Caracterização geral, genética e bioquímica da microalga Neochloris oleoabundans, visando a...
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Caracterização geral, genética e Caracterização geral, genética e bioquímica da microalga bioquímica da microalga Neochloris Neochloris
oleoabundansoleoabundans, visando a produção de , visando a produção de biodieselbiodiesel
Aluna: Raíssa Estrela Curado
Co-orientadora: Laudiene Meyer
• Problemática do carbono - combustíveis fósseis • Biodiesel• Considerações gerais acerca das microalgas
– Por que ainda não são utilizadas?– Como torná-las utilizáveis?– Neochloris oleoabundans
• Genômica de microalgas• Transcriptômica de microalgas• Manipulação genética e das condições de
cultivo
Introdução
• Reajustes constantes no preço do barril de petróleo
• Crise ambiental
Problemática do carbono e combustíveis fósseis
Introdução
O longo prazo requerido para a
formação de combustíveis fósseis
torna todo o processo de uso destes, insustentável
California Energy Commission, 2004
• Emissão vs. Fixação de CO2 neutro curtos prazos para o fechamento do ciclo.
BiodieselBiodieselintrodução
• Mundo Colza, girassol, soja• Brasil lei 11.097/2005 – Soja
– 2008 B2 – 2013 B5
BiodieselBiodieselintrodução
Problemas...Problemas...• Deslocamento das
fronteiras agrícolas• EUA: a total substituição
do petrodiesel por biodiesel consumido em transporte exigiria que 48% de toda a área cultivável dos EUA fosse voltada exclusivamente para o plantio de palma (Chisti, 2007)
• Baixa produtividade • Baixa eficiência
fotossintética
• Grande diversidade• Unicelulares• Altas taxas de crescimento
– EUA: 2-6% área cultivável• Alta eficiência fotossintética• Não competem por solos• Menor requerimento hídrico
Nova vertente: microalgasNova vertente: microalgasintrodução
200 a 300X Mais óleo
Área 100X menor
• Alimentação humana • Atualmente, no Brasil aqüicultura
• Altos custos implantação• Necessidade de melhor desempenho
Por que ainda não são Por que ainda não são utilizadas?utilizadas?
introdução
Como torná-las utilizáveis?Como torná-las utilizáveis?
Biorrefinaria• EUA, Canadá e
Alemanha colza e soja– Aproveitamento
total da biomassa
Manipulação• Condições de cultivo• Interferência em vias
metabólicas
introdução
• Microalga verde – C. reinhardti• Revisão bibliográfica (Griffiths e Harrison 2008; Tornabene et al. 1983; Li
et al. 2008; Band 1992)
– Alta produtividade lipídica (32% a 54%)– Bom perfil lipídico– Pouco estudada
Neochloris oleoabundansNeochloris oleoabundansintrodução
oleaginosa Teor de óleo %
soja 18-20girassol 35-45mamona 45-50palma 45-50
amendoim 45-50
• Nuclear: NCBI 9
• Cloroplasto:– Chlamydomonas reinhardtii,
Chaetosphaeridium globosum, Chlorella vulgaris e Mesostigma viride
Genômica de microalgasGenômica de microalgasintrodução
Espécie Tamanho Status Data Quem
Chlamydomonas reinhardtii 120M Draft
assemblyset/05 Department of Energy's Joint Genome
Institute
Chlorella sp. NC64A40M
in progress Department of Energy's Joint Genome
Institute
Chlorella vulgaris 40M
in progress Department of Energy's Joint Genome
Institute
Coccomyxa sp. C-169
in progress Department of Energy's Joint Genome
Institute
Dunaliella salina
in progress Department of Energy's Joint Genome
Institute
Micromonas pusilla draft
assemblyfev/08 Department of Energy's Joint Genome
InstituteOstreococcus 'lucimarinus'
13M draft assembly
jul/08 Department of Energy's Joint Genome Institute
Ostreococcus sp12M draft
assemblymai/08 Department of Energy's Joint Genome
Institute
Volvox carteri 120M
in progress Department of Energy's Joint Genome
Institute
• 21 trabalhos – diferentes fotoperíodos (Ledford et al. 2004)– situações de privação de nutrientes
• fósforo (Moseley et al. 2006)• enxofre (Nguyen et al. 2008)
Transcriptoma de microalgasTranscriptoma de microalgasintrodução
Manipulação • Cultivo• Nitrogênio, silício• Manipulação de
condições, como o pH, intensidade luminosa, temperatura, agitação
• Genética• 25 espécies passíveis
de transformação genética
• Técnicas de transformação, genes marcadores selecionáveis, promotores e genes repórteres disponíveis
Objetivos• Geral:
– Caracterização geral, genética e bioquímica da espécie estudada, visando identificar condições ambientais, genes e vias metabólicas com papéis importantes na produtividade lipídica
FotobiorreatorFotobiorreator Objetivos
B
Caracterização geralCaracterização geral
Condições de cultivo
- privação de nutrientes (nitrogênio)- em presença e ausência de glicose- em diferentes concentrações de CO2-em diferentes intensidades luminosas- em diferentes temperaturas...
medições de biomassa, produtividade lipídica,eficiência fotossintética e perfil lipídico
Condições ótimas!
Objetivos
Caracterização genéticaCaracterização genética
Extração de DNA
Seqüenciamento
Seleção das condições
ótimas
Extração de RNA
Microarray
Análise dos dados
Análise dos dados
Genes alvos Manipulação?
Objetivos
Caracterização BioquímicaCaracterização Bioquímica
Ativadores/inibidores de fotossíntese e síntese lipídica
Caracterização de complexos enzimáticos envolvidos nestes processos
Medições de atividade enzimática
Objetivos
Chlorella luteo-viridis e Neochloris oleoabundans
• Meios• Curvas de crescimento• Microscopia • Extraçao de lipidios
Resultados preliminaresResultados preliminares
Resultados preliminaresMeiosMeios
•Chlorella•Bristol •Proteose
•Proteose•Soil Extract•Soil Extract (- Soil + Fe)•Bristol• Soil Extract modificado•BBM
Observações
Curvas de crescimentoCurvas de crescimentoShaker vs. Bancada
Resultados preliminares
10mM NaNo3 vs. 5mM NaNO3
Curvas de crescimento – Curvas de crescimento – AgitaçãoAgitação
Curvas de crescimento - Curvas de crescimento - NitrogênioNitrogênio
10mM papel AL y = 0,1501Ln(x) - 0,1166R2 = 0,5202
-0,2-0,1
00,10,20,30,40,50,6
0 5 10 15
dias
A75
0nm Série1
Log. (Série1)
5mM papel Al y = 0,1812Ln(x) - 0,173R2 = 0,5587
-0,4-0,2
00,20,40,6
0 5 10 15
dias
A75
0nm Série1
Log. (Série1)
y = 0,1501Ln(x) - 0,1166R2 = 0,5202
y = 0,1812Ln(x) - 0,173R2 = 0,5587
-0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15
Neo - TesteNitrogênio - BBM10mM (Papel Al)
Neo - TesteNitrogênio - BBM5mM (Papel Al)
Log. (Neo - TesteNitrogênio - BBM10mM (Papel Al))
Log. (Neo - TesteNitrogênio - BBM5mM (Papel Al))
Contagem e pesagem de células
• Contagem – Neubauer– Vs. Abs e peso seco
• Pesagem – em aprimorando– Centrifugação – papel Alumínio – estufa 24h
A750nm
Peso (g/mL)
Peso (g/mL)
Nº cél/mLNº cél/mL
A750nm
MicroscopiaMicroscopia
Azul de Toluidina Vermelho neutro
Próximos passos• Extração de lipídios e cromatografia - ok• Fotobiorreator• Curvas de crescimento em privação de nitrogênio - ok• Extração de DNA - ok• Curvas de crescimento com glicose…
Obrigada!