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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DE Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verlot. EM LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS. SHIRLEY FERREIRA DE OLIVEIRA NASCIMENTO Belém-PA 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DE Arrabidaea chica
(Humb. & Bonpl.) B. Verlot. EM LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS.
SHIRLEY FERREIRA DE OLIVEIRA NASCIMENTO
Belém-PA
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DE Arrabidaea chica
(Humb. & Bonpl.) B. Verlot. EM LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS.
Autora: Shirley Ferreira de Oliveira Nascimento Orientador: Prof. Dr. José Otávio Carréra Silva Júnior
Co-Orientador: Prof. Dr. Julio Cesar Pieczarka
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em
Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e
Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Pará, como requisito para a obtenção
do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Belém- PA 2016
SHIRLEY FERREIRA DE OLIVEIRA NASCIMENTO
CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DO EXTRATO HIDROETANÓLICO DE Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verlot. EM
LINHAGENS DE CÉLULAS HUMANAS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará como requisito para a obtenção do título de mestre em Ciências Farmacêuticas.
Aprovado em: ____/____/______
Banca Examinadora
______________________________________________ Prof. Dr. Madson Ralide Fonseca Gomes
Instituição: UNIFAP
______________________________________________ Prof. Dr. José Fernandes Vieira
Instituição: PPGCF/UFPA
______________________________________________ Prof. Dr. José Otávio Carrera Silva Júnior
Instituição: PPGCF/UFPA
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais Maria Tereza e Osvaldo,
responsáveis pela minha formação e caráter.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois a Ele devo tudo o que tenho e sou.
Ao meu orientador Prof. Dr. José Otávio Carréra Silva Junior, agradeço sobretudo a
sua atenção e paciência.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Julio Cesar Pieczarka e a Prof. Dra. Cleusa
Nagamachi, pelo apoio e compreensão.
A minha mãe, Maria Tereza Ferreira de Oliveira e meu pai Osvaldo Cunha de
Oliveira, maiores incentivadores da minha formação pessoal e profissional, ao meu
esposo Franklin Coelho Nascimento e meus filhos Shirley Franklin Oliveira
Nascimento e Franco de Oliveira Nascimento, que me incentivaram sempre nesta
jornada.
À Prof. Dra. Renata Noronha agradeço por me fazer acreditar que sou capaz, por
me acompanhar, apoiar e me incentivar em todos os momentos.
À Prof. Dra. Jaqueline Silva, pela imensa ajuda, no desenvolvimento da minha
pesquisa. Obrigada pela grande ajuda nos momentos de aflição. Sempre me
trazendo paz e confiança.
Ao meu amigo Jorge Rissino, pela ajuda incondicional em todos os momentos.
Aos amigos, Taylon Aguiar, Erika Valerio, Francisco Souto, Daniele Moysés, e
Henrique Fonseca, Ananda Pety, Milla Machado entre outros, que me ajudaram
muito.
A todos os professores e laboratórios que contribuíram com meu trabalho.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pela oportunidade.
RESUMO
Arrabidaea chica, pertencente à família Bignoniaceae e popularmente
conhecida como “pariri”, é amplamente utilizada na medicina popular para o
tratamento de várias enfermidades, entre elas as inflamações, infecções, cólicas
intestinais, diarréias, anemias e enfermidades da pele. Estudos fitoquímicos
demonstram que os extratos obtidos das folhas de A. chica, apresentam:
flavonoides, antocianinas, taninos, fitosteróis e pigmentos utilizados em cosméticos,
tais como carajurona, carajurina e 3-deoxiantocianidina. Os flavonoides são
metabólitos secundários de importante ação antitumoral, antioxicidante, anti-
inflamatória, citostática, antiangiogênica. Dentre os flavonoides já evidenciados
nesta espécie, estão a luteolina e o canferol. Diante da preocupação cada vez maior
do Ministério Público de Saúde em regulamentar as plantas medicinais de uso
popular, de forma a garantir à população brasileira o acesso seguro e seu uso
racional, o presente estudo objetivou caracterizar o extrato hidroetanólico de A.
chica, bem como avaliar o potencial citotóxico em linhagens de células tumorais
HepG2 e não tumorais de fibroblastos Mrc5. A análise cromatográfica do extrato
hidroetanólico de A. chica, bruto e liofilizado, constatou a identidade do material
vegetal através da detecção dos marcadores químicos canferol e luteolina, por LC-
MS. Por meio da validação do método, que apresentou parâmetros recomendados
pela legislação vigente, foram determinados 60,22 μg/mL de canferol e 29,13 µg/mL
de luteolina no extrato hidroetanólico bruto e 0,49% (m/m) de canferol e 0,18%
(m/m) de luteolina no extrato hidroetanólico liofilizado Os espectros de massas
obtidos, demonstraram os íons de m/z 287,0544 e 287,0547 sugestivamente
referentes às molecilas de canferol e luteolina respectivamente. Na avaliação da
citotoxicidade verificou-se que o extrato liofilizado foi mais citotóxico para as células
HepG2 que para MRC5 , nos dois tempos de tratamento, 24 e 48 horas, sugerindo
que essa diferença pode evidenciar uma atividade específica para cada tipo celular.
Constatou-se que quanto uma maior citotoxicidade para o tempo de 48 horas. Os
resultados apontam que o extrato liofilizado apresenta maior atividade citotóxica que
o extrato bruto, ainda que ambos apresentem os marcadores químicos canferol e
luteolina, possíveis responsáveis dessa ação, demonstrando que a liofilização
preserva, de um modo geral, os constituintes químicos termolábeis, conferindo maior
estabilidade comparativamente ao extrato bruto. Esse extrato apresenta um grande
potencial como recurso farmacológico para o desenvolvimento de novos fármacos
com atividade antitumoral.
Palavras chave: Arrabidaea chica, Bignoniaceae, flavonoides, ensaio MTT,
citotoxicidade.
ABSTRACT
Arrabidaea chica, popularly known as “pariri”, belongs to the Bignoniaceae
family, and is widely used in popular medicine for the treatment of various diseases,
including inflammation, infection, intestinal cramps, diarrhea, anemia and skin
diseases. Phytochemical studies have shown that extracts from A. chica leaves have
flavonoids, anthocyanins, tannins, phytosterols, and pigments used in cosmetics,
such as carajurona, carajurina and 3-Deoxyanthocyanidin. Flavonoids are secondary
metabolites of important anti-tumoral, antioxidant, anti-inflammatory, cytostatic and
antiangiogenic action. Among the flavonoids already evident in this species are
luteolin and kaempferol. Given the growing concern of the Ministry of Public Health
for the regulation of medicinal plants of popular use, to ensure the Brazilian
population safe access and rational use of them, this study aimed to characterize the
hydroethanol extract of A. chica, and to assess the cytotoxic potential in tumoral cell
lineages HepG2 and non tumoral cell lineages of MRC5 fibroblasts. Chromatographic
analysis of the hydroethanolic extract of A. chica, raw and lyophilized, verified the
identity of the plant material through the detection of chemical markers luteolin and
kaempferol, by LC-MS. Through method validation, which presented parameters
recommended by the current legislation, was determined 60.22 μg/mL of kaempferol
and 29.13 μg/mL of luteolin in raw hydroethanol extract and 0.49% (m/m) of of
kaempferol and 0.18% (m/m) of luteolin in the lyophilized hydroethanolic extract. The
mass spectra obtained showed the ions m/z 287.0544 and 287.0547 suggestively
referring to the kaempferol and luteolin molecules respectively. In the assessment of
cytotoxicity it was observed that the lyophilizate extract was more cytotoxic to HepG2
cells than for MRC5 in both treatment times, 24 and 48 hours, suggesting that this
difference may reveal a specific activity for each cell type. It was observed a higher
cytotoxicity at the 48 hours mark. The results indicate that the lyophilized extract has
higher cytotoxic activity than the raw extract, although both show the kaempferol and
luteolin chemical markers, possibly responsible for this action, demonstrating that
lyophilization preserves, in general, the chemical thermolabile constituents, providing
greater stability compared to the raw extract. This extract has a great potential as a
pharmacological resource to develop new drugs with antitumoral activity.
Key words: Arrabidaea chica, Bignoniaceae, flavonoids, MTT assay, cytotoxicity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Foto do Pariri, Arrabidaea chica (Humb. &Bompl.) B. Verl...................18
Figura 2- Estrutura base dos Flavonoides............................................................21
Figura 3- Redução do MTT por enzimas mitocondriais........................................31
Figura 4- Esquema da placa desenvolvida para o ensaio do
MTT.......................................................................................................44
Figura 5- Cromatograma do Canferol...................................................................46
Figura 6- Cromatograma da Luteolina..................................................................47
Figura 7- Perfil Cromatográfico do Extrato Hidroetanólico Bruto de A. chica.......47
Figura 8- Perfil Cromatográfico do Extrato Hidroetanólico Liofilizado de A.
chica......................................................................................................48
Figura 9- Cromatograma comparativo dos extratos bruto e liofilizado.................49
Figura 10- Perfil cromatográfico qualitativo para comparação dos padrões(canferol
e luteolina ) com os extratos (bruto e liofilizado)...................................49
Figura 11- Curva Padrão Canferol.........................................................................51
Figura 12- Curva Padrão Luteolina........................................................................51
Figura 13A- Espectros de ESI (+)-MS sugestivo de canferol no extrato
hidroetanólico........................................................................................58
Figura 13B- Espectros de ESI (+)-MS sugestivo de luteolina no extrato
hidroetanólico........................................................................................58
Figura 14- Cromatograma e massas do padrão Canferol (Sigma-Aldrich)..........59
Figura 15- Espectros de ESI (+)-MS do padrão canferol da (Sigma-Aldrich).........59
Figura 16- Cromatograma e massas do padrão Luteolina (Sigma-Aldrich)...........60
Figura 17- Espectros de ESI (+)-MS do padrão luteolina (Sigma-Aldrich).............61
Figura 18- Ilustração das possíveis quebras nas moléculas de canferol e
luteolina......................................................................................................................61
LISTA DE TABELAS Tabela 1- Estrutura química de alguns flavonoides de ocorrência natural em
plantas...................................................................................................22
Tabela 2- Parâmetros para a análise cromatográfica de Arrabidaea chica..........39
Tabela 3- Sistema de gradiente do método cromatográfico dos extratos de
Arrabidaea chica...................................................................................40
Tabela 4- Concentrações de canferol e da luteolina injetadas no cromatógrafo..50
Tabela 5- Valores dos Limites de Quantificação e Detecção dos padrões Canferol
e Luteolina a partir do método validado em microgramas por mL........52
Tabela 6- Coeficientes de Variação a partir da repetibilidade do padrão de
Canferol.................................................................................................53
Tabela 7- Coeficientes de Variação a partir da repetibilidade do padrão de
Luteolina................................................................................................54
Tabela 8- Recuperação do Padrão Canferol.........................................................55
Tabela 9- Recuperação do Padrão Luteolina........................................................55
Tabela 10- Alterações utilizadas para avaliar a Robustez do Método....................56
Tabela 11- Quantificação do canferol e da luteolina nos
extrato...................................................................................................57
Tabela 12- Comparação das médias de viabilidade celular de Células HepG2,
comparando a dose de cada extrato (Com/Lio/Sec) com o tempo de
exposição (24 e/ou 48h)........................................................................62
Tabela 13 Comparação das médias de viabilidade celular de Células Mrc5,
comparando a dose de cada extrato (Com/Lio/Sec) com o tempo de
exposição (24 e/ou 48 h).......................................................................63
LISTA DE ABREVIAÇÕES
A.chica Arrabidaea chica
ADN Ácido Desoxirribonucleico
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC American Type Culture Collection
CIPLAN Comissão Interministerial de Planejamento
CLAE Cromatrografia Líquida de Alta Eficiência
CO2 Gás Carbônico
DMEM Meio Dulbecco’sModifiedEagle Médium
DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH Radical 1,1-difenil-2-picrilidrazila
HepG2 Human liver hepatocellular carcinoma
i.p Intraperitoneal
KCl Cloreto de Potássio
mL Mililitro
Mrc5 Células oriundas de tecido normal de pulmão humano
MTT Brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difeniltetrazolio
m/z Massa/carga
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
NIH–National Institutes of Health. Instituto Nacional de Saúde
OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Tampão Fosfato Salino
pH Potencial de hidrogênio
PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares
PNPMF Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
RENAFITO Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
RENISUS Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS
RMN Ressonância Magnética Nuclear
SUS Sistema Único de Saúde
TPP “Techno Plastic Products”, Trasadingen, Switzerland
v.o Via oral
v/v Volume/volume
μL Microlitro
SUMÁRIO
1..INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14
2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................... ...........16
2.1 Normatização das Plantas Medicinais e Fitoterápicos .................................. 16
2.2 Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verlot. ................................................. 17
2. 3 Flavonoides ...................................................................................................... 20
2.4 Padronização de extratos vegetais .................................................................. 24
2.4.1 TINTURAS ................................................................................................ 24
2.4.2 EVAPORAÇÃO ROTATIVA ...................................................................... 24
2.4.3 LIOFILIZAÇÃO .......................................................................................... 25
2.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .......................................... 25
2.6 Validação de Método para doseamento por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para Determinação do Canferol e da Luteolina. .................... 26
2.7 Estudos in vitro ................................................................................................. 29
2.7.1 ENSAIO DO MTT ( 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) .............. 31
2.8 Linhagens celulares .......................................................................................... 32
2.8.1 CÉLULAS HepG2...................................................................................... 32
2.8.2 CÉLULAS Mrc5 ..................................................................................... 33
3 OBJETIVOS ........................................................................................................ ...34
3.1 Geral ................................................................................................................... 34
3.2 Específicos ........................................................................................................ 34
4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS .......................................................................... 35
4.1 Material Vegetal ................................................................................................. 35
4.2 Solventes e Reagentes ..................................................................................... 35
4.2.1 PADRÕES ANALÍTICOS ....................................................................... 35
4.3 Equipamentos .................................................................................................... 36
5 MÉTODOS ............................................................................................................. 37
5.1 Aquisição do material vegetal .......................................................................... 37
5.1.1 IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DO MATERIAL VEGETAL ......................... 37
5.2 Processamentos do material vegetal .............................................................. 37
5.3 Obtenções da solução extrativa (tintura) de A. chica .................................... 38
5.4 Obtenção do extrato bruto de A. chica ............................................................ 38
5.5 Obtenção do extrato liofilizado de A. chica .................................................... 38
5.6 Análises Qualitativas e Quantitativas do Canferol e da Luteolina no extrato hifroetanólico de A. chica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).38
5.6.1 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS ....................................................... 39
5.6.2 AMOSTRAS E PREPARAÇÕES DAS SOLUÇÕES PADRÕES ............... 39
5.6.3 VALIDAÇÃO .............................................................................................. 40
5.6.4 OBTENÇÃO DOS ESPECTROS DE MASSAS ........................................ 40
5.6.5 CÉLULAS .................................................................................................. 41
5.6.5.1 Cultivo celular ......................................................................................... 41
5.6.5.2 Contagem das células e número de células semeadas em placa, utilizando o azul de tripan 0,4% ......................................................................... 42
5.6.5.3 Plaqueamento das células ..................................................................... 43
5.6.5.4 Tratamentos ........................................................................................... 43
5.6.6 TESTE DO MTT ........................................................................................ 43
5.6.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................... 43
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 46
6.1 Análise quantitativa do canferol e da luteolina no extrato hidroetanólico da A. chica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ........................................ 46
6.2 Validação do método de quantificação por CLAE .......................................... 50
6.2.1 LINEARIDADE .......................................................................................... 50
6.2.2 CURVAS DE CALIBRAÇÃO E EQUAÇÕES DA RETA DA LUTEOLINA E CANFEROL .................................................................................................... 51
6.2.3 LIMITES DE QUANTIFICAÇÃO E DETECÇÃO ........................................ 52
6.2.4 REPETIBILIDADE ..................................................................................... 53
6.2.5 EXATIDÃO ................................................................................................ 55
6.2.6 ROBUSTEZ................................................................................................56 6.3 Identificação dos flavonoides por LC/MS ....................................................... 57
6.4 Caracterização do perfil dos flavonoides em extratos de A. chica ............... 58
6.5 Efeito do extrato hidroetanólico de A. chica sobre as células HEpG2 ......... 62
6.6 Efeito do extrato de A. chica sobre as células Mrc5 ...................................... 63
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 68
14
INTRODUÇÃO
As plantas medicinais e seus derivados consistem na base de tratamento,
cura e prevenção para muitas enfermidades na medicina popular. Sendo o resultado
do acúmulo secular de conhecimentos empíricos sobre a utilização dos vegetais por
diversos grupos étnicos. Cerca de 25% dos fármacos são de origem vegetal,
enquanto 50% são de origem sintética, mas relacionados aos princípios isolados de
plantas medicinais. Isto se deve, em parte, à grande variedade de espécies (250-500
mil) de plantas existentes na flora mundial, muitas com importantes propriedades
terapêuticas. O Brasil é um dos países com maior diversidade genética vegetal,
contando com mais de 55.000 espécies catalogadas, sendo assim a maior cobertura
vegetal em todo o globo (NEWMAN e CRAGG, 2007; GUERRA e NODARI, 2007).
Contudo apenas uma pequena percentagem teve o isolamento de seus princípios
ativos investigados e uma fração ainda menor foi avaliada quanto à atividade
biológica.
Com o objetivo de garantir à população brasileira o acesso seguro e uso
racional de plantas medicinais e fitoterápicos, assegurando o uso sustentável da
biodiversidade, bem como incentivando a pesquisa e desenvolvimento tecnológico
na área com o fortalecimento das cadeias e arranjos produtivos, o Governo Federal
criou a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (BRASIL, 2006b).
O Ministério da Saúde criou em 2008 a Relação Nacional de Plantas
Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS), que tem por finalidade subsidiar o
desenvolvimento de toda cadeia produtiva, nos aspectos relacionados à
regulamentação, cultivo, manejo, produção, comercialização e dispensação de
plantas medicinais e fitoterápicos. Objetiva, também, orientar estudos e pesquisas
que possam contribuir para a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais
e Fitoterápicos (RENAFITO), o desenvolvimento e a inovação nessa área. A
RENISUS foi elaborada considerando as espécies vegetais já utilizadas nos serviços
de saúde estaduais e municipais, o conhecimento tradicional e popular e os estudos
químicos e farmacológicos disponíveis. As espécies constantes nessa lista
apresentam potencial de avançar na cadeia produtiva e de gerar produtos de
interesse ao SUS (BRASIL, 2009).
15
Dentre as inúmeras espécies vegetais de interesse medicinal encontradas
nesta lista, está a Arrabidaea chica, da família Bignoniaceae, que ocorre desde a
Amazônia até o Rio Grande do Sul e desperta interesse de estudo de suas
atividades farmacológicas, devido ao seu vasto uso popular e por apresentar grande
potencial em gerar princípios ativos farmacologicamente importantes. Alguns
princípios ativos da A.chica já foram isolados e a ação antiinflamatória, cicatrizante,
antifúngica, tripanocida, dentre outras, já foram comprovadas cientificamente. É
conhecida popularmente por pariri (PA), crajiru (AM), crejeru, cajuru-piranga,
piranga, capiranga, cipó cruz, cipó-pau e chica em outras localidades (RIBEIRO,
2008; PUHL et al. 2007).
Estudos fitoquímicos das folhas de A. chica, CHAPMAN et al. (1927),
observaram a presença de 3-deoxiantocianidina e do pigmento carajurina.
Propondo-se, posteriormente, que a ocorrência deste raro pigmento em
Bignoniaceae era provavelmente restrita a A. chica. Foram isolados e identificados
os fitoesteróis, as antocianinas, 7,4’-di-hidroxi-5-metaxiflavona e 6, 7, 3’, 4’-
tetrahidroxi-5-metoxiflavona (carajuruflavona) (TAKEMURA et al., 1995),
antraquinonas, catequinas, ácidos orgânicos, açúcares redutores, esteróides,
taninos, e xantonas, 4’- hidroxi-3,7-dimetoxiflavone; vicenina-2 e canferol (BARBOSA
et al, 2008). Identificou-se a presença da luteolina por CLAE, RMN 1H e RMN 13C
(AMARAL et al, 2006).
A caracterização de extratos e avaliação de efeitos citotóxicos, mutagênicos e
carcinogênicos de compostos de origem vegetal e o entendimento dos benefícios
e/ou toxicidade potencial dessas plantas a saúde, são de fundamental importância
para reduzir os possíveis riscos desses agentes. Assim, o desenvolvimento de
novas drogas bioativas necessita de modelos apropriados para a identificação de
alvos moleculares que sejam fundamentais no crescimento celular, seja in vitro ou in
vivo (LODISH et al., 1999).
Com essa finalidade, este trabalho visa contribuir para a caracterização e o
estudo da atividade biológica do extrato hidroetanólico da Arrabidaea chica,
avaliando o efeito in vitro frente às células hepatocarcinogênicas HepG2 (ATCC HB-
8065) e as células não tumorais Mrc5 (ATCC CCL 171). Para isso foi analisada a
viabilidade celular dos cultivos submetidos a quatro concentrações do extrato de A.
chica, em função do tempo de exposição (24 e 48 horas).
16
1 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Normatização das Plantas Medicinais e Fitoterápicos
A Organização Mundial de Saúde (OMS), desde a década de 70, tem
estimulado as instituições de saúde a formularem políticas na área da medicina
tradicional. Em 1978, com a Declaração de Alma-Ata, a OMS reforça sua posição a
respeito da necessidade de valorizar a utilização de plantas medicinais no âmbito
sanitário (BRASIL, 2006a).
No Brasil, o interesse pela inserção de plantas medicinais e da fitoterapia na
atenção básica do sistema público, teve seu início a partir da década de 1980, com a
criação do SUS. A Resolução da Comissão Interministerial de Planejamento
(CIPLAN) n° 8/88, regulamentou a introdução da fitoterapia nos serviços de saúde e
nas unidades assistenciais médicas. Essa mesma prática foi reforçada nos relatórios
das Conferências Nacionais de Saúde em 1996 e 2003, mostrando a necessidade
de se investir em pesquisa e desenvolvimento de tecnologia para produção de
medicamentos da flora brasileira (BRASIL, 1988; BRASIL, 2006a).
Com a finalidade de garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso
racional de plantas medicinais e fitoterápicos, em 22 de junho de 2006, foi aprovada
a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), promovendo o
uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da
indústria nacional. O desenvolvimento de fitomedicamentos se apresenta como um
nicho forte de mercado a nível nacional e internacional, representando para o
Complexo Industrial da Saúde no Brasil, uma oportunidade de viabilizar o
fortalecimento da capacidade tecnológica industrial dessa categoria de
medicamentos (BRASIL, 2006b; MACEDO e GEMAL, 2009).
A exigência da qualidade em produtos de origem vegetal é reforçada em
resoluções da ANVISA, como a Resolução RE n° 899/03, que estabelece um Guia
para validação de métodos analíticos e bioanalíticos, a RDC n° 88/04, que sugere as
Referências bibliográficas para a avaliação da eficácia e segurança de fitoterápicos,
a RDC 89/04, que determina a Lista de Registro Simplificado de Fitoterápicos, onde
as espécies constantes na lista não necessitam de validação das suas indicações
17
terapêuticas e segurança de uso e a RDC n° 90/04 que trata dos estudos de
toxicidade (BRASIL, 2003; BRASIL, 2004a; BRASIL, 2004b; BRASIL, 2004c).
Ainda no sentido da normatização das plantas medicinais e fitoterápicos, no
que se refere ao processo de registro, a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) n°
14 de 31 de Março de 2010, dispõe sobre o Registro de Medicamentos Fitoterápicos
junto à Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Essa Resolução
estabelece os requisitos mínimos para a concessão, enfatizando a necessidade dos
ensaios de controle de qualidade e a apresentação de relatórios de todas as etapas
envolvidas na produção desse tipo de produto, envolvendo testes de segurança e
eficácia (BRASIL, 2010).
No ano de 2008 o Ministério da Saúde criou a Relação Nacional de Plantas
Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS). Essa lista foi elaborada considerando
as espécies vegetais já utilizadas nos serviços de saúde estaduais e municipais, o
conhecimento tradicional e popular e os estudos químicos e farmacológicos
disponíveis. As espécies constantes nessa lista apresentam potencial de avançar na
cadeia produtiva e de gerar produtos de interesse ao SUS. A espécie Arrabidaea
chica encontra-se na RENISUS dentre as 71 espécies relacionadas. A RENISUS
tem por finalidade subsidiar o desenvolvimento de toda cadeia produtiva, nos
aspectos relacionados à regulamentação, cultivo, manejo, produção,
comercialização e dispensação de plantas medicinais e fitoterápicos. Objetiva,
também o desenvolvimento e a inovação nessa área, bem como orientar estudos e
pesquisas que possam contribuir com a elaboração da Relação Nacional de Plantas
Medicinais e Fitoterápicos (RENAFITO), (BRASIL, 2009).
2.2 Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verlot.
Arrabidaea chica (Humb. &Bonpl.) B. Verlot. pertence à família Bignoniaceae,
que abrange cerca de 120 gêneros e 800 espécies com distribuição nas regiões
tropicais, na América do Sul e na África. No Brasil plantas desta família ocorrem
desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul, não apresentando habitat único,
podendo ser encontradas nos Cerrados, Mata Atlântica e região Amazônica.
Morfologicamente caracteriza-se como uma espécie escandente, semiarbustiva, com
18
folhas cruzadas opostas, trifoliadas, apresenta folíolo terminal modificado em
gavinhas nas porções superiores dos ramos (Figura 1). O limbo dos folíolos se
apresenta com formato oblongo-lanceolado, base obtusa, ápice agudo, margem
inteira, consistência herbácea, superfície glabra, e a nervação é do tipo peninérvea
(LORENZI, 2002; PAULETTI et al, 2003 ;PUHL et al, 2007).
Figura 1- Arrabidaea chica (Humb. & Bompl.) B. Verl. Fonte: arquivo pessoal.
Dependendo da região é conhecida popularmente por pariri (PA), crajiru (AM),
crejeru, cajuru-piranga, piranga, capiranga, cipó cruz, cipó-pau e chica em outras
localidades (RIBEIRO, 2008).
Nesta espécie, foi evidenciada a presença de vários pigmentos derivados da
carajurina, supostamente eficazes para combater dermatoses (CORREA, 1984).
Estes pigmentos produzem um corante vermelho-escuro que é utilizado para tingir
fibras artesanais, bem como é conhecido o seu uso por indígenas da Amazônia,
para a pintura corporal, para tingir enfeites, utensílios, vestuários e ainda em
19
tatuagens, na arte, magia e até na proteção contra picada de insetos e como
protetor solar (CHAPMAN, 1927; ZORN, 2001).
Segundo a medicina tradicional, o chá preparado a partir das folhas de A.
chica é utilizado para o tratamento de doenças como: diarréia, anemia, icterícia,
albuminúria, hepatites e nervosismo. Há ainda relatos de eficácia antiinflamatória,
antibacteriana, antifúngica, antiparasitária, e contra cânceres de boca, útero e
leucemia. Essa planta medicinal se aplicada topicamente pode auxiliar no combate
às enfermidades da pele como psoríase, feridas e úlceras (CORRÊA, 1984;
TAKEMURA et al., 1995; KALIL FILHO et al., 2000; LORENZI e MATOS, 2002;
BARBOSA et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2009; HÖFLING et al., 2010).
A A. chica desperta interesse de estudo de suas atividades farmacológicas,
principalmente por ser muito utilizada popularmente. Assim, pesquisas têm sido
feitas para avaliar essas atividades. O potencial cicatrizante foi comprovado através
do estímulo de crescimento de fibroblastos e síntese de colágeno in vitro com
resultados semelhantes aos da alantoína e ácido ascórbico (Jorge et al 2008).
Barbosa et al. (2008) constataram que o extrato etanólico apresentou ação contra
Trichophyton mentagrophytes, a uma concentração inibitória mínima de 3,125
mg/ml. Não sendo detectada toxicidade aguda relevante, mesmo a uma dose de
1000 mg/kg. Os autores sugerem a atividade tripanocida do extrato etanólico frente
ao Trypanosoma cruzi. A ação antibacteriana do extrato etanólico bruto de A. chica
frente ao Staphylococcus aureus (62,5mg/ml), Escherichia coli (250mg/ml) e
antifúngica contra leveduras de Candida albicans (500mg/ml) foi evidenciada em
estudos de Ribeiro (2008).
Oliveira et al (2009) demonstraram atividade inibitória do extrato aquoso
administrado por via intraperitoneal ou subcutânea sobre os efeitos inflamatórios dos
venenos das serpentes Bothropsatrox e Crotalus durissus ruruima. Lima et al. (2011)
relataram que o extrato hidroetanólico das folhas de A. chica, apresenta efeito
hepatoprotetor. Os extratos desta planta têm sido utilizados em formulações
farmacêuticas e cosméticas como corantes componentes de protetores solares ou
produtos para cuidados da pele: em produtos de maquiagem, como antioxidante
inibindo formação de rugas e melhorando a tonicidade da pele. Juntamente com
extratos de outras plantas é usado no tratamento da pele, antienvelhecimento e
tratamento de cabelos (XAVIER, 2003; BARATA et al., 2006).
20
Testes de toxicidade aguda indicaram que a DL50 ou dose letal mediana
ultrapassa 2 g/kg i.p e 6 g/kg v.o., o que sugere baixa toxicidade do extrato aquoso.
Nos testes de toxicidade crônica as doses avaliadas não evidenciaram nenhum sinal
ou sintoma de anormalidade, ou ainda alterações histopatológicas (OLIVEIRA et al.
2009).
A atividade antioxidante foi analisada experimentalmente, frente ao
difenilpicrilidrazina (DPPH) por Amaral et al. (2006) onde observou-se o grande
potencial da espécie em sequestrar radicais livres, com destaque para o extrato de
diclorometano, que apresentou atividade melhor que o padrão de Ginkgo biloba.
Estudos apresentados por Jorge (2008) reforçaram a atividade antioxidante
utilizando os ensaios DPPH e Folin-Ciocalteau.
No estudo fitoquímico das folhas de A. chica, CHAPMAN et al. (1927),
observaram a presença de 3-deoxiantocianidina e do pigmento carajurina.
Propondo-se, posteriormente, que a ocorrência deste raro pigmento em
Bignoniaceae era provavelmente restrita a A. chica. Foram isolados e identificados
os fitoesteróis, as antocianinas, 7,4’-di-hidroxi-5-metaxiflavona e 6, 7, 3’, 4’-
tetrahidroxi-5-metoxiflavona (carajuruflavona) (TAKEMURA et al., 1995),
antraquinonas, catequinas, ácidos orgânicos, açúcares redutores, esteróides,
taninos, e xantonas, 4’- hidroxi-3,7-dimetoxiflavone; vicenina-2 e canferol
(BARBOSA et al, 2008). Identificou-se a presença da luteolina por CLAE, RMN 1H e
RMN 13C (AMARAL et al, 2006). Segundo estudos de Magalhães em 2009 foi
evidenciada a presença dos minerais como Ca, Fe e Mn, não sendo detectados
cobre e zinco nas amostras avaliadas. Diniz (2013) em seus experimentos encontrou
esses dois minerais nas amostras que avaliou, mas em pequena quantidade.
2. 3 Flavonoides
Os flavonoides constituem uma subclasse dos polifenóis, onde os anéis
aromáticos contém ao menos uma hidroxila. São compostos fenólicos
hidrossolúveis, fazem parte do metabolismo secundário das plantas, sendo
encontrados em várias partes destas, como: folhas, raiz, caule e etc. São
responsáveis pela coloração de flores, frutos e folhas de algumas espécies e
também são fatores de grande importância no crescimento, desenvolvimento e
21
imunidade, também podendo atuar como antioxidantes e sinalizadores
intracelulares. Têm sua origem biossintética na via dos fenilpropanóides.
Quantitativamente e qualitativamente, os flavonoides compõem um dos maiores
grupos de produtos naturais conhecidos. A estrutura química dos flavonoides está
baseada no núcleo flavilium, que consiste, na maioria das vezes, em três anéis
fenólicos, são constituídos por unidades de C15, dispostos em C6 – C3 – C6
(HARBORNE e WILLIAMS, 2000; STAFFORD, 2000; HAVSTEEN, et al. 2002; REN
et al. 2003; BEECHER, 2003; ZUANAZZI, 2007; LEITE, 2009).
Figura 2 – Estrutura química geral de um flavonóide
Dependendo da substituição e do nível de oxidação no anel C3, os
flavonoides podem ser divididos em subclasses: flavanóis (catequina), flavonóis
(quercitina, canferol), flavonas (luteolina, rutina, apigenina), antocianidinas
(cianidina), isoflavonoides (genisteína) e flavanonas (mirecetina, hesperidina).
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). As atividades dos flavonoides e de seus
metabólitos também podem variar com essas substituições, incluindo hidrogenação,
hidroxilações, metilações, malonilações, sulfatações e glicosilações. Flavonoides e
isoflavonoides ocorrem comumente com ésteres, éteres ou derivados glicosídicos,
ou ainda, uma mistura deles. As substituições glicídicas incluem D-glicose, L-
rhamnose, glicorhamnose, galactose, lignina e arabinose (BIRT e HENDRICH,
2001). Com exceção do grupo das leucoantocianinas, os demais flavonoides
ocorrem em plantas sempre acompanhados por glicídios recebendo assim, a
denominação de glico-flavonóide ou flavonoides glicosilados. Quando se
22
apresentam isentos de glicídios, a estrutura recebe o nome de aglicona
(DEGÁSPARI e WASZCZYNSKYJ, 2004).
Mais de 6000 diferentes flavonoides foram descritos (MARCHAND, 2002). Na
tabela 1 observam-se as estruturas dos flavonoides das principais classes já
estudadas.
A atividade citotóxica dos flavonoides é referenciada em muitos trabalhos na
literatura, progressivamente mais substâncias químicas pertencentes a esse grupo
são descobertas como promissores agentes anticancer (SUN et al., 2006).
Tabela 1- Estrutura química de alguns flavonoides de ocorrência natural em plantas. Fonte: Birt,
Hendrich e Wang, 2001.
Os efeitos antioxidantes foram os primeiros efeitos estudados dos
flavonoides, o que aumentou o interesse de muitos pesquisadores, devido à
associação da produção excessiva de espécies reativas de oxigênio com o
desenvolvimento de várias doenças, entre elas o câncer (BRAVO, 1998).
23
Diante de novos trabalhos com flavonoides, descobriu-se que essas
moléculas podem atuar também como pró-oxidantes, apresentando atividades
citotóxica e carcinogênica. O radical hidroxila gerado nos processos de auto-
oxidação e ciclo redox dos flavonoides pode desencadear a peroxidação lipídica em
membranas celulares, podendo assim induzir indiretamente o estresse oxidativo
celular. Propriedades antioxidantes ou pró-oxidantes dos flavonoides dependem
tanto da concentração usada quanto da sua estrutura. Os efeitos pró-oxidantes são
responsáveis por efeitos citotóxicos e pró-apoptóticos de vários flavonoides
presentes em ervas medicinais (ISMAIL e ALAM, 2001; UEDA et al., 2002). Foi
demonstrado que a ordem de eficácia entre as classes dos flavonoides foi: flavonas
(apigenina) ˃ flavonóis (galangina) ˃ isoflavonas (genisteína) ˃ flavononas
(naringenina) (AHMED-BELKACEM et al., 2005).
A ingestão de flavonoides interfere em diversos processos fisiológicos,
auxiliando na absorção e na ação de vitaminas, atuando nos processos de
cicatrização como antioxidantes, além de apresentarem atividade antimicrobiana e
moduladora do sistema imune. Estes compostos podem inibir vários estágios da
carcinogênese como: a iniciação, a promoção e a progressão, incluindo
antiproliferação, inativação carcinogênica, interrupção do ciclo celular, indução à
apoptose, inibição da angiogênese, antioxidação e reversão da resistência às drogas
químicas (HAVSTEEN, et al. 2002; REN et al. 2003; WILLIAMS et al., 2004). A
interferência em pontos de checagem que controlam o ciclo celular de células
tumorais em G1/S e G2/M tem sido feita por flavonoides como a silimarina,
genisteina, quercetina, diadzeina, luteolina, kampferol, apigenina, flavopiridol e
epigalocatequina 3-galato (REN et al. 2003).
Alguns flavonoides pertencentes às classes das flavonas, flavonóis,
flavanonas e isoflavonas possuem efeitos antiproliferativos em diferentes linhagens
de células tumorais (KUNTZ et al., 1999; SHUKLA e GUPTA, 2010). A atividade
antitumoral de vários flavonoides, como a exemplo da quercetina e miricetina, em
alguns casos é atribuída a sua eficiência em inibir as enzimas topoisomerases I e II
(SUKARDIMAN et al., 2000). Alguns flavonoides podem atuar diminuindo a
proliferação celular como consequência de sua ligação ao receptor de estrógeno
(PRIMIANO et al., 2001). Flavonoides também apresentam atividade inibidora de
proteínas quinases (GAMETPAYRASTRE et al., 1999)
24
2.4 Padronização de extratos vegetais
2.4.1 TINTURAS
As tinturas são consideradas preparações alcoólicas ou hidroalcoólicas
resultantes da extração de drogas vegetais ou animais ou da diluição dos
respectivos extratos. São classificadas em simples e compostas, conforme
preparadas com uma ou mais matérias-primas, respectivamente (FARMACOPEIA
BRASILEIRA IV, 1988).
Dentre os métodos clássicos de extração utilizados encontra-se a percolação,
que foi utilizado para a preparação do extrato deste trabalho.
2.4.2 EVAPORAÇÃO ROTATIVA
Este método é o mais comumente utilizado na evaporação de solventes a
partir de uma mistura. O evaporador rotativo é constituído por um balão de vidro
rotativo que é mantido sob vácuo, conectando um tubo de ligação a um
condensador. O balão de rotação é aquecido por imersão parcial em banho de água
quente. A rotação do balão proporciona melhor transferência de calor para o líquido
contido, ao mesmo tempo em que reduz a formação de bolhas causadas pelo
superaquecimeto do líquido. Os vapores seguem pelo tubo de ligação e são
resfriados no condensador. A seção do condensador é organizada de modo que
ocorra a saída dos vapores condensados para outro recipiente, onde são recolhidos.
Consiste de um método muito eficiente de eliminar rapidamente grandes
quantidades de solvente (POMBEIRO, 2003).
25
2.4.3 LIOFILIZAÇÃO
A liofilização també denominada criodesidratação ou criosecagem, é um
processo de secagem onde ocorre a cristalização da água, utilizando baixas
temperaturas. O processo ocorre da seguinte forma, primeiramente o produto é
congelado, de modo que a água presente no material seja transformada em gelo,
posteriormete, esse gelo é removido pela conversão direta do estado sólido para
vapor em um processo denominado sublimação. Finalmente, a água que ainda
permanece fortemente ligada aos solutos, denominada de água de adsorção, é
convertida em vapor e removida do produto, em um processo chamado de
dessorção. O fato de utilizar baixas temperaturas e, geralmente sob vácuo esse
método é recomendade para materiais termolábeis. (GARCIA, 2009;
PITOMBO,1989).
A principal etapa da liofilização é o congelamento, pois dele depende o
desempenho global, devido a forma dos poros, bem como tem a finalidade de
imobilização do produto a ser liofilizado, interrompendo reações químicas e
atividades biológicas (BARUFFALDI, 1998).
As condições do procedimento são: baixa temperatura, pressão reduzida e
ausência de fase líquida intermediária eliminam em grande parte os fatores de
alteração e desnaturação do material. Assim, considera-se que a técnica de
liofilização preserva, de um modo geral, os constituintes químicos termolábeis,
conferido ao material maior estabilidade em comparação à solução extrativa (SILVA,
2007).
2.5 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A CLAE é uma técnica analítica que compreende uma grande variedade de
formas de separação, que podem ser escolhidos de acordo com a natureza química
dos compostos a serem analisados, é considerado um método rápido e preciso que
permite distinguir e dosar, com eficiência, pequenas quantidades de material
(ZUANAZZI e MONTANHA, 2003). É o método de escolha para análises de
26
estabilidade de componentes vegetais e seus possíveis produtos de degradação.
Respeitando a composição química da droga vegetal, a CLAE permite separar um
largo espectro de UV de flavonoides, alcançando desde os compostos polares até
os apolares (HEIGL e FRANZ, 2003).
A quantificação conjunta dos flavonoides é complexa devido ao
comportamento dos heterosídeos das respectivas agliconas e pela dificuldade de
isolamento destas substâncias de outras classes de fenóis (ZUANAZZI e
MONTANHA, 2003). O teor de constituintes presentes nas plantas também varia
consideravelmente em função de fatores externos, como: temperatura, umidade,
luminosidade, nutrientes do solo, método de coleta, secagem e transporte, parte da
planta usada, bem como a época em que a planta é coletada, o que constitui um dos
fatores de maior importância, visto que a quantidade e, às vezes, até mesmo a
natureza dos constituintes ativos não é constante durante o ano. Dessa forma, cada
um desses fatores pode influenciar diretamente a qualidade da matéria prima
vegetal, e consequentemente, o produto final e a eficácia dos medicamentos
fitoterápicos (CALIXTO, 2003; GOBBO-NETO e LOPES, 2007).
Para o melhor desempenho, a cromatografia pode ser acoplada a diferentes
sistemas de detecção, a exemplo de um espectrômetro de massas, onde se
combina a alta seletividade e eficiência de separação dessa técnica com as
vantagens da espectrometria de massas (obtenção de informação estrutural, massa
molar e aumento adicional da seletividade) (VÉKEL, 2001).
Um espectrômetro de massas via de regra consiste de um instrumento
contendo uma fonte de íons, um separador ou filtro de massas, na realidade
massa/carga (m/z) e um detector.
2.6 Validação de Método para doseamento por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) para Determinação do Canferol e da Luteolina.
A validação de metodologia analítica está ligada ao desenvolvimento de
métodos e permite assegurar que o mesmo seja adequado para obter resultados
confiáveis (ARIGONY, 2005).
Podem ser de quatro tipos os métodos analíticos (ICH,1993) :
27
Testes de identificação: Esses métodos visam assegurar a identidade
do analito. Geralmente é realizado através de ensaios comparativos
das propriedades da amostra e um padrão.
Testes para a quantificação de impurezas: caracteriza a pureza da
amostra.
Testes para o controle do limite de impurezas.
Testes para a quantificação da substância ativa presente em amostra
da substância pura ou de produtos acabados, ou de componentes que
fazem parte da formulação.
Nestes métodos analíticos desenvolvidos, o analista escolhe os parâmetros
específicos que serão avaliados para garantir que o mesmo esteja validado. (USP
28, 2005; ICH, 1996; BRASIL, 2003).
1. Exatidão: mede a proximidade entre o valor de referência (aquele
aceito como valor real ou convencional) e o valor encontrado.
Quando não for possível adquirir todos os componentes da formulação é
aceitável acrescentar uma quantidade conhecida da substância ativa ao produto ou
formulação ou comparar os resultados obtidos a outro método que a validade já
tenha sido comprovada;
Para a determinação da exatidão deve ser utilizado no mínimo nove
determinações de três concentrações que estejam dentro da faixa de linearidade do
método. A exatidão deve ser expressa em percentagem de recuperação da
quantidade composto ativo adicionado na amostra ou como a diferença entre o valor
médio e o valor real, junto com os intervalos de confiança.
Pode ser determinada através de análise de misturas elaboradas com
compostos do produto farmacêutico, as quais foram adicionadas quantidades
conhecidas da substância ativa de interesse;
2. Precisão: Responsável por determinar o grau de acerto entre uma
determinada série de medidas obtidas de múltiplas medições de uma
amostra homogênea. A precisão apresenta três níveis: repetibilidade,
precisão intermediária e reprodutibilidade e se expressa em termos de
variância, desvio padrão relativo ou coeficiente de variação de uma
série de medidas.
28
3. A precisão intermediária mede as variações que podem ocorrer dentro
do laboratório em dias de analise, como Por exemplo, dias diferentes
de análise, diferentes analistas, diferentes equipamentos entre outros.
4. Especificidade: avaliar sem erros o analito de interesse, mesmo na
presença de outras substâncias (impurezas, produtos de degradação,
excipientes), mediante a comparação dos resultados obtidos com
amostras do analito e os obtidos com amostras sem o analito (SHARP,
2000; ICH, 1993). Em métodos cromatográficos a especificidade é
comprovada pela resolução dos componentes.
5. A reprodutibilidade é responsável por expressar a precisão entre
laboratórios diferentes e é testada através de estudos colaborativos.
6. Repetibilidade refere-se à precisão do método quando se utiliza as
mesmas condições operacionais, em um curto tempo. Este parâmetro
é avaliado utilizando no mínimo nove (9) determinações com
concentrações dentro da faixa de linearidade do método, ou com um
mínimo de seis (6) determinações com 100% da concentração
esperada da amostra.
7. Linearidade: Mede a capacidade de obter resultados que são
diretamente proporcionais à concentração ou quantidade do analito na
amostra, dentro de um intervalo determinado. É avaliada através de
análise da reta gerada por um grupo de sinais como função da
concentração. Utiliza-se um mínimo de concentrações, e apresentar-se
o coeficiente de correlação, o intercepto da ordenada, a inclinação da
linha de regressão e a soma residual dos quadrados, assim como o
gráfico obtido e o desvio padrão.
8. Limite de quantificação: É a quantidade mínima de amostra que pode
ser quantificada com a precisão e exatidão adequada. Este parâmetro
é determinado através de cálculos matemáticos, e é recomendável
validar, experimentalmente, estes dados mediante análise de uma
quantidade apropriada de amostras preparadas de modo tal que
contenham concentrações perto do limite de quantificação calculado.
9. Limite de detecção: é a menor quantidade da substância ativa na
amostra detectável, não possível de ser quantificada.
29
10. Intervalo de linearidade: É o intervalo entre a maior e a menor
concentração do analito na amostra. Este intervalo é estabelecido
confirmando se o método apresenta linearidade, exatidão e precisão ao
ser aplicado à análise de amostras com concentrações entre 80-120%
da substância ativa presente na formulação.
11. Robustez: Capacidade de manter-se inalterado mesmo com pequenas
variações controladas de alguns parâmetros. É indicativo da confiança
que se pode esperar do método durante seu uso cotidiano.
A validação visa garantir a inserção da técnica desenvolvida na rotina do
laboratório assegurando, através do uso de ferramentas estatísticas e segundo
critérios e parâmetros pré-estabelecidos, linearidade, exatidão, reprodutibilidade,
limites de detecção e quantificação, especificidade e robustez frente às
metodologias analíticas propostas (ICH, 1996; SWARTZ e KRULL, 1997; PAVEI,
2004).
2.7 Estudos in vitro
A Morte celular está presente durante o desenvolvimento de todos os
organismos multicelulares, determinando o número de células, sua proliferação, seu
tipo celular específico (MURRAY & CRISPE, 2004). É um assunto que tem atraído
muita atenção pela grande quantidade de informação que tem sido adquirida
utilizando ferramentas de biologia celular e molecular. A morte celular pode ser
definida de duas formas: morte celular programada e não programada (LOCKSHIN e
ZAKERI 2004).
Apoptose ou morte celular programada é um tipo de "autodestruição celular"
que requer energia e síntese proteica para a sua execução. Está relacionada com a
homeostase na regulação fisiológica do tamanho dos tecidos, exercendo um papel
oposto ao da mitose. O termo é derivado do grego, que se referia à queda das folhas
das árvores no outono - um exemplo de morte programada fisiológica e apropriada
que também implica em renovação. Ocorre no desenvolvimento embrionário, na
organogênese, na renovação de células epiteliais e hematopoiéticas, na involução
30
cíclica dos órgãos reprodutivos da mulher, na atrofia induzida pela remoção de
fatores de crescimento ou hormônios, na involução de alguns órgãos e, ainda, na
regressão de tumores (FRANKS e TEICH,1998). Portanto, consiste em um tipo de
morte desejável e necessária, que participa na formação dos órgãos e que persiste
em alguns sistemas adultos, como a pele e o sistema imunológico.
Muitas plantas exercem efeito anti-proliferativo, reduzindo a viabilidade e
inibindo o crescimento e a proliferação de linhagens celulares de câncer, através da
indução do processo de apoptose. Neste sentido, algumas plantas e seus derivados
já demonstraram exercer esse efeito sobre linhagens celulares. Por exemplo, a
Salvia officinalis L. apresenta atividade citotóxica sobre as células Hep-2 e HepG2
(GARCIA et al., 2012) o Linum persicum e a Euhorbia cheiradenia têm atividade
citotóxica e induzem apoptose em células K-562, Jurkat, A-549 e Fen
(AMIRGHOFRAN et al., 2006).
Extratos de Albizzia julibrissin, utilizada na medicina tradicional oriental para o
tratamento de insônia, diurese, astenia e confusão, induzem apoptose de forma mais
efetiva sobre células Jurkat do que sobre monucleares normais isolados de sangue
periférico (WON et al., 2006). Estudos mais recentes demonstraram que extratos
etanólicos da Lactuca indica L. exercem efeito apoptótico específico sobre células
HL-60, não afetando a sobrevivência de linfócitos normais isolados do sangue
periférico (CHEN et al., 2007). A fração acetato de etila do extrato da erva medicinal
chinesa Sarcandra glabra mostrou maior sensibilidade sobre a proliferação de
células HL-60, com detenção do ciclo celular e com a regulação das proteínas pró-
apoptóticas Bax e Bcl-2 (LI et al., 2007). De forma semelhante, o extrato dos rizomas
de Rhodiola rosea, amplamente utilizada na medicina popular da Rússia e da China,
inibiu a divisão celular destas células, onde se observou acúmulo de células na fase
de prófase do ciclo celular e posterior indução de apoptose e necrose (MAJEWSKA
et al., 2006). Este mesmo efeito foi observado para o extrato de Selaginellata
mariscina, com ativação da via das caspases (AHN et al., 2006). Outra planta
estudada, de onde é proveniente o chá verde, Camellia sinensis, através do extrato
metanólico de suas raízes expressaram efeito citotóxico e apoptogênico sobre
células K-562, não exibindo o mesmo efeito sobre leucócitos normais (GHOSH et al.,
2006).
31
2.7.1 ENSAIO DO MTT ( 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio)
De acordo com o guideline da OECD (2010) (Organization for Economic
Cooperation and Development) para testar substâncias químicas usando os testes in
vitro, devem ser avaliadas, no mínimo, três concentrações diferentes da droga.
Estas deverão ser escolhidas dos dados obtidos de estudos preliminares sobre
citotoxicidade. Os testes de citotoxicidade in vitro são importantes para se verificar a
toxicidade de novos compostos, principalmente quando se está verificando sua
aplicabilidade como agente terapêutico (MELO et al., 2000). Entre os diferentes
testes que podem ser utilizados na avaliação da citotoxicidade de um composto,
destaca-se o ensaio MTT proposto por Mosmann em 1983, o qual tem sido
amplamente utilizado para determinar a viabilidade e proliferação de células após a
exposição a substâncias tóxicas, e também para a caracterização da toxicidade de
novos fármacos (MOSMANN, 1983; BERRIDGE e TAN, 1993; LIU et al., 1997;
BERRIDGE et al., 2005).
O ensaio com MTT é um ensaio colorimétrico que baseia-se na capacidade de
células metabolicamente ativas reduzirem no meio intracelular o sal solúvel de
tetrazólio dando origem a cristais de formazan, que é um produto de cor roxa,
insolúvel em água, (MOSMANN, 1983).
Figura 3- Redução do MTT por enzimas mitocondriais. Fonte: GOMES, 2008.
Apesar de inicialmente se ter atribuído a redução do MTT a desidrogenases
mitocondriais (MOSMANN, 1983), foi demonstrado que a redução do MTT em
32
células intactas ocorre na maioria das vezes, fora da mitocondria, por
desidrogenases não mitocondriais, e provavelmente envolve os cofatores
nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) e nicotinamida adenina dinucleótido
fosfato (NADPH) (BERRIDGE e TAN, 1993; LIU et al, 1997). Foi então proposto que
o MTT entra nas células por um processo de endocitose e que o produto da sua
redução, o formazan, se acumula em endossomas/lisossomas, sendo depois
secretado por exocitose. O método envolve a conversão, pelas células, do MTT de
coloração amarela em cristais de formazan de coloracão roxa. Após a adição de
dimetilsulfóxido (DMSO), os cristais são solubilizados, liberados e quantificados
colorimetricamente, através de espectrofotometria tipo ELISA (COLLIER e
PRITSOS, 2003; VELLONEN et al., 2004).
2.8 Linhagens celulares
2.8.1 CÉLULAS HepG2
As células HepG2 são uma linhagem derivada de hepatocarcinoma humano
de um paciente de sexo masculino, livre de agentes virais hepatotrópicos
conhecidos, que expressam uma acentuada variedade de funções metabólicas
específicas do fígado (JAVITT, 1990). Encontra-se disponível comercialmente e está
catalogada sob o número ATCC HB-8065. Estas células crescem em monocamadas,
sua morfologia é de natureza epitelial e diferem dos hepátocitos quanto à expressão
de proteínas e fatores tumorais, possuindo ciclo celular com tempo médio de 20
horas (NATARANJAN e DARROUDI, 1991).
As células HepG2 mantém muitas das propriedades observadas nas células
hepáticas saudáveis, como o crescimento contínuo, tempo de vida praticamente
ilimitado e um fenótipo estável, além disso, suas condições de cultivo são simples e
estabelecidas com maior facilidade (BOKHARI et al., 2007).
A linhagem celular HepG2 é caracterizada pela alta capacidade de
metabolização de xenobióticos, já que apresenta atividade de várias enzimas de
fase I e fase II, que desenvolvem papéis importantes nos processos de ativação e
33
detoxificação de pró–carcinógenos genotóxicos (KNASMÜLLER et al., 2004). A
aplicação das células HepG2 para a avaliação da genotoxicidade e
antigenotoxicidade de extratos de plantas medicinais e componentes bioativos tem
sido demonstrada na literatura (PILLAY et al., 2013; YANG et al., 2011; ANGELI et
al., 2010).
2.8.2 CÉLULAS Mrc5
É uma linhagem diplóide fibroblástica de pulmão de feto humano. Foi
derivada de tecido normal de um pulmão de 14 semanas de idade de feto masculino
por JP Jacobs, em Setembro de 1966. Encontra-se disponível comercialmente e
está catalogada sob o número ATCC CCL 171.
34
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Esse trabalho objetiva caracterizar e avaliar a citotoxicidade do extrato
hidroetanólico de Arrabidaea chica (Humb. e Bonpl.) B. Verlot. em culturas de
células humanas HepG2 e Mrc5.
3.2 Específicos
1. Obtenção dos extratos na forma bruta e liofilizada;
2. Desenvolvimento do Método Analítico em Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) dos extratos hidroetanólicos (bruto e) de Arrabideae chica;
3. Validação do Método Analítico para a quantificação de dois marcadores
presentes nos extratos: Luteolina e Canferol;.
4. Avaliar o potencial citotóxico do extrato hidroetanólico de Arrabidaea chica
(Humb. e Bonpl.) B. Verlot. nas células, observando sinais de possível
toxicidade;
35
4 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
4.1 Material Vegetal
-Nome científico: Arrabidaea chica (Humb&Bompl) B. Verlt
-Família botânica: Bignoniaceae
-Gênero: Arrabidaea
-Parte usada: folhas jovens e maduras
4.2 Solventes e Reagentes
Água ultrapurificada Milli-Q, padrões Kaempferol e Luteolin, (Sigma Chemical Co.
St. Louis,EUA).; Acetonitrila padrão HPLC (LabSynth); Cloreto de Sódio- Merck; DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle Medium); Álcool Etílico Absoluto P.A 99,8% ACS; Solução de
Etanol a 70%;Metanol P.A (Intex) padrão HPLC; Metanol P.A (Intex), HCl P.A; Ácido
Fórmico P.A; Azul de Tripan 0,4% (Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY);
Thazolyl Blue TetrazoliumBromide 98% (Sigma-Aldrich); Hepes – Dinâmica; Soro Bovino
Fetal (Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY); Tripsina (Tryple Express 1x -
Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY); DMSO (Dimetil Sulfóxido, Sigma, St.
Louis, U.S.A);
4.2.1 PADRÕES ANALÍTICOS
Luteolina (Sigma-Aldrich); Canferol (Sigma-Aldrich).
36
4.3 Equipamentos
Moinho de facas e martelo de aço inoxidável DPM Júnior; estufa BIOMATIC;
mufla ENGRO modelo 3551; Balança analítica SARTORIUS TE214S; Alcoômetro
Gay Lussac INCOTERM; Estufa de CO2 ULTRASAFE; Capela com fluxo laminar
VECO, modelo Bioseg 09 Classe; Evaporador rotatório Buchi; Ultrassom (UNIQUE-
UltraSonicCleaner USC 1400; Banho- Maria .Sieger; Liofilizador LIOTOP L101;
Analisador de umidade por infravermelho GEHAKA IV 2000; Cromatógrafo Waters
Aliance e 2695, Microscópio invertido – Zeiss.
Materiais diversos: Balões de fundo chato capacidade para 125, 250 500 e
1000mL - Vidrolabor , Barra magnética, Cadinhos de porcelana, Câmara de
Neubauer, Eppendorf, Espátulas de aço inoxidável, Lâminas, Lamínulas, funil de
vidro, funil de metal; filtros; frascos para cultura celular (TPP - “Techno
PlasticProducts”, Trasadingen, Switzerland), Sistema de filtração com membrana de
0,22µm, Tubo Cônico - Tipo Falcon 15 e 50mL, Placas de fundo chato – TTP, com
96 poços e com 12 poços.
37
5 MÉTODOS
5.1 Aquisição do material vegetal
O material vegetal foi adquirido junto à Associação dos Vendedores de Ervas
do Mercado Ver-o-Peso (Ver-a-Erva), procedente da região metropolitana de Belém,
distrito de Icoaraci, Estado do Pará, coletada no mês de março de 2010.
5.1.1 IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DO MATERIAL VEGETAL
A identificação da espécie foi realizada pelo Doutor Mário Augusto Gonçalves
Jardim, botânico do Museu Paraense Emílio Goeldi, em exsicata sob o nº MG:
132453.
5.2 Processamentos do material vegetal
O material vegetal, após coleta foi submetido à lavagem com água corrente
para a retirada de sujidades e ligeiramente lavado em solução etanol a 70% de
modo a promover sua desinfecção . Após este procedimento, seguiu-se à secagem
prévia, por aproximadamente 72 horas, à temperatura ambiente sobre as bancadas
do laboratório de Processamento de Material Vegetal da Faculdade de Farmácia
(UFPA), previamente limpas, sanitizadas e revestidas com papel absorvente, para a
evaporação do álcool e da água presentes no material. Após esta secagem, o
material foi levado para a Central de Extração da Faculdade de Química (UFPA) e
colocado em estufa de ar circulante a uma temperatura em torno de 40°C a 45°C.
Este processo durou aproximadamente 4 dias, até peso constante, observado
através de uma alíquota do material, que teve o seu peso monitorado.
Posteriormente as folhas secas foram levadas ao moinho de facas e trituradas a pó.
38
5.3 Obtenções da solução extrativa (tintura) de A. chica
A tintura foi obtida pelo método da percolação (FARMACOPEIA BRASILEIRA
I, 1926), no qual 200g do pó das folhas foi colocado em contato com solução etanol:
água (70: 30, v/v), na razão 1:10, totalizando 2000mL de tintura. Estando a mistura
ao abrigo da luz e em temperatura ambiente. O solvente empregado foi uma mistura
hidroetanólica 70% (v/v).
5.4 Obtenção do extrato bruto de A. chica
A tintura foi concentrada em evaporador rotativo para a evaporação do
solvente utilizado na extração, utilizando-se uma temperatura de 40°C e pressão de
-600 a -700 mmHg, até a total evaporação do álcool. O objetivo desta etapa é
aumentar o teor de sólidos e melhorar o rendimento nos processos de liofilização e
secagem por spray dryer. O resíduo do balão foi denominado de extrato bruto (EB).
5.5 Obtenção do extrato liofilizado de A. chica
Para a etapa de liofilização do extrato bruto de A. chica, foi utilizado um
liofilizador Liotop L101, onde o material, previamente congelado, foi desidratado por
sublimação seguida pela dessorção, utilizando-se baixas temperaturas de secagem
a pressões reduzidas. O produto da liofilização foi denominado extrato liofilizado
(EL).
5.6 Análises Qualitativas e Quantitativas do Canferol e da Luteolina no extrato hifroetanólico de A. chica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
39
5.6.1 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
Procedeu-se análise cromatográfica utilizando os parâmetros descritos na Tabela 2 a seguir.
Tabela 2: Parâmetros para a análise cromatográfica de Arrabidaea chica
Características Descrição
Cromatógrafo Waters Aliance e 2695
Detector Waters 2998 Coluna RP 18 25 cm Pré-coluna phenomenex Temperatura da coluna 40°C Sistema de eluição Gradiente Fase móvel A- Água: TFA 0,1%
B- ACN: TFA 0,01% Volume de injeção 10µl Comprimento de onda 280 e 340 nm Tempo de corrida 25 min Tempo de limpeza da coluna
8 min
Tempo total 33 min
5.6.2 AMOSTRAS E PREPARAÇÕES DAS SOLUÇÕES PADRÕES
Para esta análise, efetuou-se a pesagem de 1 mg dos extratos: bruto e
liofilizado , bem como dos padrões luteolina e canferol, que posteriormente foram
solubilizados em metanol grau HPLC. As soluções foram sonicadas por 30 minutos e
deixadas em repouso por mais 30 minutos, após esse tempo o volume final
completado para 10 mL. As soluções foram filtradas em filtro Millipore 0,45 μm.
Alíquotas de 10 μL dos extratos e dos padrões foram manualmente injetadas
em equipamento de cromatografia de alta eficiência, com detector de arranjo de
diodos (DAD), em análises distintas, no sistema cromatográfico a fim de definir os
perfis da composição de cada amostra.
A acetonitrila (grau analítico para CLAE / VETEC), água ultrapura (Milli-Q)
foram filtradas previamente através de membrana filtrante (GS em Ester de Celulose
0,22 μm de poro, 90 MM de diâmetro, branca lisa) e desaeradas por 10 min em
40
banho de ultrassom. O sistema utilizado foi gradiente e encontra-se descrito na
Tabela 3
Tabela 3- Sistema gradiente do Método Cromatográfico dos extratos de Arrabidaea chica
Tempo (min) Fase A (%) Fase B (%)
0 85 15 25 57,9 42,1 26 0 100 28 0 100 29 85 15 33 85 15
5.6.3 VALIDAÇÃO
Os parâmetros utilizados para a validação do método por CLAE foram
fundamentados nas normas estabelecidas pela Conferência Internacional de
Harmonização (ICH, 1996), USP (2005) e pela Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA) Resolução de n. 899 (BRASIL, 2003) e estão listados a seguir:
Linearidade;
Curvas de calibração e equações da reta;
Limites de quantificação e detecção;
Repetibilidade;
Exatidão;
Robustez.
5.6.4 OBTENÇÃO DOS ESPECTROS DE MASSAS
As soluções das amostras foram injetadas, seguindo a metodologia de
Francescato (2013), por uma bomba de injeção automática, equipamento Agilent
G6460A com triplo quadrupolo com ionização por electrospray . O software utilizado
foi o MassHunter workstation versão B.03.01, Agilent, coluna Phenomenex Luna
41
18(2) (250 x 4,6 mm2). O cromatógrafo com arranjo de diodos foi o Waters Alliance
2690.
5.6.5 CÉLULAS
As linhagens celulares humanas HepG2 e Mrc5, foram gentilmemente
cedidas pelo Prof. Dr. Rommel Burbano, do Instituto de Ciências Biológicas, da
Universidade Federal do Pará. A linhagem celular tumoral HepG2 é proveniente do
fígado de um adolescente de 15 anos do sexo masculino com carcinoma
hepatocelular diferenciado, constituída por células epiteliais aderentes. A linhagem
celular Mrc5 é uma linhagem diplóide fibroblástica de pulmão de feto humano. Foi
derivada de tecido normal de um pulmão de 14 semanas de idade de feto masculino
por JP Jacobs, em Setembro de 1966.
5.6.5.1 Cultivo celular
As células hepatocarcinogênicas humanas, linhagem HepG2 (ATCC HB-
8065) e Mrc-5 (ATCC CCL 171) foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s
Modified Eagle Medium) e suplementadas com 10% soro fetal bovino inativado e 1%
de antibiótico (Penicilina/Estreptomicina). As células foram mantidas em garrafas
para cultura de tecido em estufa a 37°C e atmosfera umidificada com 5% de CO2
para a adesão, crescimento e replicação até obtenção da quantidade de células
necessárias para o desenvolvimento dos experimentos. Os repiques celulares foram
feitos conforme observação da confluência celular, que deve ocorrer dentro de 48-72
horas. Todos os reagentes foram previamente aquecidos em banho Maria a 37ºC.
Após retirar o meio de cultura da garrafa, a mesma foi lavada com aproximadamente
3 mL de Hank’s e adiciona-se a mesma quantidade de solução de tripsina.
Passados aproximadamente 2 minutos, acrescentou-se meio de cultura (3mL) à
solução dispersante para inibir a ação da tripsina. As células da superfície da garrafa
42
foram retiradas da garrafa com auxilio de uma pipeta acoplada a um pipetador
automático.
A suspensão foi transferida para um tubo Falcon e levada à centrifugação de
1000 rpm por 3 minutos. Retirou-se o sobrenadante, deixando aproximadamente
1mL. Após a homogeneização transferiu-se 200µL para uma nova garrafa de cultura,
sendo adicionado 20mL meio de cultura .
5.6.5.2 Contagem das células e número de células semeadas em placa, utilizando o azul de tripan 0,4%
O teste do azul de tripan permite quantificar separadamente as células viáveis
e as não viáveis. Este teste baseia-se na capacidade que o corante tem de penetrar
em todas as células. Entretanto, apenas as células viáveis conseguem bombear o
corante para fora, sendo possível, observar uma marcação azulada para as células
não viáveis, que perderam essa capacidade (PERES & CURI, 2005).
A contagem das células foi realizada com o objetivo de calcular o número de
células viáveis ideal a serem semeadas em cada placa.
Após a tripsinização, as células foram contadas pelo método de Azul de
Tripan 0,4% e preparadas suspensões contendo 1x103, 1x104, 1x105, 1x106 células,
para determinar qual o número ideal de células nos experimentos futuros.
As suspensões foram semeadas em quadriplicata em placas de poliestireno
de 96 poços, estéreis, descartáveis (TPP - “Techno PlasticProducts”, Trasadingen,
Switzerland), e as mesmas foram avaliadas diariamente em um período de 4 dias
(NIH, 2008).
A diluição da amostra de células com o Azul de Tripan 0,4% foi preparada na
proporção de 1:5, (10 microlitros do concentrado de células e 40 microlitros de Azul
de Tripan), colocada na câmara de Neubauer (hemocitômetro), preenchendo-a
completamente e deixando-a em repouso por 5 minutos em câmara úmida; e
contadas nos quatro quadrantes laterais o número de células nucleadas.
43
5.6.5.3 Plaqueamento das células
Vinte e quatro horas antes do tratamento com os extratos, as células foram
semeadas em placas de 96 poços (5×104células/mL) com meio completo e
incubadas para crescimento por no mínimo 24 horas, atingindo 60-70% de
confluência.
5.6.5.4 Tratamentos
Para o tratamento com o extrato hidroetanólico de A. chica, os extratos na
forma bruto e liofilizado foram solubilizados em meio de cultura DEMEN e, ao
atingirem a semi- confluência as células HepG2 e Mrc5 foram tratadas com as
concentrações de 250, 500, 1000 e 2000 µg/mL por de 24 e 48 horas.
5.6.6 TESTE DO MTT
A viabilidade celular foi medida utilizando-se o teste do MTT descrito por
Mosmann (1983), com modificações. Utilizando placa de 96 poços foram distribuídas
as células Mrc5 e HepG2 (1x104 células/mL meio DMEM suplementado com 10%
de SFB). As As placas foram incubadas a 37 °C em atmosfera úmida com 5% de
CO2.
Depois de 24h de incubação foi realizado o tratamento com quatro
concentrações crescentes (250μg/mL; 500μg/mL; 1000μg/mL e 2000μg/mL) do
extrato hidroetanólico de A. Chica nas formas : bruto e liofilizado, utilizando-se como
controle negativo apenas o meio DMEN. (Figura 4). As placas foram incubadas a 37
°C, em atmosfera úmida com 5% de CO2.
Após 24 horas de tratamento, o meio de cultura das células foi retirado e as
células fora incubadas com 100 µL da solução de MTT 0,5 mg/mL em estufa a 37°C
e 5% de CO2 por 3h. Após o período de incubação removeu-se a solução de MTT e
44
os cristais de formazan, dissolvidos com 200µL de DMSO e a absorvância
determinada a um comprimento de onda de 595 nm, num leitor automático de placas
de cultura Epoch. Esta mesma metodologia foi aplicada com um tratamento de 48h.
Legenda: Apenas células / Apenas DMSO (branco)
Extrato Bruto
Extrato Liofilizado
Figura 4- Esquema da placa desenvolvida para o ensaio do MTT.
A viabilidade celular expressa em percentagem foi calculada da seguinte
forma:
% viabilidade celular = absorvância do tratamento x 100 absorvância do controle
EB
EL
45
Para o controle foram usadas células não submetidas ao tratamento. Os
ensaios foram realizados em triplicata.
5.6.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos na avaliação da citotoxicidade pelo método do MTT foram
submetidos à Análise de Variância (ANOVA) a 95% de confiabilidade, e depois de
verificado os pressupostos de normalidade dos resíduos, foi realizada a comparação
das médias por meio do teste de Tukey, considerando p-valor < 0,05 de
probabilidade (MONTEGOMERY, 1991; CONAGIN, 2008). Os resíduos dos dados
observados submetidos a Análise de Variância que não atenderam aos
pressupostos foram submetidos a transformação de Box-Cox. As médias dos
tratamentos também foram submetidas à Análise de Regressão Linear, o qual
considerou-se um R> 0,70 pra observar os pontos de inflexão das curvas (DRAPER,
1981). As análises dos dados foram realizadas por meio de software R, versão 3.0.3
(R Core Team, 2012).
46
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Análise quantitativa do canferol e da luteolina no extrato hidroetanólico da A. chica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Sabidamente a Cromatografia Líquida de alta eficiência vem destacando-se,
há décadas, como uma das metodologias analíticas mais amplamente empregadas
na análise quantitativa, devido a possibilidade de separar os constintuintes e
simultaneamente quantificá-los, com rapidez, simplicidade e confiabilidade.
As figuras 5 e 6 indicam o perfil cromatográfico qualitativo dos padrões de
flavonóides utilizados: canferol e luteolina. Os tempos de retenção para canferol, e
luteolina foram 16,5 e 21,5 respectivamente.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0
50
100
150
200
mV
Detector A Ch2:340nm Detector A Ch1:280nm
Figura 5- Cromatograma do canferol
47
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0
25
50
75
100
125
mV
Detector A Ch2:340nm Detector A Ch1:280nm
Figura 6- Cromatograma da luteolina
A mesma condição cromatográfica usada para o padrão de flavonóides foi
utilizada para analisar os extratos da A. chica. O extrato hidroetanólico (bruto e
liofilizado) apresentou um pico no mesmo tempo de retenção (16,5 min) visualizado
para o canferol e outro pico no tempo de retenção (21,5) visualizado para a luteolina
(Figuras 7 e 8). Barbosa et al. (2008) isolaram três flavonoides: 4’-hidroxi-3,7-
dimetoxiflavona, vicenina-2 e canferol.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0.0
2.5
5.0
7.5
mV
Detector A Ch2:340nm Detector A Ch1:280nm
Figura 7- Perfil cromatográfico do extrato hidroetanólico bruto de A. chica. Condições de eluição: Coluna RP-18 25 cm, fase móvel: A- água: TFA 0,1%; B- ACF:TFA 0,01%; temperatura= 40º C, comprimento de 280 e 340nm.
48
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min
0
1
2
3
4
5
6
7mV
Detector A Ch2:340nm Detector A Ch1:280nm
Figura 8- Perfil cromatográfico do extrato hidroetanólico liofilizado de A. chica. Condições de eluição: Coluna RP-18 25 cm, fase móvel: A- água: TFA 0,1%; B- ACF:TFA 0,01%; temperatura= 40º C, comprimento de 280 e 340nm.
Takemura et al.(1995), isolaram o flavonoide luteolina a partir do extrato
metanólico das folhas de Arrabidaea chica. Ribeiro (2012) sugeriu a presença de
luteolina no extrato metanólico de Arrabidaea chica.
Amaral et al. (2006) mencionam o isolamento de flavonoides em A. chica, a
partir do extrato de diclorometano, onde foi identificada a presença de luteolina..
Estudo feito por Zorn et al. (2001) cita o isolamento de 6,7,3’-trihidroxi-5,4’-dimetoxi-
flavilium; 6,7,3’,4’-tetrahidroxi-5-metoxi-flavilium;6,7-dihidroxi-5,4’-dimetoxi-flavilium
carajurina); 6,7,4’-trihidroxi-5-metoxi-flavilium (carajurona) e da flavona acacetina.
Também foram encontradas nas folhas da espécie, duas 3-deoxiantocianidinas:
6,7,3’,4’-tetrahidroxi-5-metoxiflavilium e 6,7,4’-trihidroxi-5-metoxiflavilium e o
pigmento carajurina (DEVIA et al. 2002).
A figura 9 indica o cromatograma dos extratos hidroetanólico bruto e do
extrato hidroetanólico liofilizado para comparação à λ=280nm e λ=340nm.
Analisando a figura 9, observa-se que o extrato bruto apresenta picos nos mesmos
tempos de retenção, mas com intensidades diferentes, comparativamente ao extrato
liofilizado. Assim observa-se que o extrato bruto tem picos mais elevados e
interessante é que isso não se reflete na sua atividade. Como será visto adiante, o
extrato bruto apresenta atividade citotóxica, entretanto o extrato liofilizado tem
atividade mais significativa em relação à atividade citotóxica.
49
Figura 9- Cromatograma comparativo dos extratos bruto e liofilizado (vermelho – extrato bruto; verde – extrato liofilizado). Condições de eluição: Coluna RP-18 25 cm, fase móvel: A- água: TFA 0,1%; B- ACF:TFA 0,01%; temperatura= 40º C, comprimento de 280 e 340nm.
A observação do cromatograma comparativo dos padrões e dos extratos
(bruto e liofilizado) de A. chica demonstra que todas as amostras analisadas
apresentam os padrões luteolina e canferol, o que é um indício de que o processo
de secagem não causou a perda destes compostos (Figura 10). Isso demonstra
também a eficiência do processo e as condições selecionadas.
Figura 10- Perfil cromatográfico qualitativo para comparação dos padrões(canferol e luteolina ) com os extratos (bruto e liofilizado) : verde –extrato liofilizado, azul – extrato bruto, rosa padrão canferol e vermelho padrão luteolina. Condições de eluição: Coluna RP-18 25 cm, fase móvel: A- água: TFA 0,1%; B- ACF:TFA 0,01%; temperatura= 40º C, comprimento de 280 e 340nm.
50
Estes resultados se assemelham a estudos de Silva (2007), diante da
avaliação de diferentes técnicas de secagem do extrato de llex paraguaiensis, foi
observado que não houve diferença significativa nos teores de polifenóis,
demonstrando que a técnica de secagem não exerce influência sobre esses
parâmetros.
6.2 Validação do método de quantificação por CLAE
6.2.1 LINEARIDADE
A linearidade foi testada na concentração de 1 a 50 µg/mL de luteolina e
canferol. Para isso, foi preparada uma solução-mãe (SM) com 5 mg de cada padrão
e colocado em um balão de 100 mL e o volume foi completado com metanol. A partir
dessa solução mãe foi preparado 6 soluções com diluições seriadas como
exemplificado na tabela 4.
Tabela 4- concentrações de canferol e da luteolina injetadas no cromatógrafo
Concentração Volume da SM Volume de metanol
1 µg/mL 0,1 4,9
5 µg/mL 0,5 4,5
10 µg/mL 1 4
20 µg/mL 2 3
30 µg/mL 3 2
40 µg/mL 4 1
50 µg/mL 5 0
Cada solução foi injetada no cromatógrafo em triplicata e em 3 dias
diferentes. Foi plotado um gráfico de dispersão relacionando a média das áreas dos
picos formados no cromatogramas e suas respectivas concentrações. Foi calculado
51
o coeficiente de correlação utilizando o método dos mínimos quadrados, onde,
segundo a resolução 899 (BRASIL, 2003), não pode ser menor que 0,99.
6.2.2 CURVAS DE CALIBRAÇÃO E EQUAÇÕES DA RETA DA LUTEOLINA E CANFEROL
Após a realização das 9 curvas de calibração sendo que cada triplicata realizada
em dias diferentes e consecutivos, a partir de diluições obtivemos as curvas (Figuras
11 e 12) com as seguintes concentrações: 5, 10, 20, 30, 40 e 50 µg/mL.
a) Canferol
Figura 11- Curva Padrão Canferol.
b) Luteolina
Figura 12- Curva padrão Luteolina.
52
É importante ressaltar que a Resolução- RE n° 899/03 da Agência Nacional
de Vigilância Sanitária (ANVISA) preconiza o valor de R igual a 0,99, e com isso
nossas curvas apresentaram valor satisfatório como preconiza a legislação.
6.2.3 LIMITES DE QUANTIFICAÇÃO E DETECÇÃO
O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções
contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável
com precisão e exatidão aceitáveis. Pode ser expresso pela equação:
O Limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma
amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as
condições experimentais estabelecidas. Pode ser expresso pela equação:
Desta forma, temos os valores obtidos conforme demonstrado na tabela 4.
Tabela 5- Valores dos Limites de Quantificação e Detecção dos padrões Canferol e Luteolina a partir do método validado em microgramas por mL.
Substâncias Limite de Quantificação Limite de Detecção
Canferol 6,58 2,17 Luteolina 2,71 0,89
53
6.2.4 REPETIBILIDADE
A repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9 (nove)
determinações, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 (três)
concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6
determinações a 100% da concentração do teste. O valor máximo aceitável deve ser
definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração do analito na
amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método.
Calculamos o coeficiente de variação usando a equação (X) e esse
coeficiente não pode ser maior que 5%.
De acordo com a tabela 6 temos:
Tabela 6- Coeficientes de Variação a partir da repetibilidade do padrão de Canferol.
Concentração de Canferol
Média DP CV
5 118872 5,038769 5,113384 0,191296 3,741083
5 129455 5,428782 5 120585 5,101898 5 120585 5,101898 5 129455 5,428782 5 118872 5,038769 5 114532 4,878828 5 116939 4,967533 5 118775 5,035194 20 518567 19,76864 19,75876 0,136357 0,690108
20 521505 19,87691 20 512616 19,54933 20 512616 19,54933 20 521505 19,87691 20 518567 19,76864 20 517479 19,72854 20 518699 19,7735 20 523136 19,93702
54
50 1350880 50,44168 50,01524 0,341769 0,683331
50 1336897 49,92637 50 1352968 50,51863 50 1334654 49,84371 50 1333765 49,81095 50 1322127 49,38205 50 1338664 49,99149 50 1341610 50,10006 50 1342213 50,12228
Conforme demonstrado na tabela 6, obtivemos valores abaixo de 5%,
demonstrando que o método é preciso para o padrão de canferol.
De acordo com a tabela 7 temos:
Tabela 7- Coeficientes de Variação a partir da repetibilidade do padrão de Luteolina.
Concentração de Luteolina
média DP CV
5 233676 5,042348 5,190941 0,162291 3,126429
5 248105 5,336968 5 249446 5,364349 5 249446 5,364349 5 248105 5,336968 5 233676 5,042348 5 229429 4,95563 5 240158 5,174701 5 236539 5,100807 20 956186 19,79498 19,7155 0,130342 0,661114
20 956075 19,79271 20 941601 19,49717 20 941601 19,49717 20 956075 19,79271 20 956186 19,79498 20 952765 19,72513 20 951708 19,70354 20 958447 19,84114 50 2463941 50,58119 50,07102 0,410157 0,81915
50 2439126 50,07451 50 2478537 50,87922 50 2416392 49,61031 50 2423289 49,75114 50 2433129 49,95206
55
Conforme demonstrado na tabela 7, obtivemos valores abaixo de 5%,
demonstrando que o método é preciso para o padrão de luteolina.
6.2.5 EXATIDÃO
A exatidão avalia se o valor encontrado pela análise está próximo do valor
real da amostra. Para avaliar esse teste foi analisado 3 concentrações (5, 20 e 40
µg/mL) em 3 dias diferentes. Foi calculado a recuperação e esse valor não pode ser
menor que 5%.
Temos ainda, de acordo com a tabela 8:
Tabela 8- Recuperação do Padrão Canferol.
Recuperação do Canferol Média DP
5 119090 121420 122700
97,34824 100,9612 101,1892
99,83289 2,154782
10 808798 759866 843594
97,03309 96,15538 102,257
98,48184 3,298743
20 1261122 1329884 1290388
93,11077 98,81273 96,35025
96,09125 2,859793
Desta forma, temos de acordo com a tabela 9
Tabela 9- Recuperação do padrão Luteolina.
Recuperação da Luteolina Média DP
5 231890 234012 235988
101,4605 104,6205 103,9641
103,3484 1,667549
56
10 1486702 1501528 1472120
98,23109 103,2199 96,46863
99,30655 3,501783
20 2397406 2476034 2346804
97,5777 101,0554 96,17643
98,26984 2,512044
Podemos notar nas tabelas 8 e 9, os valores estão aceitáveis de acordo com a legislação.
6.2.6 ROBUSTEZ
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir
a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança
durante o uso normal.
Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliação
da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do método à variações nas
condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser
incluídas no procedimento.
Dentre as possibilidades de variações que a legislação preconiza,
estabelecemos as seguintes alterações: no fluxo e na temperatura da coluna para
mais e para menos.
A Tabela 10 mostra a avaliação da robustez, variando o parâmetro fluxo (1,05
mL/min) e temperatura (41ºC)
Tabela 10- Alterações utilizadas para avaliar a Robustez do Método.
CV% Canferol CV% Luteolina Fluxo
(1,05 mL/min) 3,85 3,91
Temperatura (41ºC)
4,17 4,23
A partir dos dados obtidos não verificamos alterações significativas no
método, demonstrando que o método apresenta-se robusto.
57
Depois de validado o método, foi possível quantificar o canferol e a luteolina
no extrato (bruto e liofilizado).
Tabela 11- Quantificação do canferol e da luteolina nos extratos.
Canferol Luteolina
Extrato Bruto 68,65 μg/mL 31,64 μg/mL
Extrato Liofilizado 0,49% (m/m) 0,18% (m/m) % (m/m)
6.3 Identificação dos flavonoides por LC/MS
A análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas do
extrato hidroetanólico de Arrabidaea chica Verlot, foi realizado estudo no Núcleo de
Análises e Pesquisas orgânicas-NAPO, Departamento de Quimica da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul e permitiu identificar no extrato
hidroetanólico, os flavonoides: luteolina, canferol, entre outros.
Os tempos de retenção e os valores dos íons moleculares coincidem com os
existentes na literatura (Kite et al., 2007).
Na análise com detector de arranjo de Diodos, os extratos observam-se os
picos com tempos de retenções 1,12; 1,40; 1,82; 2,13; 2,63 que apresentam
espectros em ultravioleta sugestivo de Carajurina, Antocianosídeo, 6-OH luteolina,
Luteolina e Canferol, respectivamente. Dados cromatográficos sugerem que a
substância majoritária deste extrato seja a carajurina, que tem o tempo de retenção
em 1,12 minutos (Figura 13). Esse resultado corrobora com estudos de Cabral
(2010), onde a análise de plantas provenientes de diferentes origens geográficas
demonstrou que dependendo da região onde foi realizada a coleta houve diferença
na intensidade da coloração vermelha, característica do pó obtido das folhas
Arrabidaea chica, as amostras do grupo de coloração vermelho intenso,
apresentaram maior intensidade do íon m/z 299 (carajurina). Em outros de
tonalidade menos intensa o íon m/z de maior intensidade foi 285 (carajurona).
58
Gobbo-Neto e Lopes (2007) descreveram os diversos fatores que influenciam no
acúmulo de metabólitos secundários em plantas, dentre eles a temperatura.
6.4 Caracterização do perfil dos flavonoides em extratos de A. chica
Para caracterizar o perfil de flavonoides das folhas A. chica, procedeu-se a
análise do extrato bruto por ESI (+) –MS.
Nos espectros obtidos do extrato bruto, foram detectados os íons de m/z
287,0544 e 287,0547 referentes aos picos sugestivos de canferol (Figura 13-A) e
luteolina (Figura 13-B) respectivamente.
m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
%
0
100
20140430_ACHICA_C_03 105 (1.948) AM (Cen,4, 80.00, Ht,5000.0,0.00,0.70); Sm (SG, 2x3.00); Sb (1,40.00 ) 1: TOF MS ES+ 300287.0544
121.9686
102.1282
73.0668
60.0444
144.9821
146.9845 213.9311
288.0579
289.0680445.1853
393.8334 463.1068 586.7784 814.2121670.0634 721.2287 951.7115
Figura 13A- Espectros de ESI (+)-MS sugestivo de canferol no extrato hidroetanólico
m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
%
0
100
20140430_ACHICA_C_03 122 (2.263) AM (Cen,4, 80.00, Ht,5000.0,0.00,0.70); Sm (SG, 2x3.00); Sb (1,40.00 ) 1: TOF MS ES+ 211287.0547
121.9670
102.1263
73.0654
60.0520
144.9834
146.9786235.1658
288.0584
301.0959
388.8776 411.9179 464.8594 593.0736 713.7064661.1182 814.2044
Figura 13B- Espectros de ESI (+)-MS sugestivo de luteolina no extrato hidroetanólico
59
A figura 14 refere-se aos cromatogramas obtidos da injeção do padrão
Canferol da Sigma Chemical, onde o tempo de retenção observado foi de 2,66 / 2,76
minutos, UV mínima de 265,3138 e máxima de 366,8138.
CANFEROL
29-Apr-2014 16:55:19
Time0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
%
0
100
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
AU
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
1.0e+1
1.2e+1
20140429_CANF_01 3: Diode Array Range: 2.294e+10.34
2.66
0.39
20140429_CANF_01 1: TOF MS ES+ 287
9.22e3
2.76
Figura 14- Cromatograma e massas do padrão Canferol (Sigma-Aldrich)
O espectro de massas referente ao pico do padão de canferol é de 287,0522,
conforme podemos observar na figura 15.
m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
%
0
100
20140429_CANF_01 151 (2.800) AM (Cen,4, 80.00, Ht,5000.0,0.00,0.70); Sm (SG, 2x3.00); Sb (1,40.00 ) 1: TOF MS ES+ 857287.0522
102.127973.0659 213.0374121.9671286.9247
288.0567
289.0603379.0310
361.0212407.0276
629.0475464.8959542.8065 897.1060652.2844
726.9446 924.9152
Figura 15- Espectros de ESI (+)-MS do padrão canferol da (Sigma-Aldrich)
60
A figura 16 refere-se aos cromatogramas obtidos da injeção do padrão
luteolina da Sigma Chemical, onde o tempo de retenção observado foi de 2,12 / 2,
23 minutos, UV mínima de 252,8139 e máxima de 348,8135.
LUTEOLINA
30-Apr-2014 10:27:22
Time0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
%
0
100
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80
AU
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
1.0e+1
1.2e+1
20140429_LUT_01 3: Diode Array Range: 2.239e+10.34
2.12
0.39
20140429_LUT_01 1: TOF MS ES+ 287
1.24e4
2.23
Figura 16- Cromatograma e massas do padrão Luteolina (Sigma-Aldrich)
O espectro de massas referente ao pico do padrão de luteolina 287,0500,
conforme podemos observar na figura 17.
O espectrômetro de massas mostra o pico do íon molecular com eletrospray
positivo, aumentando a massa do composto em um próton, dessa forma as massas
de canferol e luteolina são 287,0522 e 287,0544 respectivamente, como podemos
observar nas figuras 15 e 17.
61
m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
%
0
100
20140429_LUT_01 121 (2.244) AM (Cen,4, 80.00, Ht,5000.0,0.00,0.70); Sm (SG, 2x3.00); Sb (1,40.00 ) 1: TOF MS ES+ 1.47e3287.0500
259.1347213.0351111.037294.0447
288.0583
292.2061
293.2097
379.0305353.0759
455.2863 629.0670557.2233 897.1321798.3730671.0680
712.2082940.0545
982.0400
Figura 17- Espectros de ESI (+)-MS do padrão luteolina (Sigma-Aldrich)
Dependendo da substituição e do nível de oxidação no anel C3, os
flavonoides podem ser divididos em subclasses, assim com a substituição em 3’ a
luteolina encontra-se na classe das flavonas e o canferol com a substituição em 4’,
na classe dos flavonóis.
As moléculas canferol e luteolina apresentam massas moleculares
semelhantes (286 µmol), sendo, portanto isômeros. Para confirmar a identidade das
moléculas seria necessário realizar a análise por LC-MS/MS, onde através da
quebra molecular os picos referentes aos seus fragmentos seriam evidenciados
(Cabral, 2010). Uma ilustração a figura 18.
Figura 18- Ilustração das possíveis quebras nas moléculas de canferol e luteolina
m/z 109
m/z 177
m/z 93
m/z 193
LUTEOLINA CANFEROL
62
Estudos de Cabral (2010), obtidos pela avaliação de espectrometria de
massas, evidenciaram no extrato bruto metanólico a presença de íons de m/z 285,
299, 301 e 315, referentes a carajurona, carajurina, 6,7,3’,4’- tetrahidoxi-5-metoxi-
flavilium e 6,7,3’-trihidroxi-5-dimetoxiflavilium, respectivamente.
6.5 Efeito do extrato hidroetanólico de A. chica sobre as células HEpG2 O extrato hidroetanólico de A. chica produzido a partir das folhas, obtido
através de diferentes métodos de secagem: bruto e liofilizado foi submetido à
avaliação da citotoxicidade (ensaio MTT) utilizando células HepG2.
Diante da exposição das células do carcinoma hepatocelular da linhagem
HepG2 a diferentes concentrações do extrato hidroetanólico bruto de A.chica (250,
500, 1000 e 2000 µg/mL), durante dois tempos (24 e 48 horas), observou-se que no
período de 24 horas, não houve inibição significativa (p< 0,05) da proliferação
celular.
Observou-se maior redução da viabilidade em 48 horas, onde todas as doses
diferiram estatísticamente do controle (0µg/mL). Nas maiores doses, 1000 e
2000µg/mL, a citotoxicidade do extrato de A.chica foi de 15 e 20%, respectivamente.
Na exposição ao extrato hidroetanólico liofilizado de A.chica, não foi observada
redução significativa da viabilidade celular após 24 horas, as médias não diferiram
do controle. Em 48 horas, houve redução siginificativa da viabilidade celular, visto
que todas as doses diferiram do controle.
Tabela 12 Comparação das médias de viabilidade celular de Células HepG2, comparando a dose de
cada extrato (Com/Lio/Sec) com o tempo de exposição (24 e/ou 48 h).
Tabela de comparação de médias por meio do Teste de Tukey com p-valor < 0,05 de probabilidade. As letras maiúsculas iguais na linha e letras minúsculas iguais na coluna, as médias não diferem a 95% de confiabilidade. Para atender os pressupostos da ANOVA a 5% de significância todas as variáveis sofreram transformação Box-cox, os respectivos lambdas se encontram nos apêndice B.
[ ] Amostra µg/mL Bruto 24h Bruto 48h Lio 24h Lio 48h
250 0,4883bAB 0,3570cA 0,4173bAB 0,4380bcAB
500 0,4780bA 0,3413cA 0,4080bA 0,4053bA
1000 0,4567bB 0,2977bcA 0,3580bAB 0,3890bAB
2000 0,4343bB 0,2343bA 0,3543bAB 0,3813bB
Branco 0,0437aA 0,0483aA 0,0460aA 0,0460aA
Controle 0,5253bA 0,5470dA 0,6180bA 0,6000cA
63
Os valores encontrados para o cultivo das células HepG2 com o extrato
hidroetanólico (bruto e liofilizado) de A.chica indicam efeito citotóxico para todos os
tratamentos após 48 horas (Tabela 11), pois houve redução significativa (p< 0,05) da
viabilidade quando se utilizou concentrações de 250, 500, 1000 e 2000 µg/mL) dos
extratos bruto e liofilizado de A.chica, sendo que o ensaio a 2000 µg/ml apresentou o
maior potencial citotóxico. Observou-se que extrato liofilizado foi o mais efetivo na
redução da viabilidade celular, na maior dose de exposição, em 24 horas houve uma
redução de 47%, em relação ao controle (0 µg/ml). Após 48 horas evidenciou-se o
aumento da ação antiproliferativa para 65%.
6.6 Efeito do extrato de A. chica sobre as células Mrc5
A exposição das células Mrc5 às diferentes concentrações do extrato
hidroetanólico de A.chica, bruto e liofilizado (250, 500, 1000 e 2000 µg/ml), por 24
horas não mostrou redução significativa da viabilidade celular.
O extrato liofilizado apresentou efeito citotóxico significativo apenas para o
extrato liofilizado, após 48 horas de exposição, na maior concentração (2000ug/mL),
observando-se uma sobrevivência de apenas 33% (Tabela 12)
Tabela 13- Comparação das médias de viabilidade celular de Células Mrc5, comparando a dose de cada extrato (Bruto/Lio/Sec) com o tempo de exposição (24 e/ou 48 h).
Tabela de comparação de médias por meio do Teste de Tukey com p-valor < 0,05 de probabilidade. As letras maiúsculas iguais na linha e letras minúsculas iguais na coluna, as médias não diferem a 95% de confiabilidade. Para atender os pressupostos da ANOVA a 5% de significância todas as variáveis sofreram transformação Box-cox, os respectivos lambdas se encontram nos apêndice A.
[ ] Amostra µg/mL Bruto 24h Bruto 48h Lio 24h Lio 48h
250 0,4603bB 0,8720bA 0,4960bB 0,7583dA
500 0,4887bBC 0,7473bA 0,4813bB 0,6767dA
1000 0,4867bD 0,8117bC 0,4787bD 0,5880dB
2000 0,4970bD 0,5710bC 0,4337bA 0,3440bB
Branco 0,0447aA 0,0470aA 0,0457aA 0,0470aA
Controle 0,5103bB 0,8790bA 0,4773bB 0,9327cA
64
Em geral, a citotoxicidade é diretamente proporcional à concentração da
amostra e ao tempo de exposição (KUMAR et al. 2009). No presente estudo, quando
se utilizou a HepG2, observou-se uma correlação direta entre a concentração e
citotoxicidade. Em relação ao tempo de exposição, observou-se que quanto maior o
tempo maior a citotoxicidade.
Os resultados indicam que a citotoxicidade do extrato hidroetanólico é maior
para a linhagem HepG2, quando comparada a Mrc5, nos dois tempos de tratamento
sugerindo que essa diferença pode evidenciar uma atividade específica para cada
tipo celular, corroborando com o resultado obtido por RIBEIRO et al. (2012), ao
avaliar a citotoxicidade de extratos de Arrabideae chica em linhagens HL60 e
Jurkat.
O extrato etanólico da A. chica possui diferentes classes de substâncias como
fenóis, taninos, flavonóis, antocianinas (BARBOSA et al.2008), estes, despertam
interesse por sua comprovada atividade antioxidante e protetora (CAO et al. 1997),
bem como por sua efetiva atividade antitumoral (FERRER et al. 2006), a exemplo
da quercetina e mirecetina, pode ser atribuída à sua eficiência em inibir as enzimas
topoisomerases I e II .Também apresentam atividade inibidora de proteínas
quinases (GAMETPAYRASTRE et al. 1999).
Neste estudo o extrato de A. chica mostrou em seu perfil químico, dentre
outros componentes: quercetina, luteolina e canferol, pertencentes à classe dos
flavonoides, reconhecidamente, estes compostos apresentam atividade antitumoral,
antioxidante, anti-inflamatória, citostática, antiangiogênica, dentre outras de acordo
com diversos estudos (CHEN et al. 2012; HODEK et al. 2002; PARK et al. 2012;
SALMELA et al. 2012).
Takemura et al. (1995) isolaram o flavonóide luteolina a partir do extrato
metanólico das folhas de A. chica. O canferol foi isolado a partir do extrato etanólico
, por Barbosa et al. Em 2008.
Sabe-se que, dos metabólitos secundários presentes nas plantas, os
flavonoides são considerados os mais versáteis. A presença destes compostos na
Arrabidaea chica (Humb. &Bonpl.) B. Verlot, pode justificar a atividade biológica
exercida pelo extrato frente às linhagens celulares utilizadas neste estudo. Dentre
estes compostos podemos citar: 4’-hidroxi-3,7-dimetoxiflavone; vicenina-2 e canferol,
quercetina, luteolina, entre outros, já evidenciados em vários estudos e que podem
ser responsáveis pela atividade antitumoral observada frente as células HepG2.
65
Ren et al., 2010 reportaram que a quercetina e o canferol apresentam
significativo efeito antileucêmico in vitro. Esses flavonoides induziram parada do
ciclo celular em G2/M e apoptose de células HL60.
A quercetina (3,3’,4’,5,7- pentahidroxi-flavona) é um flavonol que apresenta
forte poder inibitório em células HepG2, com a redução da viabilidade celular acima
de 80%. Destaca-se também por seu efeito antioxidante. Em pequenas
concentrações 10 a 25 µmol/L, ela atua contra espécies reativas de oxigênio (ERO),
prevenindo o processo tumorogênico e, em concentrações mais elevadas acima de
50µmol/L, tem efeito pró-oxidante e citotóxico, apresentando tendência à indução da
apoptose nas células. Vários estudos comprovam que flavonoides como a
apigenina, quercetina e canferol afetam o potencial transmenbrana mitocondrial,
com liberação do citocromo c ao citoplasma e ativação da procaspase-9, resultando
em apoptose, na seguinte ordem de potencialidade: apigenina quercetina
canferol em linhagens de células da leucemia (HL-60) tratadas com 60µmol/L destes
flavonoides (KUNTZ et al. 1999).
A luteolina, por sua vez, tem suas propriedades antitumorais amplamente
discutidas na literatura. Efeitos citotóxicos frente a várias linhagens tumorais são
descritas, sendo relacionados ao bloqueio do ciclo celular entre a fase G2 e a
mitose, seguido de apoptose. A luteolina ainda mostra-se capaz de inibir a
angiogênese, previnir a carcinogênes e sensibilizar as células tumorais a agentes
quimioterápicos.
O extrato liofilizado apresentou melhores resultados de citotoxicidade em
relação aos extratos bruto, demonstrando que a liofilização preserva, de um modo
geral, os constituintes químicos termolábeis, conferindo maior estabilidade.
Os mecanismos bioquímicos envolvidos na inibição da proliferação e morte
celular podem ser explicados através de algumas vias intracelulares já conhecidas e
atribuídas a alguns dos constituintes do extrato utilizado, e que serão descritos a
seguir:
Muitas plantas exercem efeito anti-proliferativo, reduzindo a viabilidade e
inibindo o crescimento e a proliferação de linhagens celulares. A exemplo disso,
estudos demonstraram que a Salvia officinalis L. apresenta atividade citotóxica sobre
as células Hep-2 e HepG2 (Garcia et al. 2012), o o Linum persicum e a Euhorbia
cheiradenia têm atividade citotóxica e induzem apoptose em células K-562, Jurkat,
A-549 e Fen (AMIRGHOFRAN et al., 2006). A mesma atividade também foi atribuída
66
a alguns flavonoides isolados de Lonchocarpus spp sobre a linhagem P-388 de
células tumorais leucêmicas, onde estes metabólitos foram responsáveis pelo
bloqueio do ciclo celular das células neoplásicas (ARGAEZ-BORGES et al., 2007).
A atividade citotóxica dos flavonoides tem sido demonstrada em muitos
trabalhos. SONODA et al. (2004) testaram dezessete flavonoides em leucemia
humana (HL60), dentre eles, dez inibiram a proliferação das células leucêmicas in
vitro . O composto 2’,3’,5,7 – tetrahidroxiflavona apresentou maior atividade (CI50de
9,5 μM) seguido por apigenina, viscidulina III (5,2’,6’-trihidroxi-7,8-dimetoxiflavona),
wogonina (5,7-dihidroxi-8-metoxiflavona) e luteolina . GÁLVEZ et al. (2003)
mostraram a atividade citotóxica da luteolina também em melanoma com CI50 de 10
μg/ml.
Dois flavonoides isolados da Amburana cearensis, o isocampferídeo (3-
metoxi-5,7,4’-trihidroxiflavona) e o caempferol (3,5,7,4’-tetrahidroxiflavona)
apresentaram atividade citotóxica em diferentes linhagens de células tumorais com
CI50 variando de 2,6 a 5,5 μg/mL e 11,5 a 22,7μg/mL, respectivamente. A única
diferença na estrutura desses compostos é a presença da metoxila no carbono 3 do
anel C, no lugar de uma hidroxila, demonstrando que a metoxila aumenta a atividade
citotóxica (COSTA-LOTUFO et al., 2003).
Estudos de avaliação da atividade antitumoral do extrato de A. chica
demonstrou que o extrato etanólico-EE a 50μg/mL apresentou potente atividade
citotóxica contra células Jurkat e HL60. Este contém o flavonóide canferol, ao qual
somado a outras substâncias atribui-se a atividade observada. (DE CARVALHO
RIBEIRO, 2012).
O extrato hidroetanólico de Salvia officinalis L. (1:10), nas concentrações 0,35
a 2mg/mL reduziu significativamente a viabilidade das células Hep-2 e HepG2. Onde
observou-se que as células Hep-2 foram mais sensíveis ao extrato, enquanto as
células HepG2 apresentaram menor sensibilidade (GARCIA et al. 2012).
67
7 CONCLUSÃO
O método por cromatografia líquida de alta eficiência, desenvolvido e
validado, permitiu a detecção dos flavonoides: canferol e luteolina, tanto no extrato
bruto, como no extrato liofilizado, demontrando que a forma de secagem não
interferiu na composição do extrato.
A partir dos parâmetros avaliados na validação, o método mostrou-se linear,
preciso, exato e robusto, não tendo as variações propostas, alterado
significativamente os valores obtidos a partir do método proposto;
Mediante a análise de LC-MS, ambos os flavonoides: canferol e luteolina,
foram identificados.
A partir dos resultados obtidos no teste de citotoxicidade, o extrato
hidroetanólico (bruto e liofilizado) das folhas de A. chica reduziu o número de células
hepatocarcinogênicas HepG2 em cultura após 48 horas de tratamento, promovendo
a citotoxicidade das células tumorais. No ensaio utilizando as células normais Mrc5,
apenas o extrato liofilizado apresentou redução do número de células, após 48 horas
de tratamento, demonstrando a importância de uma investigação preliminar dos
extratos de plantas utilizadas na medicina popular, bem como a dose e a forma com
que estes extratos são utilizados pela população necessitam de investigações
cientificas, sendo imprescindível a estimulação destes estudos. Os resultados
apontam que o extrato liofilizado apresenta maior atividade citotóxica que o extrato
bruto, ainda que ambos apresentem os marcadores químicos canferol e luteolina,
possíveis responsáveis dessa ação, demonstrando que a liofilização preserva, de
um modo geral, os constituintes químicos termolábeis, conferindo maior estabilidade
comparativamente ao extrato bruto. Esse extrato apresenta um grande potencial
como recurso farmacológico para o desenvolvimento de novos fármacos com
atividade antitumoral. A avaliação do tipo de morte envolvido nesse processo bem
como a avaliação da genotoxicidade também se fazem necessários para uma
melhor elucidação da atividade biológica do extrato hidroetanólico de A. chica.
68
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