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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Bioquímica Médica

Biologia Estrutural de Flavivírus:

Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas Biomiméticas

e Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina Inativada

por Alta Pressão Hidrostástica

Ygara da Silva Mendes

*2009*

Livros Grátis

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Biologia Estrutural de Flavivírus:

Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas Biomiméticas

e Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina Inativada por Alta

Pressão Hidrostástica

Ygara da Silva Mendes

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Título de Doutor em Química Biológica.

Orientação: Andréa Cheble de Oliveira

Co-Orientação: Jerson Lima da Silva

Rio de Janeiro

*Março/2009*

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Biologia Estrutural de Flavivírus: Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas Biomiméticas e Implicações para o Desenvolvimento de uma

Vacina Inativada por Alta Pressão Hidrostástica

Ygara da Silva Mendes Orientação: Andréa Cheble de Oliveira

Co-Orientação: Jerson Lima da Silva

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Título de Doutor em Química Biológica.

Banca Examinadora:

...................................................................................... Dra. Andrea Thompson Da Poian

Profa. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ (Presidente da banca)

...................................................................................... Dra. Ana Paula Canedo Valente

Profa. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ (Revisora e Suplente interno)

...................................................................................... Dr. José Daniel Figueroa Villar

Prof. Associado do Instituto Militar de Engenharia ......................................................................................

Dr. Fábio Ceneviva Lacerda Almeida Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ ......................................................................................

Dra. Izabel Chistina Nunes de Palmer Paixão Profa. Associada do Departamento de Biologia Celular e Molecular - UFF

...................................................................................... Dr. Davis Fernandes Ferreira

Prof. Adjunto do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/CCS/UFRJ (Suplente externo)

...................................................................................... Dra. Andréa Cheble de Oliveira

Profa. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ (Orientadora)

...................................................................................... Dr. Jerson Lima da Silva

Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ (Co-orientador)

Rio de Janeiro

*Março/2009*

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Ficha Catalográfica

Mendes, Ygara da Silva Biologia Estrutural de Flavivírus: Propriedades Biofísicas da Interação de

Peptídeos de Fusão com Membranas Biomiméticas e Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina Inativada por Alta Pressão Hidrostástica/ Ygara da Silva Mendes – Rio de Janeiro: UFRJ/IBqM, 2009

Xxv, 201 f., il., 31 cm Orientador: Andréa Cheble de Oliveira Co-Orientador: Jerson Lima Silva Tese (Doutorado) – UFRJ / Instituto de Bioquímica Médica/ Programa de

Pós-Graduação em Química Biológica, 2009. Referências Bibliográficas: f. 177-202 1. Flavivírus; 2. Vacina Inativada; 3. Peptídeo de Fusão; 4.

Espectroscopia; 5. Alta Pressão Hidrostática; 6. Dinâmica Molecular; 7. Calorimetria. I. Oliveira, Andréa Cheble de. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica. III. Título.

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Esta tese foi desenvolvida no Laboratório de Termodinâmica de Proteínas e

Estruturas Virais Gregorio Weber, Programa de Biologia Estrutural, Instituto de

Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação

da Professora Andréa Cheble de Oliveira e co-orientação do Professor Jerson

Lima da Silva, sob a vigência dos auxílios do Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Programa Nacional de

Excelência (PRONEX), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP),

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES),

Instituto Milênio de Biologia Estrutural em Biomedicina e Biotecnologia

(IMBEBB), e Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB).

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A maior recompensa do nosso trabalho não é o que nos pagam por ele, mas aquilo em que ele nos transforma.

(John Ruskin)

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Dedico esta tese... Ao meu amado filho Pedro, que me faz viver intensamente e muito mais feliz. Você fez mais sentido à minha vida. Longe de você o tempo passa tão devagar... No trabalho, rezo para que chegue logo a hora de te reencontrar. Nos fins de semana, para que o tempo demore mais a passar...

Te amo incondicionalmente!

Ao meu querido maridinho Ivan, por toda dedicação e preocupação. Confesso que muitas vezes racional além da conta, mas esta é a base do equilíbrio da nossa união, o balanço entre o racional e o irracional, a paciência e a inpaciência, o sonho e a realidade. Você é meu apoio, meu incentivo, meu consolo, meu alicerce, meu guia... Minhas vitórias eu dedico essencialmente a você.

Te Amo Muito! E por isso serei eternamente sua...

À minha mãezinha Vanda, por todo carinho, apoio e disponibilidade nos momentos mais corridos da minha vida. A quem sempre recorro e que sempre está disposta a me ajudar. Obrigada pelo seu amor e pela sua dedicação por todos esses anos.

Ao meu querido pai Jamil, por todo incentivo e preocupação quanto à minha educação, que trilhou meu caminho até aqui. Este presente eu carregarei comigo para sempre. Muito obrigada por tudo!

À minha irmã Yramaia, que mesmo de longe está sempre torcendo pelas minhas conquistas. Sinto muita saudade e gostaria muito de poder estar mais ao seu lado...

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Agradecimentos

A Deus, por toda força e conquista, pela felicidade da minha família, pela saúde do meu filho, pelo amor do meu marido e pelo carinho de grandes amigos que já conquistei até o momento. Sem todos vocês, nada faz sentido... E tudo isso eu devo ao Senhor. À minha querida orientadora Andréa, que por tantas vezes foi meu apoio emocional e psicológico para um simples desabafo, familiar ou profissional. Encantadora, sublime... Sua Ternura me encanta. Tem sempre ótimas palavras para confortar seu coração. Seus conselhos são sempre muito bem vindos e foram eles que me fizeram crescer a cada momento, de alegria ou de tristeza, de vitórias ou de derrotas. Forte ou frágil? Ainda não sei. Mas talvez sua fortaleza esteja na simplicidade de seus sentimentos, de odiar ou de amar, de chorar ou de sorrir, de se irritar ou de se emocionar. Espero poder viver sempre ao seu lado. É impossível contar minha história de vida sem falar de você. Linda. Linda por suas vitórias, linda por sua garra, linda por ser exatamente como você é: Verdadeiramente Encantadora! Obrigada pela sua amizade, pela sua dedicação e por amar o Pedro. Mas se você está precisando de férias de mim, tudo bem. Seu pedido é uma ordem. Só volto mês que vem... À minha querida (ex) aluna Nathalia, uma menina doce e que por incontáveis vezes foi meu braço direito e meu braço esquerdo juntos. Obrigada por cobrir toda minha ausência no momento mais importante e recompensador da minha vida. Obrigada por tudo! Esta tese também é sua!

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Ao grande amigo Théo. Difícil imaginar sua vida sem enter, shift e control, mas sei que você é brasileiro e não desiste nunca! Mineirinho, chegou de mansinho, e conquistou o coração de muitos (as). Nem sei como agradecer tudo o que você fez por mim. É inacreditável sua generosidade e sua disponibilidade. Era capaz de largar o que tivesse fazendo para atender a um pedido meu. Por quantas vezes fez overnight pra mim... Você foi meu último suspiro neste trabalho. Suas explicações muitas vezes faziam minha cabeça dar um ‘tilct’. Você é demais! Muito obrigada do fundo do meu coração... Ao querido compadre Andre, por todas as oportunidades de ouvir suas brilhantes explicações. Suas críticas e muitas vezes ‘broncas’ de verdade fazem desse laboratório mais cauteloso e organizado. Homem de personalidzade forte, mas que me encanta por sua integridade moral. Muito obrigada por agora fazer parte da minha família. Você é sensacional! Ao Jerson, pela grande oportunidade de me permitir chegar até aqui. Apesar de longe nestes últimos anos, sempre busca estar presente e ciente dos pequenos grandes problemas do laboratório. À Professora Débora Foguel, que na ausência do Jerson, frequentemente procurou tomar a frente para resolver os problemas do laboratório sempre com muita objetividade. Parabéns pelo seu empenho e dedicação ao IBqM. À querida amiga Shana, pelos abraços apertados e carinhosos. Não sei se com alguma outra intenção, mas eram sempre bem vindos. A última massagem, então, foi inesquecível! rsrsrs Obrigada!

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À doce amiga Cris Latgé, com seu jeitinho meigo e sempre carinhosa conquistou meu coração. É sempre muito bom estar do seu lado, mas nunca irei contar pra você um só segredo. “Não vou falar, não vou falar, já falei...”. Desejo que você seja muito feliz e que seus sonhos sejam sempre concretizados. Ao querido e futuro papai Daniel, que sempre está com sua carteira aberta para nossas festinhas surpresa. Desculpas se te cobrei sempre o valor dobrado. Muito obrigada por toda sua atenção e por me fazer rir com suas piadinhas sempre oportunas. À minha companheira de sempre, Ana Paula, que na correria do dia-a-dia sempre paramos para nos amparar e conversar sobre a tese. Muito esforçada com seu trabalho, abdicava do aconchego do seu maridinho para trabalhar noite a dentro, finais de semana, feriados... Precisamos ‘bebemorar’ muito por mais essa etapa cumprida. Ao Carlos, que foi essencial para a confecção de nossos posters e apresentações em geral. Qualquer problema é só chamá-lo que ele resolve. Mas ah se não existisse paint... Não sei o que seria dele... À Vanessa, uma menina super dedicada e que por muitas vezes teve que abdicar de seu orientador para me emprestá-lo, nem que fosse por um dia inteiro. “Ai gente, o que foi que eu fiz?!?!?!” À Pati, pelas comidas maravilhosas, caronas, festinhas. Mas como gosta de dançar, uma verdadeira duracell. À Clara, com seu sorriso encantador e carismático, que sempre faz alegrar o meu dia.

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À Milena, uma menina com uma maturidade exemplar, que sempre está disposta a ajudar e a contribuir para a organização do nosso espaço. À Mari, que apesar de seu coração gelado, sempre foi muito atenciosa comigo. À Tuane, por toda conversa jogada fora. Fofocas do IBqM... contrate Tuane. Não porque ela seja fofoqueira, mas sim uma boa informante... À Mônica, que sempre esteve disponível para tirar minhas muitas dúvidas. À Susanna, pelas histórias engraçadas. È uma verdadeira comédia. Ao Samir, um rapaz muito educado, que está sempre bem humorado e por sempre se mostrar prestativo nas tarefas do laboratório. À Amanda, uma menina muito especial e carinhosa e que está sempre com um sorriso lindo no rosto. À equipe que tenta manter nosso espaço mais organizado e produtivo, Emerson, D. Silvia e Márcia. Sem a ajuda de vocês tudo seria muito mais difícil. Muito obrigada pela limpeza, pelos pedidos de esterilização e meio, muitas vezes em cima da hora. Muito obrigada por tudo! Ao corpo burocrático do LTPV/LAPA, Rosey, Rberta e Sr. Áureo, pelos pedidos de papel, compras... Ao restante dos companheiros de longa estrada do laboratório LTPV/LAPA, Dani, Keron, Thais, Vivian, Diego, Guilherme,

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Marisa, Adrielly, Ana Cris, Carol Léo, Priscila, Fernando, Estefânia, Nathália, Ricardo, Carlos, Aline, Rogério, Carlos Henrique, Elias e Marcos, que foram de alguma forma importantes na minha caminhada e que colaboraram de maneira direta ou indireta para a realização deste trabalho. Aos queridíssinmos amigos Rafa e Wal, que apesar de bem distantes, sempre davam uma palavra de consolação, incentivo ou esperança. Muito obrigada por ontem, por hoje e tenho certeza que pelo amanhã também. Voltem logo, vocês fazem muita falta! Aos amigos que por aqui passaram, mas que ainda permanecem nas minhas boas lembranças, Sheilinha, Cris Rocha, Karinne e Viveca. À Luciane Gaspar e a todos do LATEV/FIOCRUZ, pela colaboração super produtiva nos projetos de inativação viral, pelos experimentos de imunogenicidade, pelos vírus gentilmente cedidos e por todo apoio. À Professora Maria Lúcia Bianconi, pela sua grande colaboração e que sempre se propunha a pensar sobre meus resultados de calorimetria. Muito obrigada! À Mariana e à Karla, pela luta semanal nas marcações dos calorímetros e por sempre concederem seus dias para a realização dos nossos experimentos. Ao Professor Pedro Pascutti, pela oportunidade de colaborar com seu grupo nos experimentos de simulação.

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Ao Rafael Bernardi, pela grande colaboração nos experimentos de simulação. Que difícil cruzar as informações de um físico com uma biomédica. Mas acho que superamos, apesar dos encontros e desencontros frequentes... Muito obrigada pela paciência e pelo trabalho. Ao Professor Marcius Almeida e a suas alunas Vivi e Laíses, por sempre nos concederem o uso do espectrofotômetro, fundamental para iniciar nossos experimentos. A todo grupo do CNRMN, por todo apoio que com certeza foi essencial para este trabalho. A todos do IBqM, que de alguma forma foram fundamentais para a realização dos experimentos desta tese. À Professora Ana Paula Valente, pela sua revisão e sugestões. E interessantemente, nos Encontros que ocorriam na Universidade, era você a nossa avaliadora, que acabava ficando sempre ciente do andamento deste trabalho. Aos Professores Daniel Figueroa, Fábio Almeida, Izabel Paixão e Davis Ferreira por aceitarem gentilmente compor a banca examinadora da minha defesa. Às minhas amadas afilhadas Letícia e Luísa, minhas verdadeiras paixões. Apesar da dindinha nunca ter muito tempo para ver vocês, vocês estão sempre aqui, no meu coração. Amo muito vocês! À Júlia, uma menininha tão linda e delicada. A titia morre de saudades de você. Volta logo, tá?

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À família Sousa, Rosilda, Lek, Marília, Wagner e Fábio, por toda dedicação que tiveram durante todo este tempo. Vocês foram muito importantes para esta caminhada. Obrigada por tudo! À Marcela, pelas palavras de incentivo de que tudo iria dar certo.

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Abreviações e Siglas

Cp – variação de capacidade calorífica

G – variação da energia livre de Gibbs

H – variação de entalpia

S – variação de entropia

17D-204 – cepa vacinal da Febre Amarela distribuída no mundo (exceto no Brasil)

17DD - cepa vacinal da Febre Amarela distribuída no Brasil

2K – proteína não estrutural 2K

AAS – ácido acetilsalicílico

ADN – ácido desoxirribonucléico

AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

APH – alta pressão hidrostática

ARN – ácido ribonucléico

ATCC – banco de cultura de células americano

C – proteína capsídica

CD – dicroísmo circular

CDC – Centro de Controle de Doenças

CEUA - Comitê Institucional de Experimentação e Cuidados com os Animais

CMC – carboxi-metil-celulose

cmc – concentração micelar crítica

C-terminal – terminal carboxi

DEN - Dengue

DENV - Vírus da Dengue

DMEM – meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco

DPPC – di-palmitoil-fosfatidilcolina

DSC – Calorimetria Diferencial de Varredura

DTT - ditiotreitol

E – proteína de envelope

ELISA – ensaio imunoenzimático

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

FLAG – peptídeo de fusão de Flavivírus que possui um resíduo de Gly na posição 104

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FLAH - peptídeo de fusão de Flavivírus que possui um resíduo de His na posição 104

FMDV – Vírus da Febre Aftosa

G – proteína G

gp – glicoproteína

HA - hemaglutinina

HIV1 – Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1

HIV2 – Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 2

i.c. - intracerebral

ITC – Calorimetria Isotérmica de Titulação

JE - Encefalite Japonesa

JEV - Vírus da Encefalite Japonesa

KSV – constante de Stern-Volmer

L - fase líquido-cristalina

LATEV – Laboratório de Tecnologia Virológica

Lc – fase lamelar cristalina

Lβ’ – fase gel inclinada

M – proteína de membrana

MD – dinâmica molecular

MLD50 - dose mínima letal capaz de matar 50% dos animais

MLVs - vesículas multilamelares

n-OGP - n-octil-β-D-glicopiranosídeo

NS1 – proteína não estrutural 1

NS2A – proteína não estrutural 2A

NS2B – proteína não estrutural 2B


NS4A – proteína não estrutural 4A

NS4B – proteína não estrutural 4B


N-terminal – terminal amino

ORF – região aberta de leitura

PC - fosfatidilcolina

PDB - Banco de Dados de Proteínas

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PG – Fosfatidilglicerol

PME – método “Particle-Mesh Ewald” para tratamento das interações eletrostáticas

POPE - Palmitoil-Oleoil-Fosfatidiletanolamina

prM – proteína precursora da proteína de membrana

PRNT - teste de neutralização de redução de 50% dos plaques

Pβ’ – fase gel ondulada

RE – retículo endoplasmático

RMN – ressonância magnética nuclear

RMSD – desvio quadrático médio da estrutura

SDS - dodecil sulfato de sódio

SIV – Virus da Imunodeficiência de Símios

SLE - Encefalite de St. Louis

TBE - Encefalite transmitida por carrapato

TBEV - Vírus da Encefalite Transmitida por Carrapato

TFE - 2, 2, 2-trifluoretanol

Tm – temperatura de transição

TMV - Vírus do Mosaico do Tabaco

Tpre – temperatura de transição média

UFP – unidade formadora de plaque

UV - ultravioleta

VSV – Vírus da Estomatite Vesicular

WHO – Organização Mundial de Saúde

WNE - Encefalite do Oeste do Nilo

WNV - Vírus do Oeste do Nilo

YF - Febre Amarela

YFV - Vírus da Febre Amarela

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Resumo

Biologia Estrutural de Flavivírus: Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas Biomiméticas e Implicações para o Desenvolvimento de uma


Ygara da Silva Mendes Orientador: Andréa Cheble de Oliveira

Co-Orientador: Jerson Lima Silva

Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Título de Doutor em Química Biológica.

Os Flavivírus são responsáveis por causar doenças de grande impacto global, como Febre Amarela, Dengue e Febre do Oeste do Nilo. Estes arbovírus entram nas células por endocitose, onde as proteínas de envelope sofrem uma alteração conformacional e expõem um peptídeo de fusão (PF), que se insere dentro de uma membrana alvo e induz o processo de fusão. Embora este mecanismo geral da fusão seja bem aceito, o modo pelo qual os PFs de Flavivírus executam este papel permanece desconhecido. Este trabalho foi dividido em duas partes: (1) as propriedades de interação de dois PFs de Flavivírus foram estudadas através de metodologias biofísicas; e (2) a imunogenicidade do Vírus da Febre Amarela vacinal (YF 17DD) inativado por alta pressão hidrostática (APH) foi avaliada em modelo murino. Na primeira parte, os resultados indicam que ambos os peptídeos foram capazes de interagir com diferentes modelos de micelas e membranas, induzindo o processo de desmicelização e alterando a fluidez da membrana. O aumento da força iônica induz a perda da contribuição entálpica em todas as temperaturas analisadas, apresentando-se como um processo endotérmico e entropicamente favorecido. Em solução, os peptídeos exibem essencialmente uma conformação randômica, entretanto, na presença de membranas, os peptídeos apresentaram uma estrutura em dobra mais estável. Apesar de existir uma vacina atenuada bastante eficaz contra o vírus da Febre Amarela (YFV), sérios eventos adversos têm sido relatados nos últimos anos. Na segunda parte deste trabalho, mostramos que o vírus vacinal YF 17DD, inativado por APH (310 MPa por 3 h a 4°C), induz uma completa proteção em camundongos, apesar destes apresentarem baixos títulos de anticorpos neutralizantes. A principal vantagem da APH é não introduzir agentes exógenos abolindo o risco de toxicidade. Como não existe um tratamento específico contra os Flavivírus, tentativas para produção de vacinas são certamente necessárias. Além disso, para identificar moléculas que inibam especificamente etapas cruciais do ciclo de infecção destes vírus, é necessário conhecer detalhes bioquímicos e caracterizar estruturalmente as proteínas virais essenciais neste processo. Palavras-chave: Flavivírus, Vacina Inativada, Peptídeo de Fusão, Espectroscopia, Alta Pressão Hidrostática, Dinâmica Molecular, Calorimetria.

Rio de Janeiro

*Março/2009*

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Abstract

Structural Biology of Flavivirus: Biophysical Properties of Fusion Peptide- Mimetic Membrane Interaction and Implications for the Development Inactivated Vaccine by

High Hydrostatic Pressure

Ygara da Silva Mendes Orientador: Andréa Cheble de Oliveira

Co-Orientador: Jerson Lima Silva

Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Título de Doutor em Química Biológica.

Flaviviruses are responsible for causing diseases of great global impact, such as Yellow Fever, Dengue and West Nile fever. These arboviruses entry into the cells by endocytosis, when the envelope proteins undergo conformational changes and expose a fusion peptide, which inserts itself into an appropriate target membrane and induces the fusion process. Although this main fusion mechanism has been accepted, the process by which fusion peptides of Flaviviruses execute this role remains elusive. The present work was divided into two parts: (1) the interaction properties of two fusion peptides (FP) of Flavivirus were studied through biophysical methodologies; and (2) the immunogenicity of YFV 17DD inactivated by High Hydrostatic Pressure (HHP) was evaluated in murine model. In the first part, the results indicate that both FP were able to interact with different micelles and membranes models, inducing a demicellization process and changing the membrane fluidity. The increase of ionic strength induces loss of enthalpic contribution in all temperatures analyzed, shows an endotermic process and largely entropy-driven. In solution, the peptides exhibit essentially random coil conformation, however, in membrane-mimetic environment, the FPs show a bend structure with higher stability. Despite the excellente record of efficacy and safety of the successful Yellow Fever (YF) attenuated vaccine, serious adverse events have been reported and influenced extensive vaccination in endemic areas. In the second part, we demonstrate that the YF 17DD vaccine virus inactivated by HHP (310 MPa for 3 h at 4°C), exhibits a complete protection in mice, although with low neutralizing antibody titers. The main advantage of HHP is that it does not introduce exogenous substances into the vaccine, abolishing the risk of toxicity of the inactivant agent. Since an efficient treatment against most of Flaviviruses is not available, the efforts to produce inactivated vaccines are certainly necessary. Moreover, to identify molecules that inhibit specifically critical steps of viral life cycle, it is necessary to know biochemistry details and characterize structurally the essential viral proteins in this process. Key-word: Flavivirus, Inactivated Vaccine, Fusion Peptide, Spectroscopy, High Hydrostatic Pressure, Molecular Dynamics, Calorimetry.

Rio de Janeiro

*Março/2009*

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Índice

1. INTRODUÇÃO GERAL...............................................................................................1 1.1. A História da Virologia: o desenvolvimento dos conceitos de vírus......................1 1.2. Epidemiologia.........................................................................................................5 1.3. A Febre Amarela...................................................................................................10 1.3.1. Histórico da Doença.............................................................................................10 1.3.2. As Características da Doença...............................................................................12 1.3.3. A Vacinação: suas vantagens e seus problemas..................................................14 1.4. A Estrutura dos Flavivírus.....................................................................................24 1.5. Ciclo de Infecção: entrada, replicação do genoma e processamento das proteínas.........................................................................................................................33 1.6. A Fidelidade e a Diversidade dos Peptídeos de Fusão.........................................41 1.6.1. Peptídeos de Fusão..............................................................................................41 1.6.2. Os Peptídeos de Fusão dos Flavivírus..................................................................43 1.6.3. Interação Peptídeo-Membrana...........................................................................48 2. OBJETIVOS............................................................................................................55 2.1. Objetivos: Parte I..................................................................................................55 2.2. Objetivos: Parte II.................................................................................................57 3. MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................60 3.1. Reagentes.............................................................................................................60 3.2. Células e Vírus......................................................................................................60 3.3. Peptídeos de Fusão..............................................................................................61 3.4. Ensaio com Micelas..............................................................................................63 3.5. Preparação das Vesículas Multilamelares...........................................................65 3.6. Espectroscopia de Fluorescência.........................................................................65 3.6.1. Supressão de Fluorescência por Acrilamida........................................................68 3.7. Dicroísmo Circular (CD)........................................................................................72 3.8. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC)..........................................................75 3.9. Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)......................................................77 3.10. Simulações por Dinâmica Molecular...................................................................78 3.11. Inativação Viral por Alta Pressão Hidrostática....................................................82 3.11.1. Ensaio de Infecciosidade.....................................................................................86 3.11.2. Avaliação da Infecciosidade Residual do YFV Inativado.....................................87 3.12. Ensaios em Camundongos..................................................................................88 3.12.1. Ensaios de Inocuidade........................................................................................88

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3.12.2. Imunização..........................................................................................................89 3.12.3. Ensaio de Proteção.............................................................................................89 3.13. Ensaios para Detecção de Neutralização dos Anticorpos...................................90 3.14. Análises Estatísticas............................................................................................91

4. RESULTADOS.........................................................................................................92

Parte I.............................................................................................................................92

“Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas Biomiméticas”

4.1. Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade dos Peptídeos de Fusão Virais...............................................................................................................................93 4.2. Análise das Propriedades Estruturais da Interação Peptídeo-Micela.................96 4.3. Termodinâmica da Interação Peptídeo-Micela.................................................105 4.4. Análise das Mudanças Conformacionais dos Peptídeos...................................113 4.5. Perturbação da Bicamada Lipídica Promovida pela Interação dos Peptídeos de Fusão............................................................................................................................122 4.6. Análise Computacional da Interação Peptídeo-Membrana através de Simulação por Dinâmica Molecular...............................................................................................128 Parte II..........................................................................................................................142

Apresentação do artigo intitulado: “Pressure-Inactivated Yellow Fever Virus: Implications for Vaccine Development”

5. DISCUSSÃO..........................................................................................................150 Parte I...........................................................................................................................150

“Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas Biomimética”

Parte II..........................................................................................................................162 “Febre Amarela: Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina Inativada por Alta

Pressão Hidrostástica” 6. CONCLUSÕES.......................................................................................................172 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................175 8. ANEXOS...............................................................................................................202

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Índice de Tabelas

I. Parâmetros Espectroscópicos Medidos para a Ligação dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH a Diferentes Micelas......................................................................................103

II. Parâmetros Termodinâmicos da Interação Peptídeo-Micela...................................109

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Índice de Esquemas

1. Estrutura do SDS.........................................................................................................64

2. Estrutura do n-octil-β-glicopiranosídeo......................................................................64

3. Estrutura Química da Acrilamida................................................................................70

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Índice de Figuras

1. Distribuição Global de Flavivírus Dominantes e Potencialmente Importantes.........7

2. Uma Década da Doença Dengue (1995-2005)...........................................................7

3. Estrutura do Vírus da Dengue Maduro....................................................................25 4. Estrutura do Ectodomínio da Proteína E dos Flavivírus e seus Diferentes Estados

Oligoméricos............................................................................................................28

5. Sequência de Eventos Mostrando as Mudanças Conformacionais de Diferentes Proteínas de Fusão de Vírus....................................................................................32

6. O Ciclo Replicativo dos Flavivírus.............................................................................35

7. Representação Esquemática da Organização do Genoma e do Processamento da Poliproteína dos Flavivírus.......................................................................................37

8. Esquema das Etapas do Processo de Fusão de Flavivírus........................................44

9. Reconhecimento Molecular de Peptídeos na Superfície da Membrana.................52

10. Estrutura da Proteína E do WNV e dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH................62

11. Representação do Peptídeo de Fusão FLAH em Caixa d’água ou em Bicamada Lipídica Composta por POPE...................................................................................81

12. Loop de Fusão da Glicoproteína E dos Flavivírus.....................................................81

13. Sistema de Alta Pressão Hidrostática......................................................................85

14. Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade de Peptídeos de Fusão Virais........................................................................................................................95

15. Espectros de Absorção e de Emissão de Fluorescência dos Peptídeos de Fusão de Flavivírus..................................................................................................................97

16. Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de SDS, Monitorada por Supressão de Fluorescência por Acrilamida..........................................................100

17. Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo, Monitorada por Supressão de Fluorescência por Acrilamida...104

18. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH..................................................................................................107

19. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH....................................108

20. Efeito da Temperatura na Entalpia de Ligação Peptídeo-Micela...........................111

21. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de NaCl................................................................112

xxv

22. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de TFE....................................................................................................................116

23. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH Submetidos à Alta Temperatura..................................................................................................117

24. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de Micelas de SDS..................................................................................................119

25. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo...........................................................120

26. Termograma de Vesículas Multilamelares na Presença e na Ausência dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH............................................................................126

27. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH durante Simulações em Água..............................................................................................130

28. Número de Ligações de H e Distância Mínima entre os resíduos de Trp e Phe....132

29. Representação da Simulação da Interação dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH com membrana de POPE.......................................................................................133

30. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH durante Simulações em Membrana....................................................................................135

31. Distância Mínima dos Resíduos Gly104 e His104 em Relação à Membrana.........137

32. Número de Ligações de H entre os Componentes do Sistema..............................139

33. Distância Mínima dos Resíduos Arg99, Trp101 e Phe108 entre si e em Relação à Membrana....................................................................................................................141

Introdução Geral

1

1. Introdução Geral

1.1. A História da Virologia: o desenvolvimento dos conceitos de vírus

Na última metade do século XIX, a existência de um mundo

microbiológico diverso de bactérias, fungos e protozoários foi bem

estabelecida. Por volta de 1840, o anatomista alemão Jacob Henle sugeriu

a existência de agentes infecciosos que seriam muito pequenos para

serem observados por um microscópio e que eram capazes de causar

doenças específicas. Como não encontrou nenhuma evidência direta para

tal entidade, esta idéia não foi bem sucedida.

O primeiro avanço na Microbiologia para a descoberta destes

agentes submicroscópicos foi dado por Louis Pasteur, através da

demonstração de que a geração espontânea de microorganismos não

ocorre. Joseph Lister contribuiu para a técnica de diluição limite para

obter culturas puras de organismos, e Robert Koch, um estudante de

Jacob Henle, dentre outras descobertas, desenvolveu o meio sólido e o

isolamento de colônias individuais de bactérias. Embora muitos cientistas

daquela época tenham contribuído para diversas técnicas e conceitos,

foram principalmente Pasteur, Lister e Koch que propuseram juntos uma

nova tecnologia experimental para a Ciência Médica.

Introdução Geral

2

Estes estudos formalizaram algumas idéias originais de Henle e são

hoje conhecidas como os postulados de Koch que definem se um

determinado organismo é de fato o agente causador de uma doença. Os

postulados de Koch determinam que (a) o organismo deve ser

regularmente encontrado nas lesões da doença, (b) o organismo deve ser

isolado em cultura pura, (c) a inoculação de tal cultura pura em

hospedeiros deveria iniciar a doença, e (d) o organismo deve ser

recuperado novamente a partir das lesões do hospedeiro (Levine & Enquist,

2007).

Em 1879, Adolf Mayer, um cientista alemão, começou sua pesquisa

com a doença do tabaco e, embora ele não fosse o primeiro a descrever

tal doença, nomeou a Doença do Mosaico do Tabaco após observar e

estudar pontos claros e escuros sobre a folhagem infectada. Em um de

seus experimentos, foi inoculado extrato das plantas doentes em plantas

sadias. Este é o primeiro relato de transmissão experimental de uma

doença viral. Porém, embora estes estudos estabelecessem a natureza

infecciosa da doença, nenhum agente bacteriológico ou fúngico pode ser

cultivado ou detectado nestes extratos, o que não satisfazia os postulados

de Koch (Levine & Enquist, 2007).

Introdução Geral

3

O segundo passo foi dado por Dimitri Ivanofsky, um cientista russo.

Em 1887, Ivanofsky repetiu as observações de Mayer demonstrando que a

seiva das plantas infectadas continha um agente capaz de transmitir a

doença para as plantas saudáveis e passou esta seiva através de um filtro

que bloqueava a passagem de bactérias, o filtro de Chamberland. Assim,

em fevereiro de 1892, Ivanofsky relatou à Academia de Ciências de St.

Petersburg que a seiva das folhas infectadas com a Doença do Mosaico do

Tabaco retinha sua propriedade infecciosa mesmo após a passagem pelo

filtro. Este experimento forneceu uma definição funcional de vírus (Levine

& Enquist, 2007).

Contudo, Ivanofsky, assim como Mayer, fracassou em cultivar um

organismo a partir de um extrato filtrado e, portanto, não satisfez os

postulados de Koch. Na época, muitos refutaram seus experimentos,

sugerindo que o filtro utilizado poderia estar defeituoso ou até mesmo

que sua metodologia pudesse estar errada. Por esta razão, o próprio

Ivanofsky sugeriu a possibilidade de que uma toxina (não um agente vivo

ou reprodutor) poderia passar através do filtro e causar a doença. Como

no fim do século XIX os conceitos de Koch se tornaram paradigmas

dominantes da Microbiologia Médica, muitos cientistas interpretavam

Introdução Geral

4

erroneamente seus resultados. Somente quando estas regras foram

quebradas é que o conceito de um vírus nasceu (Levine & Enquist, 2007).

O terceiro cientista a ter um papel importante no desenvolvimento

dos conceitos de vírus foi Martinus Beijerinck, que repetiu os

experimentos de Mayer e Ivanofsky, mas estendeu seus estudos

mostrando que o extrato filtrado poderia ser diluído e então recuperar sua

“força” após replicação em tecido vivo da planta hospedeira, não em

extrato sem célula, indicando que o agente não era uma simples toxina.

Este foi o progresso para a descoberta de um organismo menor que uma

bactéria (um agente filtrável), não observável em microscópio comum, e

capaz de se reproduzir em células ou tecidos vivos. Beijerinck nomeou

este agente como um líquido vivo contagioso. O conflito sobre a natureza

dos vírus serem líquidos ou partículas durou 25 anos, até d’Her elle

desenvolver o ensaio de plaque, em 1917, e o surgimento das primeiras

micrografias eletrônicas do Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), em 1939.

Loeffler e Frosch descreveram e isolaram o primeiro agente filtrável a

partir de animais, o Vírus da Febre Aftosa (FMDV), e Walter Reed

identificou o primeiro vírus filtrável humano, o Vírus da Febre Amarela

(YFV) (Levine & Enquist, 2007).

Introdução Geral

5

Os vírus, devido à sua natureza predatória, têm formado a história e

a evolução de seus hospedeiros. As consequências médicas das infecções

virais humanas têm alterado nossa história e têm resultado em grandes

esforços por parte dos virologistas para estudar, compreender e erradicar

estes agentes patogênicos (Levine & Enquist, 2007).

1.2. Epidemiologia

Flaviviridae é uma grande família de patógenos virais responsável

por causar severas doenças e mortalidade em humanos e animais. A

família consiste de três gêneros: Flavivírus, Pestivírus e Hepacivírus.

Flavivírus é o maior gênero existente na família, composto por 53 espécies

de vírus que abrigam mais de 70 vírus já descritos. A classificação é

baseada em conceitos das espécies virais que consideram a morfologia, a

organização genômica, a relação das sequências de nucleotídeos, a

associação dos vetores e a ecologia dos vírus. Neste gênero, ganham

destaque o Vírus da Dengue (DENV), o Vírus da Encefalite Japonesa (JEV),

o Vírus da Encefalite Causada por Carrapato (TBEV), o Vírus do Oeste do

Nilo (WNV) e o Vírus da Febre Amarela (YFV). O nome Flavivírus é

derivado do latim, onde a palavra flavus significa amarelo, devido à

icterícia causada pelo YFV, o protótipo da família (Lindenbach & Rice, 2001).

Introdução Geral

6

Os Flavivírus, em sua grande maioria, são patógenos transmitidos

por artrópodes, onde 27 espécies de vírus são transmitidas por mosquito,

12 são transmitidas por carrapato e 14 ainda não possuem seu vetor

identificado (Gubler et al., 2007). Os sintomas da infecção podem alcançar

desde febre moderada e mal-estar até encefalite fatal e febre

hemorrágica.

Os Flavivírus encefalíticos JEV e WNV são vírus zoonóticos,

possuindo os pássaros como seus hospedeiros vertebrados naturais e

mosquitos da espécie Culex como vetores. YFV e DENV são vírus mais

viscerotrópicos e podem causar febre hemorrágica. Estes vírus

apresentam um ciclo florestal, possuindo os primatas inferiores como seus

hospedeiros vertebrados e mosquitos Aedes como vetores principais.

As doenças causadas pelos Flavivírus estão emergindo em novas

áreas e populações, ou estão aumentando em frequência e na distribuição

geográfica (Figura 1) (Mackenzie et al., 2004).

Introdução Geral

7

Figura 1 – Distribuição Global de Flavivírus Dominantes e Potencialmente Importantes.

JE, Encefalite Japonesa; SLE, Encefalite de St. Louis; TBE, Encefalite Causada por Carrapato; WNE, Encefalite do Oeste do Nilo; YF, Febre Amarela; DEN, Dengue. Adaptado de Ghosh & Basu, 2008.

Figura 2 – Uma Década da Doença Dengue (1995-2005).

O vírus da Dengue é endêmico na maioria das áreas tropicais e subtropicais do mundo. Os números de casos de febre provocada pela Dengue, incluindo os casos de dengue hemorrágica no período entre 1995 e 2005 estão mostrados. Uma falta de vigilância dos casos de dengue durante a década passada dificulta avaliar os níveis endêmicos de Dengue nesta região. Extraído de Whitehead et al., 2007.

Introdução Geral

8

O DENV, que é transmitido por mosquito, é responsável pelas

maiores taxas de doença e mortalidade entre os membros do gênero

(Burke & Monath, 2001). Epidemias globais do DENV têm ocorrido, em parte,

devido a uma diminuição do empenho no que diz respeito ao controle dos

mosquitos acoplada a fatores sociais, como o aumento da densidade

urbana (Lindenbach et al., 2007). Mais de 50 milhões de casos da infecção

causada pelo DENV são estimados ocorrer anualmente (Figura 2) (Burke &

Monath, 2001; Gubler, 2002; WHO, 2002a). Infecções sequenciais por múltiplos

sorotipos do DENV podem levar a um quadro de febre hemorrágica, dos

quais existe uma estimativa de 500 mil casos anuais no mundo inteiro

(Burke & Monath, 2001).

WNV tem origem africana, mas sua distribuição é quase global, uma

vez que já foi isolado em quase todos os continentes, exceto na Antártica

(Figura 1). Este vírus é transportado por aves migratórias e tem emergido

em regiões temperadas da Europa e da América do Norte. A doença era

geralmente moderada, onde danos neurológicos eram raros. A partir da

década de 1990, o padrão epidemiológico mudou. Epidemias associadas a

altas taxas de doenças neurológicas e morte em cavalos e humanos

começaram a ocorrer no Norte da África. Em outubro de 2005, mais de 16

mil pessoas foram infectadas com WNV nos Estados Unidos, 7 mil das

Introdução Geral

9

quais foram afetadas por doenças neurológicas e mais de 600 pessoas

morreram (Gubler et al., 2007).

A Febre Amarela é uma doença zoonótica, cujo ciclo de transmissão

primária envolve primatas não humanos e mosquitos silvestres.

Alternativamente, os mosquitos domésticos, Aedes aegypti, podem

transmitir o vírus, sendo os humanos os únicos hospedeiros que

apresentam viremia no ciclo urbano. A Febre Amarela ocorre em muitos

países tropicais da América do Sul e da África Sub-Saariana (Gubler et al.,

2007). A Organização Mundial da Saúde estima que a cada ano existam

cerca de 200 mil casos de Febre Amarela, com aproximadamente 30 mil

mortes em todo o mundo (WHO, 2001). O oeste da África, uma região

bastante incidente, já experimentou cinco epidemias urbanas de Febre

Amarela desde 2000 (WHO, 2005).

O JEV apresenta uma ampla distribuição pela Ásia. Cerca de 50 mil

casos e 10 mil mortes são identificados anualmente por toda a Ásia,

porém a doença é fracamente relatada. A incidência no Japão, na Coréia

do Sul e em Taiwan tem declinado consideravelmente desde a década de

1980 devido à expansão do uso da vacina em crianças, além de outras

medidas preventivas. Apesar disso, a incidência de Encefalite Japonesa na

China ainda é alta e alcança mais de 10 mil casos por ano (Gubler et al.,

Introdução Geral

10

2007). Em 2001, mais de 50 mil casos da doença foram reportados (WHO,

2002b). Além disso, em 2004, uma pequena epidemia ocorreu em Hong

Kong. Em países mais pobres da Ásia, 68% das crianças estão em risco.

Estudos na Índia mostram que 70% dos pacientes com Encefalite Japonesa

podem morrer ou apresentar deficiência neurológica (Gubler et al., 2007).

O TBEV apresenta uma distribuição natural por todo norte central

da Eurásia, incluindo pelo menos 16 países na Europa, que geralmente

segue a distribuição geográfica dos principais carrapatos vetores. Na

Rússia, a maior incidência ocorre no oeste da Sibéria, com mais de 10 mil

casos anualmente. Nos países da Escandinávia, o número de casos tem

aumentado possivelmente devido aos invernos mais quentes e à chegada

precoce da primavera (Gubler et al., 2007).

1.3. A Febre Amarela

1.3.1. Histórico da Doença

A Febre Amarela foi reconhecida como uma entidade clínica em

1648, em Yucatan. As áreas tropicais das Américas foram sujeitas a

grandes epidemias desde o século XVII até início do século XX, e a doença

ocorreu em focos epidêmicos até o norte de Boston e Halifax. Ela também

apareceu durante o século XVIII na Itália, França, Espanha e Inglaterra. Em

Introdução Geral

11

1905, ainda houve 5000 casos e 1000 mortes nos portos das cidades do

sul dos EUA. Os mosquitos foram sugeridos como vetor da Febre Amarela

por Nott em 1848, mas esta teoria só foi seriamente proposta por Carlos

Finlay, em 1881. Em 1900, Walter Reed demonstrou a existência de um

agente filtrável no sangue de pacientes (Gubler et al., 2007).

Os Flavivírus têm sido experimentalmente estudados desde inícios

do século passado. O Vírus da Febre Amarela (YFV) foi o primeiro agente

filtrável mostrado como sendo um causador de doença em humanos, e o

primeiro vírus demonstrado ser transmissível por um vetor artrópode

(Theiler & Downs, 1973). Essas descobertas ocorreram no limiar do século XX,

cerca de 350 anos após a primeira descrição da doença.

Em 1927, Mahaffy e Bauer isolaram o primeiro Flavivírus, o YFV, por

inoculação de um macaco Rhesus com sangue de um paciente em Ghana.

Esta foi a fonte da cepa Asibi, origem da vacina 17D (Stokes et al., 1928). Em

1937, Theiler e Smith relataram a atenuação da cepa Asibi por passagens

em embriões de galinha e demonstraram o uso dos vírus modificados

(17D) para imunização humana (Theiler & Smith, 1937a). Durante a primeira

década do século passado, o Vírus da Dengue foi também mostrado ser

um agente filtrável e transmitido por artrópodes, mas ele não foi isolado

até 1943.

Introdução Geral

12

A Febre Amarela continuou sendo um dos maiores problemas de

saúde pública nas Américas. Os maiores casos são do tipo selvagem, e

nenhuma epidemia ocasionada por Aedes aegypti tem sido relatada nos

últimos 50 anos. Entretanto, na África, grandes epidemias envolvendo

milhares de casos continuam ocorrendo, e a incidência da doença tem

sido dramaticamente aumentada nos últimos anos (Lindenbach & Rice, 2001).

O Aedes aegypti e vários vetores silvestres têm sido responsáveis pelas

transmissões epidêmicas neste continente.

1.3.2. As Características da Doença

A Febre Amarela é uma doença infecciosa, não contagiosa, que se

mantém endêmica ou enzoótica nas florestas tropicais da América e

África, causando periodicamente surtos isolados ou epidemias de maior

ou menor impacto em saúde pública, sendo transmitida ao homem

mediante a picada de insetos hematófagos da família Culicidae, em

especial dos gêneros Aedes e Haemagogus (Monath, 2001). Humanos e

primatas são os principais animais infectados pelo vetor, o mosquito.

O Vírus da Febre Amarela se insere no grupo dos arbovírus,

apresentando-se em sua forma clássica com febre hemorrágica de elevada

letalidade. A Febre Amarela constitui a febre hemorrágica original, a

Introdução Geral

13

primeira descrita e que mais temor provoca na sociedade moderna

(Monath, 2001).

Sob o ponto de vista epidemiológico, a Febre Amarela se divide em

duas formas, rural e urbana, que diferem entre si quanto à natureza dos

transmissores e dos hospedeiros vertebrados, e o local de ocorrência

(Monath, 1988). Embora apenas um sorotipo do vírus amarílico seja

conhecido, há pequenas alterações genéticas entre as cepas da América e

da África, que permitem atualmente caracterizar dois e cinco genótipos,

respectivamente, não se sabendo se um é mais patogênico que o outro

(Wang et al., 1996; Mutebi et al., 2001).

Eliminou-se a forma urbana na América em 1954, mas ainda hoje

ela ocorre na África (Monath, 2001). A letalidade global varia entre 5-10%,

percentual elevado quando comparado a outras viroses. Entre os casos

graves que evoluem com síndromes ictero-hemorrágica e hepato-renal, a

letalidade pode chegar a 50%. Os pacientes mais acometidos são

geralmente indivíduos jovens, do sexo masculino, realizando atividades

agropecuárias e de extração de madeira, bem como ecoturistas que se

embrenham nas matas sem vacinação prévia.

A África responsabiliza-se por mais de 90% dos casos de Febre

Amarela anualmente notificados à Organização Mundial de Saúde, o que

Introdução Geral

14

corresponde a cerca de 5000 casos anuais. Na América do Sul, estima-se a

ocorrência de 300 casos por ano. E em alguns países da África há

transmissão urbana da doença (Robertson et al., 1996).

O vírus inicialmente se replica nos nódulos linfáticos, então se

espalha para o fígado, baço, medula óssea e miocárdio (Shoff et al., 2001). Ele

permanece silencioso durante uma fase de incubação que dura de 3 a 6

dias, e então o indivíduo apresenta um quadro de febre, mialgia, dor de

cabeça, anorexia e vômito. Geralmente a febre ocorre em pulsos lentos.

Muitos pacientes melhoram após 3 a 4 dias. Contudo, 15% entram na

“fase tóxica” dentro de 24 horas, e sua condição progride para coagulação

intravascular disseminada (Shoff et al., 2001). A febre reaparece, e a icterícia

hemolítica e hepática se desenvolve rapidamente, e é acompanhada por

dores abdominais e vômitos. A hemorragia pode ocorrer no nariz, boca,

olhos ou estômago, e o funcionamento do rim deteriora. O tratamento é

mantido, mas metade dos pacientes morrem na “fase tóxica”, dentro de

duas semanas.

1.3.3. A Vacinação: suas vantagens e seus problemas

O controle da transmissão dos Flavivírus tem sido realizado

principalmente por medidas de controle do vetor e pela vacinação.

Introdução Geral

15

Entretanto, um número ainda limitado de vacinas está disponível,

incluindo a vacina contra a Febre Amarela (YF), que usa o vírus YF 17D

atenuado, as vacinas inativadas contra a Encefalite causada por carrapato

(TBE) e a Encefalite Japonesa (JE), todas para uso em humanos, além da

vacina inativada contra a Febre do Oeste do Nilo (WN), para uso em

animais (Mackenzie et al., 2004; Pugachev et al., 2005).

Apesar disso, as doenças provocadas por estes vírus são ainda

proeminentes no mundo inteiro (Lindenbach & Rice, 2001). Grandes esforços

vêm sendo empenhados para o desenvolvimento de uma vacina contra

DENV e este tem sido um desafio constante há décadas. A principal

questão é desenvolver uma vacina que proteja simultaneamente contra os

quatro sorotipos existentes (Sampath & Padmanabhan, 2009).

Na ausência de vacinas, fármacos para terapias específicas se

tornam necessários, mas nenhuma medicação antiviral está aprovada para

uso contra os Flavivírus. Ribavirina suprime a replicação de alguns agentes

in vitro, mas demonstrações de atividade in vivo têm tornado este

fármaco limitante para uns poucos modelos de roedores (Leyssen et al., 2008).

Existe, então, uma necessidade de identificação e desenvolvimento de

novos antivirais que possam reduzir a viremia durante os estágios iniciais

da infecção, bloqueando a replicação viral no cérebro no caso de uma

Introdução Geral

16

possível encefalite, ou modulando a resposta do hospedeiro para evitar ou

combater a doença (Bray, 2008).

Desta maneira, não havendo tratamento específico para o paciente

acometido pela doença, o médico deve tratar os sintomas, como as dores

de cabeça e no corpo, com analgésicos e antitérmicos. Porém, devem ser

evitados os salicilatos (AAS e Aspirina), já que seu uso pode favorecer o

aparecimento de manifestações hemorrágicas.

Em 1927, uma cepa do YFV foi isolada, a qual mais tarde resultou na

vacina usada para imunização humana: a cepa Asibi (Stokes et al., 1928)

isolada de um jovem africano, assim chamado, por passagens em macacos

Rhesus (Macaca mulatta).

Em 1935, a cepa Asibi foi adaptada para o crescimento em tecido

embrionário de camundongos (Lloyd et al., 1936). Após 17 passagens, o vírus,

nomeado 17D, foi cultivado até a passagem 58 em tecido embrionário

sadio de galinha e depois disso, até a passagem 114, somente em tecido

embrionário de galinha denervado. Nesta época, verificou-se uma redução

acentuada no viscero- e neurotropismo viral quando o vírus foi injetado

intracerebralmente em macacos (Theiler & Smith, 1937b). Além disso, estes

vírus foram subcultivados até passagens 227 e 229, que foram usados em

8 voluntários (Theiler & Smith, 1937a) com resultados satisfatórios, como

Introdução Geral

17

mostrado pela ausência de reações adversas e soroconversão para Febre

Amarela dentro de duas semanas. A imunização em larga escala foi então

realizada no Brasil (Smith et al., 1938; Soper & Smith, 1938).

O desenvolvimento da primeira vacina atenuada contra Flavivírus,

YFV cepa 17D, levou ao reconhecimento de Max Theiler através de um

Prêmio Nobel em 1951. Atualmente, duas cepas são usadas na produção

de vacinas contra a Febre Amarela: 17DD no Brasil e 17D-204 no resto do

mundo. A diferença entre elas é que a cepa 17DD possui 81 passagens a

mais (Galler et al., 2001).

YF 17D é uma vacina viral atenuada, segura e eficaz, preparada a

partir de embriões de galinha infectados sob os padrões desenvolvidos

pela Organização Mundial de Saúde (Lindenbach & Rice, 2001). A imunidade

ocorre em cerca de 95% dos vacinados dentro de 10 dias. Pela proposta

do certificado internacional, a imunização é válida por 10 anos, mas vários

estudos têm mostrado persistência dos anticorpos por mais de 30 anos

(Lindenbach & Rice, 2001). Muitos países da América do Sul conduzem

campanhas de vacinação e uma grande cobertura da vacina em áreas

enzoóticas tem limitado a incidência da doença em humanos.

O princípio da vacina de vírus atenuado é que o patógeno é

suficientemente deficiente, sendo incapaz de provocar doença. As

Introdução Geral

18

maiores preocupações no desenvolvimento de vacinas atenuadas são o

grau de atenuação e o potencial para reversão da virulência. Utilizando a

tecnologia convencional, a atenuação é realizada por passagens do agente

in vitro, e os variantes são selecionados pela sua virulência reduzida. Uma

vez que o agente deve se replicar in vivo com o objetivo de induzir uma

resposta imune efetiva, a super-atenuação limitaria a replicação, e a

magnitude e a qualidade da resposta imune não seriam adequadas para

fornecer proteção contra o vírus selvagem. Em contraste, a baixa

atenuação resultaria em doença clínica. Então, deve existir um balanço

fino entre a atenuação de magnitude suficiente para reduzir os sinais

clínicos e a super-atenuação, que limitaria a eficiência da vacina (Babiuk et

al., 2002).

Infelizmente, esta maneira de abordar é puramente empírica, já que

os genes podem ser alterados como resultado de mutações, o que leva a

dois problemas. Primeiro, cada mutante deve ser testado in vivo para

avaliar se seu nível de atenuação é suficiente para não causar doença, e

ainda assim ser capaz de estimular a imunidade e a memória. Segundo,

uma vez que a atenuação ocorre ao acaso e ela não é caracterizada, existe

a possibilidade do agente voltar a mutar e reverter a virulência (Babiuk et

al., 2002).

Introdução Geral

19

Assim, apesar destas vacinas serem geralmente muito eficientes,

existe uma preocupação em relação ao seu potencial satisfatório. Isto é o

caso de alguns indivíduos que possam estar parcialmente

imunossuprimidos devido ao estresse ou a outros fatores que possam

torná-los susceptíveis à vacina atenuada. Algumas destas vacinas não

podem ser usadas em grávidas, já que podem induzir aborto (Straub, 1990).

É por esta razão que algumas companhias, produtores e países não são

favoráveis às vacinas atenuadas. Se a estabilidade genética para estas

vacinas fosse bem controlada, elas seriam consideradas melhores que as

vacinas inativadas, uma vez que elas induzem uma ampla resposta imune

(celular e humoral), similar àquela induzida pela infecção natural. Outra

vantagem da vacina é que os vírus se replicam normalmente no

hospedeiro e isto geralmente induz uma maior duração da imunidade.

Existem também outras desvantagens, como a presença de

contaminantes estranhos aos vírus, já que a vacina é crescida em cultura

de tecido (Babiuk et al., 2002).

Estudos comparativos das cepas selvagens e variantes vacinais

indicaram somente 13 substituições nos aminoácidos, sendo 5 deles

localizados na proteína de envelope (Duarte dos Santos et al., 1995), o que pode

estar associado com a atenuação. Simulação computacional do

Introdução Geral

20

enovelamento e da estrutura secundária do ARN viral derivado da região

3’ não-codificante tem mostrado diferenças entre as cepas atenuada e

virulenta, que podem ser de importância funcional (Proutski et al., 1997).

Contudo, apesar de muitos estudos, o conhecimento dos fatores virais que

implicam na atenuação ainda está incompleto.

Os vírus vacinais são testados em macacos Rhesus para ausência de

neurotropismo e efeitos clínicos, e para garantir que alguma viremia

resultante seja baixa. Desde o declínio dos programas de controle dos

mosquitos na década de 80, a vacina 17D tem sido o elemento chave no

controle da Febre Amarela. A vacina não é recomendada para crianças

menores de 9 meses, devido à grande incidência de neurotropismo. Em

1994, uma cepa isolada de um caso fatal de encefalite associada à vacina

apresentou diferenças na sequência quando comparada ao vírus vacinal, e

foi associada com o aumento da virulência em camundongos e macacos

(Jennings et al., 1994).

Por mais de 50 anos a vacina contra a Febre Amarela foi quase além

da censura. Entretanto, recentemente, sete casos associados à vacina,

sendo seis fatais, têm desafiado a reputação dessa vacina: dois foram

brasileiros (Vasconcelos et al., 2001), quatro foram turistas norte-americanos

(Martin et al., 2001), e um foi um turista australiano (Chan et al., 2001). Assim,

Introdução Geral

21

uma maneira de resolver o problema da segurança e reversão da

virulência é o uso de vacinas inativadas, que são produzidas pela

inativação dos agentes infecciosos, de maneira que este não se replica no

hospedeiro e não altera a imunogenicidade das proteínas protetoras. A

maior desvantagem das vacinas inativadas é que elas não são muito

imunogênicas e, portanto, necessitam ser combinadas a fortes adjuvantes

para melhorar sua eficácia. E apesar de existir uma constante busca por

novos adjuvantes, somente poucos têm sua eficiência comprovada, e

muitos deles são caros e frequentemente levam a reações colaterais

adversas (Babiuk et al., 2002).

As vacinas inativadas consistem de agentes íntegros, que tenham

sido “mortos” por aquecimento ou por substâncias químicas (como é o

caso da vacina inativada contra a Poliomielite), ou são simplesmente a

parte importante do agente infeccioso que promove resposta através do

sistema imune (como na vacina contra Hepatite B). Ao contrário das

vacinas atenuadas, as vacinas inativadas não são capazes de se replicar e,

portanto, não causam nem os casos brandos da doença, porém sua

presença promove uma resposta rápida do sistema imune. Entretanto,

estas vacinas causam uma resposta relativamente fraca, de maneira que a

vacinação deve ser repetida. Diferente das vacinas atenuadas, as vacinas

Introdução Geral

22

inativadas são seguras para as pessoas que têm seu sistema imune

enfraquecido, para mulheres grávidas e para crianças com menos de um

ano. Os efeitos colaterais geralmente são apresentados na forma de dores

apenas onde a vacina foi injetada e, possivelmente, alguma febre breve

após a vacinação.

De fato, cinco são os problemas das vacinas que utilizam os vírus

“vivos”: 1) a possibilidade de reversão da linhagem da vacina, o que causa

aumento da virulência; 2) desenvolvimento da doença em indivíduos

imunosuprimidos; 3) má formação fetal, particularmente se a vacina é

dada no primeiro trimestre; 4) disseminação da linhagem vacinal a

pessoas não vacinadas; e 5) o descobrimento de complicações anteriores

desconhecidas (Seligman & Gould, 2004).

Apesar disso, a vacinação permanece altamente aconselhável para

moradores e turistas de áreas endêmicas e epidêmicas. Contudo, esses

relatos levantam questões relevantes sobre os mecanismos de atenuação

do Vírus da Febre Amarela que precisam ser urgentemente investigados.

Por este motivo, o Ministério da Saúde solicitou à Fundação

Oswaldo Cruz, maior produtor da vacina atualmente utilizada no Brasil, o

desenvolvimento de uma vacina inativada contra o YFV. Embora as vacinas

inativadas apresentem algumas vantagens como o reduzido custo de

Introdução Geral

23

produção e um baixo risco de reversão da doença, elas têm sido

correlacionadas com algumas desvantagens, como o risco de uma

incompleta inativação, toxicidade dos agentes químicos que normalmente

são utilizados para inativar as partículas virais, e alterações nas

propriedades imunogênicas dos vírus.

A alta pressão hidrostática (APH) tem sido apontada como uma

ferramenta alternativa para inativação viral e o desenvolvimento de uma

possível vacina (Masson et al., 2001; Silva et al., 2002; Ishimaru et al., 2004; Murchie et al.,

2005). Como um método físico, a APH apresenta como vantagem não

introduzir substâncias exógenas dentro da vacina, além de ser

frequentemente seletiva na sua ação sobre estruturas macromoleculares,

o que geralmente resulta em preparações altamente imunogênicas (Silva et

al., 1992; Tian et al., 1999; Pontes et al., 2001; Ishimaru et al., 2004).

Com este objetivo, iniciamos uma colaboração com o Laboratório

de Tecnologia Virológica (LATEV) de Bio Manguinhos, que apresenta uma

grande experiência nesta área. Nossa intenção era buscar a condição ideal

de inativação do YFV 17DD utilizando como ferramenta a APH. A partir

deste resultado que foi bastante satisfatório, este trabalho endereçou

duas questões importantes: será que as partículas virais inativadas são

capazes de gerar uma resposta imunológica eficiente? Qual o grau de

Introdução Geral

24

modificação que a pressão promove na estrutura das partículas? Esta

última questão foi abordada em minha dissertação de mestrado, onde

mostramos que a pressão é capaz de induzir uma mudança

conformacional sutil parcialmente reversível, mantendo as partículas

íntegras (Mendes, 2005). Assim, a possível resposta imunogênica induzida

pelo YFV 17DD inativado por APH será abordada na segunda parte desta

tese.

1.4. A Estrutura dos Flavivírus

Os virions do gênero Flavivírus possuem aproximadamente 50 nm

de diâmetro e são compostos por um genoma ARN de fita simples,

polaridade positiva, que é empacotado por proteínas capsídicas virais e

uma bicamada lipídica derivada da célula hospedeira, onde se encontram

inseridas 180 cópias de duas glicoproteínas virais (Figura 3) (Lindenbach &

Rice, 2001; Mukhopadhyay et al., 2005).

A proteína E consiste de um dímero em que cada monômero

apresenta três domínios em β-barril: um domíno estrutural central

(domínio I) contém o N-terminal e é flanqueado pelos outros dois

domínios; um domínio de dimerização alongado (domínio II), que contém

um peptídeo de fusão em sua extremidade; e um domínio III, que é um

Introdução Geral

25

domínio tipo imunoglobulina e contém o sítio de ligação ao receptor

(Whitehead et al., 2007).

Figura 3- Estrutura do Vírus da Dengue Maduro.

Empacotamento da glicoproteína E no vírus maduro. O DENV é um vírus esférico e envelopado, apresentando um diâmetro de aproximadamente 50 nm. Um dos 90 domínios compostos por um dímero da glicoproteína E dispostos paralelamente está em evidência. Os domínios I, II e III estão coloridos em vermelho, amarelo e azul respectivamente. O peptídeo de fusão está representado em verde. Adaptado de Whitehead et al., 2007.

Glicoproteína de Envelope

― Domínio I – estrutura central

― Domínio II – dimerização

― Domínio III – ligação ao receptor

― Peptídeo de Fusão

Introdução Geral

26

O genoma em torno de 10,8 kb é uma região aberta de leitura

flanqueada por regiões 5’ e 3’ não traduzidas, que apresentam estruturas

secundárias essenciais para a iniciação da tradução e para a replicação. A

tradução do genoma pela maquinaria da célula hospedeira codifica uma

única poliproteína. Cerca de ¼ do terminal amino desta poliproteína

codifica três proteínas estruturais – capsídica (C), de membrana (M, que é

expressa como prM, o precursor da M) e de envelope (E) – que

constituem a partícula viral. O restante do genoma codifica as proteínas

não-estruturais – NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B e NS5 - que são

essenciais para a replicação viral (Lindenbach et al., 2007).

A proteína capsídica é altamente básica, consiste de cerca de 120

aminoácidos (massa molecular 11 kDa) e está envolvida no

empacotamento do genoma viral e na formação do nucleocapsídeo

(Lindenbach & Rice, 2001). A proteína C nascente contém uma âncora

hidrofóbica C-terminal que serve como um peptídeo sinal para a

translocação de prM pelo retículo endoplasmático (RE). Este domínio

hidrofóbico é clivado pela serino-protease viral (Lobigs, 1993). A proteína C

se enovela em dímeros compactos e cada monômero possui quatro -

hélices (Jones et al., 2003; Dokland et al., 2004; Ma et al., 2004). Ainda não está

claro como os dímeros da proteína C se organizam em nucleocapsídeos,

Introdução Geral

27

mas a interação com ARN ou ADN pode induzir dímeros isolados a se

montarem em partículas como nucleocapsídeos (Kiermayr et al., 2004).

prM e E são duas glicoproteínas que ficam ancoradas no envelope

lipídico viral através de duas hélices transmembranares e que, durante a

montagem dos virions no RE, ficam complexadas, formando partículas

imaturas. A glicoproteína prM ( 26 kDa) é a proteína precursora da

proteína M e funciona como uma chaperona para auxiliar no perfeito

enovelamento e montagem da proteína E (Lorenz et al., 2002). Assim, a

principal função da prM é evitar que a proteína E sofra um rearranjo

estrutural, catalisado pelo meio ácido, para a forma fusogênica durante a

transição através da via secretória (Guirakhoo et al., 1992; Heinz et al., 1994).

A conversão das partículas imaturas em maduras (Figura 4) ocorre

na via secretória e coincide com a clivagem de prM pela protease furina

do Golgi, produzindo o peptídeo pr e a proteína M (~ 75 aminoácidos)

(Stadler et al., 1997). Após a clivagem, o heterodímero prM-E se dissocia, o

fragmento pr é liberado e ocorre a formação de homodímeros da proteína

E (Wengler & Wengler, 1989; Stiasny et al., 1996).

Introdução Geral

28

Figura 4 – Estrutura do Ectodomínio da Proteína E dos Flavivírus e seus Diferentes Estados Oligoméricos.

Estado oligomérico da proteína E na partícula imatura (A), na partícula madura (B) e na conformação fusogênica (C). Na partícula imatura, a proteína E forma um trímero de heterodímeros prM-E, que deve se dissociar e formar homodímeros de proteína E durante a maturação. Em seguida, ocorre uma reorganização para formar homotrímeros de proteína E anterior ao processo de fusão e entrada do vírus na célula. Em um monômero da proteína E, os domínios I, II e III estão coloridos em vermelho, amarelo e azul, respectivamente, e o peptídeo de fusão está mostrado em verde. A proteína prM, colorida em ciano, só é encontrada nos vírus imaturos e está mostrada em seu papel como uma estrutura protetora do peptídeo de fusão. Extraído de Perera et al., 2008.

A B C

Vírus Imaturo Trímero de Heterodímeros prM-E

Vírus Maduro Homodímero E

Vírus Pós-Fusão Trímero de E

Maturação Ativação da Fusão

Introdução Geral

29

A glicoproteína E ( 53 kDa), a maior proteína da superfície dos

Flavivírus, é o maior representante antigênico da partícula viral e contém

um sítio de ligação ao receptor celular e um peptídeo de fusão importante

para a entrada do vírus na célula hospedeira (Allison et al., 2001). A forma

nativa de E se enovela em uma estrutura alongada rica em folhas-β,

formando homodímeros que se dispõem paralelamente à superfície viral

(Rey et al., 1995). Cada subunidade da proteína E é composta por três

domínios: I, que forma uma estrutura barril-β; II, que se projeta ao longo

da superfície do vírus entre as regiões transmembranares das subunidades

homodiméricas; e III, que mantém um enovelamento tipo imunoglobulina.

O Domínio III parece estar envolvido na ligação ao receptor e é o maior

alvo de anticorpos neutralizantes.

Os vírus envelopados infectam as células via fusão da membrana

viral com a membrana da célula hospedeira (Earp et al., 2005; Harrison, 2005).

Este evento de fusão, essencial para o ciclo de infecção destes vírus,

entrega o genoma viral para dentro do citoplasma para iniciar a infecção.

A fusão de membranas dos vírus pode ocorrer tanto na membrana

plasmática ou em uma localização intracelular após internalização do vírus

por endocitose mediada por receptor (Smith & Helenius, 2004; Earp et al., 2005;

Sieczkarski & Whittaker, 2005). A fusão é mediada pelas proteínas virais

Introdução Geral

30

transmembranares conhecidas como proteínas de fusão. Sob condições

apropriadas, as proteínas de fusão interagem com a membrana alvo

através de um segmento hidrofóbico e sofre uma mudança

conformacional que governa a reação de fusão de membrana (Earp et al.,

2005).

Baseado em características estruturais importantes, as proteínas de

fusão de membrana dos vírus envelopados são divididas dentro de três

grupos (Figura 5): as proteínas de fusão da classe I, exemplificadas pela

hemaglutinina (HA) do vírus Influenza e pela gp41 do HIV-1, as proteínas

de fusão da classe II dos Alfavírus e dos Flavivírus, e as proteínas de fusão

da classe III, que foi descrita mais recentemente e tem como

representante a proteína G do VSV (Lescar et al., 2001; Da Poian et al., 2005;

Kielian, 2006; Harrison, 2008). Dentre todas as proteínas de fusão, a

hemaglutinina do vírus Influenza é a proteína de fusão melhor

caracterizada.

As proteínas de fusão da classe II são moléculas alongadas com três

domínios globulares compostos praticamente por folhas-β que se

arranjam em dímeros antiparalelos à superfície viral e sofrem uma

mudança conformacional para formarem uma estrutura trimérica durante

a reação de fusão. Em contraste, as proteínas de fusão da classe I são

Introdução Geral

31

homotrímeros que se projetam verticalmente da membrana viral e

contêm principalmente estrutura em -hélice. Uma importante

característica é que estas proteínas são trímeros antes e após a reação de

fusão. As proteínas da classe III são muito similares às da classe I, mas sua

principal diferença está na reversibilidade conformacional do seu estado

fusogênico (Skehel & Wiley, 2000; Da Poian et al., 2005; Kielian, 2006; Harrison,

2005; 2008).

Introdução Geral

32

Figura 5 – Sequência de Eventos Mostrando as Mudanças Conformacionais de Diferentes Proteínas de Fusão de Vírus.

(A) Alterações sofridas pelas proteínas de fusão classe I, mostrando sua conformação de pré-fusão (a), a dissociação da proteína HA1 (b), a estrutura intermediária de fusão (c) e a conformação de pós-fusão (d). O inserto ilustra algumas características da região proximal de membrana da HA2 após o término da fusão. O asterisco ilustra o peptídeo de fusão. Cada subunidade é mostrada em cores diferentes. (B) Alterações das proteínas classe II, mostrando a estrutura viral com as 180 subunidades da proteína E com os seus respectivos domínios I (vermelho), II (amarelo) e III (azul) (a), visão lateral da conformação pré-fusão (b), transição monomérica entre o dímero pré-fusogênico e estado intermediário trimérico (c), estado intermediário estendido (d) e a conformação pós-fusão (e). (C) Alterações conformacionais das proteínas classe III, mostrando o trímero pré-fusogênico (a), a conformação pré-fusogênica (b), a conformação intermediária estendida (c), a conformação pós-fusão de uma subunidade (d) e a conformação pós-fusão do trímero (e). As três subunidades são mostradas em cores diferentes e o asterisco denota o loop de fusão. Extraído de Harrison et al., 2008.

A

B

C

Introdução Geral

33

1.5. Ciclo de Infecção: entrada, replicação do genoma e processamento das proteínas

Os Flavivírus se ligam à superfície da célula hospedeira e

subsequentemente entram por endocitose mediada por receptor (Figura

6). Diversas moléculas de superfície celular, atuando como receptores

primários e co-receptores de baixa afinidade, vêm sendo descritas por

interagirem com partículas de Flavivírus, mas somente poucas vêm sendo

de fato caracterizadas. Os Flavivírus podem utilizar múltiplos receptores

para diferentes tipos celulares e em diferentes espécies de hospedeiro

(Mukhopadhyay et al., 2005; Lindenbach et al., 2007).

A infecção por DENV e WNV de células dendríticas, um provável

alvo primário da infecção, diferentemente para o YFV-17D, depende da

expressão celular de lectina tipo C, que funcionaria apenas como um

receptor de ligação, já que sua internalização não é necessária

(Tassaneetrithep et al., 2003; Lozach et al., 2005; Davis et al., 2006; Barba-Spaeth et

al., 2005). Desta maneira, outras moléculas seriam essenciais para a

endocitose ocorrer. Glicosaminoglicanos altamente sulfatados, como

heparan sulfato, parecem exercer um papel importante na ligação inicial

de diversos Flavivírus às células alvo (Chen et al., 1997; Kroschewski et al.,

2003).

Introdução Geral

34

Os Flavivírus são internalizados via invaginações cobertas por

clatrina e trafegam para um compartimento endocítico pré-lisossomal,

onde o baixo pH induz a fusão entre o vírus e a membrana da célula

hospedeira para liberar o nucleocapsídeo (Gollins & Porterfield, 1986; Chu &

Ng, 2004). A acidificação endossomal promove uma trimerização

irreversível da proteína E, que resulta na fusão do envelope viral com a

membrana da célula hospedeira (Figura 3) (Allison et al., 1995, Stiasny et al.,

1996). Após a fusão ter ocorrido, o nucleocapsídeo é liberado para dentro

do citoplasma, onde a proteína capsídica e o ARN se dissociam (Figura 6)

(Lindenbach et al., 2007).

Introdução Geral

35

Figura 6 – O Ciclo Replicativo dos Flavivírus.

Os virions se ligam a moléculas e receptores da célula hospedeira e são internalizados por endocitose. No pH endossomal, a glicoproteína E medeia a fusão entre o envelope viral e a membrana celular, permitindo a desmontagem do virion e a liberação do ARN no citoplasma. O ARN viral é traduzido em uma poliproteína que é processada por proteases virais e celulares. As proteínas não-estruturais, então, replicam o genoma viral. A montagem do virion ocorre na membrana do RE. A proteína capsídica e o ARN viral são envelopados pelas glicoproteínas E e prM inseridas na membrana para formar partículas imaturas, que então são transportadas através da via secretória. Na rede trans-Golgi, prM é clivada pela furina. Virions maduros são agora liberados por exocitose. Extraído de Sampath & Padmanabhan, 2009.

Introdução Geral

36

Uma vez o genoma liberado dentro do citoplasma, o ARN

polaridade positiva é traduzido diretamente para uma única poliproteína

que é co- e pós-traducionalmente processada pela serino-protease viral

(NS2B/NS3) e por proteases hospedeiras (sinalase e furina) em pelo

menos dez proteínas. A peptidase sinal do hospedeiro é responsável pelas

clivagens entre C/prM, prM/E, E/NS1 e 2K-NS4B. Uma serino-protease

codificada pelo vírus é responsável pelas clivagens entre NS2A/NS2B,

NS2B/NS3, NS3/NS4A, NS4A/2K e NS4B/NS5 (Figura 7). A enzima

responsável pela clivagem NS1/NS2A permanece desconhecida até o

momento (Lindenbach et al., 2007).

Introdução Geral

37

Figura 7 – Representação Esquemática da Organização do Genoma e do Processamento da Poliproteína dos Flavivírus.

O genoma ARN (~ 11 kb) de fita simples polaridade positiva contém região aberta de leitura (ORF) que codifica proteínas estruturais – Capsídica (C), precursor de Membrana (prM) e Envelope (E) – e não-estruturais - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B e NS5. ORF é rodeado por regiões não traduzidas. Os sítios de clivagem da poliproteína pela NS2B-NS3 viral e pelas sinalase e furina do hospedeiro estão indicados. As atividades enzimáticas de NS3 e NS5 também estão mostradas. Extraído de Sampath & Padmanabhan, 2009.

Introdução Geral

38

NS3 (70 kDa) e NS5 (104 kDa) são as proteínas não-estruturais mais

bem caracterizadas, com múltiplas atividades enzimáticas necessárias à

replicação viral. NS3 apresenta três atividades distintas: (1) serino-

protease (junto com o co-fator NS2B), essencial para o processamento da

poliproteína; (2) atividade helicase/NTPase, importante para desenrolar a

forma dupla fita replicativa do ARN; (3) ARN trifosfatase, necessária para

proteger o ARN viral nascente (Falgout et al., 1991; Zhang et al., 1992; Arias et al.,

1993; Li et al., 1999; Benarroch et al., 2004). Mutações que afetam cada

atividade impedem a replicação viral (Matusan et al., 2001a,b). NS5 é a

proteína maior e mais conservada dos Flavivírus, com mais de 75% de

identidade de sequência em relação a todos os sorotipos de DENV. Esta

proteína apresenta duas atividades enzimáticas distintas: metiltransferase

e ARN polimerase dependente de ARN (Egloff et al., 2002; Grun & Brinton,

1986; Tan et al., 1996).

NS1 (46 kDa) é importante para a replicação dos Flavivírus, já que

está envolvida na síntese de ARN fita negativa por um mecanismo ainda

desconhecido (Muylaert et al., 1997). NS2A (22 kDa) é uma proteína

transmembrana pequena e hidrofóbica, que está envolvida na geração de

membranas induzidas por vírus durante a montagem viral (Leung et al.,

2008). NS4A (16 kDa) é uma proteína de membrana integral, que induz a

Introdução Geral

39

reorganização da membrana para formar o complexo de replicação viral

(Miller et al., 2007; Roosendaal et al., 2006). NS4B (27 kDa) inibe a resposta de

interferon tipo I da célula hospedeira e pode modular a replicação viral

por interagir com NS3 (Munoz-Jordan et al., 2005; Umareddy et al., 2006).

A replicação do genoma ocorre sobre membranas intracelulares e a

montagem das novas partículas virais ocorre sobre a superfície do RE,

quando as proteínas estruturais e os novos ARNs sintetizados brotam para

dentro do lúmen do RE (Lindenbach & Rice, 2001; Lindenbach & Rice, 2003;

Brinton, 2002).

As novas partículas geradas, contendo as proteínas E e prM,

membrana lipídica e nucleocapsídeo, ainda não são capazes de induzir a

fusão na célula hospedeira, portanto, não são infecciosas (Guirakhoo et al.,

1991; 1992). Estas partículas imaturas apresentam suas glicoproteínas E e

prM em uma conformação heterodimérica. Este processo de replicação é

capaz de gerar também partículas subvirais, contendo apenas as

glicoproteínas e o envelope lipídico, não possuindo, portanto, nem a

proteína capsídica, nem o genoma viral, o que também as tornam não-

infecciosas (Schalich et al., 1996).

Por conseguinte, as partículas resultantes não-infecciosas, imaturas

e subvirais, são transportadas através da rede trans-Golgi. Os virions

Introdução Geral

40

imaturos são clivados pela protease furina hospedeira, gerando partículas

maduras infecciosas, onde suas glicoproteínas E assumem uma

conformação homodimérica na superfície do virion. As partículas subvirais

também são clivadas pela furina, sendo, desta forma, subsequentemente

liberadas por exocitose, assim como os virions maduros (Stadler et al., 1997;

Elshuber et al. 2003; Stiasny & Heinz, 2006).

Avanços na técnica de crio-microscopia eletrônica têm fornecido

importantes informações sobre a estrutura de vírus envelopados (Mancini

et al., 2000; Zhang et al., 2002; 2003). Além disso, muitas das proteínas

estruturais destes vírus vêm sendo determinadas a nível atômico (Ma et al.,

2004; Modis et al., 2003; Rey et al., 1995; Zhang et al., 2004; Lescar et al., 2001; Choi

et al., 1996; Dokland et al., 2004). Isto tem permitido as estruturas atômicas

serem fitadas dentro de mapas de densidade da crio-microscopia

eletrônica, resultando em estruturas “pseudo-atômicas” de vírus

envelopados. Desta forma, analisando diferentes intermediários na

montagem e na via de entrada dos vírus, estes processos dinâmicos

podem ser entendidos a nível molecular.

Introdução Geral

41

1.6. A Fidelidade e a Diversidade dos Peptídeos de Fusão

1.6.1. Peptídeos de Fusão

Muitos processos biológicos importantes envolvem a partição de

fragmentos de proteínas bastante hidrofóbicos dentro de membranas

lipídicas. Os peptídeos de fusão são segmentos moderadamente

hidrofóbicos de proteínas de fusão de membrana, viral ou não-viral, que

capacitam estas proteínas a romperem e conectarem duas membranas

biológicas próximas. Este processo, que resulta na fusão de membranas,

ocorre de maneira bem controlada com uma pequena quantidade de

extravazamento de conteúdo dos volumes encapsulados para o lado

externo. A questão chave é entender como os peptídeos de fusão, que são

ditos como a extensão funcional mais crítica das proteínas de fusão,

executam esta complexa tarefa (Tamm & Han, 2000).

As sequências dos peptídeos de fusão são altamente conservadas

dentro de diferentes grupos de proteínas de fusão, por exemplo, dentro

de diferentes famílias de vírus, mas não entre elas. A maioria dos

peptídeos de fusão estão localizados na extremidade N-terminal de

subunidades transmembranares de proteínas de fusão. Entretanto, em

alguns casos, peptídeos de fusão internos são encontrados, como é o caso

da proteína fertilina- de esperma, da proteína G do Vírus da Estomatite

Introdução Geral

42

Vesicular (VSV), da proteína gp64 do Baculovírus e da proteína gp37 do

Vírus do Sarcoma de Rous (Tamm & Han, 2000).

A deleção da sequência completa do peptídeo de fusão ou, até

mesmo, alterações em um único aminoácido conservado no peptídeo de

fusão podem abolir completamente a fusão de membranas, enquanto

outras propriedades estruturais e funcionais desta proteína de fusão

podem permanecer intactas. Tais experimentos de mutagênese apontam

claramente para o papel central dos peptídeos de fusão na fusão de

membranas. Mesmo peptídeos de fusão isolados podem sustentar a idéia

de fusão de membranas em sistemas modelo. Desta forma, estes estudos

tentam elucidar o papel preciso dos peptídeos de fusão no mecanismo de

fusão de membranas mediado por proteínas. Diversos pesquisadores têm

desenvolvido muitos sistemas modelo nos últimos vinte anos com o

objetivo de estabelecer a relação estrutura-função de peptídeos de fusão

em sistemas simples de bicamada lipídica (Tamm & Han, 2000).

Embora muitas propriedades importantes dos peptídeos de fusão já

tenham sido descritas há anos, algumas questões a respeito da estrutura e

da função destes peptídeos permanecem sem respostas. Recentes

progressos no desenho de peptídeos têm gerado esperança sobre o

Introdução Geral

43

entendimento baseado na estrutura de como os peptídeos de fusão

funcionam sobre a membrana (Tamm & Han, 2000).

O Vírus Influenza é um exemplo de um vírus típico que utiliza a

acidificação endossomal para ter acesso ao citoplasma da célula

hospedeira. Este processo tem sido extensivamente explorado, e o

mecanismo de escape ocorre através da fusão de membranas. O baixo pH

endossomal induz alterações conformacionais na proteína de envelope

Hemaglutinina (HA2), resultando na exposição de um segmento de 20-25

aminoácidos. Este segmento é conhecido como o peptídeo de fusão deste

vírus devido a sua capacidade em mediar a fusão entre vesículas lipídicas,

mesmo na ausência do restante da proteína. Em vários subtipos do Vírus

Influenza tipo A, a sequência dos peptídeos de fusão é altamente

conservada (Tamm, 2003).

1.6.2. Os Peptídeos de Fusão dos Flavivírus

Estudos cristalográficos mostram a presença de um loop CD na

ponta do domínio II da glicoproteína E dos Flavivírus. Este loop, contendo

os aminoácidos 98-113, foi interpretado como sendo o peptídeo de fusão

destes vírus (Rey et al., 1995).

Introdução Geral

44

No virion maduro, o peptídeo de fusão de um monômero está

escondido sob a superfície dos domínios I e II no monômero adjacente

(Seligman, 2008). Na presença do baixo pH endossomal, a proteína E sofre

trimerização com exposição do peptídeo de fusão e posterior inserção na

membrana alvo. Este mecanismo induz a aproximação entre o envelope

viral e a membrana do endossomo facilitando o processo de mistura de

lipídios entre as membranas (hemifusão), formação do poro e liberação do

nucleocapsídeo no citoplasma celular (Figura 8).

Figura 8 – Esquema das Etapas do Processo de Fusão de Flavivírus.

Desenho esquemático da configuração da proteína E sobre a superfície dos vírions em um pH neutro no estado de pré-fusão (a); dissociação dos dímeros de E em monômeros induzida pelo baixo pH, havendo projeção dos monômeros com exposição e interação dos peptídeos de fusão com a membrana alvo (b); formação do trímero (c); formação do intermediário de hemifusão com mistura dos folhetos externos (d); formação do estágio final de pós-fusão e abertura do poro de fusão (e). Proteína E colorida como na Figura 3. Membrana viral: folheto externo em amarelo, folheto interno em azul; membrana alvo: folheto externo em preto, folheto interno em vermelho. Extraído de Stiasny et al., 2009.

Introdução Geral

45

A estrutura cristal da proteína E do vírus da Dengue na conformação

pós-fusão foi determinada por Modis et al. (2004). Os loops de fusão nos

trímeros inseridos em um modelo de membrana apresentam a mesma

conformação que nos dímeros (Modis et al., 2003). Como os dímeros podem

se dissociar reversivelmente, o loop de fusão é estável quando

completamente exposto, sugerindo que ele retenha essencialmente a

mesma conformação quando escondido por outra subunidade, quer esteja

inserido em uma bicamada lipídica ou exposto ao solvente aquoso (Modis

et al., 2004).

Baseado na conservação dos aminoácidos entre os Flavivírus, no

elevado conteúdo de resíduos de Glicina, na flexibilidade molecular e em

características químicas similares a peptídeos de fusão já conhecidos,

sugere-se que os aminoácidos de 98 a 120 da proteína E sejam capazes de

mediar a fusão de membranas (Roehrig et al., 1989). Análises subsequentes

dos peptídeos de fusão incluíram os aminoácidos 98-110 (Roehrig et al.,

1990) e 99-116 (Ledizet et al., 2007).

Avaliações funcionais para alguns aminoácidos que influenciam a

fusão ou a replicação viral já foram reportadas, por exemplo, para os

aminoácidos 104, 106 e 107 (Pletnev et al., 1993; Allison et al., 2001; Trainor et

al., 2007). Acredita-se que o N-terminal do peptídeo de fusão seja o resíduo

Introdução Geral

46

D98. Isto porque esta região é o início de uma sequência de aminoácidos

conservados e devido à sua participação em uma ponte salina com o

resíduo K110. O C-terminal ainda não tem funcionalidade definida

(Seligman, 2008).

Uma sequência canônica é definida como uma sequência

conservada em uma variedade de vírus quando comparada a uma

sequência selvagem. De acordo com esta definição, 12 dos 16

aminoácidos que englobam o peptídeo de fusão dos Flavivírus

compreendem uma sequência canônica, 98DRGWGNXCGXFGKGXX113

(onde X representa os aminoácidos variáveis). Em Flavivírus transmitidos

por mosquito, o aminoácido 104 é uma Glicina, enquanto nas cepas

transmitidas por carrapato, 104 é uma Histidina. Independente do vetor,

107 é um resíduo de Leucina, exceto no Vírus de Powassan (transmitido

por carrapato), em que na posição 107 existe uma Fenilalanina (Seligman,

2008).

Somente 18% dos aminoácidos são completamente conservados

entre as glicoproteínas E dos Flavivírus patogênicos (Seligman & Bucher,

2003). Embora o peptídeo de fusão contenha somente 3,2% dos

aminoácidos nesta proteína, ele contém 13% dos aminoácidos

Introdução Geral

47

conservados em E, tornando-o a sequência mais conservada na proteína E

e possivelmente no genoma inteiro dos Flavivírus (Seligman, 2008).

Seis dos aminoácidos conservados do peptídeo de fusão são Glicinas

(cinco nos vírus transmitidos por carrapato). Uma vez que os resíduos de

Glicina podem permitir a rotação ao redor de suas ligações C-C e C-N, sua

presença provavelmente facilita as alterações conformacionais

necessárias para a fusão ocorrer. Desta maneira, do ponto de vista

evolucionário, a conservação destes aminoácidos associada a estas

mudanças conformacionais altamente organizadas foi extremamente

importante, principalmente porque a partícula viral deve ser capaz de

fundir tanto com células de mamífero como com células de artrópodes

(Seligman, 2008).

Como uma consequência da entrada na célula via endocitose

mediada por clatrina, durante a maturação, o endossoma se torna ácido,

causando liberação da extremidade escondida do peptídeo de fusão. Os

monômeros da proteína E agora se associam como um trímero, e a fusão

com a membrana da célula hospedeira ocorre, permitindo a transferência

do genoma para o interior do citoplasma. O requisito para a grande

mudança conformacional no peptídeo de fusão acoplado ao seu elevado

Introdução Geral

48

nível de conservação entre os Flavivírus, sugere que peptídeos de fusão

mutantes devem ser raros (Seligman, 2008).

1.6.3. Interação Peptídeo-Membrana

Os fosfolipídios são de importância fundamental para compor a

base estrutural de todas as membranas celulares, além de funcionarem

como precursores de diversas moléculas sinalizadoras intracelulares. As

classes majoritárias de fosfolipídios de membrana podem variar

significativamente de um tipo celular para outro ou até mesmo de uma

organela para outra dentro de uma mesma célula. Fosfolipídios de

membrana são moléculas anfipáticas, que tendem a se auto-organizar em

solução aquosa para formar uma bicamada lipídica (Huang & Li, 1999).

Uma bicamada lipídica composta por um único fosfolipídio, em

excesso de água, pode sofrer múltiplas transições de fase termotrópicas

sob aquecimento (Chapman, 1993). Destas diversas transições, a transição

do estado em gel para líquido-cristalino é a transição de fase principal que

é acompanhada pela maior mudança entrópica. A literatura disponibiliza

os estudos de transições de fase de bicamadas lipídicas principalmente

para fosfolipídios de cadeias saturadas idênticas. Estas transições podem

ser detectadas por uma ampla variedade de técnicas físicas, tais como

Introdução Geral

49

calorimetria diferencial de varredura (DSC), difração por raio-X,

espalhamento de luz dinâmico, ressonância magnética nuclear (RMN) e

espectroscopia de fluorescência. Embora cada uma destas técnicas físicas

possa fornecer informações específicas, as mudanças termodinâmicas que

ocorrem em uma transição de fase lipídica são avaliadas por DSC (Huang &

Li, 1999).

As propriedades físicas de membranas, tais como fluidez, carga e

curvatura, podem influenciar sua função. Proteínas e peptídeos podem

modular estas propriedades e, ao mesmo tempo, o ambiente hidrofóbico

e a interação lipídio-proteína (ou peptídeo) pode afetar sua atividade e/ou

sua estrutura. Muitas metodologias biofísicas estão disponíveis para

estudar estes efeitos utilizando sistemas de lipídio reconstituído (Lins et al.,

2008).

Por um lado, modificar a organização lamelar dos lipídios e,

portanto, a estabilidade da membrana poderia favorecer o processo de

fusão de membranas, por exemplo. Por outro lado, alguns fatores

intrínsecos de peptídeos, tais como a hidrofobicidade e a carga

influenciam a interação peptídeo-lipídio, modulando sua partição entre a

membrana e o ambiente aquoso. Além disso, a flexibilidade estrutural

Introdução Geral

50

também é um parâmetro importante na interação entre peptídeos e

lipídios (Lins et al., 2008).

A proteína gp41 do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) catalisa

a fusão de membranas através da indução de estruturas não-lamelares

transientes no ponto de encontro entre duas membranas (Eckert & Kim,

2001; Gallo et al., 2003). A sequência desta proteína é altamente conservada

e contém diferentes regiões funcionais essenciais para a fusão de

membranas, como o peptídeo de fusão (Bosch et al., 1989). Estas regiões da

glicoproteína gp41 têm a capacidade de ligação e partição na superfície de

membranas fosfolipídicas modelo, alterando sua conformação e induzindo

a formação de estruturas não-lamelares. Dependendo da composição

fosfolipídica da membrana modelo, estes segmentos mudam sua

conformação após ligação e modulam o comportamento da bicamada

lipídica (Pascual et al., 2005a, b).

Lipídios aniônicos são componentes integrais de membranas

biológicas e estão presentes invariavelmente em quantidades

substanciais, apresentando funções específicas em membranas biológicas

(Lakey et al., 1994; Pinheiro & Watts, 1994). A proposta é de que as interações

eletrostáticas entre as cabeças de lipídios aniônicos e resíduos de

proteínas ou peptídeos carregados positivamente sejam cruciais na

Introdução Geral

51

associação de proteínas ou peptídeos com membranas (Liu & Deber, 1997).

Neste sentido, os lipídios aniônicos têm sido amplamente utilizados como

sistemas modelo. Assim, a fusão de membrana viral é um importante

tópico de pesquisa, uma vez que ela serve como um modelo para eventos

de fusão celular, além de ser um excelente alvo para intervenções

terapêuticas (Earp et al., 2005).

Desta forma, a termodinâmica da interação peptídeo-membrana

depende da natureza química dos lipídios, peptídeos e carboidratos

envolvidos. As forças eletrostáticas, a formação de ligações de hidrogênio

e as interações hidrofóbicas apresentam papéis igualmente importantes

(Seelig, 2004).

A interação de um peptídeo com uma membrana lipídica pode ser

dividida em três etapas termodinâmicas, como ilustrado na Figura 9. Na

primeira etapa, a ligação é iniciada pela atração eletrostática de um

determinado peptídeo catiônico a uma membrana aniônica. Dependendo

da carga do peptídeo e do tamanho do potencial de membrana da

superfície, a atração (ou repulsão) eletrostática aumentará (ou diminuirá)

significativamente a concentração de peptídeo próximo à superfície da

membrana. Entretanto, a atração eletrostática não é um pré-requisito

para a interação, já que a ligação pode ocorrer também entre um

Introdução Geral

52

peptídeo não carregado e uma membrana neutra. Sob estas condições, a

concentração do peptídeo próximo à superfície da membrana é idêntica à

da solução estoque (Seelig, 2004).

Figura 9 – Reconhecimento Molecular de Peptídeos na Superfície da Membrana.

O diagrama mostra diferentes estágios de ligação de peptídeo à membrana-alvo. O peptídeo carregado é atraído eletrostaticamente para a superfície da membrana, interage e sofre uma determinada alteração conformacional. Extraído de Seelig, 2004.

A próxima etapa é a transição do peptídeo dentro do plano de

ligação. A localização exata desta camada é difícil de ser definida e

depende do balanço hidrofóbico/hidrofílico dos grupos moleculares e da

força envolvida. A terceira etapa no processo de ligação é uma mudança

da conformação do peptídeo ligado. Em muitos casos, os peptídeos estão

em uma conformação randômica em solução e adotam uma determinada

estrutura secundária quando associados à membrana lipídica. A ligação,

atração eletrostática

adsorção

mudança conformacional

Introdução Geral

53

incluindo estas alterações conformacionais, acarreta em mudanças nos

parâmetros termodinâmicas (Seelig, 2004).

As forças dirigidas para a adsorção e ligação de peptídeos são as

interações hidrofóbicas, eletrostáticas e ligações de hidrogênio. A inserção

de um peptídeo baseado em uma interação exclusivamente hidrofóbica

pode ser descrita por um simples equilíbrio de partição. Entretanto, se o

peptídeo e a membrana são carregados, as interações eletrostáticas se

tornam dominantes e a curva de ligação fica não-linear (Seelig, 2004).

Embora muita informação tenha sido fornecida nestes últimos anos

acerca das diferentes conformações das proteínas de fusão dos Flavivírus,

pouco ainda se conhece sobre os mecanismos de fusão de membranas

induzidos por eles. Desta maneira, é importante elucidar a natureza das

interações entre as proteínas de membrana e as membranas e os

mecanismos pelos quais os peptídeos de fusão aceleram a formação dos

intermediários de fusão.

Neste trabalho, nós descrevemos uma análise comparativa

estrutural e termodinâmica sobre a interação de duas diferentes

sequências internas de peptídeos de fusão de Flavivírus com sistemas

biomiméticos de membrana de diferentes cargas. Os peptídeos

apresentam 13 resíduos cada um e uma diferença de um único

Introdução Geral

54

aminoácido (Gly x His). As Histidinas de diversas proteínas de fusão de

vírus têm sido avaliadas como interruptores moleculares devido a sua

mudança de estado de protonação desde não carregada a duplamente

carregada em pH ligeiramente ácido encontrado em endossomas (Carneiro

et al., 2003; Bressanelli et al., 2004; Kampmann et al., 2006; Mueller et al., 2008; Fritz

et al., 2008).

Objetivos

55

2. Objetivos

2.1. Objetivos: Parte I

Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão de Flavivírus com Membranas Biomiméticas

Os arbovírus se mantêm na natureza em ciclos complexos que

envolvem vetores artrópodes, como mosquito e carrapato. Os peptídeos

de fusão dos Flavivírus são extremamente conservados dentro do seu

gênero, apresentando, de uma forma geral, apenas uma modificação na

posição 104 da sequência, onde os vírus que são transmitidos por

mosquito possuem uma Glicina e os que são transmitidos por carrapato

possuem uma Histidina.

Neste sentido, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a estrutura

e caracterizar o modo de interação de dois peptídeos de fusão de

Flavivírus, FLAG e FLAH, em modelos biomiméticos de membrana. A única

diferença entre eles está exatamente neste resíduo na posição 104, onde

FLAG possui uma Glicina e tem como representantes YFV, DENV e WNV, e

FLAH, que apresenta uma Histidina, onde o TBEV é o representante de

maior importância. Desta forma, o interesse neste estudo também se

Objetivos

56

deve à protonação/desprotonação da cadeia lateral da His, o que poderia

modular a diferença de interação entre os dois peptídeos estudados.

Portanto, nossos objetivos específicos para este estudo foram:

Avaliar a acessibilidade dos resíduos de Trp presentes na sequência

dos peptídeos, através de espectroscopia de fluorescência intrínseca do

Trp e, assim, inferir características da interação com diferentes modelos

de membrana alvo.

Investigar os parâmetros termodinâmicos (entalpia da ligação) que

regem a interação peptídeo-micela, através de calorimetria isotérmica de

titulação (ITC), utilizando alvos com diferentes propriedades físicas.

Analisar possíveis mudanças na temperatura de transição de

vesículas lipídicas de diferentes composições, através de calorimetria

diferencial de varredura (DSC). Desta forma, é possível avaliar o grau de

perturbação da membrana promovida pelos peptídeos.

Aferir a conformação do peptídeo em solução, através da

espectroscopia de dicroísmo circular, e avaliar uma possível mudança

estrutural após sua interação com modelos de membrana alvo.

Avaliar parâmetros espaciais e acompanhar, em função do tempo,

as mudanças conformacionais da interação dos peptídeos de fusão com

Objetivos

57

bicamadas lipídicas, utilizando como ferramenta simulações por dinâmica

molecular.

2.2. Objetivos: Parte II

Febre Amarela: Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina

Inativada por Alta Pressão Hidrostástica

A Febre Amarela é uma doença infecciosa aguda que representa um

importante problema de saúde pública, especialmente na África. Apesar

de existir uma vacina até certo ponto satisfatória e eficaz, a doença ainda

permanece incontrolável. Em diferentes períodos da história humana, a

Febre Amarela tem causado incontroláveis sofrimentos entre as

populações nas Américas, Europa e África.

Nos trópicos, a maior frequência da doença ocorre no período das

chuvas, entre os meses de janeiro e abril, quando a densidade vetorial

(quantidade de mosquitos) é elevada, coincidindo com a época de maior

atividade agrícola. No Brasil, no período de 1982 a novembro de 2004,

foram confirmados 594 casos de febre amarela, com ocorrência de 286

óbitos, representando uma taxa de letalidade de 48% no período. O

estado de Minas Gerais é o campeão de casos no Brasil.

Objetivos

58

A vacinação é a principal estratégia de controle da doença.

Entretanto, como a vacina é feita a partir de vírus atenuado, que tem a

capacidade de se replicar, vários eventos de reações adversas à vacina

vêm ocorrendo nos últimos anos. Como a alta pressão hidrostática tem

sido apontada como um método eficiente para a inativação de diversos

vírus, esta ferramenta foi utilizada para inativar o YFV com bastante

sucesso pelo nosso grupo. Entretanto, o grande problema de uma vacina

inativada é não oferecer uma proteção eficaz. Assim, o principal objetivo

deste estudo foi avaliar a imunogenicidade do Vírus da Febre Amarela

inativado por Alta Pressão Hidrostática. Para avaliar esta questão,

destacamos nossos objetivos específicos:

Avaliar a perda total de infecciosidade dos vírus inativados por

pressão através de um ensaio para detecção de infecciosidade residual

realizado em células Vero e C6/36.

Analisar a presença de alguma infecção promovida pela amostra

viral inativada através de um ensaio de detecção de infecciosidade

residual em camundongos.

Realizar ensaios de imunização dos animais através de inoculação

subcutânea.

Objetivos

59

Avaliar a resposta dos animais através de um ensaio de

neutralização dos anticorpos por redução de plaques.

Aferir a proteção promovida pela inoculação do vírus inativado

através da inoculação intracerebral de uma dose letal.

Material e Métodos

60

3. Material e Métodos

3.1. Reagentes

2, 2, 2-trifluoretanol (TFE), Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e n-octil-

β-D-glicopiranosídeo (n-OGP) foram obtidos da Sigma Co. (St. Louis, MO).

Os lipídios Di-Palmitoil-Fosfatidilcolina (DPPC) e Fosfatidilglicerol (PG)

foram adquiridos da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Acrilamida foi

obtida da Amersham Bioscience. Todos os reagentes utilizados foram de

grau analítico. A água era deionizada e purificada através de um

equipamento Milli-Q da Millipore (Molsheim, France).

3.2. Células e Vírus

As células Vero (rim de macaco verde africano) (CCL 81) e C6/36

(Aedes albopictus) foram obtidas a partir da American Type Culture

Collection (ATCC, Manassas, VA). As células Vero foram mantidas em meio

199 com sais de Earle (M199, Gibco), tamponado com bicarbonato de

sódio e suplementado com 5% de soro fetal bovino (Cultilab), penicilina

(100 U/mL) e estreptomicina (100 g/mL). As células C6/36 foram

cultivadas em meio L-15 suplementado com 10% de soro fetal bovino,

0,02 mM de L-glutamina (Gibco), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina

(100 g/mL).

Material e Métodos

61

O Vírus da Febre Amarela utilizado neste estudo é derivado da

vacina YFV 17DD (035VFA035P) produzida em Bio-Manguinhos, Fundação

Oswaldo Cruz. Para os estudos de inativação, os vírus foram crescidos em

garrafas tipo roller com uma multiplicidade de infecção de 0,02 UFP/célula

a 37°C. Após 7 dias de infecção, o sobrenadante era coletado e clarificado

dos restos celulares por centrifugação a 1000 x g por 10 minutos a 4°C em

uma centrífuga Beckman usando o rotor JA-10.

3.3. Peptídeos de Fusão

Os peptídeos, 98DRGWGNHCGLFGK110 (FLAH - TBEV) e

98DRGWGNGCGLFGK110 (FLAG – YFV, DENV, WNV) (Figura 10) foram

sintetizados pela Genemed Synthesis Inc. (South San Francisco, CA). A

identidade e a pureza (> 95%) foram determinadas por análise de

aminoácidos, espectrometria de massa e cromatografia líquida de alta

resolução. Para os experimentos, as soluções estoques de peptídeo foram

preparadas diluindo-os em tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7,4. A

concentração dos peptídeos em solução aquosa foi determinada a partir

dos valores de absorbância a 280 nm, levando-se em consideração o

coeficiente de extinção molar teórico ( = 5500 M-1 cm-1) baseado na

cadeia lateral de um Trp presente em cada sequência.

Material e Métodos

62

Figura 10 - Estrutura da Proteína E do WNV e dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.

(A) A glicoproteína E monomérica adota uma topologia típica de outras glicoproteínas de envelope de Flavivírus, onde o loop de fusão está mostrado (PDB: 2hg0). (B) Sequência (vermelho) dos peptídeos de fusão FLAG e FLAH colorida no programa RasMol. Os dois primeiros resíduos de Glicina estão mostrados em amarelo e o único triptofano em azul.

FLAG

Resíduos 98-110

FLAG 98DRGWGNGCGLFGK110

FLAH 98DRGWGNHCGLFGK110

A

B

Resíduos 98-110

FLAH

loop CD

Material e Métodos

63

3.4. Ensaio com Micelas

As micelas constituem um sistema mimético para o estudo de

atividade e toxicidade por serem semelhantes a bicamadas lipídicas. Além

disso, são muito utilizadas em metodologias biofísicas justamente como

mimetizantes de membrana. As micelas possuem um cerne hidrofóbico e

flexível, uma interface hidrofílica e são normalmente usados como

monocamadas ou bicamadas em métodos experimentais (Langham et al.,

2007). A formação das micelas é dirigida pelo efeito hidrofóbico, devido à

interação dos grupos não polares com a água.

O SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) (Esquema 1) é um detergente que

possui grupamentos aniônicos polares em uma das extremidades de sua

estrutura e uma cadeia apolar na outra. Quando uma quantidade

suficiente de SDS é dissolvida em água, diversas propriedades são

modificadas, em particular a tensão superficial (que diminui) e a

habilidade da solução solubilizar hidrocarbonetos (que aumenta). Esta

concentração é denominada concentração micelar crítica (cmc). A cmc do

SDS é dependente de sal, sendo em água de 8 mM, em 10 mM de NaCl de

3,5 mM, e em 100 mM de NaCl de 1,4 mM.

Material e Métodos

64

Esquema 1 - Estrutura do SDS. Extraído de www.sigmaaldrich.com

O n-octil-β-D-glicopiranosídeo (Esquema 2) é um detergente não

desnaturante e não iônico muito utilizado para solubilizar proteínas de

membrana. As micelas destes detergentes possuem baixo peso molecular

e são facilmente removidas por diálise. A cmc deste detergente varia de

20 a 25 mM.

Esquema 2 – Estrutura do n-octil-β-D-glicopiranosídeo.

Extraído de www.sigmaaldrich.com

Material e Métodos

65

A ligação do peptídeo de fusão às diferentes micelas foi analisada

através da variação da fluorescência emitida pelo triptofano, sendo este

excitado a 280 nm e sua emissão sendo coletada de 300 a 420 nm.

3.5. Preparação das Vesículas Multilamelares

Uma determinada quantidade de fosfolipídio diluído em

clorofórmio é inicialmente seca sob um fluxo de nitrogênio no fundo de

um tubo de vidro cônico para a completa remoção do solvente orgânico e

formação de um filme lipídico. A solubilização deste filme em tampão

fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, contendo ou não uma

quantidade apropriada de peptídeo, gera as vesículas multilamelares

(MLVs) para a realização das medidas de DSC. A concentração dos

fosfolipídios foi calculada baseada no peso do lipídio liofilizado.

3.6. Espectroscopia de Fluorescência

Há cerca de 30 anos vem ocorrendo um crescimento importante no

uso de fluorescência aplicada à Biologia, onde a espectroscopia de

fluorescência vem sendo aplicada nas áreas de Bioquímica e Biofísica. A

fluorescência é muito utilizada para sequenciar ADN, análises genéticas

por hibridização in situ, identificação celular em citometria de fluxo e

Material e Métodos

66

análises de imagens celulares para revelar a localização e o tráfego de uma

determinada molécula. Devido à alta sensibilidade de detecção da

fluorescência, diversos testes baseados no fenômeno da fluorescência são

hoje aplicados à clínica, como o ELISA. A aplicação da fluorescência

associada ao contínuo desenvolvimento de instrumentações e marcadores

fluorescentes torna possível analisar a dinâmica de diversas

macromoléculas em diferentes processos, desvendando intermediários do

enovelamento de proteínas importantes no ciclo celular, por exemplo

(Lakowicz, 1999).

A luminescência é a emissão de luz de alguma substância e ocorre a

partir dos estados excitados eletronicamente. Este fenômeno é

formalmente dividido em duas categorias, a fluorescência e a

fosforescência, dependendo da natureza do estado excitado. No estado

excitado singlete, o elétron no orbital excitado está pareado (com spins

opostos) com o segundo elétron no orbital do estado fundamental.

Consequentemente, o retorno ao estado fundamental ocorre

rapidamente pela emissão de um fóton. O tempo de vida de um

fluoróforo é próximo de 10 ns e representa o tempo médio entre sua

excitação e seu retorno ao estado fundamental. A fosforescência é a

emissão da luz a partir dos estados triplete, em que o elétron no orbital

Material e Métodos

67

excitado tem a mesma orientação de spin que o elétron no estado

fundamental. Além disso, o tempo de vida fosforescente é maior e varia

de milisegundos a segundos (Lakowicz, 1999).

As proteínas contêm três resíduos de aminoácidos que contribuem

para sua fluorescência: Tirosina (Tyr ou Y), Triptofano (Trp ou W) e

Fenilalanina (Phe ou F). A emissão de fluorescência das proteínas é

dominada pelo Trp, que absorve em comprimento de onda mais longo e

apresenta o maior coeficiente de extinção. Além disso, devido ao seu

longo comprimento de onda, a energia absorvida pela Phe e pela Tyr é

frequentemente transferida para os resíduos de Trp na mesma proteína. O

rendimento quântico da Phe em proteínas é pequeno (0,03), enquanto os

rendimentos quânticos da Tyr e do Trp são muito maiores (0,14 e 0,13,

respectivamente) (Lakowicz, 1999).

A fluorescência de proteínas é geralmente excitada no máximo de

absorção próximo a 280 nm ou a comprimentos de onda maiores. O

máximo de emissão do Trp em água ocorre próximo a 350 nm e é

altamente dependente da polaridade e/ou do ambiente local. Como o Trp

é um aminoácido bastante sensível a qualquer mudança de polaridade do

meio, em ambientes apolares, este resíduo emite em comprimentos de

onda menores (próximo a 320 nm) e, portanto, mais energéticos.

Material e Métodos

68

Entretanto, à medida que a proteína expõe seu Trp para o meio aquoso,

por exemplo, em uma desnaturação, ocorre um desvio de espectro para o

vermelho, já que o Trp passa a emitir fluorescência em comprimentos de

onda maiores e menos energéticos. Isto ocorre porque parte desta

energia é gasta para orientar as moléculas no solvente (Lakowicz, 1999).

Todos os experimentos de fluorescência foram realizados em um

espectrofluorímetro ISS K2 (ISS Inc., Champaign, IL) a 37°C. Comprimento

de onda de excitação de 280 nm foi utilizado e a emissão coletada de 300

a 420 nm, com um intervalo de 1 nm. A fenda utilizada na excitação foi de

2 nm e na emissão de 1 nm. A concentração final dos peptídeos foi de 10

M diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM nos pHs 7,4 ou 5,5. A

solução estoque das micelas foi preparada no mesmo tampão. Os valores

de pH foram aferidos antes e após cada experimento. n-octil-β-D-

glicopiranosídeo foi preparado em água Milli Q em uma concentração

muito acima da concentração micelar crítica (cmc).

3.6.1. Supressão de Fluorescência por Acrilamida

A intensidade de fluorescência pode ser diminuída por uma ampla

variedade de processos. Esta diminuição na intensidade é denominada de

supressão, que pode ocorrer por diferentes mecanismos. A supressão

Material e Métodos

69

colisional ocorre quando o fluoróforo no estado excitado é “desativado”

sob contato com outra molécula em solução, conhecida como supressor

de fluorescência. Neste caso, o fluoróforo retorna ao estado fundamental

durante uma colisão com o supressor sem emitir fluorescência. As

moléculas não são quimicamente alteradas no processo (Lakowicz, 1999).

Uma ampla variedade de pequenas moléculas ou íons pode atuar

como supressores colisionais de fluorescência, tais como o iodeto (I-), o

oxigênio, halogênios, aminas e a acrilamida (Esquema 3). A acessibilidade

dos fluoróforos por um determinado agente supressor pode ser usada

para determinar a localização de marcadores sobre macromoléculas ou a

porosidade de proteínas e membranas ao supressor. A intensidade da

emissão de fluorescência de um Trp sobre a superfície de uma proteína ou

sobre a superfície de uma membrana diminuirá na presença de um

supressor solúvel em água, como a acrilamida. Entretanto, a intensidade

de um resíduo de Trp escondido no interior de uma membrana será

menos afetada pelo supressor dissolvido (Lakowicz, 1999).

Material e Métodos

70

Esquema 3 – Estrutura Química da Acrilamida.

Extraído de Besaratinia & Pfeifer, 2005

O mecanismo da supressão varia com o par fluoróforo-supressor.

Por exemplo, a supressão do anel indol pela acrilamida é provavelmente

devido à transferência de elétrons do indol para a acrilamida, que não

ocorre no estado fundamental. Além da supressão colisional, os

fluoróforos podem formar complexos não fluorescentes com os agentes

supressores. Este processo é conhecido como supressão estática, uma vez

que ele ocorre no estado fundamental e não depende de difusão ou

colisão molecular (Lakowicz, 1999).

O fenômeno da supressão fornece informações importantes sobre o

tempo de vida do estado excitado, importante para detectar processos

dinâmicos em solução ou em macromoléculas. A idéia fundamental é que

a absorção é um evento instantâneo e ocorre tão rápido que não existe

tempo para movimento molecular durante este processo (Lakowicz, 1999).

Para a supressão colisional, a diminuição na intensidade é descrita pela

equação de Stern-Volmer:

Material e Métodos

71

F0 / F = 1 + KSV [Q] = 1 + kq τ0 [Q] (1)

onde F e F0 são as intensidades de fluorescência na presença e na ausência

de acrilamida, respectivamente; KSV representa a constante de supressão

de Stern-Volmer [Q] é a concentração molar total do agente supressor em

solução, kq é a constante de supressão bimolecular e τ0 é o estado não

suprimido (Lakowicz, 1999).

Os dados de supressão geralmente são apresentados como gráficos

de F0 / F versus [Q]. Isto é porque F0 / F é esperado ser linearmente

dependente da concentração do agente supressor. Um gráfico de F0 / F

versus [Q] produz um intercepto de 1 sobre o eixo y e uma inclinação igual

a KSV. Um gráfico de Stern-Volmer linear geralmente é indicativo de uma

classe simples de fluoróforos, todos igualmente acessíveis ao supressor

(Lakowicz, 1999).

Para os experimentos de supressão de fluorescência do Trp,

pequenas alíquotas de acrilamida solubilizadas em água foram

adicionadas a partir de uma solução estoque de 5 M na ausência e na

presença de micelas. Comprimento de onda de excitação de 280 nm foi

utilizado e as intensidades de fluorescência foram monitoradas a cada

adição de acrilamida a 349 nm em tampão, a 334 nm na presença de

micelas de SDS e a 346 nm na presença de micelas de n-octil-β-D-

Material e Métodos

72

glicopiranosídeo. As constantes de supressão de fluorescência (KSV), uma

medida da acessibilidade do Trp ao ambiente polar onde se encontra a

acrilamida, foram obtidas a partir de uma regressão linear usando a

equação de Stern-Volmer para um processo de supressão dinâmico (Eftink

& Ghiron, 1976; Lakowicz, 1999).

3.7. Dicroísmo Circular (CD)

O fenômeno de Dicroísmo Circular (CD) consiste da absorção

diferencial de luz polarizada circularmente para a esquerda e para a

direita por uma molécula quiral. Na ausência de um campo magnético, a

molécula deve ser quiral para dar para uma diferença na interação com os

dois tipos de luz polarizada circularmente. CD é a diferença na absorção da

luz polarizada circularmente para a esquerda e para a direita e é definido

como:

() = E() – D() (2)

onde E e D são os coeficientes de extinção para os componentes

polarizados circularmente para a esquerda e para a direita,

respectivamente, a um determinado comprimento de onda . As unidades

para CD, quando definidas como , são M-1·cm-1, onde M é a

concentração molar.

Material e Métodos

73

Baseado na energia das transições eletrônicas que dominam uma

determinada faixa, os espectros de proteína por CD são geralmente

divididos dentro de três faixas de comprimento de onda, (i) a região UV

distante (abaixo de 250 nm), onde as contribuições peptídicas dominam,

(ii) a região UV próximo (250-300 nm), onde as cadeias laterais dos

resíduos aromáticos contribuem, e (iii) a região visível (300-700 nm), onde

os cromóforos extrínsecos contribuem.

A cadeia polipeptídica em uma proteína é primariamente

constituída por amidas secundárias. Polipeptídeos formam diferentes

estruturas secundárias baseadas no arranjo dos grupos amida ditados pela

conformação do esqueleto carbônico. -hélices e folhas-β são as duas

mais importantes estruturas secundárias em proteínas, sendo

estabilizadas, respectivamente, por ligações de hidrogênio intra- e inter-

cadeia. Elas são caracterizadas por um conjunto de ângulos diedro e

(: -57°, -47°; β: -120°, +120°) que se repetem ao longo da cadeia

polipeptídica formando grupos amidas sucessivos orientados

identicamente em toda direção da cadeia (Sreerama & Woody, 2004).

Os grupos amida em -hélices formam uma superfície cilíndrica com

ligações de hidrogênio intra-cadeia paralelas ao eixo da hélice, e grupos

amida em folhas-β estendem-se por uma superfície planar. Em geral, -

Material e Métodos

74

hélices são maiores e mais rígidas que as folhas-β devido à natureza das

ligações de hidrogênio que as estabilizam. Outra importante estrutura

secundária é a volta-β, geralmente formada por três resíduos, podendo

ser estabilizada ou não por uma ligação de hidrogênio entre o primeiro e o

terceiro grupamento amida, que efetivamente reverte a direção da

cadeia. Aminoácidos que não formam nenhuma estrutura secundária

existente em proteínas são chamados de desordenados por não

possuírem uma conformação ordenada (Sreerama & Woody, 2004).

As medidas de CD foram realizadas em um espectropolarímetro

Jasco J-715/1505 entre 190 e 260 nm em uma cubeta de quartzo

cilíndrica, com caminho óptico de 0,02 cm, ou cúbica de 0,2 cm (apenas

para as análises em alta temperatura). Os espectros foram gravados com

0,2 nm de resolução e a 50 nm/min de velocidade. O tempo de resposta

utilizado foi de 8 s com 100 mgrau de sensibilidade. A passagem do feixe

de luz foi de 2 nm. Cada espectro representa uma média de 10 varreduras.

A concentração dos peptídeos utilizada foi de 1 mM ou 50 M (para as

análises a 85°C) e os espectros foram adquiridos à temperatura ambiente

(~ 25°C), em tampão fosfato de sódio 20 mM pH 5,5 ou 7,4. A contribuição

do sinal do tampão na ausência e na presença de cada reagente foi

subtraída dos espectros de CD adquiridos para cada amostra.

Material e Métodos

75

3.8. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC)

A elucidação dos princípios energéticos da afinidade e da

especificidade de ligação é uma questão central em muitas áreas da

ciência atual. A Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) é uma valiosa

técnica experimental que facilita a quantificação dos parâmetros

termodinâmicos que caracterizam os processos de reconhecimento

envolvendo macromoléculas. A técnica de ITC é utilizada para investigar

todos os tipos de interações de proteínas, incluindo interações proteína-

proteína, proteína-ácido nucléico, interações de proteínas com pequenas

moléculas, além de cinéticas enzimáticas (Liang, 2008; Bjelić & Jelesarov, 2008).

ITC é uma excelente técnica bastante utilizada para obter

informações importantes sobre os parâmetros termodinâmicos

fundamentais que governam a ligação de peptídeos a bicamadas lipídicas

(Seelig, 2002). Titulando o peptídeo para um excesso de lipídio, é possível

obter a entalpia da ligação, e ao contrário, titulando lipídio em peptídeo

até a saturação, é possível calcular a energia livre da ligação. A entropia da

ligação pode então ser deduzida a partir da relação G = H – TS (Li et al.,

2003).

Os dados de ITC foram adquiridos utilizando um calorímetro de

titulação MicroCal VP-ITC (MicroCal, Northampton, MA), titulando o

Material e Métodos

76

peptídeo em uma solução de micelas. O calorímetro foi calibrado

eletricamente e as amostras foram tituladas em uma solução com

agitação contínua. No primeiro caso de titulação, alíquotas de 5 L de

peptídeo foram adicionadas, a partir de uma solução estoque de 100 M,

à cela calorimétrica contendo SDS a 20 mM ou n-octil-β-D-

glicopiranosídeo a 40 mM, ambos diluídos em tampão fosfato de sódio 20

mM pH 7,4 ou 5,5. Cada injeção era realizada em um período de 5 s, com

um espaço de 360 s entre cada injeção.

Os resultados foram analisados utilizando o programa Origin 7.0, e

os valores de entalpia (H) e de variação da capacidade calorífica (Cp)

foram obtidos a partir da integração da área de cada pico de calor em

diferentes temperaturas (37°C, 25°C e 15°C). Para descontar o calor de

diluição, experimentos controle foram realizados titulando as micelas

dentro de uma solução tampão na ausência de peptídeo em todos os pHs

e em todas as temperaturas. O calor de diluição era sempre muito

pequeno quando comparado ao da amostra, e foi subtraído a partir da

reação de calor do experimento de titulação real.

Material e Métodos

77

3.9. Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)

A Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) tem emergido como

uma poderosa técnica experimental para determinar propriedades

termodinâmicas de macromoléculas. DSC é uma técnica de análise térmica

capaz de determinar a pureza, as formas polimórficas e o ponto de fusão

de diversas amostras. Além disso, esta técnica capacita monitorar

detalhes do processo de desenovelamento de proteínas. Através de

medidas dos parâmetros termodinâmicos e sob condições que afetam a

estabilidade do sistema, é possível estudar também o comportamento

térmico de bicamadas lipídicas e sistemas de entrega de drogas lipídicas,

como lipossomos (Demetzos, 2008; Spink, 2008).

Os dados de DSC foram coletados em um calorímetro Microcal VP-

DSC de alta sensibilidade (Microcal, Northampton, MA). As vesículas de

DPPC e PG foram utilizadas em tampão fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150

mM, pH 7,4. A razão molar de lipídio:peptídeo utilizada nos experimentos

foi de 100:1. Para as amostras contendo vesículas de DPPC, a velocidade

de varredura utilizada foi de 10°C/h, enquanto que, para as vesículas

DPPC:PG, a velocidade foi de 30°C/h. A aquisição dos dados e a análise

foram realizadas usando o programa Origin 7.0. A concentração de lipídios

totais utilizada nas medidas de DSC foi de 1 mM

Material e Métodos

78

3.10. Simulações por Dinâmica Molecular

A dinâmica molecular (MD) consiste em acompanhar a evolução

temporal de um determinado sistema molecular. Este método trata os

átomos em um meio contínuo, com as ligações químicas vibrando, ângulos

de ligação variando e a molécula rodando (Leach, 1996). Com o

desenvolvimento de novos computadores, os métodos de modelagem

molecular vêm se aprimorando e sendo amplamente utilizados nas

pesquisas científicas. Seus conceitos fundamentais se baseiam em

equações muito conhecidas no mundo da física há muito tempo e seus

métodos constituem poderosas ferramentas no estudo de propriedades

atômicas e moleculares.

O avanço na área de modelagem molecular busca, através das

equações de Newton, uma metodologia para descrever propriedades

moleculares quânticas em função de um campo de força clássico e, assim,

encontrar a representação mais próxima do real (Mundin, 2002). No método

de mecânica molecular, as ligações químicas são representadas por

potenciais harmônicos. As moléculas funcionam como uma coleção de

massas ligadas por “molas” com suas propriedades representadas através

de potenciais harmônicos e anarmônicos (Levine, 2003).

Material e Métodos

79

No início, a MD consistia de um modelo de esferas rígidas com

choques perfeitamente elásticos representando as interações atômicas

(Alder & Wainwright, 1957). Nesta época, as equações de movimento de

Newton já eram utilizadas para descrever um sistema de n átomos

interagindo. Entretanto, com o avanço nesta área, o número de átomos

aumentou e, consequentemente, a complexidade dos sistemas estudados.

Por este motivo, existe a necessidade de computadores cada vez mais

potentes que tenham a capacidade de processar um número enorme de

átomos. As técnicas também devem ser cada vez mais rebuscadas para

resolver problemas quânticos de forma clássica a fim de tornarmos a

simulação possível e confiável.

As simulações neste estudo foram realizadas a 35°C ou a 85°C

utilizando os peptídeos de fusão em caixas d’água (Figura 11A) ou em

bicamadas lipídicas compostas por Palmitoil-Oleoil-Fosfatidiletanolamina

(POPE) (Figura 11B) obtidas utilizando o programa GROMACS (van der Spoel

et al., 2001). A configuração da bicamada, composta por 340 unidades

lipídicas (170 em cada folheto), e os parâmetros de simulação foram

ajustados como descrito anteriormente (Marrink et al., 1996; Tieleman &

Berendsen, 1996; Kandt et al., 2007). Este modelo de bicamada foi escolhido

porque é o mais bem equilibrado em um modelo grande de simulação.

Material e Métodos

80

Contra-íons foram utilizados para manter a eletroneutralidade dos

sistemas e os peptídeos foram modelados através da utilização do campo

de força GROMOS45A3. O passo de integração utilizado foi de 2 ƒs. As

interações de van der Waals foram simuladas por uma função Switch a um

raio de até 1 nm, e as interações eletrostáticas foram consideradas até 1,1

nm utilizando o método de PME (“Particle-Mesh Ewald”). Para as

simulações utilizando o peptídeo FLAH, os resíduos de His foram

protonados, mimetizando um ambiente ácido (pH < 6). O método de

Berendsen, que realiza a correção da temperatura no sistema, foi aplicado

a cada 0,1 ps. Para o acoplamento de pressão, foi utilizado o método de

Parrinelo-Rahman, o mais utilizado em membranas. As condições

periódicas de contorno foram mantidas constantes utilizando o método

“ensemble statistico NPT”. E para manter os átomos ligados, o algoritmo

de vínculo Lincs foi utilizado.

As coordenadas do peptídeo de fusão FLAG foram adquiridas a partir

da estrutura cristalográfica da proteína E do WNV depositada no Banco de

Dados de Proteínas (PDB) (Nybakken et al., 2006; pdb: 2HG0) e o FLAH foi

obtido a partir de uma mudança de um resíduo de Gly por um resíduo de

His na posição 104 do peptídeo. Este processo foi realizado minimizando a

energia nas vizinhanças do resíduo de His (Figura 12).

Material e Métodos

81

Figura 11 – Representação do Peptídeo de Fusão FLAH em Caixa d’água ou em Bicamada Lipídica Composta por POPE.

Representação da estrutura do peptídeo FLAH (vermelho) antes de iniciar a simulação em água (A) ou na presença de bicamada lipídica de POPE (B). Em azul, está representada a água, em cinza, os ácidos graxos dos fosfolipídios da membrana e, em verde e amarelo, os íons Cl- e Na+.

Figura 12 – Loop de Fusão da Glicoproteína E dos Flavivírus.

Estrutura cristalográfica da proteína E do WNV depositada no Banco de Dados de Proteínas (Nybakken et al., 2006; pdb: 2HG0). Do lado direito estão os dois peptídeos de fusão dos Flavivírus sobrepostos evidenciando os resíduos de Gly (vermelho – FLAG) e de His (azul - FLAH).

A B

Material e Métodos

82

3.11. Inativação Viral por Alta Pressão Hidrostática

Recentes estudos têm emergido sobre o uso da alta pressão

hidrostática (APH) para tentar revelar estados intermediários na via de

montagem e desmontagem de vários vírus, proteínas multiméricas e

complexos proteína-ácido nucléico, endereçando muitas questões de

reconhecimento macromolecular (Silva et al., 1996). Além disso, vários

estudos têm mostrado a importância de comparar complexos protéicos e

integrar informações sobre estrutura, dinâmica e energética (Silva et al,

2001; 2002).

A alta pressão pode promover eficientemente a dissociação tanto

de proteínas oligoméricas (Silva & Weber, 1993; Robinson & Sligar, 1995), como

de estruturas virais (Silva et al., 1996). Ela tem uma propriedade única, onde

a perturbação das estruturas macromoleculares em solução depende

exclusivamente da variação de volume do processo de

dissociação/desnaturação (Silva et al., 2001).

A perturbação por pressão pode produzir novas informações acerca

da estabilidade, volume e empacotamento de macromoléculas em uma

extensa variedade de fenômenos biológicos, e tem sido particularmente

útil na investigação de transições conformacionais em proteínas (Jonas &

Jonas, 1994; Heremans & Smeller, 1998; Desai et al., 1999). Em geral, a pressão

Material e Métodos

83

mantém o conjunto de estruturas secundárias, mas é desfavorável às

interações hidrofóbicas, que são predominantemente responsáveis pela

manutenção da estrutura terciária de uma proteína (Silva et al., 1996;

Mozhaev et al., 1996). A variação de volume negativa que ocorre com a

dissociação ou desenovelamento protéico procede integralmente de

interações mais íntimas entre a cadeia polipeptídica e a água. Assim, a

pressão desestabiliza interações hidrofóbicas e eletrostáticas, além de

eliminar as cavidades existentes (Silva et al., 1996; 2001; Frye & Royer, 1998;

Hummer et al., 1998).

Recentemente, a pressão hidrostática tem sido usada para estudar a

montagem de vírus icosaédricos, com o objetivo de entender como a

plasticidade necessária para a perfeita montagem de uma partícula viral

está codificada dentro da conformação enovelada de uma subunidade

protéica do capsídeo (Foguel et al., 1995; Da Poian et al., 1995; Gaspar et al., 1997;

Oliveira et al., 1999a). Esta combinação dos estudos termodinâmicos e

estruturais tem sido utilizada para tentar identificar as regras gerais que

governam a montagem viral. Em linhas gerais, as proteínas do capsídeo

isoladas (monômeros ou dímeros) são muito menos estáveis frente aos

efeitos da pressão do que as partículas icosaédricas montadas (Silva et al.,

1996).

Material e Métodos

84

Assim, apesar de encontrar-se disponível uma vacina de vírus

atenuado bastante imunogênica e eficaz contra o Vírus da Febre Amarela,

recentemente têm sido registradas frequentes ocorrências de casos fatais

devido a reações adversas e reversão da doença em pacientes recém-

vacinados (Vasconcelos et al., 2001; Martin et al., 2001; Chan et al., 2001). Muitos

destes casos de morte associados à vacina são de turistas que vão visitar

áreas endêmicas e são recomendados pelo governo a se vacinar. Para

tentar solucionar este problema, o Ministério da Saúde solicitou à

Fundação Oswaldo Cruz o desenvolvimento de uma vacina inativada

contra o Vírus da Febre Amarela.

A cela de alta pressão (Figura 13A) utilizada em nossos estudos foi

descrita por Paladini & Weber (1981) e fabricada pela ISS Inc. (Champaign,

IL). A cela é de aço vascomax e equipada com três janelas ópticas de

quartzo ou safira (Silva et al., 1992), para eventuais análises

espectroscópicas. Além disso, a cela possui uma abertura superior por

onde é aclopado um tubo apropriado contendo a amostra, que equaliza a

pressão entre o meio hidrostático (etanol) e a amostra que se encontra no

interior do tubo, e por onde é acoplado uma haste flexível que conecta a

cela ao gerador de pressão. A cela também suporta diferentes

Material e Métodos

85

temperaturas pelo acoplamento de um banho-maria circulatório (Fisher

Scientific).

Figura 13 - Sistema de Alta Pressão Hidrostática.

Ilustração dos componentes do sistema de alta pressão. (A) Cela de pressão e as suas janelas ópticas. (B) Componentes do gerador de pressão: (A) reservatório de etanol; (B) válvula que controla a saída do etanol para o gerador de pressão; (C) gerador manual de pressão; (D) válvula que controla a saída do etanol do gerador de pressão para a bomba de pressão; (E) cela de pressão onde é colocada a amostra; (F) manômetro que afere a pressão aplicada na amostra.

O segundo componente do sistema de pressão é o gerador de

pressão propriamente dito (Figura 13B). Ele é composto por um pistão

operado manualmente, que tem por objetivo comprimir o etanol no

interior da tubulação e, consequentemente, a amostra. Esta compressão

se dá por duas válvulas que controlam o fluxo de etanol no tubo

conectado à cela. A pressão gerada no sistema é acompanhada por um

manômetro.

Material e Métodos

86

A pressão utilizada para inativar o YFV 17DD foi de 310 MPa (3,1

kbar = 45 kPSI). Além disso, durante o tempo de pressurização, as

amostras foram mantidas a 4°C com auxílio de um banho-maria

circulatório.

3.11.1. Ensaio de Infecciosidade

Este método foi utilizado com o objetivo de avaliar o grau de

infecciosidade das partículas virais antes e após serem submetidas à alta

pressão hidrostática. Os ensaios foram realizados em placas estéreis de 6

poços (Corning) com uma monocamada semi-confluente de células Vero.

Foram realizadas diluições seriadas da ordem de 101 a 1010, onde 100 L

da amostra a ser avaliada são colocados em cada poço correspondente à

diluição.

Após o tempo de adsorção de 1 h a 37°C, são adicionados 2 mL de

meio semi-sólido (DMEM a 10% de soro fetal bovino, em uma

concentração final de 3% de carboxi-metil-celulose - CMC) a cada poço da

placa. Após 7 dias a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, as placas são

reveladas corando-se as células com uma solução de cristal violeta 1% e

formaldeído 20% por 30 min. O meio semi-sólido é utilizado para diminuir

a difusão do vírus pela placa. Isto permite observar placas de lise celular

Material e Métodos

87

sobre a monocamada, que representam a infecção de apenas uma

partícula que iniciou o ciclo. Desta maneira, após os 7 dias, as placas de

lise são então contadas.

O título viral é expresso em unidades formadoras de placa por

unidade de volume (UFP/mL). Assim, o grau de infecciosidade era avaliado

através de ensaios de infecciosidade, onde quanto maior a diluição do

vírus, e ainda assim sendo capaz de induzir efeito citopático, maior é o seu

título. A maioria das preparações gerava amostras com títulos próximos a

107 UFP/mL e, além disso, podíamos aferir também o grau de

infecciosidade das amostras submetidas à alta pressão hidrostática.

3.11.2. Avaliação da Infecciosidade Residual do YFV Inativado

A fim de confirmar a inativação viral, a infecciosidade residual do

YFV inativado foi avaliada pela incubação de 1 mL do vírus em células Vero

e C6/36. Assim, monocamadas destas células cultivadas em garrafas de 25

cm2 foram inoculadas em triplicatas com amostras virais inativadas pela

pressão. Após 1 h de adsorção, as partículas virais não adsorvidas foram

retiradas e meio 199 ou L-15 eram adicionados às células Vero e C6/36,

respectivamente. Após 7 dias, o sobrenadante da cultura era coletado e a

infecciosidade viral era avaliada por um ensaio de titulação em

Material e Métodos

88

monocamadas de células Vero (Caufour et al., 2001). A inativação viral foi

realizada com diferentes preparações do vírus 17DD clarificado e os

resultados apresentam valores obtidos a partir de três experimentos

independentes.

3.12. Ensaios em Camundongos

Todos os ensaios utilizando animais foram realizados de acordo com

o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Experimentação e

Cuidados com os Animais (CEUA – FIOCRUZ: P0152/02). As preparações

inativadas do vírus (310 MPa por 3 h a 4˚C) eram administradas

diretamente após o tratamento de alta pressão.

3.12.1. Ensaios de Inocuidade

Para os estudos de inocuidade, camundongos suíços webster (Mus

musculus) de 3 a 7 dias foram inoculados por via intracerebral (i.c.) com

YFV 17DD da vacina produzida em Bio-Manguinhos (número do lote

035VFA035P), YFV 17DD inativado por pressão ou meio 199 (controle

negativo). Os vírus foram diluídos em meio 199 e o inóculo era novamente

titulado logo após o procedimento. A quantidade de vírus em UFP

necessária para matar 50% dos camundongos foi estabelecida como

Material e Métodos

89

descrito anteriormente (Caufour et al., 2001). Os animais foram monitorados

durante 21 dias e as eventuais mortes foram registradas. Animais

visivelmente letárgicos foram mortos por exposição a CO2.

3.12.2. Imunização

Os estudos de imunogenicidade foram realizados com o vírus 17DD

produzido em células Vero. Neste ensaio, grupos de fêmeas de

camundongos suíços com idade de 3 a 7 semanas foram imunizados por

via subcutânea (s.c.) com doses de 0,1 mL. A programação consistiu de 3

doses com intervalos de 2 semanas. Os vírus diluídos em meio de cultura

199 completo foram inoculados com aproximadamente 104 UFP/dose. O

grupo dos animais que serviram como controle negativo receberam

apenas meio de cultura 199 completo. Os vírus foram titulados

novamente, logo após o procedimento de imunização. Os camundongos

foram sangrados a partir do plexo retro-orbital, utilizando uma pipeta de

vidro estéril antes da primeira dose e após 2 semanas de cada imunização.

3.12.3. Ensaio de Proteção

Para avaliar a proteção possivelmente concedida pela imunização,

ensaios de desafio dos animais foram realizados 45 dias após a

Material e Métodos

90

imunização. Camundongos de 9 semanas, previamente imunizados, foram

inoculados por via intracerebral (i.c.) com 30 L de uma dose letal de 5.0

log10 UFP do YFV 17DD cepa vacinal (número do lote 035VFA035P). Os

animais foram monitorados diariamente durante 21 dias. A dose mínima

letal capaz de matar 50% dos animais (MLD50) foi calculada de acordo com

protocolo descrito anteriormente (Freire et al., 2005). Assim, a MLD50 foi

calculada a partir da quantidade de animais mortos para cada diluição

juntamente com os títulos em UFP após a imunização para estabelecer a

quantidade de vírus (em UFP) necessária para matar 50% dos

camundongos.

3.13. Ensaios para Detecção de Neutralização dos Anticorpos

O título dos anticorpos foi determinado pelo teste de neutralização

de redução de 50% dos plaques (PRNT) em células Vero. O PRNT foi

calculado a partir de diluições seriadas começando em 1:10 em placas de

96 poços, como já descrito (Stefano et al., 1999). O título dos anticorpos

neutralizantes foi expresso em unidades internacionais por mL (IU/mL),

usando uma preparação de soro para YFV 17DD contendo 111,5 IU/mL.

Este soro foi padronizado de acordo com um soro de referência contendo

Material e Métodos

91

14,300 mIU/mL, seguindo os procedimentos da Organização Mundial da

Saúde (Copenhagen Serum Institute) (Freire et al., 2005).

3.14. Análises Estatísticas

As médias e os desvios padrão foram calculados para os

experimentos de espectroscopia de fluorescência de supressão por

acrilamida e para os ensaios de detecção de infecciosidade residual e

imunogenicidade do YFV em camundongos. O teste Student t foi usado

para comparar as médias. As diferenças foram consideradas

estatisticamente significativas se os valores de P fossem iguais ou menores

que 0,05. As análises estatísticas foram realizadas usando o programa

Statistica 6.0 (Stata Corporation, College Station, TX. 1999).

Resultados – Parte I

92

4. Resultados

Parte I

Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com

Membranas Biomiméticas

Os vírus envelopados entram nas células através da fusão entre o

envelope viral e a membrana da célula hospedeira. Uma ou mais proteínas

de membrana viral facilitam as várias etapas de fusão. A fusão entre duas

membranas é termodinamicamente favorável, mas existe uma barreira

energética alta. As proteínas de fusão viral conseguem diminuir esta

barreira energética utilizando a energia livre liberada durante a alteração

conformacional da proteína (Chernomordik et al., 2003; 2006).

As proteínas de fusão de vírus possuem uma sequência, bastante

conservada dentro de cada gênero, importante para a atividade de fusão.

Este fragmento é conhecido como peptídeo de fusão, e seu caráter

hidrofóbico facilita sua inserção em membranas alvo. Os Flavivírus

possuem esta sequência conservada que varia majoritariamente em

apenas uma posição. De uma forma geral, os vírus transmitidos por

mosquito apresentam um resíduo de Glicina na posição 104, enquanto os

vírus que possuem como vetor o carrapato apresentam um resíduo de

Histidina.


93

Embora a idéia geral do processo de fusão dos vírus envelopados

seja bem aceita, os mecanismos que regem a interação são pobremente

entendidos. Portanto, neste estudo, as propriedades da interação de dois

peptídeos de fusão de Flavivírus, FLAG e FLAH, com membranas

biomiméticas foram investigadas.

4.1. Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade dos Peptídeos de Fusão

A sequência dos peptídeos de fusão consiste de um intervalo de 13

aminoácidos, sendo dois resíduos carregados positivamente (Arg99 e

Lys110) e um resíduo carregado negativamente (Asp98), além de um

aminoácido aromático (Trp101) importante para as medidas de

fluorescência neste estudo (Figura 14A). Em pH neutro, estes peptídeos

exibem carga +1, entretanto, a presença de um resíduo de His na posição

104 torna o peptídeo FLAH mais carregado (+2) em pHs abaixo de 6. Uma

característica bastante comum em peptídeos de fusão de vírus é que

ambos os peptídeos estudados aqui são ricos em Gly, o que os tornam

altamente flexíveis e conformacionalmente polimórficos (Figura 14A).

A partição de oligopeptídeos dentro de interfaces de membrana

promove a formação de estrutura secundária. Uma descrição quantitativa

do acoplamento da formação de estrutura para particionar, que pode


94

fornecer uma base para o entendimento de enovelamento e inserção de

proteínas de membrana, requer uma escala de energia livre apropriada

para partição. Wimley e White (1996), levando em consideração a

contribuição das ligações peptídicas, descreveram uma escala de

hidrofobicidade interfacial completa determinada a partir de duas séries

de pequenos peptídeos modelo dentro da interface de membranas

fosfolipídicas zwiteriônicas. Neste trabalho, eles mostraram que a

interação dos resíduos aromáticos é favorável dentro da interface de

membranas, enquanto os resíduos carregados são desfavoráveis. Além

disso, a redução do alto custo de partição das ligações peptídicas através

de ligações de hidrogênio pode ser importante para promover a formação

de estrutura na interface da membrana (Wimley & White, 1996).

De acordo com a escala de hidrofobicidade (Figura 14B), os

aminoácidos carregados, presentes nas porções terminais de cada

sequência, mostram uma pequena tendência para particionar dentro da

bicamada lipídica. Isto sugere que os peptídeos de fusão dos Flavivírus,

FLAG e FLAH, podem adotar uma estrutura curvada na interface de

membranas.


95

(A)

(B)

Figura 14 – Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade de Peptídeos de Fusão Virais.

(A) Sequências de diferentes peptídeos de fusão de vírus. A diferença entre FLAG e FLAH é um resíduo de Gly que está na posição de uma His. Neles, o Trp101, a Gly104 e a His104 estão indicados em negrito, enquanto os aminoácidos conservados dentro do gênero estão sublinhados. (B) Gráfico de hidrofobicidade para os peptídeos de fusão de Flavivírus FLAG e FLAH, conforme escala descrita por Wimley & White (1996).

Sequências de Peptídeos de Fusão de Vírus

Vírus Sequência Resíduos Gly

FLAG DRGWGNGCGLFGK 13 38%

FLAH DRGWGNHCGLFGK 13 31%

SFV GVYPFMWGGAYCFCDSEN 18 17%

HIV-1 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF 24 29%

Influenza A AVGIGAIFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQA 30 20%

Aminoácido

98 100 102 104 106 108 110

Hid

rofo

bici

dade

-1

0

1

2FLAGFLAH


96

4.2. Análise das Propriedades Estruturais da Interação Peptídeo-Micela

O espectro de emissão de fluorescência de peptídeos que

apresentam resíduos aromáticos em suas sequências pode fornecer

informações valiosas acerca das propriedades estruturais locais (Lakowicz,

1999). Em solução, ambos os peptídeos estudados apresentam um máximo

de absorção a 280 nm, valor utilizado para excitar as amostras em todos

os nossos experimentos de fluorescência. Além disso, ambos mostraram

um máximo de emissão a 349 nm (Figura 15A), valor bastante desviado

para o vermelho, o que indica uma exposição dos resíduos de Trp ao meio

aquoso.

Há muitos anos, diversos estudos vêm mostrando que detergentes

iônicos, como o Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), são capazes de se ligar a

muitas proteínas com alta afinidade e utilizados para diversas finalidades

estruturais (Decker & Foster, 1966; Reynolds et al., 1967; Parker & Song, 1992). As

interações são governadas pelo estado agregado do detergente (micelas),

que se liga a proteínas via interações entre seu grupamento sulfato e a

cadeia lateral de aminoácidos carregados positivamente, e entre a cadeia

alquila e as cadeias laterais hidrofóbicas (Yonath et al., 1977; Wang et al.,

1996).


97

Figura 15 – Espectros de Absorção e de Emissão de Fluorescência dos Peptídeos de Fusão de Flavivírus.

(A) Espectro de absorção do peptídeo FLAG. Espectros de emissão de fluorescência dos resíduos de Trp dos peptídeos FLAG (B e D) e FLAH (C e E) adquiridos em tampão (linhas pretas), na presença de micelas de SDS 10 mM (B e C) e n-octil-β-D-glicopiranosídeo 40 mM (D e E) (linhas azuis). A concentração dos peptídeos utilizada foi de 10 M diluídos em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4. Em ambas as micelas, não existe diferença significativa entre os pHs 5,5 e 7,4. Exc: 280 nm; Em: 300-420 nm. Os dados mostrados são muito similares ao peptídeo FLAH.

Comprimento de Onda (nm)

260 280 300 320A

bsor

bânc

ia

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15FLAG


300 320 340 360 380 400 420

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Nor

mal

izad

a

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 0 mM n-OGP40 mM n-OGP


300 320 340 360 380 400 420

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

(U.A

.)

0

20

40

60

80

100

120

140 0 mM n-OGP40 mM n-OGP


300 320 340 360 380 400 420

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

Nor

mal

izad

a

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 0 mM SDS10 mM SDS


300 320 340 360 380 400 420

Inte

nsid

ade

de F

luor

escê

ncia

(U.A

.)

0

50

100

150

200

250

300 0 mM SDS10 mM SDS

A

B C

D E


98

Para determinar a extensão relativa da interação dos resíduos de

Trp com micelas de diferentes características, experimentos de supressão

de fluorescência foram realizados. A fluorescência intrínseca do Trp de

ambos os peptídeos obedece à equação linear de Stern-Volmer, utilizando

acrilamida como um agente supressor neutro, hidrofílico e dinâmico.

Na presença de micelas aniônicas de SDS, o pico do comprimento de

onda de emissão é desviado de 349 nm para cerca de 334 nm em ambos

os peptídeos (Figura 15B) e não existe diferença significativa entre os pHs

analisados. Este desvio para o azul é representativo dos resíduos de Trp,

completamente expostos à água em tampão, sendo particionado dentro

de um ambiente mais hidrofóbico fornecido pelas micelas (Lakowicz, 1999).

Além disso, a intensidade de fluorescência aumenta cerca de três vezes,

sugerindo um ambiente mais rígido em torno dos resíduos de Trp (Figura

15B).

Em solução e em ambos os pHs, os valores das constantes de

supressão de Stern-Volmer (KSV) foram próximos a 12 M-1 e 15 M-1 para

FLAG e FLAH, respectivamente (Figuras 16 e 17; Tabela I). Quando micelas

de SDS estão presentes no meio, a extensão da supressão diminui,

indicando uma diminuição na probabilidade de colisão entre o fluoróforo

e o agente supressor. Portanto, a proteção parcial frente ao solvente


99

aquoso é também suportada pela diminuição da constante de Stern-

Volmer (KSV) para cerca de 11 M-1, alteração mais evidente para o

peptídeo FLAH (Figura 16). As intensidades de fluorescência de ambos os

peptídeos na presença de micelas de SDS são muito similares e existe

pouca diferença entre a eficiência de supressão dos resíduos de Trp pela

acrilamida, indicando que o pH não tem efeito significativo sobre a

acessibilidade do supressor, pelo menos, no que diz respeito ao estudo de

pequenos peptídeos sintéticos individuais.


100

Figura 16 – Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de SDS, Monitorada por Supressão de Fluorescência por Acrilamida.

Supressão da fluorescência por acrilamida dos triptofanos presentes nos peptídeos FLAG (A) e FLAH (C) na presença ou na ausência de micelas de SDS. 10 M de peptídeo foram incubados com concentrações crescentes de acrilamida a 37°C, excitados em 280 nm e a emissão foi analisada em 349 nm (ausência) e 334 nm (presença). Em preto e em azul, representação na ausência e na presença de concentração micelar de SDS em pH 5,5, respectivamente. Em vermelho e em verde, representação dos peptídeos na ausência e presença de concentração micelar de SDS em pH 7,4, respectivamente. (B e D) Quantificação da supressão utilizando a constante de Stern-Volmer. Análise estatística utilizando o teste t (Student’s t-test). * P = 0,0426; ** P = 0,0056; *** P = 0,0002; **** P < 0,0001.

B FLAG

FLAH D

Acrilamida (mM)

C FLAH

Acrilamida (mM)

FLAG A

*

* **

**

**** **** ***

***

5,5

5,5

7,4

7,4


101

Por outro lado, na presença de micelas neutras de n-octil-β-D-

glicopiranosídeo, os espectros de ambos os peptídeos apresentaram um

desvio para o azul de apenas 3 nm (Figura 15C e Tabela I). Esta

observação sugere que os peptídeos na presença de micelas estão

parcialmente protegidos da água, mas ainda permanecem em contato

com o solvente através de ligações de hidrogênio, o que está consistente

com a imersão do fluoróforo dentro da interface micela-água. Estes

resultados indicam que o desvio para o azul é mais substancial com

micelas de SDS do que com micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo (334

vs. 346 nm), sugerindo uma maior interação do anel indol do Trp com

detergentes carregados negativamente e uma interação diferenciada com

as micelas neutras (Lakowicz, 1999).


102

Tabela I – Parâmetros Espectroscópicos Medidos para a Ligação dos

Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH a Diferentes Micelas

Ksv (M-1) Calculado

Condição

Experimental

Tampão (tp) SDS

(10 mM)

razão

(tp/SDS)

n-OGP

(40 mM)

razão

(tp/n-OGP)

FLAG em pH 7,4 12,72 0,285 11,76 0,319 1,08 10,51 0,199 1,21

FLAG em pH 5,5 12,13 0,38 10,73 0,203 1,13 11,72 0,212 1,03

FLAH em pH 7,4 14,95 0,206 12,23 0,126 1,22 14,25 0,22 1,05

FLAH em pH 5,5 16,17 0,312 11,75 0,373 1,38 11,3 0,668 1,43

Comprimento de onda de emissão (nm)

349

334

-

346

-

Desvio do espectro (nm)a

- 15 - 3 -

Estes experimentos foram realizados em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 e 5,5, usando 10 M de peptídeo. a O desvio do espectro foi determinado após subtração do espectro controle.

O desvio padrão foi obtido através de replicatas independentes (n ≥ 3) para cada experimento.


103

Entretanto, a constante de supressão mostrou uma mudança

estatisticamente significativa, principalmente para o peptídeo FLAH em pH

5,5 (11 M-1) quando comparada com o controle (16 M-1). A razão entre as

constantes de Stern-Volmer em tampão e na presença de micelas de n-

octil-β-D-glicopiranosídeo, calculada como uma média entre aquelas

obtidas a partir dos gráficos de intensidade (Tabela I), é maior para o

peptídeo FLAH em pH 5,5 em ambas as micelas analisadas. Estes

resultados podem ser interpretados como uma indicação de que a

acessibilidade do supressor ao fluoróforo diminui devido à inserção do

FLAH dentro de regiões não polares das micelas nesta condição (Figura 17

e Tabela I). Ao contrário, nenhuma variação significativa foi observada em

pH 7,4, sugerindo que, na presença de micelas de SDS, os resíduos de Trp

de ambos os peptídeos estão mais escondidos nesta condição.


104

Figura 17 - Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo, Monitorada por Supressão de Fluorescência por Acrilamida.

Experimento de supressão da fluorescência por acrilamida dos triptofanos presentes nos peptídeos FLAG (A) e FLAH (C) na presença ou na ausência de micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo. 10 M de peptídeo foram incubados com concentrações crescentes de acrilamida a 37°C, excitados em 280 nm e a emissão foi analisada em 349 nm (ausência) e 346 nm (presença). Em preto e em azul, representação na ausência e na presença de concentração micelar de n-octil-β-D-glicopiranosídeo em pH 5,5, respectivamente. Em vermelho e em verde, representação dos peptídeos na ausência e presença de concentração micelar de n-octil-β-D-glicopiranosídeo em pH 7,4, respectivamente. (B e D) Quantificação da supressão de acrilamida utilizando a constante de Stern-Volmer. Análise estatística utilizando o teste t (Student’s t-test). * P = 0,0003; ** P = 0,0038.

Acrylamide (mM)

FLAH

C

FLAG

A

FLAG B

FLAH D

*

**

**

*

5,5

5,5

7,4

7,4


105

Juntos, estes resultados indicam que para os peptídeos FLAG e FLAH

a associação à membrana é parcialmente dependente de carga. Além

disso, os dados sugerem que os peptídeos podem interagir de forma

distinta na presença de diferentes micelas, podendo envolver ou não o

ambiente do Trp. Embora a supressão de fluorescência tenha diminuído

significativamente na maioria dos casos, a baixa diferença nos valores das

constantes de Stern-Volmer indica que parte dos resíduos de Trp estão

expostos ao ambiente polar, sugerindo que a interação peptídeo-micela

esteja ocorrendo mais superficialmente.

4.3. Termodinâmica da Interação Peptídeo-Micela

A adsorção à superfície, a inserção na membrana e a ligação

específica são geralmente acompanhadas por alterações no conteúdo de

calor do sistema e podem ser medidas através de calorimetria isotérmica

de titulação (ITC), evitando a necessidade de marcação de peptídeos. ITC

foi utilizado para avaliar e comparar a entalpia de interação dos peptídeos

FLAG e FLAH com diferentes micelas. Devido à própria característica de

equilíbrio das micelas, a interação, neste caso, não alcança um nível de

saturação, já que existirá sempre muito mais detergente do que peptídeo,

e por este motivo não é possível calcular as constantes de ligação.


106

A entalpia de ligação (H) de cada reação foi calculada a partir dos

fluxos de calor resultantes de quatro injeções de peptídeo em micela em

diferentes temperaturas e em ambos os pHs, 7,4 e 5,5. Em todos os casos,

experimentos controle foram realizados e subtraídos com o objetivo de

descontar o calor de diluição da amostra.

Na presença de micelas de SDS, o processo de ligação é

endotérmico a 37°C e exotérmico a 25°C e 15°C (Figura 18). Por outro

lado, a interação com micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo produz um

calor de reação exotérmico em todas as temperaturas analisadas,

indicando que esta ligação é amplamente governada por entalpia (Figura

19). Surpreendentemente, os valores das entalpias de todas as ligações

foram extremamente elevados, variando desde 50 kcal/mol até -830

kcal/mol (Tabela II). Além disso, em todos os experimentos de ITC, o pH

não influenciou nos resultados e não houve diferença significativa entre os

dois peptídeos estudados.


107

Figura 18 – Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.

Perfis calorimétricos após a injeção de alíquotas de 5 L de peptídeo, a partir de um

estoque a 100 M, à cela calorimétrica contendo micelas de SDS em tampão em pH

5,5. Cada injeção representa a adição de aproximadamente 0,003 M de peptídeo. Em (A), peptídeo FLAG adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato pH 5,5. Em (B), peptídeo FLAH adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato pH 5,5. As temperaturas analisadas foram 15°C (verde), 25°C (vermelho) e 37°C

(azul). Em todos os painéis, a primeira injeção foi de 1 L de peptídeo. Os resultados foram muito similares em pH 7,4. As medidas de ITC foram realizadas utilizando um calorímetro VP-ITC da MicroCal, Llc (Northamptom, MA).

Tempo (seg)

0 500 1000 1500 2000

Flux

o de

Cal

or (

cal s

-1)

-1

0

1

2SDS - 15°C SDS - 25°C SDS - 37°C

FLAG

Tempo (seg)

0 500 1000 1500 2000

Flux

o de

Cal

or (

cal s

-1)

-1

0

1

SDS - 15°C SDS - 25°CSDS - 37°C

FLAH

A

B


108

Figura 19 – Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.

Perfis calorimétricos após a injeção de aproximadamente 0,003 M de peptídeo à cela calorimétrica contendo micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo em tampão em pH 5,5. Em (A), peptídeo FLAG adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato pH 5,5. Em (B), peptídeo FLAH adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato pH 5,5. As temperaturas analisadas foram 15°C (verde), 25°C (vermelho) e 37°C

(azul). Em todos os painéis, a primeira injeção foi de 1 L de peptídeo. Os resultados foram muito similares em pH 7,4. As medidas de ITC foram realizadas utilizando um calorímetro VP-ITC da MicroCal, Llc (Northamptom, MA).

Tempo (seg)

0 500 1000 1500 2000

Flux

o de

Cal

or (

cal s

-1)

-20

-15

-10

-5

0

n-OGP - 15°C n-OGP - 25°C n-OGP - 37°C FLAG

Tempo (seg)

0 500 1000 1500 2000

Flux

o de

Cal

or (

cal s

-1)

-20

-15

-10

-5

0

n-OGP - 15°C n-OGP - 25°C n-OGP - 37°C FLAH

A

B


109

Tabela II – Parâmetros Termodinâmicos da Interação Peptídeo-Micela

Condição Experimental

pH

H (kcal/mol)

Cp (kcal/mol x K)

37°C

25°C 15°C

FLAG (SDS) 7,4 85,6 -2,26 -76,07 7,35

5,5 70,73 -8,46 -84,24 7,03

FLAH (SDS) 7,4 45,24 -22,29 -78,75 5,64

5,5 50,44 -22,59 -73,17 5,63

FLAG (SDS/NaCl) 5,5 77 109 303 -10,02

FLAH (SDS/NaCl) 5,5 41,3 80,4 216,1 -7,79

FLAG (n-OGP) 7,4 -199,4 -503,7 -780 26,36

5,5 -215,2 -510,8 -752,4 24,42

FLAH (n-OGP) 7,4 -197,1 -491,4 -830,3 28,64

5,5 -196,5 -492 -794 27,07

Estes experimentos foram realizados em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 e 5,5, na presença ou na ausência de NaCl 250 mM.


110

A entalpia de ligação obtida em diferentes temperaturas (Figura 20

A e B) possibilita encontrar os valores de variação da capacidade calorífica

(Cp) para cada sistema de reação. Todos os valores de Cp foram

expressivamente positivos (Tabela II), indicando que as interações dos

peptídeos FLAG e FLAH com micelas de SDS e n-octil-β-D-glicopiranosídeo

são predominantemente não-hidrofóbicas (Cooper, 2000).

Neste sentido, para avaliar a presença de interações eletrostáticas,

NaCl 250 mM foi incluído no sistema de reação contendo micelas de SDS

nesta condição. A perda entálpica da interação dos peptídeos com micelas

de SDS pode ser observada (Tabela II), uma vez que a reação se mostrou

endotérmica em todas as temperaturas analisadas (Figura 21). Portanto, a

presença de sal é capaz de reverter a termodinâmica do sistema, tornando

os valores de Cp completamente negativos, sugerindo uma

predominância de interações hidrofóbicas nesta condição (Figura 20A).


111

Figura 20 - Efeito da Temperatura na Entalpia de Ligação Peptídeo-Micela.

A variação da capacidade calorífica é descrita pela variação do H em função da temperatura. As medidas foram realizadas a 15°C, 25°C e 37°C. Em vermelho e azul, os peptídeos FLAG e FLAH, respectivamente, foram adicionados à cela contendo 20 mM de SDS (A) ou 40 mM de n-octil-β-D-glicopiranosídeo (B) em tampão fosfato de sódio pH 5,5; já em verde e ciano, os peptídeos FLAG e FLAH, respectivamente, foram adicionados à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato de sódio, NaCl 250 mM, pH 5,5.

Temperatura (°C)

15 20 25 30 35 40

H (k

cal m

ol-1

)

-200

-100

0

100

200

300

400FLAG - SDSFLAH - SDSFLAG - SDS/NaClFLAH - SDS/NaCl

Temperatura (°C)

15 20 25 30 35 40

H (k

cal m

ol-1

)

-900

-800

-700

-600

-500

-400

-300

-200

-100FLAG - n-OGPFLAH - n-OGP

A

B


112

Figura 21 - Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de NaCl.

Perfis calorimétricos após a injeção de alíquotas de 5 L de peptídeo, a partir de um

estoque a 100 M, à cela calorimétrica contendo micelas de SDS em tampão em pH 5,5. Em (A), peptídeo FLAG adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato de sódio, NaCl 250 mM, pH 5,5. Em (B), peptídeo FLAH adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato de sódio, NaCl, 250 mM, pH 5,5. As temperaturas analisadas foram 15°C (verde), 25°C (vermelho) e 37°C (azul). Em todos os painéis, a primeira injeção foi de 1 L de peptídeo. Os resultados foram muito similares em pH 7,4. As medidas de ITC foram realizadas utilizando um calorímetro VP-ITC da MicroCal, Llc (Northamptom, MA).

Tempo (seg)

0 500 1000 1500 2000

Flux

o de

Cal

or (

cal s

-1)

0

1

2

3

4

5

6 SDS/NaCl - 15°C SDS/NaCl - 25°C SDS/NaCl - 37°C

FLAG

Tempo (seg)

0 500 1000 1500

Flux

o de

Cal

or (

cal s

-1)

0

1

2

3

4SDS/NaCl - 15°C SDS/NaCl - 25°C SDS/NaCl - 37°C

FLAH

A

B


113

4.4. Análise das Mudanças Conformacionais dos Peptídeos

Apesar das contribuições aromáticas serem muitas vezes fracas em

comparação a outras estruturas amidas, alterações no ambiente de

cadeias laterais de resíduos aromáticos em proteínas causadas por uma

ligação, por exemplo, podem levar a mudanças detectáveis em seu sinal

de dicroísmo circular (CD). Tais contribuições são geralmente monitoradas

na região de UV próximo, onde o esqueleto amida não contribui. Apesar

da aparente estrutura randômica observada no espectro de CD, a faixa

positiva na região entre 225 e 235 nm se deve às cadeias laterais dos

resíduos Trp ou Tyr, ou a ligações dissulfeto, uma vez que contribuições

amidas nesta região geralmente são negativas (Sreerama & Woody, 2004).

As cadeias laterais aromáticas frequentemente formam interações

pareadas ou clusters em proteínas. O acoplamento de dois grupos

aromáticos depende da distância que os separa e da orientação de seus

anéis aromáticos. Normalmente, distâncias mais curtas levam a sinais de

CD mais fortes (Sreerama & Woody, 2004). Além disso, interações aromático-

aromático fazem uma maior contribuição para a estabilidade de β-hairpin

do que as interações alifático-aromático (Cochran et al., 2001; 2002; Hughes &

Waters, 2006).


114

As medidas de CD neste estudo revelam que os peptídeos FLAG e

FLAH em solução aquosa exibem uma conformação randômica, devido ao

forte pico negativo próximo à região de 200 nm (Figura 22). Além disso,

um pico positivo aparece na região entre 225-230 nm, o que poderia

indicar presença de pontes dissulfeto ou uma interação entre resíduos

aromáticos. De fato, os peptídeos apresentam um resíduo de Cys na

posição 105, e a formação de oligômeros entre eles através de ligações

dissulfeto seria possível. Entretanto, esta hipótese foi descartada porque o

pico positivo permanece no espectro mesmo após tratamento dos

peptídeos com DTT, um agente redutor (dados não mostrados).

Portanto, a possível interação entre os resíduos aromáticos Trp101

e Phe108 presentes em cada sequência foi investigada. A interação

aromático-aromático pode ser rompida de maneira reversível

submetendo os peptídeos a altas temperaturas (Takekiyo et al., 2009), como

mostra a Figura 23. Desta maneira, é provável que o aparecimento do pico

positivo seja reflexo da interação Trp-Phe. Como estes resíduos

aromáticos estão presentes em cada extremidade das sequências dos

peptídeos, a provável interação entre eles indica que ambos os peptídeos

adotariam, em solução, uma conformação curvada.


115

2, 2, 2-trifluoretanol (TFE) é um álcool muito utilizado em estudos

de enovelamento de proteínas por afetar fortemente sua estrutura

tridimensional. Sua presença pode promover o aumento das populações

de hélices. Acredita-se que o TFE se agrega ao redor da proteína na

mistura água-álcool, levando à formação de uma matriz que excluiria

parcialmente a água e promoveria interações locais, via ligação de

hidrogênio, que ordenariam a estrutura secundária da molécula,

tornando-a mais estável (Roccatano et al., 2002). Desta forma, a estrutura

dos peptídeos foi avaliada na presença de TFE, e análises de CD

mostraram que TFE não é capaz de induzir a formação de hélices (Figura

22). Isto indica fortemente que estes peptídeos não possuem propensão

para formarem tal estrutura.


116

Figura 22 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de TFE.

Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão (preto) ou na presença (azul) de 100% de TFE. A concentração de peptídeo utilizada foi de 1 mM diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 5,5, a 25°C.

FLAG


200 210 220 230 240 250 260

Elip

ticid

ade

Bru

ta (m

grau

)

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

controle100% TFE

FLAH


200 220 240 260

Elip

ticid

ade

Bru

ta (m

grau

)

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

controle100% TFE

A

B


117

Figura 23 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH Submetidos à Alta Temperatura.

Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão a 25°C (preto) ou a 85°C (azul). O retorno a temperatura de 25°C está mostrado em vermelho. A concentração de peptídeo utilizada foi de 1 mM diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4.

FLAG


200 210 220 230 240 250 260

Elip

itici

dade

Bru

ta (m

grau

)

-6

-4

-2

0

2

25°C85°C retorno

FLAH


200 210 220 230 240 250 260

Elip

itici

dade

Bru

ta (m

grau

)

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

25°C85°Cretorno

A

B


118

A presença de um ambiente hidrofóbico refletido pelas micelas de

SDS induz um ganho de estrutura na região próxima a 218 nm (Figura 24),

sugerindo uma possível conformação adicional em volta-β, que é

geralmente formada por três resíduos e estabilizada por uma ligação de

hidrogênio entre o primeiro e o terceiro grupamento amida, revertendo a

direção da cadeia (Sreerama & Woody, 2004). Isto poderia indicar a presença

de uma estrutura mais estável, formada por duas fitas-β, que em um

ambiente apolar estariam conectadas por uma volta-β, ambas formando

uma estrutura em β-hairpin, já que o pico positivo próximo à região de

230 nm permanece no espectro, indicando a interação entre os

aromáticos. Entretanto, a presença de micelas neutras de n-octil-β-D-

glicopiranosídeo não é capaz de induzir tal estrutura, uma vez que seu

espectro é muito similar ao controle (Figura 25).


119

Figura 24 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de Micelas de SDS.

Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão (preto) ou na presença de micelas de SDS a 10 mM (azul). A concentração de peptídeo utilizada foi de 1 mM, diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, a 25°C. Perfil similar foi observado para o pH 5,5.

FLAG


200 220 240 260

Elip

itici

dade

Bru

ta (m

grau

)

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

controleSDS 10 mM

FLAH


200 220 240 260

Elip

itici

dade

Bru

ta (m

grau

)

-8

-6

-4

-2

0

2

controleSDS 10 mM

A

B


120

Figura 25 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo.

Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão (preto) ou na presença de micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo a 40 mM (azul). A concentração de peptídeo utilizada foi de 1 mM, diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4. O mesmo perfil foi observado para o pH 5,5.

FLAG


200 220 240 260

Elip

itici

dade

Bru

ta (m

grau

)

-6

-4

-2

0

2

controlen-OGP 40 mM

FLAH


200 220 240 260

Elip

itici

dade

Bru

ta (m

grau

)

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

controlen-OGP 40 mM

A

B


121

Em modelos de peptídeos em hélice, a estabilização da estrutura

ocorre principalmente por uma consequência das interações locais. Ao

contrário, as folhas-β são propagadas por resíduos em partes

completamente diferentes da sequência dos peptídeos. Um β-hairpin

representa o modelo mais simples aceito de uma folha-β antiparalela,

consistindo de duas fitas-β ligadas por um pequeno loop ou por uma volta

reversa (Griffiths-Jones et al., 1999; Takekiyo et al., 2009).

β-hairpin apresenta estabilidade marginal (G° 0 a 30°C),

fornecendo um sistema modelo sensível para avaliar a natureza de

interações relevantes que estabilizam uma estrutura em folha-β, e, assim,

entender a estabilidade e os eventos iniciais de enovelamento de uma

proteína (Minor & Kim, 1994). A origem da estabilidade tem sido atribuída a

um número de fatores chave, incluindo o papel das ligações de hidrogênio

entre as fitas, o efeito das interações hidrofóbicas devido à cadeia lateral

(Searle et al., 1995; Ramirez-Alvarado et al., 1996; Maynard et al., 1998) e as

preferências conformacionais amplamente associadas às sequências de

volta-β (de Alba et al., 1997a, b; Haque & Gellman, 1997).

Vários exemplos têm ilustrado como as sequências de uma volta

podem ditar não somente a estabilidade do hairpin e a própria

conformação da volta, mas também o registro das ligações de hidrogênio


122

entre as fitas e o pareamento dos resíduos entre as duas fitas-β (Blanco et

al., 1993; Searle et al., 1995; de Alba et al., 1997a, b; Haque & Gellman, 1997).

Hairpin é uma estrutura altamente resistente a desnaturação,

permanecendo significativamente enovelada em 7 M de uréia (Griffiths-

Jones et al., 1999).

Enquanto sequências arbitrárias extraídas de proteínas raramente

formam β-hairpins estáveis em solução aquosa, muitos pesquisadores têm

mostrado que pequenos peptídeos projetados podem se enovelar em

uma estrutura em β-hairpin (Muñoz et al., 1997; Gellman, 1998; Cheng et al.,

2001; Hughes & Waters, 2006). Estudos de interações aromáticas ganham

destaque através da agregação de folhas-β, que leva à formação de placas

amilóides e resulta em agregação de proteínas e doenças

neurodegenerativas (Gazit, 2002; Tracz et al., 2004).

4.5. Perturbação da Bicamada Lipídica Promovida pela Interação dos Peptídeos de Fusão

Em um termograma de aquecimento por DSC, a temperatura de

transição corresponde à altura máxima do pico de transição e a entalpia

de transição corresponde à área integrada do pico dividida pela

concentração lipídica. As vesículas compostas por Di-Palmitoil-


123

Fosfatidilcolina (DPPC) são bicamadas bem caracterizadas e bastante

utilizadas como modelo para diversos estudos.

Um termograma para uma dispersão aquosa de bicamadas de

DPPC, ou C(16):C(16)PC, mostra três transições endotérmicas. O pico de

menor temperatura, com uma temperatura de transição de 21,5°C e uma

entalpia de transição (H) de 6 kcal/mol, é pequeno e mais alargado. Esta

transição de menor temperatura é chamada de sub-transição. A

temperatura de transição média, conhecida como pré-transição (Tpre), é

muito pequena e é caracterizada por uma temperatura de transição de

35°C e uma entalpia de 1 kcal/mol. O pico maior e mais estreito que

aparece em uma temperatura superior é a transição de fase principal, com

uma temperatura de transição (Tm) de 41,5°C e uma entalpia de transição

de 8,7 kcal/mol (Huang & Li, 1999).

Como aparecem três transições diferenciadas, quatro fases

lamelares, designadas como Lc, Lβ’, Pβ’ e L, podem ser definidas para uma

bicamada de DPPC dentro de uma faixa de 0°C a 50°C sob pressão

atmosférica. Lc, Lβ’, Pβ’ e L são as fases lamelares cristalina, gel inclinada,

gel ondulada e líquido-cristalina, respectivamente. Portanto, as transições

de fase sub-, pré- e principal são atribuídas às transições Lc Lβ’, Lβ’

Pβ’, Pβ’ L, respectivamente. Como a pré-transição é muito pequena, a


124

transição de fase gel para líquido-cristalino (Lβ’ L) é freqüentemente

chamada de transição principal (Huang & Li, 1999).

A temperatura de transição de fase de uma bicamada composta

apenas por lipídios insaturados é baixa, podendo chegar a valores abaixo

de zero, dificultando as análises por DSC. Apesar disso, sistemas binários

compostos por lipídios saturados e insaturados podem ser utilizados

porque a tendência é haver uma temperatura de transição principal

intermediária.

O comportamento de fase termotrópico de membranas modelo foi

estudado por DSC, uma técnica muito sensível para avaliar efeitos

causados por pequenos componentes que particionam dentro da matriz

lipídica (McElhaney, 1982). Desta maneira, para avaliar a interação dos

peptídeos e uma possível perturbação da membrana, foram realizados

termogramas através de DSC utilizando vesículas multilamelares

compostas por DPPC e DPPC:PG (1:1) (Figura 26).

A temperatura de transição principal de membranas formadas

unicamente por DPPC é em torno de 41°C. Isto significa que abaixo desta

temperatura a membrana encontra-se em fase gel, o que poderia impedir

a interação dos peptídeos. Entretanto, o peptídeo FLAG foi capaz de se

ligar à membrana, afetando o comportamento de fase das vesículas por


125

diminuir a Tpre, indicando que a interação é capaz de influenciar a fluidez

da membrana analisada (Figura 26A). Além disso, podemos observar que

o pico da transição principal é maior, mostrando um aumento da variação

de entalpia para a mudança de transição de fase principal.


126

Figura 26 – Termograma de Vesículas Multilamelares na Presença e na Ausência dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.

Termograma realizado através de Calorimetria Diferencial de Varredura utilizando vesículas multilamelares compostas por DPPC (A) e DPPC:PG (B) na presença do peptídeo FLAG (vermelho) e FLAH (azul). A razão molar lipídio:peptídeo utilizada foi de 100:1.

Temperatura (°C)

20 25 30 35 40 45 50

Cp

(kca

l/mol

/°C)

0

2

4

6

8

10

12

14

16DPPC puro DPPC FLAGDPPC FLAH

Temperatura (°C)

0 10 20 30 40 50

Cp

(kca

l/mol

/°C)

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5DPPC:PG puro DPPC:PG FLAGDPPC:PG FLAH

A

B


127

Uma vez que nossos dados espectroscópicos indicam que os

peptídeos apresentam uma preferência por grupos carregados

negativamente, experimentos de DSC utilizando vesículas aniônicas

compostas por DPPC:PG (1:1) foram realizados. O termograma destas

vesículas se mostrou bastante alargado, comum para membranas

compostas, apresentando duas transições. Isto é bem característico da

presença de duas fases de membrana, onde ocorre segregação dos lipídios

(Figura 26B). Sob adição dos peptídeos, o comportamento de fase das

vesículas formadas por DPPC:PG foi significativamente afetado. A fase de

transição principal em torno de 26°C é desviada significativamente para

temperaturas menores no peptídeo FLAH, além de diminuir a variação de

entalpia da transição. Já o peptídeo FLAG apresentou pouca variação em

relação ao controle, entretanto, diminuiu a segregação dos peptídeos,

homogeneizando mais a membrana, já que as duas transições

desapareceram do termograma.

Estes dados confirmam a existência de uma interação preferencial

por membranas carregadas negativamente, uma vez que ambos os

peptídeos são capazes de perturbar com mais intensidade o

comportamento de fase de membranas que contenham lipídios

negativamente carregados, como o PG.


128

4.6. Análise Computacional da Interação Peptídeo-Membrana através de Simulação por Dinâmica Molecular

Recentemente, o avanço das técnicas de modelagem molecular

computacional tem fornecido uma ferramenta alternativa para simular as

estruturas estáticas e dinâmicas de fosfolipídios na presença de água. A

natureza dinâmica de bicamadas lipídicas no estado líquido-cristalino

pode ser simulada pelos métodos de dinâmica molecular (Tieleman &

Berendsen, 1996). Consequentemente, torna-se possível estudar

simultaneamente a estrutura e o comportamento de fase dos

fosfolipídios.

Para se compreender as características da interação peptídeo-

membrana, simulações por dinâmica molecular dos peptídeos FLAG e FLAH

foram realizadas utilizando as coordenadas do fragmento de interesse da

proteína E do WNV (Nybakken et al., 2006; pdb: 2HG0), para análise de uma

estrutura de menor energia. O modelo utilizado para este estudo foi uma

bicamada lipídica zwiteriônica composta unicamente por Palmitoil-Oleoil-

Fosfatidiletanolamina (POPE) e formada por 340 unidades lipídicas.

As simulações foram realizadas para ambos os peptídeos em caixas

d’água e na presença de uma bicamada lipídica. Três sistemas diferentes

foram montados para cada peptídeo: (1) peptídeos na caixa d’água a 35°C;


129

(2) peptídeos na caixa d’água a 85°C; e (3) peptídeos a uma determinada

distância da interface da bicamada lipídica de POPE a 35°C.

Para avaliar o comportamento dos peptídeos em solução, a primeira

simulação realizada foi com os peptídeos de fusão dentro de uma caixa

d’água a 35°C. Analisando os resultados, é possível observar que ambos os

peptídeos apresentaram predominantemente uma estrutura curvada, e,

eventualmente, adquiriam estrutura em volta. Além disso, seus resíduos

terminais se mostraram muito instáveis, apresentando estrutura ao acaso

durante todo o tempo de simulação (Figura 27A e B).

Como nossos resultados de dicroísmo circular indicam que esta

estrutura se encontra em uma conformação dobrada, provavelmente

favorecida pela interação entre os aromáticos Trp101 e Phe108, uma

simulação também em água foi realizada a 85°C. A alta temperatura

favorece a quebra de interações, tornando a estrutura mais aberta,

conforme já foi sugerido com a perda do sinal positivo do espectro de CD.

Analisando a estrutura secundária dos peptídeos durante a simulação em

água, podemos notar claramente que eles se mantiveram muito instáveis

ao longo de toda simulação, apresentando muitas oscilações de estruturas

secundárias momentâneas, porém prevalecendo uma conformação

randômica (Figura 27C e D).


130

Figura 27 – Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH durante Simulações em Água.

Estrutura secundária dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) durante simulações em água a 35°C. Estrutura secundária dos peptídeos de fusão FLAG (C) e FLAH (D) durante a simulação em água a 85°C. As análises de simulação foram realizadas utilizando o programa GROMACS.

Tempo (ps)

Tempo (ps)

Tempo (ps)

Tempo (ps)

A

B

C

D


131

As interações não covalentes são essenciais para a manutenção da

estrutura de proteínas, para os processos de reconhecimento e para as

interações proteína/ligante. A ligação de hidrogênio é um tipo essencial de

interação entre átomos não-ligados, possuindo um papel muito

importante na afinidade de uma molécula por uma proteína e na

determinação da estrutura tridimensional de proteínas nativas (Voet et al.,

2002). Uma ligação de hidrogênio pode ser representada por doadores

fracamente ácidos e um átomo aceptor fracamente básico.

Assim, as interações presentes nestes dois sistemas podem ser

melhor visualizadas pela formação/rompimento de ligações de hidrogênio

ao longo da simulação, onde é possível observar que, em média, estas

interações estão em menor quantidade nas simulações realizadas a 85°C,

quando comparadas ao controle a 35°C (Figura 28A e B). Esta quebra das

ligações de H é mais evidente para o peptídeo FLAH. Observando o gráfico

de distância mínima entre os átomos, é possível avaliar a aproximação dos

resíduos aromáticos Trp-Phe e comparar o perfil entre as duas simulações

realizadas em diferentes temperaturas (Figura 28C e D). Podemos notar

que o sistema na temperatura de 35°C foi mais estável, enquanto que a

85°C o perfil da curva oscilou significativamente, indicando que a alta


132

temperatura rompeu diversas ligações de hidrogênio, o que desfavoreceu

a aproximação dos resíduos Trp101 e Phe108.

Figura 28 – Número de Ligações de H e Distância Mínima entre os resíduos de Trp e Phe.

Número de ligações de hidrogênio internas dos peptídeos FLAG (A) e FLAH (B) formadas durante a simulação em água a 35°C (vermelho) e a 85°C (preto). A distância mínima entre os resíduos Trp101 e Phe108 dos peptídeos FLAG (C) e FLAH (D) em cada sistema simulado. As análises de simulação foram realizadas utilizando o programa GROMACS.

A B

C D


133

Buscando compreender as características da interação peptídeo-

membrana, simulações por dinâmica molecular dos peptídeos FLAG e FLAH

foram realizadas utilizando como modelo uma bicamada lipídica formada

por Palmitoil-Oleoil-Fosfatidiletanolamina (POPE) (Figura 29).

Figura 29 – Representação da Simulação da Interação dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH com membrana de POPE.

Representação da interação do peptídeo FLAG (azul) e FLAH (vermelho) a cada 5 ns de simulação. As cabeças polares dos fosfolipídios do folheto externo da membrana estão mostradas em cinza. Em cada peptídeo estão destacadas as cadeias laterais dos resíduos Trp101 e Phe108. As análises das simulações foram realizadas utilizando o programa GROMACS.


134

Através da análise da energia e RMSD, que representa o desvio

quadrático médio, ou seja, o quanto a estrutura variou ao longo do tempo

de simulação, podemos verificar que um tempo de simulação de 1 ns é

suficiente para revelar a interação entre os peptídeos e a bicamada

lipídica, onde eles permanecem ligados durante o tempo restante da

simulação. A energia necessária para a interação peptídeo-membrana

diminui mais conforme o peptídeo avança para dentro da bicamada,

comparada à energia dos peptídeos em água. Isto sugere que um simples

modelo hidrofóbico pode favorecer a interação do peptídeo.

Analisando a arquitetura dos peptídeos durante o tempo de

simulação com membrana, podemos observar que a estrutura curvada

dos peptídeos se mantém bastante estável, indicando que a membrana,

de fato, é um ambiente favorável que estabiliza os peptídeos de fusão

(Figura 30).


135

Figura 30 – Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH durante Simulações em Membrana.

Estrutura secundária dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) durante simulações em bicamada lipídica composta unicamente por POPE a 35°C. As análises de simulação foram realizadas utilizando o programa GROMACS.

B

Tempo (ps)

A

Tempo (ps)


136

A única diferença entre os peptídeos estudados é a presença de um

resíduo de Gly ou de His na posição 104 da sequência. Por este motivo, é

interessante analisar a diferença destes resíduos em relação à membrana

alvo. Através de um gráfico da distância mínima de cada resíduo em

relação à cabeça polar dos lipídios POPE que compõem a membrana, mais

precisamente do fósforo presente na sua estrutura, é possível comparar

os peptídeos FLAG e FLAH e perceber que a Gly, por ser um resíduo

pequeno, provavelmente interage melhor sobre a cabeça polar dos

lipídios que formam a membrana. Ao contrário, a His, que possui uma

cadeia lateral grande, fica bastante afastada da membrana. Isto sugere

que o peptídeo FLAG é capaz de se acomodar melhor na interface

membrana-água (Figura 31).


137

Figura 31 – Distância Mínima dos Resíduos Gly104 e His104 em Relação à Membrana.

Distância mínima dos resíduos Gly104 (preto) e His104 (vermelho) de cada peptídeo em relação ao fósforo da cabeça polar do lipídio (POPE). As análises de simulação foram realizadas utilizando o programa GROMACS.


138

Avaliando a formação das ligações de hidrogênio durante o tempo

de simulação, podemos notar que ambos os peptídeos formam

predominantemente ligações de H com a água. Isto sugere que, mesmo

após 28 ns de simulação, os peptídeos permanecem na superfície da

membrana (dados não mostrados). As ligações de H entre o peptídeo

FLAG e a água diminuem sutilmente logo nos primeiros 2 ns de simulação

e, consequentemente, ele aumenta sua interação com a membrana

(Figura 32). Após 2 ns, parte das ligações de H que estavam sendo

formadas dentro da cadeia do peptídeo é perdida e ocorre um leve

aumento das ligações de H entre o peptídeo e a membrana. O peptídeo

FLAH também apresenta majoritariamente ligações de H com a água, e,

portanto, também tem uma tendência a ficar na interface da membrana.

Entretanto, quando chega à membrana, sua estabilidade é alcançada mais

rapidamente quando comparado ao peptídeo FLAG.


139

Figura 32 – Número de Ligações de H entre os Componentes do Sistema.

Número de ligações de hidrogênio dos peptídeos FLAG (A) e FLAH (B) entre o peptídeo e a água (preto), entre o peptídeo e a membrana (vermelho) e internas na sequência (verde) durante a simulação em membrana de POPE.

B

A


140

Além disso, como podemos visualizar para o peptídeo FLAG através

da distribuição mínima de alguns resíduos em relação à membrana (Figura

33), os aminoácidos que mais se aproximaram da membrana e se

mantiveram próximos foram exatamente o Trp e a Phe, ao contrário da

Arg99, presente no N-terminal da sequência, que se encontra bem mais

afastada da membrana. No peptídeo FLAG, os dois resíduos aromáticos

alcançam rapidamente a interface da membrana e se acomodam bem,

permanecendo muito estáveis durante o restante da simulação. Porém, a

interação Trp-Phe não ocorreu durante o tempo de simulação. No

peptídeo FLAH, ambos os resíduos chegam rapidamente à membrana e

permaneceram estáveis. Entretanto, apenas o Trp parece interagir de

alguma forma com a membrana, uma vez que ele fica mais perto da

cabeça polar. Além disso, os resíduos Trp e Phe estão muito próximos um

do outro, sugerindo uma possível interação.


141

Figura 33 – Distância Mínima dos Resíduos Arg99, Trp101 e Phe108 entre si e em Relação à Membrana.

Distância mínima dos resíduos Arg99 (azul), Trp101 (preto) e Phe108 (vermelho) em relação à membrana, e dos resíduos Trp101 e Phe108 entre si (verde) durante a simulação em membrana de POPE a 35°C. O peptídeo FLAG está mostrado em A e FLAH em B. As análises de simulação foram realizadas utilizando o programa GROMACS.

A

B

Resultados – Parte II

142

Parte II - Apresentação do artigo intitulado:

Pressure-Inactivated Yellow Fever Virus: Implications for Vaccine

Development

Luciane P. Gaspara,*, Ygara S. Mendesb, Anna M. Y. Yamamuraa, Luiz F. C. Almeidaa, Elena Caridea, Rafael B. Gonçalvesb#, Jerson L. Silvab, Andréa C.

Oliveirab, Ricardo Gallera, Marcos S. Freirea

aPrograma de Vacinas Virais, Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, RJ 21045-900, Brazil

bPrograma de Biologia Estrutural, Instituto de Bioquímica Médica and Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas Jiri Jonas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 21941-590, Brazil

Publicado no periódico Journal of Virological Methods 150, 57-62 (2008)


143

A vacina contra a Febre Amarela é utilizada há mais de 60 anos e

efeitos colaterais graves (incluindo óbitos) são extremamente raros.

Apesar de sua grande eficácia, cerca de 5% das pessoas pode desenvolver

sintomas da doença. Nos últimos anos, sérios eventos adversos vêm

sendo relatados, o que tem influenciado a reputação da vacina. Portanto,

por sugestão do Ministério da Saúde, estratégias alternativas devem ser

tomadas, o que inclui o desenvolvimento de uma vacina produzida a partir

de vírus inativados.

A alta pressão hidrostática (APH) tem sido apontada como uma

ferramenta alternativa para inativação viral e o desenvolvimento de uma

possível vacina (Masson et al., 2001; Silva et al., 2002; Ishimaru et al., 2004; Murchie et al.,

2005). Assim, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar a inativação por

APH e a imunogenicidade do vírus YF 17DD em modelo murino. Este vírus

foi inativado por uma pressão de 310 MPa por 3 h a 4°C, que abole a

infecciosidade do vírus e elimina sua capacidade de causar a doença.

Nossos dados indicam que os vírus inativados por APH suscitam uma

proteção completa contra uma inoculação letal de vírus YF 17DD em

modelo murino. Nossos resultados discutem as possíveis implicações para

o desenvolvimento de uma vacina inativada por alta pressão contra o

Vírus da Febre Amarela.


Gaspar et al., 2008. Journal of Virological Methods 150, 57-62.

144



145



146



147



148



149

Discussão – Parte I

150

5. Discussão

Parte I

Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com

Membranas Biomiméticas

Apesar do relativo sucesso inicial no desenvolvimento de uma

vacina de vírus atenuado contra a Febre Amarela há mais de 50 anos, além

de amplos estudos epidemiológicos, os Flavivírus permaneceram até

muito recentemente entre os mais pobremente caracterizados dos vírus

de ARN que infectam humanos. Eles são os menores dos vírus

envelopados (40-60 nm), mas compreendem um dos maiores grupos

(cerca de 70 espécies), incluindo muitas espécies patogênicas para

humanos e animais domésticos e selvagens (Lindenbach & Rice, 2001).

Os peptídeos de fusão virais têm um papel chave no mecanismo de

glicoproteínas em mediar a fusão de membranas e proceder com o ciclo

de infecção viral. De acordo com o atual modelo de fusão viral, os

peptídeos de fusão sustentam uma capacidade intrínseca de romper a

arquitetura da bicamada lipídica alvo após sua inserção, e diretamente

mediar a fusão de membranas (White, 1990; Tamm & Han, 2000; Nieva & Agirre,

2003). Estes peptídeos se inserem nas bicamadas lipídicas de células alvo,


151

onde adotam uma determinada conformação distinta da conformação

nativa.

Os peptídeos de fusão de vírus são considerados a peça chave para

iniciar o processo de fusão de membranas permitindo, assim, que o vírus

continue seu ciclo infeccioso. Os Flavivírus possuem uma sequência

extremamente conservada, representada pelo peptídeo de fusão, que

apresenta majoritariamente uma variação na posição 104 de sua

sequência. Estudos de sequência de diversos Flavivírus indicam que esta

modificação está relacionada ao vetor transmissor de cada vírus, podendo

ser uma Gly nos vírus transmitidos por mosquito ou uma His nos vírus

transmitidos por carrapato (Seligman, 2008).

Os estudos apresentados aqui fornecem uma análise estrutural e

termodinâmica da ligação de dois peptídeos de fusão de Flavivírus a

diferentes modelos biomiméticos de membrana. Uma vez que os

Flavivírus infectam e se replicam muito eficientemente no fígado, onde a

membrana plasmática contém muitos lipídios carregados negativamente

(Jain, 1988), nós inicialmente empregamos como alvo micelas aniônicas e

utilizamos para comparação micelas neutras.

O Triptofano é um resíduo muito sensível às variações de polaridade

do meio em que se encontra. Ele é muito utilizado como uma sonda


152

intrínseca de proteínas, o que facilita investigar diversos processos de

desenovelamento protéico, interação proteína-proteína e proteína-ácido

nucléico. Quando excitado em solução, este resíduo emite luz em

comprimentos de onda de maiores. Entretanto, sua inserção em um meio

apolar desvia seu espectro de emissão para comprimentos de onda

menores e mais energéticos, podendo também haver um aumento em seu

rendimento quântico representado pelo aumento na intensidade de

fluorescência. De uma forma geral, a interação de peptídeos com

membranas e micelas, que reproduzem muito bem um ambiente

hidrofóbico, induz um aumento na intensidade de fluorescência do

peptídeo e um desvio para o azul do pico máximo de emissão.

A acessibilidade do Trp ao solvente também pode ser inferida

utilizando agentes supressores, como a acrilamida. Em solução, à medida

que a concentração do supressor aumenta, mais a fluorescência do Trp é

suprimida. Entretanto, se este resíduo está escondido do ambiente polar,

como é o caso de proteínas bem enoveladas, interação com outra

molécula ou inserção em membrana, a fluorescência do Trp é menos

suprimida. Esta supressão pode ser visualizada com a diminuição da

constante de Stern-Volmer (KSV), que reflete a acessibilidade do resíduo


153

ao solvente. A presença de um ambiente apolar refletido pelas micelas

promove uma diminuição da constante KSV.

Portanto, o aumento na intensidade de fluorescência e o desvio

para o azul do pico máximo de emissão, além da diminuição significativa

da constante KSV, indicam que os peptídeos FLAG e FLAH são capazes de

interagir com ambas as micelas de SDS e n-octil-β-D-glicopiranosídeo de

maneiras diferenciadas, onde o resíduo de Trp nem sempre parece estar

envolvido nesta interação. Além disso, nossos resultados indicam que os

peptídeos têm uma preferência por membranas carregadas

negativamente, e embora sejam capazes de interagir com bicamadas

neutras, esta interação poderia ocorrer sem que o processo de fusão de

membranas procedesse com sucesso.

Além disso, nossos dados sugerem que a interação ocorre de

maneira superficial à membrana. De fato, Modis et al. (2004) mostraram

que, no trímero, os três resíduos hidrofóbicos no loop de fusão – Trp101,

Leu107 e Phe108 – estão completamente expostos na superfície

molecular. Eles formam uma concavidade na ponta do trímero,

apresentando uma borda hidrofóbica formada por resíduos carregados.

Neste mesmo trabalho, foi proposto que os trímeros de E penetram cerca

de 6 Å dentro da camada de hidrocarboneto da membrana alvo, e que o


154

loop de fusão é mantido na interface da membrana principalmente por

uma âncora aromática formada pelos resíduos Trp101 e Phe108 (Modis et

al., 2004).

Nossos dados de simulação também nos permitem concluir que, até

28 ns de análise, os peptídeos permaneceram na interface da membrana,

uma vez que grande parte de suas ligações de H eram realizadas com a

água. Isto indica que um simples sistema hidrofóbico favorece a interação

dos peptídeos de fusão.

Esta interação mais superficial é extremamente interessante

quando comparado a outros peptídeos de fusão virais pertencentes à

classe I, como os peptídeos de fusão do SIV (Brasseur et al., 1990; Martin et al.,

1994), HIV-1 (Martin et al., 1996; Lins et al., 2001), Influenza (Luneberg et al., 1995;

Efremov et al., 1999) e Ebola (Lins et al., 2001), que assumem uma

conformação em hélice e apresentam uma inserção oblíqua à bicamada

lipídica. Isto também vai de encontro a estudos de simulação por

modelagem molecular que propõem que a fusogenicidade depende não

somente da inserção do peptídeo, mas também da capacidade destes

peptídeos desestabilizarem os dois folhetos da membrana (Lorin et al.,

2007).


155

A proposta é que para o processo de fusão acontecer, a inserção do

loop de fusão deve produzir uma distorção na bicamada lipídica, que é

favorecida por um cluster de loops formado pela trimerização de E. Assim,

as cadeias de ácidos graxos do folheto interno da membrana devem se

estender para fazer contato com a base da cavidade do loop de fusão, ou

as cadeias dos ácidos graxos do folheto externo devem se inclinar sobre

esta base (Modis et al., 2004).

De fato, os peptídeos de fusão interagem com modelos de

membrana lipídica artificiais de diferentes composições, onde sua

interação é capaz de perturbar a bicamada lipídica, diminuindo a

temperatura de transição de fases, tornando-a mais fluida. Para a

interação do peptídeo FLAH com vesículas contendo PG, uma diminuição

da variação de entalpia da transição é observada. Isto sugere que o

peptídeo é capaz de desestabilizar a bicamada lipídica, já que um menor

H indica um menor número de ligações que estabilizam a membrana. É

possível que estas perturbações ajudem a promover a distorção na

bicamada, importante para desencadear o processo de fusão entre

membranas.

Para melhor compreender como as membranas podem ser

convertidas a intermediários de alta energia durante a fusão, é


156

interessante conhecer como tanta energia, entalpia e entropia, é

fornecida pela inserção de peptídeos de fusão em bicamadas lipídicas (Li et

al., 2003). Os experimentos realizados na ausência de sal são sistemas

predominantemente exotérmicos, à exceção da temperatura de 37°C.

Entretanto, a força iônica é capaz de reverter a termodinâmica desta

interação, tornando a reação endotérmica e a interação entropicamente

dirigida.

Estes perfis entálpicos estão relacionados a três etapas principais

durante a interação peptídeo-micela: 1) interação dos peptídeos com as

micelas; 2) mudanças estruturais no peptídeo; e 3) alterações na dinâmica

de equilíbrio das micelas. Entretanto, o calor da interação é predominante

do processo de desestabilização das micelas promovido pela ligação dos

peptídeos, uma vez que estes perfis são muito similares ao calor de

desmicelização de ambas as micelas nas diferentes temperaturas

analisadas (dados não mostrados). A variação de entalpia associada à

dissociação das micelas de SDS também foi dependente da temperatura

analisada, a 37°C o processo foi endotérmico, enquanto que a baixas

temperaturas o processo foi exotérmico. Esta característica poderia

explicar os valores de variação de entalpia extremamente elevados e está


157

de acordo com alguns estudos de desmicelização já mostrados para outras

micelas (Beyer et al., 2006; Bordbar et al., 2008).

Em solução, ambos os peptídeos mostram uma estrutura

predominantemente randômica. Além disso, o pico positivo a 225 nm nos

espectros de CD sugere fortemente a formação de uma conformação

curvada, que é provavelmente devido à interação de dois aminoácidos

aromáticos presentes em sua sequência, o Trp e a Phe. Nossos dados de

CD utilizando alta temperatura confirmam a presença de interações não-

covalentes na estrutura do peptídeo, uma vez que a altas temperaturas o

pico positivo nesta região desaparece de forma reversível. Esta

aproximação entre os resíduos aromáticos também pode ser observada

em nossas simulações em água, onde o aumento da temperatura

promove o rompimento de interações, como as ligações de H,

distanciando os resíduos Trp e Phe, o que torna a estrutura com uma

conformação mais aberta e instável.

A presença de um ambiente apolar que favoreça a interação,

representado por micelas de SDS, leva à formação adicional de uma

estrutura β, onde os peptídeos assumiriam possivelmente uma

conformação de β-hairpin, o que oferece uma maior estabilidade ao

peptídeo quando ligado. Contudo, através de análises de CD, não foi


158

possível observar modificações na estrutura dos peptídeos na presença de

micelas neutras de n-octil-β-D-glicopiranosídeo. A presença de TFE não foi

capaz de induzir a formação de hélices como mostrado para muitos

peptídeos de fusão de vírus, como o HIV-1 e o vírus da Hepatite G (Gordon

et al., 2002; Mazzini et al., 2007). Isto confirma nossa idéia sobre o modo de

interação dos peptídeos, que pode ocorrer de maneira diferenciada

dependendo das propriedades físicas da membrana alvo.

Analisando os dados de dinâmica molecular dos peptídeos

simulados na presença de bicamada lipídica composta por POPE, não

podemos afirmar que exista uma conformação em β-hairpin, mas

podemos verificar que os peptídeos apresentam predominantemente uma

estrutura curvada bastante estável, com eventuais formações de voltas.

Além disso, podemos notar que os resíduos aromáticos estão

intimamente ligados à membrana. Entretanto foi possível observar que a

interação entre os resíduos Trp-Phe foi significativamente mais evidente

para o peptídeo FLAH. A influência da interação aromático-aromático

também foi estudada para o peptídeo de fusão do vírus Ebola, onde a

interação entre o anel aromático do Trp e a cadeia lateral da Phe parece

ser importante para a manutenção da estabilidade da estrutura


159

secundária do peptídeo sob interação com membranas miméticas (Freitas

et al., 2007).

A Glicina também é um importante resíduo presente em peptídeos

de fusão de muitos vírus envelopados, como os vírus Influenza, SIV e HIV-2

(Tamm et al., 2002), embora seu exato papel ainda não tenha sido

determinado. A alta porcentagem deste resíduo tem sido correlacionada

com a flexibilidade conformacional dos peptídeos de fusão, que é

necessária para a atividade de fusão (Wong, 2003). De fato, mutações nos

resíduos de Gly nas posições 104 e 106 do vírus da Encefalite de St. Louis

abolem o processo de fusão (Trainor et al., 2007). Nossos resultados indicam

que a Gly104 é capaz de se acomodar melhor sobre a cabeça polar da

bicamada lipídica, ao contrário da His104. Isto é consistente com sua

característica, já que os resíduos de Gly não particionam favoravelmente

dentro de uma membrana (White & Wimley, 1999).

Embora exista uma diferença na sequência de aminoácidos destes

peptídeos de fusão de Flavivírus, eles apresentam comportamentos

similares quando analisados pelos diferentes métodos aplicados neste

estudo, mostrando uma preferência por grupos carregados

negativamente, apesar de serem capazes de se ligar a alvos hidrofóbicos

neutros. É proposto que os resíduos de His atuem como um sensor de pH


160

na fusão de membranas para diversos vírus. Entretanto, a presença da

His104 no peptídeo FLAH parece representar pouca importância para a

interação, principalmente porque, na partícula madura, ambos os

peptídeos são capazes de prosseguir com o processo de fusão de seus

respectivos vírus. De fato, um recente estudo, utilizando análises

mutacionais em Histidinas conservadas da proteína E de Flavivírus,

destaca apenas a His323 e provavelmente a His146 por atuarem como um

sensor de pH na fusão de membrana de Flavivírus (Fritz et al., 2008).

Ao contrário, os resíduos de Arg e/ou Lys presentes em ambos os

peptídeos, poderiam apresentar mérito substancial para a interação. Os

resíduos Trp e Arg parecem apresentar papéis muito importantes na

atividade de diversos peptídeos antimicrobianos (Jing et al., 2003).

Peptídeos ricos em Arg, como a penetratina (Derossi et al., 1996), têm sido

interesse de diversos estudos pelas suas capacidades de penetrarem em

membranas celulares. A capacidade destes peptídeos de se translocarem

através de membranas parece ser o resultado do grupamento de

guanidina da cadeia lateral da Arg, que foi mostrada ser mais eficiente que

outros aminoácidos carregados positivamente (Mitchell et al., 2000). Esta

interpretação foi também sugerida para dois peptídeos antimicrobianos,


161

que podem se ligar e parcialmente penetrar na superfície de membranas

(Rezansoff et al., 2005).

Além disso, cadeias laterais aromáticas, particularmente o anel

indol do Trp, preferem fortemente particionar na região de interface de

membranas. Sendo assim, as propriedades de ancoramento na membrana

das cadeias laterais do Trp nestes peptídeos podem contribuir para suas

capacidades de ligar e desestabilizar membranas miméticas e adotar uma

estrutura bem definida (Rezansoff et al., 2005). De fato, já foi sugerido que o

Trp101 é importante para a capacidade infecciosa dos Flavivírus (Modis et

al., 2004).

Assim, enquanto a função do resíduo de Trp é promover a inserção

do peptídeo na interface da membrana, o resíduo básico de Arg poderia

estabilizar esta ligação, atuando como uma âncora hidrofílica para as

interações eletrostáticas. Desta forma, ambas as interações eletrostáticas

da Arg pelas micelas e a presença do anel indol do Trp na superfície da

membrana alvo devem governar o processo de associação peptídeo-

membrana.

Discussão – Parte II

162

Parte II

Febre Amarela: Implicações para o Desenvolvimento de uma


Embora vacinas humanas estejam disponíveis para as doenças Febre

Amarela, Encefalite Japonesa e Encefalite causada por Carrapato, por

exemplo, a incidência e a distribuição geográfica das doenças causadas

por Flavivírus têm aumentado nos últimos anos (Chang et al., 2004).

A Febre Amarela é uma doença infecciosa causada por um

flavivírus, que não tem tratamento específico e que apresenta

aproximadamente 20% de mortalidade (Vasconcelos, 2003). A doença está

re-emergindo devido à re-infestação do mosquito e à falta de cobertura

vacinal adequada (Gubler et al., 2004). Entre o fim de 2007 e início de 2008,

o Brasil passou por um abrupto aumento no número de mortes de

macacos em matas próximas de cidades, e por um aumento no registro da

contaminação por Febre Amarela silvestre de pessoas não vacinadas que

residem próximo a esses locais ou que adentraram áreas de mata

selvagem. A grande preocupação é com o possível aumento do vírus

circulante da doença nas florestas ou cerrado, havendo, então, a

necessidade de intensificação da vacinação das pessoas que irão entrar

em contato com áreas de matas, florestas ou cerrado nas áreas de risco,


163

uma vez que a vacinação ainda é o método mais eficaz para prevenir a

doença (Ministério da Saúde, 2008).

Hoje, a vacinação mundial é realizada com dois tipos diferentes de

vacinas existentes, 17D e 17DD, baseadas em vírus “vivo” atenuado e que

têm fornecido bastante eficácia. Apesar disso, a presença do vírus ainda

infeccioso na vacina representa um risco de reversão da doença,

principalmente para pessoas imuno-comprometidas. Por mais de 50 anos

a vacina atenuada contra a Febre Amarela era tida como segura e

eficiente, e as reações adversas leves ocorriam em apenas 2 a 5% das

pessoas vacinadas. Entretanto, a ocorrência de eventos adversos

associados aos vírus vacinais 17D e 17DD justifica o desenvolvimento de

uma vacina alternativa elaborada a partir de vírus inativados,

principalmente, para as pessoas imuno-comprometidas e turistas com

destino a áreas endêmicas.

Entretanto, ao contrário das vacinas inativadas, as vacinas feitas a

partir de vírus atenuados oferecem excelente proteção, uma vez que estes

vírus são capazes de se replicar dentro do organismo. Por este motivo,

uma possibilidade é o uso de uma vacina inativada como uma dose

primária de vacinação conjugada a uma segunda dose da vacina atenuada

comercial. Isto deve evitar riscos de eventos adversos causados pela


164

replicação do Vírus da Febre Amarela e, por outro lado, garante uma

proteção imunogênica mais eficaz e mais longa, característica mais difícil

de obter apenas com uma vacina inativada.

Os métodos mais comuns de inativação viral em células, meio de

cultura ou tampões específicos incluem o uso de β-propil-lactona,

etilenimina binária, formol, irradiação, iodino, ozônio, ultravioleta (UV) e

compostos fotoativos. Tentativas para desenvolver uma vacina inativada

contra YF são realizadas desde 1928, preparadas pelo tratamento de

fígado e/ou rim de macaco infectado com fenol ou formaldeído (Hindle,

1928). Em 1936, um estudo de vacina inativada contra YF usando

aquecimento ou UV foi realizado em macacos (Gordon & Hughes, 1936).

Entretanto, os problemas descritos para estas vacinas foram a presença de

infecciosidade residual sobre as preparações ou a ausência de proteção

imunogênica.

A alta pressão tem emergido como uma importante técnica para

tentar resolver vários problemas na Medicina e na Biotecnologia, e tem

revelado ser uma poderosa ferramenta para o estudo das interações

proteína-proteína e proteína-ácido nucléico (Da Poian et al., 1993; 1995; Silva

et al., 1996), estando voltada mais recentemente para o estudo de

estruturas virais, vias de montagem, estados intermediários do ciclo de


165

infecção e inativação de vírus envelopados e não envelopados (Da Poian et

al., 1995; Oliveira et al., 1999b; Gaspar et al., 2002; Silva et al., 2002; Schwarcz et al.,

2004; Ishimaru et al., 2004).

Trabalhos recentes vêm mostrando que a alta pressão, além de

levar à inativação, induz um estado intermediário de fusão de vírus

envelopados como Influenza, Sindbis e VSV. O que se propõe é que a

pressão hidrostática induz uma alteração conformacional nas

glicoproteínas destes vírus, a pH neutro, muito similar à alteração

alcançada pelo baixo pH, ou seja, o efeito da pressão pode mimetizar a

etapa que ocorre dentro do endossoma (Gaspar et al., 2002; Gomes et al.,

2003). Assim, o uso da pressão para atingir o estado ativo de fusão pode

ser utilizado no desenvolvimento de novas drogas e vacinas antivirais.

Uma vez que a pressão causa uma perturbação sutil quando

comparada a agentes desnaturantes químicos e alta temperatura (Silva &

Weber, 1993; Silva et al., 2001), geralmente ela não produz alterações tão

drásticas na estrutura da partícula viral. Ela apenas desvia o equilíbrio

entre as formas desnaturada e/ou dissociada e a forma nativa, na direção

daquela que ocupa o menor volume, ou seja, as formas dissociadas (Weber

& Drickamer, 1983; Silva & Weber, 1993; Mozhaev et al., 1996; Jonas & Jonas, 1994;

Silva et al., 2002).


166

Desta forma, em colaboração com os Drs. Marcos Freire e Luciane

Gaspar e o Laboratório de Tecnologia Virológica (LATEV) de Bio

Manguinhos, envolvido no desenvolvimento de vacinas, realizamos

estudos de imunogenicidade visando ao desenvolvimento de uma vacina

inativada contra o Vírus da Febre Amarela. Sendo assim, o principal

objetivo deste estudo foi avaliar a imunogenicidade do YFV 17DD

inativado por alta pressão, além de investigar a eficácia da proteção em

modelo murino.

Os resultados apresentados neste trabalho discutem o uso da APH,

um método relativamente novo para a inativação de vírus. A cinética do

YFV foi dependente do tempo e da pressão, similar a outros vírus animais

já estudados (Jurkiewicz et al., 1995; Tian et al., 2000; Ishimaru et al., 2004; Freitas

et al., 2006). Além disso, a inativação por APH foi rápida e irreversível

quando comparado a outros vírus envelopados previamente estudados

(Silva et al., 1992; Gaspar et al., 2002). Além disso, o processo produziu

preparações satisfatórias, como mostradas pelos ensaios de

infecciosidade, inoculação de amostras inativadas utilizando linhagens

celulares permissivas (ensaio cego), teste para avaliar infecciosidade viral

residual em camundongos, e ensaio de neutralização em células Vero.


167

De fato, após submeter o YFV 17DD às condições de inativação (310

MPa por 3 h a 4°C) não foi possível detectar nenhuma partícula infecciosa,

muito importante para confirmar a ausência de infecciosidade residual. A

maioria dos estudos anteriores não foram controlados desta maneira

(Hindle, 1928; Gordon & Hughes, 1936). Este controle é de extrema importância

porque garante a eliminação de eventos adversos severos causados pela

presença de vírus infecciosos na vacina atenuada contra YF comercial.

Modelos animais têm sido extensivamente utilizados em testes pré-

clínicos de vacinas para obtenção do “proof of concept” (prova de

conceito). Nossos resultados mostram que os camundongos suíços

imunizados com três doses subcutaneamente com o vírus inativado por

pressão foram tão efetivos quanto o vírus vacinal atenuado em relação à

proteção contra uma dose letal do YFV. Porém, como a produção de

anticorpos neutralizantes foi baixa, possivelmente a imunização com o YF

17DD inativado não produz uma resposta humoral protetora. A duração

desta resposta do anticorpo está sendo examinada. Estudos de pressão

realizados para outros vírus já foram previamente demonstrados e

sustentam nossos dados (Silva et al., 1992; Jurkiewicz et al., 1995; Tian et al.,

1999; 2000; Gomes et al., 2003; Freire et al., 2005, Grove et al., 2006).


168

Juntos, nossos resultados mostram que APH é capaz de inativar as

partículas virais de YF, além de produzir partículas imunogênicas. O

tratamento por pressão parece preservar importantes epítopos sobre a

superfície do vírus, permitindo às partículas inativadas estimularem uma

produção de anticorpos neutralizantes protetores contra a YF em

camundongos. Nossa proposta para a perda da infecciosidade destas

partículas é que a estrutura viral é preservada, entretanto a pressão deve

afetar o rearranjo dimérico da proteína E, como previamente

demonstrado para outros vírus que induzem o estado ativo de fusão

(Gaspar et al., 2002; Gomes et al., 2003; Freitas et al., 2006; Grove et al., 2006).

De fato, nossos resultados de caracterização estrutural das

partículas inativadas por APH, que foram previamente apresentados em

minha dissertação de mestrado (Mendes, 2005), indicam que a estrutura

parece ser pouco afetada, característica muito importante para a

manutenção do interesse em desenvolver a vacina. Não há dúvidas de que

as partículas são inativadas pela alta pressão nas condições estudadas, e a

manutenção de sua integridade pode ajudar a favorecer uma resposta

imune eficaz quando um indivíduo for infectado pela forma virulenta.

Além disso, já que a pressão pode ser capaz de mimetizar alguma etapa do

ciclo de infecção natural do vírus, ela pode “congelar” o vírus numa


169

conformação, sutilmente diferente da nativa, que expõe mais resíduos

hidrofóbicos, o que torna estas partículas mais imunogênicas. Essa

hipótese é corroborada pelos ensaios que realizamos utilizando bis-ANS,

uma sonda capaz de se ligar a segmentos hidrofóbicos estruturados

próximos a cargas positivas, e que se encontra mais ligado à partícula

pressurizada (Mendes, 2005).

Problemas metodológicos durante o desenvolvimento de vacinas

inativadas são principalmente relacionados à produção de antígenos, à

inativação viral e à falta de potência antigênica. Devido à dificuldade em

obter altos títulos virais em uma linhagem celular apropriada, as vacinas

inativadas não são valorizadas (Putnak et al., 2005). Contudo, esta concepção

pode ser mudada pelas novas ferramentas para cultivar células em meio

livre de soro em micro-transportadores, como mostrado para as vacinas

contra os vírus da Raiva, da Encefalite Japonesa, Enterovírus tipo 71 e

Influenza (Merten et al., 1999; Frazatti-Gallina et al., 2004; Wu et al., 2004; Mohler et

al., 2005; Trabelsi et al., 2006; Liu et al., 2007).

Neste estudo existem dois problemas que necessitam de mais

tentativas: a produção de antígeno (devido à quantidade limitada de vírus

propagado) e a necessidade para múltiplas doses de quantidades maiores

de vírus inativado para produzir uma resposta imune mais eficaz. Grandes


170

esforços para a produção de vacinas inativadas são certamente

necessários. Nas próximas etapas serão utilizados adjuvantes para

fornecer uma resposta imune mais eficaz, avaliadas as respostas de

anticorpos neutralizantes por estudos de dose-resposta em camundongos

e utilizados micro-transportadores para melhorar a produção de vírus.

Como estas doenças constituem uma séria questão de saúde

pública e vêm causando um impacto na economia mundial, grandes

investimentos estão voltados para o desenvolvimento de uma vacina que

extermine com as epidemias de Flavivírus, que atualmente estão

disseminadas em várias partes do mundo, seja através da tecnologia da

engenharia genética, seja pelo método convencional (atenuada ou

inativada).

A vantagem da ferramenta de alta pressão hidrostática está

justamente em seu custo reduzido, inclusive para processamento de

grandes volumes, além de ser um processo limpo por não fazer uso de

agentes químicos, como o formol. Além disso, o aparato de pressão em

larga escala já está sendo amplamente utilizado em indústrias alimentícias

como forma de inativação de enzimas. Assim, este trabalho pode abrir

portas para a inativação de diversos vírus com o objetivo de desenvolver

vacinas que ainda não existem, mas que estão sendo amplamente


171

pesquisadas, como é o caso do Vírus da Dengue, que já vem sendo um dos

focos de nossos estudos.

Conclusões Gerais

172

7. Conclusões Gerais

A infecção por Flavivírus resulta em manifestações clínicas que vão

desde febre moderada até encefalite e febre hemorrágica, apresentando

um impacto global sobre a saúde pública como um resultado de sua ampla

distribuição e sua capacidade de causar significante morbidade e

mortalidade em humanos (Mackenzie et al., 2004). Por esta razão, estudos

voltados para o desenvolvimento de vacinas e tratamentos antivirais

eficazes se tornam necessários.

Devido à ocorrência de alguns casos de reversão da doença após a

vacinação contra a Febre Amarela, grandes investimentos estão sendo

tomados no sentido de desenvolver uma vacina alternativa que não

ofereça risco à saúde. Para isto, a imunogenicidade do YFV inativado por

alta pressão hidrostática foi investigada através de estudos in vivo. Nossos

dados mostram que a inoculação destas partículas oferece uma proteção

completa em modelo murino.

Portanto, nossos resultados indicam fortemente uma metodologia

de sucesso para o desenvolvimento de uma vacina promissora contra o

Vírus da Febre Amarela e, possivelmente, contra outros Flavivírus de

importância médica.

Conclusões Gerais

173

Além disso, neste estudo, a interação de dois peptídeos de fusão

diferentes de Flavivírus com membranas miméticas foi investigada. Este

segmento interage com a membrana da célula hospedeira, levando à

desestabilização da membrana e, consequentemente, ao processo de

fusão (Seligman, 2008). Através de análises biofísicas, foi possível

caracterizar a interação destes peptídeos com micelas e bicamadas

lipídicas aniônicas e neutras.

Como conclusão, a conformação destes peptídeos ligados a

membranas miméticas suporta a contribuição das interações

eletrostáticas e hidrofóbicas com a cabeça lipídica carregada

negativamente e com a cauda de ácidos graxos das membranas,

respectivamente. Assim, a alta hidrofobicidade dos peptídeos

provavelmente favorece sua partição sobre a bicamada lipídica.

Entretanto, a localização exata dos peptídeos sobre a bicamada pode

variar com a carga e a estrutura dos grupamentos polares lipídicos.

Neste sentido, nossos resultados sugerem que a fusão dos Flavivírus

é promovida por uma inserção superficial dos peptídeos de fusão dentro

das bicamadas lipídicas, com seu concomitante enovelamento em uma

estrutura na forma de grampo (β-hairpin).

Conclusões Gerais

174

Um grande exemplo de sucesso de estudos estruturais básicos está

na tentativa de desenvolver novos inibidores de entrada mais eficazes

contra o HIV, por exemplo. Até então, a principal estratégia para combater

a AIDS se baseava em terapias químicas para inibir a transcriptase reversa

ou protease do HIV. Todavia, um peptídeo sintético de 36 aminoácidos, o

Enfuvirtide, que bloqueia a entrada do vírus em células-alvo, foi o primeiro

inibidor de entrada do HIV aprovado para uso em pacientes (Fletcher, 2003;

Mattews et al., 2004). Enfuvirtide mimetiza uma determinada sequência de

aminoácidos da proteína gp41, que é um domínio importante para a fusão

de membranas (Esté & Telenti, 2007), e inibe a mudança conformacional da

glicoproteína, evitando, assim, a fusão entre o envelope do HIV e a

membrana da célula CD4 e, consequentemente, sua entrada na célula

hospedeira (Raffi, 2004).

Dessa forma, para se identificar pequenas moléculas que

especificamente inibam etapas críticas no ciclo de infecção dos vírus como

esta, é necessário conhecer detalhes bioquímicos e caracterizar

estruturalmente as proteínas virais essenciais neste processo, neste caso,

a glicoproteína E, mais precisamente o seu peptídeo de fusão.

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