a
free, intuitive, and minimalist spreadsheet program for statistical analyses of experiments. Crop Breending and Applied Biotechnology, 20(3): e327420312, 2020.
http://dx.doi.org/10.1590/1984-70332020v20n3s46
CASSIM, A.; GOUGUET, P; GRONNIER, J; LAURENT, ; GERMAIN, V; GRISON, ;
BOUTTÉ, Y; GERBEAU-PISSOT, P; SIMON-PLAS, F; MONGRAND, S (2018). Plant
lipids: Key players of plasma membrane organization and function. Progress in Lipid
Research. doi:10.1016/j.plipres.2018.11.002
CHETTY, V. J.; CEBALLOS, N.; GARCIA, D.; NARVÁEZ-VÁSQUEZ, J.; LOPEZ, W.; OROZCO-CÁRDENAS, M. L. (2013). Evaluation of four Agrobacterium tumefaciens strains
for the genetic transformation of tomato (Solanum lycopersicumL.) cultivar Micro-Tom.
Plant Cell Reports, 32(2), 239–247. doi:10.1007/s00299-012-1358-1
CHRISTENSEN, A. B.; CHO, B. H.; NÆSBY, M.; GREGERSEN, P. L.; BRANDT, J.; MADRIZ-ORDEÑA, K.; COLLINGE, D. B.; THORDAL-CHRISTENSEN, H. The
molecular characterization of two barley proteins establishes the novel PR-17 family of
pathogenesis-related proteins. Molecular Plant Pathology, London, v. 3, n. 3, p. 135-144,
2002.
CHOUDHARY, V., SCHNEITER, R. Pathogen-Related Yeast (PRY) proteins and members
of the CAP superfamily are secreted sterol-binding proteins. Proc Natl Acad Sci USA 2012;
109: 16882–7.
CRUZ-MENDÍVIL, A., RIVERA-LÓPEZ, J., GERMÁN-BÁEZ, L. J., LÓPEZ-MEYER, M.,
HERNÁNDEZ-VERDUGO, S., LÓPEZ-VALENZUELA, J. A., REYES-MORENO, C., &
VALDEZ-ORTIZ, A. (2011). A Simple and Efficient Protocol for Plant Regeneration and
Genetic Transformation of Tomato cv. Micro-Tom from Leaf Explants, HortScience horts,
46(12), 1655-1660.
DARWICHE, R., EL ATAB, O., BARONI, R. M., TEIXEIRA, P. J. P. L., MONDEGO, J. M. C., PEREIRA, G. A. G., SCHNEITER, R. (2017). Plant pathogenesis-related proteins of the
cacao fungal pathogen Moniliophthora perniciosa differ in their lipid-binding specificities.
Journal of Biological Chemistry, 292(50), 20558–20569.
DARWICHE, R., EL ATAB, O., COTTIER, S., SCHNEITER, R. (2018) The function of
yeast CAP family proteins in lipid export, mating, and pathogen defense. FEBS Lett. 2018
Apr;592(8):1304-1311.
DAN, Y., H. YAN, T. MUNYIKWA, J. DONG, Y. ZHANG, AND C.L. ARMSTRONG.
2006. MicroTom—a high throughput model transformation system for functional genomics.
Plant Cell Rpt. 25:432–441
DANGL, J.; JONES, J. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature
411, 826–833 (2001).
68
DE MORAES, C. M.; Lewis, W. J.; Paré, P. W.; Alborn, H. T.; Tumlinson, J. H.; Nature
1998, 393, 570.
DEVELEY‐ RIVIÈRE, Marie‐ Pierre; GALIANA, Eric. Resistance to pathogens and host
developmental stage: a multifaceted relationship within the plant kingdom. New Phytologist,
v. 175, n. 3, p. 405-416, 2007.
DOREY, S.; BAILLIEUL, F.; PIERREL, M. A.; SAINDRENAN, P.; FRITIG, B.;
KAUFFMANN, S. Spatial and temporal induction of cell death, defense genes, and accumulation of salicylic acid in tobacco leaves reacting hypersensitively to a fungal
glycoprotein elicitor. Molecular Plant-Microbe Interaction, St. Paul, v. 10, p. 646-655,
1997
DURNER, J.; SHAH, J.; KLESSIG, D. F. Salicylic acid and disease resistance in plants.
Trends in Plant Science, Oxford, v. 2, p. 266-274, 1997.
ESCOBAR-RESTREPO, J. M. et al. The Feronia receptor-like kinase mediates male–female
interactions during pollen tube reception. Science, 317, 656–660, 2007.
FARMER, E.E.; RYAN, C.A. Interplant communication: airborne methyl jasmonate induces
synthesis of proteinase inhibitors in plant leaves. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990
Oct;87(19):7713-6. doi: 10.1073/pnas.87.19.7713. PMID: 11607107; PMCID: PMC54818.
FARI, MIKLÓS; RESENDE, GERALDO MILANEZ DE; MELO, NATONIEL FRANKLIN
DE. Avaliação da capacidade de regeneração in vitro em tomateiro industrial. Pesq. agropec.
bras., Brasília , v. 35, n. 8, p. 1523-1529, Aug. 2000.
FERREIRA, R; MONTEIRO, S; FREITAS, R; SANTOS, C; CHEN, Z; BATISTA, L;
DUARTE, J.; BORGES, A; TEIXEIRA, A. The role of plant defence proteins in fungal
pathogenesis. Molecular plant path, v. 8, p.677–700, 2007.
FU, Z., DONG, X. 2013. Systemic acquired resistance: turning local infection into global
defense. Annual Review of Plant Biology 64, 839-863.
FORTI G. Caracterização Funcional de Duas Proteínas Pr-1-RK de Cacaueiro, Utilizando O
Sistema Modelo Micro Tom (2018). Dissertação de Mestrado, IAC.
FRASER, R.S.S. (1981) Evidence for the occurrence of the “pathogenesis-related” proteins in
leaves of healthy tobacco plants during flowering. Physiol. Plant Pathol. 19, 69–76
GAMBINO, G.; GRIBAUDO, I. Genetic transformation of fruit trees: current status and
remaining challenges. Transgenic Research, London, V2, p. 1163-1181, 2012.
GAMBORG, O.L.; MILLER, R.A.; OJIMA, K. (1968) Nutrient requirement of suspension
cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50: 151-158
GAMIR, J.; DARWICHE, R.; VAN'T HOF, P.; CHOUDHARY, V.; STUMPE, M.;
SCHNEITER, R.; MAUCH, F. (2017) The sterol-binding activity of PATHOGENESIS-
RELATED PROTEIN 1 reveals the mode of action of an antimicrobial protein. Plant J. 2017
Feb;89(3):502-509.
GANAPATHI, T. R.; SUPRASANNA, P.; RAO, P S; BAPAT, V A.Tobacco (Nicotiana
tabacum L.)-A model system for tissue culture interventions and genetic engineering. Indian
J of Biotech. 2004.
69
GARCIA, D., NARVÁEZ-VÁSQUEZ, J., & OROZCO-CÁRDENAS, M. L. (2014). Tomato
(Solanum lycopersicum). Agrobacterium Protocols, 349–361. doi:10.1007/978-1-4939-1695-
5_28
GONZÁLEZ-LAMOTHE, R.; MITCHELL, G.; GATTUSO, M.; DIARRA, M.S.;
MALOUIN, F.; BOUARAB, K. Plant antimicrobial agents and their effects on plant and
human pathogens. Int J Mol Sci. 2009;10(8):3400-3419. Published 2009 Jul 31.
doi:10.3390/ijms10083400
GIBBS, G.M.; ROELANTS, K.; O’BRYAN, M.K. (2008) The CAP superfamily: cysteine-
rich secretory proteins, antigen 5, and pathogenesis-related 1 proteins–roles in reproduction,
cancer, and immune defense. Endocr Rev 29, 865–897
GIRI, C. et al. Progress in tissue culture, genetic transformation and application of
biotechnology to trees: an overview. Trees, v.18, n.2, p.115-135, 2004.
GREEFF, C., ROUX, M., MUNDY, J. AND PETERSEN, M. (2012) Receptor-like kinase complexes in plant innate immunity. Front. Plant Sci. 3, 209.
HAJDUKIEWICZ, P, SVAB, Z, MALIGA, P., (1994) The small versatile pPZP family of
Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol 25:989-994
HARTMAN, G.L.; PAWLOWSKI, M.L.; CHANG, H.-X.; HILL, C.B.Emerging
Technologies for Promoting Food Security. Chapter: 3 Successful Technologies and
Approaches Used to Develop and Manage Resistance against Crop Diseases and Pests. 2016.
Pages 43-66.
HAMMOND-KOSACK, K. E.; JONES, J. D. G. Responses to plant pathogens. In:
BUCHANAN, B.; GRUISSEM, W., JONES, R. (Ed.) Biochemistry and Molecular Biology
of Plants. Rockville, Maryland, American Society of Plant Physiologists, 2000. cap. 21, p.
1102-1157.
HANSEN, G.; WRIGHT, M.S. Recent advances in the transformation of plants. Trends in
Plant Science, v. 4, p. 226-231, 1999.
HANSEN, G. (2000). Evidence for Agrobacterium-induced apoptosis in maize cells. Mol
Plant Microbe Interact 13:649–657. doi:10.1094/MPMI.2000.13.6.649.
HEATH, M.C. (2000a). Hypersensitive response-related cell death. Plant Mol. Biol. 44, 321–
334.
HEATH, M. C. (2000b). Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Current
Opinion in Plant Biology, 3(4), 315–319.
IKEUCHI M, IWASE A, RYMEN B, ET AL. Wounding Triggers Callus Formation via Dynamic Hormonal and Transcriptional Changes. Plant Physiol. 2017;175(3):1158-1174.
doi:10.1104/pp.17.01035
IWASE A, HARASHIMA H, IKEUCHI M, et al. WIND1 Promotes Shoot Regeneration
through Transcriptional Activation of ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1 in
Arabidopsis. Plant Cell. 2017;29(1):54-69. doi:10.1105/tpc.16.00623
70
JINN, T.L.; STONE, J.M.; WALKER, J.C. HAESA, an Arabidopsis leucine-rich repeat
receptor kinase, controls floral organ abscission. Genes Dev. 2000 Jan 1;14(1):108-17. PMID:
10640280; PMCID: PMC316334.
JONES, J., DANGL, J. The plant immune system. Nature 444, 323–329 (2006).
https://doi.org/10.1038/nature05286
KARBAN, R.; BALDWIN, I. T.; Induced Responses to Herbivory, University of Chicago:
Chicago, 1997.
KAREEM, A., DURGAPRASAD, K., SUGIMOTO, K., DU, Y., PULIANMACKAL, AJ,
TRIVEDI ZB, PLETHORA Genes Control Regeneration by a Two-Step Mechanism.
Current Biology. 2015; 25(8):1017–30. https://doi.org/10.1016/j.cub.2015.02.022 PMID:
25819565
KHANNA, H.K.; JEAN-YVES, P.; HARDING R.M.; DICKMAN, M.B.; DALE, J.L. (2007)
Inhibition of Agrobacterium—induced cell death by antiapoptotic gene expression leads to
very high transformation efficiency of banana. Mol Plant Microbe Interact 20:1048–
1054.doi:10.1094
KISHI-KABOSHI M, AIDA R, SASAKI K. Parsley ubiquitin promoter displays higher
activity than the CaMV 35S promoter and the chrysanthemum actin 2 promoter for
productive, constitutive, and durable expression of a transgene in Chrysanthemum morifolium.
Breed Sci. 2019;69(3):536-544. doi:10.1270/jsbbs.19036
KOMORI, T.;IMAYAMA, T.;KATO, N.;ISHIDA, Y.;JUN, U.;KOMAR, T. "Current status
of binary vectors and superbinary vectors." Plant physiology 145.4 (2007): 1155-1160.
KOTHARI, K.S.; DANSANA, P.K.; GIRI, J.; TYAGI, A.K. Rice Stress Associated Protein 1
(OsSAP1) Interacts with Aminotransferase (OsAMTR1) and Pathogenesis-Related 1a Protein
(OsSCP) and Regulates Abiotic Stress Responses. Front Plant Sci. 2016;7:1057. Published
2016 Jul 19. doi:10.3389/fpls.2016.01057
KOORNNEEF, M.; MEINKE, D.. The development of Arabidopsis as a model plant. The
Plant Journal, v. 61, n. 6, p. 909-921, 2010.
LACROIX, B.; CITOVSKY, V. The roles of bacterial and host plant factors in
Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int J Dev Biol. 2013a;57(6-8):467-81. doi:
10.1387/ijdb.130199bl. PMID: 24166430.
LACROIX B, CITOVSKY V (2013b). Crown Gall Tumors. In: S.H. Maloy, K. (ed)
Brenner’s Online Encyclopedia of Genetics, 2nd edition. Academic Press.
LARCHER, W. (2006). Ecofisiologia vegetal, São Carlos, SP: RiMa, 531p.
LEAH, R.; TOMMERUP, H.; SVENDSEN, I.; MUNDY, J. Biochemical and molecular
characterization of three barley seed proteins with antifungal properties. J Biol Chem. 1991
Jan 25;266(3):1564-73. PMID: 1899089.
71
LEE, M.H.; LEE, J; JIE, E.Y.; CHOI, S.H; JIANG, L., AHN, W.S.; KIM, C.Y.; KIM, S.W.
Temporal and Spatial Expression Analysis of Shoot-Regeneration Regulatory Genes during
the Adventitious Shoot Formation in Hypocotyl and Cotyledon Explants of Tomato (CV.
Micro-Tom). Int J Mol Sci. 2020 Jul 26;21(15):5309. doi: 10.3390/ijms21155309.
LEHNINGER, Albert L. et al. Bioquímica. Edgard Blücher, 1976.
LOTAN, T.; ORI, N.; FLUHR, R. Pathogenesis-related proteins are developmentally
regulated in tobacco flowers. Plant Cell. 1989;1(9):881-887. doi:10.1105/tpc.1.9.881
LI, S; WILKINSON, M.F; Site-directed mutagenesis: a two-step method using PCR and
DpnI, Biotechniques 23 (1997) 588–590.
LINCOLN, J.E.; SANCHEZ, J.P.; ZUMSTEIN, K.; GILCHRIST, D.G. 2018. Plant and
animal PR1 family members inhibit programmed cell death and suppress bacterial pathogens
in plant tissues. Mol Plant Pathol. 19:2111–2123.
LIU, H., NAISMITH, J.H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and
multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol 8, 91 (2008).
LIU, W.X.; ZHANG, F.C.; ZHANG, W.Z.; SONG, L.F.; WU, W.H.; CHEN, Y.F.
Arabidopsis Di19 functions as a transcription factor and modulates PR1, PR2, and PR5
expression in response to drought stress. Mol Plant. 2013 Sep;6(5):1487-502. doi:
10.1093/mp/sst031. Epub 2013 Feb 12. PMID: 23404561.
LU, S.; FARIS, J.D.; EDWARDS, M.C. Molecular cloning and characterization of two novel
genes from hexaploid wheat that encode double PR-1 domains coupled with a receptor-like
protein kinase. Mol Genet Genomics. 2017 Apr;292(2):435-452. doi: 10.1007/s00438-017-
1287-3. Epub 2017 Jan 24. PMID: 28120099.
MARELLI, J. P.; MAXIMOVA, S. N.; GRAMACHO, K. P.; KANG, S.; GUILTINAN, M.J.
Infection Biology of Moniliophthora perniciosa on Theobroma cacao and Alternate
Solanaceous Hosts. Tropical Plant Biology, New York, v. 2, p. 149-160, 2009.
MARTINEZ, C.; BACCOU, J. –C.; BRESSON, E.; BAISSAC, Y.; DANIEL, J. –F.;
JALLOUL, A.; MONTILLET, J. –L.; GEIGER, J. –P.; ASSIGBETSÉ, K.; NICOLE, M.
Salicylic acid mediated by the oxidative burst is a key molecule in local and systemic
responses of cotton challenged by an avirulent race of Xanthomonas campestris pv
malvacerum. Plant Physiology, Bethesda, v. 122, p. 757-766, 2000.
MOREAU, R.A.; NYSTRÖM, L.; WHITAKER, B.D.; WINKLER-MOSER, J.K.; BAER, D..J; GEBAUER, S.K.; HICKS, K.B. Phytosterols and their derivatives: Structural diversity,
distribution, metabolism, analysis, and health-promoting uses. Prog Lipid Res. 2018
Apr;70:35-61. doi: 10.1016/j.plipres.2018.04.001. Epub 2018 Apr 5. PMID: 29627611.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco
tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v.15, p.473-497, 1962
NAYLOR, M., MURPHY, A.M., BERRY, J.O. and CARR, J.P. (1998). Salicylic acid can
induce resistance to plant virus movement. Mol. Plant Microbe Interact. 11, 860–868.
NIDERMAN, T., GENETET, I., BRUYTXE, T., GEES, R., STINTZI, A., LEGRAND, M.,
FRITIG, B., MOSINGER, E. (1995). Pathogenesis-related PR-1 proteins are antifungal -
72
isolation and characterization of 3 14-kilodalton proteins of tomato and of a basic PR-1 of
tobacco with inhibitory activity against Phytophthora infestam Plant Physiology 108, 17-27.
NOJOSA, G.B.A et al. Uso de fosfitos e silicatos na indução de resistência. In: CAVALCANTI, L.S; DI PIERO, R; CIA, P.; PASCHOLATI, S.F; RESENDE, M. L.V.;
ROMEIRO,R.S. (Ed) Indução de resistência em plantas a patógenos e insetos. Piracicaba:
FEALQ, 2005. p139-153.
O'DONNELL, P.J.; CALVERT, C.; ATZORN, R.; WASTERNACK, C.; LEYSER, H.M.O.; BOWLES, D.J. Ethylene as a Signal Mediating the Wound Response of Tomato Plants.
Science. 1996 Dec 13;274(5294):1914-7. doi: 10.1126/science.274.5294.1914. PMID:
8943205.
ODELL, J., NAGY, F. & CHUA, NH. Identification of DNA sequences required for activity
of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, 810–812 (1985).
https://doi.org/10.1038/313810a0
OERKE, E.C., 2005. Crop losses to pests. The Journal of Agricultural Science 144, 31–43.
OW, D.W.; JACOBS, J.D; HOWELL, S.H. Functional regions of the cauliflower mosaic
virus 35S RNA promoter determined by use of the firefly luciferase gene as a reporter of
promoter activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Jul;84(14):4870-4. doi:
10.1073/pnas.84.14.4870. PMID: 16578811; PMCID: PMC305207.
PARK, S.H., MORRIS, J.L., PARK, J.E., HIRSCHI, K.D. AND SMITH, R.H. (2003)
Efficient and genotype-independent Agrobacterium-mediated tomato transformation. J. Plant
Physiol. 160: 1253–1257.
PINHEIRO, M.M.; SANDRONI, M.; LUMMERZHEIM, M.; OLIVEIRA DE, D.E. A defesa
das plantas contra as doenças. Ciência Hoje. 147.1999.
POTENZA, C. et al. Targeting transgene expression in research, agricultural, and
environmental applications: promoters used in plant transformation. In Vitro Cell. Dev. Biol.
Plant 40, 1-22, 2004.
RYALS, J.A.; NEUENSCHWANDER, U.H.; WILLITS, M.G.; MOLINA, A;, STEINER,
H.Y.; HUNT, M.D. Systemic Acquired Resistance. Plant Cell. 1996;8(10):1809-1819.
doi:10.1105/tpc.8.10.1809
REYMOND, Philippe; FARMER, Edward E. Jasmonate and salicylate as global signals for
defense gene expression. Current opinion in plant biology, v. 1, n. 5, p. 404-411, 1998.
PIETERSE, C.M.J., VAN WEES, S.C.M., 2015. Induced disease resistance. In: Lugtenberg, B. (Ed.),Principles of Plant-Microbe Interactions: Microbes for Sustainable Agriculture.
Springer. International Publishing.
RICROCH, A; CHOPRA, SR; FLEISCHER, S J. (2014). Plant Biotechnology.,
10.1007/978-3-319-06892-3(), doi:10.1007/978-3-319-06892-3
ROBERT, N.; FERRAN, J.; BREDA, C.; COUTOS-THÉVENOT, P.; BOULAY, M. Molecular characterization of the incompatible interaction of Vitis vinifera leaves with
Pseudomonas syringae pv. pisi: Expression of genes coding for stilbene synthase and class 10
PR protein. European Journal of Plant Pathology, v. 107, p. 249–261, 2001.
73
SARTORETTO, L. M.; SALDANHA, C. W.; CORDER, M.P. M. Transformação genética:
estratégias e aplicações para o melhoramento genético de espécies florestais. Cienc. Rural
[online]. 2008, vol.38, n.3. https://doi.org/10.1590/S0103-84782008000300046.
SHARMA, MK.; SOLANKE, A.U.; JANI, D.; SINGH, Y.; SHARMA, A.K. A simple and
efficient Agrobacterium-mediated procedure for transformation of tomato. Journal of
Bioscience, Karnataka, v.34, n.3, p.423-433, 2009.
TOSARINI, T. R.; RAMOS, P. Z.; DE SOUZA, G. P.; BARONI, R. M.; MASSIRER, K. B.; COUÑAGO, R. M.; MONDEGO, J.M.C. (2018). Cloning, expression and purification of
kinase domains of cacao PR-1 receptor-like kinases. Protein Expression and Purification,
S1046592817307076–. doi:10.1016/j.pep.2018.01.004
The Tomato Genome Consortium., Kazusa DNA Research Institute., Sato, S. et al. The
tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature 485, 635–641
(2012). https://doi.org/10.1038/nature11119
VAECK, M.; REYNAERTS, A.; HÖFTE, H. Transgenic plants protected from insect attack.
Nature, London, v. 327, p. 33-37, 1987.
VAN ECK, J., KEEN, P., & TJAHJADI, M. (2019). Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation of tomato. In Methods in Molecular Biology (Vol. 1864, pp. 225–234).
Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8778-8_16
VAN LOON, L. C.; VAN KAMMEN, A. Polyacrylamide disc electrophoresis of the soluble
leaf proteins from Nicotiana tabacum var ‘Samsun’ and ‘Samsun NN’. Changes in protein
constitution after infection with TMV. Virology. New York, v. 40, p. 199-211, 1970
VAN LOON LC, Bakker, P., Pieterse, C.M.J., 1998. Systemic resistance induced by
rhizosphere bacteria. Annual Review of Phytopathology 36, 453–483.
VAN LOON LC, VAN STRIEN EA. 1999. The families of pathogenesis-related proteins,
their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiol. Mol. Plant Pathol.
55:85–97
VAN LOON, L. C., REP, M., & PIETERSE, C. M. J. (2006). Significance of Inducible
Defense-related Proteins in Infected Plants. Annual Review of Phytopathology, 44(1), 135–
162.
VAN NORMAN, JM; BENFEY, PN. Arabidopsis thaliana as a model organism in systems
biology. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2009 Nov-Dec;1(3):372-379. doi:
10.1002/wsbm.25. PMID: 20228888; PMCID: PMC2836806.
VERBENE, M. C.; VERPOORTE, R.; BOL, J. F.; MERCADO-BLANCO, J.; LINTHORST,
H. J. M. Overproduction of salicylic acid in plants by bacterial transgenes enhances pathogen
resistance. Nature Biotechnology, New York, v. 18, p. 779-783, 2000.
VOINNET, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics,
v.17, n.8, p.449-459, 2001.
PEČENKOVÁ, T.; PLESKOT, R.; ŽÁRSKÝ, V. 2017. Subcellular localization of
Arabidopsis pathogenesis-related 1 (PR1) protein. Int JMol Sci. 18:825.
74
PINO, L.E.; LOMBARDI-CRESTANA, S.; AZEVEDO, M.S.; SCOTTON, D.C.; BORGO,
L.; QUECINI, V.; FIGUEIRA, A.; PERES, L.E. The Rg1 allele as a valuable tool for genetic
transformation of the tomato 'Micro-Tom' model system. Plant Meth. 2010 Oct 7;6:23. doi:
10.1186/1746-4811-6-23. PMID: 20929550; PMCID: PMC2958934.
PINTO-ZEVALLOS, DELIA M.; MARTINS, CAMILA B. C.; PELLEGRINO, ANA C. AND ZARBIN, PAULO H. G..Compostos orgânicos voláteis na defesa induzida das plantas
contra insetos herbívoros. Quím. Nova [online]. 2013, vol.36, n.9 [cited 2021-04-10],
pp.1395-1405.
QIU, D. et al. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and
production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD. Scientia
Horticulturae, Amsterdam, v. 112, p. 172-175, 2007
SCHRICK, K.; FUJIOKA, S.; TAKATSUTO, S.; STIERHOF, Y.D.; STRANSKY, H,
YOSHIDA, S. A link between sterol biosynthesis, the cell wall, and cellulose in Arabidopsis.
The Plant journal: for cell and molecular biology. 2004;38:227-43.
SCHNEITER, R.; DI PIETRO, A. (2013) The CAP protein superfamily: function in sterol
export and fungal virulence. Biomol Concepts 4, 519–525.
SHENOY, A. R., & VISWESWARIAH, S. S. (2003). Site-directed mutagenesis using a
single mutagenic oligonucleotide and Dpn I digestion of template DNA, 319, 335–336.
https://doi.org/10.1016/S0003-2697(03)00286-0
SHI, Y.L.; SHENG, Y.Y.; CAI, Z.Y.; YANG, R.; LI, Q.S.; LI, X.M.; LI, D.; GUO, X.Y.; LU, J.L;YE, J.H. 2019. Involvement of salicylic acid in anthracnose infection in tea plants
revealed by transcriptome profiling. Int J Mol Sci. 20:2439.
SHIKATA M, EZURA H. Micro-Tom Tomato as an Alternative Plant Model System: Mutant
Collection and Efficient Transformation. Methods Mol Biol. 2016;1363:47-55. doi:
10.1007/978-1-4939-3115-6_5. PMID: 26577780.
SNIDER, C.S.; HSIANG, T.; ZHAO, G.; GRIFFITH, M. Role of ice nucleation and
antifreeze activities in pathogenesis and growth of snow molds. Phytopathology. 2000
Apr;90(4):354-61. doi: 10.1094/PHYTO.2000.90.4.354. PMID: 18944584.
SILVA, R.A.; REIS, V.M.; BALDANI, J.I.; OLIVARES, F.L. “Defesa de plantas contra o
ataque de fitopatógenos”. Documentos – Embrapa - Centro Nacional de Pesquisas de
Agrobiologia, Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil (2008)
SELS, J.; MATHYS, J.; DE CONINCK, B. M. A.; CAMMUE, B. P. A.; DE BOLLE, M. F.
C. Plant pathogenesis-related (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology and
Biochemistry, v. 46, p. 941–950. 2008.
SUDISHA, J., SHARATHCHANDRA, R.G., AMRUTHESH, K.N., KUMAR, A., SHETTY, H.S., 2012. Pathogenesis related proteins in plant defense response. Biological Control 12,
379–403.
75
SUN HJ, UCHII S, WATANABE S, EZURA H. A highly efficient transformation protocol
for Micro-Tom, a model cultivar for tomato functional genomics. Plant Cell Physiol. 2006
Mar;47(3):426-31
TAIZ, L.; ZEIGER, E.; MØLLER, I. M.; MURPHY, A. Fisiologia e Desenvolvimento
Vegetal - 6ed. Artmed Editora, 1 de jan. de 2017 – pag. 721.
TEIXEIRA, P. J. P. L., THOMAZELLA, D. P. T., VIDAL, R. O., DO PRADO, P. F. V.,
REIS, O., BARONI, R. M., MONDEGO, J. M. C. . The Fungal Pathogen Moniliophthora
perniciosa Has Genes Similar to Plant PR-1 That Are Highly Expressed during Its Interaction
with Cacao. PLoS ONE. 2012.
TEIXEIRA, P. J. P. L., COSTA, G. G. L., FIORIN, G. L., PEREIRA, G. A. G., &
MONDEGO, J. M. C. (2013). Novel receptor-like kinases in cacao contain PR-1 extracellular
domains. Molecular Plant Pathology.
TON, J.; D'ALESSANDRO, M.; JOURDIE, V.; JAKAB, G.; KARLEN, D.; HELD, M.;
MAUCH-MANI, B.; TURLINGS, T.C. Priming by airborne signals boosts direct and indirect
resistance in maize. Plant J. 2007 Jan;49(1):16-26. doi: 10.1111/j.1365-313X.2006.02935.x.
Epub 2006 Nov 28. PMID: 17144894.
THATCHER, L.F.; ANDERSON, J.P.; SINGH, K.B. Plant defence responses: what have we
learnt from Arabidopsis? Funct Plant Biol. 2005 Feb;32(1):1-19. doi: 10.1071/FP04135.
PMID: 32689107.
TURLINGS, T. C. J.; WÄCKERS, F. L. Em Advances in Insect Chemical Ecology; Cardé, R.
T.; Millar, J., eds.; Cambridge University Press: Cambridge, 2004, cap. 2.
XIONG, L.; ISHITANI, M.; ZHU, J.K. Interaction of osmotic stress, temperature, and
abscisic acid in the regulation of gene expression in Arabidopsis. Plant Physiol. 1999
Jan;119(1):205-12. doi: 10.1104/pp.119.1.205. PMID: 9880362; PMCID: PMC32221.
WANG, W. AND MARCOLM, B.A. (1999) Two-stage PCR protocol allowing introduction
of multiple mutations, deletions and insertions using QuickChangeTM site-directed
mutagenesis. BioTechniques, 26, 680–682.
WANG, M., LI, P.; MA Y, NIE X, GREBE M, MEN S. Membrane Sterol Composition in
Arabidopsis thaliana Affects Root Elongation via Auxin Biosynthesis. Int J Mol Sci.
2021;22(1):437. Published 2021 Jan 4. doi:10.3390/ijms22010437
WHALEN, M.C. 2005. Host defence in a developmental context. Molecular Plant
Pathology 6: 347–360.
WALLING, L. The Myriad Plant Responses to Herbivores. J Plant Growth Regul 19, 195–
216 (2000).
WALKER, J.C. (1994) Structure and function of the receptor-like protein kinases of higher
plants. Plant Mol. Biol. 26, 1599–1609
WATANABE, M. A. et al. Controle biológico do ácaro rajado com ácaros predadores
fitoseídeos (Acari: Tetranychidae, Phytoseiidae) em culturas de pepino e morango. Scientia
Agricola, v. 51, n. 1, p. 75-81, 1994.
76
WATSON, J.D.; BAKER, T.A.; BELL, S.P.; GANN, A.; LEVINE, M. & LOSICK, R. 2006.
Biologia Molecular do Gene. Editora Artmed, Porto Alegre, 5 edição.
WEN, Z.; YAO, L.; SINGER, S.D.; MUHAMMAD, H.; LI, Z.; WANG, X. 2017.
Constitutive heterologous overexpression of a TIR-NB-ARC-LRR gene encoding a putative disease resistance protein from wild Chinese Vitis pseudoreticulata in Arabidopsis and
tobacco enhances resistance to phytopathogenic fungi and bacteria. Plant Physiol Biochem.
112:346–361.
WIT, P. J. G. M. Visions & reflections (minireview) - How plants recognize pathogens and
defend themselves. Cellular and Molecular Life Sciences, Switzerland, v. 64, p. 2726-
2732,2007.
WU, JIANQIANG; BALDWIN, IAN T. Herbivory‐ induced signalling in plants:
perception and action. Plant, cell & environment, v. 32, n. 9, p. 1161-1174, 2009.
WU, G.. Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids. 2013 Sep;45(3):407-
11. doi: 10.1007/s00726-013-1500-6. Epub 2013 Apr 18. PMID: 23595206.
YANG, J.; WANG, G.Q.; ZHOU, Q.; LU, W.; MA, J.Q.; HUANG, J.H. 2019. Transcriptomic and proteomic response of Manihot esculenta to Tetranychus urticae
infestation at different densities. Exp Appl Acarol. 78:273–293.
YONEYA, K., KUGIMIYA, S., & TAKABAYASHI, J. (2009). Can herbivore‐ induced plant
volatiles inform predatory insect about the most suitable stage of its prey?. Physiological
Entomology, 34(4), 379-386.
ZAREIE, R.; MELANSON, D. L.; MURPHY, P. J. Isolation of fungal cell wall degrading
proteins from barley (Hordeum vulgare L.) leaves infected with Rhynchosporium secalis.
Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Paul, v. 15, n. 10, p. 1031-1039, 2002.
ZHENG, L.; BAUMANN, U.; REYMOND, J.L. An efficient one-step site-directed and site-
saturation mutagenesis protocol. Nucl. Acids Res., 32:e115, 2004.
ZIPFEL, C., ROBATZEK, S., NAVARRO, L. Bacterial disease resistance in Arabidopsis
through flagellin perception. Nature 428, 764–767 (2004).
https://doi.org/10.1038/nature02485
ZIPFEL C. Plant pattern-recognition receptors. Trends Immunol. 2014 Jul;35(7):345-51.
doi: 10.1016/j.it.2014.05.004. Epub 2014 Jun 16. PMID: 24946686.
