Caracterização Molecular da Via de Sinalização Mediada...

Universidade de São Paulo

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

Caracterização Molecular da Via de

Sinalização Mediada pelo Receptor Notch em

S. mansoni

Lizandra Guidi Magalhães

Ribeirão Preto

2005

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ÍNDICE

Abreviaturas ..........................................................................................................I

Resumo................................................................................................................ V

Summary ........................................................................................................... VII

1- Introdução ........................................................................................................1

1.1. Aspectos gerais da esquistossomose .........................................................2

1.2. Histórico ......................................................................................................3

1.3. Ciclo de vida de S. mansoni ........................................................................4

1.4. O genoma de S. mansoni............................................................................8

1.5. Vias de desenvolvimento celular ...............................................................11

1.5.1 Via de sinalização mediada pelo receptor Notch .................................15

2-Objetivos .........................................................................................................22

2.1. Objetivo geral ............................................................................................23

3- Materiais e Métodos ......................................................................................24

3.1. Análise in silico da via de desenvolvimento Notch ....................................25

3.1.1. Comparação da via Notch entre S. mansoni e S. japonicum..............26

3.2. Manutenção do ciclo biológico de S. mansoni...........................................26

3.3. Obtenção de ovos .....................................................................................27

3.4. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos ..................27

3.5. Extração de RNA total...............................................................................28

3.6. Extração do DNA genômico ......................................................................30

3.7. Quantificação de DNA e RNA ...................................................................31

3.8. Síntese dos oligonucleotídeos iniciadores ................................................32

3.9. RT-PCR (Transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase) ..........34

3.10. Purificação do produto de PCR...............................................................35

3.11. Clonagem do produto de PCR ................................................................36

3.12. Minipreparação de DNA plasmidial .........................................................37

3.13. Sequenciamento .....................................................................................38

3.14. Análise computacional das seqüências...................................................39

3.15. Northern Blot ...........................................................................................39

3.16. Preparo da sonda radioativa ...................................................................40

3.17. Reação de Hibridização ..........................................................................41

3.18. Autoradiografia ........................................................................................42

4- Resultados .....................................................................................................43

4.1. Análise in silico da via de sinalização Notch .............................................44

4.2. Amplificação dos fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e Supressor

de Deltex a partir do DNA genômico do S. mansoni..............................................48

4.3. Sequenciamento e análise computacional dos fragmentos gênicos de

Notch, Presenilina e Supressor de Deltex .............................................................49

4.4. Perfil de expressão dos fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e

Supressor de Deltex durante o ciclo de vida do parasita.......................................58

4.5. Estimativa por Northern Blot do tamanho da mensagem codificadora de

Notch e Presenilina................................................................................................62

5- Discussão.......................................................................................................64

6- Conclusões ....................................................................................................73

7- Referências Bibliográficas............................................................................76

8-Apêndice .........................................................................................................88

Abreviaturas

Abreviaturas

II

[αP32] DcTP Citosina trifosfato radiomarcada na posição α com 32P ºC Graus Celsius 32P Fosfato radiomarcado Ca 2+ Íon cálcio CaCl2 Cloreto de Cálcio cDNA DNA complementar cpm Contagem por minuto cm Centímetros CO2 Dióxido de Carbono CTAB Brometo de hexadeciltrimelilamônio DEPC Dietilpirocarbonato DNA Ácido dexorribonucleotídeo DNAg DNA genômico DNTP Deoxinucleosídeo trifosfato (N= A,C,G,T) D.O Densidade Óptica DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilenodiaminotetracético (sal dissódico) EST Expressed Sequence Tags g Grama HCl Ácido Clorídrico HEPES 2-4-(2-hidroxietil)-pperazinil-(1)-Ácido Etanosulfônico kDa Kilodaltons-1kDa equivale a 1000 Daltos Kb Kilobases- 1kb equivale a 1000 bases nucleotídicas KCl Cloreto de Potássio KH2PO4 Fosfato diácido de Potássio LB Lúria Bertani-Meio de cultura bacteriano LE Luis Evangelista – linhagem do parasita Schistosoma mansoni mV Milivolts M Mols/L MgCl2 Cloreto de magnésio MgSO4 Sulfato de magnésio mg Miligrama mL Mililitro mM Milimolar mm Milímetro mRNA Ácido Ribonucléico mensageiro MOPS [Ácido 3-(N-Morfolino)Propanosulfônico] NaCl Cloreto de Sódio NaHCO3 Bicarbonato de Sódio Na2HPO4 Fosfato de sódio dibásico NaOH Hidróxido de Sódio NaOAc Acetato de Sódio NEXT Domínio extracelular de Notch truncado NICD Domínio intracelular de Notch ng Nanograma nm Nanomols

Abreviaturas

III

Oligo(dt) Oligo desoxitimina ORF Open Reading Frame pb Pares de base PBS Solução salina tamponada com fosfato pmol Picomol RNAse Ribonuclease RNAseH Ribonuclease H RNA Ácido Ribonucléico rpm Rotações por minuto RT-PCR Transcriptase Reversa-Reação de Cadeia Polimerase SDS Dudecilsulfato de sódio SmNotch Fragmento gênico de Notch em S.mansoni SmPresenilina Fragmento gênico de Presenilina em S. mansoni SmSu(dx) Fragmento gênico de Supressor de deltex em S. mansoni Taq Thermos aquaticus TIGR The Institute for Genomic Research tris Tris-hidroximetilaminometano U Unidades v/v Volume/volume V Volts Xg Velocidade de sedimentação em unidade gravitacional WHO Organização Mundial da Saúde µCi Microcuries µg Micrograma µL Microlitros µM Micromolar

Abreviaturas

IV

AMINOÁCIDOS ABREVIAÇÃO DE TRÊS LETRAS

ABREVIAÇÃO DE UMA LETRA

Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Ácido glutâmico Glu E Cisteína Cys C Glicina Gly G Glutamina Gln Q Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Tirosina Try Y Treonina Thr T Triptofano Trp W Valina Val V

Resumo

Resumo

VI

Vias de transdução de sinal podem desempenhar um papel essencial para o

desenvolvimento e a homeostase de Schistosoma mansoni. Entre as diversas vias

de sinalização, a via mediada pelo receptor Notch se destaca por ser crítico na

diferenciação celular em muitos organismos. Alguns dos componentes dessa via,

como o receptor Notch, a protease Presenilina e a enzima ubiquitina ligase

Supressor de Deltex, desempenham papéis fundamentais durante a ativação e a

regulação da via Notch. O presente trabalho reconstituiu in silico essa via de

sinalização e analisou o perfil de expressão dos referidos genes durante o ciclo de

vida do parasita S. mansoni.

A reconstituição in silico demonstrou a presença de transcritos dos principais

componentes da via Notch. Através da técnica de RT-PCR foi possível demonstrar

que Notch é expresso em baixíssimos níveis durante o estágio de cercária,

entretanto, Presenilina e Supressor de Deltex são expressos nos principais estágios

evolutivos deste parasita. A análise dos fragmentos amplificados a partir do DNA

genômico mostrou a ausência de íntrons nas regiões flanqueadas pelos

oligonucleotídeos específicos.

Esta caracterização inicial constituiu uma abordagem pioneira no estudo dessa

via em S. mansoni. Desta forma, as análises subseqüentes de caráter estrutural e

funcional poderão ser empregadas para a elucidação dos mecanismos pelo qual a

via Notch coopera para garantir tanto a diferenciação como o desenvolvimento deste

parasita.

Summary

Summary

VIII

Signaling transducing pathways may have an essential role in the development

and the homeostasis of Schistosoma mansoni. Among the diverse signaling

pathways, the Notch pathway is emphasized by its critical role in cellular

differentiation in various organisms. Some components of this pathway, such as the

Notch receptor, the Presenilin protease and the Suppressor of Deltex ubiquitin ligase

enzyme, have an essential role during activation and regulation of the Notch

pathway. The present work highlights the in silico reconstitution of this pathway and

analyzes the expression profile of the mentioned genes during the life cycle of the

parasite S. mansoni.

The in silico reconstitution demonstrated the presence of transcripts coding for

several components of the Notch pathway. By using RT-PCR we were able to

demonstrate that Notch is lower expression during the cercariae stage whereas

Presenelin and Supressor of Deltex were expressed throughout different larval and

adult stage. In addition, the analyses of amplified fragments from genomic DNA

showed absence of introns concerning the regions flanked by each specific pair of

oligonucleotides.

This initial characterization constitutes the first evidence suggesting the

existence of the Notch pathway in S. mansoni. In this way, subsequently structural

and functional analysis towards the elucidation of the mechanisms by which the

Notch pathway cooperates to guarantee parasite development and differentiation.

1- Introdução

Introdução

2

1.1. Aspectos gerais da esquistossomose

Schistosoma mansoni é um trematódeo digenético, da família

Schistosomatidae, gênero Schistosoma, cuja principal característica é o seu

acentuado dimorfismo sexual em sua forma adulta. A infecção por S. mansoni

determina uma patologia denominada esquistossomose intestinal, popularmente

conhecida no Brasil como "Xistose", "Mal do caramujo" ou "Barriga d'água", devido à

ascite que acompanha as formas mais graves (MELO & COELHO, 2005). O sucesso

desse parasita está relacionado com a sua adaptação e na habilidade de se

transformar rapidamente durante os diferentes ambientes.

Existem 6 espécies de Schistosoma que podem infectar o ser humano, sendo:

S. mansoni, S haematobium, S. japonicum, S. intercalatum, S. mekongi e S.

malayensis. Contudo, no Brasil, somente a espécie S. mansoni se adaptou,

provavelmente devido à presença de moluscos do gênero Biomphalaria, que atuam

como hospedeiros intermediários.

Atualmente, estima –se existir pelo menos 300 milhões de pessoas infectadas

em todo mundo, e um total de 600 milhões de pessoas expostas ao risco de contrair

uma das esquistossomoses, em áreas tropicais e subtropicais do mundo (WHO,

1996). No Brasil, a área endêmica abrange 19 estados com aproximadamente 26

milhões de habitantes expostos ao risco, e cerca de 8 a 10 milhões de indivíduos

infectados pelo parasita, os quais em muitos casos apresentam severas deficiências

orgânicas, comprometendo o desenvolvimento de jovens e a produtividade de

adultos e fazendo desta doença um dos mais sérios problemas de saúde nos países

Introdução

3

em desenvolvimento (MELO & COELHO, 2005; LAMBERTUCCI & BARRAVIEIRA,

1994).

O tratamento com a droga praziquantel constitui uma importante arma no

controle da morbidade e na diminuição da prevalência e da incidência dessa doença

nas áreas endêmicas (KATZ, 1998), no entanto, a resistência do parasita contra essa

droga tem sido relatada em muitas localizações (ISMAIL et al, 1999). Desse modo,

vários métodos têm sido usados para combater a esquistossomose, incluindo

saneamento básico e educação sanitária, no entanto, esses métodos têm se

mostrado pouco eficiente no controle da esquistossomose.

1.2. Histórico

A esquistossomose é uma doença conhecida desde a antiguidade. O exame de

múmias do antigo Egito revelou a presença de granulomas hepáticos que são

característicos da infecção por S. mansoni. Em 1851, o médico alemão Theodoro

Bilharz, durante a realização de uma autópsia em um egípcio, observou a presença

de um parasita intravascular o qual deu o nome de Distoma haematobia.

Posteriormente, Winland denominou o mesmo helminto de Schistosoma e, em 1907

a denominação da espécie – Schistosoma mansoni foi dada por Sambon.

Acredita-se que as espécies do gênero Schistosoma chegaram no Brasil

durante o tráfico de escravos e com os imigrantes vindos da África. A descoberta dos

primeiros casos no Brasil aconteceu em 1951, pelo cientista brasileiro Manuel

Augusto Pirajá da Silva, na Bahia, quando estava fazendo numerosos exames de

fezes e necropsias. Os trabalhos realizados por Pirajá da Silva esclareceram todas

Introdução

4

as dúvidas em relação à espécie, mas a denominação coube a Sambon (MELO &

COELHO, 2005).

1.3. Ciclo de vida de S. mansoni

A biologia de S. mansoni apresenta um ciclo do tipo heteroxeno, o qual requer

dois hospedeiros para completar sua evolução, um hospedeiro invertebrado que são

os caramujos do gênero Biomplalaria e um hospedeiro definitivo vertebrado (Figura

1). Devido a esse complexo plano de desenvolvimento, o parasita S. mansoni sofre

profundas alterações morfológicas, como também alterações funcionais de diversas

vias metabólicas (HOCKLEY, 1973 ; RUMJANEK, 1987).

Assim que os ovos são liberados na água pelo hospedeiro definitivo, esses

eclodem devido a vários fatores como a temperatura, luz intensa e oxigenação da

água, liberando a forma larval denominada de miracídio. Uma vez liberado, esses

irão à procura do seu hospedeiro intermediário. Os mecanismos envolvidos no

reconhecimento do caramujo hospedeiro pelo miracídio têm sido alvo de muitos

estudos, no entanto, alguns relatos mostram que o miracídio é controlado por dois

tipos de respostas. Primeiramente, o miracídio responderia a estímulos físicos do

ambiente e num segundo momento, o miracídio responderia a estímulos químicos

originados pelo molusco (KAPP, et al; 2003). Após penetrar pelas partes moles dos

caramujos susceptíveis, os miracídios desenvolvem-se em esporocisto mães, por

poliembrionia, e posteriormente, diferenciam em esporocistos filhos, que migram

para as glândulas digestivas e ovoteste do molusco. Por reprodução assexuada,

originam as formas de vida livre conhecidas como cercárias, cerca de 20 a 30 dias

Introdução

5

após a infecção do hospedeiro intermediário. Um miracídio pode produzir de 100.000

a 300.000 cercárias, sendo que cada miracídio define o sexo das cercárias que serão

produzidas (ROLLINSON & SIMPSON, 1987).

Sob condições ideais de temperatura e luminosidade, as cercárias são liberadas

para o meio externo (água), podendo viver livremente por algumas horas até que

suas reservas energéticas, principalmente glicogênio, sejam consumidas. Neste

período, elas nadam ativamente na água, e como são fototrópicas positivas, elas se

concentram na superfície das águas, tornando o contato com o hospedeiro definitivo

mais provável.

Ao alcançarem a pele do hospedeiro, se fixam preferencialmente entre os

folículos pilosos com o auxilio de duas ventosas e de uma substância mucoprotéica

secretada por suas glândulas acetabulares. Através da ação lítica devido à presença

de proteases presentes nas glândulas pré-acetabulares e sub tegumentares, e por

ação mecânica, ocorre à penetração do corpo cercariano através da epiderme e

derme (GONZALES, 1989). Durante a penetração no hospedeiro definitivo, as

cercárias perdem a cauda e, algumas horas após, completam a metamorfose,

atingindo o estágio de esquistossômulo. Estes últimos migram pelo tecido

subcutâneo e, ao penetrarem num vaso, são levados da pele até os pulmões, onde

permanecem, por pelo menos 48 horas. Do pulmão, os esquistossômulos dirigem-se

para o sistema porta-hepático e, nesse ambiente ocorre à maturação sexual e o

acasalamento dos parasitas.

Num espaço de aproximadamente seis semanas pós-infecção, os vermes

encontram–se na sua forma adulta e migram para as veias mesentéricas, onde

ocorre a postura dos ovos na submucosa. Da submucosa, os ovos passam para a

Introdução

6

luz intestinal. Os casais de vermes adultos podem produzir de 300 a 1000

ovos/dia/casal, sendo que, parte desses ovos chegando à luz intestinal, é eliminada

para o exterior junto com o bolo fecal completando desse modo, o ciclo de vida do

parasita. Cerca de 50% desses ovos ficam retidos no hospedeiro, fato este

responsável pela patologia da doença, uma vez que, a presença de ovos induz

reações imuno–teciduais que desencadeiam a formação dos granulomas (WARREN,

1987). A formação desses granulomas é mediada por uma resposta celular,

constituída por subpopulações de linfócitos T e outros grupos celulares como

neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e fibroblastos, os quais, migram para o local da

lesão devido aos componentes dos ovos que liberam determinados fatores solúveis

que induzem esta resposta imune (STADECKER, 1992).

Em relação ao sistema imune do hospedeiro, diversos grupos independentes

demonstraram que este desempenha um papel muito importante tanto na

modulação da carga parasitária como na capacidade de evitar ou minimizar re-

infecções, especialmente em áreas endêmicas. O grau da sintomatologia

apresentada pelo paciente como também a possibilidade de ocorrência de outras

afecções, devido à imunossupressão induzida pelo parasita, também está

intimamente relacionada ao sistema imune do hospedeiro (PEARCE &

MACDONALD, 2002.). Desta forma, no início da infecção ocorre um aumento de

IgE, decorrente da dermatite cercariana, e em seguida, uma elevação tanto de IgM

como de IgG2a, sendo que esta última imunoglobulina, encontra-se mais elevada

até o início da ovoposição. Nas fases mais tardias, observa-se uma diminuição do

título de IgG2a e a “modulação” ou diminuição do tamanho dos granulomas.

Introdução

7

Figura 1- Diagrama esquemático do ciclo de vida do parasita S. mansoni. Dentro do seu hospedeiro vertebrado, as formas larvais dão origem a parasitas sexualmente maduros os quais se acasalam e produzem os ovos que são liberados para o meio aquático. Os ovos eclodidos liberam os miracídios, e esses penetram nos caramujos dando origem a numerosos esporocistos, os quais culminam com a liberação de cercarias, a forma infectante deste parasita para o hospedeiro vertebrado. Adaptado de - Introdução à Parasitologia. Wilson, R.A,.p.13, 1980.

Introdução

8

Pouco se conhece sobre os aspectos da reprodução em S. mansoni. No

entanto, o parasita e seus hospedeiros têm uma relação intima que envolve a

exploração de sinais endócrinos e imunes dos hospedeiros, resultando na expressão

coordenada de um conjunto de genes distintos, necessários para o desenvolvimento,

diferenciação sexual e adaptação do parasita (SALZET, et al, 2000; DAVIES, et al.

2001). Desta forma, o conhecimento de genes e dos mecanismos que controlam as

suas expressões, permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos

com o desenvolvimento, diferenciação sexual, maturação e na adaptação deste

parasita em ambientes distintos. O conhecimento molecular também poderá ajudar

na escolha de novos alvos para drogas, bem como, de futuras vacinas, as quais

poderão desencadear uma resposta protetora, ou o bloqueio do desenvolvimento do

parasita no hospedeiro vertebrado.

1.4. O genoma de S. mansoni

S. mansoni apresenta um genoma estimado em 2.7X108 pb, organizado em oito

pares de cromossomos sendo sete pares autossômicos e um par de cromossomos

sexuais. Os machos são homogaméticos (ZZ) e as fêmeas heterogaméticas (ZW)

(TANAKA, 1995).

Considerando que este parasita apresenta diversas formas evolutivas para

completar um ciclo biológico, e sendo este processo acompanhado de profundas

alterações tanto morfológicas como bioquímicas em diversas vias metabólicas

durante este ciclo, provavelmente o genoma do parasita deve apresentar uma

grande plasticidade e conseqüentemente manter o padrão de expressão gênica

Introdução

9

diferencial. Desta forma, além dos genes constitutivos, pode–se esperar a existência

de dois outros grupos gênicos: um grupo, cujos genes são regulados por

mecanismos de estresse (como por exemplo: térmico, osmótico ou oxidativo) e um

outro, de genes regulados durante o desenvolvimento do parasita, o que sustentaria

um padrão de proteínas tanto estágio-específica como com níveis regulados durante

os distintos estágios evolutivos.

Nos últimos anos, através da iniciativa do Programa de Pesquisas em Doenças

Tropicais da Organização Mundial de Saúde e de outras agências de fomento

diversos grupos vêm estudando de uma forma sistemática o genoma desse parasita,

resultando numa rápida expansão do conhecimento (JOHNSTON, 1997).

A produção de ESTs (Expressed Sequence Tags), que são seqüências parciais

de cDNAs, com cerca de 150-600 pb, obtidas das extremidades 3’ e 5’ e a produção

de ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags), que são

seqüências parciais de cDNA com cerca de 150-800 pb, correspondentes à região

central dos transcritos, têm mostrado serem métodos relativamente simples e rápidos

tanto para descobrir novos genes (FRANCO, et al, 1995; HILLIER, et al, 1996; DIAS-

NETO, et al, 2000) como para examinar o padrão de expressão gênica, incluindo a

identificação dos genes diferencialmente expressos (LEE, et al, 1995 ; MANGER et

al, 1998).

Até 2002, aproximadamente 12.000 ESTs tinham sido geradas, o que

representa um número pouco significativo, se for levado em consideração o tamanho

do genoma do parasita, onde se estima a existência de 20.000 genes (FRANCO, et

al, 2000).

Introdução

10

Utilizando a metodologia ORESTES, Verjovski e colaboradores (2003), geraram

163,000 ESTs provenientes de bibliotecas representativas dos seis estágios de

desenvolvimento do parasita. Essas seqüências resultaram em 31,000 contigs e a

estimativa da existência de aproximadamente 14,000 genes no genoma do parasita,

sendo que 92% destes possuem seqüências depositadas nos bancos públicos

(VERJOVSKI, et al., 2003). Esses dados também abriram novas perspectivas para o

entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos com desenvolvimento,

evasão do sistema imune, organização tecidual, sinalização, dimorfismo sexual e

interação com o hospedeiro, além da identificação de novos genes que codificam

para proteínas candidatas a vacinas e potenciais alvos para novas drogas

(VERJOVSKI, et al, 2003).

A Figura 2, mostra os genes diferencialmente expressos durante o

desenvolvimento, bem como, genes cuja expressão esta relacionada com a

diferenciação sexual tanto em S.mansoni como S. japonicum.

Introdução

11

1.5. Vias de desenvolvimento celular

Estudos indicam que o desenvolvimento de qualquer organismo baseia-se no

uso de pequenos sinais moleculares provenientes de dezessete vias de transdução

de sinal (Tabela 1). Cinco dessas vias agem durante o estágio inicial de

desenvolvimento em metazoários, vertebrados, artrópodes e nematódeos. Outras

cinco vias estão agindo no estágio tardio de desenvolvimento, que corresponde a

formação dos órgãos e a diferenciação celular além das vias que atuam no estágio

inicial. Para a manutenção do funcionamento fisiológico do feto, jovens e adultos, o

qual é acompanhado por diferenciação celular, outras sete vias estão atuando

(GERHART, 1999).

Figura 2: Resumo de alguns genes expressos o durante os estágios de desenvolvimento dos parasitas S. mansoni e S.japonicum. Os dados foram baseados dos transcriptomas de S.mansoni e S. japonicum. Adaptado de- Schistosome transcriptomes: new insights into the parasite and schistosomiasis. Wei HU, et al. TRENDS in Molecular Medicine, v. 10, p. 3491-3496, 2004.

Introdução

12

Vias de transdução de sinal atuantes durante o desenvolvimento

Estágio inicial e tardio do desenvolvimento

1- Via Wingless (Wg)

2- Via Hedgehog (Hh)

3- Via de Fator de Crescimento e Transformação β (TGF-β)

4- Receptor de Tirosina Quinase (RTK)

5- Via Notch

Estágio intermediário e tardio do desenvolvimento

6- Receptor de Citocina

7- Receptor de Hormônio Nuclear

8- Via NF-kB IL1/Toll

9- Via apoptótica

10- Via do Receptor Fosfotirosina Fosfatase

Manutenção do Funcionamento Fisiológico na Fase Larval/Adulto

11- Via do Receptor de Guanilato ciclase

12- Via do Receptor de Oxido Nítrico

13- Via do Receptor Acoplado a Proteína G

14- Via da Integrina

15- Via da Caderina

16- Vias de Junções do Tipo Gap

17- Via de Canal de cátion dependente de ligante

Tabela 1- Dezessete vias de sinalização intracelular que atuam durante o desenvolvimento. As cinco primeiras vias agem durante o estágio inicial do desenvolvimento. Durante o estágio intermediário e tardio do desenvolvimento além das cinco vias que agem durante o estágio inicial, outros cincos estão atuando. As outras sete vias atuariam na manutenção fisiológica nas fases larvais e adultos. Adaptado de- 1998 Warkany Lecture: Signaling Pathways in Development. Gerhart, J., Teratology,. v. 60 p. 226-239, 1999.

Introdução

13

A maioria das vias de transdução de sinal envolve um receptor

transmembrânico que interage a um ligante específico. Essa ligação faz com que o

receptor sofra uma mudança conformacional em seu domínio intracelular,

desencadeando posteriormente sucessivas modificações de proteínas

intermediárias. A maioria dessas proteínas intermediárias são proteínas quinases, e

a ativação ou inativação dessas proteínas são dadas por reações em cascata de

fosforilação/desfosforilação (Figura 3). Ao final, a proteína quinase ativada fosforila

uma proteína alvo, levando a ativação ou a inibição de um processo celular

particular.

Figura 3- Diagrama esquemático das vias de transdução de sinal mediadas por receptores transmembrânicos. A interação de ligantes na porção extracelular do receptor induz uma mudança conformacional no domínio intracelular. Essa mudança desencadeia alterações nas proteínas quinases através de reações de fosforilação/desfosforilação, resultando na ativação ou inativação de proteínas alvo. Adaptado de- 1998 Warkany Lecture: Signaling Pathways in Development. Gerhart, J., Teratology, v. 60 p. 226-239, 1999.

Introdução

14

Em S.mansoni as vias envolvidas com o desenvolvimento do parasita, melhores

caracterizadas até o momento são as seguintes: Fator de Crescimento e

Transformação β (TGF-β), via mediada por Receptor de Tirosina Quinase (RTK) e a

via mediada por Receptores de Hormônios Nucleares (BELL, et al, 2000;

SHOEMARKER, et al, 1992: VICOGNE, et al, 2003; MENONÇA, et al, 2000).

Com relação à via TGF-β, ancorado no tegumento do parasita foi identificado o

Receptor Quinase tipo I. Esse receptor denominado de SmRK1 contém um motivo

de glicina-serina conservado, com 58% de similaridade com domínio quinases de

ortólogos de receptores tipo I (DAVIES, et al, 1998). Além do receptor, foi identificado

duas R-Smads (SmSmad1 e SmSmad2), as quais mostram interagir com o SmRK1

in vitro (OSMAN, et al, 2001). Outras evidências demonstraram que o SMRK1 é

capaz de sinalizar via SmSmad2 em resposta ao TGF β (BEALL., et al, 2000).

Estudos relacionados com a via RTK em S mansoni identificaram três

receptores com essa atividade: um Receptor Fator de Crescimento Epidermal (EGF)

presente no músculo de parasitas adultos, um Receptor de Insulina e um terceiro

receptor não usual pertencente a uma nova classe de Receptor de Tirosina Quinase,

sendo que esses dois últimos estão presentes em esporocisto e ovocistos

(SHOEMARKER, et al, 1992; VICOGNE, et al, 2003).

Finalmente, dentre os receptores caracterizados em S. mansoni relacionados

com a transdução de sinal mediada por Receptor Nuclear estão os receptores para o

hormônio da tireóide, esteróides e para ácido retinóico, além de muitos receptores

órfãos, cujos ligantes ainda permanecem por ser identificados (MENDONÇA, et al,

2000).

Introdução

15

1.5.1 Via de sinalização mediada pelo receptor Notch

A via de sinalização Notch é evolutivamente conservada, estando presente em

todos metazoários (ARTAVANIS-TSAKONAS, et al, 1999). O nome Notch é derivado

de mutações em Drosophila melanogaster que afetam o crescimento da asa e causa

"notches" (rachaduras) nas mesmas. Posteriormente, o gene Notch ficou conhecido

como neurogênico, devido a sua capacidade de inibir o desenvolvimento neural em

D. melanogaster (POULSON, 1950).

Em vertebrados, por exemplo, esta via de sinalização esta envolvida com o

controle da diferenciação pancreática (MURTAUGH, et al., 2003), com a regulação

da hematopoiese (VIRAG, et al, 2005), no desenvolvimento e manutenção vascular

(KARSAN, 2005). Além disso, o comprometimento da função de qualquer um dos

componentes centrais desta via, tem sido associado com a formação de tumores

sólidos e linfáticos (EGAN, et al,1998 ; GRIDLEY, 1997). Em D. melanogaster, dentre

outros processos, esta via esta envolvida com o desenvolvido do sistema nervoso

central e periférico, da asa, do olho, na oogênese (PORTIN, 2002). Em C. elegans,

por exemplo, tanto a especificação inicial do blastômero como a indução da

assimetria direita-esquerda e indução da proliferação de células germinativa, são

reguladas pela via Notch (GREENWALD, 1998).

A Tabela 2 resume os componentes centrais da via Notch já caracterizados em

várias espécies. Nesse trabalho, a nomenclatura utilizada é a descrita para D.

melanogaster.

Introdução

16

Componentes Centrais

C.elegans D.melanogaster Mamíferos

Ligante LAG-2, APX-1, ARG-2, F16B12.2

Delta, Serrate Delta-like 1, Delta like-2,

Delta-like-3, Jagged 1, Jagged 2

Receptor LIN-12, GLP-1

Notch Notch1, Notch 2, Notch 3, Notch 4

Fator transcricional

(CSL)

LAG-1 Supressor de Hairless[Su(H)]

CBF1/RBJκ RBPL

Dados experimentais têm mostrado que a ativação de Notch envolve clivagens

proteolíticas em três sítios que são denominados de S1, S2 e S3, como demonstrado

na Figura 4 (MUMM, et al, 2000; BARON, et al, 2002). A clivagem S1 ocorre por

uma protease presente no complexo de Golgi denominada Convertase Furina Símile

(LOGEAT, et al, 1998). Essa clivagem tem como função promover o processo de

maturação do receptor e favorecer a montagem do heterodímero que será enviado

para a membrana plasmática. O ataque proteolítico, entretanto, não resulta em

dissociação e conseqüente separação das cadeias, mas permite a associação iônica

entre elas através da coordenação com átomos de Ca2+. O transporte do receptor

para a membrana culmina com a inserção do mesmo, orientado com sua porção C-

terminal para o meio intracelular, e a porção N-terminal, voltada para o meio

extracelular (RAND, et al, 2000).

A clivagem S2 é catalisada pela protease Desintegrina em resposta a interação

dos ligantes Delta ou Serrate com o receptor Notch; essa clivagem libera a maioria

do domínio extracelular do receptor, deixando somente o fragmento denominado

NEXT (domínio extracelular de notch truncado), o qual é o alvo para a clivagem S3.

Tabela 2- Componentes centrais da via Notch de sinalização em diferentes espécies. Adaptado de- Notch signaling: control of cell communication and cell fate .Eric, C. Lai. Development, v. 131, p. 965-973, 2004.

Introdução

17

A clivagem S3 por sua vez, irá liberar o NICD (domínio intracelular de Notch), o

qual é translocado para o núcleo para exercer sua função. Esta última clivagem é

realizada por um complexo γ - secretase, sendo a Presenilina, a componente chave

desse complexo proteolítico. Além disso, outra protease que faz parte desse

complexo é a Nicastrina. Estudos demonstram que essa proteína pode ser

imunopurificada do complexo γ - secretase juntamente com Presenilina (YU, et al,

2000). Aparentemente a função molecular da Nicastrina é regular a estabilidade da

Presenilina (CHUNG & STRUHL, 2001; HU, 2002). A Figura 5 ilustra a ativação de

Notch.

No núcleo, o alvo molecular do NICD é um complexo protéico denominado CSL

(CBF1, Su(H), Lag-1) que ligado ao DNA tem a propriedade de atuar como um

sistema repressor da transcrição gênica (na ausência de ativação da via), ou como

um ativador de genes responsivos, após a interação com NICD.

O estado de repressão é garantido através da ligação de vários elementos

repressores a CSL, como por exemplo, as histonas deacetilases e os SMRT

(Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid hormone receptors). Entretanto, a

ativação do receptor intramembrana e conseqüente liberação para o núcleo de NICD

induzem que o mesmo recrute complexos desrepressores da transcrição gênica,

como as histonas acetilases. Em seguida, NICD liga-se ao complexo CSL

desestabilizando o estado de repressão. Finalmente, por meio do recrutamento de

complexos ativadores adicionais como Lag-3/ Mastermind, o conjunto CSL, NICD e

proteínas acessórias atuam como ativadores da transcrição gênica, dando início às

mudanças celulares associadas com a sinalização através da via Notch (MUMM &

KOPAM, 2000; WU, et al, 2002).

Introdução

18

ECN

Figura 4- Cascata proteolítica da ativação de Notch. Sítios de clivagens em Notch 1 de camundongo. A localização dos sítios de clivagem pode não ser conservada entre as espécies. Após a ligação do receptor com o ligante, o receptor sofre uma mudança conformacional expondo o sítio para a segunda clivagem (S2). O produto resultante é o NEXT e, esse será o substrato para a clivagem 3. Nessa última clivagem será formado o NICD e esse, sendo translocado para o núcleo, ativa o fator transcricional Supressor de Hairless. Abreviações: EGF, Fator de Crescimento Epidermal; LNR, domínio de repetições Lin-12/Notch; domínio RAM, RAM 23; nls, sinal de localização nuclear; ANK domínio de repetições de ankirin; PEST região rica em prolina, glutamina e serina. ECN, domínio extracelular de Notch; TMIC, domínio transmembrânico e Intracelular de Notch; NEXT, domínio extracelular de Notch truncado; NICD, domínio intracelular de Notch. Adaptado de: Notch Signaling: From the Outside In. Mumm, J.S & Kopam.R. Developmental Biology, v.228, p. 151-165, 2000.

Introdução

19

A via Notch é regulada por uma variedade de mecanismos moleculares, porém,

estudos têm demonstrado uma grande importância da via de ubiquitinação no

controle dessa sinalização. A via de modificação pós-traducional dependente de

ubiquitina inicia-se quando a ubiquitina é ativada pela enzima ativadora de ubiquitina

(E1) e posteriormente, transferida para a enzima conjugadora de ubiquitina (E2). A

enzima ubiquitina ligase (E3) confere a especificidade do substrato alvo, e se

associa com E2 e substrato para catalisar a transferência da ubiquitina para o

substrato (ERIC, 2003). Até o momento, quatro isoformas de E3 ligases parece

estarem diretamente envolvidas com a regulação dos níveis intracelulares do

receptor Notch e de outros componentes dessa via. O Supressor de Deltex promove

a ubiquitinação do domínio intracelular do Notch na membrana plasmática

(FOSTIER, et. al, 1998); Sel-10, no núcleo, conjuga ubiquitina no domínio

intracelular do Notch (WU, et al, 2001); "Neuralized", esta envolvida com a

ubiquitinação do domínio intracelular do ligante delta (DI) (YEH, et al, 2001; ERIC, et

al, 2001) e finalmente, a ubiquitina E3 ligase ligante de Numb (LNX) que medeia a

ubiquitinação de Numb (NIE, et al., 2002). Esta proteína é assimetricamente

localizada em células progenitoras em divisão, segregando preferencialmente para

uma das células filhas (SPANA & DOE, 1996; UEMURA, et al., 1989). Estudos

indicam que Numb regula negativamente a via de sinalização Notch, e desse modo,

é proposto que LNX pode aumentar a sinalização de Notch através a diminuição de

Numb.

Como qualquer via de transdução de sinal que finalmente resulta em

transcrição gênica, uma célula que tenha recebido um sinal da célula vizinha que

possui o ligante e o internaliza através do receptor Notch sofrerá profundas

Introdução

20

alterações em seu conteúdo protéico. Conseqüentemente, alterações metabólicas e

estruturais resultarão em uma célula diferenciada da população de células vizinhas.

Os mecanismos moleculares primordiais que definem o momento e o número de

células que devem se diferenciar em uma população, ainda são pouco

compreendidos, entretanto, parecem depender da distribuição diferencial e

quantitativa entre ligantes de superfície e receptores presentes em diferentes células

embrionárias (KIMBLE & SIMPSON, 1997).

Figura 5- Diagrama esquemático da via Notch. (a) O receptor Notch é sintetizado como uma proteína precursora de 300 kDA. (b) Através da ação da protease "Furin Convertase" o receptor é clivado no compartimento trans Golgi e o heterodímero maturo, liberado para a superfície celular (c) O receptor maturo presente na superfície celular, (d) sofre uma clivagem mediada por TACE após a sua ligação com o ligante. Essa clivagem libera o domínio extracelular do receptor. O fragmento que fica na membrana, denominado NEXT é clivado posteriormente pela Presenilina, (e) liberando desse modo, o domínio intracelular o qual transloca para o núcleo (f) e ativa a proteína CSL que induz a transcrição de genes alvo. Abreviaturas: NEXT, domínio extracelular truncado. Adaptado de- Notch and Presenilin: a proteolytic mechanism emerges. Fortini, M.A. Current Opinion in Cell Biology, v. 13, p.627-634, 2001.

indução de genes alvos

Introdução

21

Deste modo, o rastreamento molecular das etapas pelas quais S. mansoni sofre

um processo de desenvolvimento significa indiretamente, entender a fonte e a

natureza química dos estímulos recebidos de seus hospedeiros ou do ambiente

aquático. Neste sentido, este estudo poderá contribuir para a elucidação de alguns

mecanismos moleculares que podem permitir a complexa adaptação de S. mansoni

ao homem, à água, e ao caramujo, resultando no conseqüente sucesso evolutivo

deste parasita.

2-Objetivos

Objetivos

23

2.1. Objetivo geral

O objetivo geral deste trabalho foi à reconstituição in silico dos componentes da

via Notch e a identificação molecular da expressão dos fragmentos gênicos de

Notch, Presenilina e Supressor de Deltex que compõe a via de sinalização mediada

pelo receptor Notch durante o ciclo de via do parasita S. mansoni. Para isso foram

abordados os seguintes objetivos específicos:

1. Análise in silico dos componentes da via Notch utilizando dados do banco

originado pelo Projeto Transcriptoma de S. mansoni.

2. Comparação in silico da via Notch em S. mansoni e S. japonicum.

3. Obtenção de seqüências genômica.

4. Análise do perfil de expressão, por RT-PCR nas fases de vermes adultos,

ovos, esporocistos, cercárias e esquistossômulos.

5. Determinar a organização genômica evidenciando exóns e íntron.

6. Determinar o tamanho dos transcritos de Notch e Presenilina.

3- Materiais e Métodos

Materiais e Métodos

25

3.1. Análise in silico da via de desenvolvimento Notch

Os componentes da via de desenvolvimento Notch, que foram descritos para D.

melanogaster e C. elegans (ARTAVANIS-TSAKONAS, et al, 1999; GREENWALD,

1998) foram analisados nos 30,988 contigs gerados pelo Projeto Transcriptoma de

S.mansoni a partir do alinhamento de ORESTES, obtidos dos seis estágios de vida

do parasita (VERJOVISK et al, 2003), disponível no endereço

http://verjo18.iq.usp.br/schisto/. A seguir, as seqüências recuperadas foram

analisadas com auxílio do algoritmo BLASTp, disponível em:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. As seqüências foram consideradas confiáveis

quando apresentavam um e value < e –5.

As seqüências referentes aos clusters de Notch (608600.1) e Presenilina

(705353.1) foram extendidas com o auxílio do banco de dados da TIGR (The Institute

for Genomic Research), disponível no endereço http://www.tigr.org/tdb/e2K1/sma1/

(Tabela 3). Para certificarmos que as seqüências recuperadas relacionavam com os

contigs mencionados acima, as seqüências foram submetidas ao BLAST2 presente

no endereço http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ e ao programa BLASTx presente

no banco de dados do Projeto Transcriptoma de S. mansoni.

Cluster Tamanho (nt) ORF Tamanho após extensão (nt) ORF 608600.1 763 nt 231 aa 984 nt 327 aa 705353.1 427 nt 135 aa 486 nt 161 aa

Tabela 3- Tamanho das seqüências dos clusters 608600.1 e 705353.1 após a extensão. Na extensão, foram utilizadas seqüências do banco de dados genômico da TIGR (http://www.tigr.org/tdb/e2K1/sma1/)


26

3.1.1. Comparação da via Notch entre S. mansoni e S. japonicum

As seqüências do banco de dados de S. mansoni que deram similaridade com

os componentes da via Notch, foram comparados com os 13.131 genes gerados

pelo Transcriptoma de Schistosoma japonicum (WEI, et al, 2004). As análises foram

realizadas pelo programa BLASTn(base de dados dsEST) presente no endereço

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Os alinhamentos foram considerado confiável

quando apresentavam um e value < que e–5.

3.2. Manutenção do ciclo biológico de S. mansoni

O ciclo biológico de S.mansoni, linhagem LE é rotineiramente mantido no

Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, do Departamento de Bioquímica e

Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.

Os ovos de S.mansoni presentes nas fezes de camundongos das linhagens

Swiss ou Balb/C previamente infectados com o parasita são recolhidos pelo método

de Hoffmann e expostos por aproximadamente 1 hora sob luz, para a liberação dos

miracídios. Os miracídios foram utilizados para infectar o hospedeiro intermediário,

os caramujos da espécie B. glabrata, que após 38 a 43 dias liberaram a forma

infectante do parasita, as cercárias, que por sua vez infectarão o hospedeiro

vertebrado. As cercárias são inoculadas nos camundongos via subcutânea e após

aproximadamente 45 dias os vermes adultos são recuperados do sistema porta-

hepático por perfusão (SMITHERS & TERRY, 1965).


27

Após a coleta, os parasitas foram mantidos em meio RPMI 1640 (Invitrogen) ou

em solução de NaCl a 0.9% e mantidos em gelo. Para a obtenção dos vermes

(macho ou fêmea), estes foram mecanicamente separados com o auxilio de um

pincel, sendo em seguida congelados e estocados à -70ºC, até o momento do uso.

3.3. Obtenção de ovos

Para a obtenção dos ovos, aproximadamente dez fígados de camundongos

infectados foram coletados durante perfusão e homogeneizados em 200 mL de

solução pH 8,3 contendo 1.79 g de Na2HPO4, 0.09 g de KH2PO4, e 20 mg de tripsina

(Invitrogen). O homogeneizado foi incubado em banho-maria a 37ºC durante 3 horas

e posteriormente, os ovos foram recuperados por tamização em malhas de 300 e

180 µm em solução de NaCl a 0.9%. (Castro-Borges, 2005).

3.4. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos

Inicialmente 120.000 cercárias ficaram em repouso por 90 minutos dentro de

um béquer no gelo. Posteriormente, o sobrenadante foi aspirado e descartado

cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta. As cercárias presentes no fundo do

béquer foram transferidas para tubos tipo falcon de 15 mL e submetidas a um pulso

de centrifugação cuja velocidade variou de 10.000 a 13.000 rpm. O sobrenadante foi

descartado e as cercárias foram ressuspendidas em 10 mL de água declorada

previamente filtrada em membranas com poros de 0.2 µm. O processo de

centrifugação e descarte do sobrenadante foi repetido por duas vezes.


28

Para a transformação mecânica das cercárias em esquistossômulos, as

cercárias presentes em tubo tipo falcon contendo 6 mL de meio RPMI 1640

(Invitrogen) foram agitadas em vortex sob velocidade máxima, durante 90 segundos

para a indução do rompimento da cercaria em corpo cercariano/cauda.

Em condições estéreis, os corpos e caudas cercarianas foram ressuspendidos

e transferidos para um frasco de cultura de 40 mL contendo 30 mL do meio RPMI

1640 suplementado com 100mg/mL de estreptomicina e 100mg/mL de ampicilina e

incubados em estufa a 37ºC/CO2 5%, durante um período de 4 horas.

Após o período de incubação, aproximadamente 28mL do sobrenadante foi

aspirado e descartado; cerca de 2 mL restantes foram distribuídos em dois tubos tipo

eppendorf de 2 mL. Posteriormente, para remoção das caudas, 1mL de meio RPMI

1640 foi adicionado em cada eppendorf e após 4 minutos, aproximadamente 1 mL

do sobrenadante foram descartados. Esse procedimento foi repetido de 3 a 5 vezes.

Após a remoção das caudas, os corpos cercarianos foram armazenados a –70 ºC

até o momento do uso (HARROP & WILSON, 1993).

3.5. Extração de RNA total

De posse do material biológico necessário (vermes adultos, ovos, cercárias,

esquistossômulos, hepatopâncreas de caramujos infectados (com 40 dias de

infecção como fonte de esporocistos) e hepatopâncreas de caramujos não

infectados), procedemos a extração do RNA total, como brevemente descrito a

seguir:


29

Cerca de 100mg de vermes adultos foram homogeneizados em 1mL de

TRIZOL LS (Invitrogen) com auxílio de um homogeneizador de tecidos (politron), até

completa solubilização. Em seguida, esse extrato foi incubado por 15 minutos a

temperatura ambiente.

Decorrido este intervalo de tempo, adicionamos a esse extrato, 200 µL de

clorofórmio, e as amostras agitadas em vortex vigorosamente por 1 minuto e

incubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos, sendo posteriormente

centrifugadas a 10000 x g por 10 minutos a 4 °C.

Após esta etapa de centrifugação, a mistura separa-se em uma fase inferior de

cor vermelha (fase fenol-clorofórmio), interfase e fase aquosa superior incolor. O

DNA fica na interfase e as proteínas na fase orgânica, enquanto o RNA permanece

exclusivamente na fase aquosa. A fase aquosa foi transferida para um tubo estéril

(tipo eppendorf) e o RNA foi precipitado pela adição de 500 µL de isopropanol. Após

30 minutos de incubação à temperatura ambiente, o RNA foi então recuperado por

centrifugação a 10000 x g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi desprezado e o

precipitado lavado com 1,0 mL de etanol 70% em água previamente tratada com

dietilpirocarbonato (DEPC), sendo em seguida centrifugado a 10000 x g por 8

minutos a 4°C. O precipitado final foi seco a vácuo e ressuspendido em 30 µL de

água tratada com DEPC.

Para a extração do RNA total das formas larvais de S. mansoni foram utilizados

aproximadamente 120.000 cercárias, 80.000 esquistossômulos e 5.000 ovos. A

Figura 6 mostra um gel típico do procedimento de extração que foi conduzido como

descrito acima.


30

3.6. Extração do DNA genômico

Os parasitas adultos mantidos a –70 °C foram transferidos para um grau de

porcelana juntamente com gotas de nitrogênio líquido, com a finalidade de facilitar a

pulverização dos vermes. Em seguida, procedeu-se a extração do DNA genômico,

conforme o seguinte protocolo simplificado por COSTA PI (Tese de Doutorado,

1997).

Para cada 100 mg de vermes pulverizados, foram adicionados 250 µL do

tampão de lise (Tris 0,05 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, 1% de N-laurilsarcosina e 100

µg/mL de proteinase K) e mantidos a 37 °C durante 1 hora. A seguir, foi

acrescentado 100µL de NaCl 5M e a mistura incubada por 10 minutos a 65°C.

Posteriormente, foi adicionado 50µL de uma solução de CTAB/NaCl a 10%, seguido

por uma incubação de 20 minutos a 65°C.

Figura 6 - Análise da integridade do RNA total. O RNA foi extraído pelo método de Trizol a partir de macho (M), fêmea (F), vermes adultos (VA), esporocisto (EP), caramujo não infectado (C-),ovos (O) , cercárias (CE) e esquistossômulos (ES). Cerca de 3 µg de RNA de cada preparação foram analisadas em gel de agarose/formaldeído a 1% e visualizados com a coloração de brometo de etideo.

M F VA EP C- O CE ES


31

O DNA foi extraído com clorofórmio (v/v) e posteriormente precipitado pela

adição (v/v) de isopropanol e incubado à -20°C, durante 30 minutos. Posteriormente

o DNA foi centrifugado a 12000 x g, lavado com etanol a 70%, seco, ressuspendido

em TE e armazenados a 4°C.

A Figura 7 mostra uma preparação de DNA genômico realizada como descrito

acima e analisada em gel de agarose.

3.7. Quantificação de DNA e RNA

As concentrações tanto de DNA como de RNA foram estimadas a partir da

medida de absorbância a 260nm. Uma unidade de absorbância a 260nm

corresponde aproximadamente a 50µg/mL de DNA (fita dupla) e 40µg/mL para RNA

e DNA de fita simples. O grau de pureza da preparação foi estimado através da

relação entre as leituras a 260 e 280nm. As preparações foram consideradas boas,

quando o valor da razão A=260/280 variava entre 1,8-2,2.

Figura 7- Análise da integridade do DNA genômico. O DNA genômico foi extraído pelo método do CTAB a partir de vermes adultos. Cerca de 50 ng de DNA genômico foi analisado em gel de agarose 0.7% e visualizados com coloração de brometo de etídio.


32

3.8. Síntese dos oligonucleotídeos iniciadores

Para a idealização dos oligonucleotídeos iniciadores, a seleção dos clusters,

correspondentes aos fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e Supressor de

Deltex foram realizadas baseadas em dois critérios: 1º presença do domínio que

caracteriza a proteína e 2º tamanho da seqüência.

Desse modo os oligonucleotideos correspondentes para aos fragmentos

gênicos de Notch e Presenilina foram idealizados com base nas seqüências dos

clusters 608600.1 e 705353.1, que foram posteriormente extendidas com o auxílio

do banco de dados da TIGR e descrito em 3.1. Os oligonucleotídeos para Supressor

de Deltex foram idealizados com base na seqüência do cluster 610048.1. Os

oligonucleotídeos iniciadores para os fragmentos gênicos em estudo foram

idealizados utilizando o programa Generunr. A Tabela 4 mostra as seqüências dos

oligonucleotideos utilizadas com as respectivas temperaturas de anelamento e os

tamanhos dos produtos esperados. Os oligonucleotideos idealizados estão indicados

nas seqüências dos referentes clusters, mostradas na Figura 8.

Gene Número do

cluster

Seqüência dos oligonucleotideos Temperatura de

anelamento

Produto esperado

(pb) Notch 608600.1 5'-CATGTGACAAAGGGTATCACC-3’

3'-GACATACACATTCTCCAGTCG-5'

47º C 850

Presenilina 705353.1 5’-CCGAACCGATGCAATTGTAG -3' 3'-GAACACACGTTCAATGGCTG- 5'

47º C 400

Supressor de Deltex

610048.1 5’-TATGGGAGTCCCATTGCAAT-3’ 3’-AATCTCTGGCATACCGGATA- 5’

47º C 800

Tabela 4-Seqüências dos oligonucleotideos específicos referentes a Notch, Presenilina e Supressor de Deltex. Os oligonucleotídeos de Notch e Presenilina foram idealizados com base nas seqüências dos clusters 608600.1 e 705353.1 que foram posteriormente extendidos com o auxílio do banco de dados da TIGR. Nota-se que a temperatura de anelamento para os três oligonucleotideos é de 47ºC e os produtos esperados são de 850 pb para Notch, 400pb para Presenilina e 800 pb para Supressor de Deltex.


33

Figura 8- Seqüência consenso obtida durante o Projeto Transcriptoma de S. mansoni: A)

Receptor Notch (608600.1), (B) Presenilina (705353.1), C) Supressor de Deltex (610048.1). Em negrito e sublinhado estão os oligonucleotídeos direto e reverso.

C

1 ATGGATGAAACACAACCTCTCCCGCCTGGATGGGAGAAACGTTATACGGCCCAGGGACAA 60

61 AGGTTTTTCATTGATCATAATACCCATACTACTACCCTTGTTGATCCACGTACTGGACAA 120

121 CATGCTGGTTCACTAGGTAGTATGGGAGTCCCATTGCAATATGAAAGGAATTTCCGATCC 180

181 AAAGTGAATTATTTTCGTGCTTGTTGTACAAATGCCATGTTAAATGGGCAAACTAAACTT 240

241 CTTATATCAAGAGACAATTTATTAGAGGACTCGTTCCAACTGGTATCTCAAATGTCTTCA 300

301 TCTGGTTTAAGAAGACGTTTATCAATTACATTTCTACATGAAGAAGGTTTGGATTACGGT 360

361 GGAGTAGCCAGAGAATGGTTCTATCGTCTTTCAAGAGAAATTTTAAACCCAATGTTTGGC 420

421 TTGTTTGAGTATACTGGAACAGATTATGCCTTACAAGTAAATCCAGCCTCTCATGTTAAT 480

481 CCAAATCATATGGCGTATTTTCGATTTGTTGGACGCTTTATTGGTATGGCACTTTTTCAT 540

541 GGTCGCTGTATTGACGGCGGGCTTACTCTTGCTTTTTATAAACAAATTTTGAAGCGGAAA 600

601 TTAACATTAGAAGATCTTGGTCATACGGATCACAGTTATTATCAATCGTTAATTTATGTC 660

661 AGAGACAATCCAGTTGATGAGTGTGATTTGGACTTGTACTTTATTGGAACCTATGACCTT 720

721 TTAGGCGTTTTGCATGAAGACGAACTTATTGAAGGTGGCAAAGATATTAAAGTGACTGAA 780

781 GAAAATAAATCCGATTATATCAGACTGATGGTTGATTGGCGGTTCAACAGAGGAGTAAAA 840

841 AAACAAACAGAAGAAATTCACAAAGGTATTTTTGAAGTACTAAATCCCGAATGGCTGGAA 900

901 TTATTCGATGAGCGTGAACTTGAACTCCTATTATCCGGTATGCCAGAGATTGATGTTGAT 960

961 GATTGGGAAAAGAACACGGTCTACATAAAGTACACACGATCAAGTAAACAGATTATTTGG 1020

1021 TTTTGGAAGTTGATTCAAAAACTTGATAATGAACATCGTGCTCGTCTTCTTCAATTCGTC 1080

1081 ACTGGTACCTGTCATTTACCATTAGGAGGCTTCTCTGAATTGACTGGCAGCGGTGGTCGT 1140

1141 CAATTATTTTGTATTGAGCGTACAGGTGATGAACAATGGCTTCCACGTAGTCACACATGT 1200

1201 TTCAACCGGTTAGATTTACCGCCATACAATTCGTACGATCAATTGTGCGAAAAACTGCAA 1260

1261 ATGGCAATTGAAGAAACTAAGGGATTTGGACAAGAATAA 1299

A

1 ATGGGTCATATTATTGTACATGTGACAAAGGGTATCACCAAGATTACAGAGGTCACTAGT 60

61 CTTCCAAACAAATGTAGTCCTGAATGTGTTCATGGACAAGGCGAATGTACATCTAATGGA 120

121 AAATGCTTGTGTAATCCAGGTTTTCGAGGGTTATCTTGTGAGACAGACGTAGATGAATGC 180

181 GCTGAAGGAAAACATAATTGTCAACAGGAATGTATCAATACTCCTGGGTCTTTTAAATGT 240

241 TCTTGTCATTCAGGTTACAAATTATCCACTGTAGATCCATCAAAATGTGAACCTATTTCT 300

301 TGTCCTTCTCAATGCAATTTAATAGATGGAGAATGTGACTGCGAATGCAAGCTTGGACAT 360

361 TTTGGACTTAATTGTAATCAAACAGTAGATTCATGTGCAATTAAACCATGTGACCAAATT 420

421 TGTGTGGATTTAGGTGATGGGAAGTATACATGCAAATGTAATGAAGGTTTTGAACCAAGT 480

481 CCAAATAATCCTAGACGATGTCAGCGTATATGTAAAGATGGTATAGACTGTATATATGGA 540

541 AGCTGTCGAACTGTGTTTTCAAATGACACAGATCAATCTTTATGTACTTGCCTAGAAGGA 600

601 TTTTACGGAACAAACTGTCAAAACGATGTAAACGAATGCTTGAATGAGAATGGTCAAAAA 660

661 CATTTTTGTGAACATCATTGCATAAATACATTAGGATCATACCAATGTTTTTGTGATCCG 720

721 GATTATGAATTACAATCTGATGGTCGAACGTGTAAAAAACAGTTTAAAGGTGAAATGAAA 780

781 TGTCCTGAATACTGCCTAAATGGTGCAACTTGTAAATCGACTGGAGAATGTGTATGTCAA 840

841 CCTGGTTATGAAGGAATATATTGTGAAAAAATAAAAGATATTTGTGCAATACTTAAGTTA 900

901 TGTGATCAACAATGTTTTCCTAAAGAAGTAAGTCGACTACATTATTTAATAACAGACAAC 960

961 ATTTGTGATACTGTACTTAAGTAG 984

B 1 ATGACAGGGAATTCAAGAAACATGTTAAATATTCCTAATAATACGTCCCGAACCGATGCA 60

61 ATTGTAGTTGATACTCCTGATGACAATACGATTAATAATGATGCCAGGAATAACAATGAA 120

121 ACTATATCACAGGCACCTCATGAAACAGATACACTTGTAGCAGGCCGACCCAATCGTTGG 180

181 CAAGAACTGCAAGCAGATTTAATTGATCGTGACTCAAAGGGTGTAAAACTTGGTTTAGGC 240

241 GATTTTGTATTTTATAGTTTACTGATTGGTCGTGCAACACTTGATGGCGATGCAGTCACT 300

301 GTGGTCACATGTTATGTGGCTATATTGGTTGGAATGTGTATTACTGTTATAGTATTGGGA 360

361 ATTACACGACAAGCATTACCAGCTTTACCAATATCCATAACATGTGGTATATTATTTTAT 420

421 TTTGTCAGTTCAGCGACGATATCACCGTTTCTTGAAGCAACAGCCATTGAACGTGTGTTC 480

481 TTCTGA 486


34

3.9. RT-PCR (Transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase)

Para a obtenção dos cDNAs codificando para Notch, Presenilina e Supressor

de Deltex em S. mansoni e para analisar a presença desses transcritos nas várias

fases evolutivas do parasita, utilizamos a técnica de RT- PCR.

Nesse procedimento, inicialmente foi sintetizada a fita simples de cDNA,

utilizando o kit ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) e como iniciador oligo

(dT), como resumidamente descrito abaixo.

Foram utilizados 3µg de RNA total obtido a partir de parasitas e suas formas

intermediárias, 50pmol do iniciador oligo (dT) e água livre de RNAse, para um

volume final de 10µL. Esta mistura foi incubada por 5 minutos a 65ºC, sendo em

seguida adicionado dNTPs, tampão da enzima e enzima transcriptase reversa.

Posteriormente a amostra foi transferida para um termociclador, sendo incubada por

60 minutos a 50ºC. Após este intervalo de tempo, a reação foi interrompida,

incubando-se as amostras por 5 minutos a 85ºC. Em seguida foi adicionado 1,0 µL

de RNAse H e a amostra foi incubada durante 20 minutos a 37ºC e posteriormente

estocada a -20ºC.

Para a amplificação do cDNA de fita dupla e do DNA genômico, foi adotado o

seguinte procedimento. Em um tubo eppendorf de 200µL foi adicionada a mistura de

reação para um volume de 50µL. Os componentes desta mistura são: água (RNAse

livre), tampão para Taq DNA polimerase, MgCl2, iniciadores gene específicos direto e

reverso, dNTPs, cDNA ou DNA genômico e a enzima Taq DNA polimerase Platinum

(Invitrogen). Como controles negativos das reações de PCR, foram utilizados todos

os componentes descrito acima, exceto o cDNA ou DNA genômico.


35

A reação de amplificação de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex

consistiram de uma etapa de desnaturação a 95ºC durante 3 minutos, seguido de 40

ciclos, de acordo com seguinte programa: desnaturação a 95º C durante 1 minuto; 1

minuto de anelamento a 47ºC e extensão a 72ºC durante 1:3 minutos. Ao término

dos 40 ciclos a reação foi mantida por um tempo adicional de 10 minutos a 72 ºC e

posteriormente a 4ºC.

Em seguida, 10µL desta reação foram analisadas em gel de agarose 1,5% e

visualizados com a coloração com brometo de etídeo (0,5 µg/mL).

3.10. Purificação do produto de PCR

Após a análise do PCR no gel de agarose, as bandas de interesse (850pb para

Notch, 400pb para Presenilina e 800pb e 850pb para Supressor de Deltex), foram

removidas do gel com o auxílio de um estilete. A purificação das bandas foram

realizadas utilizando o Kit In Concert Rapid Gel Extraction System (Invitrogen)

conforme o protocolo simplificado.

As bandas removidas foram transferidas para um tubo eppendorf de 2 mL. Em

cada eppendorf foram adicionados 500 µl do tampão de solubilização, e incubado

por 15 minutos a 50ºC. Posteriormente, o conteúdo do eppendorf foi transferido para

uma coluna de purificação e centrifugado a 12000 X g por 1 minuto. O eluído foi

descartado e após adicionar 500 µL da solução de eluição, a amostra ficou em

repouso durante 1 minuto e depois novamente centrifugado a 12000 X g por 1

minuto. Após esse procedimento o eluído foi descartado e adicionado 700 µL de

tampão de lavagem, novamente repouso por 1 minuto e depois centrifugado a


36

12000X g por 1 minuto. Por fim, cada coluna foi transferida para um tubo eppendorf e

adicionado aproximadamente 30 µl TE (TRIS-EDTA) previamente aquecido no

centro da coluna, e centrifugado 12000 x g. A eficiência da purificação foi analisada

em gel de agarose 1,5% e visualizados com a coloração com brometo de etídeo (0,5

µg/mL.

3.11. Clonagem do produto de PCR

Os produtos de PCR purificados foram posteriormente clonados no vetor

pGEM- T Easy (Promega), utilizando o kit conforme instruções do fabricante.

Cerca de 5,0 µL das reações de ligação foram utilizados nos procedimentos de

transformação. Nestes experimentos foram utilizadas células competentes

preparadas pelo método descrito por HANAHAN (1985).

O plasmídio foi introduzido em bactéria competente E. coli da linhagem DH5α,

através de choque térmico (90 segundos a 42°C; 3 minutos em banho de

gelo),crescimento sob agitação em meio SOC (SOB enriquecido com glicose) a 200

RPM e 37°C, por 1h e 30 min. Decorrido este intervalo, a suspensão bacteriana foi

plaqueada em meio LB/ampicilina contendo X-GAL(20µL/mL), para que ocorra a

seleção dos plasmídeos com inserto (colônias brancas) e sem inserto (colônias

azuis) e mantidas em estufa durante uma noite a 37°C.


37

3.12. Minipreparação de DNA plasmidial

Após a realização da clonagem no vetor pGEM-T Easy (Promega),

selecionamos dez colônias que poderiam conter inserto (seleção azul/branca) e

posteriormente, foram crescidas em LB/ampicilina durante uma noite e submetidas à

amplificação específica como descrito a seguir.

Os componentes da mistura de reação foram: água (livre RNAse), tampão para

enzima Taq DNA polimerase, MgCl2, oligonucleotideos direto e reverso, dNTPs, 1,0

µL da cultura bacteriana e enzima Taq DNA polimerase. Como iniciadores foi

utilizado o par de oligonucleotídeos M13 Universal (Invitrogen). A reação de

amplificação consistiu de 40 ciclos, segundo o programa: desnaturação a 95ºC

durante 45 segundos; 45 segundos de anelamento a 55ºC e extensão a 72ºC

durante 1 minuto. Ao término dos 40 ciclos a reação foi incubada por um tempo

adicional de 5 minutos a 72ºC e mantida posteriormente a 4ºC. Cerca de 10µL dessa

preparação foram analisados em gel de agarose 1,5%e visualizados com a

coloração com brometo de etídeo (0,5 µg/mL)

Após identificarmos quais colônias continham os insertos com os pesos

moleculares esperado, ou seja, em torno de 850 pb, 400 pb e 800pb, procedemos à

extração do DNA plasmidial segundo o método brevemente descrito.

Cerca de 1,5 mL da cultura bacteriana crescida em LB/ampicilina, durante uma

noite foram transferidos para tubos "eppendorf" e o precipitado bacteriano, foi obtido

por centrifugação a 10.000 x g.

Em seguida, este precipitado foi solubilizado em 300 µL de solução contendo

Tris-HCl 500 mM; EDTA 10mM e 100 µg de Rnase A; pH em 8,0. Após 15 minutos


38

de incubação à temperatura ambiente foram adicionados, 300 µL de solução

contendo NaOH 200mM e SDS 1%, e incubou-se 5 minutos à temperatura ambiente.

Logo após, adicionou-se 300 µL da solução de acetato de potássio 3.0 M pH 5,5 e

centrifugou-se durante 10 minutos a 14.000g. O sobrenadante foi transferido para um

novo tubo e em seguida, adicionados 400·µL de isopropanol. Posteriormente, as

amostras foram centrifugadas durante 10 minutos a 14.000 x g à temperatura

ambiente. Decorrido este intervalo de tempo, foi descartado o sobrenadante e o

precipitado resultante foi lavado com 700 µL de etanol 70%. As amostras foram

novamente centrifugadas a 4oC por 5 minutos.

Por fim, descartou-se o etanol e o precipitado seco foi ressuspendido em 23 µL

de tampão TE (EDTA 1.0 mM; Tris 10mM; pH em7,5). Alternativamente, para se

obter uma preparação de plasmídeos com elevado grau de pureza, utilizamos o kit

Concert Rapid Plasmid System (Invitrogen), conforme instruções do fabricante.

3.13. Sequenciamento

Para o sequenciamento dos DNAs genômico e do cDNAs, utilizamos a técnica

do término do crescimento da cadeia, inicialmente desenvolvida por SANGER et al,

1997. As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o kit Big-Dye

Terminator (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante e as

reações, analisadas no sequenciador automático de DNA, ABI 3100 Genetic

Analyzer (Applied-Biosystems). Os plasmídeos foram sequenciados nas direções

“direta” e “reversa".


39

A Figura 9 mostra um cromatograma típico obtido utilizando o protocolo descrito

acima.

3.14. Análise computacional das seqüências

As seqüências obtidas foram submetidas à busca de similaridade com

nucleotídeos e aminoácidos utilizando os algoritmo BLASTn (base de dados dsEST)

e BLASTx, respectivamente disponível no site www.ncbi.nlm.nih.gov. Também foi

utilizado o algoritmo PFAM (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/) para identificar os

domínios conservados nas seqüências de aminoácidos preditas. Os alinhamentos

das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos de S. mansoni obtidas com as

seqüências ortólogas, foram realizada com o auxílio do programa CLUSTALW

(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) e do algoritmo BLAST 2 www.ncbi.nlm.nih.gov.

3.15. Northern Blot

As confecções dos géis de agarose/formaldeído 1,2% foram realizadas de

acordo com SAMBROOK et al., 1989. Para cada amostra de RNA total de vermes

adultos (10 a 20µg), foi adicionado o tampão da amostra de RNA (formamida

deionizada 62,5%, formaldeído 1,14M, MOPS 1,25X, azul de bromofenol 0,25% e

Figura 9- Cromatograma obtido após a leitura em gel de seqüênciamento automático. O aparelho utilizado foi o sequenciador automático ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied-Biosystems).


40

brometo de etídeo 0,5µg/mL de concentração). As amostras de RNA foram

desnaturadas a 65ºC por 15 minutos, seguido de banho de gelo por 3 minutos,

aplicadas nos poços de gel de agarose e a corrida eletroforética ajustada para 90

volts durante 1 hora e 30 minutos.

Em seguida, os géis foram tratados com SSC 10X durante 1 hora, e os RNAs

transferidos para uma membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham - Biosciences)

durante 18 horas. Posteriormente, o sistema de transferência foi desmontado e as

membranas lavadas durante 5 minutos em SSC 6X, colocadas entre duas folhas de

papel de filtro 3mm, embrulhada em papel alumínio e mantidas em estufa a 80ºC por

duas horas para permitir a imobilização dos RNA na membrana. Decorrido esse

intervalo de tempo, as membranas foram armazenadas a temperatura ambiente até

o momento do uso.

3.16. Preparo da sonda radioativa

Para a obtenção das sondas radioativas, utilizamos a técnica de Random

Primer Extension (FEINBERG & VOGELSTEIN, 1983), e o kit Random Primer

Labelling System (Invitrogen). Esse procedimento permite obter fragmentos de DNA

marcados com 32P que podem ser empregados como sonda em experimentos de

hibridização. O método baseia-se na utilização de hexanucleotídeos sintéticos

aleatórios, como iniciadores, para a polimerização de qualquer segmento de DNA

molde. Para que ocorra a síntese de uma nova fita, são necessários uma mistura de

deoxinucleotídeos e o fragmento Klenow da DNA polimerase I. Neste caso, um dos

deoxinucleotídeos, o dCTP, possui um 32P na posição α.


41

Na reação de obtenção da sonda, cerca de 50-100ng do cDNA de Notch e

Presenilina foram desnaturadas por 5 minutos a 100°C, sendo em seguida

adicionados 2µL de cada um dos deoxinucleotídeos (dTTP,dGTP e dATP, na

concentração final de 0,5mM), 4µCi [α32P] dCTP, 1 unidade de DNA polimerase I

(fragmento Klenow) e água milli-Q estéril para completar um volume final de 50µL. A

reação foi incubada a temperatura ambiente por 1 hora, sendo posteriormente

interrompida pela adição de 2µL de EDTA 0,5M. Em seguida, para a remoção dos

nucleotídeos não incorporados, a sonda foi purificada em coluna de Sephadex G-50,

previamente equilibrada com tampão NT (Tris-HCl 10mM, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM

pH em 8,0). A coluna foi montada em pipeta Pasteur, contendo lã de vidro na sua

extremidade e o empacotamento feito por sedimentação. Foi adicionado à sonda,

7µL do corante blue dextran e a mistura aplicada no topo da coluna. A sonda

marcada foi eluida no mesmo tampão (NT), sendo recolhida em um tubo eppendorf.

3.17. Reação de Hibridização

As membranas de náilon (contidas em saco plástico), inicialmente foram pré-

hibridizadas a 65°C, sob agitação moderada, no mínimo 4 horas, em uma solução

previamente aquecida composta por: 6X SSC, 2X reagente de Denhardt e 0,1%

SDS (100mg/mL) e 20µg de DNA de esperma de salmão para 1mL de solução de

pré-hibridização, por 4 a 6 horas sob agitação leve.

Posteriormente, foi adicionada a sonda previamente desnaturada, com uma

atividade específica de 2x108 cpm/µL. A incubação foi mantida por 18 horas. Em

seguida, para retirar o excesso de sonda não incorporada e remover os híbridos não


42

homólogos, as membranas foram lavadas seqüencialmente, uma vez, com as

seguintes soluções:

1) Solução 1: SSC 2X, SDS 0,1X, 15 minutos a temperatura ambiente;

2) Solução 2: SSC 0,5X, SDS 0,1%, 15 minutos, temperatura ambiente, com

agitação moderada;

3) Solução 3: SSC 0,1X, SDS 0,1%, 15 minutos, temperatura ambiente, com

agitação moderada;

4) Solução 4: SSC 0,1X, SDS 1% por 30 minutos a 50°C, com agitação

moderada.

3.18. Autoradiografia

Para verificar as regiões de homologia, as membranas obtidas após a reação

de hibridização, foram levemente secas, em papel de filtro, embrulhadas em filme de

PVC e acondicionada em cassetes contendo intensificador e expostas a filmes

Kodak (X-OMAT-XAR-5). O período de exposição foi variável e de acordo com a

intensidade do sinal, monitorada previamente com contador VICTOREEN, modelo

489-110C.

As revelações foram feitas de acordo com as instruções do fabricante,

utilizando como solução reveladora o Revelador e Reforçador GBX e como fixadora,

o Fixador e Revelador GBX (KODAK).

4- Resultados

Resultados

44

4.1. Análise in silico da via de sinalização Notch

A presença dos componentes da via de sinalização Notch, descritos para D.

melanogaster e C.elegans (ARTAVANIS-TSAKONAS, et al, 1999; GREENWALD,

1998) foram analisados nos 30,988 contigs gerados pelo Projeto Transcriptoma de

S.mansoni (VERJOVISKI et al, 2003). Posteriormente, as seqüências recuperadas

foram analisadas conforme descrito em Materiais e Métodos.

A Tabela 5 mostra os genes supostamente envolvidos com a via Notch de

sinalização em S.mansoni. Como podemos observar, essas análises permitiram a

identificação de oito clusters para o receptor Notch, um do ligante Delta, três do

ligante Numb, dois para o Supressor de Hairless, dois para Supressor de Deltex, dois

para Desintegrina, dois para Preselinina e um para a Convertase Furina-Símile,

sugerindo fortemente que todos os principais componentes dessa via apresentam

sequências depositadas no banco de dados.

Resultados

45

Clusters Domínios Tamanho nt ORF e value Organismo Ortólogo

Tamanho do ortologo

Nº de acesso no GenBank

Receptor Notch

608341.1 CBM-14 446 122 aa e-08 Scalloped wings 2653 aa gi: 1389670 608600.1 EGF 763 231 aa e

-14 Xenopus leavis 2524 aa gi: 104252

606847.1 561 76 aa e-05

Danio rerio 2437 aa gi: 18859115 701364.1 EGF 333 58 aa e

-08 Danio rerio 2437 aa gi: 18859115

709630.1 EGF 433 99 aa e-12

Mouse 2531 aa gi: 1352528 718490.1 348 81 aa e

-14 Mus musculus 1687 aa gi: 6679094

714129.1 EGF 257 54 aa e-05

Drosophila melanogaster

1451 aa gi: 24641704

702241.1 EGF 413 133 aa e-05


2703 aa gi: 85085

Ligante Delta

604155.1 846 286 aa e-12

Danio rerio 615 aa gi: 18858543 Ligante de

Numb (LNX)

603097.1 PDZ 582 175 aa e-18

Homo sapiens 673 aa gi: 13872241 709509.1 317 50 aa e

-12 Homo sapiens 673 aa gi: 24025688

612502.1 WD40 401 112 aa e-25


1490 aa gi: 6537312

Supressor de Hairless

604025.1 TIG 1495 190 aa e-57

Xenopus leavis 481 aa gi: 1477787 708460.1 493 88 aa e

-27 Xenopus leavis 481 aa gi: 1477787

Supressor de Deltex

610048.1 HECT 2004 432 aa e-145

C. elegans 792 aa gi: 25143393 602992.1 HECT 1294 338 aa e


Convertase Furina-Símile,

712047.1 Peptidase S8

586 105 aa e-30

Aplysia californica

824 aa gi: 790671

Presenilina 606421.1 Rhomboid 914 157 aa e


705353.1 Presenilin 427 135 aa e-11

Helix lucorum 582 aa gi: 1066248

Desintegrina ADAM

611586.1 776 181 aa e-22

Mus musculus 544 aa gi: 6680638 611924 784 182 aa e

-15 Rattus norvegicus

1213 aa gi: 34870701

Tabela 5- Identificação "in sílico" de genes supostamente envolvidos com a via de sinalização Notch A identificação das seqüências que codificam para os componentes da via Notch em S. mansoni foram realizadas utilizando o banco de dados do Projeto Transcriptoma de S. mansoni. As seqüências indicadas pelo programa BLASTp são consideradas confiáveis quando o e value for ≤ e-5.

Resultados

46

Como mostra a Figura 10, também foi possível verificar que a maioria das

seqüências do Projeto Transcriptoma de S.mansoni que deram similaridade com

componentes da via Notch, foram obtidas utilizando mRNA dos estágios larvais

deste parasita. Os transcritos para o receptor Notch foram detectados na fase de

esporocisto (EP) e esquistossômulos (ES), estando pouco representado ou mesmo

ausente em verme adulto (VA), macho (M), fêmea (F), ovos (O), miracídio (MI) e

cercária (CE). No caso do transcrito de Supressor de Deltex, foi possível verificar que

a presença do transcrito na fase de verme adulto e a sua ausência nas fases de

macho e fêmea podem ser devido ao menor número de seqüências produzidas com

mRNA de parasitas adultos separados (macho e fêmea).

Figura 10- Estimativa da expressão dos genes relacionados à via Notch durante o ciclo de vida do S. mansoni. Os dados foram obtidos a partir da análise “in silico” do banco de dados do Projeto Transcriptoma de S. masoni. Abreviaturas: VA, mRNA de verme adulto; M, mRNA de macho; F, mRNA de fêmea; O, mRNA de ovos; MI mRNA de miracídio; EP, mRNA de esporocisto; CE, mRNA de cercária; ES, mRNA de esquistossômulo com 7 dias de cultivo in vitro.

0

5

10

15

20

25

VA CE O EP ES MI M F

fases do ciclo do parasita

nº d

e tr

ansc

ritos

Notch

Ligante Delta

Ligante de Numb

Supressor de Hairless

Supressor de Deltex

Convertase Furina-Símile

Presenilina

Desintegrina

Resultados

47

Os transcritos de S. mansoni que deram similaridade com os componentes da

via Notch de outros organismos, foram analisados quanto a sua presença no banco

de dados gerado pelo Projeto Transcriptoma de S. japonicum (WEI, et al.2004)

conforme descrito em Materiais e Métodos.

Como mostra a Tabela 6 essa análise, ao contrário do que foi observado para o

S. mansoni, não identificou a maioria dos componentes da via de sinalização

mediada pelo receptor Notch em S. japonicum. Esse resultado pode ser justificado

pelo fato de que a maioria das seqüências de S. japonicum depositadas nos bancos

de dados públicos foram geradas a partir de bibliotecas de cDNA construídas a partir

de mRNA de ovos, verme adulto, macho e fêmea (WEI, et al, 2004). Indiretamente

esse resultado corrobora com os obtidos no banco de S. mansoni, sugerindo que os

transcritos relacionados com a via Notch são mais abundantes nos estágios larvais

relacionados tanto com o hospedeiro invertebrado como vertebrado,

respectivamente esporocistos e esquistossômulos.

Clusters do S. mansoni Nº de acesso do S. japonicum no GenBank

Estágio do desenvolvimento

e value

Ligante Delta 604155.1 gi: 28326430 M 1e-19 604025.1 gi: 28345625 O

Supressor de Deltex 610048.1 gi: 28354711 F 0.0

Presenilina 606421.1 gi: 28352486 F 8e-34 705353.1 gi:28332365 M 5e-45

Tabela 6- Comparação dos componentes da via Notch entre S. mansoni e S. japonicum. A comparação foi realizado utilizando o programa BLASTn. As seqüências indicadas pelo programa BLASTn são consideradas confiávies quando o e value for ≤ e5 . .Abreviaturas: M, mRNA de macho; F, mRNA de fêmea; O mRNA de ovos.

Resultados

48

4.2. Amplificação dos fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e Supressor

de Deltex a partir do DNA genômico do S. mansoni

Com objetivo de confirmamos os resultados obtidos na análise in silico,

realizamos reações de amplificações de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex a

partir de oligonucleotídeos gene-específico e DNA genômico, como descrito em

Materiais e Métodos.

Como podemos observar na Figura 11, os oligonucleotídeos para Notch

amplificaram um fragmento de aproximadamente 850 pb (A), para Presenilina,

utilizando os oligonucleotídeos específicos obtivemos um fragmento de

aproximadamente 400pb (B). Podemos observar que os oligonucleotídeos gene-

específico para Supressor de Deltex, amplificaram dois fragmentos, um de

aproximadamente 800 e outro com 850 pb (C).

Resultados

49

4.3. Sequenciamento e análise computacional dos fragmentos gênicos de

Notch, Presenilina e Supressor de Deltex

Para confirmarmos se os produtos amplificados estavam relacionados com os

genes em estudo, os produtos obtidos foram purificados, clonados no vetor pGEMT-

PM VA C

600pb 400pb

PM VA C

600pb

850 pb

PM VA C

600pb

850 pb 800 pb

A B

C

Figura 11- Amplificação dos fragmentos gênicos correspondentes ao gene Notch (A), Presenilina (B) e Supressor de Deltex.(C). Aproximadamente 50 ng de DNA genômico proveniente de vermes adultos foram utilizados nas reações de amplificações (PCR). Cerca de 10µl da preparação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% e corados com brometo de etídeo a 0,5 µg/ml. Abreviaturas: (PM) Peso Molecular 100pb, (VA) verme adulto, (C) controle negativo da reação de PCR.

Resultados

50

Easy (Promega) e seqüenciados em sequenciador automático ABI 3100 Genetic

Analyzer (Applied-Biosystems) como descrito em Materiais e Métodos.

As seqüências foram submetidas à busca de identidade com outras seqüências

de nucleotídeos e aminoácidos depositadas no GenBank (NCBI-NIH, Bethesda,

USA), utilizando-se o algoritmo BLASTn (base de dados dbEST) e BLASTx.

Podemos notar que, utilizando as seqüências de nucleotídeos e a base de

dados dbEST, foi possível verificar que as seqüências de Notch, Presenilina e

Supressor de Deltex apresentam identidade com diversas EST obtidas de S.

mansoni. No caso da Presenilina e do Supressor de Deltex as seqüências também

apresentam identidade com seqüências de S. japonicum, como pode ser observado

nas Tabela 07 A, B e C. Os resultados da análise computacionais também

mostraram que o fragmento de 850 pares de bases obtida com os oligonucleotídeos

específicos para Supressor de Deltex era inespecífico.

A

Nº de acesso no GenBank Organismo Identidade % e value

gi:34714368 S. mansoni 99% 0.0 gi:34707103 S. mansoini 99% 0.0

B

Nº de acesso no GenBank Organismo Identidade% e-value gi:12354025 S. mansoni 100% 0.0 gi:34712029 S. mansoni 97% 0.0

gi:5788730 S. mansoni 99% e-120 gi:5788642 S. mansoni 100% e-154 gi:60232785 S. japonicum 90% e-105 gi:60234653 S. japonicum 91% e-101

Resultados

51

C

Para a identificação das prováveis regiões codificadoras, as seqüências obtidas

após o sequenciamento foram submetidas à análise utilizando o algoritmo ORFfinder

disponível no endereço: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html.

Na Figura 12-A, B e C, podemos observar que os fragmentos amplificados

possuem uma seqüência predita com 273, 144 e 270 aminoácidos, para Notch,

Presenilina e Supressor de Deltex, respectivamente.

Nº de acesso no GenBank Organismo Identidade % e-value gi:34629380 S. mansoni 99% 0.0 gi:34689860 S. mansoni 99% 0.0 gi:34714442 S. mansoni 98% 0.0 gi:28354711 S. japonicum 88% e-161

Tabela 7- Análise das seqüências de Notch (A), Presenilina (B) e Supressor de Deltex (C) utilizando o programa BLASTn (base de dados dbEST).A identidade indica a % de resíduos idênticos observados na região de alinhamento. As seqüências indicadas pelo programa BLASTn são consideradas estatisticamente confiáveis quando o e value for ≤ e-5.

Resultados

52

A

1 catgtgacaaagggtatcaccaagattacagaggtcactagtctt

H V T K G I T K I T E V T S L

45 ccaaacaaatgtagtcctgaatgtgttcatggacaaggcgaatgt

P N K C S P E C V H G Q G E C

90 acatctaatggaaaatgcttgtgtaatccaggttttcgagggtta

T S N G K C L C N P G F R G L

135 tcttgtgagacagacgtagatgaatgcgctgaaggaaaacataat

S C E T D V D E C A E G K H N

180 tgtcaacaggaatgtatcaatactcctgggtcttttaaatgttct

C Q Q E C I N T P G S F K C S

225 tgtcattcaggttacaaattatccactgtagatccatcaaaatgt

C H S G Y K L S T V D P S K C

270 gaacctatttcttgtccttctcaatgcaatttaatagatggagaa

E P I S C P S Q C N L I D G E

315 tgtgactgcgaatgcaagcttggacattttggacttaattgtaat

C D C E C K L G H F G L N C N

360 caaacagtagattcatgtgcaattaaaccatgtgaccaaatttgt

Q T V D S C A I K P C D Q I C

405 gtggatttaggtgatgggaagtatacatgcaaatgtaatgaaggt

V D L G D G K Y T C K C N E G

450 tttgaaccaagtccaaataatcctagacgatgtcagcgtatatgt

F E P S P N N P R R C Q R I C

495 aaagatggtatagactgtatatatggaagctgtcgaactgtgttt

K D G I D C I Y G S C R T V F

540 tcaaatgacacagatcaatctttatgtacttgcctagaaggattt

S N D T D Q S L C T C L E G F

585 tacggaacaaactgtcaaaacgatgtaaacgaatgcttgaatgag

Y G T N C Q N D V N E C L N E

630 aatggtcaaaaacatttttgtgaacatcattgcataaatacatta

N G Q K H F C E H H C I N T L

675 ggatcataccaatgtttttgtgatccggattatgaattacaatct

G S Y Q C F C D P D Y E L Q S

720 gatggtcgaacgtgtaaaaaacagtttaaaggtgaaatgaaatgt

D G R T C K K Q F K G E M K C

765 cctgaatactgcctaaatggtgcaacttgtaaatcgactggagaa

P E Y C L N G A T C K S T G E

810 tgtgtatgtc

C V C

B

2 cgaaccgatgcaattgtagttgatactcctgatgacaatacg

R T D A I V V D T P D D N T

43 attaataatgatgccaggaataacaatgaaactatatcacag

I N N D A R N N N E T I S Q

85 gcacctcatgaaacagatacacttgtagcaggccgacccaat

A P H E T D T L V A G R P N

127 cgttggcaagaactgcaagcagatttaattgatcgtgactca

R W Q E L Q A D L I D R D S

169 aagggtgtaaaacttggtttaggcgattttgtattttatagt

K G V K L G L G D F V F Y S

211 ttactgattggtcgtgcaacacttgatggcgatgcagtcact

L L I G R A T L D G D A V T

253 gtggtcacatgttatgtggctatattggttggaatgtgtatt

V V T C Y V A I L V G M C I

295 actgttatagtattgggaattacacgacaagcattaccagct

T V I V L G I T R Q A L P A

337 ttaccaatatccataacatgtggtatattattttattttgtc

L P I S I T C G I L F Y F V

379 agttcagcgacgatatcaccgtttcttgaagcaacagccatt

S S A T I S P F L E A T A I

421 gaacgtgtgttc

E R V F

Resultados

53

Como observado na Tabela 08, a análise das seqüências de aminoácidos

preditas para os fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex

apresentaram identidade com diversas seqüências de aminoácidos de Notch,

Presenilina e Supressor de Deltex descritas para vários organismos.

C

2 atgggagtcccattgcaatatgaaaggaatttccgatccaaagtg M G V P L Q Y E R N F R S K V

46 aattattttcgtgcttgttgtacaaatgccatgttaaatgggcaa

N Y F R A C C T N A M L N G Q

91 actaaacttcttatatcaagagacaatttattagaggactcgttc

T K L L I S R D N L L E D S F

136 caactggtatctcaaatgtcttcatctggtttaagaagacgttta

Q L V S Q M S S S G L R R R L

181 tcaattacatttctacatgaagaaggtttggattacggtggagta

S I T F L H E E G L D Y G G V

226 gccagagaatggttctatcgtctttcaagagaaattttaaaccca

A R E W F Y R L S R E I L N P

271 atgtttggcttgtttgagtatactggaacagattatgccttacaa

M F G L F E Y T G T D Y A L Q

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361 cgatttgttggacgctttattggtatggcactttttcatggtcgc

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541 tgtgatttggacttgtactttattggaacctatgaccttttaggc

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586 gttttgcatgaagacgaacttattgaaggtggcaaagatattaaa

V L H E D E L I E G G K D I K

631 gtgactgaagaaaataaatccgattatatcagactgatggttgat

V T E E N K S D Y I R L M V D

676 tggcggttcaacagaggagtaaaaaaacaaacagaagaaattcac

W R F N R G V K K Q T E E I H

721 aaaggtatttttgaagtactaaatcccgaatggctggaattattc

K G I F E V L N P E W L E L F

766 gatgagcgtgaacttgaactcctattatccggtatgccagagatt

D E R E L E L L L S G M P E I

Figura 12- Seqüências dos nucleotídeos e aminoáciods preditas

referentes a Notch (A), Presenilina (B) e Supressor de Deltex (C) . As melhores sequências de aminoácidos correspondentes às possíveis regiões codificadoras foram obtidas com auxílio do programa ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Os nucleotídeos sublinhados correspondem aos oligonucleotideos direto e reverso utilizados nas amplificações.

Resultados

54

A

B

C

Nº de acesso no Genbank

Organismo Identidade% e value

gi:25143391 C. elegans 51% 7e-72 gi:27477109 Homo sapiens 52% 9e-70 gi:40352723 Mus musculus 47% 6e-69 gi:50758591 Gallus gallus 47% 2e-69

Para confirmar a identidade das sequências de aminoácidos preditas dos

fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex, as seqüências

também foram analisadas em banco de dados que permite a identificação de

domínios conservados numa seqüência primária de aminoácidos. Neste caso,

utilizamos a base de dados do algoritmo Pfam disponível no endereço

(www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/).



gi: 104252 Xenopus leavis 32% 6e-30 gi: 22770986 Boophilus microplus 32% 8e-29 gi: 13242247 Rattus novergicus 29% 8e-25

gi: 85085 D. melanogaster 29% 8e-24



gi: 2062395 D.melanogaster 52% 2e-24 gi: 17529699 Branchiostoma floridae 46% 2e-24 gi: 40950170 Canis familiaris 47% 3e-23 gi: 47575859 Rattus novergicus 47% 5e-23

gi: 4506163 Homo sapiens 47% 5e-23

Tabela 8- Análise das seqüências de Notch (A), Presenilina (B) e Supressor de Deltex (C) utilizando o programa BLASTx, com seqüências ortólogas de outros organismos. A identidade indica a % de resíduos idênticos observados na região de alinhamento. As seqüências indicadas pelo programa BLASTp são consideradas estatisticamente confiáveis quando o e value for ≤ e-5.

Resultados

55

A base de dados Pfam evidenciou a presença de cinco domínios EGF

(Epidermal Growth Factor) no fragmento gênico de Notch. Esse resultado sugere que

o fragmento amplificado provavelmente é a porção extracelular do receptor Notch.

No caso da Presenilina, a análise da seqüência predita, mostrou a presença de um

domínio Presenilina, que é característico dessa família de protease. Por fim, a

análise do Supressor de Deltex, demonstrou a presença do domínio Hect

(Homologous to E-6AP carboxy-terminus), que caracteriza a porção C-terminal da

família das proteínas ubiquitina ligase. Esses alinhamentos podem ser observados

no Apêndice1.

Como observado na Figura 13, as seqüências de aminoácidos preditas

referentes aos fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex em

S. mansoni, foram alinhadas com os respectivos ortólogos utilizando o algoritmo

CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Os resultados dos alinhamentos

confirmaram que as seqüências dos fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e

Supressor de Deltex estão alinhando nas regiões de domínios das seqüências

ortólogas, como descrito anteriormente.

Resultados

56

A XlNotch NTYGGYNCVCVNGWTGEDCSENIDDCANAACHSGATCHDRVASFYCECPHGRTGLLCHLD 374 BmNotch NTIGGYSCICVNGWTGADCSENIDDCAVAACFNGATCHDRVGSFYCQCAPGKTGLLCHLD 383 DmNotch NTHGSYSCICVNGWAGLDCSNNTDDCKQAACFYGATCIDGVGSFYCQCTKGKTGLLCHLD 411 SmNotch -------------------------------------------------HVTKGITKITE 11

XlNotch NACISNPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPPGYTGPACNNDVDECSLG-ANPCERGGRCTNT 433

BmNotch DACASNPCHAGAICDTSPIDGTYLCSCPNGFQGVDCTEDVDECAQG--FPCEHQGLCVNT 441

DmNotch DACTSNPCHADAICDTSPINGSYACSCATGYKGVDCSEDIDECDQG--SPCEHNGICVNT 469

SmNotch VTSLPNKCSPECVHGQGECTSNGKCLCNPGFRGLSCETDVDECAEG--SKHNCQQECINT 69

XlNotch LGSFQCNCPQGYAGPRCEIDVNECLSNPCQNDSTCLDQIGEFQCICMPGYEGLYCETNID 553

BmNotch PGSFRCNCTRGFAGPRCEVNINECDSNPCQNEGTCLDERGGFRCVCMPGYRGVHCEVDID 561

DmNotch PGSYRCNCSQGFTGPRCETNINECESHPCQNEGSCLDDPGTFRCVCMPGFTGTQCEIDID 589

SmNotch PGSFKCSCHSGYK-----------------------------------------------

XlNotch ECASNPCLHNGKCIDKINEFRCDCPTGFSGNLCQHDFDECTSTPCKNGAKCLDGPNSYTC 493

BmNotch ECLPNPCLNGGICSDRINGFQCLCPVGFSGKKCETNEDDCSSFPCRNGGSCHDGIASYTC 501

DmNotch ECQSNPCLNDGTCHDKINGFKCSCALGFTGARCQINIDDCQSQPCRNRGICHDSIAGYSC 529

SmNotch -------------------------------LSTVDPSKCEPISCPSQCNLIDG—-ECDC 109

XlNotch QCTEGFTGRHCEQDINECIPDPCHYGTCKDGIATFTCLCRPGYTGRLCDNDINECLSKPC 613

BmNotch HCPPGFTGSNCETNMDDCQSSPCHHGECIDGTNAFTCNCHPGYTGLLCQNQINECLSSPC 621

DmNotch ECPPGYTGTSCEININDCDSNPCHRGKCIDDVNSFKCLCDPGYTGYICQKQINECESNPC 649

SmNotch ECKLGHFGLNCNQTVDSCAIKPCDQICVDLGDGKYTCKCNEGFE---------PSPNNPR 160

XlNotch LNGGQCTDRENGYICTCPKGTTGVNCETKIDDCASNLCDNGK-CIDKIDGYECTCEPGYT 672

BmNotch QHGGTCEDLVNGYQCRCRRGTSGPDCQFNVNECFSNPCRNGAKCVDGIDSYICECLPGYT 681

DmNotch QFDGHCQDRVGSYYCQCQAGTSGKNCEVNVNECHSNPCNNGATCIDGINSYKCQCVPGFT 709

SmNotch RCQRICKDGIDCIYGSCRTVFS-----------------------NDTDQSLCTCLEGFY 197

XlNotch GKLCNININECDSNPCRNGGTCKDQINGFTCVCPDGYHDHMCLSEVNECNSNPCIH-GAC 731

BmNotch GIHCETDINECASNPCANGGVCIDLINGFKCNCPRGYFDARCLSNVNECASNPCQHGGTC 741

DmNotch GQHCEKNVDECISSPCANNGVCIDQVNGYKCECPRGFYDAHCLSDVDECASNPCVNEGRC 769

SmNotch GTNCQNDVNECLNE------------NGQKHFCEH-----------------------HC 222

XlNotch HDGVNGYKCDCEAGWSGSNC—DINNNECESNPCMNGGTCKDMTGAYICTCKAGFSGPNC 789

BmNotch EDEVNHFVCHCPPGYGGHRC—EQDIDECQSNPCQHGGSCHDALNNYSCACIEGYSGRNC 799

DmNotch EDGINEFICHCPPGYTGKRC—ELDIDECSSNPCQHGGTCYDKLNAFSCQCMPGYTGQKC 827

SmNotch INTLGSYQCFCDPDYELQSD--------------------------GRTCKKQFKG--- 251

XlNotch QTNINECSSNPCLNHGTCIDDVAGYKCNCMLPYTGAICEAVLAPCAGSPCKNGGRCKESE 849

BmNotch ETNLDDCSPNPCRNGGSCIDLVGTFRCVCEVPFTGPTCEVELNPCSPNKCRNGAQCSPSS 859

DmNotch ETNIDDCVTNPCGNGGTCIDKVNGYKCVCKVPFTGRDCESKMDPCASNRCKNEAKCTPSS 887

SmNotch ------------------------------------------------------------

XlNotch DFETFSCECPPGWQGQTCEIDMNECVN-RPCRNGATCQNTNGSYKCNCKPGYTGRNCEMD 908

BmNotch NYLDFACSCKLGFTGRLCDEDIDECAVSSPCRNEATCINTNGSYECACTKGYEGRDCLIN 919

DmNotch NFLDFSCTCKLGYTGRYCDEDIDECSLSSPCRNGASCLNVPGSYRCLCTKGYEGRDCAIN 947

SmNotch -----------------------EMKCPEYCLNGATCKSTG---ECVC------------ 273

Resultados

57

B

HsPres HWKGPLVLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWSAWVILGAISVYDLVAVLCPKGPLRMLVE 279

CfPres HWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPKGPLRMLVE 268

RnPres HWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPKGPLRMLVE 273

DmPres HWQGPLRLQQGYLIFVAALMALVFIKYLPEWTAWAVLAAISIWDLIAVLSPRGPLRILVE 295

SmPres -----------------------------------------RTDAIVVDTPDD--NTINN 17

HsPres TAQERNEPIFPALIYSSAMVWTVG----------MAKLDPSSQG------ALQLPYDPEM 323

CfPres TAQERNETLFPALIYSSTMVWLVN----------MAEGDPEAQRKVSK--NSNYNAQSTE 316

RnPres TAQERNETLFPALIYSSTMVWLVN----------MAEGDPEAQRRVPK--NPKYSTQGTE 321

DmPres TAQERNEQIFPALIYSSTVVYALVNTVTPQQSQATASSSPSSSNSTTTTRATQNSLASPE 355

SmPres DARNNNETISQAPHETDTLV----------------AGRP-------------------- 41

HsPres EEDSYDS------------------FGE-------PSYPEV--FEPPLTGYPG------- 349

CfPres S-ETQDP------------------VTESDDGGFSEEWEAQR--DSRLGPHHSTTETRAA 355

RnPres REETQDT------------------GTGSDDGGFSEEWEAQR--DSHLGPHRSTPESRAA 361

DmPres AAAASGQRTGNSHPRQNQRDDGSVLATEAEAAGFTQEWSANLSERVARRQIEVQSTQSGN 415

SmPres -----------------------------------NRWQELQ------------------ 48

HsPres ------------------------------EELEEEEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKAAA 379

CfPres VQELSS----------------------NILASEDPEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKASA 393

RnPres VQELSG----------------------SILTSEDPEERGVKLGLGDFIFYSVLVGKASA 399

DmPres AQRSNEYRTVTAP---------------DQNHPDGQEERGIKLGLGDFIFYSVLVGKASS 460

SmPres ------------------------------ADLIDRDSKGVKLGLGDFVFYSLLIGRATL 78

HsPres NG--DWNTTLACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFGLIFNFATANLVTPFTD 439

CfPres TGSGDWNTTLACFVAILIGLCLTLLLLAVFKKALPALPISITFGLIFYFSTDNLVRPFMD 453

RnPres TASGDWNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFGLVFYFATDYLVQPFMD 459

DmPres TASGDWNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFGLIFYFATDYLVQPFMD 518

SmPres YG— DWTTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIWRKALPALPISITFGLIFCFATSAVVKPFME 136

144

HsPres ALASQQVY 447

CfPres TLASHQLY 461

RnPres QLAFHQFY 467

DmPres QLAFHQFY 526

SmPres DLSAKQVF 144

C

MmSu(dx) DPRTGKSALDN---GPQIAYVRDFKAKVQYFRFWCQQLAMPQHIKITVTRKTLFEDSFQQ 525

CeSu(dx) DPRTGKPVGPLGVVGVQMAMEKSFRWKIAQFRYLCLSNSVPNHVKITVSRNNVFEDSFQE 453

SmSu(dx) -------------MGVPLQYERNFRSKVNYFRACCTNAMLNGQTKLLISRDNLLEDSFQL 47

MmSu(dx) IMSFSPQDLRRRLWVIFPGEEGLDYGGVAREWFFLLSHEVLNPMYCLFEYAGKDNYCLQI 585

CeSu(dx) IMRKNAVDLRRRLYIQFRGEEGLDYGGVAREWFFLLSHEVLNPMYCLFMYAGNNNYSLQI 513

SmSu(dx) VSQMSSSGLRRRLSITFLHEEGLDYGGVAREWFYRLSREILNPMFGLFEYTG-TDYALQV 106

MmSu(dx) NPASYINPDHLKYFRFIGRFIAMALFHGKFIDTGFSLPFYKRILNKPVGLKDLESIDPEF 645

CeSu(dx) NPASFVNPDHLKYFEYIGRFIAMALFHGKFIYSGFTMPFYKKMLNKKIVLKDIEQVDSEI 573

SmSu(dx) NPASHVNPNHMAYFRFVGRFIGMALFHGRCIDGGLTLAFYKQILKRKLTLEDLGHTDHSY 166

MmSu(dx)_YNSLIWVKENNIEECGLEMYFSVDKEILGEIKSHDLKPNGGNILVTEENKEEYIRMVAEW 705

CeSu(dx) YNSLMWIKDNNIDECDMELYFVADYELLGELKTYELKEGGTEIAVTEENKLEYIELLVEW 633

SmSu(dx) YQSLIYVRDNPVDECDLDLYFIGTYDLLGVLHEDELIEGGKDIKVTEENKSDYIRLMVDW 226

MmSu(dx) RLSRGVEEQTQAFFEGFNEILPQQYLQYFDAKELEVLLCGMQEIDLNDWQRHAIYRHYTR 765

CeSu(dx) RFNRGVEQQTKAFFTGFNSVFPLEWMQYFDERELELLLCGMQDVDVDDWQRNTVYRHYAP 693

SmSu(dx) RFNRGVKKQTEEIHKGIFEVLNPEWLELFDERELELLLSGMPEI---------------- 270

Figura 13- Alinhamento da região codificadora dos fragmentos gênicos de Notch (A), Presenilina (B) e Supressor de Deltex (C) de S. mansoni com as seqüências ortólogas. Os alinhamentos representam somente as regiões onde os fragmentos de S. mansoni estão alinhando. Na cor preta estão representados os aminoácidos idênticos e em cor cinza, os aminoácidos conservados. Abreviaturas: Sm, S. mansoni; Rn, R. novergicus; Xl, X. leavis; Bm, B. microphilus; Dm, D. melanogaster; Cf, C. familiaris; Hs, H. sapiens; Mm, M. musculus; e Ce, C. elegans. Nº de acesso das seqüências: notch, Xl 104252, Bm 22770986, Dm 85085; presenilina, Dm 2062395 Cf 40950170, Rn 47575859, Hs 4506163; supressor de deltex, Mm40352723, Ce 25713391.

Resultados

58

4.4. Perfil de expressão dos fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e

Supressor de Deltex durante o ciclo de vida do parasita

Neste trabalho, a expressão de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex

foram investigados em diferentes estágios de desenvolvimento do parasita, com a

finalidade de evidenciar a existência ou não de uma possível expressão diferencial

estágio específico durante o ciclo de vida do parasita.

Desse modo, a partir do RNA total de vermes adultos, hepatopâncreas de

caramujo infectado (fonte de esporocistos), hepatopâncreas de caramujo não

infectado (controle negativo), cercárias e esquistossômulos, e oligonucleotídeos

gene-específicos, os respectivos cDNAs foram sintetizados, utilizando a técnica de

RT-PCR, conforme descrito em Materiais e Métodos. Após a amplificação, os

produtos do PCR, foram analisados em gel de agarose 1,5%. Para confirmar se os

cDNAs amplificados eram correspondentes aos genes Notch, Presenilina e

Supressor de Deltex os cDNAs foram clonados no vetor pGEM-T easy (Promega),

e posteriormente seqüenciados. As seqüências obtidas foram idênticas a dos

correspondentes genômicos e podem ser analisadas no Apêndice 2 e 3.

Como pode ser observado na Figura 14 A, a análise do perfil de expressão

durante o ciclo de vida do parasita mostra que os baixíssimos níveis de expressão

do receptor Notch não foram detectados pela técnica de RT-PCR. Esse resultado

corrobora com os resultados obtidos durante a análise in silico, onde mostra que há

poucos transcritos para Notch nessa fase, por outro lado, pode observar a

amplificação do transcrito de Notch nas fases de esporocisto, esquistossômulo, ovo

e verme adulto.

Resultados

59

Em relação aos transcritos de Presenilina e Supressor de Deltex, esses se

mostraram expressos em todas as fases como podem ser observados nas Figuras

14B e 14C.

PM VA EP C- CE ES O C

600 pb

A

850 pb

PM VA EP C- CE ES O C

600 pb

B

400 pb

Resultados

60

Com o objetivo de avaliarmos se haveria expressão sexo específica dos

fragmentos gênicos de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex, RNA total dos

parasitas machos e fêmeas foram separadamente submetidos à transcrição reversa

e os produtos gênicos amplificados exatamente como descrito em Materiais e

Métodos. Como mostra as Figuras 15 A, B e C, os genes em estudo foram

expressos em ambos sexo do parasita.

C PM VA EP C- CE ES O C

600 pb 800 pb

Figura 14- Perfil de expressão durante o ciclo de vida do parasita. RT- PCR do RNAm codificador para Notch (A), Presenilina (B) e Supressor de Deltex.(C). Cerca de 10µl de cada preparação foram aplicados em gel de agarose 1,5% e o gel corado com brometo de etídeo. Abreviaturas: Peso Molecular 100pb (PM); verme adulto (VA); esporocisto (EP), caramujo não infectado (C-), cercária (CE), esquistossômulo (ES) , ovo (O) e controle negativo da reação de PCR (C).

Resultados

61

A

600 pb

600 pb 850 pb

PM VA M F C

PM VA M F C

400 pb

B

PM VA M F C C

600 pb 800 pb

Figura 15- Perfil de expressão dos transcritos em relação ao sexo do parasita. RT- PCR do RNAm codificador para Notch (A), Presenilina (B) e Supressor de Deltex (C). Cerca de 10µl de cada preparação foram aplicados em gel de agarose 1,5% e o gel corado com brometo de etídeo. Peso Molecular 100pb (PM); verme adulto (VA); macho (M), fêmea (F) e controle negativo da reação de PCR (C).

Resultados

62

4.5. Estimativa por Northern Blot do tamanho da mensagem codificadora de

Notch e Presenilina

Com a finalidade de estimarmos o tamanho da mensagem codificadora de

Notch e Presenilina, e a presença de sub-populações de mRNAs utilizamos a técnica

de Northern Blot. Para isso, cerca de 15 µg de RNA total de vermes adultos foram

separados em gel de agarose formaldeído 1.2% e transferidos para membrana

Hybond N+ e posteriormente hibridizados, utilizando como sonda os cDNAs de Notch

e Presenilina conforme descrito em Materiais e Métodos.

Embora anteriormente tendo amplificado um produto de aproximadamente 850

pb codificando para Notch e um produto de aproximadamente 400 pb codificando

para Presenilina, a análise de Northern Blot evidenciou uma mensagem de

aproximadamente 2.7Kb para Notch; (Figura 16 A), e para Presenilina, uma

mensagem de aproximadamente 3.25 Kb, (Figura 16 B). Essa diferença entre os

cDNAs amplificados e o tamanho estimado da mensagem codificadora,

provavelmente esta relacionado com a utilização de oligonucleotídeos específicos

durante a técnica de RT-PCR que estão flanqueando parte da região codificadora do

gene e, também, até o momento não amplificamos as regiões 5’e 3’ não traduzidas

dos genes Notch e Presenilina.

Resultados

63

2.7 Kb 3.25 Kb

VA VA

A B

Figura 16- Northern-blot de Notch (A) e Presenilina (B), para avaliar o tamanho dos correspondentes RNAm . Cerca de 15 µg de RNA total de vermes adultos (VA) foram separados em gel de agarose formaldeído 1.2% e posteriormente hibridizados, utilizando como sonda os cDNAs de Notch e Presenilina.

5- Discussão

Discussão

65

Para que ocorra o desenvolvimento de organismos multicelulares é necessário

que as células interpretem e transmitam sinais extrínsecos provenientes do meio ou

do hospedeiro em questão para o meio intracelular onde, culminará na ativação

transcricional de vários genes, resultando na diferenciação de um tipo celular. A

maioria desses sinais é liberada por um pequeno número de vias de sinalização, os

quais são altamente conversados entre as espécies. Dentre os mecanismos de

sinalização estão: a via Wingless, Fator de Crescimento e Transformação β,

Receptor de Tirosina Quinase, Hedgehog, Receptores Nucleares, JAK/STAT e Notch

(HANSSON, et al, 2004).

Estudos com S.mansoni, têm mostrado que as vias envolvidas com o

desenvolvimento do parasita, melhores caracterizadas até o momento são: Fator de

Crescimento e Transformação β (TGF-β), via mediada por Receptor de Tirosina

Quinase (RTK) e a via mediada por Receptores Nucleares (BELL & PEARCE, 2000;

SHOEMARKER, et al,1992, VICOGNE, et al, 2003; MENONÇA, et al 2000).

Nas últimas duas décadas, a via de transdução mediada pelo receptor Notch

vem sendo amplamente estudada em diversos modelos experimentais. Os

receptores Notch e seus ligantes foram primeiramente identificados em D.

melanogaster e C. elegans, onde mostraram regular tanto a proliferação como a

diferenciação celular. Estudos subseqüentes em camundongos e humanos

demonstraram que a sinalização mediada pelo receptor Notch era essencial em

múltiplos estágios da hematopoiese, como também na regulação do

desenvolvimento ou na homeostase celular em muitos tecidos (MCLNNES &

MICHAUD, 2003).

Discussão

66

Desse modo, a reconstituição in silico e a obtenção de seqüências dos

componentes essenciais dessa via, podem ser indicativos da presença da via Notch

durante o ciclo de vida de S. mansoni.

Neste contexto, a comparação de genes individuais de D. melanogaster e C.

elegans, por homologia de função, podem sugestivamente desempenhar papéis

semelhantes em parasitas como S. mansoni. Deste modo, a análise in silico da via

Notch pelo banco de dados do Projeto Transcriptoma de S. mansoni (VERSOVSKI,

et al, 2003), mostrou que este parasita apresenta várias seqüências codificando para

grande parte dos constituintes da via de sinalização mediada pelo receptor Notch. A

análise in silico também demonstrou que a maioria das seqüências para o receptor

Notch estavam presentes nas fases de esporocisto e esquistossômulos, no entanto,

a técnica de sequenciamento utilizada durante o Projeto Transcriptoma de S.

mansoni (VERSOVSKI, et al, 2003) somente nos permitiu estimar a expressão de

genes relacionados a via Notch, devido ao fato de as EST’s geradas terem sido

seqüenciadas aleatoriamente dos diversos estágios do parasita.

A análise comparativa dos componentes da via Notch com o Transcriptoma de

S. japonicum , mostrou que o parasita apresenta poucas seqüências codificando

para os constituintes da via Notch. Esses dados podem ser explicados devido a

utilização somente das fases de verme adulto, macho, fêmea e ovos na confecção

das bibliotecas de cDNA (WEI, et al, 2004).

Na caracterização molecular, o primeiro fragmento gênico investigado refere-se

ao próprio receptor Notch. Em S. mansoni a seqüência obtida durante o Projeto

Transcriptoma do parasita com similaridade significativa com este receptor em outros

organismos, contém apenas 763 pb (608600.1). A partir deste achado, houve a

Discussão

67

necessidade de extensão da seqüência consenso para o receptor utilizando-se de

ferramentas de bioinformática que permitiram a comparação entre a seqüência

proveniente do transcrito em S. mansoni com aquela depositada no banco genoma

do parasita, disponível no site: http://www.tigr.org. Com esta estratégia, foi possível

obtermos uma nova seqüência consenso para este receptor estendida em 221

nucleotídeos diferentemente distribuídos nas regiões 3' e 5' do transcrito original.

Uma nova idealização de oligonucleotideos permitiu a obtenção de um fragmento de

820 pares de bases, nas reações de amplificação utilizando o material genético do

parasita, e que corresponde a uma matriz de leitura aberta de 273 aminoácidos.

O segundo gene de interesse tem como produto um componente enzimático de

membrana denominado Presenilina. A função deste gene, já estabelecida, refere-se

a clivagem proteolítica da porção intracelular do receptor Notch de modo a liberar

esta última para atuação como fator de transcrição de genes alvos no núcleo celular

(CHUNG & STRUHL, 2001). Em S. mansoni, a seqüência obtida no Projeto

Transcriptoma deste parasita com similaridade significativa com a de outros

organismos, contém apenas 427 pb (705353.1). A partir deste achado, foi possível

de maneira análoga à utilizada para o receptor Notch, estender a seqüência

consenso para Presenilina em 59 nucleotídeos, diferentemente distribuídos nas

regiões 3' e 5' do transcrito original. Uma nova idealização de oligonucleotideos

permitiu a obtenção de um fragmento de 420 pares de bases nas reações de

amplificação utilizando material genético do parasita e que corresponde a uma matriz

de leitura aberta de 144 aminoácidos.

Um terceiro componente da via denominado Supressor de Deltex foi avaliado

neste estudo. Este gene codifica para uma enzima E3 ligase responsável pela

Discussão

68

ubiquitinação da porção intracelular do receptor Notch num evento mediado pelo

domínio HECT (Homologous to E-6AP carboxy-terminus) presente em sua estrutura.

Embora o mecanismo de ação desta enzima ainda permaneça por ser elucidado,

dados da literatura suportam a hipótese desta enzima atuar como um regulador

negativo da transdução de sinal mediada pela via Notch (ERIC,C.L, 2003). Utilizando

oligonucleotídeos específicos, foi possível a obtenção de um fragmento gênico de

811 pares de base, que corresponde a uma matriz de leitura aberta de 270

aminoácidos.

Estudos de organização estrutural dos genes Notch, Presenilina e Supressor de

Deltex em outros organismos demonstram a existência de íntrons (GREENWALD,

1985; MARTÍNEZ-MIR, et al, 2001; CORNELL, et al., 1999). Em nosso estudo, a

análise comparativa entre o DNA genômico e o cDNA dos fragmentos gênicos de

Notch, Presenilina e Supressor de Deltex através do alinhamento das seqüências e

do algoritmo BLAST 2 mostrou a ausência de introns no DNA genômico nas regiões

que estudamos.

Como descrito por WHARTON et al (1985). o receptor Notch é constituído por

uma porção extracelular, o qual é formada por repetições consecutivas de domínio

EGF e 3 repetições consecutivas Notch/Lin-12 rico em cisteína. Na porção

intracelular existem 6 repetições consecutivas de ankirin, um domínio rico em

glutamina (opa), e uma seqüência PEST (Região rica em prolina,glutamato, serina e

treonina) (Figura 17).

Com relação à Presenilina, dados da literatura demonstram que essa protease

é uma proteína com oito seções transmembrâna que apresenta o domínio

Presenilina (XIAJUN & GREENWALD, 1996; DOAN, et al. 1996). Para o Supressor

Discussão

69

de Deltex, estudos demonstraram que essa E3 ligase é constituída na região N-

termina de um domínio C2 (Protein kinase C conserved region 2 ), quatro domínios

WW (Two conserved tryptophans domain) e um domínio C-terminal HECT

(Homologous to E-6AP carboxy-terminus) (PERRY, et al., 1998). Desse modo.

através do algoritmo Pfam e do alinhamento com seqüências ortólogas, podemos

sugerir que o fragmento gênico Notch caracterizado faz parte da porção extracelular

do receptor, devido à presença de domínios de EGF.No caso do fragmento gênico

Presenilina, a análise pelo Pfam e o alinhamento demonstrou que o fragmento

caracterizado faz parte do domínio Presenilina. Por fim, o fragmento gênico de

Supressor de Deltex caracterizado faz parte da região C-terminal, devido a presença

do domínio HECT.

Neste trabalho, uma característica importante foi o perfil de expressão de

Notch, Presenilina e Supressor de Deltex durante o ciclo de vida do parasita. O

principal achado no contexto da biologia do S. mansoni, refere-se aos baixíssimos

Figura17: Similaridade estrutural entre os produtos de glp-1, lin-12, e Notch. Os 1295 aminoácidos de glp-1 são comparados com os 1429 aminoácios de lin-12 e os 2703 aminoácidos de Notch de D. melanogaster. Adaptado de - Yochem, J. and Greenwald, I. glp-1 and lin-12, Genes implicated in Distinct Cell-Cell Interations in C.elegans, encoded similar Transmembrane Proteins. Cell., v.58, p. 533-563, 1989.

Discussão

70

níveis de expressão do receptor, não detectados no estágio cercariano pela técnica

de RT-PCR mas, que foram observados durante a análise in silico poucos transcritos

para Notch nesse estágio. Esses baixíssimos níveis de expressão do receptor,

aliada à sua presença em níveis significativos, detectados nas fases de ovos,

esporocisto e esquistossômulo, sugerem que este gene poderia potencialmente

mediar o processo de diferenciação deste parasita, quando mantido no interior do

hospedeiro definitivo e intermediário. Sabendo que a via de sinalização Notch já foi

descrita estar envolvida com os processos de oogênese e espermatogênese em

outros organismos (PORTIN, 2002) e, considerando que o parasita S. mansoni

possui dimorfismo sexual e que no seu estágio de verme adulto a espermatogênese

e oogênese são constantes, (WERNER, 2001) sugerimos que a amplificação do

receptor Notch observada na fase de verme adulto poderia ser devido à presença de

células indiferenciadas relacionadas durante esses processos de oogênese e

espermatogênese. Experimentos futuros como de imunohistoquímica e de hibridição

em situ serão necessários para comprovarmos essa hipótese.

Conforme Wei, et al (2004), baseado nos dados dos Transcriptomas de S.

mansoni e S. japonicum, demonstrou a expressão de Notch somente no estágio de

esporocistos, esse fato pode ser devido a grande abundância de transcritos

observados nesse estágio de vida do parasita em relação aos outros estágios. Como

observamos nos nossos resultados, o receptor Notch se encontra expresso em

todos os estágios de vida do parasita S. mansoni.

A análise de expressão de Presenilina demonstrou a presença do transcrito em

todas as fases investigadas, inclusive no estágio de cercária. Este resultado reforça

a hipótese do envolvimento da Presenilina com outras vias de sinalização celular

Discussão

71

não diretamente relacionadas ao receptor Notch. (VIDAL, et al, 2005). Neste sentido,

a presença também em todas as fases do transcrito de Supressor de Deltex ao

longo do ciclo do parasita pode ser indicativa de funções celulares adicionais à

regulação desta via.

Outra possibilidade do controle da expressão que poderia ocorrer seria a

expressão sexo específico dos referidos fragmentos gênicos, no entanto, os

resultados, mostraram que os fragmentos gênicos foram expressos em ambos os

sexos do parasita.

Para estimarmos os tamanhos das mensagens de Notch e Presenilina, foram

realizados experimentos de Northern Blot. Dados da literatura demonstram que o

gene Notch em D. melanogaster codifica um transcrito único de aproximadamente

10kb (WHARTON, et al 1985). Em C. elegans os genes Lin-12 e Glp-1, os quais são

os homólogos de Notch codificam um transcrito único de aproximadamente 4.6 Kb

no caso de Lin-12 e um de 4.2 kb no caso de Glp-1 (AUSTIN. & KIMBLE., 1989). Em

S. mansoni, nossos resultados demonstraram um transcrito único de

aproximadamente 2.7 Kb. As diferenças, especificamente com relação ao tamanho

dos transcritos podem ser suportadas pelos dados da literatura que demonstra que

apesar do alto grau de conservação dos receptores Notch já caracterizados, as

proteínas de D. melanogaster e vertebrados diferem da proteína de C. elegans em

dois aspectos principais. Primeiro, o número e o espaçamento das repetições

semelhantes à EGF varia entre os organismos. O segundo fator que os distingue,

refere-se à presença de uma seqüência rica em poliglutamina denominada “opa”

localizada anteriormente à seqüência PEST C-terminal (Figura 17) (WHARTON et

al., 1985).

Discussão

72

Com relação a Presenilina, em nosso estudo foi obtido um transcrito único de

aproximadamente 3.25 Kb. Estudos realizados utilizando as fases de embrião, larva

e adulto de D. melanogaster demonstraram a presença de um transcrito único de

aproximadamente 2 Kb (CHANG-SOOK.& KOO, 1997). Contrapondo com esses

resultados, um outro estudo demonstrou a presença de transcritos de 2 a 5 Kb em

todas as fases de D.melanogaster, sugerindo a ocorrência de processamento

alternativo (BOULIANNE,et al, 1997)

Ao término da caracterização molecular de alguns componentes da via Notch

em S. mansoni, foi possível determinar que as fases de vida do parasita que são

mantidos no interior do hospedeiro definitivo e intermediário merecem ser

investigada com mais detalhes. Desta forma, os resultados desse trabalho

permitiram uma abordagem pioneira no estudo dessa via em S. mansoni e, para a

confirmação destas evidências tornam-se necessárias análises em caráter estrutural

e funcional, que contribuirão para um melhor entendimento da atuação tecido-

específica desta via.

6- Conclusões

Conclusões

74

Os resultados obtidos durante a realização desse trabalho nos permitiram

concluir que:

- A análise in silico da via Notch pelo banco de dados do Projeto Transcriptoma

de S. mansoni, mostrou que este parasita apresenta várias seqüências

codificando para grande parte dos constituintes da via de sinalização mediada

pelo receptor Notch.

- A análise comparativa dos componentes da via Notch com o Transcriptoma de

S. japonicum , mostrou que esse parasita apresenta poucas seqüências

codificando para os constituintes da via Notch. Esse dado pode ser explicado

devido à utilização somente das fases de verme adulto, macho, fêmea e ovos na

confecção das bibliotecas de cDNA.

- Os fragmentos de Presenilina e Supressor de Deltex apresentaram expressos

em todos os estágios do ciclo de vida do parasita S. mansoni analisados. Por

outro lado, os baixíssimos níveis de expressão de Notch no estágio de cercária

não detectados pela reação de RT-PCR, forneceu uma indicação de que esse

receptor pode ser essencial para a diferenciação celular das fases do parasita

dentro dos seus hospedeiros definitivo e intermediário.

- Não foi observadas íntrons nas seqüências de DNA genômico dos três

fragmentos gênicos analisados.

Conclusões

75

- A análise de Northern Blot demonstrou que o Notch possui um transcrito único

de aproximadamente 2.7 Kb enquanto que Presenilina possui um único transcrito

de aproximadamente 3.25 Kb.

7- Referências Bibliográficas

Referências Bibliográficas

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8-Apêndice

Apêndice

89

1- Representação esquemática da analise de domínios dos fragmentos gênicos

de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex, utilizando o algoritmo Pfam.

1.1 Representação de Notch

1.2. Representação de Presenilina

1.3.Representação de Supressor de Deltex

Apêndice

90

2- Alinhamentos das seqüências dos cDNA dos fragmentos gênicos de Notch,

Presenilina e Supressor de Deltex com os respectivos DNAg.

2.1 Alinhamento de Notch

SmcDNA CATGTGACAAAGGGTATCACCAAGATTACAGAGGTCACTAGTCTTCCAAACAAATGTAGT 60

SmDNAg CATGTGACAAAGGGTATCACCAAGATTACAGAGGTCACTAGTCTTCCAAACAAATGTAGT 60

************************************************************

SmcDNA CCTGAATGTGTTCATGGACAAGGCGAATGTACATCTAATGGAAAATGCTTGTGTAATCCA 120

SmDNAg CCTGAATGTGTTCATGGACAAGGCGAATGTACATCTAATGGAAAATGCTTGTGTAATCCA 120

************************************************************

SmcDNA GGTTTTCGAGGGTTATCTTGTGAGACAGACGTAGATGAATGCGCTGAAGGAAAACATAAT 180

SmDNAg GGTTTTCGAGGGTTATCTTGTGAGACAGACGTAGATGAATGCGCTGAAGGAAAACATAAT 180

************************************************************

SmcDNA TGTCAACAGGAATGTATCAATACTCCTGGGTCTTTTAAATGTTCTTGTCATTCAGGTTAC 240

SmDNAg TGTCAACAGGAATGTATCAATACTCCTGGGTCTTTTAAATGTTCTTGTCATTCAGGTTAC 240

************************************************************

SmcDNA AAATTATCCACTGTAGATCCATCAAAATGTGAACCTATTTCTTGTCCTTCTCAATGCAAT 300

SmDNAg AAATTATCCACTGTAGATCCATCAAAATGTGAACCTATTTCTTGTCCTTCTCAATGCAAT 300

************************************************************

SmcDNA TTAATAGATGGAGAATGTGACTGCGAATGCAAGCTTGGACATTTTGGACTTAATTGTAAT 360

SmDNAg TTAATAGATGGAGAATGTGACTGCGAATGCAAGCTTGGACATTTTGGACTTAATTGTAAT 360

************************************************************

SmcDNA CAAACAGTAGATTCATGTGCAATTAAACCATGTGACCAAATTTGTGTGGATTTAGGTGAT 420

SmDNAg CAAACAGTAGATTCATGTGCAATTAAACCATGTGACCAAATTTGTGTGGATTTAGGTGAT 420

************************************************************

SmcDNA GGGAAGTATACATGCAAATGTAATGAAGGTTTTGAACCAAGTCCAAATAATCCTAGACGA 480

SmDNAg GGGAAGTATACATGCAAATGTAATGAAGGTTTTGAACCAAGTCCAAATAATCCTAGACGA 480

************************************************************

SmcDNA TGTCAGCGTATATGTAAAGATGGTATAGACTGTATATATGGAAGCTGTCGAACTGTGTTT 540

SmDNAg TGTCAGCGTATATGTAAAGATGGTATAGACTGTATATATGGAAGCTGTCGAACTGTGTTT 540

************************************************************

SmcDNA TCAAATGACACAGATCAATCTTTATGTACTTGCCTAGAAGGATTTTACGGAACAAACTGT 600

SmDNAg TCAAATGACACAGATCAATCTTTATGTACTTGCCTAGAAGGATTTTACGGAACAAACTGT 600

************************************************************

SmcDNA CAAAACGATGTAAACGAATGCTTGAATGAGAATGGTCAAAAACATTTTTGTGAACATCAT 660

SmDNAg CAAAACGATGTAAACGAATGCTTGAATGAGAATGGTCAAAAACATTTTTGTGAACATCAT 660

************************************************************

SmcDNA TGCATAAATACATTAGGATCATACCAATGTTTTTGTGATCCGGATTATGAATTACAATCT 720

SmDNAg TGCATAAATACATTAGGATCATACCAATGTTTTTGTGATCCGGATTATGAATTACAATCT 720

************************************************************

SmcDNA GATGGTCGAACGTGTAAAAAACAGTTTAAAGGTGAAATGAAATGTCCTGAATACTGCCTA 780

SmDNAg GATGGTCGAACGTGTAAAAAACAGTTTAAAGGTGAAATGAAATGTCCTGAATACTGCCTA 780

************************************************************

SmcDNA AATGGTGCAACTTGTAAATCGACTGGAGAATGTGTATGTC 820

SmDNAg AATGGTGCAACTTGTAAATCGACTGGAGAATGTGTATGTC 820

****************************************

Apêndice

91

2.2 Alinhamento de Presenilina

SmcDNA CCGAACCGATGCAATTGTAGTTGATACTCCTGATGACAATACGATTAATAATGATGCCAG 60

SmDNAg CCGAACCGATGCAATTGTAGTTGATACTCCTGATGACAATACGATTAATAATGATGCCAG 60

************************************************************

SmcDNA GAATAACAATGAAACTATATCACAGGCACCTCATGAAACAGATACACTTGTAGCAGGCCG 120

SmDNAg GAATAACAATGAAACTATATCACAGGCACCTCATGAAACAGATACACTTGTAGCAGGCCG 120

************************************************************

SmcDNA ACCCAATCGTTGGCAAGAACTGCAAGCAGATTTAATTGATCGTGACTCAAAGGGTGTAAA 180

SmDNAg ACCCAATCGTTGGCAAGAACTGCAAGCAGATTTAATTGATCGTGACTCAAAGGGTGTAAA 180

************************************************************

SmcDNA ACTTGGTTTAGGCGATTTTGTATTTTATAGTTTACTGATTGGTCGTGCAACACTTGATGG 240

SmDNAg ACTTGGTTTAGGCGATTTTGTATTTTATAGTTTACTGATTGGTCGTGCAACACTTGATGG 240

************************************************************

SmcDNA CGATGCAGTCACTGTGGTCACATGTTATGTGGCTATATTGGTTGGAATGTGTATTACTGT 300

SmDNAg CGATGCAGTCACTGTGGTCACATGTTATGTGGCTATATTGGTTGGAATGTGTATTACTGT 300

************************************************************

SmcDNA TATAGTATTGGGAATTACACGACAAGCATTACCAGCTTTACCAATATCCATAACATGTGG 360

SmDNAg TATAGTATTGGGAATTACACGACAAGCATTACCAGCTTTACCAATATCCATAACATGTGG 360

************************************************************

SmcDNA TATATTATTTTATTTTGTCAGTTCAGCGACGATATCACCGTTTCTTGAAGCAACAGCCAT 420

SmDNAg TATATTATTTTATTTTGTCAGTTCAGCGACGATATCACCGTTTCTTGAAGCAACAGCCAT 420

************************************************************

SmcDNA TGAACGTGTGTTC 433

SmDNAg TGAACGTGTGTTC 433

*************

Apêndice

92

2.3 Alinhamento de Supressor de Deltex SmcDNA TATGGGAGTCCCATTGCAATATGAAAGGAATTTCCGATCCAAAGTGAATTATTTTCGTGC 60

SmDNAg TATGGGAGTCCCATTGCAATATGAAAGGAATTTCCGATCCAAAGTGAATTATTTTCGTGC 60

************************************************************

SmcDNA TTGTTGTACAAATGCCATGTTAAATGGGCAAACTAAACTTCTTATATCAAGAGACAATTT 120

SmDNAg TTGTTGTACAAATGCCATGTTAAATGGGCAAACTAAACTTCTTATATCAAGAGACAATTT 120

************************************************************

SmcDNA ATTAGAGGACTCGTTCCAACTGGTATCTCAAATGTCTTCATCTGGTTTAAGAAGACGTTT 180

SmDNAg ATTAGAGGACTCGTTCCAACTGGTATCTCAAATGTCTTCATCTGGTTTAAGAAGACGTTT 180

************************************************************

SmcDNA ATCAATTACATTTCTACATGAAGAAGGTTTGGATTACGGTGGAGTAGCCAGAGAATGGTT 240

SmDNAg ATCAATTACATTTCTACATGAAGAAGGTTTGGATTACGGTGGAGTAGCCAGAGAATGGTT 240

************************************************************

SmcDNA CTATCGTCTTTCAAGAGAAATTTTAAACCCAATGTTTGGCTTGTTTGAGTATACTGGAAC 300

SmDNAg CTATCGTCTTTCAAGAGAAATTTTAAACCCAATGTTTGGCTTGTTTGAGTATACTGGAAC 300

************************************************************

SmcDNA AGATTATGCCTTACAAGTAAATCCAGCCTCTCATGTTAATCCAAATCATATGGCGTATTT 360

SmDNAg AGATTATGCCTTACAAGTAAATCCAGCCTCTCATGTTAATCCAAATCATATGGCGTATTT 360

************************************************************

SmcDNA TCGATTTGTTGGACGCTTTATTGGTATGGCACTTTTTCATGGTCGCTGTATTGACGGCGG 420

SmDNAg TCGATTTGTTGGACGCTTTATTGGTATGGCACTTTTTCATGGTCGCTGTATTGACGGCGG 420

************************************************************

SmcDNA GCTTACTCTTGCTTTTTATAAACAAATTTTGAAGCGGAAATTAACATTAGAAGATCTTGG 480

SmDNAg GCTTACTCTTGCTTTTTATAAACAAATTTTGAAGCGGAAATTAACATTAGAAGATCTTGG 480

************************************************************

SmcDNA TCATACGGATCACAGTTATTATCAATCGTTAATTTATGTCAGAGACAATCCAGTTGATGA 540

SmDNAg TCATACGGATCACAGTTATTATCAATCGTTAATTTATGTCAGAGACAATCCAGTTGATGA 540

************************************************************

SmcDNA GTGTGATTTGGACTTGTACTTTATTGGAACCTATGACCTTTTAGGCGTTTTGCATGAAGA 600

SmDNAg GTGTGATTTGGACTTGTACTTTATTGGAACCTATGACCTTTTAGGCGTTTTGCATGAAGA 600

************************************************************

SmcDNA CGAACTTATTGAAGGTGGCAAAGATATTAAAGTGACTGAAGAAAATAAATCCGATTATAT 660

SmDNAg CGAACTTATTGAAGGTGGCAAAGATATTAAAGTGACTGAAGAAAATAAATCCGATTATAT 660

************************************************************

SmcDNA CAGACTGATGGTTGATTGGCGGTTCAACAGAGGAGTAAAAAAACAAACAGAAGAAATTCA 720

SmDNAg CAGACTGATGGTTGATTGGCGGTTCAACAGAGGAGTAAAAAAACAAACAGAAGAAATTCA 720

************************************************************

SmcDNA CAAAGGTATTTTTGAAGTACTAAATCCCGAATGGCTGGAATTATTCGATGAGCGTGAACT 780

SmDNAg CAAAGGTATTTTTGAAGTACTAAATCCCGAATGGCTGGAATTATTCGATGAGCGTGAACT 780

************************************************************

SmcDNA TGAACTCCTATTATCCGGTATGCCAGAGATT 811

SmDNAg TGAACTCCTATTATCCGGTATGCCAGAGATT 811

*******************************

Apêndice

93

3. Representação esquemática da análise dos cDNA dos fragmentos gênicos

de Notch, Presenilina e Supressor de Deltex com os respectivos DNAg,

utilizando o algoritmo Blast 2

3.1. Representação esquemática de Notch

3.2. Representação esquemática de Presenilina

3.3. Representação esquemática de Supressor de Deltex

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