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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

DEPTO. BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO

LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOS

TATIANE KANNO

MARAYSA MELO

“Biologia do Desenvolvimento: mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação do ser”

Alfenas Setembro- 2011

(Magritte, 1936)

A Biologia do Desenvolvimento integra de diferentes níveis da

biologia para a formação do ser

Modelos experimentais utilizados no Estudo em Biologia do Desenvolvimento

“Mosca da fruta” Drosophila melanogaster

“Sapo” Xenopus leavis

“Galinha” Gallus gallus

“Camundongo”

“Peixes” Zebrafish

•Baixo Custo

•Facilidade de obtenção

•Maior parte do Desenvolvimento é Externo

•Permite microcirurgia e manipulação genética

•Embrião transparente nos estágios iniciais

•Desenvolvimento similar a humanos nos estágios iniciais

Galinha como modelo experimental

Como um organismo multicelular pode ser formado a partir de um ovo?

Processo de desenvolvimento do animal

Perguntas da Biologia do Desenvolvimento

1. De onde as células vêm? Para onde vão?

2. O que estas células podem ser?

3. Quando elas decidem o que vão ser?

4. Como ocorre esta decisão?

Descrição Expressão Cirurgia

Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento

- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento

embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ

Expressão diferencial de genes

determinam a diferenciação

celular

Ablação Transplante

Cultura







celular


Cultura

Descrição Visualização do desenvolvimento embrionário

Gilbert 8th Edition

Descrição Visualização do desenvolvimento embrionário







celular


Cultura

Como seguir uma célula entre várias?

Gilbert 8th Edition

A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular

A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular

Células da crista neural

Neurulação

Células da crista neural estão adjacentes a placa neural

Crista neural dá origem aos Gânglios de Raiz Dorsal

Epiderme

Células migratórias

Notocorda

Células da crista neural

Crista neural

D

V

Neuroectoderme

Crista neural

Epiderme

Nat

ure

Rev

iew

s N

euro

scie

nce

8,

11

4-1

27

, 20

07

GRD

Tubo Neural

c

c

Os Gânglios da Raiz Dorsal ficam dispostos ao longo da coluna vertebral

Gânglios de Raiz Dorsal (GRD)

Medula

D

D

V

V

TN

GRD







celular


Cultura

Imunohistoquímica: localização da proteína

Epítopo (Sítio de ligação específico da proteína – reconhecido pelo Anticorpo)

Anticorpo Primário (reconhece o epítopo)

Anticorpo Secundário (reconhece o Ac primário)

Fluoróforo (conjugado ao Ac secundário)

PROTEÍNA

Pergunta:

A proteína Miosina Va é expressa no

desenvolvimento do sistema nervoso?

Tubo Neural – Futura Medula

Gânglio da Raiz Dorsal

Armazena neurônios sensoriais

Gânglio da Raiz Dorsal

Expressão de Miosina Va no desenvolvimento do Sistema nervoso

Pergunta:

A proteína Miosina Va é expressa no

desenvolvimento do sistema nervoso?

Miosina Va é expressa no tubo neural e

no gânglio da raiz dorsal






Cultura



celular

Hibridação in situ: localização do RNAm

Hibridação in situ para cScratch2 em embrião de galinha

D V

Dados Felipe Vieceli







celular


Cultura

O transplante de vesícula óptica para o ectoderma do tronco em anfíbios gera cristalino ectópicos:

O ectoderma do tronco tem potencial de formar cristalino

doador

aceptor

Transplantes de crista neural de codorna para galinha mostraram quais são os derivados de cada porção da crista







celular


Cultura

uper Expressão Gênica!!!! •Microinjeção de RNA

•Eletroporação

•Infecção

•Transgênese

Microinjeção de RNA

uper Expressão Gênica!!!! •Microinjeção de RNA

•Eletroporação

•Infecção

•Transgênese

Superexpressão de genes através de Eletroporação in ovo De

velo

p. G

row

th D

iffer

. 199

9 41

, 335

–344

GRD

DNA

+ -

Embrião 48 h pós-eletroporação expressando GFP na região truncal

Imunohistoquímica para detecção do GFP em criocorte retirado da região truncal de embrião HH25

HH19

Em Resumo...

• Origem embrionária das células

• Destino final das células durante o desenvolvimento

• Potencial de diferenciação celular

• Período no qual ocorre a determinação do que as células irão originar

• Quais os fatores moleculares que influenciam a diferenciação destas células

Vias de sinalização em desenvolvimento

NIH Stem Cell Progress Report 2001

1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão?

2. O que estas células PODEM ser?

3. QUANDO elas decidem o que vão ser?

4. COMO ocorre esta decisão?

Existem várias modalidades de comunicação intercelular:

Por contato direto

Por difusão de proteínas extracelulares

Por matriz extracelular

•FGF (Fibroblast Growth Factor)

•Wnt

•BMP (Bone Morphogenic Protein)

•Ácido Retinóico

•Shh (Sonic Hedgehog)

1. SHH se liga ao receptor transmembrana PTCH,

2. inicia-se a sinalização celular que ativa os fatores de transcrição GLI

O Shh é produzido na notocorda, tubo digestório e broto do membro

Na região da medula espinhal, os motoneurônios ficam próximos da NOTOCORDA.

SERÁ QUE A NOTOCORDA DETERMINA ONDE SERÃO FORMADOS OS MOTONEURôNIOS?

51

Comprovação: Transplante de notocorda na região lateral induz motoneurônios

NOTOCORDA

TRANSPLANTE DE NOTOCORDA

NOTOCORDA

Moto neurônios

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COMO que a notocorda determina onde serão formados os motoneurônios?

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COMO que a notocorda determina onde

serão formados os motoneurônios? a) Proteína nuclear? b) Proteína citoplasmática? c) Proteína de membrana? d) Proteína secretada?

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COMO que a notocorda determina onde

serão formados os motoneurônios? a) Proteína nuclear? b) Proteína citoplasmática? c) Proteína de membrana? d) Proteína secretada?

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Nature 412, 194-198 (12 July 2001)

Camudongos com deleção para o gene Shh carecem de motoneurônios no tubo neural

Normal Mutante

Det

ecçã

o de

m

oton

eurô

nio

Na região da medula espinhal, a notocorda direciona a diferenciação de motoneurônios através do Shh

1. O SHH (sonic hedgehog) precisa da adição de colesterol

2. Quando SHH se liga ao receptor transmembrana PTCH, inicia-se a sinalização celular que ativa os fatores de transcrição GLI

Ciclopia

Efeito teratogênico de inibidores da via metabólica do colesterol

Nature 412, 194-198 (12 July 2001)

Camudongos com deleção para o gene Shh carecem de motoneurônios E TEM DEFEITOS NA CABEÇA

Normal Mutante

Det

ecçã

o de

m

oton

eurô

nio

Isto era para ser

uma cabeça!

61

A interação de Shh, secretado pela notocorda, com receptores das células no tubo neural induz a expressão de genes relacionados a diferenciação de motoneurônios no tubo neural.

desenvolvimento do membro

O broto do membro é composto de ectoderma e mesoderma

B

A

D

C

Em aves e mamíferos existe um espessamento distal da ectoderme do broto do membro: a PREGA ECTODÉRMICA APICAL (AER)

As fases desenvolvimento do broto do membro :

1. Definição do campo do membro

2. Crescimento do broto

3. Definição dos eixos

O membro tem 3 eixos: 1)antero-posterior = dedão- mindinho 2)Dorso-ventral = costas-palma 3)Proximo-distal= ombro-mão

Eixo Antero-posterior (ordem dos dígitos)

Existe uma região no broto de membro que é responsável pela definição do eixo Antero-Posterior: a Zona Polarizadora

Duplicação da Zona Polarizadora por transplante resulta em duplicação especular dos dígitos

4 3 2 4 3 2 2 3 4

Duplicação da Zona Polarizadora por transplante resulta em duplicação especular dos dígitos

Concentrações altas de X induzem a formação de dígitos mais posteriores

Que tipo de molécula é X?

O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora Shh: Proteína secretada no meio extracelular

O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora de TODOS os membros

O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora de TODOS os membros Shh: Proteína secretada no meio extracelular

SERÁ QUE O SHH É RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE DA ZONA

POLARIZADORA??

OU SEJA, SERÁ QUE O SHH DETERMINA A ORDEM DOS DÍGITOS?

A implantação de vírus que secretam Shh no primórdio do membro tem o mesmo efeito que o transplante da região polarizadora

A superexpressão de Shh nos membros causa polidactilia

Son

ic H

edge

hog

Car

tiage

m

Maas e Falon, 2005

Dedos adicionais

SERÁ QUE O SHH É RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE DA ZONA

POLARIZADORA??

OU SEJA, SERÁ QUE O SHH DETERMINA A ORDEM DOS DÍGITOS?

Sim!

Concentrações altas de X induzem a formação de dígitos mais posteriores Que tipo de molécula é X? O Shh é transcrito e traduzido pela Zona Polarizadora e secretado no meio extracelular Altas concentração de Shh = posterior= dedo mindinho Baixas concentração de Shh= anterior= polegar

Síndromes = Efeito Eddie Murphy

Distal

Proximo

Eixo Proximo-distal (braço, antebraço e mão)

Na sequência próximo-distal, o membro é subdivido em: Estilópodo -> Zeugópodo -> Autópodo

O esqueleto do membro desenvolve-se no sentido proximo-distal, i.e. estruturas mais proximais surgem primeiro.

A prega ectodérmica apical (AER) define o crescimento do membro

Em aves e mamíferos existe um espessamento distal da ectoderme do broto do membro: a PREGA ECTODÉRMICA APICAL (AER)

prega ectodérmica apical (AER)

O FGF8 é expresso na prega ectodérmica apical FGF: Proteína extracelular secretada


•Wnt




Hipótese: O FGF8 no Prega Ectodérmica Apical é responsável pelo crescimento do broto do membro.

A ausência da prega ectodérmica apical (AER) pode ser compensada por FGF8

Hipótese: O FGF8 no Prega Ectodérmica Apical é responsável pelo crescimento do broto do membro. ENTÃO…. Se não tiver FGF8 não tem membro??!!

Camudongos mutantes com deleção genômica para FGF8 são normais !!!!

E AGORA????? Jogo a hipótese no lixo?

Boulet et al, 2004

Existem outros FGFs além de FGF 8, i.e. os ligantes FGF constituem uma grande família

R&D systems

Fgf8-/- Fgf4-/- Normal

Camundogos com deleção genômica para FGF8 E FGF4 não apresentam membros

Boulet et al, 2004

Fgf8-/- Fgf4-/- Normal

Camundogos com deleção genômica para FGF8 E FGF4 não apresentam membros

OU seja, o FGF 4 pode agir como “estepe” do FGF8 quando este está ausente

FGF4

FGF8

Isto também quer dizer que normalmente, tanto FGF8 quanto FGF4 cooperam para que o plano final se concretize

RESUMINDO…

Uma única via de sinalização está presente em vários momentos e locais da embriogênese.

A mesma via de sinalização tem vários membros da família que agem normalmente em conjunto e podem compensar pela ausência de um membro.

FGF4

FGF8

Modificado de S. Gilbert

Redundância de sinalização é importante!

Cinto e suspensórios


•Wnt




LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOS Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento – ICB-USP

http://www.biocel.icb.usp.br/~ireneyan/index.html

Edgar Ruiz

Felipe Vieceli

Maraysa Melo

Tatiane Kanno

José Antonio Turri

Orientadora: Profa. Dra. Irene Yan

OBRIGADA!

[email protected] [email protected]

AULA PRÁTICA

Aula Prática Biologia do Desenvolvimento in silico

Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL/MG

Maraysa Melo e Tatiane Kanno

Modelos animais:

•Embrião de galinha (Gallus gallus)

•Embrião de camundongo (Mus musculus)

•Embrião de sapo (Xenopus Laevis)

•Embrião de peixe paulistinha (Danio rerio)

Sites:

http://geisha.arizona.edu/geisha/

http://www.emouseatlas.org/emap/home.html

http://www.xenbase.org/common/

http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

Gene: Pax6

http://geisha.arizona.edu/geisha/

http://www.emouseatlas.org/emap/home.html

http://www.xenbase.org/common/

http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

Pax6 comanda o desenvolvimento ocular: A expressão de Pax6 em patas cria olhos ectópicos em moscas

Drosophila melanogaster

Superexpressão de Pax6 forma de olhos extras em anfíbios

Xenopus laevis

Normal Visão dorsal

Mutante com mais Pax6

Visão dorsal

Embriões de Cefalópodos expressam Pax6 no olho

Planárias transgênicas demonstram a presença de Pax6 nos olhos

Astyanax fasciatus mexicanus

O peixe-cego das cavernas mexicanas

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