Universidade Estadual de CampinasDepartamento de Bioqumica - IB Laboratrio de Aula Prtica

Caracterizao de uma enzima mitocondrial: DESIDROGENASE SUCCNICAIntroduo geral: As enzimas so catalizadores biolgicos cujas mais notveis caractersticas so o seu alto poder cataltico e grande especificidade. Quase todas as enzimas conhecidas so protenas, e vrias podem ser inibidas, estimuladas ou modificadas in vivo, propriedade importante para regulao do metabolismo. Enzimas (ou catalisadores) NO MUDAM O EQUILBRIO DE REAO, apenas DIMINUEM A ENERGIA DE ATIVAO DO SISTEMA, acelerando a reao. A mitocndria a organela responsvel pela respirao celular; e este processo ocorre na presena de um conjunto de enzimas, dentre estas encontram-se a DESIDROGENASE SUCCNICA, uma flavoenzima exclusivamente mitocondrial. Ela encontrada na membrana interna das mitocndrias de clulas eucaritas e na membrana plasmtica de procariotos e participa de uma das etapas do ciclo de Krebs, catalisando a converso do succinato a fumarato, de acordo com a reao:

Esta reao importante pois faz parte de um grupo de reaes canalizadoras de energia para a sntese de ATP. Nesta enzima esto presentes uma molcula de FAD e trs diferentes grupos ferro-enxofre, por onde passam os eltrons originrios do succinato, combinando-se a seguir com o oxignio, gerando gua. A desidrogenase succnica inibida competitivamente pelo malonato (HOOC-CH20COOH), um anlogo do succinato (HOOC-CH2-CH2-COOH). Para se caracterizar uma protena, como por exemplo a desidrogenase succnica presente em mitocndrias, devemos separa-las de vrias outras protenas. Para isto deve-se levar em conta alguns fatores, tais como:

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Qual o material de partida; Quanto de material de partida ser necessrio; Qual o nvel de pureza da protena ser requerido; O material de partida dever ser de fcil obteno e conter uma qualidade razovel da protena desejvel; A localizao desta protena na clula (mitocndria, ncleo, ribossoma, citoplasma...). Normalmente a purificao de uma protena se d em vrias etapas. Com a enzima purificada pode-se realizar sua caracterizao cintica atravs de estudos como: efeito do pH, temperatura, concentrao de substrato, inibidores... Tais estudos iro fornecer informaes importantes sobre o mecanismo da reao catalisada pela enzima em questo.

Objetivos: Demonstrar parcialmente a tcnica de isolamento de mitocndrias. Caracterizar a presena da desidrogenase succnica na frao mitocondrial. Demonstrar a inibio enzimtica competitiva.

Material Mitocndria de fgado de rato

PARTE EXPERIMENTALParte 1 Preparo das Mitocndrias Ateno! Ao se trabalhar com protena, deve-se tomar alguns cuidados: - manter a soluo protica em baixas temperaturas, para evitar a perda da atividade; - no se deve agitar vigorosamente a soluo, pois pode provocar desnaturao; - em se tratando de enzima, deve-se ter um mtodo de quantificala; - ensaios enzimticos devem ser feitos sistematicamente com controles adequados (brancos) para evitar erro na avaliao da atividade enzimtica (exemplo: substrato instvel, que degrada mesmo na ausncia de enzima). decapitar o rato e remover rapidamente o fgado. Pesar o fgado e mergulhar em meio de extrao gelado, constitudo por:

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Sacarose 0,32M Tampo fosfato 0,02M pH=7,3 EDTA o,01M lavar bem para remover o sangue. Cortar o fgado em pedaos minsculos com o auxlio de uma tesoura (gelada). Triturar em gral gelado at obter um homogeneizado uniforme. Adiciona-se para cada 1g de tecido 9mL de meio de extrao. Transferir o homogeneizado para tubos de plstico (gelados). Centrifugar a 1000xg a 3C por 10 minutos. Decantar o sobrenadante para outro tubo de centrfuga gelado. Desprezar o precipitado. Deixar o sobrenadante resfriar por 2 a 5 minutos em banho de gelo. Centrifugar por 10 minutos a 8000xg (precipitao das mitocndrias). Desprezar o sobrenadante.

Parte II Dosagem de protenas O sedimento mitocondrial ressuspenso em 2mL de meio de extrao gelado e esta suspenso utilizada como fonte de enzima. A concentrao de protenas da suspenso deve estar na faixa de 40-50mg de protenas/mL, a dosagem ser feita segundo Peterson. Determinao da atividade da desidrogenase

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Parte III succnica

A quantidade de enzima presente em uma dada soluo ou extrato de tecido pode ser dosada quantitativamente em termos do efeito cataltico que produz. A atividade de uma enzima expressa em unidades enzimticas. Por conveno internacional, 1 unidade enzimtica definida como a quantidade de enzima necessria para produzir 1 mol de produto por minuto, em condies timas de medida (pH, temperatura, ...). Para se dosar a atividade de uma dada enzima, deve-se ter alguns conhecimentos sobre esta enzima, tais como: - reao catalisada por esta enzima; - processo analtico para se determinar o desaparecimento do substratos o aparecimento dos produtos da reao; - se a enzima requer coenzimas ou cofatores; Tendo estes conhecimentos, deve-se saber as condies timas para a enzima em questo catalisar a reao. Os principais estudos que devem ser realizados so: efeito do pH, do substrato e inibidores.

Ateno! Para a obteno de bons resultados, observar os seguintes pontos: - Pipetar o volume exato dos reagentes; - O tempo de reao deve ser o mesmo em todos os tubos, portanto, se a enzima for adicionada tubo por tubo, de 10 em 10 segundos, a paralisao da reao tambm dever ser feita nestes mesmos intervalos de tempo; - Preparar duplicatas de todos os tubos; - Ensaios enzimticos devem ser feitos sistematicamente com controles adequados (BRANCOS) para evitar erro na avaliao da atividade enzimtica. A medida da atividade da desidrogenase succnica pode ser feita utilizando-se um aceptor artificial de eltrons como oxidante final, desde que possua um potencial redox capaz de reoxidar as flavoprotenas, desviando toda a seqncia natural de transporte de eltrons dos citocromos. O 2, 3, 5,-trifenil-tetrazlio um aceptor final de eltrons que em soluo aquosa AMARELO-PLIDO e se torna VERMELHO quando reduzido a formazana. A alterao molecular do aceptos artificial de eltrons, devido reduo, a seguinte:

A determinao da atividade da desidrogenase succnica, bem como a sua inibio pelo malonato ser feito segundo tabela abaixo:Tubos Tp. Fosfato 0,02M pH 7,3 Succinato de sdio 0,5M pH 7,3 Tetrazlio 0,5% Malonato de sdio 0,1M pH 7,3 Susp. Mitocondrial

1 1,4 0,1 0,25 -

2 1,4 0,25 0,1 -

3 1,3 0,1 0,25 0,1 -

4 1,3 0,1 0,25 0,1

5 1,1 0,1 0,25 0,2 0,1 -

6 0,2 1,0 0,25 0,2 0,1 -

Susp. De mitocndrias fervida por 10 min em banho-maria Tubos: 1 brancos, 2 controle da mitocndria, 3 sistema completo, 4 controle s/ mitocndria, 5 sistema completo c/ inibidor, 6 sistema completo c/ inibidor, aumentando-se a [sussinato] (inibio competitiva.