CARACTERIZAÇÃO, ISOLAMENTO E ESTABILIDADE DE … · Nutrición, Havana, Cuba, 2012. ... em...
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Universidade Federal do Rio de Janeiro Fabricio de Oliveira Silva CARACTERIZAÇÃO, ISOLAMENTO E ESTABILIDADE DE COMPOSTOS BIOATIVOS DA TORTA DE SOJA RIO DE JANEIRO 2014
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Fabricio de Oliveira Silva
CARACTERIZAÇÃO, ISOLAMENTO E ESTABILIDADE DE
COMPOSTOS BIOATIVOS DA TORTA DE SOJA
RIO DE JANEIRO
2014
Fabricio de Oliveira Silva
CARACTERIZAÇÃO, ISOLAMENTO E ESTABILIDADE DE COMPOSTOS BIOATIVOS DA TORTA DE SOJA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de
Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre em
Ciência de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Perrone
Rio de Janeiro 2014
Silva, Fabricio de Oliveira.
Caracterização, isolamento e estabilidade de compostos bioativos da torta de
soja / Fabricio de Oliveira Silva. -- Rio de Janeiro: UFRJ/IQ, 2014.
Orientador: Daniel Perrone.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Química, Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Rio de Janeiro, 2014.
Referências Bibliográficas: f. 77- 86.
1. Soja. 2. Torta de soja. 3. Isoflavonas. 4. Saponinas. 5. Estabilidade. 6.
Cromatografia semi-preparativa. I. Perrone, Daniel. (orient.). III. Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Química, Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos. IV. Caracterização, isolamento e estabilidade de compostos
bioativos da torta de soja.
Fabricio de Oliveira Silva
CARACTERIZAÇÃO, ISOLAMENTO E ESTABILIDADE DE
COMPOSTOS BIOATIVOS DA TORTA DE SOJA.
Prof. Dr. Daniel Perrone
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciência de Alimentos.
Aprovada por:
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, pelo infinito amor
e dedicação para que eu recebesse uma
educação de qualidade e chegasse até
aqui.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, que com seu infinito amor, poder e graça me sustentou e
conduziu até aqui. Obrigado por todas as bênçãos e vitórias recebidas.
À minha mãe, que com sua força, garra e determinação trabalhou muito para que eu
chegasse até aqui. Obrigado pela educação concedida, pelo esforço, amor, apoio e por aturar
meus momentos de estresse. Você é meu maior exemplo.
Ao meu pai e irmão pelo apoio e amor.
Ao meu orientador acadêmico, professor Daniel Perrone, pela oportunidade concedida
e confiança depositada em mim para realização desta pesquisa. Muito obrigado pela
dedicação, paciência, ensino e tempo dedicados a mim, com certeza você contribuiu muito
para a minha formação.
Ao professor Alexandre Guedes Torres pelos conselhos científicos e orientação nas
rotinas de análise e atividades do laboratório.
Às queridas Fabiana Ramos e Suellen Gomes, por me auxiliarem no início da minha
pesquisa me ensinando boa parte das análises que realizei e a rotina do laboratório. Obrigado
meninas pelo apoio e companheirismo.
À “companheira de soja” Nívea Dias pela amizade e auxílio científico.
Às amigas de laboratório Andressa Alves, Ellen Lacerda, Michele e Vanessa Rezende.
Obrigado por tornarem o trabalho “menos pesado”.
À toda equipe do LBNA, pelo suporte e por tornar o convívio no ambiente de trabalho
muito agradável.
À Patrícia pelo suporte técnico no laboratório.
Aos amigos Osmar, Elaine, Wagner, Gustavo e Patrícia que sempre me apoiaram e
compreenderam minhas prioridades.
A todos os meus familiares e amigos que contribuíram com sua torcida e orações para
a realização deste grande sonho na minha vida.
RESUMO
Silva, Fabricio de Oliveira. CARACTERIZAÇÃO, ISOLAMENTO E ESTABILIDADE DE
COMPOSTOS BIOATIVOS DA TORTA DE SOJA. Rio de Janeiro, 2014. Dissertação
(Mestrado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
A torta de soja é um co-produto proteico da indústria do óleo de soja. Além de teores elevados
de proteína, possui também componentes bioativos, como as isoflavonas e as saponinas de
soja. O objetivo deste estudo foi caracterizar, isolar e avaliar a estabilidade de compostos
bioativos da torta de soja. Amostras de soja, torta de soja da indústria e torta de soja
experimental foram utilizadas. Com relação aos compostos bioativos e atividade antioxidante,
os valores encontrados para as amostras de torta de soja foram, respectivamente, de 29 a
101% e 52% maiores do que os encontrados para os grãos de soja. Além disso o teor de
proteínas foi 43% maior que o da soja. As amostras de torta de soja apresentaram em média
1,71 mg de isoflavonas totais e 3,57 mg de saponinas de soja por g. O processamento térmico
na presença de umidade empregado durante a obtenção da torta de soja experimental levou a
um aumento de 13 vezes no teor de agliconas. Além do maior rendimento de extração (29
vezes) em relação a extração com etanol, os compostos bioativos mostraram maior
estabilidade nos extratos obtidos utilizando-se a mistura ternária de solventes
independentemente da amostra ou condição de armazenamento (freezer, temperatura
ambiente ao abrigo da luz, temperatura ambiente exposto a luz).. Foi possível o isolamento
por cromatografia líquida semi-preparativa das isoflavonas daidzina, glicitina, genistina,
malonil genistina, acetil daidzina, malonil daidzina, daidzeína e genisteína com grau de
pureza acima de 65%. As saponinas de soja B-I e B-II foram isoladas com grau de pureza
acima de 90%. O isolamento destes compostos a partir da torta pode ser uma estratégia para a
obtenção de padrões analíticos e compostos isolados para futuros estudos de bioatividade.
Palavras-chave: soja, torta de soja, isoflavonas, saponinas, estabilidade, cromatografia semi-
preparativa.
ABSTRACT
Silva, Fabricio de Oliveira. CHARACTERIZATION, ISOLATION AND STABILITY OF
BIOACTIVE COMPOUNDS FROM SOYBEAN CAKE. Rio de Janeiro, 2014. Dissertação
(Mestrado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
Soybean cake is a by-product of soybean oil industry. In addition to the high level of protein,
soybean cake is also a source of bioactive compounds, such as isoflavones and soyasaponins.
The aim of this study was to characterize, isolate and to investigate the bioactive compounds
stability of soybean cake. Soybeans, soybean cakes from industry and experimental soybean
cake were used in the study. Soybean cake samples presented higher protein (43%) and
bioactive compounds contents (29% to 101%) and antioxidant capacity (52%) than soybeans.
Soybean cake samples showed 1,71 mg of total isoflavones and 3,57 mg of soyasaponins, on
average, per g. High moisture thermal procedure employed during soybean cake processing
led to a 13-fold increase in aglycone isoflavones contents. In addition to a 29-fold higher
extraction yield, bioactive compounds showed higher stability in ternary solvent mixture
extracts in comparison to ethanol, independently of the sample or storage conditions (freezer,
room temperature protected and unprotected from light). Soybean cake is a good source of
protein and bioactive compounds and could be used in the functional foods industry.
Isoflavones and soyasaponins showed stability during the 180 days of storage in the extracts
obtained with the ternary solvent mixture. The isoflavones daidzin, glycitin, genistein,
malonyl genistein, acetyl daidzin, malonyl daidzin, daidzeína, glycitein and genistein were
isolated at the semipreparative HPLC system with purity greater than 65%. Soyasaponins B-I
and B-II were isolated with purity greater than 90%. the isolation of isoflavones and
soyasaponins from soybean cake by semipreparative HPLC is an alternative strategy to obtain
isolated compounds for use as analytical standards as well as for further bioactivity studies.
Keywords: soybean, soybean cake, isoflavones, saponins, stability, semipreparative HPLC.
PUBLICAÇÕES
Artigo submetido a periódico
1. Silva, F.O.; Perrone, D. Characterization and stability of bioactive compounds from
soybean cake. Food Chemistry. 2014.
Resumos publicados e submetidos em anais de congressos:
1. Ramos, F; Silva, F.; Calado, V.M.A.; Torres, A.; Perrone, D. Antioxidant capacity
and differential extraction of phenolic compounds, flavonoids and saponins from soy
using mixture and factorial experimental designs. XVI Congreso Latinoamericano de
Nutrición, Havana, Cuba, 2012.
2. Silva, F.; Perrone, D. Soybean cake as a potential source of bioactive compounds. VI
International Conference on Polyphenols and Health (ICPH), Buenos Aires,
Argentina, 2013.
3. Torres, A.G.; Silva, F.; França, C.C.; Monteiro, M.C.; Perrone, D. Soybean cake as a
source of stable bioactive compounds. Experimental Biology 2014, San Diego,
California, 2014.
4. Silva, F.O.; Perrone, D. Isolation of isoflavones and soyasaponins from soybean cake
by semipreparative high performance liquid chromatography. 17th IUFoST World
Congress of Food Science and Technology, Montreal, Canadá, 2014.
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
Figura 1. Grão de soja e seus componentes e vagem da soja ...................................... 18
Figura 2. Estrutura química geral das principais classes de flavonoides .................... 25
Figura 3. Estrutura química das isoflavonas da soja ................................................... 27
Figura 4. Estrutura química dos precursores de terpenos ............................................ 29
Figura 5. Principais classes de terpenos presentes nos alimentos, alguns exemplos e
estruturas ..................................................................................................................... 30
Figura 6. Estrutura química das saponinas de soja ...................................................... 32
Figura 7. Esquema representativo das principais etapas para o estudo de fitoquímicos
em alimentos ............................................................................................................... 35
Figura 8. Semelhança estrutural entre o estradiol (estrogênio) e o equol, um metabólito
das isoflavonas no organismo humano ........................................................................ 40
Figura 9. Fluxograma de processamento dos grãos de soja para a obtenção do óleo de
soja ............................................................................................................................. . 43
Capítulo 2
Figura 1. Proximate composition (A), contents of total phenolics (TP), flavonoids (TF)
and saponins (TS) (B), and antioxidant capacity (C) in soybean and soybean cake
experimental and industrial samples ………………………………………………... 54
Figura 2. Isoflavones profile from soybean and soybean cake samples experimental
and industrial samples ………………………………………………………………. 59
Figura 3. Stability of bioactive compounds and antioxidant capacity (FRAP and
TEAC) in dry soybean cake (experimental and industrial) extracts (obtained with
ethanol or ternary solvent mixture) during storage at -20 oC (freezer) and room
temperature (protected and unprotected from light) for 180 days ………………….. 63
Figura 4. Stability of isoflavones and soyasaponins in dry soybean cake (experimental
and industrial) extracts (obtained with ethanol or ternary solvent mixture) during
storage at -20 oC (freezer) and room temperature (protected and unprotected from
light) for 180 days …………………………………………………………………... 65
Capítulo 3
Figura 1. Cromatograma (UV 254 nm) representativo das isoflavonas isoladas a partir
do extrato da torta de soja da indústria ........................................................................ 72
Figura 2. Cromatograma (250 nm) das frações isoladas no sistema semipreparativo 73
Figura 3. Cromatograma (UV 195nm) representativo das saponinas de soja isoladas a
partir do extrato da torta de soja da indústria .............................................................. 75
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1. Composição centesimal aproximada do grão de soja .................................. 18
Tabela 2. Composição em vitaminas e minerais por 100 g do grão de soja ............... 21
Tabela 3. Classes de flavonoides e sua distribuição no reino vegetal ......................... 26
Tabela 4. Exemplo de alguns solventes e os principais compostos extraídos por eles 34
Tabela 5. Principais componentes da soja e seus efeitos na saúde humana ................ 39
Tabela 6. Principais ingredientes proteicos obtidos a partir da torta de soja e seu uso na
indústria alimentícia .................................................................................................... 44
Capítulo 2
Tabela 1. Isoflavones and soyasaponins contents (mg/g DW) in soybean and soybean
cake experimental and industrial samples …………………………………………... 57
Tabela 2. Contents of bioactive compounds and antioxidant capacity at t = 0 and t =
180 days in dry soybean cake (experimental and industrial) extracts (obtained with
ethanol or ternary solvent mixture) during storage at -20 oC (freezer) and room
temperature (protected and unprotected from light) ………………………………... 64
Capítulo 3
Tabela 1. Gradiente de eluição do sistema de CLAE semi-preparativa ...................... 70
Tabela 2. Massa e grau de pureza de isoflavonas e saponinas de soja isoladas por
CLAE semi-preparativa ............................................................................................... 74
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAPH 2,2‟-azobis-(2-methylpropionamidine) dihydrochloride
ABTS 2,2‟-Azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt
ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC Association of Official Analytical Chemists
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de
diodos
CONAB Companhia Nacional de Abastecimento
DAD Detector de arranjo de diodos
DDMP 2,4-dihidro-2,5-dihidróxi-6-metil-4-pirona
DW Dry weight basis
EM Espectrômetro de Massas
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
FDA Food and drug administration
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power
GAE Gallic acid equivalents
GE Genistein equivalents
HDL Lipoproteína de alta densidade
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HPLC High performance liquid chromatography
LC-DAD-MS Liquid chromatography coupled to diode array detector and mass
spectrometer
LDL Lipoproteína de baixa densidade
ND Not detected
ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity
PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor
SIM Single ion monitoring
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity
TF Total flavonoids
TP Total phenolics
TPTZ 2,4,6-tripyridyl-S-triazine
TROLOX 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid
TS Total saponins
UV Ultravioleta
Vis Visível
SUMÁRIO
Capítulo 1 ............................................................................................................................. ... 15
1. A soja ..................................................................................................................... 16
1.1. Características agronômicas ......................................................................... 16
1.2. Composição nutricional ................................................................................. 17
2. Fitoquímicos e bioatividade da soja ...................................................................... 20
2.1. Fitoquímicos ................................................................................................... 21
2.1.1. Compostos fenólicos: isoflavonas ....................................................... 22
2.1.2. Saponinas ............................................................................................ 27
2.2. Extração e análise de isoflavonas e saponinas .............................................. 31
2.3. Bioatividade da soja ....................................................................................... 36
3. Processamento e consumo da soja ........................................................................ 41
Objetivo geral .......................................................................................................................... 44
Capítulo 2 ................................................................................................................................ 46
1. Introduction ........................................................................................................... 47
2. Materials and methods .......................................................................................... 48
2.1. Standards and chemicals ................................................................................ 48
2.2. Samples ........................................................................................................... 48
2.3. Proximate composition ................................................................................... 49
2.4. Bioactive compounds analysis ....................................................................... 49
2.4.1. Phenolic compounds ………………………………………………… 49
2.4.2. Flavonoids …………………………………………………………... 49
2.4.3. Saponins ……………………………………………………………... 50
2.4.4. Isoflavones and soyasaponins …………………….…………………. 50
2.5. Antioxidant capacity ………………………………………………………... 51
2.6. Stability of bioactive compounds from soybean cake extracts ……………... 52
2.7. Statistical analysis ………………………………………………………….. 52
3. Results and discussion …………………………………………………………... 52
3.1. Proximate composition ……………………………………………………... 52
3.2. Total phenolics, flavonoids, saponins and antioxidant activity ………...….. 53
3.3. Isoflavones and soyasaponins by LC-DAD-MS ……………………………. 56
3.4. Bioactive compounds stability ………………………...……………………. 59
4. Conclusion ………………………………………………………………………. 65
Capítulo 3 …………………………………………………………………………………… 66
1. Introdução ……………………………………………………………………….. 67
2. Objetivos específicos .…………………………………………………………… 68
3. Material e métodos ……………………………………………………………… 68
3.1. Amostra …………………………………………………………………….. 68
3.2. Sistema de CLAE semi-preparativa …………..……………………………. 68
3.3. Coletor de frações ………………………………………………………….. 69
3.4. Identificação das frações coletadas ………………………………………... 70
3.5. Grau de pureza ……………………………………………………………... 70
4. Resultados e discussão ………………………………………………………….. 70
5. Conclusão ……………………………………………………………………….. 75
Referências bibliográficas ……………………………………...…………………………… 76
16
Capítulo 1
Revisão Bibliográfica
17
1. A soja
A soja (Glycine Max. (L) Merrill) é um produto agrícola de grande interesse mundial
graças à sua versatilidade de aplicação na alimentação humana e animal e seu valor
econômico nos mercados nacional e internacional. O Brasil é um dos maiores produtores
mundiais de soja, sendo a leguminosa cultivada em várias regiões do país (Silva et al., 2006).
Estima-se que a safra produzida no Brasil no ano de 2013 seja de 81 milhões de toneladas,
segundo dados divulgados pela Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2013).
Evidências históricas e geográficas indicam que a soja tenha se originado no norte da
China, onde seu cultivo ocorre há mais de 5 milênios (Liu, 2004). Durante a primeira metade
do século 20, a China foi a maior produtora de soja mundial. Na década de 50 o cultivo
aumentou rapidamente nos Estados Unidos, e desde então o país vem sendo o maior produtor
do grão (Qiu & Chang, 2010).
No Brasil, a introdução da soja ocorreu no estado da Bahia em 1822. Em 1941 a
primeira indústria processadora de soja instalou-se no País, no estado do Rio Grande do Sul.
Entretanto, somente a partir da década de 70 a produção começou a tornar-se expressiva. Em
1987 foi criado o programa EMBRAPA Soja, objetivando a pesquisa e desenvolvimento de
novos cultivares adaptados a diferentes regiões climáticas do país com características mais
favoráveis para a indústria processadora de alimentos. Com o aumento das áreas de plantio o
Brasil tornou-se o segundo maior produtor de soja no mundo (Martino et al., 2011; Qiu &
Chang, 2010).
1.1.Características agronômicas
A soja pertence à família botânica Febaceae (também conhecida como Leguminosae
ou leguminosas), sub-família Papilionoideae e gênero Glycine. A planta cresce anualmente e
pode atingir até 1,5 m de altura dependendo do cultivar e das condições de plantio (Figallo,
2003; Palomo et al., 2011). Sua habilidade de fixação de nitrogênio, adaptação a diversos
tipos de clima e solo e elevado conteúdo protéico quando comparada a outros grãos são
algumas das características que favorecem seu plantio (Liu, 2004).
Os grãos de soja crescem em vagens, que medem cerca de 5 cm e comportam de 2 a 3
grãos. Estes são de formato esférico, pesam entre 100 e 300 mg cada e seu tamanho pode
variar de 4 a 8 mm. Os grãos são compostos aproximadamente de 8% de casca, 90% de
18
cotilédones e 2% de hipocótilos (Figura 1). A cor varia, podendo ser amarelos, verdes,
marrons ou pretos. A variedade mais cultivada mundialmente é a amarela (Snyder, 1993;
Figallo, 2003; Sugano, 2006).
Figura 1. Grão de soja e seus componentes (a) e vagem da soja (b)
1.2.Composição Nutricional
O grão de soja contém aproximadamente 20% de lipídios, 40% de proteínas, 35% de
carboidratos (dos quais 17% são fibras dietéticas) e 5% de cinzas em base seca. Esse conteúdo
pode variar dependendo do cultivar e das condições de plantio. Além disso, a soja também
contém diversas vitaminas em sua composição (Snyder, 1993; Sugano, 2005; Dixit et al.,
2011). A Tabela 1 apresenta a composição centesimal aproximada do grão de soja integral.
Tabela 1. Composição centesimal aproximada do grão de soja.
Componente Teor (g/100g)
Umidade 9,7
Proteínas 40,5
Lipídios 22,1
Carboidratos totais 22,1
Fibra dietética total 21,7
Cinzas 5,6
Fonte: Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (USP)
(b)
19
1.2.1. Proteínas
As proteínas da soja são separadas por ultracentrifugação e caracterizadas como
frações 2s, 7s, 11s e 15s (sendo s constante de sedimentação). As globulinas glicinina (11s) e
β-conglicinina (7s) representam 90% das proteínas presentes na soja. Essas proteínas contem
quase todos os aminoácidos essenciais para a nutrição humana, tendo como aminoácido
limitante a metionina. Apesar disto, a soja é uma excelente fonte proteica vegetal alternativa à
fonte animal (Dixit et al., 2011).
Além da β-conglicinina, a fração 7s também é constituída por hemaglutininas (ou
lectinas) e lipoxigenases. As hemaglutininas são glicoproteínas termolábeis que causam
aglutinação de glóbulos vermelhos e podem ser tóxicas. As lipoxigenases atuam na formação
de hidroperóxidos a partir de ácidos graxos como o linoléico e o linolênico (Snyder, 1993).
A soja também contém inibidores de tripsina, como o de Bowman-Birk e de Kunitz,
que constituem a fração 2s das proteínas. O primeiro inibe tanto a tripsina como a
quimiotripsina e o último inibe principalmente a tripsina. Esses componentes são
relativamente termolábeis e por isso é recomendável a cocção da soja antes de seu consumo
(Anderson & Wolf, 1995).
1.2.2. Lipídios
Os triacilgliceróis compreendem cerca de 96% da fração lipídica da soja. Outros
componentes são os fosfolipídios, matéria insaponificável (tocoferóis e fitoesteróis) e os
ácidos graxos livres. O ácido graxo predominante no grão é o linoleico (18:2 n-6), que
corresponde a aproximadamente 54% dos ácidos graxos da soja. O conteúdo de ácido
linolênico (18:3 n-3) varia de 4 a 8% e teores consideráveis de ácido oleico (18:1 n-9) (22-
25%) também estão presentes no grão. Dos ácidos graxos saturados, os majoritários são o
palmítico (16:0) (11%) e o esteárico (18:0) (4%) (Barbalho & Farinazzi-Machado, 2011).
A fração composta por fosfolipídios geralmente é designada pelo termo lecitina. A
lecitina de soja é amplamente utilizada na indústria alimentícia por conta de suas propriedades
funcionais como emulsificante, coloidal e antioxidante. Estudos sugerem que a lecitina
também pode exercer efeitos fisiológicos benéficos na saúde humana e animal (Mateos-
Aparicio et al., 2008).
20
1.2.3. Carboidratos
A maioria dos carboidratos presentes na soja são polissacarídeos não amiláceos e
oligossacarídeos. Dentre os oligossacarídeos, os principais componentes são a rafinose (1,1%)
e a estaquiose (4%). A enzima que hidrolisa estes carboidratos (α-galactosidase) não está
presente no trato digestório humano, portanto eles permanecem intactos durante a digestão.
As bactérias colônicas são capazes de fermentar esses oligossacarídeos, ocasionando a
produção de gases e a formação de ácidos graxos de cadeia curta, que possuem atividade
probiótica e estão associados com benefícios à saúde. Além destes, cerca de 5% dos
carboidratos da soja constituem de sacarose (Espinosa-Martos & Rupérez, 2006; Sugano,
2005).
Dos polissacarídeos, os principais componentes são as fibras dietéticas A fibra
dietética consiste nos componentes da planta resistentes à digestão pelos humanos. A soja
contém aproximadamente 17% de fibra dietética total em base seca. A fibra é mais prevalente
na casca do que nos cotilédones, sendo a fibra insolúvel o principal componente (Sugano,
2005; Snyder, 1993). A fração insolúvel é constituída principalmente por polissacarídeos da
parede celular como a celulose (20%), hemicelulose (50%) e substâncias pécticas (30%). O
grão também possui cerca de 1% de amido (Figallo, 2003; Martino et al., 2011).
1.2.4. Vitaminas e minerais
A soja contém tanto vitaminas hidrossolúveis como lipossolúveis (Tabela 2). As
vitaminas hidrossolúveis presentes no grão são principalmente tiamina, riboflavina, niacina,
ácido pantotênico e ácido fólico. Quantidades significativas de ácido ascórbico são
encontradas apenas no grão imaturo e nas sementes germinadas. Durante o processamento da
soja, especialmente naqueles que envolvem a utilização de água, ocorrem perdas
significativas destas vitaminas (Barbalho & Farinazzi-Machado, 2011).
21
Tabela 2. Composição em vitaminas e minerais por 100 g do grão de soja
Vitaminas Minerais (mg)
Vitamina C (mg) 6 Cálcio 277
Tiamina (mg) 0,874 Ferro 15,7
Riboflavina (mg) 0,870 Magnésio 280
Niacina (mg) 1,623 Fósforo 704
Vitamina B6 (mg) 0,377 Potássio 1797
Ácido Fólico (µg) 375 Sódio 2
Vitamina B12 (µg) 0 Zinco 4,89
Vitamina A (µg) 1 Manganês 1,90
Vitamina E (mg) 0,85
Vitamina D (µg) 0
Vitamina K (µg) 47
Fonte: National Nutrient Database for Standard Reference (USDA)
A fração lipossolúvel é composta principalmente pelas vitaminas A (na forma de
carotenóides) e E, porém, como ocorre com a vitamina C, quantidades significativas de
vitamina A somente estão presentes nos grãos imaturos ou sementes germinadas (Liu, 2004).
Com relação aos minerais, os principais encontrados na soja são ferro, zinco,
manganês, magnésio, potássio, cálcio e selênio (Tabela 2) (Barbalho & Farinazzi-Machado,
2011).
2. Fitoquímicos e bioatividade da soja
A soja e seus produtos derivados vêm sendo consumidos nos países asiáticos por
séculos. Estudos epidemiológicos indicam que a baixa incidência de diversas doenças
crônicas nestes países, incluindo as doenças cardiovasculares e certos tipos de câncer, pode
estar ligada, em parte, ao consumo regular da soja e seus derivados em grandes quantidades.
Esta ingestão, porém, deve ser aliada a hábitos de vida saudáveis, como a prática regular de
atividade física (Anderson et al., 1995; Boyapati et al., 2005; Toyomura & Kono, 2002; Zhou,
2004).
22
Uma meta-análise publicada por Anderson et al. em 1995 revisou 38 estudos clínicos
que avaliaram os efeitos da ingestão da proteína de soja na redução do colesterol plasmático.
O estudo concluiu que a ingestão da proteína de soja auxiliou na redução do colesterol total,
LDL e triglicerídeos sem afetar a fração HDL do colesterol. Os resultados positivos
despertaram o interesse da comunidade científica a respeito do efeito hipolipidêmico da
proteína de soja (Kang et al., 2010; Ugarte, 2006).
Quatro anos depois, em 1999, uma alegação de saúde para produtos contendo soja
como protetores contra a doença coronariana foi aprovada pela agência reguladora de
medicamentos e alimentos dos EUA (FDA, Food and Drug Administration). Essa decisão foi
baseada em estudos clínicos que levaram a conclusão que a ingestão de pelo menos 25 g de
proteína de soja por dia seria capaz de reduzir a fração total e LDL do colesterol plasmático.
Para isso, cada porção do produto deveria conter pelo menos 6,25 g de proteína e o consumo
mínimo deveria ser de 4 porções ao dia (Sacks et al., 2006). No Brasil, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) também autoriza o uso desta alegação.
Os efeitos benéficos da ingestão da soja podem estar relacionados não somente à sua
rica composição nutricional, mas também à presença de componentes bioativos no grão, os
chamados fitoquímicos. Esse fato tornou a soja um dos alimentos mais utilizados em
pesquisas científicas nos últimos anos. Diversos estudos envolvendo a identificação e efeitos
de componentes bioativos da soja vêm sendo realizados (Kang et al., 2010).
2.1.Fitoquímicos
Os fitoquímicos, também chamados compostos bioativos, são componentes do
metabolismo secundário das plantas com grande importância em sua sobrevivência e
funcionamento apropriado. São responsáveis pela proteção contra herbívoros, micro-
organismos e competidores, além de proteção contra danos causados por raios UV. Também
regulam o crescimento, controlam a polinização e a fertilização da planta. Produzem diversos
efeitos em outros organismos, podendo estes serem benéficos ou deletérios. Esse fato vem
aumentando o interesse na descoberta de novos compostos e a pesquisa dos efeitos e modo de
ação destes na saúde humana (Molyneux et al., 2007; Edriss et al., 2012).
De forma geral, estes compostos podem ser divididos em três grupos principais:
terpenos (como os carotenoides, as saponinas e os esteróis), compostos fenólicos (como os
23
ácidos fenólicos e os flavonoides), compostos nitrogenados (como os alcaloides e os
glucosinolatos) e compostos sulfurados. A complexa mistura destes grupos de compostos
funcionais nos alimentos é considerada como a principal responsável pelos efeitos benéficos
provenientes do consumo de alimentos de origem vegetal (Agostini-Costa et al., 2012).
O órgão, célula ou estádio de desenvolvimento da planta no qual ocorre a biossíntese
de fitoquímicos é, na maioria dos casos, específico em cada espécie. Esse processo é
altamente regulado, podendo sofrer modulação de fatores ambientais e sazonais. O local de
síntese celular é compartimentalizado e a maioria das vias são parcialmente ativas no
citoplasma. Em certos casos, como os alcaloides e alguns terpenos, evidências sugerem que a
síntese ocorra no cloroplasto. Além disso, a síntese de compostos lipofílicos bem como as
modificações pós-síntese usualmente é associada ao retículo endoplasmático (Wink, 2010).
Os fitoquímicos podem ser encontrados por toda a planta, porém seu sítio inicial de
síntese é específico a um único órgão (como as raízes, folhas ou frutos). Posteriormente eles
podem ser transportados para outros locais e armazenados nos tecidos. O local de
armazenamento dependerá da polaridade destes compostos, sendo os hidrossolúveis
armazenados nos vacúolos e idioblastos e os lipossolúveis nos tricomas, pêlos glandulares,
tilacóides ou na cutícula (Acamovic & Brooker, 2005).
A soja possui uma enorme gama destes componentes. Dentre as principais classes
podemos citar os compostos fenólicos, em especial as isoflavonas, e os terpenos, sendo as
saponinas o principal representante na soja e seus derivados.
2.1.1. Compostos fenólicos e isoflavonas
Os compostos fenólicos estão amplamente distribuídos pelas plantas e são
caracterizados por conterem pelo menos um anel aromático com um ou mais grupos
hidroxilas em sua estrutura. Variam de moléculas simples, com baixo peso molecular e um
único anel aromático, a moléculas grandes e complexas, como os taninos e polifenóis
derivados. Além de contribuírem para a coloração das plantas, também atuam nos
mecanismos de defesa contra patógenos, parasitas e predadores e no desenvolvimento e
crescimento. Existem principalmente na forma glicosilada, ligados a uma ou várias cadeias de
açúcares, ou ligados a ácidos orgânicos, proteínas, lipídios e outros fenólicos. Normalmente
24
são classificados em dois grandes grupos: os flavonoides e os não flavonoides (Crozier,
Jaganath & Clifford, 2006; Dillard & German, 2000; Liu, 2007).
A principal via de síntese destes compostos parte principalmente dos aminoácidos
aromáticos fenilalanina e, em menor extensão, tirosina. A transformação inicial destes
aminoácidos de metabólitos primários a metabólitos secundários se dá pelas enzimas
fenilalanina e tirosina amônia-liase (PAL/TAL) através de uma reação de desaminação. A
partir daí diversas reações de hidroxilação, metilação e condensação geram os diversos
compostos pertencentes à classe dos compostos fenólicos. Essa via de síntese também é
conhecida como via dos fenilpropanóides (Petersen, Hans & Matern, 2010; Castellano, Tena
& Torrens, 2012).
A principal classe de compostos fenólicos presente na soja, os flavonoides, são
derivados da condensação do ácido cinâmico a três moléculas de malonil CoA (He, Liu e Liu,
2008). São definidos quimicamente como substâncias compostas por uma estrutura
fenilcromanona (C6-C3-C6), com um ou mais substituintes hidroxila. Essa estrutura consiste
de 2 anéis aromáticos (A e B) e um anel heterocíclico (C) contendo um átomo de oxigênio
(Ghasemzadeh & Ghasemzadeh, 2011; Birt, Hendrich & Wang, 2001).
De acordo com o grau de hidroxilação e a presença de uma dupla ligação (C2-C3) no
anel heterocíclico, os flavonoides podem ser divididos em 13 classes, sendo as mais
importantes representadas pelos flavonóis, flavanóis, flavonas, isoflavonas, antocianidinas e
flavanonas (Giada, 2013). A Figura 2 apresenta a estrutura química geral de cada grupo.
Geralmente ocorrem nas plantas como derivados metilados ou sulfatados, conjugados
com monossacarídeos e dissacarídeos e formando complexos com oligossacarídeos, lipídios,
aminas, ácidos carboxílicos e ácidos orgânicos, sendo conhecidos aproximadamente 8.000
compostos. Os flavonoides possuem coloração e funcionam como pigmentos nas flores e
outras partes das plantas. Além disso, estão envolvidos em processos como proteção à luz
UV, resistência a doenças e estimulação da fixação de nitrogênio (Crozier, Jaganath &
Clifford, 2006).
25
Figura 2. Estrutura química geral das principais classes de
flavonoides (Crozier, Jaganath & Clifford, 2006).
A subclasse mais amplamente distribuída no reino vegetal é a dos flavonóis, que
abrange a quercetina e diversos compostos relacionados, como o campferol e a miricetina
(Ross & Kasum, 2002). Na Tabela 3 encontram-se relacionadas as principais classes de
flavonoides e suas principais fontes nos alimentos. A principal subclasse de flavonoides
presentes na soja e seus derivados é a das isoflavonas.
Apesar dos flavonoides serem encontrados amplamente distribuídos em diversos
alimentos, as isoflavonas estão presentes apenas em poucas famílias botânicas. Isso é
explicado pela limitada distribuição da enzima chalcona isomerase, que converte a
naringenina em 2-hidroxidaidzeína e é amplamente distribuída na família das leguminosas. A
soja é a leguminosa que contém as maiores quantidades de isoflavonas no reino vegetal (Liu,
2004; Coward et al., 1993).
26
Tabela 3. Classes de flavonoides e sua distribuição no reino vegetal
Subclasse Principais
representantes
Característica química Principais
fontes
Flavonóis Quercetina, miricetina
e campferol
Hidroxilação no anel C3 Amplamente
distribuídos
Flavanóis Catequina e
epigalocatequina
Molécula não planar Maçã, ameixa e
chá verde
Flavonas Apigenina e luteolina Ausência de hidroxilação
em C3
Azeitona verde,
aipo e pimentão
Isoflavonas Genisteína e daidzeína Anel B ligado a posição
C3 e não a C2
Soja e grão de
bico
Antocianidinas Cianidina e
delfinidina
Estrutura como cátion
flavilico
Uva e vinho
tinto
Flavanonas Hesperetina e
naringerina
Presença de um centro
quiral em C2 e ausência
de dupla ligação em C
Frutas cítricas
Fonte: Duthie, Gardner e Kyle, 2003; Crozier, Jaganath e Clifford, 2006.
As isoflavonas na soja e seus derivados apresentam-se como 3 compostos principais:
genisteína, daidzeína e gliciteína. Cada uma destas formas, denominadas agliconas, também
pode existir na forma β-glicosilada, tornando-se genistina, daidzina e glicitina. Além disso,
derivados acetil e malonil glicosilados também podem ocorrer (Figura 3), totalizando 12
isoflavonas presentes neste grupo de alimentos (Genovese & Lajolo, 2002; Barbosa et al.,
2006).
O conteúdo de isoflavonas pode ser influenciado por fatores genéticos e ambientais, os
quais juntamente com as condições de processamento irão determinar a concentração e o
perfil destes compostos na soja. As formas glicosiladas (em especial malonil e β-glicosilada)
são predominantes no grão in natura. Como resultado do processamento, as formas agliconas
e acetilglicosiladas são geradas. Em produtos fermentados, as formas agliconas são
predominantes por ação enzimática. A genisteína é a isoflavona presente em maiores
quantidades na soja e seus derivados (Genovese & Lajolo, 2002; Omoni & Aluko, 2005).
27
Isoflavona R2 R3
Daidzeína H H
Daidzina H H
6”-O-Acetildaidzina H H
6”-O-Malonildaidzina H H
Genisteína H OH
Genistina H OH
6”-O-Acetilgenistina H OH
6”-O-Malonilgenistina H OH
Gliciteína OH H
Glicitina OH H
6”-O-Acetilglicitina OH H
6”-O-Malonilglicitina OH H
Figura 3. Estrutura química das isoflavonas da soja.
A estabilidade das isoflavonas vem sendo reportada em diversos modelos de estudo
em diferentes alimentos, como o leite de soja, tofu e produtos fermentados a base de soja. As
principais mudanças ocorrem no perfil de isoflavonas e dependem do tempo de estoque,
incidência de luz e da temperatura e conteúdo de umidade, sendo comum a conversão das
28
formas malonil em acetil, β-glicosídeos ou agliconas, conversão das formas acetil em β-
glicosídeos ou agliconas e conversão dos β-glicosídeos em agliconas. O processamento em
altas temperaturas e baixa umidade, por exemplo, diminui a concentração de formas malonil e
aumenta a de formas acetil e β-glicosídeos nos alimentos. Já o aquecimento úmido leva a uma
maior formação de agliconas a partir das formas glicosiladas (Kim & Lee, 2011).
As isoflavonas malonil glicosiladas são relatadas como as mais suscetíveis à
degradação. Sua conversão às formas acetiladas usualmente se dá por descarboxilação
induzida pelo calor (Eisen et al., 2003). Mudanças no perfil de isoflavonas usualmente podem
ser observadas a partir de 25 ºC e o aumento gradual da temperatura leva a mudanças mais
drásticas. Acredita-se que as isoflavonas devem ser mantidas a temperaturas inferiores a 10 ºC
e protegidas da luz a fim de se evitar sua degradação (Rostagno et al., 2005).
2.1.2. Saponinas
As saponinas pertencem à classe dos terpenos, também conhecidos como isoprenoides
ou terpenoides. Os terpenos são a classe mais diversificada de metabólitos em plantas. Mais
de 30.000 membros desta classe já foram relatados e novas estruturas vem sendo descobertas
a cada dia. Além de numerosos, os terpenos também são bastante variáveis em estrutura,
exibindo centenas de diferentes esqueletos carbônicos e grupos funcionais. Apesar da ampla
diversidade, todos os terpenos são sintetizados por uma via comum, através da fusão de
unidades de 5 carbonos com estrutura isopentenoide (Humphey & Beale, 2006; Ashour, Wink
& Gershenzon, 2010).
Classicamente, era aceito que a molécula base para a síntese destes compostos era o
isopreno, o que era explicado pelo fato da pirólise de alguns terpenos originar unidades
isoprenoides. Porém, sabe-se que atualmente os principais blocos de construção dos terpenos
são constituídos dos isômeros isopentenil pirofosfato e dimetilalil pirofosfato (Figura 4), que
são sintetizados a partir do ácido mevalônico. Estes dois compostos são condensados em
sequência pela ação de enzimas chamadas preniltransferases. Os produtos incluem geranil,
farnesil e geranilgeranil pirofosfatos, esqualeno e fitoeno, que são os precursores das
principais classes de terpenos (Dewick, 2002).
29
Figura 4. Estrutura química dos precursores de terpenos.
A classificação dos terpenóides é baseada no número de unidades isoprenóides
presente em sua estrutura (Figura 5). As classes majoritárias são aquelas compostas por duas
unidades isoprenóides (monoterpenos), três unidades isoprenóides (sesquiterpenos), quatro
unidades isoprenóides (diterpenos), cinco unidades isoprenóides (sesterpenos), seis unidades
isoprenóides (triterpenos) e oito unidades isoprenóides (tetraterpenos). Apesar da biossíntese
ser baseada em unidades de 5 carbonos, a nomenclatura é baseada em unidades de 10
carbonos, uma vez que essa era a menor estrutura que se pensava encontrar nesta classe
(Ashour, Wink & Gershenzon, 2010).
30
Figura 5. Principais classes de terpenos presentes nos alimentos e alguns exemplos e
estruturas.
Os terpenóides possuem diversas funções nas plantas. Monoterpenos e sesquiterpenos
são compostos voláteis liberados pelas plantas após danos causados por herbívoros, atraindo
artrópodes que atacam ou parasitam herbívoros, evitando assim danos maiores. Certos
diterpenos e sesquiterpenos são fitoalexinas envolvidas na defesa direta das plantas contra
certos tipos de patógenos (Cheng et al., 2007). A família das leguminosas apresenta
principalmente a classe de triterpenóides (Wink, 2003).
Os triterpenóides são uma ampla classe de compostos e derivam do esqualeno, que é
formado a partir de duas unidades de farnesil difosfato. A ciclização do esqualeno leva à
formação de diversas estruturas triterpenóides, como as do tipo lupana, oleana e ursana. A
remoção dos grupamentos metila nos carbonos 4 e 14, leva à formação de esteroides, que são
característicos de eucariontes e originam um grande número de moléculas biologicamente
ativas, como os esteróis, as saponinas esteroidais e os glicosídeos cardioativos (Agostini-
Costa et al., 2012).
31
Além dos triterpenoides, em especial as saponinas, a soja também contém terpenos das
classes dos tetrapernóides, que são derivados da molécula de fitoeno. Os carotenoides são a
principal classe de compostos que representam este grupo. O teor destes parece ser mais
significativo nos grãos imaturos, em especial o de β-caroteno. Porém, uma redução
significativa deste composto ocorre conforme o grão amadurece, passando de
aproximadamente 0,46 mg para 0,12 mg por 100 g de soja (Simonne et al., 2000).
As saponinas estão amplamente distribuídas na natureza e seu nome é derivado da
palavra em latim sapo, que significa sabão. Isso se deve à característica das saponinas de
formar espuma quando agitadas com a água. São moléculas estruturalmente diversificadas e
que são quimicamente caracterizadas como glicosídeos triterpenos (30 átomos de carbono) ou
esteroidais (27 átomos de carbono). Consistem de uma cadeia aglicona apolar, denominada
sapogenina ou sapogenol, ligada a uma ou mais cadeias de monossacarídeos. Esta
combinação de elementos polares e apolares em sua cadeia explica a propriedade de formar
espuma em soluções aquosas (Vincken et al., 2007; Agostini-Costa et al., 2012).
As saponinas de soja possuem cadeia triterpenóide e são categorizadas de acordo com
a aglicona individual, que podem ser do grupo A, B e E. As saponinas de soja do grupo A são
estruturas bidesmosídicas com dois sítios de glicosilação nos carbonos 3 e 22 da estrutura
oleana. Este grupo também pode ser dividido em formas acetiladas e desacetiladas. As
saponinas de soja do grupo B possuem um sítio de glicosilação no carbono 3. Além disso,
podem estar ou não conjugadas ao DDMP (2,4-dihidro-2,5-dihidróxi-6-metil-4-pirona) no
carbono 22. As saponinas do grupo E possuem um grupo carboxílico no carbono 22 e são
consideradas como produtos da foto-oxidação do grupo B (Zhang & Popovich, 2009; Decroos
et al., 2005; Heng et al., 2006).
As saponinas do grupo B, principalmente as conjugadas ao DDMP, são amplamente
distribuídas na família das leguminosas, especialmente na soja. Existem duas classificações
para as saponinas de soja deste grupo. Aquelas conjugadas ao DDMP podem ser divididas em
αg, βa, βg, γa e γg, enquanto aquelas não conjugadas ao DDMP são divididas em I, II, III, IV
e V. A estrutura química das saponinas de soja pode ser observada na Figura 6 (Zhang &
Popovich, 2009; Heng et al., 2006).
32
Figura 6. Estrutura química das saponinas de soja (Adaptado de Fang et al., 2004)
A estabilidade das saponinas ainda é pouco estudada. Sabe-se que o processamento
tende a modificar o conteúdo de saponinas nos alimentos. Segundo Shi et al. (2009), o
cozimento de leguminosas por 35 minutos leva a uma redução de aproximadamente 25% no
conteúdo de saponinas, demonstrando que esses compostos são termolábeis. Esse fator é
ainda mais proeminente nas saponinas conjugadas ao DDMP que, quando degradadas em
elevadas temperaturas, geram suas respectivas formas não conjugadas (Heng et al., 2006).
2.2.Extração e análise de isoflavonas e saponinas
Os estudos qualitativos e quantitativos de compostos bioativos em plantas dependem,
em grande parte, da seleção do método de extração apropriado. A extração é o primeiro passo
de qualquer estudo deste tipo e tem papel crucial no resultado final do trabalho. Muitas vezes
a extração também é grande fonte de erro analítico. O controle necessário nesta etapa deve ser
realizado, a fim que se obtenha extratos com os compostos de interesse e com o mínimo de
perda possível (Azmir et al., 2013).
33
Nos métodos de extração usualmente utilizam-se solventes orgânicos. As operações
básicas nesta etapa envolvem passos como pré-lavagem, secagem ou liofilização da matéria,
moagem e homogeneização, que melhoram a cinética da extração e aumentam a superfície de
contato da amostra com o solvente utilizado. A escolha do sistema de solvente depende
intrinsecamente da natureza química do composto de interesse a ser extraído. Diferentes
sistemas de solventes são descritos na literatura para a extração de compostos bioativos das
plantas (Sasidharan et al., 2011).
Alguns dos solventes mais utilizados são hexano, éter, metanol, acetonitrila e etanol,
que geralmente são misturados em diferentes proporções com água. Basicamente o material
pré-tratado fica em contato por um determinado tempo com o sistema de solvente de escolha
sob agitação constante. Além do tempo, a temperatura da extração também poderá ser
controlada. Usualmente, os extratos são centrifugados a fim de remover o resíduo sólido e
obter um extrato limpo (Gil-Chávez et al., 2013).
Os métodos convencionais envolvendo uso de solventes apresentam algumas
limitações como longo tempo de extração, requerimento de solventes caros e de elevado grau
de pureza, evaporação de grande quantidade de solvente, baixa seletividade na extração e
decomposição térmica de compostos termolábeis. Com o objetivo de superar essas limitações,
novas técnicas vem sendo desenvolvidas. Algumas das mais promissoras são: extração
assistida por ultrassom, extração assistida por enzimas, extração assistida por radiação micro-
ondas, extração com fluído supercrítico e extração com líquido pressurizado (Luque de Castro
& Garcia-Ayuso, 1998; Azmir et al., 2013).
Diversos sistemas de solventes e técnicas assistidas vêm sendo empregadas na
extração de compostos fenólicos em alimentos. O desenvolvimento de um método universal
se torna difícil, devido à grande variedade química deste grupo. A grande diferença de
polaridade entre os compostos torna essencial a otimização do método de extração a fim de
obter resultados confiáveis do teor de compostos fenólicos de diferentes matrizes alimentícias.
Solventes como metanol, etanol, propanol, acetona, acetato de etila e suas combinações vem
sendo bastante utilizados (Garcia-Salas et al., 2010).
A extração de isoflavonas com metanol 80% ou acetonitrila acidificada é a mais
utilizada. A adição de água parece ser mais eficiente na extração de isoflavonas na soja e seus
derivados quando comparada a utilização de solvente acidificado. Além disso, a proporção de
34
solvente utilizado em relação à quantidade de amostra também parece exercer grande
influência na extração de isoflavonas (Rostagno et al., 2009).
Com relação às saponinas, sua extração seletiva é longa e laboriosa. Requer grande
preparo e tempo de extração da amostra e, ainda assim, produz extratos contendo quantidades
relativamente baixas de saponinas. Além disso, a característica termolábil de algumas
saponinas da soja, em especial aquelas do grupo DDMP, torna difícil a caracterização
autêntica destes compostos na matriz. Geralmente a extração de saponinas envolve a
utilização de etanol ou metanol aquoso sob agitação contínua a temperatura ambiente (Zhang
& Popovich, 2009).
Em geral, a combinação de etanol ou metanol com água produz extratos contendo
quantidades consideráveis de isoflavonas e saponinas, permitindo assim o uso de um
procedimento simplificado de extração de ambos os compostos da soja e seus derivados. O
uso de misturas ternárias também parece facilitar a extração de diferentes classes de
compostos, tendo em vista a utilização de solventes com polaridades diferentes (Visht et al.,
2012). A Tabela 4 mostra os principais solventes utilizados na extração de compostos
bioativos e as principais classes extraídas.
Tabela 4. Exemplo de alguns solventes e os principais compostos extraídos por eles
Água Etanol Metanol Clorofórmio Diclorometano Éter Acetona
Antocianinas Taninos Antocianinas Terpenóides Terpenóides Alcalóides Flavonoides
Taninos Polifenóis Terpenóides Flavonoides Terpenóides
Saponinas Flavonol Saponinas
Terpenóides Terpenóides Taninos
Alcalóides Flavonas
Polifenóis
Fonte: Azmir et al., 2013
Após o procedimento de extração, geralmente realiza-se a análise quantitativa ou
qualitativa dos compostos de interesse nos extratos obtidos. Diversos métodos vem sendo
propostos na literatura. O crescimento na busca e pesquisa de novos compostos vem
aumentando o desafio no desenvolvimento de metodologias de análise. Cada vez mais
buscam-se métodos precisos e que forneçam respostas mais rápidas. Os métodos mais
utilizados podem sem classificados de maneira simples em métodos espectrofotométricos e
métodos cromatográficos (Figura 7) (Wijngaard, Trifunovic & Bongers, 2013).
35
Figura 7. Esquema representativo das principais etapas para o estudo de fitoquímicos em
alimentos.
Os métodos espectrofotométricos são baseados na habilidade dos fitoquímicos em
absorver luz na região ultravioleta (UV) ou visível (Vis) do espectro eletromagnético ou em
formar cromóforos após reação com certos reagentes, sendo a quantificação baseada na lei de
Lambert-Beer. Esses métodos não necessitam da separação individual dos compostos no
extrato e a quantificação é expressa como a quantidade total de um grupo de compostos
similares. Geralmente são métodos rápidos, simples e de baixo custo. Os resultados são
menos precisos e não possuem especificidade para compostos individuais (Stevanato, Fabris
& Momo, 2004).
Os métodos cromatográficos são ferramentas poderosas na análise de fitoquímicos.
Além da grande versatilidade, são bastante precisos e permitem a identificação individual de
compostos. Os métodos convencionais envolvem o uso de cromatografia planar, que
geralmente tem propósito analítico, e de coluna aberta, que é utilizada principalmente no
isolamento e purificação de compostos. Já os métodos instrumentais são mais versáteis e
permitem a análise altamente específica de diversos compostos. Envolvem a cromatografia
líquida e gasosa e suas diversas variações e permitem a associação de diversos tipos de
detectores para a identificação dos compostos de interesse (Wijngaard, Trifunovic & Bongers,
2013).
36
Para a análise de compostos fenólicos em alimentos, ambas as técnicas são utilizadas.
Um dos métodos mais amplamente difundidos é aquele que utiliza o reagente de Folin
Ciocalteu. Baseia-se no processo de redução química envolvendo os elementos molibdênio e
tungstênio. Os produtos desta reação na presença de compostos fenólicos possuem uma
coloração azul com espectro de absorção em torno de 760 nm. A reação não é específica para
compostos fenólicos, podendo sofrer interferências pelo ácido ascórbico, aminas e açúcares.
O ácido gálico usualmente é utilizado como composto padrão para a reação e os resultados
expressos em equivalentes de ácido gálico (Khoddami, Wilkes & Roberts, 2013).
Métodos colorimétricos para a quantificação de flavonoides também são bastante
utilizados. Estes geralmente baseiam-se na reação de complexação com o cloreto de alumínio
(AlCl3), levando a formação de uma coloração amarelada que tem espectro de absorção em
torno de 420 nm. Uma das limitações é a reação desigual dentre as diversas classes de
flavonoides, o que pode levar a erros na interpretação dos resultados. Geralmente quercetina e
catequina são utilizadas como padrão para a reação (Chang et al., 2002; Denni & Mammen,
2012).
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é uma das técnicas preferidas para a
separação e quantificação de compostos fenólicos. Isso se dá pela possibilidade de análise
simultânea de todos os compostos de interesse e seus produtos. Geralmente é utilizada a
cromatografia de fase reversa, utilizando-se coluna C18. Acetonitrila e metanol são os
solventes mais utilizados na eluição dos compostos, sendo aplicados de forma isocrática ou
com gradiente de eluição (Dai & Mumper, 2010; Khoddami, Wilkes & Roberts, 2013).
A existência de dupla ligação conjugada e anel aromático nas estruturas dos
compostos fenólicos permite que estes compostos exibam absorção na região UV/Vis. Por
isso, a maioria dos métodos de detecção aclopados a CLAE exploram esta propriedade, sendo
os detectores UV/Vis e DAD (detector de arranjo de diodos) bastante utilizados. O DAD é o
mais usado, tendo em vista a possibilidade do registro de espectro de absorção dos compostos
analisados. A detecção eletroquímica, por ressonância magnética nuclear e por espectrometria
de massas (EM) também é bastante utilizada, geralmente acoplada a detecção UV (Dai e
Mumper, 2010).
A CLAE-DAD de fase reversa também vem sendo bastante utilizada na análise de
isoflavonas, sendo considerado o método ideal de análise destes compostos há anos.
37
Geralmente utiliza-se também a detecção por EM para aumentar a sensibilidade e seletividade
da técnica. A fase móvel mais utilizada é composta por água acidificada e acetonitrila. A
eletroforese capilar acoplada a detector eletroquímico também vem sendo utilizada na
detecção de isoflavonas na soja e seus derivados (Dentith & Lockwood, 2008; Griffith &
Collison, 2001; Rostagno et al., 2009).
A quantificação de saponinas totais em alimentos é difícil devido à ampla variedade
estrutural e comportamento químico destes compostos. Assim como para os compostos
fenólicos, alguns métodos colorimétricos também são utilizados para a determinação de
saponinas em alimentos. O mais difundido baseia-se na complexação com a vanilina, que na
presença de ácido forma um composto colorido. A desvantagem é que esse método não é
específico, podendo haver reação com fitoesteróis e compostos como os flavonoides, que
geralmente estão presentes nos extratos utilizados para a análise na soja (Oakenfull, 1981; Lai
et al., 2013).
A CLAE de fase reversa também é uma das mais utilizadas na determinação de
saponinas em alimentos. Vários detectores vem sendo utilizados, como o UV, DAD e
espalhamento de luz. A absorção máxima de saponinas geralmente se dá em 205 nm, sendo
que algumas conjugadas ao DDMP podem absorver em torno de 295 nm. A identificação
geralmente se dá por EM, aumentando a precisão do método (Zhang & Popovich, 2009).
Muitos autores vem utilizando a detecção simultânea de saponinas e isoflavonas na soja e
seus derivados (Lu et al., 2013; Fonseca et al., 2014), o que permite maior agilidade nas
rotinas de análise
2.3.Bioatividade da soja
Os efeitos dos fitoquímicos na saúde humana estão relacionados com suas ações no
organismo, que no geral são: (1) substrato em reações bioquímicas; (2) cofatores de reações
enzimáticas; (3) inibidores de reações enzimáticas; (4) ligação e eliminação de constituintes
indesejáveis no intestino; (5) agonistas ou antagonistas de receptores celulares; (6)
sequestrante de espécies químicas reativas ou tóxicas; (7) componentes que melhoram a
absorção ou a estabilidade de nutrientes essenciais; (8) fatores de crescimento para bactérias
benéficas no trato gastrointestinal; (9) substrato de fermentação para bactérias benéficas no
trato gastrointestinal e (10) inibição seletiva de bactérias deletérias no intestino (Ricon-León,
38
2003). Tais ações dependem da absorção e transformação destes compostos no organismo
humano (Acamovic & Brooker, 2005).
A avaliação da bioatividade destes compostos geralmente é o passo seguinte a sua
identificação e caracterização em matrizes alimentares. Isso já vem sendo bastante realizado
com a soja e seus derivados, onde se evidencia que seu consumo está relacionado com o
menor risco de desenvolvimento de diversas doenças. Dentre os principais componentes que
potencialmente são responsáveis por esses efeitos biológicos, podemos citar os fitoquímicos
(ácido fítico, esteróis, saponinas, isoflavonas e lignanas), a proteína e alguns lipídios. A
Tabela 5 resume os principais componentes da soja e seus potenciais efeitos benéficos à
saúde (Sugano, 2006; Kang et al., 2010).
Os compostos fenólicos estão envolvidos na prevenção de diversas doenças crônico-
degenerativas. Esse efeito está ligado a diversas funções que estes podem exercer no
organismo. Estudos vêm relatando a possível atuação na melhora da função endotelial,
sinalização celular e propriedades anti-inflamatórias. Além disso, alguns trabalhos
demonstram a ação protetora no ambiente intestinal de compostos fenólicos não digeridos
associados às fibras alimentares (Gani et al., 2012).
Os compostos fenólicos também apresentam atividade antioxidante in vitro. A
principal característica que leva os compostos fenólicos a atividade antioxidante é sua
habilidade em sequestrar radicais livres, doando átomos de hidrogênio ou elétrons, ou pelo
poder de quelar cátions metálicos. Diversas características químicas permitem esse fato. A
presença de grupos hidroxila, por exemplo, nos ácidos fenólicos determina o poder
antioxidante da molécula, de modo que quanto maior o número de hidroxilas maior será a
atividade antioxidante apresentada pelo composto. O ácido gálico é um composto
trihidroxilado e apresenta uma das maiores atividades antioxidantes dentre os ácidos fenólicos
(Balasundram, Sundram & Samman, 2006).
39
Tabela 5. Principais componentes da soja e seus efeitos na saúde humana.
Componente Efeitos
Proteína Hipocolesterolêmica, antiaterogênica, redução da gordura
corporal
Peptídeos bioativos Rápida absorção, redução de gordura corporal, anticâncer
Lectinas Anticâncer, defesa corporal
Inibidores de tripsina Anticâncer
Fibra dietética Anticâncer de cólon, regula metabolismo lipídico,
regulação trânsito intestinal
Oligossacarídeos Fator bifidogênico, melhora funções digestórias
Fitato Regulação do metabolismo do colesterol, anticâncer,
interfere na absorção de minerais
Saponinas Regulação do metabolismo lipídico, anticâncer
Isoflavonas Ação estrogênica, prevenção de osteoporose, antioxidante,
anticâncer
Ácido linoleico Ácido graxo essencial, hipocolesterolêmicos
Ácido linolênico Ácido graxo essencial, hipotrigliceridêmico, melhora
função cardiovascular
Lecitina Melhora metabolismo lipídico, manutenção de funções
neurais
Tocoferóis Antioxidante, prevenção de doenças cardiovasculares
Esteróis Hipocolesterolêmico, ação anticâncer de próstata
Vitamina K Coagulação sanguínea, prevenção de osteoporose
Mg Mineral essencial, prevenção de desordens cardiovasculares
Adaptado de Sugano (2006).
A complexidade da molécula dos flavonoides torna o mecanismo de sequestro de
radicais livres mais complicado neste grupo. Em geral, alguns fatores que determinam essa
atividade nos flavonoides são o grau de hidroxilação e posição da hidroxila no anel B, a
presença de grupamento pirogalol na molécula e a presença de dupla ligação entre os
carbonos C2 e C3. A substituição do grupamento hidroxila por metoxilas no anel B altera o
40
potencial redox da molécula, afetando sua atividade antioxidante (Pietta, 2000; Seeram &
Nair, 2002).
Dentre as isoflavonas, a molécula de genisteína possui maior número de grupos
hidroxila, o que pode ser responsável pela sua maior atividade em ensaios de capacidade
antioxidante quando comparada às outras isoflavonas da soja. Esse também é um dos fatos
que explica a maior atividade das isoflavonas agliconas em geral quando comparadas as suas
formas glicosiladas. O fato de as isoflavonas não apresentarem grupamento cetônico diminui
sua habilidade em quelar íons metálicos. Apesar disto, sugere-se que o efeito sinérgico da
mistura de diversos componentes com atividade antioxidante no alimento seja mais eficiente
do que o de um composto isolado (Kao & Chen, 2006).
Com relação às isoflavonas, seu consumo tem sido associado a múltiplos efeitos
benéficos em diversas doenças crônicas e condições patológicas, incluindo certos tipos de
câncer, doenças cardiovasculares, função óssea e prevenção da obesidade (Wu & Kang,
2010). Muitos dos efeitos à saúde relacionados as isoflavonas inicialmente foram relacionados
a sua atividade estrogênica. A estrutura molecular de seu principal metabólito no organismo, o
equol, é similar ao hormônio estradiol (Figura 8). Esse fato permite às isoflavonas a ligação
às isoformas α e β do receptor de estrogênio, sendo que a afinidade pelo receptor β é 20 vezes
maior quando comparada ao α. Apesar disso, comparadas ao estradiol, as isoflavonas
possuem afinidade 100 vezes menor com os receptores de estrogênio (Wu & Kang, 2010).
Figura 8. Semelhança estrutural entre o estradiol
(estrogênio) e o equol, um metabólito das isoflavonas
no organismo humano.
Esta atividade estrogênica pode estar relacionada à menor incidência de certos tipos de
câncer hormônio-depenentes em países asiáticos (Ganry, 2005). A competição pelo sítio de
41
ação estrogênico no organismo pode levar à prevenção da osteoporose e de câncer de mama e
próstata. Entretanto, os estudos ainda são controversos, mostrando que muitas vezes as
isoflavonas foram capazes de promover a formação do câncer de mama (Raghuveer &
Tandon, 2009).
Outro mecanismo de ação das isoflavonas, em especial a genisteína, sugere que esta
haja como inibidor da proteína tirosina quinase (PTK). Isso tem demonstrado que as
isoflavonas afetam diversas vias de sinalização intracelular. Também é relatada a interação
com receptores ativados por proliferador de peroxissomo (PPAR), que funcionam como
fatores de transcrição (Wu & Kang, 2010).
Diversos efeitos à saúde são relacionados às saponinas da soja, incluindo atividade
anticâncer de cólon, fígado e mama, efeito hipocolesterolêmico e cardioprotetor, atividade
antiviral, ação hepatoprotetora e atividade antioxidante. Esses efeitos ocorrem por diferentes
mecanismos e dependem principalmente da estrutura química de cada saponina. A atividade
antioxidante, por exemplo, é atribuída exclusivamente às saponinas do grupo B conjugadas ao
DDMP. Neste caso, as saponinas são responsáveis por prevenir a peroxidação lipídica ou
degeneração do DNA e de proteínas por ataque de radicais livres. A sua ligação ao colesterol
previne a oxidação do mesmo no cólon e seus possíveis danos oxidativos (Kang et al., 2010;
Shi et al., 2004).
Ao contrário do que se tem relatado, alguns estudos associam a ingestão da soja e seus
derivados a algumas desordens como aumento da incidência do câncer de bexiga, problemas
tireoideanos, hiperplasia de células mamárias e demência. Muitas destas evidências foram
observadas em estudos epidemiológicos que concluíram que o consumo de soja contribuiu
significativamente para estes resultados. Além disso, muito tem se falado sobre os potenciais
efeitos adversos da ingestão de fórmulas infantis a base de soja em crianças, devido à precoce
exposição aos fitoestrógenos presentes neste alimento (Fang et al., 2004).
3. Processamento e consumo da soja
A soja é parte da cultura asiática há diversos milênios. Seu consumo nestes países se
dá através do cozimento do grão ou do processamento do mesmo em diversos derivados.
Durante seu cultivo, em especial na China, ela foi transformada em diversos tipos de
alimentos e, com o passar dos anos, os outros países, como a Coréia e o Japão, introduziram
42
em sua cultura o modo de preparo dos chineses e começaram a criar também suas próprias
formas de consumir a soja (Liu, 2004; Salgado & Donado-Pestana, 2011).
Os produtos tradicionais a base de soja originaram-se da China e de outros países do
extremo oriente. Quase todos os produtos tradicionais são feitos a partir do grão integral. Eles
podem ser classificados em fermentados e não fermentados. Os não fermentados incluem o
extrato hidrossolúvel de soja (conhecido como “leite” de soja), tofu, broto de soja (grãos
germinados), yuba (nata de soja) e outros. Os fermentados incluem molho de soja (molho
shoyu), miso (pasta de soja), tempeh e natto. Estes produtos apesar de bastante populares na
Ásia, ainda não são muito consumidos pela população ocidental (Liu, 2004).
Estima-se que a ingestão de soja e seus derivados tradicionais nos países asiáticos seja
de aproximadamente 20 a 80 g diariamente, enquanto que nos países ocidentais esse consumo
é estimado em apenas 1 a 3 g por dia. Nos países ocidentais raramente a soja é consumida na
forma integral, sendo o grão utilizado usualmente para a extração do óleo, um dos mais
utilizados para cocção no mundo (Omoni e Aluko, 2005; Dixit et al, 2011).
A extração do óleo é realizada com solvente orgânico ou por prensagem, sendo a
extração com solvente a mais utilizada na indústria (Figura 9). No processo de extração com
solvente orgânico utiliza-se geralmente o hexano, que tem ponto de ebulição próximo a 70ºC.
Os flocos laminados são introduzidos no extrator após passarem por um processo de limpeza
e secagem. Ao final do processo obtém-se o óleo e um resíduo protéico, conhecido como
farelo ou torta de soja (Snyder & Wilson, 2003; Mandarino, 2001).
43
Figura 9. Fluxograma de processamento dos grãos de soja para a obtenção do
óleo de soja (Mandarino, 2001).
A torta de soja usualmente é destinada para a produção de ração animal e apenas uma
pequena porcentagem é processada em produtos proteicos de soja para consumo humano.
Geralmente esses produtos não são consumidos diretamente, mas incorporados como
ingredientes em vários tipos de alimentos incluindo bebidas, barras nutricionais, produtos de
panificação, cereais matinais, sopas, produtos cárneos, sobremesas, fórmulas infantis e
análogos do leite e da carne. Os principais ingredientes provenientes da torta são a farinha ou
farelo de soja, concentrado e isolado proteico e proteína texturizada de soja (Tabela 6) (Boye
& Ribereau, 2011; Liu, 2004).
44
Tabela 6. Principais ingredientes proteicos obtidos a partir da torta de soja e seu uso na
indústria alimentícia (Seibel e Beléia, 2009; Liu, 2004)
Produto Obtenção a partir da torta Principal uso
Farelo Moagem. Pode ser utilizado processo
de torra para inativação de enzimas
Produtos de
panificação
Concentrado protéico Desnaturação e precipitação com
solução alcoólica ou de ácido diluído
(pH 4,5)
Fortificação de
produtos e análogos da
carne
Isolado protéico Extração alcalina (pH 7-10) seguida
de precipitação ácida (pH 4,5)
Sopas, base de molhos,
bebidas, fórmulas
infantis, análogos do
leite e carne
Proteína texturizada Extrusão termoplástica Análogos da carne
Esses ingredientes provenientes da torta não agregam somente conteúdo proteico ao
alimento, mas também possuem diversas propriedades funcionais. Essas propriedades
incluem solubilidade, absorção e ligação de água, controle da viscosidade, gelatinização,
coesão, adesão, elasticidade, emulsificação, absorção ou repulsão de gordura, efeito
flavorizante, formação de espuma e controle da coloração (Liu & Limpert, 2004).
Além do elevado conteúdo proteico, tem-se mostrado que a torta também apresenta
quantidades significativas de componentes funcionais, como isoflavonas e saponinas.
Portanto, seria de grande vantagem para a indústria alimentícia, em especial a de alimentos
funcionais, a incorporação destes componentes funcionais nos alimentos através da torta de
soja. Por ser um co-produto da indústria do óleo de soja, essa matéria prima também possui a
vantagem do baixo custo (Wang et al., 2009).
Além da aplicação tecnológica, a utilização desta matéria prima para estudos de
bioatividade destes compostos também se torna uma alternativa proveitosa para este resíduo.
Kao e colaboradores (2005) isolaram a partir da torta diversas frações de isoflavonas por
cromatografia. Foi demonstrado que as frações contendo isoflavonas isoladas a partir da torta
possuíram maior atividade antioxidante in vitro do que os padrões analíticos comerciais (Kao
et al., 2005; Chiu et al., 2009). Esse fato fortalece a hipótese do uso de extratos contendo
compostos bioativos da torta para estudos de bioatividade em modelos humanos.
45
Objetivo Geral
46
O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar quimicamente a torta de soja,
além de avaliar a estabilidade de compostos bioativos em extratos da torta e realizar o
isolamento por CLAE semi-preparativa de isoflavonas e saponinas desta matriz.
Os resultados desse trabalho foram dividido em dois capítulos, um abordando a
caracterização e estabilidade dos compostos bioativos (Capítulo 2) e outro abordando o
isolamento de isoflavonas e saponinas por CLAE semi-preparativa (Capítulo 3).
47
Capítulo 2
Characterization and stability of bioactive
compounds from soybean cake
48
1. Introduction
Differently from Asian countries, soybean-based foods are not widely consumed in
Western countries, where soybean is most commonly crushed and the oil is extracted and
refined into food-grade oil for frying and cooking. The co-product from this process is a high-
protein meal, known as soybean cake, which is mainly used as animal feed. It may also be
used for the production of soy protein isolates and concentrates, which in turn are used as
ingredients in meat and bakery products, beverages, soups, infant formulas and other food
products (Liu, 2004), thus aggregating economic value to this residue.
In addition to its content of high-quality protein, soybean cake contains high contents
of bioactive compounds, mainly isoflavones (Kao & Chen, 2006; Kao et al., 2008) and
soyasaponins (Kao et al., 2007; Wang et al., 2009). Isoflavones are flavonoid compounds
virtually not presented in other legumes and the most important class of phenolic compounds
in soybeans. Soyasaponins are triterpene glycosides that differ from each other by the type of
aglycones and the type of sugar and its attachment position. They are classified in two major
groups, A and B, but group E soyasaponins may also be present due to photo-oxidation of
group B soyasaponins (Kang et al., 2010). These bioactive compounds from soybeans and its
products are associated with lower prevalence of a number of chronic diseases, including
cardiovascular diseases and certain types of cancer (Kang et al., 2010).
Moreover, soybean cake may be used as a source of various bioactive compounds for
metabolic and bioactivity studies. However, papers have focused on soybean cake as a source
of isoflavones (Kao et al., 2007; Wang et al., 2009), while soyasaponins are usually
overlooked, even though this class of bioactive compounds may occur in higher amounts than
isoflavones (Kao & Chen, 2006).
Bioactivity studies investigating the chronic effects of isoflavones and soyasaponins
isolated from soybean cake in animals and humans should consider the stability of these
compounds during the whole intervention period, since it is known that isoflavones and
soyasaponins contents and/or profile may be affected by exposure to high temperatures,
oxygen and UV-light (Rostagno et al., 2005). However, to the best of our knowledge, the
stability of bioactive compounds in soybean cake extracts has not been investigated.
Therefore, the aim of this work was to chemically characterize soybean cake samples,
with an emphasis on isoflavones and soyasaponins, in order to promote its use as a food
ingredient and thus widen high added-value applications of this residue. Additionally, we
aimed to investigate the stability of isoflavones and soyasaponins in dry extracts obtained
49
from soybean cake under different storage conditions, for future use in long-term bioactivity
studies.
2. Materials and Methods
2.1. Standards and chemicals
Folin-Ciocalteau reagent, gallic acid, 2,2’-azino-bis (2-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic
acid) diammonium salt (ABTS), 2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine (TPTZ), potassium persulfate,
fluorescein, 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) and (±)-6-
hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) were purchased from
Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Sodium carbonate, vanillin and aluminum
chloride were purchased from Spectrum Chemical Manufacturing Corp. (Gardena, CA). Iron
(II) sulfate was purchased from Merck KGaA (Darmstadt, Germany). Daidzin, glycitin,
genistin, daidzein, glycitein, genistein, soyasapogenol B, soyasaponin B-I, soyasaponin B-II
and soyasaponin B-III standards were purchased from Apin Chemicals Limited® (Abingdon,
UK). All solvents were HPLC grade from Tedia (Fairfield, OH). HPLC grade water (Milli-Q
system, Millipore, Bedford, MA) was used throughout the experiments.
2.2. Samples
Two sets of samples comprised of soybeans and soybean cake were investigated. In
both sets, soybeans and soybean cake were from the same batch. One set was donated by a
soybean oil crush industry, while the other was produced in our laboratory using commercial
soybeans purchased in local markets.
Lab-scale soybean cake production was analog to industrial processing, with
adaptations. Firstly, seeds were cracked and the hulls were separated using an air stream.
Dehulled soybeans were wet and incubated at 60 ºC for 1 h in an oven. The sample was
occasionally water-sprayed to keep the beans wet. The seeds were then ground in a domestic
processor and dried for 5 hours at 60 ºC in an oven. After drying, the sample was additionally
ground in an analytical mill (IKA A11 basic S1) in order to maximize oil extraction. 20 g of
sample was placed in a cellulose cartridge (33x94 mm) and the extraction procedure was
conducted in a Soxhlet extractor for 7 hours using n-hexane. The cake was left in a fume hood
until dry and stored at room temperature.
50
2.3. Proximate composition
Moisture, ash, proteins and lipids were determined by the official methods of the
AOAC. The conversion factor 6.25 for protein was used. Total carbohydrates were
determined by difference. Each sample was analyzed in triplicate.
2.4. Bioactive compounds analysis
Soybean and soybean cake samples were extracted with a ternary solvent mixture,
composed of water:ethanol:ethyl acetate (40:40:20), as described by Ramos (2013). Briefly, 2
g of sample were extracted with 10 mL of the ternary mixture in a vortex for 2 min. After
centrifugation for 10 min at 3000 rpm, the supernatant was collected in a 25 mL volumetric
flask and the residue was re-extracted twice as described above. The extraction procedure
for each sample was conducted in duplicate. These extracts were analyzed for the
determination of phenolic compounds, flavonoids and saponins by spectrophotometric assays,
and isoflavones and soyasaponins by LC-DAD-MS.
2.4.1. Phenolic compounds
Total phenolic content was determined by the Folin-Ciocalteau reagent assay, as
described by Singleton et al. (1999). 200 µL of extract were mixed with 1400 µL of Milli-Q
water, 100 µL of Folin-Ciocalteau reagent and 300 µL of 20% Na2CO3 solution. After
homogenization the mixture was allowed to stand at 40 ºC for 30 min. The absorbance of the
solution was measured at 765 nm using the Vitor3 1420 multilabel counter (PerkinElmer,
Turku, Finland). Quantification was performed using a gallic acid calibration curve. Results
were expressed as mg of gallic acid equivalents per g on a dry weight basis (DW) (mg
GAE/g). Each sample was analyzed in triplicate.
2.4.2. Flavonoids
Total flavonoid content was determined by the spectrophotometric assay described by
Taie et al. (2008). 500 µL of extract were mixed with 500 µL of 2% AlCl3. After 1 h at room
temperature, the absorbance of the mixture was measured at 405 nm using the Vitor3 1420
multilabel counter (PerkinElmer, Turku, Finland). Quantification was performed using a
genistein calibration curve. Results were expressed as mg of genistein equivalents per g DW
(mg GE/g). Each sample was analyzed in triplicate.
51
2.4.3. Saponins
Total saponin content was determined by the vanillin-sulphuric acid assay, as
described by Shiau et al. (2009). 100 µL of extract were mixed with 100 µL of 10% vanilin
solution in ethanol. The mixture was cooled in an ice bath for 5 min and then 1000 µL of 72%
sulfuric acid were added. After incubation at 60 ºC for 10 min and cooling for another 5 min
in ice, the absorbance of the solution was measured at 535 nm using the Vitor3 1420
multilabel counter (PerkinElmer, Turku, Finland). Quantification was performed using a
calibration curve prepared with a commercial mixture of soyasaponins. Results were
expressed as mg of total saponins per g DW. Each sample was analyzed in triplicate.
2.4.4. Isoflavones and soyasaponins
Isoflavones and soyasaponins were analyzed by LC-DAD-MS as described by
Fonseca et al. (2014). The LC system (Shimadzu, Kyoto, Japan) comprised a LC-10ADvp
quaternary pump, a CTO-10ASvp column oven, an 8125 manual injector (Rheodyne) with a
20 L loop and a SPD-M10Avp diode array detector (DAD). This LC system was coupled to
a LC–MS 2010 mass spectrometer (MS) (Shimadzu, Kyoto, Japan) equipped with an
electrospray ion source. Chromatographic separations were achieved using a Kromasil®
C18
column (150 × 2.1 mm, 5 µm, 100 Å, AkzoNobel, Bohus, Sweden) maintained at a constant
temperature of 40 °C. The LC two-phase mobile system consisted of a gradient of water
(eluent A) and acetonitrile (eluent B), both added with 0.3% formic acid, with a constant flow
rate of 0.3 mL/min. Prior to injection, the column was equilibrated with 15% B. After
injection of sample, this proportion was modified to 23% B in 1 min, kept constant until 23
min and increased to 50% B until the end of the 35 min run. Between injections, 20 min
intervals were used to re-equilibrate the column with 15% B. Prior to injection extracts were
filtered through a 0,45 µm PTFE filter unit.
Isoflavones and soyasaponins were monitored by DAD between 190 to 370 nm and
by MS using positive ionization, with a nebulizer gas (N2) flow of 3.0 L/min, operated in the
single ion monitoring (SIM) mode to detect pseudomolecular ions. Identification of
compounds was performed by comparison with retention time and molecular weight of the
respective standard. Identification of compounds for which there were no commercial
standards available was performed by the pseudomolecular ion in the MS.
Quantification was performed by external standardization. Isoflavones were quantified
by their DAD peak areas at 250 nm. The contents of malonylglucosilated and
52
acetylglucosilated isoflavones were determined from the calibration curve of the
corresponding β-glucosylated isoflavone, correcting for differences in molecular weight.
Soyasaponins (B-I, B-II and B-III) were quantified by their DAD peak areas at 195 nm.
Soyasaponins B-II and B-III were quantified together, as it was not possible to
chromatographically separate these compounds. Data were acquired by LCMS solution
software (Shimadzu Corp., version 2.00, 2000). Results were expressed as mg of compound
per g DW. Each sample was analyzed in duplicate.
2.5. Antioxidant activity
The antioxidant capacity of the extracts was determined by FRAP (Ferric Reducing
Ability of Plasma) and TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) assays.
The FRAP assay was performed according to Benzie & Strain (1996) with slight
modifications. FRAP reagent was prepared by mixing 2 mL of 10mM TPTZ solution in 6N
HCl with 2 mL of 20 mM FeCl3 solution and 20 mL of 300 mM acetate buffer (pH 3,6) and
warmed to 37 ºC prior to analysis. 20 µL of extract were pipetted into a 96-well microplate,
which was placed in the Vitor3 1420 multilabel counter (PerkinElmer, Turku, Finland) with
automatic injector. 180 µL of FRAP reagent were automatically dispensed into each well, the
plate was shaken and allowed to stand at 37 ºC for 6 min. The absorbance was then read at
595 nm. Quantification was performed using a calibration curve prepared with FeSO4. Results
were expressed as µmol of Fe+2
equivalents per g DW. Each sample was analyzed in
triplicate.
The TEAC assay was performed according to Re et al. (1999) with slight
modifications. The ABTS radical cation stock solution was generated by reacting K2S2O8 and
ABTS for 12 to 16 h prior to use. ABTS radical cation stock solution was diluted (1:50) to an
absorbance of 0,70 ± 0,02 at 720 nm. 10 µL of extract were pipetted into a 96-well
microplate, which was placed in the Vitor3 1420 multilabel counter (PerkinElmer, Turku,
Finland) with automatic injector. 190 µL of ABTS radical cation solution were automatically
dispensed into each well, the plate was shaken and allowed to stand at 37 ºC for 6 min.
Sample absorbance was read at 720 nm and subtracted from solvent blank absorbance.
Quantification was performed using a calibration curve prepared with Trolox. Results were
expressed as µmol of Trolox equivalents per g DW. Each sample was analyzed in triplicate.
53
2.6. Stability of bioactive compounds from soybean cake extracts
For the stability test both cakes were subjected to two different extractions using as
solvent either a ternary mixture of water:ethanol:ethyl acetate (40:40:20) or ethanol. The
former solvent was selected due to its high efficiency in extracting soy bioactive compounds
(Ramos, 2013), while the latter is usually employed to extract isoflavones from soy products.
20 g of soybean cake samples were extracted with 100 mL of solvent in an orbital shaker
(IKA KS 4000i control) at 500 rpm. Extraction time was 30 min and 60 min for the ternary
solvent mixture and ethanol, respectively. After centrifugation for 15 min at 3000 rpm, the
supernatant was collected and the residue was re-extracted twice as described above. The
extracts were concentrated in a rotary vacuum evaporator (Büchi V-700) until the solvent was
removed. The concentrated extracts were freeze dried (Labconco Freezone 2.5) for 24 h and
stored in three different conditions: freezer (-20ºC); room temperature (protected or
unprotected from light). Total phenolic compounds, total flavonoids, total saponins,
antioxidant capacity (FRAP and TEAC) and isoflavones and soyasaponins by LC-DAD-MS
were analyzed as described above after 15, 30, 60, 90, 120 and 180 days of storage.
2.7. Statistical analysis
Data are expressed as mean ± standard deviation. Analysis of variance (one-way
ANOVA) followed by Tukey’s multiple comparison post-test was used for comparing means.
Statistical analyses were performed using GraphPad Prism software for Windows (version
5.04). Differences were considered significant when p < 0.05.
3. Results and discussion
3.1.Proximate composition
Experimental and industrial soybean samples showed equivalent proximate
composition (Figure 1A), on average 23.2, 33.7, 5.4 and 37.8 g/100 g DW for lipids, proteins,
ash and carbohydrate, respectively, which are in accordance with typical values for soybeans
(McCann et al. 2005). Soybean cake samples also showed equivalent proximate composition,
indicating that the conditions used in our laboratory for soybean oil extraction were similar to
those employed in the industry. Soybean cake samples presented on average 1.8, 48.2, 7.0 and
43.0 g/100 g DW for lipids, proteins, ash and carbohydrate, respectively, which are in
accordance with previous reports (Grieshop et al., 2003). The high protein content of these
54
cakes favors their use as ingredients in many food products, such as infant formulas, flours,
textured fibers, and protein isolates and concentrates. Although soybean protein is considered
to be deficient in sulfur aminoacids such as methionine, it contains all the essential
aminoacids for humans. Moreover, the protein digestibility–corrected amino acid score of
soybean protein is close to 1, equivalent in quality to animal protein, which favors its use to
replace it (Liu, 2004).
Figure 1. Proximate composition (A), contents of total phenolics (TP), flavonoids (TF) and
saponins (TS) (B), and antioxidant capacity (C) in soybean and soybean cake experimental
and industrial samples. Values expressed as mean ± standard deviation (n = 3); different
superscript letters indicates significant difference (ANOVA, Tukey’s post-test; p < 0.05);
GAE = gallic acid equivalents; GE = genistein equivalents; TE = Trolox equivalents.
3.2.Total phenolics, flavonoids, saponins and antioxidant activity
Total phenolics (TP), total flavonoids (TF) and total saponins (TS) contents were 57%,
29% and 32%, higher, respectively, in soybean cake than soybeans samples (Figure 1B).
These higher contents are due to the extraction of lipids, which concentrates the functional
components naturally present in the protein fraction.
Similarly to proximate composition, the contents of bioactive compounds analyzed by
spectrophotometric assays in both soybean and soybean cake samples were equivalent, with
A
B C
55
the exception of TP. While industrial soybeans showed a 12% higher TP content than
commercial soybeans, the industrial cake showed a 19% lower TP content than that obtained
in our laboratory (Figure 1B). This behavior may be related to differences in stability of
phenolic compounds present in these soybean samples or to other compounds that may
interfere with the Folin-Ciocalteau reagent assay, such as thiols, proteins, peptides and
vitamins (Dai & Mumper, 2010). TP values in these samples correspond mainly to
isoflavones, which are the major phenolics in soybean products (Sakthivelu et al., 2008).
Differences between soybean samples might result from minor phenolics, such as phenolic
acids, mainly chlorogenic and trans-cinnamic acids (Xu & Chang, 2008) that are also present.
Moreover, phenolics composition may vary with cultivar, environmental factors and
geographical sowing region (Balisteiro et al., 2013).
Several compounds have been used as standards to estimate TF content in soybean
samples. In the present study TF was expressed as genistein equivalents, as this is the major
flavonoid present in soybean products. Although flavonoid content and profile may also be
affected by cultivar and growth conditions (Kang et al., 2010), no statistical difference was
found between soybean samples (on average 0.88 mg/g) and between soybean cake samples
(on average 1.11 mg/g) (Figure 1B). Similar values were reported by Malenčić, Popović, &
Miladinović (2007), ranging from 0.32 to 0.61 mg of rutin equivalents/g for different soybean
cultivars. In contrast, Taie et al. (2008) reported a much higher TF content (6.81 mg of
quercetin equivalents per g) for inorganic fertilized soybeans. These differences are probably
due to the specific absorptivity of chromophores generated by reacting these standards with
AlCl3 (Dai & Mumper, 2010).
The average TS content for soybean samples (27.4 mg/g) (Figure 1B) were higher
than those reported by Xu & Chang (2008) (20.7 mg/g), but similar to those reported by the
same group in a later study (25.0 mg/g) (Xu & Chang, 2011). It is worth noting that although
the vanillin-sulfuric acid method is very sensitive, the reaction is not specific for saponins and
colored products may be formed from phytosterols and other compounds like flavonoids
(Oakenfull, 1981). Nevertheless, this method is widely used for screening of saponins in food
samples.
The antioxidant capacity (AC) measured by both FRAP and TEAC assays were
equivalent between soybean samples and between soybean cake samples (Figure 1C).
Soybean samples showed, on average, FRAP and TEAC values of 7.2 µmol Fe+2
/g and 11.5
µmol Trolox/g, respectively. Soybean cake samples presented 42% and 63% higher FRAP
56
and TEAC values, respectively, than soybean samples, on average 10.3 µmol Fe+2
/g and 18.6
µmol Trolox/g. The FRAP values found in the present study for soybean samples were similar
to those reported by Xu and Chang (2008) for 28 different soybean cultivars grown in the
North Dakota-Minesota region, ranging from 8.5 to 13.4 µmol Fe+2
/g. Bolanho & Beléia
(2011) reported a higher TEAC value (7.4 µmol Trolox/g) for a soybean sample than those
found in the present study. In contrast, lower FRAP and TEAC values were reported in the
same study (Bolanho & Beleia, 2011) for a commercial defatted soybean flour sample (9.5
µmol Fe+2
/g and 9.2 µmol Trolox/g, respectively) in comparison to those found in the present
study for the soybean cake samples.
57
3.3.Isoflavones and soyasaponins by LC-DAD-MS
In the present study up to 12 isoflavones were found in soybean and soybean cake
samples (Table 1). Soybean cake samples showed a 49% higher total isoflavones contents (on
average 1.71 mg/g DW) than soybean samples (on average 1.15 mg/g DW).
Table 1. Isoflavones and soyasaponins contents (mg/g DW) in soybean and soybean cake
experimental and industrial samples1.
Compound Experimental Industrial
Soybean Soybean cake Soybean Soybean cake
Isoflavones
-glucosylated forms
Daidzin 0.34 ± 0.03a 0.06 ± 0.00
c 0.17 ± 0.01
b 0.34 ± 0.01
a
Glycitin 0.07 ± 0.01b 0.03 ± 0.00
c 0.08 ± 0.00
b 0.15 ± 0.01
a
Genistin 0.46 ± 0.03a 0.09 ± 0.00
c 0.26 ± 0.00
b 0.53 ± 0.02
a
Sub total 0.87 ± 0.08a 0.17 ± 0.01
c 0.51 ± 0.01
b 1.02 ± 0.04
a
Malonyl glucosylated forms
Daidzin 0.28 ± 0.02a 0.27 ± 0.00
a 0.27 ± 0.01
a 0.24 ± 0.01
a
Glycitin ND2 ND ND ND
Genistin 0.03 ± 0.00b 0.03 ± 0.00
b 0.05 ± 0.00
a 0.04 ± 0.00
a
Sub total 0.31 ± 0.03a 0.30 ± 0.00
a 0.32 ± 0.01
a 0.28 ± 0.02
a
Acetyl glucosylated forms
Daidzin 0.03 ± 0.00b 0.03 ± 0.00
b 0.02 ± 0.00
b 0.05 ± 0.00
a
Glycitin ND ND ND 0.03 ± 0.00a
Genistin 0.03 ± 0.00b 0.01 ± 0.00
b 0.00 ± 0.00
b 0.21 ± 0.02
a
Sub total 0.06 ± 0.01b 0.03 ± 0.00
b 0.03 ± 0.00
b 0.28 ± 0.02
a
Aglycones
Daidzein 0.04 ± 0.00b 0.36 ± 0.01
a 0.05 ± 0.00
b 0.09 ± 0.01
c
Glycitein 0.01 ± 0.00d 0.36 ± 0.01
a 0.05 ± 0.00
c 0.09 ± 0.00
b
Genistein 0.02 ± 0.00c 0.37 ± 0.02
a 0.04 ± 0.00
c 0.08 ± 0.00
b
Sub total 0.07 ± 0.01c 1.09 ± 0.03
a 0.14 ± 0.00
c 0.26 ± 0.01
b
Total 1.31 ± 0.12b 1.60 ± 0.04
a 1.00 ± 0.03
b 1.84 ± 0.08
a
Soyasaponins
B-I 1.13 ± 0.06b 2.51 ± 0.11
a 1.42 ± 0.10
b 2.95 ± 0.16
a
B-II+BIII 0.46 ± 0.03d 0.78 ± 0.00
b 0.55 ± 0.01
c 0.91 ± 0.00
a
Sapogenol B ND ND ND ND
Total 1.60 ± 0.03c 3.29 ± 0.11
b 1.96 ± 0.11
c 3.86 ± 0.16
a
1Values expressed as mean ± standard deviation (n = 2); means in the same row with different superscript letters
are significantly different (ANOVA, Tukey’s post-test; p < 0.05). 2Not detected.
58
As observed for proximate composition and total flavonoids and saponins, there was
no difference between experimental and industrial soybean and soybean cake samples.
However, industrial processing led to a higher increase (84%) in total isoflavones contents
than laboratorial processing (22%). Isoflavones contents in soybean samples in the present
study are in accordance with literature data, which reports a wide range of concentration, from
0.6 to 3.3 mg/g (Wang & Murphy, 1994; Sakthivelu et al., 2008). The levels of the soy
isoflavones may vary among cultivars, are affected by genetic and environmental factors, and
are highly influenced by agricultural practices (Balisteiro et al., 2013). For soybean cakes, the
contents found in our samples were similar to those reported by Kao & Chen (2002), which
found up to 2.1 mg/g of total isoflavones in a soybean flour using different solvents and
supersonic or shaking extraction. Wu & Muir (2010) reported higher total isoflavones content
in a commercial soybean flour sample (3.0 mg/g) using a ternary mixture of methanol,
acetonitrile and water as solvent. Kao et al. (2008) also reported higher total isoflavones
contents (up to 3.3 mg/g) than those found in the present study for a soybean cake sample
subjected to supercritical carbon dioxide extraction at different pressures and temperatures.
Despite the equivalent total isoflavones contents between experimental and industrial
soybean cakes, LC-DAD-MS analysis revealed different profiles between these samples
(Figure 2). The industrial soybean cake sample presented a β-glucoside and aglycone
isoflavones profile similar to that of the corresponding soybean, representing 53% and 14%,
on average, of total isoflavones, respectively. In contrast, the experimental soybean cake
sample presented a malonyl and acetylglucoside isoflavones profile similar to that of the
corresponding soybean, representing 20% and 3%, on average, of total isoflavones,
respectively. While industrial processing of soybeans for oil production resulted in a 48%
decrease in the relative content of malonylglucoside isoflavones and a 5.3-fold increase in the
relative content of acetylglucoside forms, the experimental conditions used in our laboratory
led to a drastic reduction (84%) of β-glucoside isoflavones relative content and a 12.9-fold
increase in the relative content of the aglycone forms. It has already been reported that
isoflavones profile changes greatly depends on thermal processes employed during food
preparation, including cooking, baking, oven-drying and roasting (Kim & Lee, 2011). Low
moisture thermal processing was reported to cause the conversion of malonyl to
acetylglucoside isoflavones (Kim & Lee, 2011). Therefore, soybean cake roasting usually
applied after industrial oil extraction probably explains the isoflavone profile change observed
in the industrial soybean cake sample. In contrast, high moisture thermal processing leads to
59
hydrolysis of malonyl and β-glucosides isoflavones to aglycones due to the increase in the β-
glycosidase activity (Kim & Lee, 2011). This phenomenon may explain the observed shift in
isoflavone profile during the production of soybean cake under laboratorial conditions, as
soybeans were constantly water-sprayed during drying prior to oil extraction.
Figure 2. Isoflavones profile from soybean and soybean cake samples experimental and
industrial samples.
The experimental soybean cake sample, which is the richest in aglycone forms (1.09
mg/g) (Table 1), might be a more bioavailable source of isoflavones because these forms are
absorbed faster and in greater amounts than glucosides in human gastrointestinal tract (Kim &
Lee, 2011; Okabe et al., 2011). Even though industrial processing increased total isoflavones
contents to a higher extent, high moisture thermal processing, such as the procedure employed
in our laboratory, as well as fermentation processes of soybean cake (Okabe et al., 2011),
could be used to improve functional value of this co-product, broadening its use in food
products with high isoflavones bioavailability.
In the present study, we investigated the contents of three group B soyasaponins and
their respective aglycone, sapogenol B. Although the industrial and experimental soybean
samples showed equivalent soyasaponins contents (on average of 1.78 mg/g), the industrial
soybean cake sample presented a 17% higher content of these compounds than the
experimental one (Table 1). The major soyasaponin in all samples was soyasaponin B-I,
which corresponded to 72% of total soyasaponins in both soybean samples and to 76% in
60
both soybean cake samples. Soyasaponins B-II and B-III accounted together for the remainder
of soyasaponins content. Soyasapogenol B was not found in any sample.
Berhow et al. (2006) reported total soyasaponin contents ranging from 4.73 to 5.75
mg/g for soybeans and from 5.86 to 6.58 mg/g for defatted soy flours. As observed in the
present study, the major soyasaponin in all samples analyzed by Berhow et al. (2006) was
soyasaponin I. Although the contents reported by Berhow et al. (2006) were up to 2.2-fold
higher than those found in the present study, it should be noted that those authors analyzed 13
soyasaponins, including soyasaponin βg, which was the second most abundant soyasaponin in
their samples. Considering only the contents of the soyasaponins analyzed in the present study
(B-I, B-II and B-III), the contents found in our samples were up to 79% higher than those
reported by Berhow et al. (2006). Unfortunately, we could not analyze soyasaponin βg in our
samples due to the lack of a commercial standard.
3.4. Bioactive compounds stability
Stability of bioactive compounds and antioxidant capacity during storage of extracts at
-20 oC (freezer) and at room temperature (protected and unprotected from light) are depicted
in Figure 3. The initial (t = 0) and final (t = 180 days) contents of bioactive compounds and
antioxidant capacity as well as their relative change are presented in Table 2.
Ternary mixture extraction yield (on average 21.0%) was much higher than that
obtained with ethanol (on average 1.4%). Moreover, extraction solvent was the parameter
with the most prominent effect on bioactive compounds and antioxidant capacity stability. In
general, ethanolic extracts showed lower stability than those obtained with the ternary
mixture, independently of the sample (experimental or industrial) or the storage conditions.
While TP, TF and FRAP increased after 180 days of storage (8% to 47%) in extracts
obtained with the ternary mixture, corresponding ethanolic extracts presented a constant
behavior for TP and a decrease in TF and FRAP (10% to 56%) (Table 2). Although TS and
TEAC were unstable for most samples and conditions, a higher decrease (from 30% to 84%)
was observed for ethanolic extracts in comparison to those obtained with the ternary mixture
(from 14% to 53%) (Table 2).
Total isoflavones behaved similarly to TP, showing stability in ethanolic extracts
regardless of the sample and storage conditions. Ethanolic extracts obtained from the
experimental soybean cake sample stored at room temperature showed an average decrease of
27% in malonylglucoside isoflavones accompanied by an identical average increase in -
61
glucoside isoflavones. Ethanolic extracts obtained from the industrial soybean cake sample
stored in the same conditions also showed a decrease in malonylglucoside isoflavones (on
average 37%) (Table 2), but the corresponding increase in -glucoside forms was only
observed until 120 days and not at the end of the storage period. Similarly, Rostagno et al.
(2005) reported that during short term storage (7 days) of dry extracts obtained with
ethanol:water (50:50) malonyl forms were the most susceptible to degradation, yielding -
glucoside forms. In our study, isoflavones contents and profile of all ethanolic extracts stored
at -20 oC remained unchanged during the whole storage period (Table 2), corroborating with
Rostagno et al. (2005). These authors concluded that temperature was the single most
important factor to affect isoflavones stability and suggested that extracts should be kept at
temperatures lower than 10 oC and protected from light to avoid degradation. Nevertheless,
Xu et al. (2002) reported that -glucoside forms could resist to heat-induced decomposition at
temperatures near 100 oC in the absence of other factors, such as enzymes and only became
unstable when heating temperatures were increased above 135 °C.
Surprisingly, total isoflavones contents increased (38% to 76%) in extracts obtained
with the ternary mixture after 180 days of storage. This increase, however, did not
significantly modify the isoflavone profile of these extracts, as the concentration of all
isoflavones forms increased similarly (from 13% to 90%) (Table 2). It is known that
isoflavones may establish different types of interactions with soy proteins, especially glycinin
and -conglycinin, because of their diverse polarity and hydrophobicity as well as their ability
to form hydrogen bonds (Speroni et al., 2010). During long-term storage, structure of soy
proteins such as glycinin might change (Saio et al., 1982; Hou & Chang, 2004), due to a
decrease in free sulfhydryl groups and an increase in disulfide bonds. Moreover, the hydrogen
bondings within the glycinin molecule might decrease because of an increase in -helix
structure and a decrease in the -sheet structure (Hou & Chang, 2004). These structural
changes might have decreased the interaction of isoflavones with soy proteins during storage
and, therefore, explain the observed increase in free isoflavones contents in extracts obtained
with the ternary mixture. In addition, the aforementioned stability of isoflavones in ethanolic
extracts (Table 2) strengthens this hypothesis and might be explained by the solubility of soy
proteins in this solvent, which is probably lower than in the ternary mixture, which contains
40% water (Pace et al., 2004).
In general, soyasaponins contents increased (24% to 39%) in extracts obtained with
the ternary mixture, whereas decreased (32% to 41%) in ethanolic extracts. Although these
62
compounds are generally considered stable at room temperature for short time periods (up to
60 min) (Heng et al., 2006), saponins from Aspargus racemosus dry powder stored for 12
months at room temperature were highly degraded (up to 50%) (Madan et al., 2008). The
observed increase in soyasaponins B-I, B-II and B-III contents in extracts obtained with the
ternary mixture may be related to the degradation of the corresponding DDMP conjugated
soyasaponins, g, a and g, respectively. The conversion of soyasaponin g to soyasaponin
B-I during storage and extraction has been reported in peas (Daveby et al., 1998).
Additionally, the hypothesis raised to explain the increase of isoflavones in these extracts
could also explain the increase in soyasaponins, as these compounds also form very tight
linkages to soy proteins (Potter et al., 1993).
63
Figure 3. Stability of bioactive compounds and antioxidant capacity (FRAP and TEAC) in dry soybean cake (experimental and industrial)
extracts (obtained with ethanol or ternary solvent mixture) during storage at -20 oC (freezer) and room temperature (protected and unprotected
from light) for 180 days.
64
Table 2. Contents of bioactive compounds and antioxidant capacity at t = 0 and t = 180 days in dry soybean cake (experimental and industrial)
extracts (obtained with ethanol or ternary solvent mixture) during storage at -20 oC (freezer) and room temperature (protected and unprotected
from light)1.
Component
Experimental Industrial
Ethanol Ternary Ethanol Ternary
t = 0 t = 180 days
t = 0 t = 180 days
t = 0 t = 180 days
t = 0 t = 180 days
RTlight RTdark Freezer RTlight RTdark Freezer RTlight RTdark Freezer RTlight RTdark Freezer
Total Phenolics
(mg GAE/g)
11.1 10.3 11.1 10.3 12.4 15.9*
(+28%)
17.7*
(+43%)
13.1 4.8 4.4 4.7 4.9 10.5 13.2*
(+26%)
12.9*
(+23%)
12.0*
(+15%)
Total Flavonoids
(mg GE/g)
13.6 10.3*
(-24%)
10.4*
(-24%)
8.6*
(-36%)
7.3 8.0*
(+11%)
9.4*
(+30%)
6.7 11.0 5.8*
(-47%)
7.5*
(-32%)
7.3*
(-34%)
10.0 11.0*
(+10%)
10.8*
(+8%)
10.1
Total Saponins
(mg/g)
71.5 52.5*
(-30%)
50.9*
(-32%)
71.4 225.0 190.9*
(-15%)
230.8 172.2*
(-23%)
43.9 29.6 27.3*
(-38%)
36.7 253.1 234.6 216.4*
(-14%)
200.4*
(-21%)
FRAP
(mol Fe2+/g)
74.7 35.1*
(-53%)
36.2*
(-52%)
32.8*
(-56%)
71.4 92.4*
(+30%)
104.8*
(+47%)
78.5*
(+10%)
48.0 34.1*
(-29%)
42.4*
(-10%)
30.6*
(-36%)
91.6 113.0*
(+23%)
111.9*
(+22%)
99.9*
(+9%)
TEAC
(mol Trolox/g)
103.1 39.8* (-61%)
49.4* (-52%)
62.3* (-40%)
105.0 49.8* (-53%)
95.6 86.9 71.7 24.4* (-66%)
11.3* (-84%)
39.4* (-45%)
109.5 107.5 78.03* (-29%)
117.0
Total isoflavones
(mg/g)
10.4 8.6 11.0 10.0 5.3 7.3*
(+38%)
9.2*
(+76%)
6.1 6.2 5.7 5.9 6.3 5.6 8.9*
(+59%)
8.7*
(+57%)
8.1*
(+46%)
-glucosides (mg/g)
1.0 1.2*
(+20%)
1.3*
(+33%)
1.1 0.7 1.1*
(+49%)
1.5*
(+106%)
0.9*
(+29%)
3.9 3.9 4.1 4.1 3.6 6.1*
(+67%)
6.0*
(+64%)
5.5*
(+53%)
Malonylglucosides
(mg/g)
0.6 0.4*
(-33%)
0.5*
(-21%)
0.6 1.1 1.3*
(+13%)
1.6*
(+46%)
1.5*
(+30%)
0.3 0.1*
(-50%)
0.2*
(-24%)
0.3 0.6 0.9*
(+41%)
0.8*
(+33%)
0.8*
(+39%)
Acetylglucosides
(mg/g)
0.1 0.09 0.1 0.1 0.1 0.1 0.2*
(+90%)
0.1 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.6*
(+43%)
0.6*
(+43%)
0.5*
(+33%)
Aglycones (mg/g)
8.6 6.9 9.1 8.1 3.3 4.7* (+44%)
5.8* (+78%)
4.8* (+47%)
1.6 1.3 1.3 1.5 0.8 1.3* (+48%)
1.3* (+48%)
1.2* (+47%)
Soyasaponins
(mg/g)
12.7
7.5*
(-41%)
7.9*
(-38%)
7.6*
(-41%)
13.2 13.9
18.3*
(+39%)
15.5 9.0 7.1 6.9 6.1*
(-32%)
15.3 20.4*
(+33%)
22.0*
(+44%)
18.9*
(+24%) 1Means at t = 180 days with a superscript asterisk are significantly different from their corresponding sample at t = 0 (ANOVA, Tukey’s post-test; p < 0.05). Relative change
in relation to t = 0 is shown in parenthesis. GAE = gallic acid equivalents; GE = genistein equivalent
65
Figure 4. Stability of isoflavones and soyasaponins in dry soybean cake (experimental and
industrial) extracts (obtained with ethanol or ternary solvent mixture) during storage at -20 oC
(freezer) and room temperature (protected and unprotected from light) for 180 days.
66
4. Conclusion
Our results suggest that soybean cakes would be more interesting as an ingredient than
soybeans themselves for the development of functional foods, since the former showed higher
protein and bioactive compounds contents as well as higher antioxidant capacity than the
latter. Moreover, high moisture thermal processing of soybeans is a procedure that could be
employed to improve the functional value of the obtained co-product as it seems to yield
cakes with potentially higher isoflavones bioavailability.
Isoflavones and soyasaponins soybean cake extracts for long-term bioactivity studies
should be preferably obtained using a ternary mixture composed of water, ethanol and ethyl
acetate (40:40:20) as this solvent led to higher extraction yields and stability of bioactive
compounds. For this purpose, these extracts may be stored at room temperature unprotected
from light for at least 180 days.
67
Capítulo 3
Isolamento de isoflavonas e saponinas da torta de
soja por cromatografia líquida semi-preparativa
68
1. Introdução
Além dos nutrientes envolvidos no metabolismo normal, alguns alimentos contém
uma gama de componentes que fazem parte do chamado metabolismo secundário, os quais
podem fornecer efeitos benéficos à saúde. Esses compostos estão presentes em especial nas
frutas, hortaliças, grãos, leguminosas e sementes (Bloch & Thomson, 1995). A soja é uma
grande fonte destes compostos, sendo as isoflavonas e as saponinas de soja os principais
representantes.
O interesse na pesquisa destes componentes nos alimentos vem aumentando.
Entretanto, a obtenção de padrões de referência para a análise destas substâncias muitas vezes
é um desafio. Em alguns casos, os compostos que se deseja quantificar sequer estão
disponíveis comercialmente e sua aquisição com certificado de garantia quase sempre
depende de importação, o que implica em custos elevados e longo prazo de entrega. Além
disso, geralmente estes padrões são comercializados em pequenas quantidades, o que impede
a avaliação de sua qualidade e pureza para obtenção de resultados confiáveis (Pacheco et al.,
2010).
Além da análise quantitativa, os padrões isolados também podem ser utilizados em
estudos de bioatividade. Muitas vezes as pesquisas deste tipo utilizam extratos que contem
uma ampla variedade de compostos, sendo difícil a atribuição dos efeitos encontrados a um
componente específico daquela mistura. Além disso, componentes com estrutura e
identidades desconhecidas também podem estar presentes, sendo necessária a avaliação
isolada de seus efeitos a fim de se evitar conclusões equivocadas. Portanto, a utilização de
compostos isolados com elevado grau de pureza é de grande relevância para este fim.
Para a obtenção de frações contendo misturas de compostos a partir dos extratos
geralmente utilizam-se métodos de extração líquido-líquido ou cromatográficos, como a
cromatografia líquida a vácuo, cromatografia em coluna, cromatografia de exclusão por
tamanho, extração em fase sólida, dentre outros. As frações geradas nestes métodos de
separação podem ser utilizadas nas etapas posteriores para obtenção do composto de interesse
(Sarker et al., 2006).
Os métodos clássicos de isolamento de compostos geralmente envolvem a
cromatografia em camada delgada, cromatografia de coluna aberta e a cromatografia flash.
Métodos cromatográficos mais modernos como a CLAE preparativa e a cromatografia
contracorrente preparativa vem sendo bastante utilizados e são considerados mais eficientes
no processo de isolamento (Sarker et al., 2006).
69
A CLAE semi-preparativa é um sistema robusto e versátil para o isolamento de
compostos bioativos a partir de misturas complexas. Uma das vantagens é a maior quantidade
de produto final isolado devido a maior capacidade das colunas deste tipo de sistema.
Entretanto, isso demanda maiores quantidades de solvente. A cromatografia semi-preparativa
pode servir para o isolamento na ordem de miligramas, para elucidação de estrutura e uso
como padrão analítico ou, para o isolamento de amostra na ordem de gramas, que poderão ser
destinadas à pesquisas que envolvem a avaliação da bioatividade (Oliveira, 2005).
Tendo como contrapartida a utilização da CLAE para obtenção de compostos isolados
em nosso próprio laboratório, o objetivo deste trabalho foi o isolamento de isoflavonas e
saponinas da torta de soja por CLAE semi-preparativa.
2. Objetivos específicos
Isolar isoflavonas e saponinas de soja a partir de extratos obtidos da torta de soja;
Caracterizar as frações isoladas por CLAE-DAD a fim de verificar suas identidades;
Determinar por CLAE-DAD o grau de pureza da fração isolada;
3. Material e métodos
3.1.Amostra
Utilizou-se como matéria prima a torta de soja obtida da indústria. O extrato seco
obtido utilizando a mistura ternária de solventes conforme descrito no item 2.6 do capítulo
anterior foi usado para o isolamento de isoflavonas e saponinas de soja por CLAE semi-
preparativa.
3.2.Sistema de CLAE semi-preparativa
O sistema de cromatografia semi-preparativa (Thermo Scientific) utilizado
compreendeu uma bomba binária, um injetor manual equipado com um loop de 2 mL, um
detector UV e um coletor automatizado de frações (Dionex Ultimate 3000). As condições
cromatográficas usadas foram coluna Spherisorb ODS-2 10 µm (250 x 10 mm) e fase móvel
constituída de água (eluente A) e acetonitrila aquosa 60% (eluente B), ambas adicionados de
0,3% de ácido fórmico, com fluxo de 4 mL/min. O gradiente utilizado no sistema de CLAE
70
semi-preparativa está apresentado na Tabela 1. A detecção UV foi realizada a 254 nm para as
isoflavonas e 195 nm para as saponinas, sendo a coleta realizada em duas corridas diferentes.
Tabela 1. Gradiente de eluição do sistema de CLAE semi-preparativa
Tempo (min) Eluente B (%)
Isoflavonas Saponinas
0,0 23,0 23,0
0,1 30,0 30,0
12,0 30,0 30,0
15,0 32,0 32,0
17,0 36,0 36,0
23,0 37,0 37,0
25,0 39,0 39,0
30,0 50,0 50,0
35,0 51,0 51,0
40,0 52,0 52,0
45,0 53,0 53,0
46,0 - 58,0
50,0 65,0 65,0
55,0 65,0 75,0
60,0 - 85,0
65,0 - 90,0
75,0 - 95,0
3.3.Coletor de frações
Para aquisição dos dados e programação do coletor automatizado de frações utilizou-
se o software Chromeleon Chromatography Data System (v. 6.8). O coletor automatizado de
frações foi programado para coleta de picos com altura acima de 2,00 mAU e slope do início
do pico de 0,40 mAU/s. A coleta se encerrava quando os picos atingiam altura de pelo menos
8,00 mAU e slope do final do pico de 1,00 mAU/s. Esses valores foram baseados em testes
prévios.
71
3.4.Identificação das frações coletadas
As frações coletadas no sistema de CLAE semi-preparativa foram identificadas por
comparação do tempo de retenção do padrão analítico comercial. Para as isoflavonas malonil
e acetil glicosiladas, a identificação se deu por injeção da fração no sistema de CLAE-DAD-
EM como descrito no item 2.4.4. do capítulo 2.
3.5.Grau de pureza
Para o cálculo da pureza foi utilizada a área dos picos no cromatograma do sistema de
CLAE-DAD. Utilizou-se a soma de todos os picos que apareciam no cromatograma nas
absorbâncias de 254 nm (isoflavonas) e 195 nm (saponinas) como valor de área total. A área
do pico de interesse foi determinada e usada para o cálculo de percentual em relação ao total
conforme mostrado abaixo:
4. Resultados e discussão
Como pode-se observar no capítulo anterior, a torta de soja é uma rica fonte de
isoflavonas e saponinas de soja. O extrato seco obtido a partir da torta com a mistura ternária
de solventes apresentou cerca de 5,6 mg/g de isoflavonas totais e 15,3 mg/g de saponinas de
soja. Na Figura 1 podemos observar o cromatograma representativo das isoflavonas que
puderam ser identificadas no sistema semi-preparativo. Foi possível o isolamento das
isoflavonas daidzina, glicitina, genistina, malonil genistina, acetil daidzina, malonil daidzina,
daidzeína e genisteína com grau de pureza acima de 65% (Tabela 3). Daidzina, genistina,
daidzeína e genisteína foram as isoflavonas isoladas com maior pureza, acima de 90%.
Como pode-se observar, em certos casos não foi possível alcançar a separação
cromatográfica completa, o que impediu o isolamento com grau de pureza elevado das
isoflavonas malonil genistina, acetil daidzina e malonil daidzina. Apesar disso, quando
comparada a outros métodos de separação, a CLAE semi-preparativa mostra-se um método
bastante eficiente e rápido. Para se isolar compostos com elevado grau de pureza muitos
trabalhos na literatura fazem uso de métodos laboriosos e que envolvem técnicas de
purificação prévia do extrato antes do isolamento. Além das isoflavonas citadas acima, em
consequência do baixo teor, não foi possível o isolamento da acetil glicitina, malonil glicitina
e acetil genistina.
72
Figura 1. Cromatograma (UV 254 nm) representativo das isoflavonas isoladas a partir do
extrato da torta de soja da indústria. 1 – daidzina, 2 – glicitina, 3 – genistina, 4 –
desconhecido, 5 – malonil genistina, 6 – acetil daidzina, 7 – malonil daidzina, 8 – daidzeína,
9 – gliciteína, 10 – acetil genistina, 11 – genisteína.
Cabe ressaltar que o isolamento das frações malonil e acetil glicosiladas das
isoflavonas, ainda que com grau de pureza entre 70 e 87%, é de grande relevância, visto que
estes compostos usualmente são de baixa disponibilidade comercial e de alto custo (em média
de 40 a 80 dólares por mg). Além disso, até onde sabemos, não há estudos na literatura
relatando o isolamento destes compostos para uso como padrão analítico.
Qu et al. (2007) isolaram as isoflavonas daidzina, glicitina, genistina, daidzeína,
gliciteína e genisteína com grau de pureza acima de 99%. Apesar da diferença encontrada no
presente trabalho, cabe ressaltar que estes autores utilizaram um sistema preparativo de CLAE
contra-corrente, que vem sendo relatado na literatura como mais eficiente no isolamento de
isoflavonas para obtenção de padrões analíticos pois envolve o uso de uma fase estacionária
líquida, aumentando a solubilidade das isoflavonas e melhorando a resolução e separação
cromatográfica (Sturtz et al., 2006). Apesar da maior pureza, os padrões isolados por este
grupo de autores tem maior disponibilidade comercial, diferente dos padrões de isoflavonas
malonil e acetil glicosiladas isoladas no presente estudo.
Os cromatogramas das frações isoladas por CLAE semi-preparativa e que foram
injetadas no sistema analítico de CLAE-DAD estão apresentados a seguir (Figura 2).
1
2
3
4
5 6
7
8
9 10 11
73
Figura 2. Cromatograma (250 nm) das frações de isoflavonas isoladas no sistema
semipreparativo.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-25
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
mAbs ID#1 250nm (1.00)
1.67
8
4.66
8
2 .5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-10.0
-7.5
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
mAbs ID#1 250nm (1.00)
0.20
20.
271
0.50
60.
657
0.86
0
1.46
01.
642
2.19
12.
409
3.19
13.
507
4.23
7
4.90
7
7.98
1 25.7
05
2 .5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
mAbs ID#1 250nm (1.00)
7.86
2
2 .5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
mAbs ID#1 250nm (1.00)
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
mAbs ID#1 250nm (1.00)
0.98
3
1.68
4
10.5
10
2 .5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
mAbs ID#1 250nm (1.00)
11.2
29
2 .5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mAbs ID#1 250nm (1.00)
13.0
35
5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
mAbs ID#1 250nm (1.00)
1.6
82
15.
480
5 .0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
mAbs ID#1 250nm (1.00)
1.0
23
1.5
41
1.7
38
2.6
17
2.8
33
8.5
73
24.
850
Daidzina Glicitina
Genistina Malonil genistina
Acetil daidzina Malonil daidzina
Daidzeína Gliciteína
Genisteína
74
Tabela 2. Massa e grau de pureza de isoflavonas e saponinas de
soja isoladas por CLAE semi-preparativa.
Composto Massa
(µg/corrida) Pureza (%)
Daidzina 167,8 93
Glicitina 64,8 68
Genistina 223,9 92
Malonil Genistina 8,5 70
Acetil Daidzina 12,3 72
Malonil Daidzina 38,6 87
Daidzeína 33,5 94
Gliciteína 11,5 98
Genisteína 19,1 99
Saponina B-I 927,9 98
Saponina B-II 195,2 91
Na Figura 3 podemos observar o cromatograma representativo das saponinas que
puderam ser encontradas no extrato. Apenas as saponinas de soja B-I, B-II e B-III puderam
ser identificadas, devido a disponibilidade de padrões comerciais. As saponinas de soja B-I e
B-II foram isoladas com grau de pureza superior a 90% (Tabela 3). Em consequência do
baixo teor e da baixa resolução cromatográfica, não foi possível a coleta da fração
correspondente à saponina B-III. Como podemos perceber, outros picos aparecem entre 55 e
60 min e 63 e 69 min no cromatograma, os quais possivelmente representam outras saponinas,
do grupo B ou conjugadas ao DDMP que, segundo Berhow et al. (2006), são abundantes na
soja e seus derivados.
A futura identificação destes outros picos poderá contribuir para a obtenção de padrões
analíticos a partir da torta de soja, contribuindo para a identificação correta destes compostos
nos alimentos. Essa identificação inicialmente poderá ser feita por CLAE acoplada a
espectrometria de massas em tandem e pela técnica de ressonância magnética nuclear de H1 e
13C, que permitirá a elucidação da estrutura dos compostos presentes na fração isolada.
Assim, será possível a confirmação da identidade através da comparação com bancos de
dados e também com os padrões comerciais, quando disponíveis (Dinan, 2006).
75
Figura 3. Cromatograma (UV 195nm) representativo das saponinas de soja isoladas a partir
do extrato da torta de soja da indústria. 1-saponina B-I, 2-saponina B-II, 3-saponina B-III.
As saponinas de soja possuem estrutura triterpenóide ligadas a uma ou mais cadeia de
açúcares e apresentam um amplo espectro de bioatividade (Yao et al., 2008). Diversos
estudos já demonstraram a ação antiviral, hipocolesterolêmica, hemolítica,
imunoestimulatória, hepatoprotetora e anti câncer (Berhow et al., 2002). Portanto, a avaliação
dos efeitos biológicos das diferentes saponinas isoladas da torta de soja por CLAE semi-
preparativa em estudos futuros contribuirá para a elucidação de mecanismos de ação destes
compostos com maior clareza.
Assim como algumas isoflavonas, os padrões analíticos de saponinas também são de
baixa disponibilidade comercial e geralmente são de alto custo. Muitos destes compostos, por
conta desta baixa disponibilidade, somente são passíveis de identificação em matrizes
alimentícias por técnicas avançadas, como por exemplo a espectrometria de massas. Mesmo
assim, a quantificação só é possível havendo o padrão de referência disponível. Como nem
todos os laboratórios de análises dispõe deste tipo de ferramenta, a identificação e
quantificação das saponinas dos alimentos acaba se tornando menos frequente quando
comparado às isoflavonas. A obtenção de padrões analíticos através da CLAE semi-
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
mAbs ID#1 195nm (1.00)
1.0
39
1.3
48
29.
215
29.
928
2 .5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 min
-150
-125
-100
-75
-50
-25
0
25
50
75
100
mAbs ID#1 195nm (1.00)
1.2
94
30.
357
Saponina B-I Saponina B-II
2
1
3
76
preparativa dos diversos tipos de saponinas da torta de soja ajudaria nessa identificação. Além
disso, com a disponibilidade do padrão, a análise cromatográfica pode ser realizada usando
detectores mais baratos, como por exemplo o detector UV, tendo em vista que estes
compostos possuem espectro de absorção em torno de 195 nm.
Com relação à quantidade de compostos isolada por corrida, na Tabela 3, podemos
observar que as isoflavonas glicosiladas daidzina, glicitina e genistina e as saponinas B-I e B-
II foram as isoladas em maiores quantidades. Esse maior rendimento agiliza a produção de
padrões analíticos, por exemplo, permitindo em poucos dias a obtenção de quantidades
suficientes, entre 1 e 10 mg, do composto para as rotinas de análise cromatográfica em um
laboratório.
Cabe ainda ressaltar que todas as frações isoladas neste trabalho e identificadas por
CLAE-DAD serão futuramente caracterizadas por meio de ressonância magnética nuclear (1H
e 13
C).
5. Conclusão
Os resultados obtidos mostram que o extrato obtido da torta de soja é uma rica fonte
de isoflavonas e saponinas. Foi possível o isolamento destes compostos a partir do extrato da
torta de soja de maneira eficiente por CLAE semi-preparativa. Estes compostos isolados
podem ser utilizados para futuros estudos de bioatividade e em análises quantitativas em
alimentos.
77
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