biocorantes2

DHIONNE CORRÊIA GOMES

PRODUÇÃO DE ESCLEROTIORINA POR

Penicillium sclerotiorum E OBTENÇÃO DE

DERIVADOS COM APLICAÇÃO POTENCIAL EM

ALIMENTOS

Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG

2011

2

DHIONNE CORRÊIA GOMES

PRODUÇÃO DE ESCLEROTIORINA POR

Penicillium sclerotiorum E OBTENÇÃO DE

DERIVADOS COM APLICAÇÃO POTENCIAL EM

ALIMENTOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciência de Alimentos Orientadora: Profª. Drª. Jacqueline A. Takahashi

Faculdade de Farmácia da UFMG Belo Horizonte, MG

2011

4

Dedico este trabalho à minha família, que mesmo nos momentos mais difíceis, deram sempre o impulso que eu precisava para pular em direção dos meus sonhos

5

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada é possível, e somente nEle se encontram as

respostas.

À Professora Jacqueline, por ter acreditado e confiado em mim desde quando este

projeto estava somente no papel. Por ser sempre exemplo de dedicação, de

inteligência, mas também de respeito, honestidade e fé.

À minha mãe Helena, por ter me dado não somente o dom da vida, mas também por

ter instigado em mim a curiosidade, e me transmitido a sabedoria e inteligência.

Aos meus irmãos Diego e Diogo, meus melhores amigos, meus pilares, meu apoio.

A meu pai.

Aos colegas de laboratório, em especial aos mais presentes: Fabiana, Karine, Ana

Sarah, Adriana, Ana Paula, Willian, Bruna, Erick, Rafael, Camila, Paulo e Isabela pelo

auxílio e por fazer com que o ambiente de trabalho, e consequentemente a realização

deste projeto, se tornasse mais agradável.

Aos meus amigos do CEFET e da graduação por estarem sempre presentes em

minhas conquistas.

Ao Philipe, pelo apoio, sensatez e compreensão nos momentos difíceis.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, pela

contribuição em minha formação científica, em especial à professora Evelyn, presente

em minha formação desde a época da graduação.

Aos amigos do laboratório de Microbiologia Industrial, em especial à Raquel e à Ana

Diolina, que foram parte fundamental na minha caminhada até aqui.

À Ivana e à Vany, pelo auxílio na obtenção e interpretação dos espectros de RMN e

dos cromatogramas.

À Professora Cidinha, pelo auxílio com a identificação de fungos.

Ao CNPQ e FAPEMIG, por terem fornecido os recursos necessários para a realização

deste projeto.

A todos os outros que, de uma maneira ou outra, com menor ou maior intensidade,

ajudaram-me a construir este sonho.

6

“Só sabemos com exatidão quando sabemos pouco. À medida que vamos adquirindo conhecimento, instala-se a dúvida”

Johann Wolfgang Von Goethe

7

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 8 LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 9 LISTA DE SIGLAS .................................................................................................... 10 RESUMO ................................................................................................................... 11 ABSTRACT ............................................................................................................... 12 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 13 2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 14 2.1 Biotecnologia ................................................................................................ 14 2.1.1 Biotecnologia da indústria de alimentos ......................................................... 15 2.2 Fungos ........................................................................................................... 15 2.2.1 Metabólitos secundários ................................................................................. 16 2.2.2 Azafilonas ....................................................................................................... 18 2.3 Penicillium sclerotiorum .............................................................................. 19 2.3.1 Esclerotiorina .................................................................................................. 21 2.4 Corantes naturais ......................................................................................... 23 2.4.1 Corantes naturais usados em alimentos ........................................................ 24 2.5 Biotransformações ....................................................................................... 29 2.5.1 Beauveria bassiana ........................................................................................ 30 3 MATERIAL ..................................................................................................... 34 4 MÉTODOS ..................................................................................................... 38 4.1 Manutenção dos micro-organismos ........................................................... 38 4.2 Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum ........................................ 38 4.3 Purificação da esclerotiorina ...................................................................... 39 4.4 Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 40 4.4.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformação .................................................... 40 4.4.2 Análise e purificação do biotransformado ...................................................... 41 4.5 Obtenção de produtos de síntese com diazometano ............................... 42 4.5.1 Síntese ........................................................................................................... 42 4.5.2 Análise e purificação ...................................................................................... 42 4.6 Biotransformação do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 42 4.6.1 Cultivo do B. bassiana e biotransformação .................................................... 42 4.6.2 Análise e purificação do produto biotransformado ......................................... 42 4.7 Obtenção de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 43 4.7.1 Triagem de fungos .......................................................................................... 43 4.7.2 Análise de CLAE ............................................................................................ 44 4.8 Identificação do Cladosporium sphaerospermum .................................... 45 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 47 5.1 Produção e extração da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum ...... 47 5.2 Purificação da esclerotiorina ...................................................................... 48 5.3 Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ................ 50 5.3.1 Cultivo de Beauveria bassiana ....................................................................... 50 5.3.2 Obtenção dos produtos biotransformados ..................................................... 52 5.3.3 Elucidação estrutural do Biotransformado 1 ................................................... 53 5.3.4 Elucidação estrutural dos outros biotransformados ....................................... 58 5.4 Síntese da 1-metil-esclerotiorina ................................................................ 62 5.4.1 Elucidação estrutural do Produto 1 ................................................................ 63 5.5 Biotransformação da 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana ... 65 5.6 Obtenção de outros derivados da esclerotiorina ...................................... 67

8

5.6.1 Identificação do Cladosporium sphaerospermum .......................................... 68 5.6.2 Análise por CLAE ........................................................................................... 69 5.6.3 Interpretação dos resultados da triagem ........................................................ 70 5.6.4 Interpretação dos resultados da biotransformação em uma etapa de B.

bassiana .........................................................................................................

73 5.6.5 Extrato de P. sclerotiorum .............................................................................. 74 5.7 Projeção para uso dos resultados em alimentos ...................................... 75 6 CONCLUSÕES .............................................................................................. 77 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 79 8 APÊNDICES E ANEXOS ............................................................................... 87

LISTA DE TABELAS

1 Corantes naturais autorizados e suas principais fontes .................................... 25 2 Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum ............... 36 3 Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana ..................... 36 4 Eluentes utilizados na coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina . 39 5 Gradientes de eluição utilizados na análise do HPLC ....................................... 44 6 Informações obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C, sub-

espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a esclerotiorina ...................

51 7 Massas das substâncias isoladas da biotransformação da esclerotiorina por

B. bassiana e respectivos rendimentos .............................................................

53 8 Deslocamentos químicos dos átomos de carbono inseridos na molécula de

esclerotiorina pela biotransformação .................................................................

54 9 Resultado da análise elementar do biotransformado 1, e número de átomos

correspondentes, levando-se em conta a massa obtida no espectro de massas ESI-MS .................................................................................................

55 10 Propriedades físico-químicas do biotransformado 1 ......................................... 60 11 Propriedades físico-químicas do biotransformado 4 ......................................... 61 12 Propriedades físico-químicas do biotransformado 5 ......................................... 61 13 Propriedades físico-químicas da 1-metil-esclerotiorina ..................................... 66 14 Algumas referências bibliográficas sobre biotransformações realizadas pelos

fungos utilizados neste experimento .................................................................

67 15 Substâncias detectadas por CLAE em extratos de biotransformação de mais

de um fungo .......................................................................................................

73

9

LISTA DE FIGURAS

1 Classes de metabólitos secundários fúngicos ................................................... 17 2 Fruto de Garcinia atroviridis ............................................................................... 20 3 Metabólitos secundários isolados de P. sclerotiorum ........................................ 20 4 Dimerização do herbertenediol .......................................................................... 21 5 Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ 21 6 Corantes produzidos por fungos ........................................................................ 24 7 Possíveis mudanças estruturais das antocioanidinas em meio aquoso em

função do pH .....................................................................................................

27 8 Estrutura básica do corante Arpink Red e estruturas das Monascusonas A e

B ........................................................................................................................

28 9 Estruturas da Ankaflavina e Monascina ............................................................ 28 10 Redução assimétrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana .............................. 30 11 Oxidação da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana ................................. 31 12 Hidroxilação de um derivado do adamantano por B. bassiana ......................... 31 13 4´-O-metil-glicosilação do composto CGP-62706 por B. bassiana ................... 32 14 Hidrólise do composto CGP-291 por B. bassiana ............................................. 32 15 Acetilação da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana ............................................. 32 16 Produtos formados pela desmetilação do Diuron por B. bassiana .................... 33 17 Montagem das vidrarias na preparação de diazometano .................................. 37 18 Penicillium sclerotiorum em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e

verso (B) do tubo ...............................................................................................

47 19 Estrutura molecular da esclerotiorina ................................................................ 48 20 Cromatografia em camada delgada comparativa do padrão de esclerotiorina

(A) e o extrato de Penicillium sclerotiorum (B) ..................................................

49 21 Coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina em três etapas de

eluição ...............................................................................................................

49 22 Beauveria bassiana em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e verso

(B) do tubo .........................................................................................................

52 23 Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da

esclerotiorina (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ......................

54 24 Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da

isocromofilona VI (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho) ...............

55 25 Estruturas da esclerotiorina (1) e da isocromofilona VI (2), mostrando os

diferentes cromóforos ........................................................................................

56 26 Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o

biotransformado 1 ..............................................................................................

57 27 Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o

biotransformado 1 ..............................................................................................

57 28 Estrutura molecular proposta para o Biotransformado 1 ................................... 57 29 Fragmento estrutural comum nos biotransformados 1, 4 e 5 ............................ 58 30 Provável estrutura do biotransformado 4 ........................................................... 59 31 Provável estrutura do biotransformado 5 ........................................................... 59 32 Mecanismo proposto para a reação entre azafilonas e aminas primárias ........ 62 33 Reação de formação do diazometano ............................................................... 62 34 Comparação entre os deslocamentos químicos da esclerotiorina (em preto) e

do Produto 1 (em vermelho) ..............................................................................

64 35 Correlações observadas no mapa de contornos HMBC para o produto 1 ........ 64 36 Estrutura molecular do Produto 1 (1-metil-esclerotiorina) ................................. 65

10

37 Microcultivo de Cladosporium sphaerospermum ............................................... 68 38 Cladosporium sphaerospermum inoculado em tubo inclinado. Frente (A) e

verso (B) ............................................................................................................

68 39 Características microscópicas do Cladosporium sphaerospermum.

Conidióforos (a), hifas septadas (b), esporos sexuais (c), detalhe da reprodução assexuada (d) .................................................................................

69 40 Cromatograma da biotransformação em duas etapas em contraste com o

cromatograma dos biotransformados isolados ..................................................

74 41 Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum ...................................... 75

LISTA DE SIGLAS

CCD Cromatografia em coluna delgada CEPT Proteína de transferência de colesterol esterificado CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência COSY Correlation spectroscopy DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer ESI-MS Espectroscopia de massas por ionização por eletrospray FDA Food and Drug Administration HDL Lipoproteína de alta densidade HIV Vírus da imunodeficiência humana HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência HSQC Heteronuclear single quantum coherence IV Infravermelho LDL Lipoproteína de baixa densidade NADPH Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina NOESY Nuclear Overhauser effect spectroscopy RMN Ressonância magnética nuclear TOCSY Total correlation spectroscopy UFMG Universidade Federal de Minas Gerais USP Universidade de São Paulo UV Ultravioleta

11

RESUMO

O fungo Penicillium sclerotiorum produz uma grande variedade de metabólitos

secundários, entre eles, a esclerotiorina, que tem tido aplicações nas indústrias

alimentícia e farmacêutica. Devido à sua forte coloração alaranjada, sua capacidade

antioxidante, potencial atividade biológica de redução do colesterol plasmático e no

tratamento da diabetes, esta substância tem sido alvo de diversos estudos na área de

alimentos. Neste projeto, foram produzidas substâncias através da biotransformação da

esclerotiorina com o fungo Beauveria bassiana, obtendo-se cinco produtos de forte

coloração avermelhada. A mudança na coloração da substância aconteceu devido à

troca de um heteroátomo de oxigênio ligado ao carbono 1 da molécula de esclerotiorina

por um átomo de nitrogênio. O experimento de biotransformação foi repetido utilizando,

como substrato, a 1-metil-esclerotiorina, uma substância semi-sintética, porém os

mesmos resultados não foram obtidos. Após a obtenção destes resultados, foi feita

uma triagem com 14 diferentes espécies de fungos, além de Beauveria bassiana, para

verificar a capacidade destes fungos em biotransformar a esclerotiorina. Os extratos

foram analisados por CLAE e mostraram que, destes 14 fungos, nove foram capazes

de biotransformar a molécula de esclerotiorina em uma ou mais substâncias que

apresentaram coloração avermelhada.

Palavras-chave: esclerotiorina, biotransformação, corantes, alimentos

12

ABSTRACT

The fungus Penicillium sclerotiorum produces a wide variety of secondary

metabolites, among them the sclerotiorin, which has many uses in food and

pharmaceutical industries. Due to its strong orange color, its antioxidant activity and

other functions related to cholesterol reduction and treatment of diabetes, this

substance has been subject of extensive studies in food science. In this project,

substances were produced by esclerotiorin biotransformation with the fungus Beauveria

bassiana. Five new products with strong red color were obtained. The change in

coloration of the molecule was due to the exchange of the oxygen heteroatom attached

to sclerotiorin carbon 1 by a nitrogen atom. The biotransformation experiment was

repeated using, as substrate, 1-methyl-sclerotiorin, a semi-synthetic substance, but the

same results were not obtained. After these results, it was performed a screening with

14 different fungi, besides Beauveria bassiana, to evaluate their capacity to

biotransform sclerotiorin. The extracts were analyzed by HPLC and showed that, from

these 14 fungi, nine were able to transform sclerotiorin molecule in one or more

substance with red color.

Key words: sclerotiorin, biotransformation, colorants, food

13

INTRODUÇÃO

Os fungos podem ser utilizados na indústria de duas maneiras: como agentes

produtores de alguma substância de interesse ou como promotores de reações para a

produção de importantes substâncias, sendo os dois processos conhecidos como,

respectivamente, fermentação e biotransformação. Utilizando-se processos

fermentativos, podem-se obter substâncias de atividades interessantes como anti-

oxidantes, antimicrobianos ou corantes.

Os corantes naturais, isolados de plantas ou micro-organismos, podem

apresentar atividades importantes na indústria farmacêutica e de alimentos. Há

necessidade constante de estudos nessa área, pois grande parte desse potencial

biotecnológico não é explorado.

As biotransformações, por serem regio e estereoespecíficas, são pontos

importantes na produção de variadas substâncias. O uso de micro-organismos para a

promoção de determinada reação causa redução de tempo e custo, pois dispensa o

uso de grandes quantidades de reagentes químicos e controle das condições do meio

reativo. Muitos produtos de biotransformação são utilizados na indústria farmacêutica e

de alimentos.

O objetivo geral do trabalho foi produzir derivados do corante natural fúngico

esclerotiorina que possam posteriormente ser usados como corantes, anti-oxidantes ou

conservantes alimentares.

Os objetivos específicos foram:

Produzir esclerotiorina a partir do cultivo do fungo Penicillium sclerotiorum por

meio de fermentação em meio submerso;

Extrair e purificar a esclerotiorina do meio de cultivo utilizando técnicas

cromatográficas;

Obter derivados da esclerotiorina em reações de síntese com diazometano;

Obter produtos biotransformados da esclerotiorina e de derivados com o

emprego do fungo Beauveria bassiana, visando a produção de azafilonas inéditas;

Avaliar a possibilidade de produção de derivados inéditos da esclerotiorina por

outros fungos presentes na coleção de fungos do LaBβ.

14

REVISÃO DA LITERATURA

2.1 – Biotecnologia

Biodiversidade ou diversidade biológica refere-se à variedade de vida na Terra,

como o resultado de bilhões de anos de evolução, compreendendo um número

extraordinário de plantas, animais e micro-organismos. Embora demasiadamente

afetada pela intervenção humana, a biodiversidade tem fornecido muitos micro-

organismos e moléculas com importantes atividades metabólicas, farmacológicas e

grande valor de mercado. Quando corretamente explorada por países de rica

biodiversidade (usualmente países em desenvolvimento ou subdesenvolvidos), o uso

dos recursos naturais de forma sustentável torna-se ferramenta para a diminuição da

pobreza, beneficiando também o planeta como um todo (Rouhi, 2003). Da extensa

biodiversidade brasileira, somente uma pequena fração de espécies de plantas e

micro-organismos já foi estudada quimicamente (Gottlieb, 1980; Hawksworth, 1991).

Atualmente, a prospecção da biodiversidade tem sido ativamente direcionada ao

desenvolvimento de novos fármacos, em processos dinâmicos de monitoramento da

atividade biológica, bem como para a descoberta de novos micro-organismos para

serem usados em processos industriais visando à produção de alimentos ou aditivos

alimentares (Araujo et al., 2006).

A biotecnologia industrial atua no desenvolvimento de produtos e processos

utilizando seres vivos, ou parte deles, sendo uma área de grande importância na

indústria de alimentos e medicamentos, principalmente quando integrada à prospecção

da biodiversidade (Butler, 2004). Processos fermentativos são utilizados na indústria

química para a produção de solventes, ácidos orgânicos, principalmente os ácidos

cítrico, lático, fumárico e giberélico. Metais diversos, como o cobre, zinco, prata, ouro

ou urânio podem ser extraídos com o emprego de micro-organismos, a partir de

minérios de baixo teor (Borzani et al., 2008).

Os processos biotecnológicos na indústria farmacêutica englobam a produção

de antibióticos, esteróides, vitaminas, aminoácidos, polissacarídeos e várias proteínas.

Modificações na estruturas de esteróides e antibióticos são obtidas com o uso de

micro-organismos que podem proporcionar reações de hidroxilação, hidrogenação,

desidrogenação, hidrólise, esterificação, isomerização, aminação ou ruptura de cadeias

(Borzani et al., 2008).

15

Processos de tratamento biológico dos resíduos (águas residuais, lixo) também

são processos fermentativos. Há, ainda, os processos que tem por objetivo a produção

industrial de micro-organismos que podem ser utilizados como fixadores de nitrogênio

do ar na agricultura (bactérias do gênero Rhizobium), no controle biológico de pragas

(bactérias do gênero Bacillus), na produção de vacinas (Borzani et al., 2008), ou ainda

para produção de massa celular como para produção de fermento biológico (levedura

prensada) ou de levedura forrageira (“single cell protein”).

2.1.1 – Biotecnologia na indústria de alimentos

A produção de alimentos fermentados, principalmente bebidas, representa o

maior uso dos micro-organismos na indústria alimentícia. Há pesquisas consolidadas

onde os melhores parâmetros para este tipo de fermentação são descritos, bem como

tem sido descrita a utilização de resíduos da indústria de alimentos para a produção

destas bebidas (Alvarenga, 2006 e Alvarenga et al., 2008). Os leites fermentados tem

sido alvo de grande número de estudos, devido aos benefícios comprovados destes

alimentos (Gonzáles-Sánchez et al., 2010).

Além disso, destaca-se a produção de vinagres, manteigas, queijos, picles,

chucrute, azeitonas, pão e cacau. Concentrados protéico-vitamínicos são produzidos

através de algas e leveduras do gênero Candida. O enriquecimento protéico de

farinhas e farelos pode ser feito pela ação de bolores (Aquarone et. al., 2008).

Fungos também podem ser utilizados em processos de biorremediação para uso

de água proveniente de indústria de alimentos (Azab, 2000).

2.2 – Fungos

Os fungos são organismos eucariotas, podendo ser unicelulares, como as

leveduras, ou pluricelulares, como os cogumelos, sendo diferenciados dos outros

reinos por possuírem parede celular contendo quitina, e ausência de clorofila (Tortora

et al., 2002). Os fungos filamentosos e leveduras apresentam a vantagem de

crescimento relativamente fácil em processos fermentativos, sendo bem adaptáveis à

produção industrial (Smedsgaard e Nielsen, 2004).

O grande avanço, intrínseco ao uso de fungos e seus metabólitos secundários,

advém de múltiplos fatores, como a relativa facilidade de produção do metabólito ativo

por fermentação; a concomitante pronta possibilidade de um scale up do processo

16

fermentativo; o fato de que mesmo espécies comuns de fungos, como aquelas dos

gêneros Penicillium e Aspergillus, conhecidos por sua ubiqüidade, produzem

metabólitos bioativos (Takahashi e Lucas, 2008). A produção de antibióticos por fungos

tem algumas características, comuns à produção de outros metabólitos secundários: a

produção do metabólito é específica da linhagem; há uma instabilidade no processo

biossintético, com tendência a uma diminuição com repiques sucessivos usados para a

manutenção das linhagens; a produção de antibióticos segue uma cinética de

crescimento fúngico associado a um meio de cultura específico (Wijeratne et al., 2004);

o aumento da produtividade freqüentemente ocorre na etapa de esporulação do micro-

organismo; e a variedade estrutural dos metabólitos biossintetizados pode ser

aumentada com pequenas variações das condições de cultivo (Takahashi e Lucas,

2008).

Fungos do filo Basidiomycota e Ascomycota sempre foram utilizados na

alimentação humana, principalmente nos países orientais. Estudos sobre o perfil

nutricional de fungos filamentosos mostram que a biomassa de alguns fungos inferiores

apresenta alto teor de proteínas, com destaque para Penicillium sclerotiorum,

Penicillium janthinellum, Syncephalastrum racemosum e Rhizopus stolonifer. Fungos

da espécie Penicillium sclerotiorum, P. citrinum e P. pinophillum apresentam boa

relação entre ácidos graxos poliinsaturados e saturados, podendo ser considerados

alimentos saudáveis (Carvalho, 2009).

2.2.1 – Metabólitos secundários

Metabólitos secundários são diferenciados dos primários por não participarem

das reações básicas fundamentais à sobrevivência dos micro-organismos. São

geralmente bioativos, de baixa massa molecular e são produzidos como famílias de

compostos em partes restritas do ciclo de vida, geralmente na fase exponencial do

crescimento fúngico, com a produção geralmente correlacionada a um estado

específico de diferenciação morfológica (Keller et al., 2005). Além das plantas,

apresentam metabolismo secundário alguns micro-organismos como as bactérias

filamentosas, as bactérias formadoras de esporos e os fungos filamentosos.

Peptídeos, alcalóides, terpenos e policetídeos são grupos representativos de

metabólitos secundários (Figura 1).

17

Figura 1 – Classes de metabólitos secundários fúngicos (adaptado de Keller et al.

2005)

18

Considerando os vinte medicamentos mais prescritos atualmente, seis são

substâncias provenientes do metabolismo secundário de fungos. Levando-se em conta

que apenas 5% dos fungos estão descritos, há um potencial muito grande a ser

explorado. A busca de metabólitos secundários deve ser feita levando em conta que

sua síntese pode corresponder ao nicho ecológico do fungo e que a interação entre

metabólitos pode induzir um aumento de sua produção (Schulz et al. 2002).

O primeiro produto cristalino considerado um metabólito bioativo foi o ácido

micofenólico, isolado de Penicillium glaucoma, em 1896, por Gosio. Alguns produtos do

metabolismo de fungos tem sido usados na prática de diferentes maneiras como, pela

aplicação direta do produto na medicina, agricultura ou indiretamente, usando-se o

produto original como material de partida para subseqüente modificação química ou

microbiológica (biotransformações), ou utilizando-o como composto principal para

sínteses químicas de novos análogos (Bérdy, 2005).

A grande maioria dos metabólitos bioativos produzidos por fungos vem de

espécies da classe dos ascomicetos e outros fungos filamentosos, além de espécies

endofíticas (fungos que vivem associados a plantas). Algumas espécies de

basidiomicetos vem sendo estudadas, como o caso do Mycena leaiana, um fungo

superior de coloração laranja, cuja substância responsável pela cor apresenta atividade

antibiótica. O número total de substâncias bioativas conhecidas produzidas por fungos

é de aproximadamente 8600, representando 38% de todos os produtos microbianos

(Brizuela et al. 1998; Bérdy, 2005).

Alguns fungos são capazes de produzir metabólitos secundários, muitos dos

quais são tóxicos e mesmo cancerígenos tanto para o homem, como para os animais.

Fungos que crescem nos alimentos, produtores de metabólitos tóxicos, são chamados

toxigênicos e os metabólitos são denominados micotoxinas (Sabino et al., 1982).

Entre as micotoxinas de grande interesse para a Saúde Pública e de importância

agroeconômica estão as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, zearalenona,

fumonisinas e os alcalóides do ergot. Uma única espécie de fungo é capaz de produzir

uma ou várias micotoxinas, e uma mesma micotoxina pode ser produzida por

diferentes espécies de fungos (Hussein e Brasel, 2001).

2.2.2 – Azafilonas

Os policetídeos fúngicos podem variar de tetracetídeos a octacetídeos, tendo

entre 4 ou 8 unidades C2 que contribuem para a cadeia policetídica. Alguns são

produzidos por biosíntese mista, podendo envolver a rota da síntese dos aminoácidos

19

ou terpenóides. Esta classe inclui as antraquinonas, hidroxiantraquinonas,

naftoquinonas e azafilonas, cada uma contendo grande variedade de cores (Mapari et

al. 2010).

As azafilonas são um grupo de substâncias que geralmente apresentam

coloração forte. Pertencem a uma classe de metabólitos secundários estruturalmente

diversa, com uma estrutura pirona-quinona, contendo um anel bicíclico altamente

oxigenado e um centro quaternário quiral (Osmanova et. al., 2010).

Azafilonas exibem uma ampla gama de interessantes atividades biológicas,

como atividade antibacteriana, antiviral, antifúngica, antioxidante, citotóxica, nematicida

e antiinflamatória. A potente atividade não seletiva das azafilonas pode estar

relacionada à formação de γ-piridonas (Osmanova et. al., 2010).

A maioria das espécies produtoras de azafilonas são pertencentes aos gêneros

Penicillium, Monascus, Chaetomium e Talaromyces (Osmanova et. al., 2010).

Musso e colaboradores investigaram a capacidade de inibição da proteína

molecular Hsp90 por azafilonas sintetizadas por Bulgaria inquinans, Monascus

purpureus e Arpergillus deflectus, assim como seus derivados semi-sintéticos. A

proteína Hsp90 atua na proliferação celular e sua inibição pode ser benéfica no

tratamento do câncer (Musso et al. 2010).

2.3 – Penicillium sclerotiorum

Muitas espécies do gênero Penicillium possuem a capacidade de produzir

substâncias bioativas, como a xestodecalactona, que possui propriedades antifúngicas

(Edrada et al., 2002) e a metil-acetal-atrovenetinona, substância com atividade anti-HIV

(Shiomi et al., 2005).

Penicillium sclerotiorum é um micro-organismo mesófilo, de coloração

esverdeada, com aspecto cotonoso. Está presente em solos, porém, já foi isolado do

interior da planta Garnicia atroviridis (Figura 2), podendo, portanto, ser também

classificado como fungo endofítico. Os extratos isolados com hexano e acetato de etila

de P. sclerotiorum apresentam atividade antimicrobiana e anti-HIV.

A investigação química dos extratos de P. esclerotiorum levou à identificação

das seguintes azafilonas: penicilazafilona A (13) e B (14) e decloroisocromofilona III

(15), além de outras substâncias: penicilisorina (16), 2,4-di-hidroxi-6-(5,7S-dimetil-2-

oxo-trans-3-trans-5-nonadienil)-3-metilbenzaldeído (17), ácido (2E,4E,6S)-4,6-di-

20

metilocta-2,4-dienóico (18) e (5S,6R)-5,6-di-hidro-3,5,6-trimetilpiran-2-ona (19)

(Arunpanichlert et al., 2010). Porém, o constituinte em maior concentração nos extratos

de P. sclerotiorum é a azafilona esclerotiorina (20) (Arunpanichlert et al., 2010). Lucas e

colaboradores descreveram estudos sobre a atividade antimicrobiana de três

substâncias isoladas dos extratos de P.sclerotiorum, pencolídeo (21), isocromofilona VI

(22), além da esclerotiorina (20). As estruturas moleculares se encontram

representadas na Figura 3 (Lucas et. al., 2007; Arunpanichlert et. al., 2010).

Fonte: The Plant Observatory, 2010

Figura 2 – Fruto de Garcinia atroviridis

Figura 3 – Metabólitos secundários isolados de P. sclerotiorum

21

Espécies do gênero Penicillium, além da produção de metabólitos, possuem um

longo histórico de uso biotecnológico na produção de enzimas. Knob e Carmona

descreveram uma β-xilosidase com grande atividade extraída de P. sclerotiorum. Esta

enzima degrada a xilana, a mais abundante fonte de carbono não-celulósica presente

em madeira e resíduos agroindustriais. A adição desta enzima a rações animais pode

aumentar seu valor nutritivo. Outro uso seria na clarificação e maceração de sucos e

vinho (Knob e Carmona, 2009).

Penicillium sclerotiorum também é relatado na literatura como útil em alguns

experimentos de biotransformação, como a dimerização do herbertenediol (23), para

formar mastigoforenos A (24) e B (25), como é mostrado na Figura 4 (Harinantenaina

et. al., 2005).

Figura 4 – Dimerização do herbertenediol

2.3.1 – Esclerotiorina

O constituinte químico predominante em P. sclerotiorum é a esclerotiorina (20),

pigmento contendo um átomo de cloro. A esclerotiorina (20) foi primeiramente isolada

em 1940 por MacCurtin (MacCurtin e Reilly, 1940). Estudos vêm mostrando que este

pigmento possui algumas atividades biológicas interessantes, como a indução de

formação de clamidosporo, célula hifal que se comporta como esporo no fungo, de

maior resistência térmica (Weng et al., 2004).

O

O

Cl

O

O

O

20

Figura 5 – Estrutura molecular da esclerotiorina

22

A esclerotiorina (20) tem tido aplicações importantes na indústria de alimentos,

como, por exemplo, a inibição da lipoxigenase. Esta enzima catalisa a oxidação regio e

estereoespecífica de ácidos graxos contendo um sistema cis,cis-1,4-pentadieno,

formando hidroperóxidos. A peroxidação de ácidos graxos provoca a rancificação de

alimentos oleoginosos e gorduras de origem vegetal e animal, alterando o sabor, odor,

coloração e reduzindo seu valor nutritivo. Em mamíferos, os produtos das reações

catalisadas pela lipoxigenase são responsáveis por uma grande variedade de

desordens, como aterosclerose, alergias, inflamação, asma e hipersensibilidade. Por

esse motivo, inibidores da lipoxigenase podem ser usados tanto em indústria de

alimentos, como antioxidantes; ou em setores de saúde, graças a seus benefícios

farmacológicos (Chidananda e Sattur, 2007).

Sabe-se também que a esclerotiorina (20) é capaz de inibir a proteína de

transferência de colesterol esterificado (CETP). A CETP é conhecida por transferir

colesterol esterificado entre as lipoproteínas do plasma. Vários fatores indicam a

importância desta proteína no desenvolvimento da aterosclerose, pois ela diminui a

concentração do colesterol nas lipoproteínas de alta densidade (HDL). Pessoas com

deficiência genética de CETP possuem alto HDL, baixos níveis de lipoproteína de baixa

densidade (LDL) e apresentam baixa incidência de aterosclerose (Tomoda et al., 1999).

Outra atividade importante da esclerotiorina (20) é a inibição da enzima aldose

redutase, uma oxiredutase dependente de NADPH que catalisa a conversão de glicose

em álcool, e promove acúmulo de sorbitol em vários tecidos, quando em condições de

hiperglicemia, como é o caso da diabetes mellitus. Este nível elevado de sorbitol pode

levar a várias complicações como retinopatia, catarata, neuropatia e nefropatia. Os

inibidores da aldose redutase podem reverter essa mudança bioquímica ou até prevenir

estas complicações (Chidananda et al., 2006).

Além dos possíveis usos na área de alimentos, estudos mostram várias outras

atividades farmacológicas interessantes da esclerotiorina (20), como a inibição da

monoamina oxidase, alvo da ação de antidepressivos; inibição do receptor de

endotelinas, responsável pela vasoconstrição e fibrose de vasos sanguíneos; ou até

mesmo sua atividade antibacteriana (Pairet et al., 1995; Weng et al., 2004). Estudos

mais recentes mostram uma atividade inibidora da protease e invertase do HIV

(Arunpanichlert et al., 2010).

23

2.4 – Corantes naturais

Um corante natural é definido como um pigmento que é sintetizado e acumulado

ou excretado a partir de células vivas. Certos pigmentos, assim como fenóis oxidados e

outros derivados mais simples de fenóis podem ser formados até mesmo por células

em processo de morte (Hendry, 1996).

A presença ou ausência de coloração de uma molécula biológica é determinada

por sua estrutura, principalmente a estrutura eletrônica, o tamanho da molécula,

solubilidade e a composição elementar. Algumas alterações na estrutura de molécula

incolores podem fazer com que ela absorva energia em comprimentos de onda menos

energéticos, e consequentemente, dão cor à substância. Esta alteração é chamada de

mudança batocrômica e pode ser causada por seis modificações estruturais: aumento

do tamanho da cadeia, ramificação da cadeia carbônica, rearranjo em um simples anel,

adição de nitrogênio ou oxigênio, ligação de dois ou mais anéis e adição de certos

metais de transição. Moléculas que já possuem coloração, ao sofrerem uma mudança

batocrômica, podem ter sua coloração alterada (Hendry, 1996).

Fungos filamentosos, particularmente ascomicetos e basidiomicetos, e liquens

são conhecidos por sintetizarem e secretarem diversas classes de pigmentos, como

metabólitos secundários, que possuem uma extraordinária gama de cores. Cogumelos

e liquens são difíceis de cultivar em laboratório, e, consequentemente, difíceis de

extrapolar a produção de seus metabólitos para escala industrial. Muitos ascomicetos,

ao contrário, são adequados à produção industrial pela facilidade de crescimento em

laboratório. O controle das condições de cultivo em biorreatores minimiza as variações

entre lotes (Mapari et al. 2010).

Diferentemente das plantas, fungos não produzem clorofilas e poucas espécies

são produtoras de carotenos. Algumas espécies fúngicas acumulam substâncias

pigmentadas que, em geral, estão ausentes ou presentes somente em baixas

concentrações em espécies de outros reinos, como é o caso da riboflavina (vitamina

B2), que proporciona a coloração amarela a fungos dos gêneros Russula e Lyophyllum.

Os únicos pigmentos comuns entre fungos e plantas ou animais são as betalaínas,

melaninas, um pequeno número de carotenóides e algumas antraquinonas (Hendry,

1996).

Os pigmentos policetídeos são encontrados predominantemente nos

ascomicetos, e em alguns basidiomicetos. Além desses, as terfenilquinonas e outros

24

derivados fenólicos, como os derivados dos ácidos fenilpropanóico e cinâmicos

também são responsáveis pela coloração de alguns fungos (Hendry, 1996).

Os corantes sintetizados por fungos apresentam diversas funções, variando de

proteção contra foto-oxidantes letais, como os carotenóides, proteção contra o estresse

ambiental, como as melaninas, ou até agindo como cofatores em catálises enzimáticas,

como o caso das flavinas (Mapari et al. 2005).

A Figura 6 apresenta a estrutura de algumas classes de corantes produzidos por

fungos, o β-caroteno (26), um carotenóide, a monascina (27), um policetídeo e o ácido

leprarínico (28), uma terfenilquinona.

Figura 6 – Corantes produzidos por fungos (adaptado de Hendry, 1996)

2.4.1 – Corantes naturais usados em alimentos

Corantes utilizados em alimentos são chamados aditivos de cor. Segundo o

FDA, aditivo de cor é qualquer corante, pigmento ou substância que, quando

adicionado ou aplicado a um alimento, droga ou cosmético, ou até ao corpo humano, é

capaz de, sozinho, ou através de reações com outras substâncias, transmitir cor (FDA,

2010).

Aditivos de cor são utilizados em alimentos por muitas razões: para encobrir a

perda de cor devido à exposição à luz, ar, temperaturas extremas, umidade e

condições de estocagem; para corrigir variações naturais na cor; para melhorar cores

que existem naturalmente e para prover cor a alimentos sem cor. Refrigerantes de cola,

margarina e balas de menta são exemplos de alimentos que possuem a coloração

devido ao uso de aditivos (FDA, 2010).

25

A preferência dos consumidores por corantes extraídos de fontes naturais está

associada à imagem de serem produtos saudáveis e de boa qualidade. Corantes

sintéticos tendem a ser julgados como indesejáveis e prejudiciais. Alguns são

considerados responsáveis por reações alérgicas e intolerâncias (Blenford, 1995).

Os corantes naturais mais utilizados estão listados na Tabela 1:

Tabela 1 – Corantes naturais autorizados e suas principais fontes (adaptado de

Mapari et. al., 2005)

Pigmento Fonte Gama de cor

Ácido carmínico e carmina Cochonilha fêmea – inseto do

Peru e Equador

Laranja a vermelho

Rosa a vermelho

Antocianinas Sabugueiro, uva, cenoura roxa,

repolho

Rosa/vermelho a

azul/malva –

dependente do pH

Betanina Beterraba Rosa a vermelho

Caramelo Carboidratos comestíveis Marrom

Carbo medicinalis Planta Preto

Carotenóides

β-caroteno Óleo de palma Amarelo a laranja

Bixina ou norbixina Sementes de urucum (Bixa

orellana) da América do Sul

Laranja

Capsantina e

capsorubina

Páprica (Capsicum annum L.) Laranja avermelhado

Licopeno Tomate (Lycopersicum

esculentum)

Vermelho alaranjado

Luteína Malmequer (Tagestas erecta) Amarelo dourado

Cantaxantina Salmão, camarão e flamingos Rosa alaranjado

Clorofila Grama, luzerna e urtiga Verde a oliva

Clorofilina (complexo

cúprico da clorofila)

Grama, luzerna e urtiga Verde azulado

Curcumina Rizoma de planta (Curcuma

longa) da Índia

Laranja-amarelo

Riboflavina Semi-sintética, usando ribose

produzida por fermentação

bacteriana

Amarelo

26

Os corantes naturais que são atualmente autorizados para uso na União

Européia são derivados de variadas fontes, de plantas a insetos, como o caso do ácido

carmínico, derivado da cochonilha, um inseto da família Dactylopiidae. A atual

produção de corantes naturais depende do suprimento externo e sazonal de diversos

materiais, resultando em variações no perfil do pigmento extraído. Como os corantes

são extraídos de fontes naturais, eles são, na maioria dos casos, misturas de

composição variada que dependem do cultivar e das condições climáticas, e são

difíceis de serem caracterizados no que diz respeito à pureza e presença de

contaminantes (Mapari et al. 2010).

Há uma grande variação na estabilidade e funcionalidade de diferentes classes

de corantes naturais existentes. Problemas de estabilidade perante aquecimento, luz e

pH limitam a aplicação de certos corantes a certos tipos de produtos. Antocianinas são

flavonóides e são caracterizadas por uma estrutura catiônica básica. A cor violeta

básica de antocioaninas é sensível à oxidação, branqueando com dióxido de enxofre, e

variando com o pH, o que limita a sua aplicação a alimentos ácidos e bebidas. A Figura

7 representa as mudanças na estrutura de antocionanidinas que resultam na mudança

da coloração. Betaninas, carotenóides e pigmentos de clorofila são facilmente

descoloridos por oxidação, sendo sensíveis à luz, ao aquecimento e ao oxigênio. O

corante curcumina apresenta um problema diferente, pois este pigmento carrega um

sabor picante, o que limita o seu uso como corante (Mapari et. al., 2005).

27

O

OAçúcar

OH

HO

R

R'

OH

O

OAçúcar

OH

O

R

R'

OH

O

OAçúcar

OH

HO

R

R'

OH

OH O

OAçúcar

OH

O

R

R'

O-

O

OAçúcar

O-

O

R

R'

O-

O-

OAçúcar

O-

-O

R

R'

O-

O

H+

OH-

-H 2O

+H 2O

H+ OH-

-H2O +H2O

H+ OH-

OH-H+

H+

OH-

pH 1-2

cátion flavílico, vermelho

pH 6,5-8

anidrobase, violeta

anidrobases, azul

pH 9-12

pH<6

carbinol, incolor

pH 13-14

pseudobase chalcona, amarelo

29 30

3132

3334

Figura 7 – Possíveis mudanças estruturais das antocioanidinas em meio aquoso

em função do pH (Terci e Rossi, 2002)

Estudos sobre corantes produzidos por fungos visam a sua utilização em

alimentos. Na República Checa, um novo corante de alimentos chamado Arpink RedTM

(35), uma antraquinona produzida por Penicillium oxalicum, foi liberado para

comercialização entre 2004 e 2006. Fungos do gênero Monascus são utilizados no sul

da China, Japão e sudeste da Ásia para produzir vinho vermelho de arroz, queijo de

soja vermelho e Anka (arroz vermelho). Estes fungos são conhecidos por produzirem

pigmentos que variam do laranja ao violeta, além das monascusonas A (36) e B (37),

pigmentos amarelos descobertos recentemente. Estes pigmentos, além do corante de

alimentos Arpink RedTM (35) estão representados na Figura 8. Entretanto, algumas

cepas de Monascus também produzem citrinina, uma micotoxina, o que limita o seu

28

uso na área de alimentos. No Japão, apenas a espécie Monascus purpureus é

autorizada para uso em alimentos (Mapari et. al., 2005 e Mapari et. al., 2010).

Figura 8 – Estrutura básica do corante Arpink Red e estruturas das

Monascusonas A e B

A toxicidade de outros policetídeos produzidos por fungos, principalmente do

gênero Monascus, têm sido pesquisada. O pigmento amarelo ankaflavina (38) e seu

análogo estrutural, monascina (39) (representados na Figura 9), apresentam baixa ou

nenhuma citotoxidade para células, o que indica que são substâncias seguras, se

consumidas em doses apropriadas (Mapari et. al., 2010).

Figura 9 – Estruturas da Ankaflavina e Monascina

Corantes vermelhos e amarelos tem sido amplamente usados em alimentos,

porém ainda há uma demanda de corantes azuis. Os ascomicetos são capazes de

produzir policetídeos que variam do vermelho ao amarelo, e até mesmo verde e azul.

29

Muitos destes corantes apresentam atividade anti-oxidante e anti-aterogênica, e alguns

já possuem estudos sobre sua toxicidade. Além de alguns policetídeos produzidos por

Monascus, corantes laranjas extraídos de P. aculeatum e corantes amarelos extraídos

de E. nigrum são potencialmente seguros. Porém, grande parte dos corantes

estudados são instáveis à luz, o que pode degradar a coloração apresentada (Mapari

et. al., 2010).

2.5 – Biotransformações

Transformações microbianas ou biotransformações representam uma série de

reações biológicas, geralmente de xenobióticos, substâncias estranhas para o

organismo, catalisadas por células íntegras ou enzimas isoladas. Devido à sua alta

regio e estereosseletividade, transformações microbianas complementam sínteses

orgânicas e tem sido muito aplicadas na indústria farmacêutica e de alimentos. As

reações de biotransformação, especialmente aquelas que utilizam fungos, também tem

sido usadas como modelos in vitro do metabolismo mamífero de uma variedade de

compostos bioativos e drogas (Rai, 2009).

As biotransformações podem ser realizadas por bactérias, fungos, leveduras e

plantas, e podem envolver diferentes enzimas, como oxigenases, redutases e

hidratases (Duetz et al., 2003; Palmqvist et al., 2006).

Biotransformações tem sido usadas na indústria de alimentos para diversos fins.

Por exemplo, as catequinas do chá são naturalmente convertidas em teaflavinas

durante o seu processamento, através da enzima polifenol oxidase. As teaflavinas são

substâncias bioativas, com alta atividade antioxidante, além de propriedades

antimutagênicas e antiinflamatórias, e aumentam a qualidade da bebida. Esta

conversão acontece naturalmente, porém, pode ser feita com maiores rendimentos

utilizando extratos de planta contendo a enzima ou até mesmo utilizando a enzima

purificada (Sharma et al., 2009).

Outro exemplo é a obtenção de compostos de aroma a partir de carotenóides. A

clivagem da molécula de carotenóides é obtida através de degradação térmica,

fotoxigenação ou autoxidação, o que gera a formação de compostos de aroma. Esta

clivagem também pode ser obtida através do sistema enzimático de dioxigenases de

micro-organismos ou plantas (Uenojo et al., 2007).

30

2.5.1 – Beauveria bassiana

Beauveria bassiana é um fungo filamentoso de ocorrência global em solos.

Como um agressivo fungo entomopatogênio e parasita, ele é causador da doença

muscardina em insetos. O fungo prolifera no corpo do inseto, produzindo toxinas, como

a beauvericina, que enfraquece o sistema imune do hospedeiro, eventualmente

matando-o (Rai, 2009).

Beauveria bassiana tem sido frequentemente empregado em estudos de

biotransformação devido a seu eficiente sistema enzimático, ampla aceitabilidade de

substratos e sua capacidade de realizar diferentes tipos de reação. Tem sido relatado

que este fungo é capaz de biotransformar mais de 300 tipos diferentes de substratos

(Rai, 2009).

Beauveria bassiana é um importante catalisador microbiano, o segundo micro-

organismo mais frequentemente usado como biocatalisador, atrás somente do

Aspergillus niger, e suas aplicações são superadas somente por A. niger,

Pseudomonas putida e Saccharomyces cerevisiae (Rai, 2009).

As principais reações catalisadas por Beauveria bassiana são descritas a seguir.

Os exemplos também representam as principais reações de biotransformação

realizadas por fungos (Rai, 2009).

Redução

Uma variedade de reduções catalisadas por fungos é conhecida, sendo que a

mais comum é a redução do grupo carbonila. A Figura 10 representa a redução

assimétrica do naftalenan-6-ona (40) por B. bassiana (Rai, 2009).

O

O

O O

O

OH O

O

OH

40 41 42

Figura 10 – Redução assimétrica do naftalenan-6-ona por B. bassiana

Oxidação

Alguns estudos sobre oxidação biocatalítica tem sido focados em reações de

sulfoxidação. A Figura 11 representa a oxidação da benzidrilsulfanil acetamida (43)

levando ao isômero R do modafinil (44), catalisada por Beauveria bassiana. Modafinil é

31

um fármaco neurotrópico autorizado para uso nos Estados Unidos para o tratamento da

narcolepsia e apnéia do sono (Rai, 2009).

S

NH2

O

S

NH2

OO

43 44

Figura 11 – Oxidação da benzidrilsulfanil acetamida por B. bassiana

Hidroxilação

Hidroxilação microbiana é uma das reações de biotransformação mais comuns e

importantes. Baseia-se na introdução regio e estereosseletiva de um grupo hidroxila em

um carbono não ativado, o que é difícil de se obter pelos métodos químicos

tradicionais. A Figura 12 representa a hidroxilação de um derivado éster do

adamantano (45) por Beauveria bassiana (Rai, 2009).

O

O

O

O

OH

45 46

Figura 12 - Hidroxilação de um derivado do adamantano por B. bassiana

Glicosilação

A inserção de uma molécula de glicose e, principalmente, a inserção de um

grupo 4’-O-metil-glicose é uma típica reação catalizada por B. bassiana. A Figura 13

mostra a glicosilação do composto CGP-62706 (47) por este fungo. Este composto é

um potente inibidor da tirosina quinase, enzima que transfere um grupo fosfato a um

resíduo de tirosina de uma proteína, e deste modo, regulando importantes funções no

corpo, como a abertura de canais iônicos e a expressão gênica (Rai, 2009).

32

N N

HN HN Cl

N N

HN HN Cl

4'-O-Metil-glicose

O

47

48

Figura 13 – 4´-O-metil-glicosilação do composto CGP-62706 por B. bassiana

Hidrólise

Hidrólise de ésteres e epóxidos são relatadas para Beauveria bassiana. A Figura

14 representa a desacetilação do composto CGP-291 (49), um agente antiprotozoário

(Rai, 2009).

N N

N

NO2N

O O

N NH

N

NO2N

O

49 50

Figura 14 – Hidrólise do composto CGP-291 por B. bassiana

Acetilação

A Figura 15 representa a biotransformação da 3,4-dicloroanilina (51) pelo B.

bassiana (Rai, 2009).

Cl

Cl

NH2 Cl

Cl

HN

O51 52

Figura 15 - Acetilação da 3,4-dicloroanilina pelo B. bassiana

33

Desmetilação

A Figura 16 representa a degradação do herbicida Diuron (53), através de

desmetilações. Os produtos formados são menos tóxicos do que o herbicida e, por esta

razão, o B. bassiana pode ser utilizado para recuperação de solos contendo este

produto tóxico (Rai, 2009).

Cl

Cl

HN N

O

Cl

Cl

HN

HN

O

Cl

Cl

HN NH2

O

53 54 55

Figura 16 – Produtos formados pela desmetilação do Diuron por B. bassiana

34

MATERIAL

A maior parte dos materiais utilizados no desenvolvimento do projeto se

encontra no LaβB, Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios, do Departamento de

Química da UFMG.

As análises de RMN, CLAE e as análises elementares foram feitas no

Departamento de Química da UFMG. A identificação do fungo foi feita no Laboratório

de Micologia, do Instituto de Ciências Biológicas. As análises por espectrometria de

massas foram feitas na Central Analítica, USP. Os fungos utilizados fazem parte da

coleção de fungos do LaβB.

Equipamentos:

Espectrômetro Bruker Avance DRX400 e DPX200 – foram utilizados para

registrar espectros de RMN

PE 2400 CHN Elemental Analyzer – foi utilizado para análise elementar

HPLC Shimadzu prominence LC-20AT

Espectometro de massas Burker Daltonics modelo MicroTOF lc

Espectômetro de massas MicroMass Waters Q-TOF-Micro

Infravermelho Perkin Elmer Spectrum BX

Ultravioleta B-380 Micronal

Ponto de fusão Gehaka modelo PF 1000, série 0530/06001020

Autoclave vertical Fanen, modelo 415/3, série J03610

Balança analítica Quimis, modelo Q-ILA2104, 210g/ 0,1mg

Balança eletrônica Digimed KN1000C, classe de exatidão II, série 04G6

Bomba de vácuo e pressão Tecnal TE-0581

Estufa de secagem Fanen Ltda Modelo 002 CB

Estufa para placa cromatográfica Quimis G-317 8122

Evaporador rotativo Fisatom Modelo 803

Capela VECO, modelo JLF 912, série FL 5799

Refrigerador Nuaire -86ºC Ultralow Freezer

Câmera fotográfica Sony Cyber-shot 7.2 mega pixels

Microondas Master Cooking CCE M-500

Mili-Q Plus Milipore Qpak 1 CPMQ004R1

35

Micropipeta automática Digipet 1-5 mL

Micropipeta automática Digipet 20-200 µL

Incubadora de bancada Cientec CT-712

Microscópio eletrônico Olympus CX 40

Coluna cromatográfica de vidro de 5cm de diâmetro e 100cm de altura

Coluna cromatográfica de vidro de 1,5cm de diâmetro e 100cm de altura

Reagentes e meios de cultura:

D-glicose

Peptona bacteriológica

Fosfato de potássio dibásico

Cloreto de sódio

Ágar batata dextrosado

Extrato de levedura

Sulfato de magnésio hepta-hidratado

Hidróxido de sódio

N-methyl-N-nitroso-p-toluenosulfonamida – Diazald

Acetato de etila

Diclorometano

Hexano

Álcool metílico

d-clorofórmio

Metanol grau HPLC

Acetonitrila grau HPLC

Termômetro Incoterm, série 313675

Sílica gel 60G (Vetec) para cromatografia em camada delgada

Sílica gel (Vetec 70-230 mesh) pra cromatografia em coluna

Sílica gel (Sigma 230-400 mesh) para cromatografia em coluna flash

Preparo de meios de cultura:

Meio base 1 (Lucas et al., 2007)

Os ingredientes listados na Tabela 2 foram dissolvidos em quantidade suficiente de

água para alcançar a concentração desejada. A solução obtida foi transferida para

recipiente adequado e esterilizado em autoclave vertical a 121 ºC por 15 min.

36

Tabela 2 – Meio de cultura utilizado no crescimento de Penicillium sclerotiorum

Ingrediente Concentração (g.L-1)

Glicose 20

Peptona de carne bacteriológica 5

Fosfato de potássio monobásico 1

Cloreto de sódio 5

Sulfato de magnésio hepta-hidratado 0,5

Meio base 2

O meio base 2 foi preparado conforme descrito para o meio base 1, porém,

utilizando 50% da concentração dos ingredientes. A solução obtida foi transferida para


Meio base 3 (Martins, 2009)

Os ingredientes listados na Tabela 3 foram dissolvidos em quantidade suficiente de

água para alcançar a concentração desejada. A solução obtida foi transferida para


Tabela 3 – Meio de cultura utilizado no crescimento de Beauveria bassiana

Ingrediente Concentração (g.L-1)

Glicose 20

Peptona de carne bacteriológica 10

Extrato de levedura 0,5

Ágar batata dextrosado

Foi preparado segundo instruções do fabricante. Em um béquer foram

adicionadas quantidades de ágar batata dextrosado e água suficientes para alcançar a

concentração de 39 g.L-1. Este béquer foi aquecido em forno de microondas até fusão

do ágar. A preparação obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em

autoclave vertical a 121 ºC por 15 min.

Ágar Sabouraud

Foi preparado segundo instruções do fabricante. Em um béquer foram

adicionados ágar sabouraud e água para alcançar a concentração de 65 g.L-1. Este

béquer foi aquecido em microondas até garantir total fusão do ágar. A preparação

37

obtida foi transferida para recipiente adequado e esterilizada em autoclave vertical a

121 ºC por 15 min.

Preparo de diazometano (Hudlicky, 1980)

Em um balão de fundo redondo, foram adicionados 200 mL de etanol P.A. e 100

mL de hidróxido de sódio a 10%. Em um funil de separação foram adicionados 10,4 g

de Diazald diluídos em 80 mL de éter etílico P.A.. Conforme a montagem (Figura 17), a

solução etérea foi gotejada no balão lentamente, devido ao risco de explosão, em

temperatura controlada de 60 ºC. O diazometano, diluído em éter etílico, foi recolhido

em um erlenmeyer.

Figura 17 – Montagem das vidrarias na preparação de diazometano

Preparo de solução de esclerotiorina 20 mg.mL-1:

Em uma proveta de 10 mL, foram dissolvidos 200 mg de esclerotiorina em 10 mL

de acetato de etila.

38

MÉTODOS

4.1 – Manutenção dos micro-organismos

Os fungos da coleção do LaβB são armazenados como uma suspensão de

esporos em glicerol 12% a -86 ºC. Os fungos a serem utilizados foram retirados do

armazenamento, transferidos para geladeira (a 8 ºC) onde permaneceram por dois

dias. Em seguida, retirou-se uma alíquota desta suspensão e inoculou-se em uma

placa de Petri contendo ágar batata dextrosado (Takahashi et al., 2008).

4.2 – Preparo do extrato de Penicillium sclerotiorum

Um pedaço do cultivo do Penicillium sclerotiorum no ágar em placa de petri foi

recortado e transferido para um tubo contendo ágar batata dextrosado inclinado. Após

três dias, a biomassa do fungo foi retirada do meio inclinado por meio de raspagem

com alça de platina, utilizando água esterilizada e inoculado em erlenmeyer de 250 mL

contendo 100 mL de meio base 1.

Este erlenmeyer foi mantido sob agitação em agitador rotatório a 100rpm, a

temperatura ambiente durante 3 dias, e após crescimento, o conteúdo foi transferido

para erlenmeyers de maior capacidade, totalizando 7 litros de meio base 2. O

crescimento ocorreu durante 21 dias, à temperatura ambiente, sem agitação.

Após o crescimento e consequente produção de esclerotiorina, o micélio foi

separado do meio de cultura através de filtração a vácuo em funil de Buchner,

utilizando filtros com poros de 14 µm. Foi adicionado acetato de etila nas duas partes:

no micélio, quantidade suficiente para cobrir o fungo e emergi-lo em todo o solvente e,

na parte líquida, quantidade relativa a 30% do volume de meio de cultura. O micélio foi

deixado em contato com o acetato de etila por 15 min, para extrair a esclerotiorina que

também estava presente nesta parte. A parte líquida foi transferida para um funil de

decantação, sendo separada a fase aquosa da fase orgânica, esta última contendo os

metabólitos secundários desejados. A fase orgânica foi reservada e procedeu-se a

extração da fase aquosa com acetato de etila por mais duas vezes.

39

Todas as frações orgânicas obtidas, juntamente com o solvente que havia sido

deixado em contato com o micélio, foram reunidas e concentradas em evaporador

rotativo, a 65 ºC, utilizando vácuo.

4.3 – Purificação da esclerotiorina

A presença de esclerotiorina (20) no extrato foi comprovada por cromatografia

em camada delgada (CCD), sendo purificada por cromatografia em coluna de sílica. O

extrato foi solubilizado em diclorometano, e a esta solução foi incorporada uma

quantidade de sílica que ocupasse aproximadamente o mesmo volume de extrato

utilizado. Após a evaporação do solvente, feita em evaporador rotativo a 50 ºC, a sílica

contendo o extrato e foi adicionada lentamente ao topo da coluna.

A partir daí, foi dado início ao processo de eluição, retirando-se frações de 250

mL. A ordem dos eluentes utilizados encontra-se listada na Tabela 4. Cada fração

retirada da coluna foi evaporada em evaporador rotativo a 65 º C, utilizando vácuo.

Tabela 4 – Eluentes utilizados na coluna cromatográfica de purificação da

esclerotiorina

Fração Eluente

1 Hexano

2 a 3 Hexano + Diclorometano 85:15



8 a 14 Diclorometano

15 a 16 Diclorometano + Acetato de etila 97:3

17 a 20 Diclorometano + Acetato de etila 95:5

21 a 22 Metanol

Procedeu-se à análise de cada fração por cromatografia em camada delgada

comparativa, constatando-se que as frações 11 a 16 continham esclerotiorina (20) em

boa quantidade, porém a amostra resultante da combinação destas frações ainda não

estava pura. Deste modo, procedeu-se a uma cromatografia em coluna flash. Esta

técnica é feita utilizando pressão na coluna e a eluição é isocrática (Still et al., 1978). O

eluente escolhido foi diclorometano/acetato de etila 99:1, sendo retiradas 19 frações de

40

50 mL. Cada fração foi analisada por CCD, constatando-se que as frações 4 a 15

estavam aparentemente puras. Desta forma, elas foram combinadas, analisadas por

CCD e uma pequena parte desta amostra foi submetida à análise de ponto de fusão.

Parte desta amostra (20mg) foi enviada para análise por RMN. Como solvente

foi utilizado clorofórmio deuterado (CDCl3).

4.4 – Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

4.4.1 – Cultivo de B. bassiana e biotransformação

Um frasco de armazenamento contendo o fungo Beauveria bassiana foi retirado

do ultra-freezer, transferido para um tubo de ensaio contendo meio ágar batata

inclinado, onde ficou por quatro dias, à temperatura ambiente. Após crescimento, a

biomassa foi transferida, por meio de raspagem com alça de platina, para erlenmeyer

de 250 mL, contendo 100 mL de meio base 1.

Foi feita uma biotransformação em duas etapas, procedimento que consiste em

se cultivar o fungo em meio de cultura apropriado e, posteriormente, transferir sua

biomassa para um recipiente contendo somente água destilada adicionada do

composto a ser biotransformado. Isso permite que as duas etapas sejam otimizadas

separadamente.

Em ensaios de biotransformação em duas etapas, na etapa de obtenção de

massa celular (fase de cultivo) o meio de cultura pode ser enriquecido de nutrientes, o

que permite o desenvolvimento mais rápido do micro-organismo. O meio usado na

biotransformação propriamente dita, ao contrário, deve ser bem simples, contendo

basicamente um tampão, solução fisiológica, ou apenas água destilada, como foi

utilizado no experimento realizado. Nessas condições, não são disponibilizados

nutrientes para o micro-organismo, impedindo sua multiplicação (crescimento), mas

sua massa celular continua viável por um período, biotransformando compostos que

sejam adicionados ao cultivo. Algumas vantagens deste processo em relação ao

processo de uma única etapa são: menor tempo de transformação, maior concentração

de substrato, controle mais fácil de reações e facilidade na extração e purificação do

produto (Medeiros, 2002).

Foram utilizados onze erlenmeyers de 500 mL contendo, cada um deles, 200 mL

de meio base 3. O inoculo do fungo B.bassiana, previamente preparado, foi transferido

para os onze erlenmeyers contendo o meio de cultura 3. Após dez dias de cultivo sem

41

agitação, à temperatura ambiente, o conteúdo de cada erlenmeyer foi filtrado a vácuo,

em funil de Buchner, e o micélio foi transferido para um outro erlenmeyer de 500 mL

contendo apenas 200 mL de água destilada esterilizada.

Dos onze erlenmeyers contendo o micélio do fungo imerso em água destilada,

um foi utilizado como controle do fungo e dez foram utilizados para a realização da

biotransformação, sendo que nesses, foi adicionado 1 mL de solução de esclerotiorina

(20) em acetato de etila na concentração de 20 mg.mL-1. Também foi adicionado 1 mL

desta solução em outro erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL água destilada estéril,

de modo a servir como controle do substrato. Todos os erlenmeyers utilizados, os dez

do experimento da biotransformação e os dois controles foram incubados sob agitação

a 100 rpm durante 14 dias, à temperatura ambiente.

Após este período, em cada erlenmeyer o micélio foi separado por filtração a

vácuo em funil de Buchner. O filtrado foi transferido para um funil de separação e

extraído 3 vezes utilizando 60 mL de acetato de etila. O solvente foi removido em

evaporador rotativo a 65 ºC a vácuo

4.4.2 – Análise e purificação de biotransformado

O extrato foi analisado por CCD, primeiramente utilizando como solvente

diclorometano e, depois, diclorometano/acetato de etila 98:2. Nenhum produto com Rf

próximo ao da esclerotiorina (20) foi observado, porém, observou-se uma mancha

vermelha mais polar, perto do ponto de aplicação da amostra. Desta forma, foi feita

outra CCD, utilizando como solvente acetato de etila e como eluente

diclorometano/acetato de etila 75:25, sendo observadas cinco manchas vermelhas.

Estas manchas não foram encontradas no perfil cromatográfico dos dois controles, e

foram classificadas como produtos novos, provavelmente, produtos de

biotransformação.

Os produtos biotransformados foram submetidos a cromatografia em coluna e

cromatografia em placa preparativa. Os produtos 1, 4 e 5 estavam presentes em maior

quantidade e foram enviados para análise por RMN. Como solvente foi utilizado o

clorofórmio deuterado (CDCl3).

42

4.5 – Obtenção de produtos de síntese com diazometano

4.5.1 – Síntese

Foram adicionados 900 mg de esclerotiorina (20) em um balão de fundo

redondo, e 100 mL de éter etílico. Após a dissolução total da amostra, o diazometano

previamente preparado foi adicionado lentamente até se verificar o desaparecimento

total das bolhas. A amostra foi deixada em repouso por 10 min e, em seguida, levada

ao evaporador rotativo para evaporação do solvente e, consequentemente, o término

da reação (Hudlicky, 1980).

4.5.2 – Análise e purificação

O produto da reação foi analisado por CCD, utilizando diclorometano como

solvente e diclorometano/acetato de etila 98:2 como eluente, em comparação com um

padrão de esclerotiorina (20). Estas condições evidenciaram a formação de dois novos

compostos com o RF próximo ao da esclerotiorina (20), um mais polar e outro menos

polar, sendo que este último estava em maior quantidade.

O derivado sintético mais polar que a esclerotiorina (20) foi separado através de

cromatografia em coluna. Foram retiradas 18 frações, sendo que o derivado foi eluído

com diclorometano. Análises de CCD mostraram que o derivado estava puro. Desta

forma, uma parte foi separada para análise do ponto de fusão. O material foi enviado

para análise por RMN, utilizando clorofórmio deuterado (CDCl3) como solvente. O

produto teve sua estrutura determinada como sendo o 1-metil-esclerotiorina (64).

4.6 – Biotransformação do 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

4.6.1 – Cultivo do B. bassiana e biotransformação

O procedimento utilizado para a biotransformação do 1-metil-esclerotiorina (64)

foi o mesmo utilizado no item 4.4.1.

4.6.2 – Análise e purificação do produto biotransformado

Análises por CCD, utilizando acetato de etila como solvente e

diclorometano/acetato de etila (75:25) como eluente evidenciaram a presença de um

único ponto vermelho, ausente no perfil cromatográfico dos controles.

43

Através de cromatografia em coluna de sílica flash (230-400 mesh), foi possível

isolar o produto vizualizado por CCD nas frações coletadas com diclorometano/acetato

de etila 80:20.

4.7 – Obtenção de outros derivados da esclerotiorina

4.7.1 – Triagem de fungos

Para verificar outras possibilidades de produção de novos biotransformados,

foram selecionadas 14 espécies de fungos da coleção do LaBβ, e, juntamente com o

Beauveria bassiana, foi feita uma triagem. Os fungos utilizados foram:

Absidia cylindrospora

Aspergillus parasiticus

Beauveria bassiana

Cladosporium sphaerospermum

Clonostachys rosea f catenulata

Microsporum gypseum

Mucor plumbeus

Paecilomyces lilacinus

Paecilomyces varioti

Penicillium janthinellum

Pestalotiopsis palustris

Rhizopus oryzae

Rhizopus stolonifer

Syncephalastrum racemosum

Thamnostylum sp.

As biotransformações foram feitas em uma única etapa. Neste processo não há

a separação do meio de cultivo, e a substância de interesse é adicionada diretamente

ao fungo, após o crescimento deste (Sato, 2001). Os fungos, após serem retirados do

armazenamento, foram repicados para tubos de ensaio contendo ágar batata

dextrosado inclinado e incubados por três dias a temperatura ambiente. Após este

período, cada fungo foi transferido através de raspagem com alça de platina e água

esterilizada para dois erlenmeyers de 250 mL, contendo cada um 100 mL de meio base

2 e deixados a temperatura ambiente, sob agitação a 100 rpm. Após três dias, os

fungos apresentaram bom crescimento, e a esclerotiorina (20) foi adicionada em um

44

dos erlenmeyers contendo cada fungo. O segundo erlenmeyer não recebeu a

substância e foi utilizado como controle. Foi adicionado 0,5 mL de solução de

esclerotiorina (20) em acetato de etila (20 mg.mL-1). Os erlenmeyes foram deixados

sob as mesmas condições de agitação e temperatura durante 14 dias.

Após este período, o conteúdo de cada frasco foi filtrado a vácuo com funil de

Buchner, o micélio foi separado, e o meio foi transferido para um funil de separação.

Procedeu-se uma extração com três volumes de 30 mL de acetato de etila, que foi

posteriormente evaporado, dando origem aos extratos. O extrato de cada fungo, assim

como seus respectivos controles, foram analisados por CLAE.

O extrato da biotransformação da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana

em duas etapas obtido no item 4.4.1 também foi analisado por CLAE. Este resultado foi

comparado com o resultado do ensaio do B. bassiana descrito neste tópico para

estimar qual dos experimentos (o primeiro, em duas etapas, ou o segundo, em uma

etapa) alcançou maior rendimento. Um extrato do Penicillium sclerotiorum (item 4.2)

também foi analisado por CLAE para obter o tempo de retenção dos metabólitos deste

fungo, inclusive o tempo de retenção da esclerotiorina (20).

4.7.2 – Análise por CLAE

Cada extrato em metanol (1 mg.mL-1) foi filtrado com uma membrana com poros

de 0,45 µm de tamanho e transferido para frasco devidamente identificado. Foram

injetados 20 µL de cada amostra no cromatógrafo. Como fase estacionária foi utilizada

uma coluna de polaridade inversa (C18). Como fase móvel, foi utilizado um gradiente

de misturas de acetonitrila e água deionizada, contendo 0,05% de ácido fórmico

(conforme Tabela 5), com um fluxo constante de 1 mL/min. Foram utilizados solventes

de grau HPLC para a eluição e preparo das amostras. Os solventes, assim como a

água, passaram por processo de desgaseificação anterior ao seu uso.

Tabela 5 – Gradientes de eluição utilizados na análise do HPLC

Tempo de análise (min) Acetonitrila (%) Água (%)

0 50 50

30 100 0

40 100 0

45

O detector foi ajustado para os comprimentos de onda 470 e 530 nm. Entre uma

análise e outra, a coluna foi lavada por 15 min com acetonitrila/água (1:1) (Castro,

2008).

Para comparação dos tempos de retenção entre diferentes amostras, foi

calculado o intervalo de confiança da média dos tempos de retenção da esclerotiorina

(20) nas diferentes amostras, e este foi extrapolado como o intervalo de confiança do

método. O intervalo de confiança é calculado pela fórmula:

Equação 1 – Intervalo de confiança

onde é a média dos tempos de retenção da esclerotiorina (20), t é o coeficiente de t

student e EPM é o erro padrão da média. O erro padrão da média pode ser calculado

pela fórmula a seguir, onde é o desvio padrão populacional e n é o número de

amostras.

Equação 2 – Erro padrão da média

O coeficiente t é obtido da tabela de distribuição de t student (Anexo 1), levando-se em

conta a confiabilidade e o número de graus de liberdade, obtido por GL = n-1.

(Pimentel-Gomes, 2000)

4.8 – Identificação do Cladosporium sphaerospermum

No início deste trabalho, o fungo C. sphaerospermum era o único que ainda não

tinha tido sua taxonomia determinada. Sua identificação foi realizada no Instituto de

Ciências Biológicas da UFMG, sob a supervisão da Profª Drª Maria Aparecida de

Resende, como descrito a seguir, a partir de seu microcultivo em ágar sabouraud.

O micro-organismo foi inoculado em uma lâmina de microcultivo para que

pudesse ser feita a sua identificação. Um pequeno bloco de ágar sabouraud foi cortado

e colocado na superfície de uma lâmina microscópica estéril. O fungo foi inoculado

neste bloco de ágar e uma lamínula estéril foi colocada em cima do ágar. O sistema foi

46

armazenado a 37 ºC em uma placa de Petri estéril com um pedaço de algodão

embebido em água glicerinada (Funder, 1968).

Após 10 dias de crescimento, a lamínula e o ágar foram retirados, o fungo foi

corado com lactofenol e outra lamínula foi posta em cima da lâmina. A lâmina foi

analisada em microscópio ótico. As hifas e estruturas de reprodução, assim como as

características macroscópicas foram utilizadas para determinar o gênero e espécie do

fungo filamentoso.

47

RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 – Produção e extração da esclerotiorina de Penicillium sclerotiorum

Penicillium sclerotiorum é um fungo filamentoso que apresenta coloração

esverdeada. Geralmente, o meio utilizado para seu cultivo fica alaranjado após alguns

dias, devido à produção de metabólitos secundários. Após três dias de cultivo em tubo

com ágar batata inclinado, o fungo apresentou bom crescimento e esporulação (Figura

18).

Figura 18 – Penicillium sclerotiorum em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente

(A) e verso (B) do tubo.

O meio base 1 foi escolhido por ter apresentado resultados satisfatórios em

outros trabalhos desenvolvidos no laboratório relacionados a crescimento de fungos

filamentosos (Bracarense, 2008; Carvalho, 2009). Este meio possui quantidades

suficientes de fontes de carbono, nitrogênio, além de minerais necessários para o

crescimento deste fungo. Após três dias neste meio, o fungo apresentava quantidade

satisfatória de biomassa, sem indícios aparentes de contaminação. Os micélios

estavam homogêneos, e o meio apresentava coloração alaranjada, sem turvação, o

que, caso acontecesse, poderia ser um indício de contaminação por leveduras e/ou

bactérias.

O próximo passo foi o cultivo deste fungo em uma escala maior, que foi obtido

por cultivo em meio de cultura líquido em frascos erlenmeyer contendo um total de sete

litros de meio de cultura. O meio foi dividido em vários recipientes com o objetivo de se

48

ter uma superfície de contato do meio de cultura com o ar maior, uma vez que o P.

sclerotiorum é um micro-organismo aeróbio. O meio foi preparado com metade da

concentração dos constituintes, com o objetivo de que os nutrientes se esgotassem

mais rapidamente e os micro-organismos alcançassem mais rapidamente a fase

estacionária, onde acontece a produção de metabólitos secundários. O crescimento foi

realizado até o 21º dia, quando o meio de cultura apresentou uma forte coloração

alaranjada.

Após a extração do conteúdo total de meio de cultura, foram obtidos 3,07 g de

extrato.

5.2 – Purificação da esclerotiorina

A estrutura da esclerotiorina (20), assim como a numeração dos átomos de

carbono, encontra-se na Figura 19.

Figura 19 – Estrutura molecular da esclerotiorina

A presença de esclerotiorina (20) no extrato foi averiguada por cromatografia em

camada delgada utilizando diclorometano como solvente e diclorometano/acetato de

etila (98:2) como eluente. Um padrão de esclerotiorina (20) pura também foi aplicado

na placa. Como o composto pesquisado possui uma forte coloração alaranjada, neste

caso não foi necessária a utilização de agentes reveladores (Figura 20). Nestas

condições, a esclerotiorina (20) apresentou um fator de retenção Rf = 0,37.

Como método de purificação da esclerotiorina (20) a partir do extrato bruto de P.

sclerotiorum, foi escolhida a cromatografia em coluna (Figura 21), pelo fato de este

metabólito possuir uma forte coloração alaranjada, o que facilita o uso desta técnica de

purificação.

49

Figura 20 – Cromatografia em camada delgada

comparativa do padrão de esclerotiorina (A) e o extrato de

Penicillium sclerotiorum (B)

Figura 21 – Coluna cromatográfica de purificação da esclerotiorina em três

etapas de eluição

50

O primeiro fracionamento do extrato gerou 22 frações, sendo que a combinação

das frações 11 a 16 gerou uma amostra com boa quantidade de esclerotiorina (20),

porém impura, que foi novamente submetida a cromatografia em coluna de sílica. Com

este segundo fracionamento, as frações 4 a 15 resultaram em esclerotiorina (20)

aparentemente pura.

Para comprovar a pureza desta substância, foi feita uma CCD, que apresentou

somente uma mancha, com o mesmo Rf que o padrão de esclerotiorina (20), também

aplicado na placa. A análise de ponto de fusão mostrou que a amostra fundiu entre 199

e 202 ºC, o que comprovou a pureza da amostra.

Foram obtidos 914,2 mg de esclerotiorina (20) por este procedimento, relativos a

aproximadamente 30% de rendimento em relação à massa total do extrato.

A análise por RMN comprovou que a substância isolada foi a esclerotiorina (20).

Os dados encontram-se na Tabela 6, página 51. Os espectros de RMN encontram-se

nos Apêndices 1 a 6. A numeração utilizada foi descrita na Figura 19, página 48.

5.3 – Biotransformação da esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

5.3.1 – Cultivo do Beauveria bassiana

O fungo Beauveria bassiana foi escolhido, pois na literatura são relatados

diversos experimentos em que este fungo foi usado na biotrasnformação de várias

substâncias (Buchanan et al., 2001; Zhan et al., 2006; Osorio-Lozada et al., 2008).

Além do que, este micro-organismo produz baixas quantidades de metabólitos

secundários, e nenhum possui uma coloração forte, o que poderia dificultar o emprego

das técnicas cromatográficas utilizadas.

Para o cultivo do Beauveria bassiana, foi escolhido o meio base 3. É relatado na

literatura que o B. bassiana apresenta crescimento adequado neste meio de cultura

(Martins, 2009). Foi feito um estudo comparativo em laboratório, o que comprovou este

dado. Após três dias de cultivo em ágar batata inclinado (Figura 22), o B. bassiana foi

transferido para erlenmeyer contendo o meio base 3, onde foi incubado por 10 dias,

sem agitação, a temperatura ambiente, apresentando bom crescimento por toda a

superfície do meio de cultura.

51

Tabela 6 – Informações obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C,

sub-espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a esclerotiorina

Numeração Multiplicidade δC (ppm) δH (ppm) JH (Hz)

1 CH 152,63 7,93 -

3 C 158,11 - -

4 CH 106,38 6,65 -

4a C 138,67 - -

5 C 110,81 - -

6 C 185,97 - -

7 C 84,58 - -

8 C 191,78 - -

8a C 114,57 - -

9 CH 115,68 6,08 d, 15,8

10 CH 142,86 7,06 d, 15,8

11 C 131,97 - -

12 CH 148,84 5,70 d, 10,0

13 CH 35,13 2,49 m

14 CH2 30,06 1,37 m

15 CH3 11,94 0,87 t, 7,2; 7,2

16 CH3 20,18 1,01 d, 6,8

17 CH3 12,35 1,85 -

18 CH3 22,53 1,57 -

19 C 170,10 - -

20 CH3 20,06 2,17 -

52

Figura 22 – Beauveria bassiana em ágar batata inclinado após 3 dias. Frente (A) e

verso (B) do tubo.

5.3.2 – Obtenção dos produtos biotransformados

O micélio de B. bassiana foi colocado em recipiente contendo água destilada

estéril, e a esclerotiorina (20) foi adicionada como solução concentrada em acetato de

etila, de modo que fosse usado um volume pequeno do solvente, portanto, em

condições de baixa toxicidade para o fungo.

O micélio do fungo e a esclerotiorina (20) foram deixados em contato por 14

dias. Muitos trabalhos relatam que este tempo é suficiente para reações de

biotransformação (Sakamaki et al., 2001, Miyazawa et al., 1995, Liu et al., 1984). Após

este período, procedeu-se a extração, sendo obtidos 360,8 g de extrato.

A purificação das substâncias se iniciou com uma cromatografia em coluna.

Foram retiradas 22 frações de 200mL, sendo utilizados como eluentes, nesta ordem,

hexano, misturas de hexano/diclorometano, diclorometano e misturas de

diclorometano/acetato de etila até a concentração de 1:1. Com este procedimento,

foram isoladas 4 frações, utilizando como eluentes, misturas de diclorometano/acetato

de etila nas concentrações de 85:15, 80:20, 60:40 e 50:50, nesta ordem. A ordem de

eluição encontra-se na Tabela 7. Análises por CCD mostraram que o material obtido

nas polaridades diclorometano/acetato de etila 85:15, 60:40 e 50:50 estavam puros.

A amostra isolada com a polaridade diclorometano/acetato de etila 80:20

possuía duas substâncias distintas, que posteriormente foram isoladas utilizando placa

preparativa de sílica gel. Este procedimento consistiu em preparar placas

cromatográficas de 10 x 10 cm, com espessura de 1 mm de sílica gel. A amostra foi

aplicada inteiramente na placa e, após a eluição e conseqüente separação dos

constituintes, as duas substâncias foram separadas pela raspagem seletiva de cada

banda visualizada na placa, diluídas com metanol e filtradas em filtro quantitativo com

poros de 14 µm. Neste procedimento, utilizando acetato de etila como solvente e

53

hexano/acetato de etila (8:2) como eluente, foi possível separar os biotransformados 2

e 3.

A massa obtida de cada substância encontra-se na Tabela 7

Tabela 7 – Massas das substâncias isoladas da biotransformação da

esclerotiorina por B. bassiana e respectivos rendimentos

Polaridade Substância Massa

(mg)

Rendimento

(%)

Diclorometano/acetato de etila 85:15 Biotransformado 1 27,5 13,8


Diclorometano/acetato de etila 80:20 Biotransformado 3 1,9 1



Os cinco produtos de biotransformação isolados do extrato de B. bassiana

possuem aparentemente as mesmas características físicas. São sólidos à temperatura

ambiente, com coloração vermelho forte, muito solúveis em diclorometano, acetato de

etila ou metanol.

5.3.3 – Elucidação estrutural do Biotransformado 1

O processo de elucidação estrutural de substâncias geralmente inicia-se com a

análise do espectro no infravermelho, cujas bandas indicam os grupos funcionais

presentes na estrutura. O próximo passo é a análise dos espectros de RMN de 1H e de

13C e do sub-espectro DEPT, que mostram a quantidade de átomos de carbono e

hidrogênio presentes, dando uma boa noção de sua vizinhança. Os espectros de RMN

bidimensionais mostram as correlações entre átomos de carbono e hidrogênio, o que,

na maioria das vezes, já permite montar a estrutura da molécula. Muitas vezes,

algumas análises suplementares como a análise elementar, espectometria de massas

ou ultravioleta podem ser necessárias para confirmar a presença de algum fragmento

estrutural ou confirmar a molécula proposta (Silverstein et al., 2005).

Em casos de reação ou biotransformação, a elucidação estrutural do produto

pode ser iniciada pela comparação de seu espectro de RMN com o espectro do

material de partida. Os deslocamentos químicos de RMN de 13C do biotransformado 1

foram comparados com os deslocamentos da esclerotiorina (20), apresentando

semelhança por toda a molécula, com exceção dos átomos de carbono próximos ao

54

oxigênio participante do heterociclo (Figura 23), podendo-se concluir que a molécula do

biotransformado 1 possui um esqueleto parecido com o da esclerotiorina (20), com

alguma alteração neste ponto da molécula.

Figura 23 – Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da

esclerotiorina (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho)

A análise do espectro de RMN de 13C do biotransformado evidenciou, ainda, a

presença de oito novos átomos de carbono, não presentes na molécula original da

esclerotiorina (20). A comparação entre os dados obtidos dos espectros de RMN de

13C (Figura 23) indica que a inserção destes átomos foi perto dos anéis da molécula.

A análise do espectro de RMN de 1H, do sub-espectro DEPT, do mapa de

contornos HSQC, assim como os valores dos deslocamentos químicos no espectro de

RMN de 13C (Tabela 8) permitiram concluir que os sinais correspondiam a: 2 carbonos

secundários, 5 carbonos terciários e 1 carbono quaternário.

Tabela 8 – Deslocamentos químicos dos átomos de carbono inseridos na

molécula de esclerotiorina pela biotransformação

Deslocamento químico δC Multiplicidade (DEPT)

36,6 CH2

55,4 CH2

127,7 CH

128,7 CH

128,7 CH

129,2 CH

129,2 CH

135,8 C

55

A análise elementar (Tabela 9) indicou a presença de um átomo de nitrogênio na

molécula. O cálculo do número de átomos foi feito usando-se massa molecular

493,2060, obtida a partir do espectro de massas ESI-MS (Apêndice 14). O pico de

massas 516,1876 é referente ao íon M+Na, inerente ao método. O pico de massas

437,1927 é referente a fragmento da molécula. Apesar da técnica de ESI-MS não ser

uma técnica destrutiva, alguns poucos fragmentos podem aparecer nos espectros

produzidos.

Tabela 9 – Resultado da análise elementar do biotransformado 1, e número de

átomos correspondentes, levando-se em conta a massa obtida no espectro de

massas ESI-MS

Átomo % de massa Número de átomos

Carbono 68,95 29

Hidrogênio 6,23 32

Nitrogênio 2,80 1

A literatura relata a produção da isocromofilona VI (22), um composto que possui

o mesmo esqueleto básico da esclerotiorina (20), porém, o heteroátomo ligado ao anel

é um nitrogênio. Os valores dos deslocamentos químicos da isocromofilona VI (22)

(Anexo 2), em comparação com os deslocamentos do biotransformado são bem

semelhantes (Figura 24), um outro indício da presença do átomo de nitrogênio na nova

molécula.

Figura 24 – Comparação entre os deslocamentos químicos de RMN de 13C da

isocromofilona VI (em preto) e do biotransformado 1 (em vermelho)

56

Finalmente, a confirmação de que a biotransformação da esclerotiorina (20)

também alterou o cromóforo da molécula foi vizualizada pela coloração do

biotransformado 1, que é bem similar à coloração da isocromofilona VI (22), que possui

o átomo de nitrogênio em seu cromóforo, o que está de acordo com o cromóforo do

biotransformado possuir um átomo de nitrogênio (Figura 25).

Figura 25 – Estruturas da esclerotiorina (1) e da isocromofilona VI (2), mostrando

os diferentes cromóforos

Deste modo, foi possível considerar que os oito novos átomos de carbonos

estavam ligados a um átomo de nitrogênio, o qual faria parte do esqueleto da molécula

do biotransformado.

Atráves do espectro bidimensional de RMN HSQC-TOCSY, foi possível mostrar

que os dois carbonos secundários fazem parte do mesmo sistema de spins, estando

separados dos 5 carbonos terciários, os quais também fazem parte de um segundo

sistema de spins. Com esta informação, e utilizando os acoplamentos indicados no

espectro de HMBC, foi possível propor o seguinte fragmento (Figura 26).

57

Figura 26 – Correlações observadas no espectro bidimensional de HMBC para o

biotransformado 1

Como o sistema de spins dos carbonos terciários é diferente dos carbonos

secundários, foi proposto que o próximo constituinte desta cadeia seria o único carbono

quaternário (Figura 27).

Figura 27 – Correlações demonstradas no espectro bidimensional de HMBC para

o biotransformado 1

Os deslocamentos químicos dos cinco carbonos terciários restantes são bem

próximos, e característicos de carbonos aromáticos. Desta forma, chegou-se à seguinte

estrutura (Figura 28):

Figura 28 – Estrutura molecular proposta para o Biotransformado 1

58

Na estrutura proposta, o anel aromático possui dois pares de carbonos que

possuem a mesma vizinhança. O espectro de RMN de 13C (Apêndice 8, página 90)

mostra que estes dois pares de sinais possuem o mesmo deslocamento químico, e

pode-se supor que possuam a mesma vizinhança. Os átomos de carbono são

conectados entre si e com os outros carbonos próximos da estrutura.

A estrutura proposta possui a fórmula estrutural de C29H32O4NCl. Calculando a

massa molecular teórica a partir das massas atômicas exatas (Silverstein, 2005), se

encontra um valor de 492,0214. A massa molecular obtida com o espectro de massas

(Apêndice 14) foi de 493,2060, o que está de acordo com a estrutura proposta.

Os dados da nova substância encontram-se na Tabela 10, página 60. Os

espectros encontram-se nos Apêndices 7 a 16.

5.3.4 – Elucidação estrutural dos outros biotransformados

Devido à pouca quantidade de massa obtida, não foi possível realizar análises

com os biotransformados 2 e 3. Os biotransformados 4 e 5 foram enviados para análise

por RMN, porém, os espectros obtidos não tinham resolução suficiente para dar

prosseguimento à elucidação estrutural. Com os dados obtidos, supôs-se que, nas

duas moléculas, assim como na molécula do biotransformado 1 (56), houve a troca do

átomo de oxigênio próximo ao carbono 1 por um átomo de nitrogênio, com a inserção

de dois carbonos secundários, que dão continuidade à molécula (Figura 29).

Figura 29 – Fragmento estrutural comum nos biotransformados 1, 4 e 5

O espectro de massas do biotransformado 4 mostra que este composto difere do

biotransformado 1 apenas por um grupo hidroxila. A provável estrutura molecular para

esta substância seria aquela proposta na Figura 30.

59

N

OH

O

Cl

O

O

O

57

Figura 30 – Provável estrutura do biotransformado 4

O biotransformado 5 possui a mesma massa que a isocromofilona VI (22),

metabólito do Penicillium sclerotiorum, e os sinais referentes à cadeia lateral da

isocromofilona VI (22) estão presentes no espectro de RMN do biotransformado. Deste

modo, a provável estrutura molecular para esta substância seria a proposta na Figura

31.

N

HO

O

Cl

O

O

O

58

Figura 31 – Provável estrutura do biotransformado 5

É importante ressaltar que nenhuma dessas estruturas pode ser confirmada sem

a obtenção de espectros de RMN com maior quantidade de amostra, ou maior pureza

desta.

Seguem abaixo os dados físico-químicos dos biotransformados 4 (57) e 5 (58).

Os espectros encontram-se nos Apêndices 17 a 22.

60

Tabela 10 – Propriedades físico-químicas do biotransformado 1

Propriedade Biotransformado 1 (56)

Estrutura molecular

Aspecto Sólido vermelho, cristalino

Fórmula molecular C29H32O4NCl

Temperatura de fusão 110-112ºC

Massas (ESI-MS) m/z 493,2060

UV (λ, nm) 375 nm

IV (KBr) (ν, cm-1) 3440, 2920, 1700, 1600, 1500, 1220, 1140

RMN de 1H, 400 MHz, CDCl3 (δ) 0,89 (3H, t, H-15, J=7,2; 7,2 Hz); 1,03 (3H, d, H-

16, J=6,4 Hz); 1,40 (2H, m, H-14); 1,52 (3H, s, H-

18); 1,81 (3H, s, H-17); 2,16 (3H, s, H-20); 2,48

(1H, m, H-13); 3,03 (2H, m, H-21); 4,05 (2H, m,

H-22); 5,68 (1H, d, H-12, J=10 Hz); 5,98 (1H, d,

H-9, J=15,6 Hz); 6,90 (1H, d, H-10, J=15,6 Hz);

6,97 (1H, s, H-4); 7,10 (1H, m, H-25); 7,10 (1H,

m, H-27); 7,26 (1H, s, H-26); 7,31 (1H, m, H-24);

7,31 (1H, m, H-28); 7,54 (1H, s, H-1)

RMN de 13C, 100 MHz, CDCl3 (δ) 11,99 (C-15); 12,62 (C-17); 20,23 (C-16); 20,30

(C-20); 23,23 (C-18); 30,04 (C-14); 35,05 (C-13);

36,63 (C-21); 55,44 (C-22); 84,82 (C-7); 102,44

(C-4a); 111,58 (C-4); 114,59 (C-8a); 114,64 (C-9);

127,71 (C-26); 128,73 (C-25); 128,73 (C-27);

129,25 (C-24), 129,25 (C-28); 131,54 (C-11);

135,79 (C-23), 140,86 (C-1); 144,30 (C-5); 144,95

(C-10); 147,80 (C-12); 148,04 (C-3); 170,04 (C-

19); 184,37 (C-6); 193,77 (C-8)

Solubilidade Solúvel em diclorometano, acetato de etila e

metanol, insolúvel em água

Rf, diclorometano/acetato de etila

(8:2)

0,42

61

Tabela 11 – Propriedades físico-químicas do Biotransformado 4


Aspecto Sólido vermelho, cristalino

Temperatura de fusão 87-90º C


UV (λ, nm) 375 nm

IV (KBr) (ν, cm-1) 3440, 2920, 1700, 1600, 1500, 1220




(1:1)

0,41

Tabela 12 – Propriedades físico-químicas do Biotransformado 5


Aspecto Sólido vermelho, oleoso


UV (λ, nm) 375 nm

IV (KBr) (ν, cm-1) 3320, 2920, 1640, 1460, 1360,1240, 740




(1:1)

0,20

Supõe-se que os cinco biotransformados de coloração vermelha produzidos pelo

Beauveria bassiana apresentaram como ponto comum a troca do átomo de oxigênio

por um átomo de nitrogênio, ligado a uma cadeia lateral, que difere em cada

biotransformado.

Wei e Yao descrevem a reatividade de azafilonas perante aminas primárias, o

que resulta na troca do heteroátomo presente no anel bicíclico. O mecanismo proposto

para esta reação encontra-se representado na Figura 32 (Wei e Yao, 2005).

62

O

X

O

O2R

R O

R NH2

O

X

O

O2R

R O

N

H H

R

O

X

O

O2R

R O

N

H H

R

O

X

O

O2R

R O

N

H H

R

OH

X

O

O2R

R O

N

H

R

O

X

O

O2R

R O

N

H

R

N

X

O

O2R

R O

R

OH

N

X

O

O2R

R O

R

- H2O

59

60

Figura 32 – Mecanismo proposto para a reação entre azafilonas e aminas

primárias

Desta forma, sugere-se que aminas primárias produzidas pelo Beauveria

bassiana reagiram com a esclerotiorina (20), dando origem aos produtos de

biotransformação 1-5.

5.4 – Síntese da 1-metil-esclerotiorina

Na tentativa de se obter um derivado semi-sintético da esclerotiorina (20) para

posterior biotransformação, foi feito uma reação com o diazometano. Este composto é

altamente reativo e instável, e por isso foi preparado anteriormente ao uso. Em razão

de suas características tóxicas (principalmente a teratogenicidade), o seu preparo foi

feito levando em conta todas as medidas de segurança necessárias (Figura 17, página

37). Seu preparo a partir do Diazald® segue a equação abaixo (Figura 33) (Struempel

et al., 2008).

Figura 33 – Reação de formação do diazometano

63

As reações com diazometano geralmente resultam em produtos metilados, e

esta metilação acontece por uma substituição de um hidrogênio na molécula do

reagente, geralmente o hidrogênio mais ácido (Solomons, 2002).

O hidrogênio 1 da molécula da esclerotiorina (20) possui maior acidez do que os

outros hidrogênios da molécula. Sua retirada é estabilizada por ressonância nos dois

anéis da molécula. A metilação na posição 1 da molécula da esclerotiorina (20) é o

evento com maior probabilidade de ocorrer a partir da reação desta molécula com o

diazometano.

A esclerotiorina (20), figura 19, página 48, foi deixada em contato com o

diazometano por 10 minutos, uma vez que este é muito reativo, e um maior tempo de

contato poderia levar à formação de produtos de degradação, diminuindo o rendimento

da reação principal. Os reagentes encontram-se dissolvidos em éter, e a evaporação

deste leva ao término da reação. A reação com diazometano também leva à formação

de nitrogênio gasoso, e o desprendimento deste pode evidenciar que a reação está em

andamento.

Análises por CCD evidenciaram a formação de dois produtos principais, um mais

polar e outro menos polar do que o material de partida, além de produtos em menor

quantidade. O produto menos polar mostrou-se altamente instável, e foi degradado

pela sílica usada na CCD e na coluna cromatográfica em menos de 30 minutos,

tornando inviável seu isolamento para posteriores estudos e análises. O produto mais

polar foi separado por meio de cromatografia em coluna. A análise do ponto de fusão

mostrou que esta substância fundiu entre 177 e 179 ºC, o que comprovou o alto grau

de pureza da amostra.

A reação foi feita com 900 mg de esclerotiorina (20) e foram obtidos 276,9 mg de

produto, o que representa um rendimento de reação de 31%.

5.4.1 – Elucidação estrutural do Produto 1

Foram obtidos espectros de RMN de 1H e de 13C, sub-espectros DEPT, além de

espectros bidimensionais do novo produto, e os valores dos deslocamentos químicos

foram comparados com os deslocamentos químicos do material de partida, a

esclerotiorina (20). Os valores encontrados foram bem próximos aos da esclerotiorina

(20), com exceção da região próxima ao carbono 1, onde os valores sofreram alguma

alteração. Isto mostra que o produto da reação manteve a estrutura parecida com a

estrutura do material de partida, porém, com alguma alteração nesta área da molécula

(Figura 34).

64

Figura 34 – Comparação entre os deslocamentos químicos da esclerotiorina (em

preto) e do Produto 1 (em vermelho).

Análises dos espectros de RMN de 1H e de 13C mostraram que, além da

estrutura básica da esclerotiorina (20), o novo produto possuía um átomo de carbono a

mais e, segundo seu valor de deslocamento químico e posicionamento no sub-espectro

de DEPT, tratava-se de um carbono primário. Os valores de deslocamento químico no

novo grupo são: δC = 20,20, δH = 2,65, simpleto.

O mapa de contornos HMBC mostrou as correlações existentes entre este

carbono primário e C1 e C8a (Figura 35), indicando que este estava ligado ao carbono

1 da molécula da esclerotiorina (20).

Figura 35 – Correlações observadas no mapa de contornos HMBC para o produto

1

O sinal de H1 na molécula da esclerotiorina (20) não foi observado nos espectros

do produto 1, o que está de acordo com a proposta de sua substituição por um grupo

CH3. Nenhuma outra alteração foi encontrada nos espectros de RMN desta molécula. A

estrutura do produto 1, identificado como 1-metil-esclerotiorina (64), está representada

na Figura 36.

65

Figura 36 – Estrutura molecular do Produto 1 (1-metil-esclerotiorina)

Os dados da nova substância encontram-se na Tabela 13, página 66. Os

espectros encontram-se nos Apêndices 23 a 32.

5.5 – Biotransformação da 1-metil-esclerotiorina pelo Beauveria bassiana

O mesmo procedimento utilizado para a biotransformação da esclerotiorina (20)

foi utilizado agora com o seu produto metilado. O objetivo foi verificar se as mesmas

alterações causadas na molécula da esclerotiorina (20) pelo Beauveria bassiana

também são causadas em uma molécula com estrutura semelhante.

A biotransformação da esclerotiorina (20) resultou em muitos novos produtos,

sendo que alguns deles foram produzidos com altos rendimentos (Tabela 7, página 53).

Este resultado não foi observado quando o substrato oferecido para o fungo foi a 1-

metil-esclerotiorina (64). Alguns poucos produtos com a mesma coloração alaranjada

foram produzidos e apenas um produto mais polar com coloração vermelha foi

observado, mesmo assim, nenhum desses em quantidade o suficiente para ser isolado

e enviado para análise visando elucidação estrutural.

Tendo em vista que um dos produtos de biotransformação da esclerotiorina (20)

por B. bassiana foi formado pelo ataque dos elétrons livres das aminas produzidas por

este fungo ao carbono 1, a metilação desta posição impediu este ataque nucleofílico, já

que, na 1-metil-esclerotiorina (64), este carbono está ligado ao grupo metila. Deste

modo, esta reação não foi possível de ocorrer, ou ocorreu em baixíssimos rendimentos.

66

Tabela 13 – Propriedades físico-químicas da 1-metil-esclerotiorina

Propriedade 1-metil-esclerotiorina (64)

Estrutura molecular

Aspecto Sólido alaranjado, cristalino

Fórmula molecular C22H25O5Cl

Temperatura de fusão 177-179 ºC


UV (λ, nm) 355 nm

IV (KBr) (ν, cm-1) 3420, 2960, 1720, 1620, 1520, 1400, 1220, 1140,

1100, 980

RMN de 1H, 400 MHz, CDCl3 (δ) 0,88 (3H, t, H-15, J=14,8; 14,8 Hz); 1,03 (3H, d,

H-16, J=13,2 Hz); 1,36 (2H, m, H-14); 1,57 (3H, s,

H-18); 1,86 (3H, s, H-17); 2,19 (3H, s, H-20); 2,50

(1H, m, H-13); 2,65 (3H, s, H-21); 5,72 (1H, d, H-

12, J=19,6 Hz); 6,07 (1H, d, H-9, J=31,4 Hz); 6,72

(1H, s, H-4); 7,06 (1H, d, H-10, J=31,4 Hz)

RMN de 13C, 100 MHz, CDCl3 (δ) 11,98 (C-15); 12,40 (C-17); 20,20 (C-20); 20,20

(C-21); 20,25 (C-16); 22,93 (C-18); 30,08 (C-14);

35,10 (C-13); 85,33 (C-7); 106,45 (C-4); 109,93

(C-5); 110,71 (C-8a); 115,74 (C-9); 131,98 (C-11);

140,47 (C-4a); 142,26 (C-10); 148,44 (C-12);

156,74 (C-3); 166,87 (C-1); 169,84 (C-19); 185,65

(C-6); 192,87 (C-8)




(98:2)

0,28

67

5.6 – Obtenção de outros derivados da esclerotiorina

Para uma triagem, quinze fungos da coleção de fungos do LaBβ foram

selecionados, levando-se em conta os seguintes critérios: alta taxa de multiplicação,

fácil crescimento no meio base, baixa produção de metabólitos secundários e ausência

de metabólitos com coloração forte. À exceção de Pestalotiopsis palustris, os demais

micro-organismos escolhidos já foram usados em experimentos de biotransformação,

como indica a Tabela 14.

Tabela 14 – Algumas referências bibliográficas sobre biotransformações

realizadas pelos fungos utilizados neste experimento

Micro-organismo Referências

Absidia cylindrospora Guiraud et al., 2008; Lacroix et al. 1999

Aspergillus parasiticus Gengar et al. 1999

Beauveria bassiana Osorio-Lozada et al., 2008; Zhan et al., 2006;

Buchanan et al., 2001

Clonostachys rósea Kakeya et al., 2002

Microsporum gypseum Siebers-Wolff et al., 1993; Olivo et al., 2005

Mucor plumbeus Lacroix et al. 1999; García-Granados et al., 2007;

Souza et al., 2009

Paecilomyces lilacinus Rosche et al., 2001; Gesell et al., 2001

Paecilomyces variotii Sachan et al., 2006; Mukherjee et al., 2006

Penicillium janthinellum Zhang et al., 2005; Kiehlmann et al., 1996

Rhizopus oryzae Rosche et al., 2001; Shiva et al. 2007

Rhizopus stolonifer Choudhary et al., 2009; Xiangjiu et al., 2010

Syncephalastrum racemosum Lacroix et al. 1999; Kiehlmann et al., 1996

Thamnostylum sp. Lacroix et al. 1999; Souza et al., 2009

68

5.6.1 – Identificação do Cladosporium sphaerospermum

A Figura 37 representa o microcultivo do fungo, três dias após a inoculação.

Figura 37 – Microcultivo de Cladosporium sphaerospermum

O fungo apresentou crescimento lento. Macroscopicamente, o fungo apresenta

coloração escura, tendendo ao esverdeado até marrom, com textura aveludada (Figura

38). Microscopicamente, o fungo possui hifas septadas, conidióforos curtos e pouco

pigmentados como estrutura de reprodução (Figura 39).

Estas características permitiram classificar o fungo como pertencente à espécie

Cladosporium sphaerospermum. Outros trabalhos sobre identificação de fungos do

gênero Cladosporium relatam as mesmas características (Pereira, 2005).

Figura 38 – Cladosporium sphaerospermum inoculado em tubo inclinado. Frente

(A) e verso (B)

69

Figura 39 – Características microscópicas do Cladosporium sphaerospermum.

Conidióforos (a), hifas septadas (b), esporos sexuais (c), detalhe da reprodução

assexuada (d)

5.6.2 – Análises por cromatografia líquida de alto desempenho (CLAE)

Em uma separação cromatográfica de alto desempenho, os compostos são

retidos e particionados por um único mecanismo de retenção. Em fases reversas, os

solutos interagem hidrofobicamente com as caldeias alquílicas do empacotamento,

porém, existe a possibilidade de interação de alguns compostos com os grupos silanol

residual, que, às vezes, chegam a mais de 20% dos grupos hidroxila da matéria prima.

Estas interações podem levar à formação de caudas, devido à interação mais forte

entre o soluto e os grupos silanol. As caudas também podem ser formadas por

diferenças do tempo de retenção entre duas formas da mesma substância, seja por

isomeria ou equilíbrio ácido base (Ciola, 2003). Para minimizar os efeitos do equilíbrio

ácido base, foi adicionado 0,05% de ácido fórmico à água utilizada na eluição.

A eluição por gradiente pode proporcionar melhor visualização do perfil

cromatográfico dos extratos. O gradiente foi otimizado a partir de uma solução de

esclerotiorina (20) e do biotransformado 1 (56). Vários sistemas de eluição foram

70

testados, sendo que o sistema apresentado na Tabela 5, página 44 foi o que

apresentou melhor separação e visualização dos picos das duas substâncias.

O detector utilizado foi ajustado para os comprimentos de onda 470 e 530 nm.

As substâncias com coloração avermelhada são detectadas nestes dois comprimentos

de onda, sendo que as substâncias com coloração alaranjada são detectadas apenas

pelo comprimento de onda de 470 nm. Desta forma, a análise de CLAE foi capaz de

discriminar substâncias alaranjadas e vermelhas, e detectar, entre os produtos novos,

quais tiveram o seu cromóforo alterado, como no caso da biotransformação da

esclerotiorina (20) pelo B. bassiana.

O cromatograma do controle também foi analisado para garantir que as

substâncias indicadas como produtos de biotransformação não eram metabólitos

produzidos pelos fungos.

Os cromatogramas encontram-se nos Apêndices 33 a 50.

5.6.3 – Interpretação dos resultados da triagem

As diferenças entre o tempo de retenção de uma mesma substância em

amostras diferentes podem ser causadas por vários fatores, como as alterações de

pressão da coluna, impurezas nos eluentes, e as diferenças das matrizes das amostras

(Ciola, 2003). Todas as amostras, com exceção dos controles, possuíam esclerotiorina

(20) e as diferenças nos tempos de retenção desta substância nos diferentes extratos

representa a variabilidade inerente ao experimento.

Os extratos de biotransformação dos fungos Mucor plumbeus, Pestalotiopsis

palustris, Rhizopus oryzae e Rhizopus stolonifer apresentaram em seus

cromatogramas nenhum pico ou picos muito pequenos indicando a presença de

poucos novos biotransformados. O cromatograma do extrato do Thamnostylum sp. não

apresentou precisão suficiente para ser analisado, mesmo após repetição do

experimento. Apesar de apresentar bons resultados na biotransformação em duas

etapas, Beauveria bassiana não apresentou nenhum biotransformado em grande

quantidade nesta triagem feita em uma etapa.

O extrato da biotransformação com Absidia cylindrospora apresentou três picos

com tempos de retenção de 8,011, 8,219 e 8,742 min, sendo que os três foram

visualizados pelos dois comprimentos de onda.

O extrato da biotransformação com Aspergillus parasiticus apresentou um pico

intenso com tempo de retenção de 8,721 min, lido pelos dois comprimentos de onda.

Foram observados três picos com tempos de retenção de 18,119, 18,413 e 20,965 min,

71

lidos somente pelo comprimento de onda de 470nm. Outros picos foram observados,

porém referem-se a metabólitos presentes no controle.

O extrato da biotransformação com Cladosporium sphaerospermum apresentou

três picos com tempos de retenção de 3,368, 3,552 e 8,748 min, sendo que os três

foram lidos pelos dois comprimentos de onda. Foram observados dois picos intensos

com tempos de retenção de 4,866 e 5,355 min, sendo que ambos foram lidos somente

pelo comprimento de onda de 470 nm.

Clonostachys rosea f catenulata apresentou um extrato com dois picos com

tempos de retenção de 8,669 e 10,053 min, sendo que os dois foram lidos pelos dois

comprimentos de onda.

Microsporum gypseum apresentou, em seu extrato, um pico com tempo de

retenção de 9,685 min, lido pelos dois comprimentos de onda. Foram observados cinco

picos com tempos de retenção de 7,769, 8,417, 10,805, 11,192 e 11,845 min, lidos

somente pelo comprimento de onda de 470 nm, sendo que o primeiro deles é bem

intenso.

Paecilomyces lilacinus apresentou, em seu extrato, um pico com tempo de

retenção de 8,941 min, lido pelos dois comprimentos de ondas.

O extrato obtido de Paecilomyces varioti apresentou dois picos intensos com

tempo de retenção de 8,950 e 10,364 min, sendo que os dois foram lidos pelos dois

comprimentos de onda.

Penicillium janthinellum apresentou, em seu extrato, quatro picos com tempos de

retenção de 8,717, 9,070, 10,092 e 10,551 min, todos lidos pelos dois comprimentos de

onda, sendo que os com tempos de retenção de 8,717 e 10,092 min são bem intensos.

Foram observados dois picos com tempos de retenção de 18,934 e 21,029 min, sendo

que os dois foram lidos somente pelo comprimento de onda de 470 nm.

A biotransformação com Syncephalastrum racemosum apresentou um extrato

com sete picos com tempos de retenção de 3,447, 3,823, 5,215, 7,996, 8,201, 8,717 e

9,063 min, todos foram lidos pelos dois comprimentos de onda, sendo que, o pico com

o tempo de retenção de 8,717 min é bem intenso.

Dos 15 fungos selecionados, nove produziram alguma substância nova em

contato com a esclerotiorina (20), sendo que todos estes produziram substâncias

avermelhadas, supostamente, resultante da troca do heteroátomo de oxigênio vizinho

ao carbono 1, por um átomo de nitrogênio. Aspergillus parasiticus, Cladosporium

sphaerospermum, Microsporum gypseu e Penicillium janthinellum também

apresentaram outros produtos de biotransformação onde não houve mudança do

72

cromóforo e as substâncias mantiveram a coloração alaranjada da esclerotiorina (20), o

que indica que estes fungos são capazes de fazer outra alteração na molécula, além da

troca do heteroátomo.

Todos os produtos de biotransformação produzidos pelos fungos apresentam

características mais polares do que a esclerotiorina (20), com exceção do composto

com tempo de retenção de 20,997 min, menos polar, produzido por Aspergillus

parasiticus e Penicillium janthinellum.

Aspergillus parasiticus, Cladosporium sphaerospermum, Microsporum gypseum,

Paecilomyces varioti, Penicillium janthinellum e Syncephalastrum racemosum

produziram um ou mais produtos com grandes rendimentos, evidenciado pela

intensidade dos respectivos picos das substâncias.

A média do tempo de retenção da esclerotiorina (20) nas 14 amostras que

resultaram em cromatogramas com boa resolução foi de 19,5014 e o desvio padrão foi

de 0,2280. Para saber se os 14 valores seguem a distribuição normal, foi aplicado o

teste de normalidade de Ryan-Joiner. O valor crítico para n=14, com α=0,01, é de

0,9402 e o valor obtido com o teste de normalidade foi de 0,9585, o que comprova,

com 99% de confiabilidade, que os valores seguem a distribuição normal.

O erro padrão médio foi de 0,0770, o que levou a um intervalo de confiança de

19,5014 ± 0,1662, com 95% de confiabilidade, utilizando 13 graus de liberdade. Esse

intervalo de confiança foi extrapolado para se comparar os tempos de retenção das

outras substâncias dos cromatogramas. Deste modo, foi possível comparar os tempos

de retenção de substâncias produzidas por diferentes fungos e estimar se a mesma

substância é produzida por fungos diferentes. Como critério, também foi levado em

conta o comprimento de onda que as substâncias absorvem. Cladosporium

sphaerospermum e Syncephalastrum racemosum produzem uma substância com

tempo de retenção 5,285 min, porém não se trata da mesma substância, pois este pico,

no primeiro fungo é lido pelos dois comprimentos de onda e, no segundo, é lido

somente pelo comprimento 470nm.

A Tabela 15 lista as substâncias produzidas por mais de um fungo. O tratamento

estatístico garante 95% de confiabilidade.

73

Tabela 15 – Substâncias detectadas por CLAE em extratos de biotransformação

de mais de um fungo

Tempo de retenção médio (min) Fungos produtores

3,408 Cladosporium sphaerospermum


8,004 Absidia cylindrospora





Aspergillus parasiticus

Cladosporium sphaerospermum

Clonostachys rosea f catenulata



9,006 Paecilomyces lilacinus

Paecilomyces variotii



10,089 Clonostachys rosea f catenulata


20,997 Aspergillus parasiticus


5.6.4 – Interpretação dos resultados da biotransformação em uma etapa de B. bassiana

O cromatograma do extrato obtido com a biotransformação em duas etapas do

Beauveria bassiana (item 4.4.1) apresentou quatro dos cinco biotransformados

evidenciados por CCD e isolados no item 5.3.2 deste trabalho. Os tempos de retenção

foram 8,625, 12,22, 16,285 e 18,060 min, sendo que os quatro foram lidos pelos dois

comprimentos de onda (Figura 40). O cromatograma do biotransformado 3 não

apresentou boa resolução mesmo após repetição do experimento, mas, pela sua

polaridade, estima-se que ele possua um tempo de retenção próximo ao do

biotransformado 2 (16,285 min). O cromatograma também evidenciou uma outra

substância com tempo de retenção de 9,993 min, que não foi isolada do extrato bruto.

74

Figura 40 – Cromatograma da biotransformação em duas etapas em contraste

com o cromatograma dos biotransformados isolados

O cromatograma obtido com o extrato da biotransformação em uma etapa não

apresentou nenhuma substância em quantidade considerável. Como já citado na

literatura (Medeiros, 2002), a biotransformação em duas etapas produz substratos em

maior quantidade, o que foi demonstrado na biotransformação da esclerotiorina (20)

pelo Beauveria bassiana.

5.6.5 – Extrato de P. sclerotiorum

O cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum, obtido no item 4.2,

apresentou os três metabólitos secundários produzidos por este fungo citados na

75

literatura (Castro, 2008): isocromofilona VI (22), esclerotiorina (20) e pencolídeo (21),

respectivamente com os tempos de retenção de 8,94, 19,78 e 22,10 min, sendo que os

dois últimos são lidos somente pelo comprimento de onda de 470nm e a isocromofilona

VI (22) é lida pelos dois comprimentos de onda (Figura 41).

Figura 41 – Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum

5.7 – Projeção para uso dos resultados em alimentos

Com os experimentos elaborados, foi possível obter várias substâncias novas a

partir da biotransformação da esclerotiona, sendo que cinco delas foram isoladas e

uma teve sua estrutura proposta.

A esclerotiorina (20) é um corante e antioxidante de atividade comprovada

(Chidananda e Sattur, 2007), com baixa toxicidade e registros de uso em alimentos

(Negishi et al., 2000). O estudo da obtenção de derivados desta molécula pode resultar

na descoberta de substâncias com melhores características, como: alteração de cor,

maior efeito antioxidante, menor toxicidade, ou melhor incorporação em alimentos.

Devido à baixa toxicidade da esclerotiorina (20), pode-se supor que alguns de

seus produtos derivados possam ser aplicados na indústria de alimentos, porém, para

isso serão necessários mais testes, principalmente os de toxicidade. A biotecnologia

tem grande importância no estudo dos alimentos e biotransformações podem ser

usadas na busca de novas substâncias para este segmento.

Tendo em mente as limitações do uso de corantes naturais, como a

dependência de materiais sazonais e a variação do perfil do pigmento e, notando o

crescente mercado para corantes naturais, pode-se inferir que o futuro da produção

industrial de corantes naturais se baseará em três áreas: produção robusta com

76

qualidade uniforme, descoberta de fontes alternativas de novas ou conhecidas classes

de pigmentos e cores, e melhoria da funcionalidade. A habilidade da classe dos

policetídeos de servir como corantes de alimentos tem escapado da atenção de

cientistas de alimentos, inclusive na indústria. A recente aprovação de carotenóides

derivados de fungos filamentosos para uso como corantes em alimentos destaca o

potencial dos policetídeos, que tem sido pouco explorado, com exceção dos pigmentos

produzidos por fungos do gênero Monascus (Mapari et al., 2010).

Estudos recentes indicam como fungos filamentosos podem ser usados como

fábricas celulares para produção de pigmentos e podem ser desenvolvidos para

expandir a paleta de cores dos corantes naturais existentes. No entanto, é preciso

compreender melhor como, porque e sob quais circunstâncias fungos filamentosos

produzem pigmentos policetídeos. Assim como outros corantes, os policetídeos

precisam passar por testes de toxicidade antes de serem aprovados. No que se diz

respeito à aceitação dos consumidores e das autoridades, os policetídeos devem ser

tratados de maneira igual aos atuais corantes aprovados que vem de fontes exóticas,

como o ácido carmínico, extraído do inseto cochonilha, e os carotenóides de origens

fúngicas (Mapari et al., 2010).

77

CONCLUSÕES

O fungo Penicillium sclerotiorum produziu esclerotiorina (20) em meio de cultura

líquido, em cultivo estático. Após 21 dias de cultivo, a extração com acetato de etila

gerou 3,07 g de extrato.

A esclerotiorina (20) presente no filtrado do cultivo do fungo foi isolada do

extrato, com alto grau de pureza, por cromatografia em coluna, utilizando

diclorometano como eluente. Foram obtidos 914,2 mg de esclerotiorina (20), relativos a

30% da massa total do extrato.

A reação da esclerotiorina (20) com o diazometano resultou na metilação da

posição 1 da molécula de esclerotiorina (20). A reação de formação do 1-metil-

esclerotiorina (64) teve rendimento de 31%.

A biotransformação da esclerotiorina (20) pelo fungo Beauveria bassiana foi

pouco eficiente quando foi adicionada diretamente no cultivo do fungo

(biotransformação em uma etapa).

A biotransformação da esclerotiorina (20) pelo fungo B. bassiana foi eficiente

quando o meio de reação continha apenas massa celular e o substrato em água

destilada (biotransformação em duas etapas).

Foram isolados cinco produtos da biotransformação da esclerotiorina (20) por B.

bassiana em duas etapas. A quantidade obtida dos biotransformados 1 a 5 foram,

respectivamente, 27,5 mg, 8,3 mg, 1,9 mg, 12,8 mg e 13,7 mg, o que representa

rendimentos de 13,75%, 4,15%, 0,95%, 6,4% e 6,85%, respectivamente.

Todos os produtos biotransformados apresentaram um átomo de nitrogênio em

substituição ao átomo de oxigênio ligado ao carbono 1 da molécula de esclerotiorina

(20), ligado a uma cadeia lateral, diferente em cada um dos cinco produtos. O

biotransformado 1 (56) foi isolado e sua estrutura molecular foi determinada por

métodos espectroscópicos.

78

A biotransformação em duas etapas da 1-metil-esclerotiorina (64) pelo Beauveria

bassiana não apresentou os mesmos resultados apresentados quando se usou a

esclerotiorina (20). O heteroátomo ligado ao carbono 1 não foi substituído,

provavelmente pelo fato de este sítio estar alterado, com um grupo metila ligado

Da triagem de 15 fungos selecionados, para verificar a capacidade de

biotransformação da esclerotiorina (20) em uma etapa, nove produziram alguma

substância com coloração vermelha, e destes, quatro produziram também alguma outra

substância de coloração alaranjada.

Os metabólitos secundários produzidos pelo Penicillium sclerotiorum,

isocromofilona VI (22), esclerotiorina (20) e pencolídeo (21), após a injeção no HPLC,

apresentaram respectivamente os tempos de retenção de 8,94, 19,78 e 22,10 min.

79

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87

APÊNDICES E ANEXOS

Apêndice 1 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

Apêndice 2 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

88

Apêndice 3 – Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

Apêndice 4 – Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

89

Apêndice 5 – Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

Apêndice 6 – Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) da esclerotiorina

90

Apêndice 7 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

Apêndice 8 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

91

Apêndice 9 – Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

Apêndice 10 – Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

92

Apêndice 11 – Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

Apêndice 12 – Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) do biotransformado 1

93

Apêndice 13 – Mapa de contornos HSQC-TOCSY (400 MHz, CDCl3) do

biotransformado 1

Apêndice 14 – Espectro de massas (ESI-MS) do biotransformado 1

437.1927

494.2060

516.1876

+MS, 0.1-0.6min #(6-34)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.

420 440 460 480 500 520 540 m/z

94

Apêndice 15 – Espectro no UV do biotransformado 1

Apêndice 16 – Espectro no IV (KBr) do biotransformado 1

95



02-Dec-2010 09:49:562203

m/z260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720

%

0

100

AMOSTRA_02_021110 11 (0.204) Sm (SG, 6x3.00); Sb (5,40.00 ); Cm (2:15) TOF MS ES+ 1.53e4510.3581

480.3997

512.3657

513.3709

533.3936

96



02-Dec-2010 09:58:072204

m/z300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700

%

0

100


376.2983

346.2778

378.3040

405.3774

436.3343

542.5028437.3427

543.5035

576.4747

97



98

Apêndice 23 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) do produto 1

Apêndice 24 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) do produto 1

99

Apêndice 25 – Espectro DEPT (100 MHz, CDCl3) do produto 1

Apêndice 26 – Mapa de contornos HSQC (400 MHz, CDCl3) do produto 1

100

Apêndice 27 – Mapa de contornos HMBC (400 MHz, CDCl3) do produto 1

Apêndice 28 – Mapa de contornos COSY (400 MHz, CDCl3) do produto 1

101

Apêndice 29 – Mapa de contornos NOESY (400 MHz, CDCl3) do produto 1

Apêndice 30 – Espectro de massas (ESI-MS) do produto 1

02-Dec-2010 09:37:502101

m/z290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480

%

0

100


317.1865

363.2074

319.1919

365.2056

407.2253

427.2208408.2386

102

Apêndice 31 – Espectro no UV do produto 1

Apêndice 32 – Espectro no IV (KBr) do produto 1

103

Apêndice 33 – Cromatograma do extrato de Absidia cylindrospora

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

104

Apêndice 34 – Cromatograma do extrato de Aspergillus parasiticus

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

105

Apêndice 35 – Cromatograma do extrato de Cladosporium sphaerospermum

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

106

Apêndice 36 – Cromatograma do extrato de Clonostachys rosea f catenulata

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

107

Apêndice 37 – Cromatograma do extrato de Microsporum gypseum

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

108

Apêndice 38 – Cromatograma do extrato de Mucor plumbeus

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

109

Apêndice 39 – Cromatograma do extrato de Paecilomyces lilacinus

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

110

Apêndice 40 – Cromatograma do extrato de Paecilomyces varioti

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

111

Apêndice 41 – Cromatograma do extrato de Penicillium janthinellum

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

112

Apêndice 42 – Cromatograma do extrato de Pestalotiopsis palustris

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

113

Apêndice 43 – Cromatograma do extrato de Rhizopus oryzae

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

114

Apêndice 44 – Cromatograma do extrato de Rhizopus stolonifer

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

115

Apêndice 45 – Cromatograma do extrato de Syncephalastrum racemosum

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

116

Apêndice 46 – Cromatograma do extrato de Thamnostylum sp.

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

117

Apêndice 47 – Cromatograma do extrato de Beauveria bassiana (biotransformação da

esclerotiorina)

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

118


1-metil-esclerotiorina)

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

119


esclerotiorina em duas etapas)

Controle – 530nm

Controle – 470nm

Amostra – 530nm

Amostra – 470nm

120

Apêndice 50 – Cromatograma do extrato de Penicillium sclerotiorum

530nm

470nm

121

Anexo 1 – Tabela de distribuição de t student (na vertical, graus de liberdade, na

horizontal, probabilidade do teste)

GL/α 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05 0,02 0,01 0,001

1 0,158 0,325 0,51 0,727 1 1,376 1,963 3,078 6,314 12,71 31,82 63,66 636,6

2 0,142 0,289 0,445 0,617 0,816 1,061 1,386 1,886 2,92 4,303 6,965 9,925 31,60

3 0,137 0,277 0,424 0,584 0,765 0,978 1,25 1,638 2,353 3,182 4,541 5,541 12,92

4 0,134 0,271 0,414 0,569 0,741 0,941 1,19 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 8,61

5 0,132 0,267 0,408 0,559 0,727 0,92 1,156 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 6,869

6 0,131 0,265 0,404 0,553 0,718 0,906 1,134 1,44 1,943 2,447 3,143 3,707 5,959

7 0,13 0,263 0,402 0,549 0,711 0,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,365 3,499 5,408

8 0,13 0,262 0,399 0,546 0,706 0,889 1,108 1,397 1,86 2,306 2,896 3,355 5,041

9 0,129 0,261 0,398 0,543 0,703 0,883 1,1 1,383 1,833 2,262 2,821 3,25 4,781

10 0,129 0,26 0,397 0,542 0,7 0,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 4,587

11 0,129 0,26 0,396 0,54 0,697 0,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 3,106 4,437

12 0,128 0,259 0,395 0,539 0,695 0,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 3,055 4,318

13 0,128 0,259 0,394 0,538 0,694 0,87 1,079 1,35 1,771 2,16 2,65 3,012 4,221

14 0,128 0,258 0,393 0,537 0,692 0,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 2,977 4,14

15 0,128 0,258 0,393 0,536 0,691 0,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 4,073

16 0,128 0,258 0,392 0,535 0,69 0,865 1,071 1,337 1,746 2,12 2,583 2,921 4,015

17 0,128 0,257 0,392 0,534 0,689 0,863 1,069 1,333 1,74 2,11 2,567 2,898 3,965

18 0,127 0,257 0,392 0,534 0,688 0,862 1,067 1,33 1,734 2,101 2,552 2,878 3,922

19 0,127 0,257 0,391 0,533 0,688 0,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 2,861 3,883

20 0,127 0,257 0,391 0,533 0,687 0,86 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,845 3,85

21 0,127 0,257 0,391 0,532 0,686 0,859 1,063 1,323 1,721 2,08 2,518 2,831 3,819

22 0,127 0,256 0,39 0,532 0,686 0,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,792

23 0,127 0,256 0,39 0,532 0,685 0,858 1,06 1,319 1,714 2,069 2,5 2,807 3,767

24 0,127 0,256 0,39 0,531 0,685 0,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,745

25 0,127 0,256 0,39 0,531 0,684 0,856 1,058 1,316 1,708 2,06 2,485 2,787 3,726

26 0,127 0,256 0,39 0,531 0,684 0,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,707

27 0,127 0,256 0,389 0,531 0,684 0,856 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 3,69

28 0,127 0,256 0,389 0,53 0,683 0,856 1,056 1,313 1,701 2,048 2,467 2,763 3,674

29 0,127 0,256 0,389 0,53 0,683 0,854 1,055 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,659

30 0,127 0,256 0,389 0,53 0,683 0,854 1,055 1,31 1,697 2,042 2,457 2,75 3,646

40 0,126 0,255 0,388 0,529 0,681 0,851 1,05 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 3,551

60 0,126 0,254 0,387 0,527 0,679 0,848 1,046 1,296 1,671 2 2,39 2,66 3,46

120 0,126 0,254 0,386 0,526 0,677 0,845 1,041 1,289 1,658 1,98 2,358 2,617 3,373

∞ 0,126 0,253 0,385 0,524 0,674 0,842 1,036 1,282 1,645 1,96 2,326 2,576 3,291

122

Anexo 2 – Informações obtidas a partir dos espectros de RMN de 1H e de 13C, sub-

espectro DEPT e mapa de contornos HSQC para a isocromofilona VI

Numeração Grupo σc (ppm) σH (ppm) JH (Hz)

1 CH-O 152,63 7,93 -

3 C-O 158,11 - -

4 CH 106,38 6,65 -

4a C 138,67 - -

5 C-Cl 110,81 - -

6 C=O 185,97 - -

7 C-O 84,58 - -

8 C=O 191,78 - -

8a C 114,57 - -

9 CH 115,68 6,08 d, 15,6

10 CH 142,86 7,06 d, 16,0

11 C 131,97 - -

12 CH 148,84 5,70 d, 10,0

13 CH 35,13 2,49 m

14 CH2 30,06 1,37 m

15 CH3 11,94 0,87 t, 5,2; 7,6

16 CH3 20,18 1,01 d, 6,8

17 CH3 12,35 1,85 -

18 CH3 22,53 1,57 -

19 C=O 170,10 - -

20 CH3 20,06 2,17 -

21 CH2 55,5 4,02 t, 4,8; 4,7

22 CH2 60,8 3,92 t, 4,8; 4,8

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