Clarificação e estabilização proteica de vinhos por

Ultrafiltração

Mariana Andreia Rodrigues de Sousa

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Engenharia Química

Orientadores: Professora Doutora Maria Norberta Neves Correia de Pinho (Professora Catedrática Jubilada, IST)

Professora Doutora Sofia Cristina Gomes Catarino (Professora Auxiliar Convidada, ISA)

Júri

Presidente: Professor Doutor Sebastião Manuel Tavares da Silva Alves (Professor Associado com Agregação, IST)

Orientador: Professora Doutora Sofia Cristina Gomes Catarino (Professora Auxiliar Convidada, ISA)

Vogal: Professor Doutor Vítor Manuel Delgado Alves (Professor Auxiliar, ISA)

Novembro 2017

i

Notas do autor

1 – O autor da presente dissertação não escreve segundo o novo Acordo Ortográfico;

2 – Todas as traduções foram feitas pelo autor;

3 – Todas as fotografias presentes na dissertação foram tiradas pelo autor;

4 – Todas as figuras não referenciadas foram desenhadas pelo autor com o suporte do programa Visio

2013.

5 – O trabalho experimental apresentado na presente dissertação foi desenvolvido nos seguintes

laboratórios: Laboratório de Membranas do Instituto Superior Técnico, Lisboa (ensaios de ultrafiltração)

e Laboratório Ferreira-Lapa do Instituto Superior de agronomia de Lisboa (caracterização físico-química

dos vinhos e fracções de ultrafiltração).

iii

Agradecimentos

Em primeiro lugar, agradeço à Professora Doutora Maria Norberta de Pinho e à Professora Doutora

Sofia Catarino um especial agradecimento pela proposta e orientação, dedicação, disponibilidade,

preocupação e rigor exigido durante todo este período e, especialmente, pela confiança que

depositaram no meu trabalho.

Ao Professor Doutor Pedro Fernandes pelo auxílio na aplicação do método de Bradford, cedência

do equipamento e materiais necessários, por toda a disponibilidade demonstrada e esclarecimento de

dúvidas.

Ao Laboratório de Águas do Instituto Superior Técnico, por me ter disponibilizado as condições

necessárias de armazenamento dos vinhos brancos.

Aos meus pais, por todo o apoio e motivação, que se tornaram imprescindíveis na concretização

desta etapa. Agradeço também aos meus irmãos, pelos conselhos e sugestões.

Ao Fábio, por estar sempre presente e disponível para me ouvir, pela motivação, por todo o apoio e

por me ter proporcionado os momentos de distracção necassários.

À minha amiga, Catarina Domingos, pelos desabafos, pela partilha de sugestões e trocas de ideias,

pelo apoio e pela presença. À Daniela, pelas tardes passadas em conjunto na biblioteca a trabalhar,

pelo apoio mútuo lado-a-lado.

Á Catarina Andrade, à Beatriz e à Patrícia pela amizade, pela presença, pela companhia. À Rita, à

Ana e à Joana, pela preocupação, pelas dicas e sobretudo pela grande amizade e apoio.

Por último, mas não menos importante, à Cíntia, por toda a ajuda e disponibilidade demonstrada,

apoio e partilha de conhecimento durante o período de trabalho no Laboratório de Membranas.

Agradeço também à Diana e ao Daniel pela excelente recepção, por toda a ajuda e motivação, pela

boa disposição e bom ambiente de trabalho que me proporcionaram durante o período de trabalho no

Laboratório Ferreira-Lapa.

v

Resumo

O objectivo principal do presente trabalho consistiu na avaliação da influência da ultrafiltração (UF) na

clarificação e estabilização proteica de vinhos brancos. Para tal, foram processados por UF dois vinhos

brancos monvarietais (Vitis Vinifera L., castas Viosinho e Moscatel Graúdo) e um vinho de lote de três

castas (Viosinho 75,0% v/v; Alvarinho 12,5% v/v; Arinto 12,5% v/v), originários da vindima de 2016.

A operação de UF foi realizada na instalação Celfa P-28, com uma membrana comercial de fluoro

polímero, FS61PP, da AlfaLaval, de área superficial de 25,25 cm2. A caracterização da membrana foi

efectuada por determinação da permeabilidade hidráulica de 44 kg/(h m2 bar) e do limite de exclusão

molecular de 45 kDa. Os ensaios de UF dos vinhos brancos decorreram à pressão transmembranar de

1,2 bar, à velocidade de recirculação de 0,79 L/min e à temperatura de 24 ºC.

As fracções de UF foram avaliadas em termos de estabilidade proteica, composição físico-química,

teor em proteínas totais, polissacáridos totais, índice de fenóis totais e turbidez.

O teor em proteínas totais dos vinhos Viosinho, Lote e Moscatel Graúdo era de 54,9; 119,2 e

82,3 mg/L, respectivamente. Após UF, a concentração obtida de proteínas totais dos vinhos estudados

foi, em média, de 5 g/L. Apesar disso, a estabilidade proteica das correntes de permeado, avaliada por

testes térmicos, não foi alcançada, sugerindo que as proteínas de baixa massa molecular são

responsáveis pela turvação dos vinhos.

Como esperado, verificou-se uma remoção significativa dos polissacáridos totais. Em relação ao

índice de fenóis totais, observou-se uma redução deste parâmetro em cerca de 10 %. A clarificação

dos vinhos foi conseguida por UF, promovendo a redução da turbidez de 467 (Viosinho), 17 (Lote) e

4,7 NTU (Moscatel Graúdo) para valores próximos de 2 NTU.

Palavras-chave: vinho branco, instabilidade proteica, ultrafiltração, turbidez.

vii

Abstract

The main objective of this work was to evaluate the influence of ultrafiltration (UF) on the clarification

and protein stabilization of white wines. Two monovariety wines (Vitis Vinifera L., Viosinho and Moscatel

Graúdo varieties) and a wine produced from of three grape varieties (75.0% v/v of Viosinho, 12.5% v/v

of Alvarinho, 12.5% v/v of Arinto), originated in 2016 harvest, were processed by UF.

The UF operation was performed in a Celfa P-28 instalation with a fluoro polymer UF membrane,

FS61PP, from AlfaLaval, with a surface area of 25.25 cm2. The membrane was characterized by

hydraulic permeability of 44 kg/(bar h m2) and the molecular weight cut-off of 45 kDa. The white wines

UF assays were performed at a transmembrane pressure of 1.2 bar, recirculation rate of 0.79 L/min at

24 ºC.

UF fractions were evaluated in terms of protein stability, physical-chemical composition, total proteins

content, total polysaccharides, total phenols index and turbidity.

Total protein content of Viosinho, Lote and Moscatel Graúdo wines was initially 54.9, 119.2 and

82.3 mg/L, respectively. After UF, the total protein concentration of wines was about 5 g/L. In spite of

that, protein stability, evaluated in permeate UF stream by applying two thermal stability tests, was not

achieved, suggesting that probably proteins of low molecular weight are responsible for protein haze.

As expected, significant removal of polysaccharides from the wines werw observed. In respect to

total phenols index, decreases close to 10% were verified. Clarification of wines was achieved by UF,

resulting in turbidity decreases from 46 (Viosinho), 17 (Lote) and 4.7 NTU (Moscatel Graúdo) to values

close to 2 NTU.

Key-words: white wine, protein instability, ultrafiltration, protein haze.

ix

Índice

Notas do autor ...................................................................................................................... i

Agradecimentos ..................................................................................................................iii

Resumo ................................................................................................................................ v

Abstract ..............................................................................................................................vii

Índice de Tabelas ................................................................................................................xi

Índice de Figuras ................................................................................................................xii

Abreviaturas ...................................................................................................................... xiii

I. Introdução ................................................................................................................. 1

1. Processos de separação com membranas ................................................................. 2

1.1. Modo de funcionamento dos processos de separação com membranas ........................... 3

1.2. Modos de operação dos processos de separação com membranas .................................. 4

1.3. Tipos de processos de separação com membranas........................................................... 4

1.4. Tipos de membranas ........................................................................................................... 6

1.5. Tipos de módulos de membranas ....................................................................................... 6

1.6. Modelos de transferência de massa em Ultrafiltração ........................................................ 8

II. Revisão Bibliográfica e Enquadramento ................................................................11

1. Composição físico-química do vinho ..........................................................................11

1.1. Ácidos orgânicos ............................................................................................................... 12

1.2. Composição azotada ......................................................................................................... 13

1.3. Polissacáridos .................................................................................................................... 15

1.4. Composição fenólica ......................................................................................................... 16

2. Estabilidade proteica de vinhos .................................................................................17

2.1. Factores que influenciam a estabilidade proteica ............................................................. 17

2.2. Avaliação da estabilidade proteica .................................................................................... 20

2.3. Tratamentos usados na estabilização proteica do vinho .................................................. 21

3. Enquadramento do tema e objectivos da dissertação ................................................25

3.1. Objectivos .......................................................................................................................... 26

III. Materiais e Métodos.................................................................................................27

1. Vinhos .......................................................................................................................27

1.1. Testes aplicados para verificação da estabilidade proteica dos vinhos ............................ 27

1.2. Caracterização físico-química geral .................................................................................. 28

2. Instalação de Ultrafiltração ........................................................................................30

x

2.1. Procedimento de funcionamento da instalação ................................................................ 32

3. Membrana .................................................................................................................32

3.1. Lavagem da membrana ..................................................................................................... 33

3.2. Compactação da membrana ............................................................................................. 33

3.3. Caracterização da membrana ........................................................................................... 33

4. Ensaios de Ultrafiltração do vinho ..............................................................................35

5. Caracterização das fracções de Ultrafiltração ............................................................37

5.1. Teor em proteínas totais .................................................................................................... 37

5.2. Índice de fenóis totais ........................................................................................................ 38

6. Análise estatística ......................................................................................................38

IV. Resultados e Discussão ..........................................................................................39

1. Caracterização da membrana de ultrafiltração ...........................................................39

1.1. Permeabilidade hidráulica ................................................................................................. 39

1.2. Rejeição a solutos de referência e determinação do limite de exclusão molecular .......... 39

2. Selecção dos vinhos brancos para os ensaios de ultrafiltração .................................40

3. Caracterização físico-química geral dos vinhos brancos ............................................42

3.1. Turbidez ............................................................................................................................. 42

3.2. Teor em Polissacáridos Totais .......................................................................................... 43

4. Ensaios de Ultrafiltração ............................................................................................43

4.1. Selecção dos parâmetros de operação ............................................................................. 43

4.2. Fluxos de permeação dos vinhos brancos ........................................................................ 44

4.3. Estabilidade proteica das fracções de ultrafiltração dos vinhos brancos .......................... 44

4.4. Caracterização físico-química geral das fracções de ultrafiltração dos vinhos e influência

do processo nesses parâmetros ................................................................................................... 46

4.5. Remoção das macromoléculas ......................................................................................... 54

V. Conclusões e perspectivas de trabalho futuro ......................................................57

VI. Referências Bibliográficas ......................................................................................59

VII. Anexos .....................................................................................................................69

xi

Índice de Tabelas

Tabela 1: Capacidade de remoção de diferentes componentes das membranas de Osmose Inversa,

Nanofiltração, Ultrafiltração e Microfiltração. ........................................................................................... 5

Tabela 2: Características das membranas de Microfiltração, Ultrafiltração, Nanofiltração e Osmose

Inversa. .................................................................................................................................................... 5

Tabela 3: Características dos diferentes tipos de módulos de membranas. .......................................... 7

Tabela 4: Principais constituintes do vinho. .......................................................................................... 11

Tabela 5: Determinação de proteínas totais pelo método de Bradford: substâncias interferentes. ..... 14

Tabela 6: Características dos solutos de referência usados na determinação do MWCO. ................. 34

Tabela 7: Rejeição aparente dos solutos de referência PEG (10, 20 e 35 kDa). ................................. 39

Tabela 8: Estabilidade proteica dos vinhos: teste térmico com adição de taninos e avaliação da

absorvância. .......................................................................................................................................... 41

Tabela 9: Estabilidade proteica dos vinhos: teste térmico com avaliação da turbidez. ........................ 41

Tabela 10: Características físico-químicas dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF. ........... 42

Tabela 11: Turbidez dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF. .............................................. 42

Tabela 12: Teor em polissacáridos totais dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF. ............. 43

Tabela 13: Fluxos de permeação dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF à pressão

transmembranar de 1,2 bar e à velocidade de recirculação de 0,79 L/min. ......................................... 44

Tabela 14: Estabilidade proteica das fracções de UF: teste térmico com avaliação da turbidez, teste

térmico com adição de taninos e avaliação da absorvância. ................................................................ 45

Tabela 15: Caracterização geral das fracções de UF. .......................................................................... 48

Tabela 16: Remoção das macromoléculas após ensaios de ultrafiltração à pressão transmembranar

de 1,2 bar e à velocidade de recirculação de 0,79 L/min. ..................................................................... 54

Tabela 17: Características da membrana de UF, FS61PP (AlfaLaval)…………….…………………….A1

Tabela 18: Informações adicionais sobre a vinificação dos vinhos brancos…………………………….B1

Tabela 19: Determinação do volume morto da instalação Celfa P-28: ensaio de UF em modo recirculação total da solução de NaCl 300 ppm à pressão transmembranar de 0,5 bar e velocidade de recirculação de 0,79 L/min…………………………………………………………………………………….D1

Tabela 20: Condições experimentais obtidas na determinação do MWCO da membrana. Ensaio realizado à pressão transmembranar de 0,5 bar e à velocidade de recirculação de 0,79 L/min………E1

Tabela 21: Determinação do TOC para os solutos de referência PEG 10000, 20000 e 35000……….E1

Tabela 22: Estabilidade proteica das fracções de UF: teste térmico com avaliação da turbidez………F1

Tabela 23: Estabilidade proteica das fracções de UF: teste térmico com adição de taninos e avaliação da absorvância………………………………………………………………………………………………….F1

Tabela 24: Leitura da Turbidez das fracções de UF…………………………………………………………G1

Tabela 25: Teor de Proteínas Totais das fracções de UF…………………………………………………..G1

Tabela 26: Teor de Polissacáridos Totais das fracções de UF…………………………………………….G1

Tabela 27: Índice de Fenóis Totais das fracções de UF…………………………………………………….G1

Tabela 28: Análise estatística: p-values para os parâmetros da caracterização físico-química dos vinhos usados nos ensaios de UF…………………………………………………………………………………….H1

xii

Índice de Figuras Figura 1: Representação esquemática dos modos de funcionamento dos processos de separação

com membranas: filtração convencional (à esquerda) e filtração tangencial (à direita). ........................ 3

Figura 2: Principais modos de operação dos processos de separação com membranas: Recirculação

total (à esquerda) e Concentração (à direita).......................................................................................... 4

Figura 3: Esquema dos diferentes tipos de membranas, segundo a sua estrutura................................ 6

Figura 4: Esquema de um módulo tubular. ............................................................................................. 8

Figura 5: Esquema de um módulo enrolado em espiral. ........................................................................ 8

Figura 6: Esquema de um módulo de pratos planos. ............................................................................. 8

Figura 7: Esquema de um módulo de fibras ocas ................................................................................... 8

Figura 8: Representação esquemática do perfil de concentrações na fase líquida adjacente à

membrana em estado estacionário. ........................................................................................................ 8

Figura 9: Instalação Celfa P-28. ............................................................................................................ 31

Figura 10: Procedimento dos ensaios de UF dos vinhos brancos. ....................................................... 36

Figura 11: Representação do fluxo de água desionizada permeada (Jp) em função da pressão (ΔP).

............................................................................................................................................................... 39

Figura 12: Determinação do limite de exclusão molecular (MWCO) da membrana FS61PP. ............. 40

Figura 13: Vinhos brancos seleccionados para os ensaios de UF. ...................................................... 42

Figura 14: Fluxos de permeação em função da pressão transmembranar para o vinho branco. ........ 44

Figura 15: Turbidez das fracções de UF para os vinhos brancos......................................................... 50

Figura 16: Gradação de cor das fracções de UF recolhidas do vinho Viosinho. .................................. 51

Figura 17: Teor em Proteínas Totais nas fracções de UF de cada vinho. ............................................ 51

Figura 18:Teor em Polissacáridos Totais nas fracções de UF de cada vinho. ..................................... 52

Figura 19: Índice de Fenóis Totais nas fracções de UF de cada vinho. ............................................... 53

Figura 20: Recta de calibração do PEG 10000……………………………………………………….……..C1

Figura 21: Recta de calibração do PEG 20000……………………………………………………….……..C1

Figura 22: Recta de calibração do PEG 35000……………………………………………………….……..C2

Figura 23: Curva de calibração da BSA - gama de altas concentrações…………………………..……..C2

Figuta 24: Curva de calibração da BSA - gama de baixas concentrações…………………………..……C2

Figura 25: Recta de calibração da Glucose………………………………………………………………….C3

Figura 26: Recta de calibração do NaCl……………………………………………………………………...D1

xiii

Abreviaturas

A – absorvância

AG – arabinogalactana

AGP – arabinogalactanoproteína

AI – alimentação inicial

ATC – ácido tricloroacético

BSA – albumina de soro bovina

C – Concentrado

CAa – concentração do soluto A na alimentação

CAp – concentração do soluto A no permeado

fA – rejeição aparente do soluto A

FTIR – espectrofotometria de Infravermelhos com Transformada de Fourier

IFT – índice de fenóis totais

ISA – Instituto Superior de Agronomia

JP – fluxo de permeação

k – coeficiente de transferência de massa

LP – permeabilidade hidráulica

MF – microfiltração

MM – massa molecular

MP – manoproteínas

MWCO – limite de exclusão molecular

NF – nanofiltração

OI – osmose inversa

OIV – Organização Internacional da Vinha e do Vinho

P – permeado

pI – ponto isoeléctrico

PR – relacionadas com o ataque de agentes patogénicos (do inglês, Pathogenesis-related)

PVPP – polivinilpolipirrolidona

Ra – resistência devida a fenómenos de adsorção

RG – ramnogalacturonanas

Rg – resistência devida à formação do gel

Rm – resistência intrínseca da membrana

Rpc – resistência devida à camada de polarização de concentração

TLP – proteínas do tipo da taumatina (do inglês, Thaumatin-like Proteins)

TOC – carbono orgânico total

u.a. – unidades de absorvância

UF – ultrafiltração

UV – ultravioleta

δ – espessura da camada sub-laminar

ΔP – pressão transmembranar

1

I. Introdução

A limpidez (ou translucência) é uma característica vital muito importante na qualidade do vinho, pois

esta propriedade é responsável por uma das primeiras impressões do consumidor. É necessário que o

vinho se mantenha clarificado e estabilizado após o processo de vinificação.

As proteínas no mosto são uma causa conhecida de instabilidade, afectando a limpidez dos vinhos

brancos. Este fenómeno de instabilidade físico-química é denominado de casse proteica, que é um

defeito comum de natureza não-microbiana que pode ocorrer nos vinhos devido a condições de

armazenamento desfavoráveis (Bayly e Berg, 1967; Hsu e Heatherbell, 1987a; Waters et al., 1992), e

que conduz a uma diminuição do valor comercial do vinho.

A instabilidade proteica do vinho branco é uma questão que tem vindo a ser estudada. A solução

para este problema requer a aplicação de um processo que não só seja suficientemente específico,

como também não altere significativamente as características físico-químicas e sensoriais do vinho, o

que implica um melhor conhecimento e uma melhor compreensão dos mecanismos que conduzem à

turvação e precipitação nos vinhos.

De acordo com a literatura, as proteínas existentes no vinho surgem em concentrações que podem

variar entre 15 a 230 mg/L. Estas macromoléculas integram a fracção coloidal dos vinhos, podendo,

em determinadas condições, afectar a limpidez e estabilidade do vinho. Sob condições de

armazenamento desfavoráveis e após engarrafamento, pode ocorrer a desnaturação lenta das

proteínas instáveis, que leva à sua agregação, floculação e precipitação (Bayly e Berg, 1967; Hsu e

Heatherbell, 1987c; Waters et al., 1991, 1992). A turvação não afecta as características olfactivas nem

gustativas do vinho, no entanto a limpidez é uma característica vital para a qualidade de qualquer vinho

branco uma vez que esta propriedade traduz a primeira impressão do consumidor, que tende a rejeitar

um vinho que se apresente turvo ou contenha precipitados. A concentração de proteínas no vinho, bem

como a composição das diferentes fracções proteicas que o constituem, depende de factores como

casta, condições climáticas, estado de maturação das uvas e processo de vinificação (Pashova et al.,

2004; Sauvage et al., 2010).

As principais proteínas responsáveis pelo fenómeno de instabilidade proteica são provenientes das

uvas e foram identificadas como proteínas relacionadas com o ataque de agentes patogénicos, uma

vez que são sintetizadas durante a maturação das uvas como mecanismo de defesa de infecções por

agentes patogénicos (Waters et al., 2005). Incluem-se neste grupo as proteínas do tipo taumatina e as

quitinases (Waters el al., 1996, 1998), atingindo concentrações no vinho que podem chegar a várias

centenas de mg/L (Pocock et al., 1998). Diversos factores são conhecidos por afectar a estabilidade

proteica dos vinhos, nomeadamente o teor de proteínas, a sua natureza, a diferença entre o pH do

vinho e o ponto isoeléctrico das proteínas, o pH do vinho e a presença de alguns compostos do vinho

de natureza não proteica, como por exemplo os taninos (Koch e Sajak, 1959; Moretti e Berg, 1965;

Krug, 1968).

A avaliação da estabilidade proteica de um vinho é feita recorrendo a ensaios laboratoriais e a testes

de estabilidade. Os mais utilizados são o teste térmico (Berg e Akiyoshi, 1961; Pocock e Rankine,

1973), o teste do ácido tricloroacético (Berg e Akiyoshi, 1961, Boulton, 1980), o bentotest (Rankine e

Pocock, 1971), o teste do etanol (Boulton, 1980) e o teste térmico com adição de tanino (Mesrob et al.,

2

1983). Porém, todos os testes acima referidos produzem precipitados muito diferentes do precipitado

natural produzido pelo próprio vinho, e por esta razão estes testes permitem apenas a previsão do

fenómeno de instabilidade proteica, não constituindo uma reprodução perfeita do mesmo.

A instabilidade proteica é actualmente prevenida principalmente por remoção das proteínas usando

agentes de colagem, que ao serem introduzidos no vinho, adsorvem e precipitam as partículas

responsáveis pela turbidez. A adição de bentonite é o processo mais usado na prevenção da

instabilidade proteica nos vinhos brancos, no entanto a colagem com bentonite sob determinadas

condições pode afectar a qualidade do vinho, como remoção de macromoléculas e compostos voláteis

(Waters et al., 1996; Høj et al., 2000), podendo alterar as características sensoriais do vinho. Além

disto, a colagem com bentonite conduz à perda de cerca de 3 – 10 % de volume de vinho, que é

removido juntamente com as borras de bentonite no final da colagem (Tattersall et al., 2001). Um outro

grande desafio no processo de vinificação quando é utilizada colagem com bentonite é a sua

regeneração. Esta regeneração refere-se à dessorção das proteínas adsorvidas da superfície deste

agente de colagem, que permitiria a sua reutilização. Actualmente, não existe qualquer processo

comercial de regeneração da bentonite e por este motivo é utilizada apenas uma vez antes de ser

descartada (Waters et al., 2005), constituindo uma fonte de desperdício.

Atendendo às dificuldades acima apresentadas, têm sido estudadas técnicas alternativas à

utilização da bentonite, tais como: ultrafiltração (Hsu et al., 1987b; Flores et al., 1990), adição de

enzimas proteolíticas (Feuillat et al., 1982; Waters et al., 1992; Dizy e Bisson, 1999), pasteurização

(Francis et al., 1994; Pocock et al., 2003), utilização de adsorventes alternativos como, por exemplo,

óxidos de zircónio (Pashova et al., 2004; Salazar et al., 2006; Salazar et al., 2010), resinas de troca

iónia, gel de sílica, hidroxipatite, alumínio (Sarmento et al. 2000b), quitina (Vincenzi et al., 2005),

zeólitos naturais (Mercurio, et al., 2010) e aplicação de colóides protectores como, por exemplo, as

manoproteínas (Waters et al., 1993; Waters et al., 1994a; Gonzales-Ramos et al., 2008).

A ultrafiltração tem sido estudada para separação e purificação de macromoléculas em vinhos e

sumos. Este processo constitui uma solução promissora para o problema de instabilidade proteica de

vinhos, permitindo a remoção de macromoléculas, nomeadamente proteínas responsáveis pela

turvação.

1. Processos de separação com membranas

Recentemente, as técnicas de separação de massa, como a destilação, cristalização, extracção com

solventes, etc., têm sido substituídas por uma classe de processos que utiliza membranas

semipermeáveis como o elemento essencial para a separação de misturas particuladas ou

moleculares. Embora os processos de separação com membranas sejam muito diferentes no seu modo

de operação e na sua aplicação dos processos e técnicas convencionais, apresentam bastantes

factores que os tornam particularmente atractivos. Com a utilização de membranas, a separação

usualmente é realizada à temperatura ambiente, permitindo que soluções sensíveis à temperatura

possam ser tratadas sem que os seus constituintes fiquem danificados ou sejam quimicamente

alterados. Isto toma uma elevada importância nas indústrias farmacêutica e alimentar, uma vez que

frequentemente utilizam produtos sensíveis à temperatura. Além desta vantagem, os processos de

3

separação com membranas apresentam outras vantagens quando comparados com os processos de

separação convencionais como: um inferior consumo energético; a retenção do sabor é assegurada,

uma vez que a operação não precisa de ser efectuada a temperaturas elevadas; não requer aditivos e

os custos de capital são inferiores. A desvantagem da utilização destes processos passa pela

ocorrência de fenómenos como a polarização de concentração e a colmatação das membranas, que

ocorrem mais acentuadamente quando se opera com elevados fluxos de permeação e alimentações

complexas.

A membrana define-se como sendo uma interface que separa duas fases e restringe o transporte

de várias espécies químicas de uma forma específica, isto é, a membrana actua como uma barreira

selectiva à transferência de massa entre duas fases homogéneas, não permitindo a permeação de um

ou mais solutos, separando-os assim da solução. A capacidade da membrana em transportar

determinado componente em detrimento de outro deve-se às diferenças físicas e/ou químicas entre a

membrana e os componentes a permear. O transporte através da membrana ocorre como resultado da

actuação individual de determinada força motriz nos componentes da alimentação.

Os processos de separação com membranas distinguem-se pelo tipo de membrana (biológica ou

sintética) e pela força motriz responsável pelo transporte de massa. Estes incluem processos como

osmose inversa (OI), microfiltração (MF), ultrafiltração (UF) e nanofiltração (NF), cuja força motriz é um

gradiente de pressão; diálise e pervaporação, onde a força motriz é um gradiente de concentração;

electrodiálise, que ocorre por acção de um campo eléctrico (Pinho et al., 2012).

1.1. Modo de funcionamento dos processos de separação com membranas

Nos processos de separação convencionais estáticos, como é o caso da filtração, a alimentação circula

perpendicularmente à membrana, que leva à formação de uma camada sob a superfície da mesma –

o bolo filtrante. A espessura da camada aumentará à medida que a operação decorre e,

consequentemente aumentará a resistência à filtração, o que poderá levar à adsorção de compostos

pelo bolo filtrante. Por esta razão, este método de separação é geralmente operado em descontínuo.

Num processo de membranas, também conhecido como filtração tangencial, a alimentação

constituída por uma mistura de dois ou mais componentes circula tangencialmente à membrana sendo

dividida em duas correntes: o concentrado e o permeado. O concentrado corresponde à fracção

rejeitada pela mesma e o permeado corresponde à fracção da alimentação que permeia

preferencialmente através da membrana. Na filtração tangencial os parâmetros de operação mais

importantes são a pressão transmembranar e a velocidade de circulação.

Na Figura 1 estão representados esquematicamente os dois modos de funcionamento acima

mencionados.

Membrana

Alimentação

Concentrado

Permeado

Permeado

Alimentação

Membrana

Figura 1: Representação esquemática dos modos de funcionamento dos processos de separação com membranas: filtração convencional (à esquerda) e filtração tangencial (à direita).

4

1.2. Modos de operação dos processos de separação com membranas

Existem diferentes modos de operação dos processos de separação com membranas, mas neste

subcapítulo irão referir-se os dois que mais interesse apresentam para o presente trabalho: o modo de

recirculação total e o modo de concentração. O modo de recirculação total consiste na recirculação do

concentrado e do permeado ao tanque de alimentação, não existindo alteração da composição de

alimentação. O modo de concentração consiste na recirculação do concentrado ao tanque de

alimentação, conduzindo à concentração da alimentação, e na recolha continuada do permeado.

Na Figura 2 estão representados esquematicamente os modos de operação descritos.

Figura 2: Principais modos de operação dos processos de separação com membranas: Recirculação total (à

esquerda) e Concentração (à direita).

1.3. Tipos de processos de separação com membranas

Os processos de separação com membranas distinguem-se não só pelo tipo de membranas como

também pela força motriz responsável pela transferência de massa.

A MF, a UF e a OI diferem principalmente na dimensão das partículas ou das moléculas dissolvidas.

A MF é usada para recuperar partículas de dimensões entre 0,1 – 20 μm de solventes que podem

conter solutos dissolvidos como sais ou proteínas e as suas principais aplicações incluem a

recuperação de células animais, leveduras, bactérias e fungos. A UF é usada para separar

macromoléculas, como as proteínas, amidos ou ADN, de solutos de pequenas dimensões tais como

sais, açúcares, amino ácidos, surfactantes e água. Os mecanismos de transporte que actuam

geralmente nas membranas de UF são a exclusão molecular, “efeito de peneiro” e a difusão. No

entanto, verifica-se que para muitos casos, estes mecanismos não são os únicos a actuar, tendo a

natureza da corrente de alimentação um papel muito importante, uma vez que a presença de material

coloidal ou que pode ser adsorvido pela membrana conduz a fenómenos de colmatação e adsorção,

alterando os mecanismos das operações de UF (Minhalma, 2001).

Na Tabela 1 estão apresentadas as capacidades de remoção de componentes para os processos

de separação. Verifica-se que as proteínas podem ser removidas por dois processos: NF e UF.

Na Tabela 2 apresentam-se as características das membranas utilizadas em cada processo de

separação com membranas.

As operações de UF e NF apresentam vantagens como: baixos consumos energéticos, não

necessitam de adição de químicos, permitem o dimensionamento a diferentes escalas, operam em

contínuo e descontínuo e apresentam grande diversidade de equipamentos (Minhalma, 2001).

5

Tabela 1: Capacidade de remoção de diferentes componentes das membranas de Osmose Inversa,

Nanofiltração, Ultrafiltração e Microfiltração. Fonte: Minhalma (2001).

Processo de separação

Tamanho das partículas (μm)

Tabela 2: Características das membranas de Microfiltração, Ultrafiltração, Nanofiltração e Osmose Inversa. Fonte: Pinho et al. (2012)

MF UF NF OI

Raio do poro (nm) 100 – 104 1 – 100 0,5 – 5 –

MWCO (Da) Muito elevado 1000 – 106 100 – 1000 10 – 100

Pressão transmembranar (bar)

0,1 – 1 0,5 – 10 10 – 40 40 – 100

Mecanismo de transporte

Exclusão por tamanho de partículas

Exclusão molecular /

Difusão

Exclusão molecular / Difusão /

Interacções electrostáticas

Difusão

Aplicações Remoção de

bactérias Clarificação

Esterilização Separação de

macromoléculas

Separação de sais polivalentes

e pequenos solutos

Separação de sais e

microsolutos

Para além dos processos de separação com membranas que utilizam o gradiente de pressão como

força motriz, existem outros processos como a pervaporação e a electrodiálise. A pervaporação

consiste num processo em que a mistura líquida se encontra em contacto com a membrana, sendo o

permeado obtido no estado gasoso. Este processo tem tido pouca aplicação na indústria vitivinícola,

sendo usado na recuperação de aromas do vinho ou mosto em fermentação (Gonçalves, 2002). A

electrodiálise é um processo onde se utilizam membranas com cargas eléctricas de forma a separar

iões sob a acção de um campo eléctrico. As membranas são carregadas positivamente ou

negativamente, sendo permeáveis a aniões ou catiões, respectivamente. Na indústria alimentar, a

electrodiálise tem sido utilizada para desmineralizar sumos de frutos e soro de queijo (Gonçalves,

2002).

Ultrafiltração

Nanofiltração

Osmose

inversa

Microfiltração

10-4 10-3 10-2 10

Colóides

Emulsão de óleos

Bactérias

Pigmentos

Vírus

Proteínas

Sais

Antibióticos

1

6

1.4. Tipos de membranas

Dependendo dos diferentes materiais e diferentes estruturas, as membranas podem ter diferentes

características que as tornam adequadas a diversos objectivos. Os materiais usados no fabrico de

membranas englobam produtos inorgânicos (vidros porosos, grafite, porcelanas e óxidos metálicos),

polímeros de origem natural (diacetato e triacetato de celulose, propionato-acetato de celulose, butirato-

acetato de celulose e metacrilato-acetato de celulose) e polímeros sintéticos (poliamida, poliacrilonitrilo,

polissulfona, polipropileno). As diferentes estruturas das membranas permite o seu agrupamento em:

membranas densas homogéneas, membranas assimétricas integrais, membranas assimétricas

compostas e membranas microporosas. Na Figura 3 apresenta-se uma representação dos tipos de

membranas mencionados.

Figura 3: Esquema dos diferentes tipos de membranas, segundo a sua estrutura.

Fonte: Membrane Technology and Applications (2004)

As membranas densas são constituídas por um filme denso do material polimérico que as constitui e

as suas aplicações mais comuns são a permeação gasosa, a pervaporação e a electrodiálise. As

membranas microporosas apresentam uma estrutura rígida, constituída por poros interligados

distribuídos aleatoriamente e são utilizadas essencialmente em MF. As membranas assimétricas

integrais apresentam uma estrutura porosa que vai desde uma camada activa muito densa até uma

camada suporte menos densa e são usadas sobretudo nos processos de separação conduzidos por

pressão de correntes líquidas, como a UF, NF e OI. As membranas assimétricas compostas são

constituídas por duas camadas (uma densa e uma porosa) de materiais diferentes e são

essencialmente utilizadas em UF, NF e OI (Minhalma, 2001; Baker, 2004).

1.5. Tipos de módulos de membranas

O uso de módulos de membranas surge industrialmente com a necessidade de obter grandes áreas de

membrana por unidade de volume. O módulo é constituído por um invólucro, suportes para as

membranas e por um conjunto de condutas que asseguram a distribuição da alimentação e a recolha

do permeado. A utilização de módulos de membranas torna a operação de separação extremamente

versátil, uma vez que permite o arranjo dos módulos em paralelo ou em série, aumentando ou

diminuindo a área total da membrana, e permite também, a substituição de um determinado módulo e

7

não de toda a instalação de permeação, durante a manutenção. Os módulos de membranas são

classificados quanto ao tipo de configuração: tubulares, de pratos planos, enrolados em espiral e de

fibras ocas. Na Tabela 3 apresentam-se as características destes módulos.

Tabela 3: Características dos diferentes tipos de módulos de membranas. Fonte: Pinho et al. (2012).

Tipo de módulo Tubular Pratos planos Enrolados em espiral

Fibras ocas

Compactação (m2/m3) 20 – 30 400 – 600 800 – 1000 600 – 1200

Preço Muito elevado Elevado Baixo Muito baixo

Facilidade de limpeza Excelente Boa Boa Má

Controlo da transferência de massa adjacente à membrana

Muito bom Razoável Razoável Pobre

Aplicações MF, UF e NF a baixa pressão

MF tangencial, UF, NF e OI

UF, NF e OI OI

Os módulos tubulares (Figura 4) são constituídos por um material poroso com resistência química,

térmica e mecânica, cuja configuração pode ser monotubular ou multicanal. A alimentação circula no

interior dos tubos, entra em contacto com a camada activa da membrana, que permeia selectivamente

através dos tubos e o permeado circula no exterior do tudo.

Nos módulos de pratos planos ou plate and frame (Figura 6), a alimentação circula no interior de um

canal estreito de secção transversal rectangular, em que uma ou duas paredes desse canal são

constituídas por membranas. Na configuração deste tipo de módulos os suportes planos com uma

membrana de cada um dos lados são empilhados alternadamente com espaçadores, a alimentação

circula tangencialmente à superfície da membrana e o fluido que permeia é recolhido nos canais de

permeado.

Os módulos enrolados em espiral (Figura 5) consistem em tubos muito compactos com perfurações,

onde são colocadas duas folhas de membranas, as quais têm a camada activa para o exterior e entre

elas um espaçador. Estes envelopes são colados ao longo da superfície lateral do tubo e enrolados. A

alimentação circula tangencialmente à camada activa, o permeado atravessa para o interior dos

envelopes e é recolhido no interior do tubo perfurado.

Os módulos de fibras ocas (Figura 7) são compostos por feixes de capilares poliméricos introduzidos

num invólucro. Quando a camada activa das membranas se encontra no interior das fibras, a

alimentação circula axialmente no interior dos capilares e o permeado é recolhido no espaço entre as

fibras e o invólucro. Quando a camada activa das membranas se encontra no exterior das fibras,

acontece o contrário.

8

Figura 4: Esquema de um módulo tubular.

Figura 5: Esquema de um módulo enrolado em espiral.

Figura 6: Esquema de um módulo de pratos planos.

Figura 7: Esquema de um módulo de fibras ocas

1.6. Modelos de transferência de massa em Ultrafiltração

1.6.1. Polarização de concentração

Nos processos de separação com membranas conduzidos por gradientes de pressão a alimentação é

transportada em direcção à membrana, que se deixa permear pelo solvente e rejeita total ou

parcialmente o soluto. Devido à rejeição parcial dos solutos, a concentração destes tende a ser mais

elevada junto à membrana do que no seio da alimentação. Este fenómeno provoca um gradiente de

concentração adjacente à membrana que é designado de polarização de concentração, representado

na Figura 8.

Figura 8: Representação esquemática do perfil de concentrações na fase líquida adjacente à membrana em

estado estacionário.

Permeado Concentrado

Membrana tubular

Câmara de distribuição Alimentação

Alimentação

Permeado

Concentrado Membrana Cobertura

Espaçador

Material de recolha

do permeado

Tubo central com orifícios

colectores de permeado

Veio hidráulico

Concentrado

Espaçador

Suporte das

membranas

Alimentação

Permeado Permeado

Permeado

Concentrado

Alimentação

Material de

vedação

Feixe de fibras ocas

9

Onde CAb é a concentração do soluto na alimentação, CA é a concentração de soluto à superfície da

membrana, CAp é a concentração de soluto no permeado, Jp é o fluxo de permeação e δ é a espessura

da sub-camada laminar.

O fenómeno de polarização por concentração leva à existência de um fluxo difusivo de soluto da

superfície da membrana em direcção ao seio da solução, −𝐷𝐴𝐵𝜕𝐶𝐴

𝜕𝑥. Este fluxo actua como uma

resistência adicional à transferência de massa, diminuindo o fluxo de permeação.

A polarização por concentração é um processo reversível e pode ser muitas vezes minimizada

alterando os parâmetros operacionais do processo, como a velocidade de recirculação, a concentração

do fluxo de alimentação, a pressão transmembranar, a temperatura e o grau de turbulência. Ao alterar

estes parâmetros, poderá haver uma dispersão dos solutos que se encontram junto à superfície da

membrana, conduzindo a uma diminuição do gradiente de concentração.

1.6.2. Modelo do filme

O modelo do filme pressupõe a existência de um filme de espessura δ (ver Figura 8), em regime laminar,

onde se desenvolve um gradiente de concentração de soluto. O balanço ao soluto em estado

estacionário é dado pela Equação (1), onde JP é o fluxo de permeado, CA é a concentração do soluto A,

DAB é a difusividade do soluto A em solução a diluição infinita, x é a distância à superfície da membrana

e CAp é a concentração do soluto A no permeado.

JPCAp = −DAB

∂ CA

∂ x+ JPCA (1)

Ao integrar a Equação (1) tendo em conta as condições fonteira (2) e (3), obtém-se a Equação (4).

x = 0 CA = CAm (2)

x = δ CA = CAb (3)

Onde CAm representa a concentração do soluto A à superfície da membrana e CAb a concentração do

soluto A no seio da alimentação.

JP = −DAB

δ ln (

CAm − CAp

CAb − CAp

) (4)

Pela teoria do filme (Bird et al., 1960), o coeficiente de transferência de massa (k) é expresso pela

Equação (5):

k =DAB

δ (5)

Substituindo a Equação (5) na Equação (4), obtém-se a equação geral da polarização de concentração

(Equação (6)).

CAm − CAp

CAb − CAp

= e JP k⁄ (6)

1.6.3. Modelo de resistências em série

Para além da resistência intrínseca da membrana a fenómenos de polarização de concentração,

existem outros factores que podem contribuir como resistências adicionais à permeação, como a

eventual formação de um gel, constituído por um depósito de macromoléculas na superfície da

membrana, e a adsorção de solutos pela membrana. Considerando estas resistências adicionais, o

fluxo de permeação pode ser descrito pela Equação (7).

JP =ΔP

μ (Rm + Rpc + Rg + Ra) (7)

10

Onde Rm é a resistência intrínseca da membrana, Rpc é a resistência devida à camada de polarização

de concentração, Rg é a resistência devida à formação do gel e Ra é a resistência devida a fenómenos

de adsorção.

11

II. Revisão Bibliográfica e Enquadramento

1. Composição físico-química do vinho

Por “vinho” entende-se o produto obtido exclusivamente por fermentação alcoólica, total ou parcial, de

uvas frescas, esmagadas ou não, ou de mostos de uvas (Anexo IV do

Regulamento (CE) n.o 479/2008).

O vinho consiste numa solução complexa de espécies químicas maioritariamente provenientes das

uvas, produzidas no decorrer de processos bioquímicos, nomeadamente durante a fermentação

alcoólica e fermentação maloláctica, e resultantes de processos físico-químicos de estabilização e

evolução, que podem ser encontradas sob a forma de solução verdadeira, solução coloidal ou

suspensão, conforme a sua dimensão. Na Tabela 4 apresenta-se um resumo dos principais

constituintes do vinho, respectivas massas moleculares (MM) e teores médios.

Tabela 4: Principais constituintes do vinho.

Composto Massa Molecular (Da) Concentração (g/L)

Água 18 750 – 900 a

Etanol 46 60 – 130 b

Glicerol 92 5 – 20 a

Ácidos orgânicos

Ácido tartárico 150 2 – 5 b

Ácido láctico 90 1 – 5 b

Ácido málico 134 0 – 5 b

Ácido sucínico 118 0,5 – 1,5 b

Ácido cítrico 192 0 – 0,5 b

Compostos azotados

Proteínas 9 600 – 70 000 0,015 – 0,23 c

Polissacáridos

Manoproteínas 53 000 – 560 000 Até 0,20 d, e

Polifenóis

Taninos 600 – 3 500 0,1 – 4 a

Antocianinas 500 – 2 000 0 – 1,5 a, f

Catiões

Potássio 39 0,5 – 2 a

Magnésio 24 0,06 – 0,15 a

Cálcio 40 0,08 – 0,14 a

Sódio 23 0,01 – 0,04 a

Aniões

Sulfatos 96 0,1 – 2 a

Cloretos 35 0,5 – 1 a

Fosfatos 95 0,07 – 1 a

Aromas

Álcoois superiores - 0,001 – 0,003 b

Ésteres - 0,002 – 0,0101 a

Acetaldeído 44 0,03 – 0,2 b

Ácido acético 60 0,5 – 1 b

a – Ribéreau-Gayon et al., 2006; b – Ribéreau-Gayon e Peynaud, 1947; c – Brissonnet et al., 1993; d – Waters et al., 1994; e – Gerbaud et al., 1997; f – Lipnizki, 2010.

1 A gama de valores apresentada está em eq/L.

12

A água é o componente mais abundante na constituição do vinho, representando entre 85 – 90 % do

seu volume, em vinhos não fortificados.

O etanol é o segundo componente mais abundante, sendo este maioritariamente produzido durante

a fermentação alcoólica de açúcares do mosto. A importância deste composto passa pela sua função

como solvente, bem como pela sua afinidade com a água, através da formação de pontes de

hidrogénio, tornando-o um excelente hidratante. Esta propriedade é importante na floculação de

colóides hidrofóbicos, proteínas e polissacáridos, mas também na dissolução de fenóis. (Ribéreau-

Gayon et al., 2006).

O glicerol é o terceiro componente mais abundante no vinho. É formado pelas leveduras no início

da fermentação alcoólica e o seu teor depende de vários factores, como: teor de açúcares no mosto,

espécies de leveduras e arejamento, temperatura, pH e presença de ácido sulfuroso durante a

fermentação (Curvelo-Garcia, 1988; Ribéreau-Gayon et al., 2006).

1.1. Ácidos orgânicos

Os ácidos orgânicos contribuem significativamente para a qualidade do vinho, influenciando as suas

qualidades organolépticas e a sua estabilidade. São responsáveis pelo pH e consequentemente

condicionam a actividade dos microorganismos durante a vinificação, conservação e envelhecimento.

O ácido tartárico, além de ser o que se encontra normalmente em maior quantidade, tem uma grande

importância neste grupo, uma vez que é específico da uva e um dos principais responsáveis pela acidez

do vinho. Este composto está presente no vinho sob a forma do enantiómero L(+)-tartárico.

O ácido málico, cuja presença no vinho provém das uvas, apresenta-se no vinho maioritariamente

sob a forma do enantiómero L(-)-málico. Quando ocorre a fermentação maloláctica, dá-se origem à

descarboxilação do ácido málico e formação de ácido láctico por acção de bactérias lácticas.

O ácido L(+)-láctico presente no vinho poderá ser proveniente da fermentação alcoólica e da

fermentação maloláctica, caso ocorra. Durante a fermentação alcoólica, o ácido láctico é produzido

pelas leveduras em pequenas quantidades. Contudo, quando este ácido se encontra em grandes

quantidades no vinho, provém das actividades metabólicas das bactérias, que transformam o ácido

málico directamente em ácido láctico – fermentação maloláctica. As leveduras sintetizam de modo igual

as formas isoméricas (D e L) de ácido láctico durante o seu metabolismo, por isso um indicador da

ocorrência de fermentação maloláctica é a predominância do estereoisómero L(+)-láctico (Ribéreau-

Gayon et al., 2006 Jackson, 2008).

O ácido sucínico é produzido durante a fermentação alcoólica e contribui para as características

sensoriais do vinho, uma vez que é caracterizado pelo seu gosto ácido intenso e uma mistura de

sabores amargos e salgados.

O ácido cítrico provém das uvas e desempenha um papel importante pelas suas características

organolépticas, como o gosto ácido, e propriedades complexantes. O seu teor no vinho não pode

exceder 1 g/L (Curvelo-Garcia, 1988).

13

1.2. Composição azotada

O azoto presente no vinho encontra-se sob formas minerais e orgânicas.

O azoto mineral representa cerca de 80% da composição total de azoto das uvas em fase de

crescimento. Após amadurecimento, o teor de azoto mineral nas uvas representa menos do que 10%

da composição total de azoto (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

O azoto orgânico no mosto e no vinho está apresenta-se sob diversas formas: aminoácidos,

oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, amidas, aminas biogénicas, ácidos nucleicos, açúcares

aminados e pirazinas.

1.2.1. Proteínas

As proteínas estão geralmente presentes no vinho em concentrações entre 15 a 230 mg/L e

apresentam massas moleculares compreendidas entre 9,6 e 60 kDa. De acordo com o pH, estas

moléculas podem apresentar carga positiva, carga negativa ou carga neutra (ponto isoeléctrico, pI). Na

sua maioria, as proteínas presentes no vinho possuem pontos isoeléctricos baixos (entre 4,1 e 5,8), o

que lhe confere carga eléctrica positiva a valores típicos de pH no vinho (Hsu e Heatherbell, 1987b;

Brissonnet e Maujean, 1993). Durante o processo de produção do vinho, a configuração das proteínas

sofre algumas modificações, no entanto as suas massas moleculares são semelhantes às

apresentadas no mosto, embora difiram nos seus pI (Lamikanra e Inyang, 1988; Murphey et al., 1989;

Pueyo et al., 1993; Waters et al., 1998).

Durante o amadurecimento das uvas são sintetizadas proteínas, das quais a fracção mais

abundante corresponde ao grupo das proteínas relacionadas com o ataque de agentes patogénicos –

as proteínas PR (do inglês, Pathogenesis-related Proteins). Este grupo inclui as quitinases e as

proteínas do tipo taumatina ou proteínas TLP (do inglês, Thaumatin-like Proteins) (Tattersall et al.,

1997). Waters et al. (1998) verificaram que as quitinases representavam cerca de metade da fracção

proteica solúvel presente nas uvas de um vinho (Vitis vinífera L. Muscat de Alexandria), representando

as proteínas TLP a restante fracção.

As proteínas PR são produzidas como mecanismo de defesa das plantas contra os ataques

patogénicos (Van Loon, 1985) e as suas concentrações são geralmente baixas em plantas saudáveis.

A sua síntese parece ser induzida como resposta a lesões nos tecidos e/ou stress biótico (Ferreira et

al., 2001). No entanto, alguns autores sugerem que a presença das proteínas PR nas uvas se deve a

mecanismos genéticos dependentes do seu próprio desenvolvimento e não a processos indutivos

(Waters et al., 1998).

A estabilidade em meios ácidos e a elevada resistência das proteínas PR a processos proteolíticos

fazem com que todo o processo de vinificação funcione como procedimento selectivo de extracção

destas proteínas do bago da uva (Linthorst, 1991). A combinação entre valores baixos de pH no vinho

(3,0 a 3,8) e actividade proteolítica, assegura que apenas as proteínas resistentes a estas condições

subsistam ao processo de vinificação, tal como as proteínas PR, tornando-as as principais percursoras

de casse proteica nos vinhos (Ferreira et al., 2001).

14

Determinação do teor total em proteínas

Os métodos geralmente mais utilizados na determinação do conteúdo total em proteínas são o do

biureto (Gornall et al., 1949), de Lowry (Lowry et al., 1951), de Bradford (Bradford, 1976), do ácido

bicinconinico (BCA) (Smith et al., 1985) e espectrofotometria de ultravioleta (UV) (Stoscheck, 1990). De

seguida apresentam-se as vantagens e desvantagens do método de Bradford.

Método de Bradford

O método de Bradford é um método para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante

Coomassie Blue G-250, também conhecido por reagente de Bradford. Este método é baseado na leitura

da absorvância a 595 nm de uma solução de proteína à qual é adicionada o corante. A adição do

corante promove a sua interacção com as proteínas, que em meio ácido, resulta na alteração da cor

da solução de castanho para azul (Zaia et al., 1998; Kruger, 2002).

O método de Bradford apresenta como vantagens a rapidez e a sensibilidade. Segundo Zaia et al.

(1998), este método apresenta algumas desvantagens, tais como a variação de absortividade

específica para diferentes proteínas, devido à baixa solubilidade ou à baixa massa molecular, e, por

vezes, a não reprodutibilidade de resultados, devida ao grau de pureza do corante, que varia conforme

a sua origem.

Na literatura existem poucas substâncias identificadas como interferentes no método de Bradford,

ou seja, que actuem sobre as proteínas de forma a impedir a reacção destas com o corante ou que

reajam com o corante, conduzindo a um aumento da absorvância. Na Tabela 5 estão apresentadas as

substâncias interferentes mais comuns a este método.

Tabela 5: Determinação de proteínas totais pelo método de Bradford: substâncias interferentes.

Fonte: Zaia et al., 1998.

Interferentes Comentários

Tolbutamida Provoca falso positivo

Ureia Fornece resultado falso positivo, acima de 45 g/L

Cloreto de sódio e de potássio Fornecem resultado falso negativo, acima de 1 M

Detergentes (Triton X-100, SDS, Tween-20)

A larga banda de absorção em 650 nm, devido a reacção entre o corante e os detergentes, interfere na banda de 595 nm, resultando em falso positivo

Ciclodextrinas Formam um complexo de inclusão com o corante, resultando em falso positivo

Polifenóis e polifenóis oxidases

Reagem com as proteínas impedindo a formação do complexo das mesmas com o corante

2mercaptoetanol + guanadina Diminuem a absorção da amostra

Glicerol Provoca falso positive

Lípidos Causam turbidez na amostra

Cloropromazina Provoca falso positive

Fluoreto Diminui a absorção da amostra

Como se pode verificar, alguns dos interferentes na determinação de proteínas totais pelo método de

Bradford fazem parte da constituição do vinho.

15

1.3. Polissacáridos

Os polissacáridos são polímeros cuja unidade básica é uma molécula de ose, caracterizando-se por se

apresentar grande diversidade. Consistem num dos principais grupos de macromoléculas presentes na

constituição do vinho e têm sido alvo de estudo devido às suas propriedades sensoriais. Os

polissacáridos desempenham um papel importante na estabilidade coloidal do vinho, devido à sua

capacidade de interacção e agregação com os taninos (Riou et al., 2002). As concentrações de

polissacáridos no vinho dependem de factores, tais como, casta, estado de maturação das uvas e

método de vinificação, variando entre 0,2 a 2 g/L (Pellerin et al., 1997).

Os polissacáridos existentes no vinho têm duas origens principais: origem vegetal (provêm das

próprias uvas) e origem microbiana (provêm das paredes celulares dos microorganismos). Os que são

provenientes das uvas incluem as arabinogalactanoproteínas (AGP) e as ramnogalacturonanas (RG-II

e RG-I), e os que são maioritariamente provenientes da parede celular das leveduras incluem as

manoproteínas (MP).

A quantidade e estrutura dos polissacáridos presentes no vinho depende da variedade de Vitis

vinífera, do estado de maturação das uvas e do processo de vinificação, podendo sofrer alterações por

tratamento do vinho com enzimas (Ducasse et al., 2010). O uso de enzimas pectolíticas, usadas para

favorecer a degradação da parede celular dos bagos das uvas, promove a extracção do aroma e de

compostos fenólicos para o vinho e afecta a composição polissacarídea do vinho. Doco et al. (2007)

observaram que a utilização destas enzimas conduziu a um aumento da RG-II e a uma diminuição dos

polissacáridos ricos em arabinose e galactose, assim como resultou na perda de resíduos de arabinose

terminais nas AGP.

1.3.1. Polissacáridos com origem na uva

Estudos realizados por vários autores (Usseglio-Tomasset, 1976; Saulnier e Brillouet, 1988; Saulnier

et al., 1991; Vidal et al., 2000) revelaram a predominância das arabinogalactanas (AG) na constituição

das uvas e do mosto. As AG recebem a designação de arabinogalactoproteínas devido ao facto de

estas se encontrarem no vinho associadas a proteínas. Tipicamente, as AGP apresentam na sua

constituição até 10 % de proteínas (Pellerin et al., 1995). As AG e as AGP representam uma parte

importante dos polissacáridos solúveis totais de um vinho, apresentando concentrações entre 100 a

200 mg/L em vinhos tintos e entre 50 – 150 mg/L em vinhos brancos (Doco et al., 2000).

As ramnogalacturonanas RG-I e RG-II têm origem na parede celular pecto-celulósica dos bagos das

uvas (Doco e Brillouet, 1993; Pellerin et al., 1995, 1996; Vidal et al., 2003). A RG-II tem uma grande

importância em Enologia, pois além de serem o polissacárido no vinho com maior carga negativa

(Vernhet et al., 1996; Pellerin et al., 1996), podem estar envolvidas em interacções electroestáticas e

iónicas com outros componentes do vinho, promovendo, desta forma, a formação de precipitados e o

aparecimento de turvação. As RG-II apresentam teores entre 100 a 150 mg/L nos vinhos tintos e entre

20 a 30 mg/L nos vinhos brancos (Pellerin et al., 1997; Doco et al.,2000).

1.3.2. Polissacáridos de origem microbiológica

As manoproteínas são polissacáridos produzidos pela levedura Saccharomyces cerevisiae durante a

fermentação alcoólica. Estes polímeros estão presentes em quantidades significativas nos vinhos,

16

representando mais de 30 % dos polissacáridos totais, e a sua concentração depende do processo de

vinificação, podendo atingir 200 mg/L (Waters et al., 1994; Gerbaud et al., 1997).

Foram efectuados alguns estudos (Llaubères et al., 1987; Saulnier et al., 1991) tendo em vista a

caracterização das MP exocelulares libertadas durante a fermentação, em meios sintéticos que

simulam o mosto, que demostraram que as MP libertadas pelas leveduras são constituídas

maioritariamente por manose e pequenas quantidades de glucose, associadas a 10 – 20 % de proteína.

As MP desempenham um papel importante nas características do vinho e no seu processamento,

nomeadamente em operações de filtração com membranas e estabilização tartárica (Gonçalves et al.,

2002), prevenção da formação de turvação no vinho (Waters et al., 1994a; Moine-Ledoux e Dubourdieu,

1999; Dupin et al., 2000), modulação da adstringência e também na volatilização dos componentes de

aroma (Lubbers et al., 1994; Dufour e Bayonoue, 1999).

1.4. Composição fenólica

Os compostos fenólicos revestem-se de grande importância, uma vez que estão relacionados directa

ou indirectamente com a qualidade dos vinhos. São responsáveis pela cor, corpo, adstringência e

amargor dos vinhos e explicam grande parte das diferenças entre uvas ou vinhos tintos e brancos, pela

ausência ou presença de antocianinas – polifenóis responsáveis pela cor dos vinhos tintos (Sun e

Spranger, 2015).Podem ser divididos em duas classes: flavonóides e não-flavonóides.

1.4.1. Compostos flavonóides

Os compostos flavonóides caracterizam-se pelo seu esqueleto C6 – C3 – C6 e pela sua estrutura

composta por dois anéis aromáticos ligados por um anel pirano, que contém oxigénio (Zoecklin et al.,

1995; Cabrita et al., 2003; Jackson, 2008). Esta classe de compostos fenólicos pode ser dividida em

famílias – os flavonóis, os flavanóis (ou 3 – flavanóis) e as antocianinas –, que se distinguem pelo grau

de oxidação do anel pirano. Os flavonóides podem encontrar-se no estado livre ou polimerizados com

outros flavonóides, açúcares, não flavonóides, ou ainda combinações dos anteriores (Cabrita et al.,

2003).

As antocianinas e os taninos são dos compostos fenólicos que desempenham mais influência nas

características organolépticas de um vinho.

As antocianinas são moléculas de estrutura flavonóide que correspondem a uma antocianidina

glicolisada. Estão presentes nos vacúolos das células da película da uva e, no caso das castas

tintureiras, na polpa, apresentando concentrações no vinho que variam entre 0,1 e 1,5 g/L (Ribéreau-

Gayon et al., 1998). As antocianinas constituem o principal pigmento que confere a coloração vermelho

vivo aos vinhos jovens (Ribéreau-Gayon el al., 2006). Durante o envelhecimento do vinho verifica-se

um decréscimo da concentração destes compostos, devido não só a reacções de degradação térmica

e oxidativa mas também à formação de novos compostos mais estáveis, nomeadamente os resultantes

da condensação com taninos.

Os taninos são compostos fenólicos com capacidade de estabelecer ligações estáveis com

proteínas e outros polímeros constituintes das plantas, nomeadamente os polissacáridos (Cabrita et

al., 2003; Ribéreau-Gayon et al., 2006). Distinguem-se duas grandes classes de taninos: os taninos

17

hidrolisáveis e os taninos condensados (ou taninos não hidrolisáveis). Os primeiros são frequentemente

encontrados nas partes lenhosas das plantas e não existem naturalmente nas uvas. No entanto, uma

vez presentes na madeira podem aparecer em vinhos armazenados ou envelhecidos em cascos

(Cabrita et al., 2003). Os taninos da uva e do vinho são exclusivamente condensados (Foo e Porter,

1981), encontram-se presentes na película, nas grainhas da uva e nos engaços e resultam da

polimerização de catequinas (compostos flavanóis). Esta classe de compostos desempenha um papel

muito importante nas características organolépticas do vinho. As proteínas da saliva precipitam com os

taninos do vinho, deixando de cumprir o seu papel de lubrificação da cavidade bucal, resultando numa

sensação de adstringência. A concentração de taninos no vinho varia entre 1 a 4 g/L nos vinhos tintos

e 100 a 300 mg/L para brancos (Ribéreau-Gayon et al., 1998).

1.4.2. Compostos não flavonóides

Os compostos não flavonóides têm uma estrutura mais simples, embora a sua origem no vinho seja

mais diversa (Jackson, 2008). Estes compostos compreendem os ácidos fenólicos (benzóicos e

cinâmicos) e outros derivados fenólicos como os estibenos. O teor de ácidos fenólicos no vinho

encontra-se na ordem dos 100 – 200 mg/L para os vinhos tintos, e na ordem dos 10 – 20 mg/L para os

vinhos brancos (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

2. Estabilidade proteica de vinhos

A casse proteica como já foi referenciado é um acidente de estabilidade físico-química susceptível de

ocorrer em vinhos brancos, afectando a sua limpidez. A natureza exacta das proteínas responsáveis

por este fenómeno é algo controversa. Isto deve-se à dificuldade em isolar proteínas específicas

causadoras da turvação do vinho pelo calor.

De acordo com Waters et al. (1991), o ideal para ultrapassar esta dificuldade seria demonstrar que

ao remover proteínas específicas, o vinho ficaria protegido contra a instabilidade, e que se se tornasse

a adicioná-las ao vinho, haveria uma indução dos problemas de turvação. Seguindo esta estratégia,

albumina de soro bovina (BSA) poderia ser utilizada como controlo, visto que apesenta um potencial

para a coagulação muito semelhante às proteínas dos vinhos (Waters et al.,1991).

O mecanismo de instabilidade proteica nos vinhos está relacionado com a insolubilização das

proteínas e pode ser explicado por duas hipóteses:

1) Individualmente, as proteínas apresentam diferentes sensibilidades à desnaturação provocada pelo

aquecimento, contribuindo, assim, diferentemente para a formação de turvação e/ou precipitado, ou

seja, apenas uma parte da fracção proteica total será responsável pela instabilidade;

2) O aparecimento de turvação nos vinhos, embora dependente das proteínas, é condicionado por um

conjunto de factores de origem não proteica.

2.1. Factores que influenciam a estabilidade proteica

Numerosos estudos têm sido desenvolvidos sobre a estabilidade proteica de vinhos, visando a

compreensão dos factores que têm influência neste problema. Um dos principais factores que alguns

18

autores (Mesquita et al., 2001; Ferreira et al., 2002) afirmam ser responsável pelo fenómeno de casse

proteica é a concentração em proteínas no vinho, no entanto os trabalhos realizados por Lagace e

Bisson (1990) e Dizy e Bisson (1999) demonstram que a instabilidade proteica não está directamente

relacionada com a concentração total de proteínas e, como tal, não constitui um factor previsível para

avaliação da potencialidade de turvação de um vinho. Existem opiniões controversas sobre a relação

da concentração em proteínas de um vinho na influência na sua estabilidade proteica.

A natureza das proteínas constitui outro factor influenciador da estabilidade proteica de um vinho.

Diversos estudos (Bayly e Berg, 1967; Hsu e Heatherbell, 1987b; Esteruelas et al., 2009a, 2009b)

permitiram constatar que diferentes fracções proteicas se comportam de maneira distinta, possuindo

diferentes sensibilidades à desnaturação, conduzindo à conclusão de que a instabilidade está

dependente de fracções proteicas específicas (Fusi et al., 2010).

Os factores que influenciam a estabilidade proteica nos vinhos englobam: a diferença entre o pH do

vinho e pI das proteínas; o pH do vinho; e, a presença de compostos de natureza não-proteica, como

flavanóis e iões metálicos.

Cada um destes factores será apresentado com maior pormenor de seguida.

2.1.1. Concentração proteica

Lee (1985) defendeu que a maior fonte de proteína no vinho é a uva e que a concentração de proteínas

totais é influenciada pela casta, estado de maturação e clima. Waters et al. (2005) afirmaram que o teor

em proteínas totais pode ser também afectado pelas tecnologias de processamento da uva. Os

engaços têm um papel importante na limitação da difusão das proteínas, podendo influenciar a

concentração proteica dos vinhos brancos: na colheita tradicional (manula), engaços e bagos são

colhidos, sendo os primeiros ricos em taninos que poderão contribuir para o decréscimo de proteínas

no mosto por floculação e precipitação, enquanto que na colheita mecânica apenas os bagos são

colhidos.

O contacto com a película aumenta geralmente a concentração de proteínas no sumo, dependendo

da sua variedade, temperatura e duração, ocorrendo uma maior extracção destas durante as primeiras

10 horas de contacto. O clima e outros factores ambientais, incluindo o stress biótico, influenciam não

só a quantidade mas também a qualidade das proteínas sintetizadas durante o desenvolvimento e

maturação da uva. A fracção solúvel presente em mostos de uva e vinhos aumenta com o aumento do

grau de maturação da fruta (Murphey et al., 1989).

O teor em proteínas totais é alterado ao longo do ciclo de vegetativo. Monteiro et al. (2006), num

estudo com a casta Moscatel, observaram teores de proteínas totais de aproximadamente 12 µg

proteínas totais/g de uva na semana subsequente à floração, de 60 µg proteínas totais/g de uva ao

estado fenológico pintor2 e de 245 µg proteínas totais/g de uva à data de vindima. Com base nestes

resultados, os mesmos autores, afirmam que a concentração total de proteína aumenta

exponencialmente, desde a floração até à vindima, sendo que o pintor funciona como que o “gatilho”

2 Pintor – é uma palavra utilizada pelos viticultores para traduzir o início do amadurecimento da uva e caracteriza-se pela mudança

de cor das uvas ao acabar o ciclo de desenvolvimento e começar o seu período de estágio (a meio do Verão). É um momento importante no ciclo da vinha. As uvas brancas perdem, num par de dias, a sua cor verde para ir adquirindo um belo tom amarelado. As tintas enchem-se de manchas violáceas e vão tornando-se escuras (adaptado de IVV).

19

para o desenvolvimento crescente das proteínas em uvas sãs (Van de Rhee et al., 1994; Ferreira et

al., 2002).

A concentração em proteínas do vinho difere de casta para casta. Pocock et al. (2000) em ensaios

realizados no Sul da Austrália para várias castas observaram teores de proteína total de 251 mg/L para

a casta Moscatel de Alexandria, 191 mg/L para Sauvignon Blanc, 62 mg/L para Pinot Noir e 31 mg/L

para a casta Shiraz. Em relação a castas portuguesas, Mesquita et al. (2001) apresentaram teores em

proteínas totais para seis vinhos produzidos em 1996 de diferentes castas, Fernão Pires, Assario,

Tamarez, Verdelho, Arinto e Moscatel, de 141,0; 114,7; 64,5; 30,9; 87,0 e 334,3 mg/L, respectivamente.

2.1.2. Natureza das proteínas

A uva é a maior fonte de proteína no vinho. Durante a fermentação, as leveduras podem excretar

pequenas quantidades de proteínas. Após a fermentação alcoólica uma quantidade maior de proteínas

constitui o vinho, resultante da autólise das leveduras. Estas proteínas não são responsáveis pela

instabilidade proteica no vinho.

A MM e o pI são duas propriedades das proteínas que se relacionam directamente com as suas

limitações de solubilidade. Alguns trabalhos demonstraram que as fracções de proteínas presentes nos

vinhos com massas moleculares baixas (entre 10 a 20 kDa) e pIs baixos são as que mais contribuem

para a sua instabilidade (Mesrob et al., 1983; Hsu e Heatherbell, 1897a, 1897b). Outros trabalhos

revelaram que só após remoção, por colagem com bentonite, das fracções proteicas com massas

moleculares baixas e pIs elevados (Ngaba e Heatherbell, 1981; Heatherbell et al., 1985; Lee, 1985), e

das proteínas com elevadas massas moleculares ou as glicoproteínas (Millies, 1975), os vinhos se

tornaram estáveis.

As quitinases e as proteínas do tipo taumatina foram identificadas como as fracções proteicas

maioritárias presentes no vinho branco (Waters et al., 1996). Por serem resistentes à proteólise e a

valores baixos de pH, sobrevivem ao processo de vinificação, podendo precipitar e turvar o vinho

(Waters et al., 1996).

A resistência de proteínas no mosto ou no vinho a vários tipos de peptidases é conhecida. Waters

et al. (1992) demonstraram que as peptidases capazes de hidrolisar BSA em meio alcoólico diluído,

também hidrolisam a BSA quando esta é adicionada a um mosto ou a um vinho. Por outro lado, estas

peptidades, quando adicionadas ao mosto ou ao vinho, deixaram intactas as proteínas instáveis

provenientes das uvas. Segundo Ribéreau-Gayon et al. (2006), é possível concluir que não existem

enzimas específicas no vinho ou no mosto que inibem a actividade das peptidases e que as proteínas

das uvas possuem uma resistência inerente muito forte e não usual à hidrólise.

2.1.3. pH do vinho e pI das proteínas

O pH do vinho é muito próximo do pI para muitas das fracções de proteínas que constituem o vinho.

Se o pH do vinho for superior ao pI de determinada fracção de proteínas, essa fracção apresenta carga

negativa, pelo que a proteína se irá ligar electrostaticamente a agentes carregados positivamente. Pelo

contrário, se o pH do vinho estiver abaixo do pI de determinada fracção, essa apresenta carga positiva

e desta forma a proteína ligar-se-á a agentes carregados negativamente. Posto isto, quanto maior for

20

a diferença entre o pH do vinho e o pI da proteína, maior será a afinidade desta com o agente a que se

liga. As características da carga das várias fracções proteicas ajudam a perceber a razão pela qual

alguns vinhos são facilmente estabilizados a nível proteico com a adição de bentonite, por exemplo,

enquanto outros não o são.

Mesquita et al. (2001) estudaram o efeito do pH na estabilidade proteica de um vinho branco

(produzido a partir de uvas da casta Fernão Pires), para o qual o teste térmico revelou que o vinho se

tornou estável com o aumento do pH do vinho de 2,5 para 7,5. Isto sugere que o pH tem um papel

importante na formação de turvação associada à instabilidade proteica e que valores elevados de pH

poderão reduzir o potencial de turvação proteica induzido por resposta aos testes térmicos.

2.1.4. Presença de compostos de natureza não proteica

Segundo Waters et al. (2005), “existem várias evidências na literatura que sugerem que outros

compostos presentes no vinho, que não as proteínas, são absolutamente necessários na formação de

turbidez visível nos vinhos brancos quando sujeitos ao teste de estabilidade térmica usado

industrialmente (80 ºC, durante 6 horas)”.

Batista et al. (2009) estudaram o mecanismo complexo de formação de turbidez e sugeriram que

existe uma necessidade absoluta da presença de um ou mais compostos no vinho de natureza não

proteica para que ocorra precipitação das proteínas nesse mesmo vinho, denominando esses

compostos como o factor X. Estes autores concluem que a baixos valores pH (inferior a 3,8), e

possivelmente a outros valores de pH, a formação de turvação proteica exibe uma necessidade

absoluta de componentes do vinho não proteicos de massas moleculares baixas (inferior a 3 kDa) –

denominado factor X – que desnaturam as proteínas por indução térmica, provocando a sua

precipitação.

Pellerin et al. (1994) testaram 15 polissacáridos e concluíram que eles não afectam nem aumentam

a turbidez durante o teste térmico de avaliação da estabilidade proteica de um vinho. Por outro lado,

Mesquita et al. (2001) mostraram que os polissacáridos aumentam a instabilidade proteica,

particularmente a temperaturas moderadamente altas (entre 40 a 50 ºC), no entanto o teor de

polissacáridos apresentado neste estudo (acima de 17 g/L) é muito superior teor de polissacáridos

reportado nos vinhos.

Waters et al. (1993, 1994a, 1994b) descreveram o efeito protector das manoproteínas provenientes

das leveduras, que protegem os vinhos da turbidez provocada pela instabilidade proteica.

Somers e Ziemelis (1973) constataram que até cerca de 50 % das proteínas do vinho se encontra

ligada a compostos flavonóides. Estes autores utilizaram esta informação para explicar as variações

de instabilidade proteica estudadas por Bayly e Berg (1967) e concluir que a turvação proteica se deve

à fracção residual de proteínas do vinho que se tornaram propensas à precipitação pela interacção com

compostos fenólicos.

2.2. Avaliação da estabilidade proteica

Foram desenvolvidos testes de estabilidade com o intuito de conhecer o risco de turbidez causado pela

instabilidade do vinho antes do engarrafamento. Os testes de estabilidade podem ser classificados de

21

acordo com o seu mecanismo de acção em: testes de desnaturação térmica, ensaios de proteína total,

desnaturação química e diminuição de solubilidade (Boulton, 1980; Mesrob et al., 1983; Dawes et al.,

1994; Sarmento et al., 2000a, Esteruelas et al., 2009a). O seu objectivo principal é avaliar a

susceptibilidade do vinho vir a desenvolver casse proteica.

O teste mais utilizado é o teste térmico com avaliação da turbidez que consiste no aquecimento do

vinho num banho de água a 80ºC durante 30 minutos. Este teste é, também, o mais fiável, sendo por

isso considerado um dos testes mais adequados para prever o fenómeno de casse proteica durante o

envelhecimento do vinho engarrafado. A turbidez ocorre durante o arrefecimento, desta forma este

parâmetro é medido antes e após o tratamento térmico. O vinho é considerado estável se a diferença

entre os valores de turbidez nestas condições for menor de 2 NTU (Dubourdieu et al., 1988).

O teste térmico pode também ser realizado com adição de tanino – teste térmico com adição de

tanino e avaliação da absorvância. Doses entre 0,5 – 2 g/L de tanino são adicionadas ao vinho e

imediatamente se torna visível a turvação devido à precipitação das proteínas. Para que não ocorra o

fenómeno de casse férrica é adicionado ácido ascórbico.

O denominado Bentotest (Jakob, 1962) não testa especificamente as proteínas sensíveis à

temperatura, apenas estima a existência de problemas associados à presença das proteínas, como a

turbidez. Este teste envolve a adição de uma mistura de ácido fosfomobíbdico e ácido clorídrico à

amostra de vinho, que desnatura e precipita as proteínas pela formação de ligações com o ião

molibdénio. A turvação aparece instantaneamente, embora possa não ser facilmente visível caso exista

ferro na amostra, uma vez que a presença deste composto irá originar uma cor azul. A turvação formada

pode ser quantificável por nefelometria.

O teste do ácido tricloroacético (ATC) consiste na mistura de 10 mL de ATC a 55% com uma amostra

de 100 mL de vinho e aquecimento no banho a 100ºC durante 2 min. A turbidez é observada após

15 min, à temperatura ambiente (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

O teste do etanol (Boulon et al., 1996) consiste na mistura de volumes iguais de etanol absoluto e

amostra de vinho, conduzindo à formação de turbidez, que pode ser medida com um nefelómetro. Esta

turbidez não consiste em apenas proteínas instáveis mas também alguns polissacarídeos e MP que

precipitam. Vinhos estáveis e com elevado conteúdo em MP tendem a apresentar turvação quando

sujeitos ao teste do etanol.

De acordo com Ribéreau-Gayon (2006), “o teste que envolve o tratamento térmico (80ºC, 30

minutos) sem adição de tanino é o método mais eficaz na determinação da estabilidade proteica de um

vinho branco”.

2.3. Tratamentos usados na estabilização proteica do vinho

Existem várias técnicas para o tratamento da estabilização proteica do vinho, como: colagem com

bentonite, adição de adsorventes, enzimas proteolíticas, manoproteínas, ultrafiltração e pasteurização.

A bentonite é um auxiliar tecnológico com vasta aplicação na clarificação e estabilização proteica

de mostos e vinhos (Catarino et al., 2008). Este agente de colagem é o mais usado em Enologia na

redução do risco de turvação no vinho causada pelas proteínas (Ferreira et al., 2001). A adsorção das

proteínas à bentonite é um processo de troca de catiões, cuja eficiência depende do tipo de bentonite,

22

da concentração adicionada, da temperatura, do pH e da composição do vinho (Ribéreau-Gayon et al.,

2006). Após hidratada com água, a bentonite possui capacidade de expansão, aumenta a sua área

superficial, forma um gel com uma carga fortemente negativa ao pH do vinho e actua interagindo

electrostaticamente com os colóides do vinho de carga positiva (em particular, as proteínas),

conduzindo à sua remoção por adsorção e precipitação conjunta (Lambri et al., 2010; Sauvage et al.,

2010).

Em diversos estudos foi observado efeito negativo na qualidade sensorial do vinho. O estudo de

Miller et al. (1985) demonstrou uma redução da concentração dos componentes responsáveis pelo

aroma após a adição de bentonite ao sumo, mosto ou vinho e, posteriormente, os estudos realizados

por Cabaroglu et al. (2003) e Pollnitz et al. (2003), confirmaram que os compostos responsáveis pelo

aroma do vinho podem ser absorvidos pela bentonite. Rankine (1989) afirmou que a colagem com

bentonite resulta em perdas de aroma e sabor e, mais tarde, Martinez-Rodriguez e Polo (2003)

alargaram esta conclusão a vinhos espumantes.

Por outro lado, outros estudos sugerem que não existem alterações significativas na qualidade

sensorial do vinho quando se aplica o processo de colagem com bentonite. A avaliação sensorial

realizada por Leske et al. (1995) aos vinhos tratados com bentonite não mostrou diferenças

significativas entre as amostras de controlo e as tratadas. De modo análogo, Pocock et al. (2003),

reportaram que a colagem com bentonite de um vinho Chardonnay e outro Semillon não mostrou efeito

negativo no aroma nem no sabor do vinho.

Alguns autores afirmam que a bentonite não é selectiva para proteínas e também remove outras

espécies carregadas ou agregados (Ferreira et al., 2001; Lambri et al., 2010). A presença de certos

colóides é necessária, uma vez que conferem “volume de boca” e contribuem para a fixação de

compostos aromáticos (Achaerandio et al., 2001). Uma vez que a bentonite não é selectiva, pode

interagir com compostos aromáticos (Moio et al., 2004), o que resulta numa perda dos compostos de

aroma e sabor (Lambri et al., 2010). A colagem com bentonite também conduz à perda de volumes

substanciais de vinho (entre 3 a 10 %) (Tattersall et al., 2001) e a deposição de bentonites usadas

constitui uma fonte de desperdício. Por estas razões, é actualmente dada especial atenção ao

desenvolvimento de alternativas a esta prática com o objectivo de estabilizar o vinho sob o ponto de

vista proteico, e que possam manter a sua qualidade, reduzir os custos e serem mais sustentáveis.

Os agentes de colagem são essencialmente usados para clarificação, tratando-se de proteínas

actuam sobre os compostos fenólicos do vinho, interactuando com outros componentes, sendo por isso

esperado que influenciem, pelo menos em parte, o potencial do vinho para se tornar turvo devido à

instabilidade proteica. Chagas et al. (2012) estudou o efeito de seis diferentes agentes de colagem

23

(caseína3, albumina de ovo4, ictiocola5, quitosana6, quitina7 e polivinilpolipirrolidona8 (PVPP)),

conhecidos pela remoção de polifenóis, melhoria do processo de clarificação e clarificação de vinhos

com diferentes problemas de turvação (Spagna et al., 1996; OIV 2012), na estabilização proteica de

vinhos brancos. Estes autores verificaram que o uso de albumina de ovo e quitosana, embora incapaz

de estabilizar o vinho, originou um pequeno mas significativo decréscimo na formação de turvação,

enquanto a quitosana e a PVPP mostraram ser os agentes de colagem mais eficazes na remoção da

maioria dos polifenóis do vinho e concluíram que os agentes de colagem analisados no seu estudo não

afectaram significativamente o conteúdo de proteínas no vinho, removendo consideráveis quantidades

de compostos fenólicos, mas não apresentaram efeito aparente na estabilização dos vinhos após a

colagem.

Vincenzi et al. (2005) estudaram o efeito da colagem com quitina na remoção de proteínas de um

vinho (Vitis Vinifera cv. Incrocio Manzoni), tendo verificado que o tratamento por colagem com doses

crescentes de quitina permitiu a redução até 80% da turbidez no vinho produzida por indução dos testes

de estabilidade proteica, o que correspondeu a uma redução de proteína neste mesmo vinho para

menos de 29%.

Relativamente às enzimas proteolíticas, os estudos realizados demonstraram que estas não

degradam eficientemente as proteínas PR às temperaturas normais dos processos de vinificação

(Heatherbell et al., 1985; Waters et al., 1992). No entanto, a utilização de enzimas em conjunto com o

tratamento térmico tem-se revelado um tema promissor em alguns estudos já realizados (Feuillat e

Ferrari, 1982; Heatherbell et al., 1985; Lagace e Bisson, 1990; Duncan, 1992; Dizy e Bisson, 1999).

Pocock et al. (2003) estudaram o efeito do tratamento térmico combinado com a adição de enzimas

proteolíticas na estabilização proteica de vinhos brancos comerciais. Estes autores submeteram os

vinhos com e sem adição de enzimas proteolíticas a tratamento térmico (aquecimento a 90 ºC durante

1 minuto e posterior arrefecimento imediato a 16 e 19 ºC). Verificaram que o tratamento combinado

conduziu à redução entre 40 – 80 % do conteúdo proteico no vinho original e que o tratamento térmico

sem adição de enzimas resultou na redução do conteúdo proteico entre 50 – 90 % em relação ao seu

conteúdo original. Isto leva à diminuição da dose de bentonite necessária para a estabilização proteica

do vinho: no caso do vinho submetido ao tratamento térmico e adição de enzimas proteolíticas, a

redução da dose de bentonite necessária para a eficácia do tratamento obtida foi entre 40 – 80 %; no

caso do vinho submetido a tratamento térmico sem adição das enzimas, verificou-se uma redução entre

50 – 70 % da dose de bentonite necessária. A avaliação sensorial dos vinhos demonstrou que o

tratamento teve um efeito negligenciável no aroma e nas características de sabor, tendo sido

3 A caseína é a principal proteína do leite. Em associação com iões sódio ou potássio forma um caseinato solúvel, que dissolvido

no vinho adsorve e remove as partículas carregadas negativamente (Jackson, 2008). 4 A clara do ovo tem sido usada na colagem de vinhos, removendo o excesso de taninos, sendo o seu ingrediente activo a

albumina. A ligação peptídica da albumina forma pontes de hidrogénio com os grupos hidroxilo dos taninos, levando à formação

de grandes agregados proteína-tanino (Jackson, 2008). 5 Ictiocola ou cola de peixe é um tipo de gelatina pura, transparente ou translúcida, obtida da bexiga de alguns peixes. É

semelhante aos agentes de colagem proteicos e a sua principal utilização é na remoção de taninos (Jackson, 2008) 6 A quitosana é um derivado da quitina. Quando o grau de desacetilação da quitina atinge cerca de 50% (dependendo da origem

do polímero), torna-se solúvel em meio ácido e toma o nome de quitosana (Rinaudo, 2006) 7 A quitina é um polímero linear da parede celular das leveduras (Klis et al., 2006) 8 PVPP é um polímero resinoso que actua de forma semelhante aos agentes de colagem proteicos. É particularmente útil na

remoção selectiva de flavanóis e mono e difenóis (Jackson, 2008)

24

observados ligeiros efeitos no aroma em alguns casos devido ao aquecimento e à adição de uma

quantidade de enzima muito superior à recomendada pelo fabricante.

Outra alternativa ao processo convencional de colagem com bentonite consiste na utilização de um

leito filtrante, isto é, utilização de uma coluna de leito fixo ou fluidizado constituído por um adsorvente

pelo qual, à medida que o vinho passa, as proteínas sejam adsorvidas. Este processo deverá permitir

a regeneração do adsorvente, reduzindo, desta forma, os resíduos e os custos de operação. Este tipo

de processo requer um adsorvente de tamanho constante que tenha as seguintes características:

capacidade de adsorção adequada das proteínas do vinho, pouca dilatação e distribuição do tamanho

das partículas adequado, possibilidade de ser regenerado, o que implica estabilidade física (Sarmento

et al., 2000b). Pashova et al. (2004) demonstraram que o uso de óxido de zircónio em pó mostrou ser

um adsorvente capaz de remover 70 % do conteúdo em proteína total de um vinho branco

(Chardonnay), removendo preferencialmente as fracções proteicas com MM entre 20 – 50 kDa e

50 – 70 kDa, enquanto as fracções abaixo de 15 kDa e acima de 70 kDa são removidas em último. No

entanto, de acordo com vários estudos, a estabilização proteica por meio deste adsorvente terá um

impacto negativo nas características físico-químicas e sensoriais do vinho (Pashova el al., 2004;

Salazar el al., 2006). Maragon et al. (2010) mostraram que um vinho branco (Chardonnay) foi

estabilizado, removendo as proteínas instáveis, por adsorção com zircónio após tratamento com 25 g/L

durante 72 horas, no entanto este vinho após tratamento mostrou uma redução na intensidade do

aroma frutado e do sabor. Mercurio et al. (2010) propuseram a utilização de zeólitos naturais como

adsorventes, uma vez que estes apresentam uma vasta superfície externa e têm carga negativa, que

permite interacções com outros catiões ou moléculas polares (como as proteínas), incapazes de

penetrar a sua estrutura microporosa. Estes autores apresentaram, no seu estudo, vantagens como o

aumento da estabilidade tartárica.

Uma solução complexa pode ser estabilizada quando um colóide macromolecular (polissacárido) e

um colóide instável são colocados “frente-a-frente”. Os colóides macromoleculares que possuem esta

característica são chamados colóides protectores e as suas propriedades previnem a formação de

turvação e depósitos nos vinhos (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Ledoux e Dubourdieu (1992)

observaram o aprimoramento espontâneo da estabilidade proteica no vinho branco durante o seu

envelhecimento em contacto com as borras. Esta observação levou à conclusão de que certas MP

libertadas no vinho quando em contacto com as borras eram capazes de estabilizar termicamente as

proteínas do vinho (Waters et al.,1993; Moine-Ledouxt e Dubourdieu, 1999), actuando como colóides

protectores. A adição de MP, como alternativa à colagem com bentonite, apresenta propriedades

benéficas na estabilização das proteínas e na redução da turvação do vinho branco, podendo exercer

um efeito positivo sobre a qualidade do vinho (Waters et al., 1993; Waters et al., 1994b; Gonzalez-

Ramos el al., 2008). As MP com baixa MM como a invertase (32 kDa) oferecem uma elevada

estabilidade proteica ao vinho e a sua interacção com outros componentes do vinho leva ao

aperfeiçoamento da sua qualidade (Moine-Ledoux e Dubourdieu, 1999). No entanto, este método

apresenta comparativamente com a bentonite uma importante desvantagem, o seu preço elevado.

25

3. Enquadramento do tema e objectivos da dissertação

Actualmente, para o problema associado à instabilidade proteica de vinhos brancos recorre-se à

colagem com bentonite. Este agente de colagem apresenta algumas desvantagens como a remoção

de alguns compostos com influência no sabor e a perda de 3 – 10 % de volume de vinho. O uso de

alternativas à aplicação de colagem tem vindo a ser estudado, apresentando-se a ultrafiltração como

uma alternativa promissora.

O primeiro problema associado à filtração do vinho é garantir a qualidade da sua clarificação e que

as partículas sejam retidas sem que causem quaisquer modificações na estrutura química capazes de

afectar o sabor do vinho (Ribéreau-Gayon et al., 2006). Sachs et al. (1983) demonstraram que, de um

modo geral, a UF não interferiu nas propriedades organolépticas, excepto para os vinhos tintos em

estudo, nos quais ocorrereu uma redução da adstringência. Balanutse et al. (1985) observaram que na

aplicação de UF em modo de concentração o sabor de um vinho foi inalterado. No entanto, os trabalhos

efectuados por Maglioli e Marchesini (1985) constataram que um vinho branco apresentava um odor e

sabor mais pronunciado que um vinho submetido a UF, tendo-se verificado uma ligeira oxidação do

último após quatro meses.

Serrano e Paetzold (1994) observaram que a filtração de um vinho tinto com uma membrana de

diâmetro de poro de 0,65 μm provocou uma redução do conteúdo em polissacáridos, fenóis e ésteres.

Estes autores observaram também que os aromas de um vinho Moscatel não foram afectados, no

entanto não foram encontradas diferenças significativas nos vinhos estudados quando colocados em

repouso após um mês de serem filtrados e testados.

Relativamente ao papel das membranas e suas características no processo de UF, os estudos

desenvolvidos por Berger et al. (1985) verificaram que determinadas membranas modificaram o

carácter dos vinhos tintos. Hsu et al. (1987b) estudaram o efeito do MWCO da membrana na

estabilidade proteica por UF, tendo demonstrado que o aumento do MWCO coincidira com o

decréscimo da retenção de proteínas pela membrana e que até 99% das proteínas foram retidas com

membranas de 10 kDa MWCO. Segundo Hsu et al. (1987b) embora a estabilidade proteica possa ser

alcançada com membranas de 10 kDa MWCO ou mesmo de 30 kDa, pequenas quantidades de

proteínas termo-instáveis permeiam através da membrana, conduzindo à aplicação posterior de

colagem com bentonite. Neste estudo, os autores verificaram também que para um vinho sujeito a UF

usando uma membrana de 30 kDa MWCO, o permeado continha fracções de proteínas de

12,6 – 28 kDa e 60 – 65 kDa, e que ao adicionar uma dose de 5 g/hL de bentonite foi removida apenas

a fracção proteica correspondente a 12,6 – 28 kDa. Isto suporta estudos anteriormente realizados (Hsu

et al., 1987c), que afirmaram que para a obtenção de estabilidade proteica de vinho, avaliada por

aplicação de testes térmicos, é necessário remover a fracção de proteínas de baixa MM (20 – 30 kDa),

que é caracterizada por possuir baixos pI (na gama de 4,1 – 5,8) e conter glicoproteínas na sua

composição. Em 1990, Flores et al. investigaram o efeito do MWCO da membrana e do factor de

concentração a nível da composição e da estabilidade dos vinhos.

Como anteriormente referido, a UF pode também ser usada para reter as macromoléculas do vinho,

de forma a possibilitar o estudo da sua contribuição para a estabilidade proteica do vinho. Esta

operação é um processo complexo, devido à transmissão e rejeição de proteínas pela membrana estar

26

dependente do sistema hidrodinâmico, ou seja, pressão transmembranar, resistência, porosidade e

morfologia da membrana, carga e hidrofobia da superfície (Cui, 2005; Saxena et al., 2009), carga

electrostática e pI das proteínas, bem como as espécies iónicas e o valor de pH do vinho (Zulkali et al.,

2005; Sarkar et al., 2009; Rohani e Zydney, 2010).

Em estudos realizados recentemente, Bruijn et al. (2011) realizaram a operação de UF em cascata

com membranas de MWCO de 10, 30, 100 e 300 kDa. O seu objectivo foi separar as macromoléculas

de um vinho branco em fracções com diferentes massas moleculares (10 – 30, 30 – 100 e

100 – 300 kDa). Estes autores constataram que a UF apresentou ser um método apropriado ao

fraccionamento do vinho, uma vez que permitiu a separação das proteínas numa fracção de

10 – 30 kDa enriquecida em proteínas bastante termo-instáveis e numa outra fracção de 30 – 100 kDa

com uma grande quantidade de proteínas bastante estáveis termicamente.

3.1. Objectivos

Esta dissertação visa a contribuição da optimização dos parâmetros de operação de ultrafiltração na

clarificação, estabilização proteica de vinhos brancos, instáveis sob o ponto de vista proteico.

Para tal, constituíram objectivos específicos do trabalho:

1) Selecção de vinhos brancos instáveis sob o ponto de vista proteico, por aplicação de diferentes

testes de estabilidade.

2) Ultrafiltração de vinhos brancos instáveis sob o ponto de vista proteico, de forma a reter as

macromoléculas, particularmente as proteínas, responsáveis pela instabilidade.

3) Avaliação da composição físico-química das correntes de ultrafiltração, incluindo polissacáridos

totais, proteínas totais e índice de fenóis totais.

4) Avaliação da estabilidade proteica das correntes de ultrafiltração, nomeadamente alimentação

inicial, concentrado e permeado (vinho tratado).

5) Avaliação da remoção das macromoléculas no processo de separação e a sua influência na

qualidade do vinho.

27

III. Materiais e Métodos

1. Vinhos

No presente trabalho foram utilizados três vinhos brancos, susceptíveis de instabilidade proteica,

produzidos na Adega Experimental do Instituto Superior de Agronomia (ISA), a partir de uvas

provenientes das vinhas do mesmo Instituto. Mais concretamente foram utilizados dois vinhos

monovarietais, Vitis Vinifera L., castas Viosinho e Moscatel Graúdo e um vinho de lote de três castas

(Viosinho 75% v/v, Alvarinho 12,5% v/v, Arinto 12,5% v/v), originários da vindima de 2016.

Os vinhos brancos foram obtidos por aplicação da tecnologia de vinificação convencional,

denominada por “bica aberta”. Durante a vindima foram adicionados 50 mg SO2/kg de uva e 50 g de

aromax B49/ 100 kg de uva. Antes da fermentação alcoólica, teve lugar a etapa de defecação à

temperatura de 12ºC, com duração de 24 horas. A duração da fermentação alcoólica foi diferente para

cada um dos vinhos em estudo, bem como a temperatura à qual ocorreu, sendo estes valores

apresentados no Anexo B.

Após a fermentação alcoólica, o vinho Viosinho foi adicionado com preparação enzimática

(glucalyse10) e foi realizada a operação de battonage duas vezes por semana com uma duração de 45

minutos.

Os vinhos anteriormente referidos foram seleccionados a partir de um grupo de seis vinhos brancos

da vindima de 2016, todos eles produzidos no ISA, o qual incluía ainda vinhos monovarietais das castas

Arinto, Encruzado e Moscatel Galego. A estabilidade proteica dos seis vinhos foi testada por aplicação

de dois procedimentos analíticos diferentes e seleccionados aqueles que revelaram maior instabilidade.

1.1. Testes aplicados para verificação da estabilidade proteica dos vinhos

Este parâmetro teve por base a realização de tratamentos térmicos das amostras de vinho em estudo

(vide Capítulo II. 2.2. Avaliação da estabilidade proteica).

Inicialmente foi avaliada a susceptibilidade à instabilidade proteica dos seis vinhos já referidos

através do teste tratamento térmico com adição de tanino (Sarmento et al., 2000a), que consiste na

adição de 1 mL de uma solução hidroalcoólica (10% v/v) com 5% (m/v) de tanino (Prolabo No. 20712)

e de 200 mg de ácido ascórbico, aquecimento em banho de água a 80 ºC durante 10 minutos e posterior

arrefecimento com água fria. São medidas as absorvâncias a 650 nm das amostras com e sem adição

de tanino e comparadas: se a diferença entre as absorvâncias for superior a 0,1, considera-se que o

vinho é susceptível de vir a desenvolver instabilidade proteica.

Foi aplicado outro teste térmico, adaptado de Dubourdieu et al. (1988), segundo o qual uma amontra

de 20 mL de vinho, após centrifugação a 14000 g durante 15 minutos, é colocada num banho a 80 ºC

durante 30 minutos e posteriormente arrefecida. É medida a turbidez desta amostra relativamente a

uma amostra de controlo (vinho sem tratamento térmico) por nefelometria e expressa em NTU: o vinho

é considerado estável do ponto de vista proteico se a diferença entre a turbidez não exceder 2 NTU.

9 O Aromax é um aditivo utilizado na indústria vitinícola que contém dióxido de enxofre e ácido ascórbico. 10 A Glucalyse é uma preparação enzimática, com pectinases e glucanases, utilizada na indústria vitivinícola para aumentar a

filterabilidade do vinho e promover a libertação de manoproteínas das paredes celulares das leveduras.

28

1.2. Caracterização físico-química geral

Os métodos de análise aplicados na determinação dos parâmetros de caracterização físico-química

geral dos vinhos em estudo estão discriminados em seguida e a maioria teve por base os métodos OIV

(OIV, 2011). Incluem: turbidez (OIV-MA-A2S-08), teor alcoólico em volume (Zoecklein et al., 1995),

massa volúmica (OIV-MA-AS2-01B), acidez total (OIV-MA-AS313-01), acidez volátil (OIV-MA-AS313-

02), teor em substâncias redutoras (OIV-MA-AS311-01A), extracto seco total (OIV-MA-AS2-03B),

dióxido de enxofre livre e total (adaptação do método OIV-MA-AS323-04B), características cromáticas

(OIV-MA-AS2-07B), pH (OIV-MA-AS313-15), e teor em polissacáridos totais (Segarra et al., 1995).

Turbidez

A turbidez consiste na redução da transparência de um fluido devido à presença de materiais em

suspensão que interferem com a passagem da luz através do mesmo. A sua avaliação for realizada

por nefelometria, de acordo com o método OIV-MA-AS2-08 (OIV, 2011), sendo expressa em NTU.

Teor alcoólico em volume

O teor alcoólico corresponde ao volume em litros de etanol presente em 100 L de vinho, à temperatura

de 20 ºC. Para avaliação deste parâmetro analítico foi aplicado um método baseado na ebuliometria.

É determinado o ponto de ebulição das amostras de vinho e de uma solução de referência de água

pura, estando a diferença entre as temperaturas de ebulição das amostras e água pura relacionadas

com a percentagem de etanol na amostra (Zoecklein et al., 1995).

Massa volúmica

A massa volúmica representa a massa por unidade de volume do vinho à temperatura de 20 ºC e pode

ser determinada por picnometria, areometria ou densimetria através da balança hidrostática.

O método utilizado para a determinação da massa volúmica encontra-se descrito no Método OIV-

MA-AS2-01B (OIV, 2011), cujo princípio é a determinação deste parâmetro por areometria. Este método

consiste na introdução de um areómetro numa proveta que contém a amostra de vinho e leitura da

massa volúmica à temperatura à qual se encontra. Posteriormente este parâmetro é corrigido para a

temperatura de 20 º C.

Acidez total

A acidez total no vinho define-se como a soma da acidez titulável a pH 7 por adição de uma solução

alcalina utilizando-se azul de bromotimol como indicador.

O método utilizado encontra-se descrito no Método OIV-MA-AS313-01 (OIV, 2011), onde a amostra

de vinho, após eliminação do dióxido de carbono por vácuo, é titulada com hidróxido de sódio na

presença do indicador azul de bromotinol.

Acidez volátil

A acidez volátil é constituída pelo conjunto de ácidos gordos da série acética, presentes no vinho nas

formas livre e salificada.

29

A determinação deste parâmetro foi realizada conforme descrito no Método OIV-MA-AS313-02 (OIV,

2011), consistindo na eliminação do dióxido de carbono da amostra seguido da destilação por

arrastamento de vapor, onde se dá a separação dos ácidos voláteis, e posterior titulação do destilado

com hidróxido de sódio na presença de fenolftaleína.

Teor em substâncias redutoras

As substâncias redutoras do vinho incluem todos os açúcares com funções aldeídica ou cetónica, que

lhes conferem poder redutor sobre uma solução cupro-alcalina.

O método usado na determinação das substâncias redutoras [Método OIV-MA-AS311-01a (OIV,

2011)] é desenvolvido em duas fases: uma etapa de clarificação da amostra para eliminação de

substâncias interferentes (compostos fenólicos e aminoácidos) e uma etapa de quantificação por

reacção do filtrado com uma determinada quantidade de licor cupro-alcalino, e posteriormente

doseamento do ião cúprico em excesso por titulação indirecta por iodometria.

Extracto seco total

O extracto seco de um vinho inclui todas as substâncias não voláteis sob determinadas condições

físicas, que devem ser tais que os componentes desse extracto sofram o mínimo de alteração possível

durante a sua determinação.

O Método OIV-MA-AS2-03B (OIV, 2011) foi utilizado para esta determinação e consiste no cálculo

indirecto deste parâmetro através da gravidade específica do vinho sem álcool. É expresso em

quantidade de sacarose que, dissolvida numa quantidade de água suficiente para perfazer 1 L,

corresponde a uma solução que apresenta a mesma densidade que o mosto ou que o vinho

desalcoolizado.

Dióxido de enxofre livre e total

O dióxido de enxofre livre apresenta-se nas diferentes formas químicas H2SO3 (ácido sulfuroso), HSO3-

(ião bissulfito) e SO3- (ião sulfito). O dióxido de enxofre total representa o conjunto das diferentes formas

de SO2 presentes no vinho, no estado livre ou combinadas com os seus constituintes (o ião bissulfito é

também a forma preponderante no SO2 combinado).

O dióxido de enxofre livre é determinado por titulação potenciométrica com uma solução de iodo. O

dióxido de enxofre total é determinado por titulação potenciométrica com solução de iodo, após hidrólise

alcalina para libertação do dióxido de enxofre combinado.

Características cromáticas

As características cromáticas de um vinho são a sua luminosidade e cromaticidade. A luminosidade

corresponde à transmitância, e varia na razão inversa da intensidade corante do vinho. A cromaticidade

corresponde ao comprimento de onda dominante, que caracteriza a tonalidade, e à pureza. Este

parâmetro é obtido pelo método espectrofotométrico.

O método utilizado para determinar este parâmetro consiste na leitura da absorvância das amostras

de vinha a um comprimento de onde de 420 nm (Curvelo-Garcia, 1998).

30

pH

Para a determinação do pH dos vinhos foi utilizado o Método OIV-MA-AS313-15 (OIV, 2011), cujo

princípio assenta na diferença de potencial entre dois eléctrodos mergulhados na amostra, onde um

dos eléctrodos apresenta o potencial em função do líquido onde está inserido, enquanto o outro

apresenta um potencial fixo e conhecido, sendo este último denominado eléctrodo de referência.

Teor em polissacáridos totais

A determinação do teor de polissacáridos totais tem como base um método espectrofotométrico

desenvolvido por Segarra et al. (1995) que consiste na separação/isolamento dos polissacáridos e sua

determinação por aplicação do método fenol-sulfúrico.

Numa primeira fase, procede-se à extracção dos polissacáridos da amostra de vinho, baseada na

sua precipitação com recurso a um solvente orgânico (etanol) e posteriores separação do precipitado

por centrifugação e lavagem com etanol (Segarra et al., 1995; Gonçalves, 2002). A etapa de

precipitação consiste na adição de 4 mL de vinho a 20 mL de etanol 96% v/v (na proporção de 1:5) e

na conservação desta solução a 5 ºC durante cerca de 12 – 16 horas. De seguida, a solução é

centrifugada durante 15 minutos a 14000 g, sendo o sobrenadante retirado e o precipitado lavado com

10 mL de etanol 96% v/v. Esta operação é repetida até que o sobrenadante retirado esteja

completamente límpido.

Os polissacáridos precipitados são dissolvidos numa solução hidroalcoólica e o resíduo seco num

evaporador rotativo. O precipitado seco é dissolvido em 4 mL de água.

A aplicação do método fenol-sulfúrico (Segarra et al., 1995; Gonçalves, 2002) consiste no conjunto

das seguintes etapas: diluição da solução de polissacáridos obtida para 1:10; a um tubo de ensaio

adiciona-se 0,4 mL da solução de polissacáridos, 0,4 mL de fenol (5% m/v) e 2 mL de ácido sulfúrico;

agitação imediata da solução num vórtex durante 4 – 5 segundos; colocação do tubo de ensaio em

banho de 30 ºC durante 15 minutos; arrefecimento sob corrente de água fria durante 15 minutos; leitura

da absorvância a 495 nm num espectrofotómetro.

A concentração em polissacáridos foi calculada com recurso à curva de calibração da glucose,

expressa em mg glucose/L, que consta no Anexo C.

2. Instalação de Ultrafiltração

A operação de UF dos vinhos foi efectuada num equipamento comercial à escala laboratorial, Celfa P-

28, apresentado na Figura 9.

31

Figura 9: Instalação Celfa P-28.

1 – Tanque de alimentação; 2 – Camisa de arrefecimento; 3 – Bomba de circulação; 4 – Válvula; 5 – Manómetro; 6 – Célula de permeação; 7 – Válvula de regulação da pressão

A instalação é constituída por um tanque de alimentação, um permutador de calor, uma bomba de

circulação com um potenciómetro para regulação do caudal de circulação, um módulo de membranas

planas, uma válvula para o escoamento da fracção do concentrado, um manómetro e uma válvula de

regulação da pressão (back-pressure valve).

O tanque de alimentação (1) é um reservatório constituído em aço inoxidável 316 e tem capacidade

de cerca de 500 mL. Está revestido por uma camisa de aquecimento (2), que permite controlar a

temperatura da alimentação através da imersão de um termómetro no tanque de alimentação.

A pressão do sistema e a circulação da alimentação através da instalação são asseguradas pela

bomba de circulação (3), cujo caudal de circulação é regulado por um potenciómetro acoplado à bomba.

A pressão do sistema é regulada pela válvula de controlo de pressão (7) – back-pressure valve – que

se situa após a célula de permeação (6). A leitura da pressão do sistema é feita no manómero (5) que

precede a célula de permeação. A pressão do sistema e o caudal de circulação são ajustados em

simultâneo através do potenciómetro e da back-pressure valve.

A célula de permeação é uma célula plana com uma área superficial de membrana de 25,25 cm2

(Minhalma, 2001).

A instalação Celfa P-28 contém no interior da célula de permeação um volume morto, o qual não é

eliminado entre os ensaios de UF, é por isso importante a sua contabilização, uma vez que em todos

os ensaios realizados existirá uma diluição da alimentação neste volume. A determinação do volume

morto da instalação de UF teve como base a realização de um ensaio de UF com uma solução de

cloreto de sódio (NaCl). Para isso foi preparada uma solução de 500 mL de NaCl com concentração

conhecida (300 ppm), que foi submetida a um ensaio de UF à pressão mínima do sistema (cerca de

0,5 bar) em modo de recirculação total durante 10 minutos. A condutividade da solução de NaCl antes

e após o ensaio permitiu determinar a concentração inicial e final desta solução, sendo estes resultados

apresentados no Anexo D. A diferença entre o volume final e o volume inicial resulta no volume morto

da instalação de UF Celfa P-28 de 19,8 mL.

Permeado Concentrado

32

2.1. Procedimento de funcionamento da instalação

A membrana foi montada na célula de permeação sobre uma folha de papel de filtro. Antes dos ensaios

serem iniciados, é necessário proceder à compactação da membrana (vide Capítulo III. 3.2

Compactação da membrana).

O procedimento dos ensaios poderá ser divido nas seguintes etapas: arranque, estabilização,

recolha de amostras e paragem; as quais se encontram descritas a seguir.

Arranque

Após a carga do tanque de alimentação com um volume de 500 mL, a bomba de circulação é posta em

funcionamento. O potenciómetro é regulado para baixos caudais, de forma a evitar a danificação da

membrana. O caudal de circulação é então regulado com o potenciómetro e a pressão com a back-

pressure valve, sem que a membrana seja submetida a variações bruscas das condições operatórias.

Nesta fase é também colocada a circular a água de refrigeração na camisa de arrefecimento, de

forma a estabilizar a temperatura para o valor pretendido.

Estabilização

Durante o período de estabilização o permeado é recirculado para o tanque de alimentação durante 10

minutos, de forma a ser obtida a estabilização das condições operatórias: caudal de circulação da

alimentação, pressão do sistema, temperatura e concentrações das correntes de alimentação e de

permeado.

Recolha de amostras

As amostras recolhidas dos ensaios de UF consistiram em amostras das diferentes fracções da UF,

isto é, da alimentação inicial (AI), do concentrado (C) e do permeado (P). A recolha da AI efectuou-se

após o período de estabilização de 10 minutos. A recolha das fracções C e P efectuavam-se após o

ensaio de UF e exactamente antes da paragem da instalação.

Entre a recolha e a análise, as amostras foram mantidas no frigorífico a 4 ºC, sendo colocadas à

temperatura ambienta até atingirem 20 – 25 ºC aquando da sua caracterização analítica.

Paragem

Após recolha das amostras de C e P, a pressão do sistema e o caudal de circulação devem ser

reduzidos gradualmente antes de se desligar a bomba de circulação, de modo a não danificar a

membrana.

3. Membrana

Para os ensaios de UF foi utilizada uma membrana comercial, FS61PP, da AlfaLaval (antiga DSS-

Denmark), baseada num suporte de polipropileno, cujas características estão apresentadas no

Anexo A.

33

Ao montar a membrana na célula da instalação, coloca-se uma folha de papel de filtro entre a

membrana e a placa porosa, de forma a proteger a membrana. Após montagem, procede-se à lavagem,

de modo a remover quaisquer vestígios de aditivos usados no seu fabrico, e posterior compactação.

3.1. Lavagem da membrana

A lavagem das membranas é efectuada com água desionizada. Esta operação é repetida a cada

alteração de ensaio e/ou a cada soluto que é feito passar pela membrana.

A operação de lavagem é realizada a baixas pressões (0,5 bar) e à velocidade de recirculação

máxima, durante cerca de 2 horas.

3.2. Compactação da membrana

A etapa de compactação tem como objectivo a minimização de quaisquer efeitos na estrutura da

membrana durante os ensaios, devido à pressão a que esta está sujeita, de forma a que não ocorra

decréscimo no fluxo de permeado.

Esta operação consiste na permeação de água desionizada a uma pressão superior à pressão

máxima de trabalho em 20% e em modo de recirculação total, durante 2 a 3 horas.

3.3. Caracterização da membrana

A caracterização da membrana tem como objectivo o conhecimento do comportamento da mesma, que

depende da sua estrutura e do seu material. A caracterização deve conter: i) informação morfológica

relacionada com a estrutura porosa, como o diâmetro dos poros e a distribuição do diâmetro dos poros;

ii) propriedades químicas, como hidrofilia/hidrofobia relativas; iii) propriedades eléctricas; e, iv)

propriedades dos polímeros que as constituem.

No presente trabalho a caracterização da membrana teve como base a determinação da

permeabilidade hidráulica (Lp), a rejeição a solutos de referência e o limite de exclusão molecular

(MWCO). Dado a utilização de uma membrana comercial, esta caracterização é efectuada com

conhecimento prévio da informação disponibilizada pelo fabricante (AlfaLaval), nomeadamente o

MWCO da membrana de 20 kDa.

3.3.1. Determinação da permeabilidade hidráulica

A permeabilidade hidráulica é o parâmetro mais comum na caracterização de qualquer membrana e é

definida como a capacidade de permeação de uma membrana à água pura. Este parâmetro pode ser

obtido através da representação gráfica dos fluxos de permeação em função da pressão

transmembranar, segundo a Equação (8), que corresponde ao declive, Lp.

Jp = Lp × ΔP (8)

Onde Jp corresponde ao fluxo de permeação da água pura.

34

3.3.2. Determinação do limite de exclusão molecular das membranas

A determinação do limite de exclusão molecular da membrana, MWCO, foi efectuada recorrendo ao

perfil de rejeição de solutos de referência, sendo a rejeição aparente de um soluto (fA) dada pela

Equação (9).

fA =CAa − CAp

CAa

(9)

Onde CAa e CAp são as concentrações de soluto na alimentação e no permeado, respectivamente. Estas

concentrações foram determinadas através da leitura do carbono orgânico total (TOC) para as

correntes de alimentação e permeado, que se encontra descrito mais à frente no tópico Carbono

Orgânico Total.

Procedeu-se à ultrafiltração de soluções dos solutos de referência apresentados na Tabela 6, à

pressão transmembranar de 0,5 bar e à velocidade de recirculação máxima de 0,79 L/min.

Tabela 6: Características dos solutos de referência usados na determinação do MWCO.

Soluto de referência (Da) Massas moleculares médias (Da) Fórmula química Marca

PEG 10 000 9000 – 12500

HO(C2H4O)nH

MERCK – Schuchardt

PEG 20 000 ~ 20000 Fluka

PEG 35 000 ~ 35000 MERCK – Schuchardt

As condições dos ensaios foram controladas da seguinte forma: foi lida a temperatura inicial da solução,

após 10 minutos de estabilização das condições operatórias do ensaio de UF e no final do ensaio de

permeação e foi também contabilizado o tempo de permeação. Estes valores estão apresentados no

Anexo E. Durante o ensaio foram retiradas amostras da solução inicial preparada, da solução de

alimentação após 10 minutos de estabilização, da solução de alimentação no final do ensaio de UF e

do permeado, sendo posteriormente determinadas as respectivas concentrações através da medição

do carbono orgânico total. As concentrações determinadas apresentam-se no Anexo E, sendo as rectas

de calibração correspondentes a cada soluto de referência usadas nesta determinação apresentadas

no Anexo C.

No final de cada ensaio realizado, a membrana foi lavada com água desionizada e foram

determinados os fluxos de água, de modo a verificar a ocorrência de algum problema de colmatação.

Através da Equação 9, determinou-se a rejeição aparente, fA, sendo que a concentração da

alimentação, CAa, correspondeu à média aritmética das concentrações correspondentes às amostras

retiradas da alimentação após estabilização e às amostras retiradas da alimentação final do ensaio de

UF.

Na determinação do MWCO, representa-se graficamente os valores de log (fA

1−fA) em função das

massas moleculares (MM) dos solutos de referência e faz-se intersectar com a recta log (fA

1−fA) = 1, que

corresponde à MM de soluto com uma rejeição de 90,9 %. O MWCO é o valor correspondente à

intercepção da recta log (fA

1−fA) = 1 com a recta log (

fA

1−fA) vs. ΔP.

35

Carbono Orgânico Total

O carbono orgânico total foi determinado num analisador de carbono Dohrmann, modelo 3300. Este

aparelho é composto por três unidades: o forno, o detector de infravermelho e o integrador.

Inicialmente abre-se a válvula de oxigénio e ajusta-se a pressão para 3 bar, liga-se o forno e

aguarda-se que a temperatura atinja 700 ºC. Antes de qualquer leitura é necessário proceder à

calibração do equipamento, que é realizada pela injecção de 40 μL de uma solução padrão de

hidrogenoftalato de potássio com a concentração de 2000 ppm em carbono numa barquinha com lã de

vidro, sendo esta inserida no forno. A concentração deverá ser de 2000 ± 40 ppm de carbono, caso

contrário o procedimento de calibração deverá ser repetido.

Após a calibração do equipamento, efectua-se a injecção de 40 μL da amostra a analisar de modo

análogo ao descrito para a calibração. Nesta etapa ocorre a conversão de todo o carbono orgânico em

CO2, sendo este dirigido para o detector de infravermelho, que envia um sinal ao integrador.

O TOC de cada amostra é obtido pela diferença entre o valor obtido para a amostra e o valor obtido

para o branco. Este último corresponde à concentração de carbono obtida para a água desionizada

utilizada na preparação das soluções aquosas.

4. Ensaios de Ultrafiltração do vinho

Efectuou-se a permeação dos três vinhos brancos anteriormente apresentados: dois vinhos monocasta

(Moscatel Graúdo, Viosinho) e um vinho de lote (Lote). A operação decorreu em modo de recirculação

total à pressão de 1,2 bar com um caudal de circulação de 0,79 L/min.

Na Figura 10 apresenta-se um esquema do procedimento dos ensaios de UF para os vinhos

brancos, que será descrito detalhadamente em seguida.

Em cada ensaio, inicialmente foi colocado um volume de 500 mL no tanque de alimentação de vinho

a permear, tendo sido recolhidos 160 mL da AI após estabilização de 10 minutos. Esta etapa de

estabilização decorreu à pressão transmembranar mínima (cerca de 0,5 bar) e teve como objectivo a

mistura de algum volume morto que terá sido retido na instalação e a estabilização da temperatura a

cerca de 22 ºC. Após recolha do volume da AI necessário para análise, alterou-se a pressão

tramsmembranar para a pressão de trabalho (1,2 bar) e foi reposto um volume de 160 mL ao tanque

de alimentação do vinho original. Seguiu-se novo período de estabilização de 10 minutos, para garantir

a mistura e a estabilização das condições operatórias, nomeadamente a pressão.

36

Figura 10: Procedimento dos ensaios de UF dos vinhos brancos.

A recolha da fracção de P foi realizada durante o ensaio e foram utilizados três frascos de recolha

para as seguintes determinações analíticas e testes: teor de proteínas totais (10 mL); caracterização

físico-química geral por FTIR (30 mL); estabilidade proteica, turbidez, teor de polissacáridos totais e

índice de fenóis totais (120 mL). Exactamente após a primeira recolha foi reposto um volume de 10 mL

ao tanque de alimentação do vinho original, e o mesmo aconteceu para a segunda recolha, sendo que

nesta o volume reposto de vinho foi de 30 mL. Durante a recolha dos 120 mL restantes, a cada 30 mL

37

recolhidos foi reposto o mesmo volume de vinho original ao tanque de alimentação, à excepção dos

últimos 30 mL recolhidos, em que não foi reposto qualquer volume de vinho à alimentação.

Posteriormente, procedeu-se à recolha de 160 mL da fracção de C.

5. Caracterização das fracções de Ultrafiltração

A caracterização físico-química geral das fracções de UF foi realizada por espectrofotometria de

infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (Ferreira, 2015), usando o equipamento Foss

WineScan FT 120. A análise por FTIR inclui os parâmetros: massa volúmica a 20 ºC, teor alcoólico em

volume a 20 ºC, extracto seco, substâncias redutoras, acidez total, acidez volátil, pH, cinzas, ácido

tartárico, ácido málico, sulfatos e cloretos.

A turbidez e o teor em polissacáridos foram determinados pelos métodos analíticos anteriormente

referidos (vide Capítulo III. 1.2. Caracterização físico-química geral).

Na caracterização das fracções de UF foi também determinado o índice de fenóis totais (Somers e

Evans, 1977) e o teor em proteínas totais (Bradford, 1976). Estes métodos encontram-se descritos de

seguida.

Relativamente à estabilidade proteica das fracções de UF, esta foi determinada pelos testes de

estabilidade proteica anteriormente descritos em III. 1.1.

5.1. Teor em proteínas totais

Na determinação do teor em proteínas totais foi utilizado o método de Bradford, um método

colorimétrico com base na alteração da absorvância resultante da ligação do corante Coomassie Blue

G-250 às proteínas.

O método de Bradford pode ser realizado tanto num tubo como numa microplaca e envolve as

seguintes etapas: combinação de uma pequena quantidade de proteína da amostra com o reagente,

homogeneização por agitação, incubação à temperatura ambiente durante um breve período e medição

da absorvância a 595 nm. A concentração de proteínas é estimada por referência a uma curva de

calibração, obtida por avaliação da absorvância numa série de padrões de albumina de sérum bovina

diluída em água. Foram construídas duas curvas de calibração para diferentes gamas de concentração

(baixas concentrações: 0 – 25 μg/L e altas concentrações: 0 – 2000 μg/L), que estão apresentadas no

Anexo C. O procedimento do ensaio para a determinação da concentração de proteínas totais nas

diferentes gamas de concentração é realizado de forma diferente para cada uma delas.

Gama de altas concentrações (0 – 2000 μg/L)

Para uma microplaca pipetou-se 5 μL da amostra, aos quais se adicionaram 250 μL do reagente de

Bradford e misturou-se durante 30 segundos. De seguida, incubou-se durante 10 minutos à temperatura

ambiente. Após esse período foi medida a absorvância das amostras a 595 nm, que foi corrigida pela

subtracção da medição da média obtida para o branco.

38

A concentração de proteínas totais foi obtida pela Equação 11, correspondente à recta de calibração

obtida para a gama de altas concentrações, que representa a concentração de BSA padrão (mg/L) em

função da absorvância a 595 nm.

A595 = 2 × 10−13 × [BSA]4 − 8 × 10−10 × [BSA]3 + 9 × 10−7 × [BSA]2 + 0,0001 × [BSA] (11)

Este procedimento foi aplicado na determinação do teor em proteínas totais das fracções de UF

Alimentação Inicial e Concentrado.

Gama de baixas concentrações (0 – 25 μg/L)

Para uma microplaca pipetou-se 150 μL da amostra, aos quais se adicionaram 150 μL do reagente de

Bradford e misturou-se durante 30 segundos. De seguida, incubou-se durante 10 minutos à temperatura

ambiente. Após esse período foi medida a absorvância das amostras a 595 nm, que foi corrigida pela

subtracção da medição da média obtida para o branco.

A concentração de proteínas totais foi obtida pela Equação 12, correspondente à recta de calibração

obtida para a gama de baixas concentrações, que representa a concentração de BSA padrão (mg/L)

em função da absorvância a 595 nm.

A595 = −1 × 10−6 × [BSA]4 + 1 × 10−4 × [BSA]3 − 0,0028 × [BSA]2 + 0,0521 × [BSA] (12)

Este procedimento foi aplicado na determinação do teor em proteínas totais da fracção de UF

Permeado.

5.2. Índice de fenóis totais

O método utilizado na determinação do índice de fenóis totais (IFT) é o método espectrofotométrico,

que consiste na leitura da absorvância das amostras a 280 nm, após centrifugação a 18000 g durante

10 minutos e diluição das mesmas em água destilada numa razão de 1:10 (no caso das amostras de

vinho branco). O IFT é obtido pela multiplicação do valor de absorvância lido pelo factor de diluição e

subtraído pelo factor de correcção empírico, 4, usando a Equação (13) (Somers e Evans, 1977).

Índice de polifenóis totais (IFT) = A280 nm × 10 − 4 (13)

6. Análise estatística

Para avaliação do efeito da operação de UF na composição físico-química dos vinhos os dados obtidos

por caracterização analítica foram tratados por análise de variância (ANOVA). A análise estatística foi

realizada por One-way ANOVA (análise de variância com um factor) e por comparação de médias

(Fischer LSD, 95 % de probabilidade), usando o programa Statistica 7.0.

39

IV. Resultados e Discussão

1. Caracterização da membrana de ultrafiltração

A membrana comercial FS61PP da AlfaLaval utilizada nos ensaios de UF foi caracterizada tendo em

conta a permeabilidade hidráulica, a rejeição a solutos de referência e o limite de exclusão molecular.

1.1. Permeabilidade hidráulica

A permeabilidade hidráulica da membrana FS61PP foi determinada através da representação gráfica

do fluxo de permeado em função da pressão transmembranar. A Figura 11 apresenta os fluxos de

permeação, Jp, para a circulação de água a um caudal de 0,79 L/min à pressão transmembranar, ΔP,

de 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 e 3 bar.

Figura 11: Representação do fluxo de água desionizada permeada (Jp) em função da pressão (ΔP).

Jp[kg (h m2)⁄ ] = 43,795 × ΔP(bar) , R2 = 0,9852

O valor da permeabilidade hidráulica corresponde ao declive da recta ajustada aos valores

experimentais, sendo esse valor 44 kg/(h m2 bar).

1.2. Rejeição a solutos de referência e determinação do limite de exclusão molecular

Com o objectivo de caracterizar a membrana em termos de permeação selectiva e determinação do

limite de exclusão molecular, que será designado por MWCO, procedeu-se à ultrafiltração de soluções

de solutos de referência (PEG 10000, 20000 e 35000). A concentração dos solutos nas soluções de

alimentação foi de 500 ppm. Os ensaios de UF foram realizados à pressão de 0,5 bar e à velocidade

de recirculação máxima de 0,79 L/min. Os coeficientes de rejeição aparente, fA, são apresentados na

Tabela 7.

Tabela 7: Rejeição aparente dos solutos de referência PEG (10, 20 e 35 kDa).

Soluto de referência Massa molecular (kDa) Rejeição aparente (fA)

PEG 10 000 10 0,6045

PEG 20 000 20 0,7115

PEG 35 000 35 0,8562

y = 43,795xR² = 0,9852

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Jp

(kg

m¯²

h¯¹)

ΔP (bar)

40

Na Figura 12 estão representados os valores de log (fA

1−fA) em função das massas moleculares, MM,

dos solutos de referência e a recta log (fA

1−fA) = 1, que representa a rejeição de solutos de 90,9 %. Da

intersecção desta recta com a recta log (fA

1−fA) vs. MM resulta o valor do MWCO da membrana.

Figura 12: Determinação do limite de exclusão molecular (MWCO) da membrana FS61PP.

O valor do limite de exclusão molecular obtido para a membrana FS61PP é de 45 kDa.

O valor deste parâmetro indicado pelo fabricante é de 20 kDa (Anexo A).

Na determinação presente as condições de operação foram anteriormente explicitadas A sua

omissão por parte do fabricante invalida qualquer comparação, pois as condições de operação,

nomeadamente o caudal de recirculação, a pressão transmembranar, o tipo de solutos de referência e

a sua concentração, são determinantes no valor obtido.

2. Selecção dos vinhos brancos para os ensaios de ultrafiltração

Conforme anteriormente descrito, os vinhos utilizados nos ensaios de UF foram seleccionados a partir

de um conjunto de seis vinhos (Arinto, Encruzado, Lote, Moscatel Galego, Moscatel Graúdo e Viosinho),

com base na seguinte estratégia: inicialmente foi realizado o teste térmico com aplicação de tanino e

avaliação da absorvância a todos os vinhos; e, posteriormente foi realizado o teste térmico com

avaliação da turbidez, para confirmação da instabilidade proteica, aos três vinhos que apresentaram

maior diferença entre os valores de absorvância no teste anterior.

Na Tabela 8 apresentam-se os resultados do teste térmico com adição de taninos para cada vinho,

sendo o valor apresentado a diferença entre os valores da absorvância a 650 nm do vinho antes e após

o tratamento térmico. Para cada teste foram feitas duas leituras independentes, sendo o valor

apresentado a média dessas leituras ± o desvio padrão.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50

log

(f A

/(1-f

A))

MM (kDa)MWCO

41

Tabela 8: Estabilidade proteica dos vinhos: teste térmico com adição de taninos e avaliação da absorvância.

Diferença entre os valores de absorvância com e sem adição de taninos a 650 nm (u.a.)

Arinto 0,18 ± 0,03

Encruzado 0,30 ± 0,04

Lote 0,45 ± 0,08

Moscatel Galego 0,33 ± 0,05

Moscatel Graúdo 0,69 ± 0,05

Viosinho 0,89 ± 0,05

Os vinhos foram considerados instáveis sob o ponto de vista proteico quando o valor da diferença entre

os valores da absorvância das amostras com e sem adição de tanino após o tratamento térmico foi

superior a 0,1 u.a.. Através dos resultados verificou-se que, segundo o teste térmico com adição de

taninos, todos os vinhos se apresentavam instáveis, sendo que os três que apresentaram maior

instabilidade foram ao vinhos Viosinho, Moscatel Graúdo e Lote. Para estes, foi avaliada novamente a

estabilidade proteica, com aplicação do teste térmico, de forma a confirmar a instabilidade dos vinhos

que havia sido observada segundo o teste anterior. Na Tabela 9 apresentam-se os valores medidos de

turbidez antes e após o tratamento térmico bem como a diferença entre eles, que permitiu concluir

acerca da estabilidade do vinho.

Tabela 9: Estabilidade proteica dos vinhos: teste térmico com avaliação da turbidez.

Turbidez (NTU)

Antes tratamento térmico Após tratamento térmico Diferença

Viosinho 5,9 11 5,1

Lote 8,8 11 2,2

Moscatel Graúdo 1,2 9,9 8,7

A interpretação dos resultados deste teste foi feita da seguinte forma: os vinhos são considerados

instáveis sob o ponto de vista proteico quando o valor da diferença de turbidez antes e após o

tratamento térmico é superior a 2 NTU. A partir dos resultados apresentados na Tabela 9, verificou-se

que os vinhos seleccionados se encontravam instáveis, confirmando os resultados obtidos para o teste

térmico com adição de taninos.

Ao analisar os resultados dos testes térmicos para avaliação da estabilidade proteica dos vinhos

seleccionados para os ensaios de UF, verificou-se que no caso do teste térmico com adição de taninos

o vinho que se encontrou mais instável sob o ponto de vista proteico foi o vinho Viosinho, apresentando

uma maior diferença nos valores de absorvância, seguido do vinho Moscatel Graúdo e do vinho Lote.

No caso do teste térmico, os resultados indicaram que o vinho que se encontrava mais instável sob o

ponto de vista proteico era o vinho Moscatel Graúdo, apresentando uma maior diferença nos valores

de turbidez, seguido do vinho Viosinho e do vinho Lote. Embora os resultados qualitativos dos dois

testes sejam concordantes em termos de estabilidade/instabilidade, verificaram-se diferenças na

ordenação dos vinhos por grau de instabilidade.

42

3. Caracterização físico-química geral dos vinhos brancos

Os resultados da caracterização físico-química geral dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF

estão apresentados na Tabela 10. À excepção da massa volúmica a 20 ºC, foram realizadas duas

determinações independentes para cada um dos outros parâmetros e apresentada a sua média e o

desvio padrão.

Tabela 10: Características físico-químicas dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF.

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

Teor alcoólico (% vol) 12,1 ± 0,3 12,7 ± 0,2 13,8 ± 0,1

Massa volúmica a 20 ºC (g/mL) 0,9934 0,9920 0,9896

Acidez total (g ác. tartárico/L) 6,2 6,1 ± 0,1 5,3

Acidez volátil (g ác. acético/L) 0,16 0,17 ± 0,01 0,27 ± 0,02

Substâncias redutoras (g/L) 1,5 0,8 ± 0,03 0,7 ± 0,03

Extracto seco total (g/L) 28,9 ± 0,7 26,9 ± 0,8 24,0 ± 0,4

Dióxido de enxofre livre (mg/L) 36 33 ± 1 26 ± 1

Dióxido de enxofre total (mg/L) 65 75 ± 7 54 ± 2

Absorvância a 420nm (u.a.) 0,195 ± 0,004 0,254 ± 0,002 0,101 ± 0,001

pH 3,27 3,19 ± 0,01 3,27

3.1. Turbidez

Na Tabela 11 apresenta-se os resultados relativos à turbidez dos vinhos brancos seleccionados para

os ensaios de UF. Os valores apresentados correspondem à média de duas leituras independentes e

respectivo desvio-padrão.

Tabela 11: Turbidez dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF.

Turbidez (NTU)

Viosinho 602 ± 2

Lote 31

Moscatel Graúdo 4,07 ± 0,01

Os valores apresentados na Tabela 11 correspondem à turbidez do vinho engarrafado, sem qualquer

tratamento de clarificação (por exemplo, colagem, filtração e centrifugação).

Figura 13: Vinhos brancos seleccionados para os ensaios de UF.

Da esquerda para a direita: Lote, Moscatel Graúdo e Viosinho.

43

Na Figura 13 apresentam-se os vinhos brancos seleccionados para os ensaios de UF. Como se verifica

pela aparência, os vinhos não se encontram clarificados, sendo que o Viosinho é o que apresenta uma

maior turvação, seguido do Lote e Moscatel Graúdo. A turvação elevada no vinho Viosinho está

relacionada com a aplicação da preparação enzimática pectolítica e manutenção do vinho em contacto

com as borras.

3.2. Teor em Polissacáridos Totais

Na Tabela 12 apresenta-se o teor inicial em polissacáridos totais dos vinhos brancos seleccionados

para os ensaios de UF. Foram feitas duas determinações independentes. Os valores apresentados

correspondem à média de duas leituras independentes e respectivo desvio-padrão.

Tabela 12: Teor em polissacáridos totais dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF.

Teor em Polissacáridos Totais (mg/L)

Viosinho 123 ± 3

Lote 95 ± 4

Moscatel Graúdo 93 ± 4

4. Ensaios de Ultrafiltração

Nos ensaios de UF realizados consideraram-se as seguintes fracções: alimentação inicial (AI), que

corresponde ao vinho diluído num volume de água desionizada de 19,8 mL (volume morto da

instalação); concentrado (C); e, permeado (P). O produto final de interesse neste trabalho corresponde

à fracção de permeado.

4.1. Selecção dos parâmetros de operação A optimização da operação de UF significa o seu funcionamento em condições de minimização da

polarização de concentração. A Equação 6 permite prever o seu controle através do fluxo de

permeação, Jp, e do coeficiente de transferência de massa, k, da superfície da membrana para a

solução de alimentação em circulação adjacente a esta. O valor máximo de k é estabelecido através

da velocidade máxima de circulação da alimentação e corresponde ao caudal máximo de recirculação

permitido pelo equipamento, 0,79 L/min. A este caudal, os fluxos de permeação de um vinho branco

produzido na Adega Experimental do ISA na vindima de 2016, na gama alargada de pressões

transmembranares de 0 a 5 bar, estão representados na Figura 14.

44

Figura 14: Fluxos de permeação em função da pressão transmembranar para o vinho branco.

Através da análise da Figura 14, verificou-se a existência de três zonas distintas: zona de baixas

pressões (0 – 1,5 bar), onde Jp varia linearmente com ΔP e com declive de 18,2 kg/(m2 h bar); zona não

linear para pressões intermédias (1,75 – 3,75 bar); e, zona de altas pressões (4 – 5 bar), onde se

verificou de novo linearidade de Jp vs. ΔP com um declive de 3,92 kg/(m2 h bar).

A pressão transmembranar de trabalho foi seleccionada na zona em que os fluxos de permeação

variaram linearmente com a pressão transmembranar de 0 a 1,5 bar, nomeadamente, à pressão

transmembranar de 1,2 bar, 20% abaixo do limite superior desta zona. O fluxo correspondente fluxo de

permeação é de 22 kg/(m2 h bar).

O caudal de recirculação de 0,79 L/min e a pressão operatória de 1,2 bar asseguram a minimização

da polarização de concentração.

4.2. Fluxos de permeação dos vinhos brancos

Durante os ensaios de UF de cada um dos vinhos em estudo, foram medidos nas condições acima

seleccionadas os fluxos de permeado, sendo esses valores apresentados na Tabela 13.

Tabela 13: Fluxos de permeação dos vinhos brancos utilizados nos ensaios de UF à pressão transmembranar

de 1,2 bar e à velocidade de recirculação de 0,79 L/min.

Fluxos de permeado [kg/(h m2)]

Viosinho 26,2

Lote 24,5

Moscatel Graúdo 23,3

Verificou-se que os fluxos de permeação apresentaram valores semelhantes para os três vinhos

brancos em estudo.

4.3. Estabilidade proteica das fracções de ultrafiltração dos vinhos brancos

A avaliação da estabilidade proteica dos vinhos brancos consistiu na realização de dois tratamentos

térmicos já referidos: o teste térmico com avaliação da turbidez e o teste térmico com adição de taninos

e avaliação da absorvância. Os resultados das leituras de turbidez e absorvância apresentam-se no

y = 18,201xR² = 0,8749

y = -1,58x2 + 14,517x + 7,5633R² = 0,9965 y = 3,9233x + 26,039

R² = 0,9858

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 1 2 3 4 5 6

Jp

(kg

m¯²

h¯¹)

ΔP (bar)

Baixas pressões

Pressões intermédias

Altas pressões

Linear (Baixaspressões)

Polinomial (Pressõesintermédias)

Linear (Altaspressões)

45

Anexo F. Na Tabela 14, apresenta-se sumariamente os resultados dos dois testes de avaliação da

estabilidade proteica.

Tabela 14: Estabilidade proteica das fracções de UF: teste térmico com avaliação da turbidez, teste térmico com

adição de taninos e avaliação da absorvância.

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

A.I. C. P. A.I. C. P. A.I. C. P.

Teste térmico - 0,1

estável 2,1

instável 0,1

estável

3,6

instável 4,7

instável 0

estável

4,3

instável 2,8

Instável 0,9

estável

Teste térmico com adição de taninos

0,50 instável

0,48 instável

0,48 instável

0,46

instável 0,35

instável 0,37

instável

0,87

instável 0,44

Instável 0,72

instável

(A.I. – Alimentação Inicial; C. – Concentrado; P. – Permeado) Os valores apresentados correspondem à diferença das leituras de turbidez (NTU) e absorvância (u.a.) para os

testes térmico e térmico com adição de taninos, respectivamente.

A partir dos resultados apresentados na Tabela 14 verificou-se que os testes de estabilidade proteica

não conduziram às mesmas conclusões relativamente à estabilidade proteica das fracções de UF. Mais

concretamente, o teste térmico indicou que após processamento por UF as fracções de permeado se

encontravam estáveis sob o ponto de vista proteico. Contrariamente, o teste térmico com adição de

taninos indicou que após processamento por UF as fracções de permeado se encontravam instáveis

sob o ponto de vista proteico. Relativamente aos vinhos antes do processamento por UF, ou seja, à

fracção de AI, verificou-se que todos os vinhos se encontravam instáveis à excepção do resultado

obtido para a fracção de AI do vinho Viosinho, que se encontrava estável sob o ponto de vista proteico

segundo o teste térmico. Este resultado poderá indicar que o vinho Viosinho estabilizou de forma natural

durante o período da primeira avaliação até à execução dos ensaios de UF.

Sarmento et al. (2000a) estudaram a influência de factores intrínsecos nos testes de avaliação de

estabilidade proteica convencionais. Para a mesma amostra de vinho, aplicaram o teste térmico

avaliado pelo desenvolvimento da turvação após aquecimento e o teste térmico com adição de tanino.

Estes autores constataram que no primeiro o desenvolvimento de turvação no vinho dependia apenas

do conteúdo proteico total, concluindo que este teste demonstra ser um indicador adequado para a

determinação da concentração do agente de colagem necessário à remoção das proteínas do vinho

causadoras de turvação. Em relação ao teste térmico com tanino, constataram que para um vinho com

teor de proteínas totais acima de 70 mg/L, este teste é influenciado por muitos factores, tais como: pH,

teor de proteínas totais e teor em ferro, potássio e cobre, o que pode indicar uma interacção mais

complexa entre estes factores. Este estudo vem em concordância com os trabalhos desenvolvidos na

área, que indicam a obtenção de diferentes resultados para os diferentes testes.

Hsu et al. (1987b) estudaram a aplicação de UF usando membranas com MWCO entre

10000 – 30000 Da. Nas condições experimentais deste estudo não sendo alcançada a estabilidade

proteica, o processamento por UF conduziu a uma redução de 80 – 95 % da dose de bentonite

necessária para a estabilização proteica do vinho.

46

4.4. Caracterização físico-química geral das fracções de ultrafiltração dos vinhos e influência do

processo nesses parâmetros

A caracterização físico-química geral das fracções de UF de cada um dos vinhos em estudo é

apresentada na Tabela 15, Para cada parâmetro o valor apresentado corresponde à média de duas

leituras independentes acompanhado do respectivo desvio padrão. Na Tabela 15, apresenta-se

também informação relativa ao efeito do processo de UF nas características físico-químicas das

fracções de UF dos vinhos. No Anexo H apresentam-se os valores p-value resultantes da análise de

variância que permitiram concluir sobre o efeito da UF em todos os parâmetros para cada vinho.

Os resultados indicam a concentração dos compostos na fracção de Alimentação Inicial após o

ensaio de UF em todos os vinhos, com excepção para os parâmetros massa volúmica a 20 ºC e ácido

málico (todos os vinhos), cloretos (Viosinho e Lote), cinzas (Lote), ácido tartárico (Lote e Moscatel

Graúdo), pH e acidez volátil (Moscatel Graúdo).

Era expectável que assim ocorresse, uma vez que as macromoléculas com MM superior ao limite

de exclusão molecular da membrana foram retidas pela mesma, conduzindo à concentração destas no

tanque de alimentação (fracção C). De modo análogo, era esperado um decréscimo na concentração

de moléculas com MM inferior ao MWCO da membrana. Os ensaios de UF foram realizados com

remoção constante de permeado e com o volume de vinho dentro do tanque de alimentação sempre

superior a 470 mL, uma vez que o volume inicial de 500 mL era reposto com vinho sempre que uma

amostra de 30 mL de permeado era retirada (vide Capítulo III. 4. Ensaios de Ultrafiltração do vinho).

No que diz respeito ao vinho Viosinho, verificou-se que a UF teve efeito significativo no teor em

substâncias redutoras e teve efeito muito significativo no teor alcoólico, extracto seco, acidez total,

acidez volátil e ácido málico. Para os parâmetros em que se observou efeito muito significativo,

verificou-se uma evidente concentração da alimentação após o ensaio de UF, à excepção do ácido

málico que terá permeado através da membrana. As diferenças entre as fracções de AI e P do vinho

Viosinho nos parâmetros para os quais a análise estatística demonstrou que a UF teve um efeito

significativo foram de 0,5% (teor alcoólico), 2,3% (extracto seco), 16% (substâncias redutoras), 0,4%

(acidez total), 1,6% (acidez volátil) e 16% (ácido málico).

Para o vinho Lote, verificou-se que a UF teve efeito significativo na massa volúmica e teve efeito

muito significativo no teor alcoólico. A diferença entre as fracções AI e P nestes parâmetros foi de 0,03%

e 1,4%, respectivamente.

Em relação ao vinho Moscatel Graúdo, a operação de UF teve um efeito significativo na massa

volúmica, teor em substâncias redutoras e sulfatos, e teve efeito muito significativo no teor alcoólico,

extracto seco e acidez total. Tendo-se, de igual modo, verificado uma evidente concentração da

alimentação após o ensaio de UF, nos parâmetros cujo efeito da UF foi significativo. As diferenças entre

as fracções de AI e P do vinho Moscatel Graúdo nos parâmetros para os quais a análise estatística

demonstrou que a UF teve um efeito significativo foram de 0,02% (massa volúmica), 1,3% (teor

alcoólico), 0,5% (extracto seco), 8,6% (substâncias redutoras), 0,4% (acidez total), 0,4% (sulfatos).

Discutindo agora o efeito da UF parâmetro a parâmetro, em relação à massa volúmica observou-se

efeito significativo da UF nos vinhos Lote e Moscatel Graúdo, com diferenças significativas entre a AI,

que apresentou um valor mais elevado, e as fracções C e P. Para os mesmos vinhos anteriormente

47

referidos, o teor alcoólico da fracção P é estatisticamente superior ao teor alcoólico da fracção AI,

evidenciando a permeação de etanol através da membrana.

O extracto seco total engloba todas as substâncias presentes no vinho que não volatilizam, incluindo

os açúcares redutores. Relativamente ao efeito da UF, observou-se um comportamento semelhante

em todos os vinhos analisados: teor da fracção P inferior ao da fracção AI e a concentração da fracção

C em relação à AI. Considerando o efeito da UF na qualidade do produto final, fracção P, constata-se

que para os vinhos Viosinho e Moscatel Graúdo, nos quais a análise estatística demonstrou um efeito

muito significativo da UF, houve uma redução de 0,5 g/L e de 0,1 g/L, respectivamente, no extracto

seco da fracção P em relação à AI. Relativamente ao vinho Lote, no qual a análise estatística demonstra

que a UF não teve efeito significativo, houve uma redução de 0,3 g/L no extracto seco do vinho tratado

(permeado) em relação à AI. Esta observação foi indicativa de que apesar do resultado da análise

estatística, a UF pode não apresentar um efeito negativo na qualidade do vinho, sendo necessária uma

avaliação sensorial do produto final para essa avaliação.

As substâncias redutoras são constituídas pelo conjunto dos açúcares de função cetónica ou

aldeídica. Em relação a este parâmetro observou-se um efeito significativo da da UF nos vinhos

Viosinho e Moscatel Graúdo, com diferenças significativas entre as fracções AI e C, que apresentaram

valores mais elevados, e a fracção P, o que evidencia a retenção de alguns açúcares pela membrana.

A acidez total corresponde à concentração analítica da totalidade de ácidos presentes no vinho e

engloba os ácidos orgânicos voláteis e não voláteis e os ácidos não ionizados. As massas moleculares

destes ácidos com valores muito inferiores ao limite de exclusão molecular da membrana (Tabela 4),

permeiam através desta e, consequentemente, as fracções de AI e P não apresentam diferenças

significativas, conforme foi verificado na Tabela 15. Verificou-se que a UF teve um efeito significativo

na acidez total dos vinhos Viosinho e Moscatel Graúdo, com diferenças significativas entre a fracção C,

que apresenta um valor mais elevado, e as fracções AI e P.

A acidez volátil contempla o ácido acético e os ácidos carboxílicos alifáticos da série acética, que

apresentam MM relativamente baixos (Tabela 4) quando comparados com o MWCO da membrana.

Posto isto, era esperado que a acidez volátil não apresentasse diferenças entre o vinho inicial e o vinho

tratado, fracções AI e P, respectivamente, como foi constatado. A operação de UF mostrou ter efeito

muito significativo neste parâmetro no que diz respeito ao vinho Viosinho, com diferenças significativas

entre a fracção C, que apresenta um valor superior, e as fracções AI e P.

Verificou-se que os valores obtidos de pH para as fracções de UF dos vinhos em estudo estão de

acordo com os valores apresentados na literatura para vinhos brancos, que apresentam valores de pH

na gama 3,1 – 3,4 (Ribéreau-Gayon et al., 2006). A análise estatística demonstrou que a UF não teve

efeito significativo no pH dos vinhos em estudo.

As cinzas constituem a composição mineral dos vinhos. Verificou-se que a operação de UF não teve

efeito significativo no teor em cinzas para os vinhos em estudo, tal como seria esperado, uma vez que

a MM dos compostos minerais é muito inferior ao MWCO da membrana, permeando através da mesma.

48

Tabela 15: Caracterização geral das fracções de UF.

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

Efeito

UF AI C P

Efeito UF

AI C P Efeito

UF AI C P

Massa volúmica

a 20 C (g/mL) n.s. 0,9922 0,9920 0,9921 * 0,9909 a 0,9905 b 0,9906 b * 0,9887 a 0,9886 b 0,9885 b

Teor alcoólico a

20 °C (%v/v) ** 10,92 (0,01) b 11,23 (0,02) a 10,86 (0,03) b ** 11,40 (0,01) c 11,73 (0,02) a 11,56 (0,01) b ** 12,65 (0,02) c 13,00 (0,01) a 12,81 (0,01) b

Extracto seco (g/L)

** 21,5 b 22,2 (0,1) a 21,0 c n.s. 19,6 (0,2) 19,8 (0,1) 19,3 (0,1) ** 17,8 (0,1) b 18,6 (0,1) a 17,7 b

Substâncias redutoras (g/L)

* 2,5 (0,1) a 2,6 (0,1) a 2,1 (0,1) b n.s. 1,77 (0,01) 1,8 (0,1) 1,59 (0,03) * 1,97 (0,02) a 2,1 (0,1) a 1,80 (0,02) b

Acidez total (g ác. tartárico/L)

** 5,63 (0,02) b 5,7 a 5,65 (0,01) b n.s. 5,55 (0,03) 5,60 (0,01) 5,56 (0,04) ** 4,52 (0,02) b 4,7 a 4,5 b

Acidez volátil (g ác. acético/L)

** 0,315 (0,007) b 0,35 a 0,32 b n.s. 0,24 (0,01) 0,25 0,24 n.s. 0,34 (0,01) 0,34 0,34 (0,01)

pH n.s. 3,20 (0,02) 3,217 (0,001) 3,22 n.s. 3,11 (0,01) 3,110 (0,001) 3,12 (0,03) n.s. 3,16 3,149 (0,001) 3,14 (0,01)

Cinzas (g/L) n.s. 1,79 (0,01) 1,87 (0,06) 1,92 (0,03) n.s. 1,8 (0,2) 1,66 (0,04) 1,7 (0,1) n.s. 1,67 (0,02) 1,74 (0,01) 1,72 (0,04)

Ácido tartárico (g/L)

n.s. 2,05 (0,08) 2,08 (0,01) 2,11 (0,08) n.s. 1,7 (0,1) 1,6 (0,1) 1,7 (0,1) n.s. 1,11 (0,06) 1,1 1,06 (0,02)

Ácido málico (g/L)

** 0,88 (0,02) b 0,88 (0,02) b 1,05 (0,03) a n.s. 1,1 (0,1) 1,1 (0,1) 1,08 (0,01) n.s. 0,64 (0,05) 0,59 (0,04) 0,66 (0,01)

Sulfatos (mg/L) n.s. 459 (3) 471 (2) 451 (10) n.s. 508 (4) a 509 (13) a 480 (1) b * 530 (10) b 558 (2) a 532 (4) b

Cloretos (mg/L) n.s. 41 41 41 n.s. 40 (1) 38 39 (1) n.s. 35 36 35

(UF – Ultrafiltração; AI – Alimentação inicial; C – Concentrado; P – Permeado; * - efeito significativo, para p-value<0,05; ** - efeito muito significativo, para p-value<0,01; n.s. – efeito não significativo, para p-value>0,05)

Os valores apresentados correspondem à média de duas réplicas independentes e as barras ao respectivo desvio padrão. Valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes ao nível de significância 0,05.

49

A operação de UF demonstrou não ter efeito significativo no teor em ácido tartárico, uma vez que

este ácido apresenta uma massa molecular de 150 Da, era esperado que a sua concentração nas

fracções AI e P não apresentasse grandes diferenças e, consequentemente, que a operação de UF

não tivesse efeito significativo neste parâmetro, tal como foi observado. O mesmo comportamento era

expectável ser observado para o teor de ácido málico, que apresenta MM de 134 Da. Através da análise

estatística, constatou-se que a operação de UF não teve efeito significativo no teor em ácido málico

dos vinhos Lote e Moscatel Graúdo, no entanto esta operação mostrou ter efeito muito significativo no

vinho Viosinho, tendo sido observado uma diferença significativa entre a fracção P, que apresenta um

resultado superior, e as fracções de AI e C, evidenciando a permeação preferencial de ácido málico

através da membrana.

Para o teor em sulfatos, verificou-se que a operação de UF não teve efeito significativo nos vinhos

Viosinho e Lote, embora no último tenha sido observada uma diferença significativa entre as fracções

AI e C, que apresentaram valores superiores, e a fracção P. Para o mesmo parâmetro, observou-se

efeito significativo da UF no vinho Moscatel Graúdo, com diferença significativa entre a fracção C, que

apresenta maior teor em sulfatos, e as fracções AI e P. Era esperado que o teor de sulfatos fosse

semelhante nas fracções AI e P, uma vez que estes compostos apresentam massas moleculares

reduzidas, permeando através da membrana.

Relativamente ao teor em cloretos, verificou-se que este parâmetro não sofreu grande alteração

durante a realização dos ensaios de UF dos três vinhos estudados. Este resultado era esperado uma

vez que a massa molecular deste composto (35 Da) é muito inferior ao MWCO da membrana.

De um modo geral, conclui-se que a UF exerceu menor influência nas características físico-químicas

gerais no vinho Lote, comparativamente com os restantes vinhos, tendo esta operação apenas efeito

muito significativo no teor alcoólico. Relativamente ao vinho Moscatel Graúdo, dos parâmetros em que

a UF teve efeito muito significativo, estatisticamente apenas é verificada diferença significativa ao nível

de significância de 0,05 entre as fracções AI e P, correspondentes ao vinho inicial e ao vinho tratado,

respectivamente, para os parâmetros teor alcoólico e substâncias redutoras. A mesma análise feita ao

vinho Viosinho, leva à conclusão de que, apenas é verificada diferença significativa antes e após o

tratamento no teor de extracto seco e substâncias redutoras, sendo que no primeiro a UF apresentou

um efeito muito significativo e no segundo a mesma operação apresentou um efeito significativo. De

forma a concluir acerca da influência da operação de UF na qualidade dos vinhos filtrados seria

necessário uma avaliação sensorial dos mesmos.

4.4.1. Turbidez

Na Figura 15 apresentam-se os resultados relativos à avaliação da turbidez das fracções de UF, para

cada um dos vinhos. Os valores apresentados correspondem à média de duas leituras independentes

e respectivos desvio padrão, sendo estes valores apresentados no Anexo G.

50

Figura 15: Turbidez das fracções de UF para os vinhos brancos. (AI – Alimentação inicial; C – Concentrado; P – Permeado)

Os valores apresentados correspondem à média de duas réplicas independentes e as barras ao respectivo desvio padrão.

Valores com a mesma letra não são significativamente diferentes ao nível de significância 0,05.

A turbidez é medida por avaliação do distúrbio causado na difusão da luz pelo contacto com partículas

num líquido. Este parâmetro pode ser associado a uma inspecção visual que resulta na classificação

de um vinho branco como brilhante ou turvo, apresentando para estas classificações valores de turbidez

abaixo de 1,1 NTU e acima de 4,4 NTU, respectivamente (Ribéreau-Gayon et al., 2006).

Verificou-se que a turbidez teve um comportamento semelhante em todas as fracções de UF, ou

seja, existiu concentração da alimentação, observada pela diferença entre as fracções de AI e C, e

verificou-se também que a turbidez obtida no vinho tratado (permeado) foi muito inferior à fracção AI

para os três vinhos, atingindo valores de 2,1 (Viosinho), 1,7 (Lote) e 1,7 NTU (Moscatel Graúdo). A

classificação dos vinhos Viosinho, Lote e Moscatel Graúdo após o tratamento situa-se entre vinho

brilhante (< 1,1 NTU) e vinho turvo (> 4,4 NTU).

Os resultados indicam um efeito muito significativo da UF na turbidez final dos três vinhos, sendo

as fracções de UF todas diferentes ao nível de significância 0,05 para todos os vinhos (ver Figura 15).

Através da análise de variância, verificou-se que as fracções de UF são significativamente diferentes

para qualquer um dos três vinhos.

A Figura 16 serve de exemplo ilustrativo da turbidez nas diferentes fracções de UF, uma vez que

resultados semelhantes foram verificados para os três vinhos em estudo.

Pode ser observada uma cor mais intensa das fracções de alimentação e concentrado, AI e C, em

relação ao permeado, P, o que era expectável uma vez que a turvação é resultado da aglomeração de

partículas em suspensão. Quando comparado o aspecto visual das fracções de AI e C, também pode

ser observada maior intensidade de turvação para a fracção C em relação à AI, o que era mais uma

vez expectável uma vez que existiu concentração de macromoléculas, nomeadamente proteínas.

b

b

b

a

a

a

c c c

0

10

20

30

40

50

60

70

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

Tu

rbid

ez (

NT

U)

AI C P

51

Figura 16: Gradação de cor das fracções de UF recolhidas do vinho Viosinho.

Da esquerda para a direita: Alimentação Inicial, Concentrado e Permeado.

4.4.2. Teor em Proteínas Totais

Na Figura 17 apresenta-se a concentração em proteínas totais para cada vinho e fracção de UF, sendo

os valores correspondentes à média de seis determinações e respectivo desvio padrão (Anexo G).

Figura 17: Teor em Proteínas Totais nas fracções de UF de cada vinho. (AI – Alimentação inicial; C – Concentrado; P – Permeado)

Os valores apresentados correspondem à média de seis réplicas independentes e as barras ao respectivo desvio padrão.

Valores com a mesma letra não são significativamente diferentes ao nível de significância 0,05.

Através da análise de variância, observou-se um efeito significativo da UF no teor em proteínas dos

vinhos, tendo sido observada uma diferença significativa entre as alimentações e os permeados de

todos os vinhos, fracções AI e P. Verificou-se que não existiram diferenças significativas entre as

fracções de AI e C dos vinhos Viosinho e Lote, embora no caso do vinho Moscatel existiram diferenças

significativas entre todas as fracções de UF.

Salienta-se as diferenças apresentadas em relação aos teores em proteínas totais das fracções AI

e C, observadas para cada vinho, referentes às seis determinações independentes realizadas pelo

método de Bradford. Estas diferenças poderão ser justificadas pela presença de interferentes ao

método (vide Capítulo II.1.2.1 Proteínas. Determinação do Teor Total em Proteínas), como polifenóis,

que reagem com as proteínas, impedindo a formação de complexos proteína-corante e consequente

detecção dos mesmos pelo método espectrofotométrico.

a

a

b

a

a

a

b b c

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

Teo

r d

e p

rote

ína

s t

ota

is (

mg

/L) AI C P

52

Após o processamento por UF, o teor de proteínas totais na corrente de permeado foi de 5 mg/L,

aproximadamente. Hsu et al.(1987b) observaram teores de proteínas totais no vinho após UF com

membranas de MWCO de 10, 30 e 50kDa dentro da gama de 3 – 20 mg/L. Os resultados obtidos estão

de acordo com o estudo realizado por estes autores.

Para todos os vinhos, os permeados de UF apresentaram estabilidade sob o ponto de vista proteico,

com base nos resultados do teste térmico com avaliação da turbidez.

Estudos desenvolvidos por Peng et al. (1997) e Esteruelas et al. (2009b), com vinhos da casta

Sauvignon Blanc, revelaram predominância de proteínas com MM entre 12 – 24 kDa. No entanto, as

proteínas com MM na ordem dos 25 – 72 kDa mostraram ser termicamente instáveis. Hsu e Heatherbell

(1987b) identificaram as fracções proteicas de 12,6 kDa e 20 – 30 kDa como sendo as mais importantes

na contribuição da instabilidade proteica de vinhos brancos. Recentemente, Bruijn et al. (2011)

estudaram o impacto da composição proteica na estabilidade de vinhos brancos e concluíram que nos

vinhos brancos em estudo, as fracções entre 18 – 60 kDa estavam relacionadas com o problema de

casse proteica.

4.4.3. Teor em Polissacáridos Totais

Na Figura 18 apresentam-se os teores em polissacáridos totais determinados experimentalmente. Os

valores apresentados correspondem à média de duas determinações independentes e respectivo

desvio padrão. A análise de variância dos dados revelou efeito significativo da UF no teor de

polissacáridos totais do vinho Lote e efeito muito significativo no caso dos vinhos Viosinho e Moscatel

Graúdo.

Figura 18:Teor em Polissacáridos Totais nas fracções de UF de cada vinho. (AI – Alimentação inicial; C – Concentrado; P – Permeado)

Os valores apresentados correspondem à média de duas réplicas independentes e as barras ao respectivo desvio padrão.

Valores com a mesma letra não são significativamente diferentes ao nível de significância 0,05.

Na Figura 18, observa-se que os vinhos Lote e Moscatel Graúdo apresentaram um comportamento

semelhante quando submetidos a UF, uma vez que o teor em polissacáridos totais dos permeados é

inferior ao teor da fracção AI, e verifica-se também um decréscimo da concentração da fracção C em

a

a a

a

bbb

b

c

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

Teo

r d

e P

oli

ssacári

do

s T

ota

is

(mg

/L)

AI C P

53

relação à fracção AI. Para o vinho Viosinho, observa-se uma grande diferença entre o vinho tratado

(permeado) e a fracção AI, sendo os teores aproximados nas fracções AI e C.

A análise estatística mostrou que para todos os vinhos os permeados são significativamente

diferentes da fracção AI. Tratando-se de macromoléculas, era expectável que as concentrações no

vinho tratado fossem significativamente mais baixas, quando comparadas com a alimentação de UF.

Devido ao facto de a membrana apresentar num valor para MWCO de 45 kDa (valor obtido

experimentalmente), garante-se que os polissacáridos de elevada massa molecular são removidos,

permanecendo na fracção de concentrado, o que pode resultar na remoção de manoproteínas

(53 – 560 kDa), que como já foi mencionado anteriormente, actuam como colóides protectores na

estabilidade proteica dos vinhos.

4.4.4. Índice de Fenóis Totais

Na Figura 19 apresentam-se os resultados obtidos para o índice de fenóis totais respectivo a cada

fracção de UF e para cada vinho em estudo. Na determinação deste parâmetro foram realizadas duas

réplicas independentes, sendo o valor apresentado a média desses valores e correspondente desvio

padrão.

Figura 19: Índice de Fenóis Totais nas fracções de UF de cada vinho.

(AI – Alimentação inicial; C – Concentrado; P – Permeado)

Os valores apresentados correspondem à média de duas réplicas independentes e as barras ao respectivo desvio padrão.

Valores com a mesma letra não são significativamente diferentes ao nível de significância 0,05.

Observou-se efeito muito significativo da UF no índice de fenóis totais dos três vinhos.

Através da análise estatística, constatou-se que o vinho tratado (permeado) apresentou uma

diferença significativa do vinho antes do tratamento (alimentação de UF) no índice de fenóis totais, IFT,

para os três vinhos em estudo.

O IFT relaciona-se com o teor de fenóis totais presentes no vinho, e, desta forma, concluiu-se que

a operação de UF promoveu uma diminuição do teor total de fenóis no vinho, o que não era esperado

uma vez que a MM dos compostos que constituem este grupo, nomeadamente os taninos que

apresentam MM entre 600 – 3500 Da (Ribéreau-Gayon et al., 2006), é inferior ao valor do MWCO da

membrana.

b

b

b

a

a

a

c

c

c

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

Índ

ice d

e F

en

óis

To

tais

AI C P

54

A presença de compostos fenólicos, nomeadamente taninos, contribui para o fenómeno de casse

proteica, uma vez que estes compostos floculam com as proteínas, podendo levar à sua precipitação.

No estudo de Batista et al. (2009) foram realizados testes térmicos a um vinho branco da casta Arinto

de forma a compreender o fenómeno complexo de precipitação proteica. Estes autores, ao avaliarem

o vinho após UF com uma membrana de MWCO de 3 kDa, concluíram que a fracção correspondente

ao permeado (< 3 kDa) continha componentes de baixa MM com um papel muito importante na

instabilidade proteica. O factor X, como foi denominado, foi definido como sendo um ou mais

constituintes do vinho de natureza não proteica e de baixa MM, cuja presença promoveria a

desnaturação das proteínas induzida por calor, a valores de pH normais do vinho. Considerando o

resultado do teste térmico realizado no presente trabalho (Tabela 14), a fracção de UF do permeado

contém os compostos de natureza proteica que formam o factor X, no entanto o resultado deste teste

térmico para os três vinhos resulta em três vinhos estáveis sob o ponto de vista proteico após a

operação de UF, que pode ser explicado pela diferença no teor em proteínas totais das fracções de P

dos vinhos em estudo (Viosinho, Lote e Moscatel Graúdo) ser muito inferior (cerca de 5 mg/L) ao

conteúdo proteico do vinho Arinto adicionado à fracção < 3 kDa (280 mg/L) no estudo de Batista et al.

(2009).

4.5. Remoção das macromoléculas

O objectivo da clarificação de um vinho é a remoção de partículas em suspensão e solução coloidal,

responsáveis pela turvação. A operação de UF permitiu a clarificação dos vinhos e, como se pode

verificar pela Figura 17 acima referida, conseguiu-se de facto uma redução visível da turbidez do vinho.

Tendo em vista a quantificação da remoção de macromoléculas durante a clarificação dos vinhos,

foram determinados os teores totais de proteínas e polissacáridos, o índice de fenóis e a turbidez. Na

Tabela 16 apresenta-se a remoção das macromoléculas após a UF dos vinhos em estudo.

A análise da operação de UF na remoção de macromoléculas dos vinhos brancos Viosinho, Lote e

Moscatel Graúdo foi realizada por comparação do produto inicial, que corresponde à fracção da

alimentação inicial, com o produto final, que corresponde à fracção de permeado.

Tabela 16: Remoção das macromoléculas após ensaios de ultrafiltração à pressão transmembranar de 1,2 bar e

à velocidade de recirculação de 0,79 L/min.

Vinhos Turbidez (NTU) Teor de Proteínas

Totais (mg/L)

Teor de Polissacáridos Totais

(mg/L)

Índice de Fenóis

Totais

AI P Redução

(%) AI P

Remoção (%)

AI P Remoção

(%) AI P

Remoção (%)

Viosinho 46 2,1 95,5 54,9 5,9 89,3 361 106 70,7 6,4 5,7 11,3

Lote 17 1,7 89,9 119,2 5,5 95,4 155 53 65,8 4,0 3,7 6,6

Moscatel Graúdo 4,7 1,7 64,5 82,3 5,4 93,5 153 90 41,1 2,5 2,4 6,2

(AI – alimentação inicial, que corresponde ao vinho inicial antes da clarificação; P – permeado, que corresponde ao vinho clarificado)

A turbidez é um parâmetro muito importante na clarificação de um vinho branco. Através da análise da

Tabela 16, concluiu-se que a operação de UF teve uma grande eficiência na clarificação dos vinhos,

nomeadamente nos vinhos Lote e Viosinho, cuja turbidez após UF foi reduzida em 89,9 e 95,5 %,

55

respectivamente. O vinho Moscatel Graúdo apresentou uma redução de turbidez de 64,5 %, mas

embora este valor seja inferior aos valores obtidos para os outros dois vinhos, o vinho Moscatel era o

que apresentava um menor valor de turbidez inicial (4,7 NTU), sendo esta reduzida após a clarificação

e tomando um valor da mesma ordem de grandeza dos valores obtidos para os vinhos Viosinho e Lote.

Feuillat (1987) afirmou que a turbidez do vinho é causada por material suspenso, como resíduos

das leveduras e compostos macromoleculares com comportamento coloidal. A remoção de 95,5 % das

partículas que contribuem para a turbidez no vinho Viosinho indica que o material suspenso

responsável pela turvação neste vinho tem, praticamente todo, massa molecular superior ao valor do

limite de exclusão molecular da membrana. De modo análogo, se conclui o mesmo para os vinhos Lote

e Moscatel Graúdo.

A remoção de proteínas nos três vinhos brancos em estudo conduziu a teores finais semelhantes

no vinho processado (permeado) de cerca de 5 mg/L. As percentagens de remoção obtidas nos vinhos

em estudo indicaram que entre 89 e 95 % das proteínas foram eliminadas.

No que diz respeito à remoção de polissacáridos totais, verificou-se uma remoção de 70,7; 65,8 e

41,1 % para os vinhos Viosinho, Lote e Moscatel Graúdo, respectivamente. Os valores de remoção

observados no que diz respeito a estas macromoléculas foram inferiores aos resultados obtidos noutros

estudos, como no estudo de Escudier et al. (1987), onde foi reportada uma remoção de 92 % de teor

em polissacáridos totais de um vinho clarificado por UF com uma membrana de 20 kDa. No estudo de

Gonçalves et al. (2001) foi reportada uma remoção de 16 % do teor em polissacáridos totais na

clarificação de um vinho branco por UF com uma membrana de 100 kDa.

Pela análise do índice de fenóis totais, concluiu-se que a concentração em fenóis totais do vinho

clarificado diminuiu, quando comparada com a concentração no vinho inicial.

57

V. Conclusões e perspectivas de trabalho futuro

O presente trabalho incidiu sobre a aplicação da UF para clarificação e estabilização proteica de vinhos,

como alternativa à colagem com bentonite, cujas desvantagens são conhecidas.

Para tal foram realizados ensaios experimentais com uma membrana seleccionada de acordo com

o estado actual de conhecimento, no que se refere às características das proteínas mais comumente

envolvidas na casse proteica. Em paralelo com a caracterização da membrana em termos de

permeabilidade hidráulica [44 kg/(m2 h bar)] e limite de exclusão molecular (45 kDa), foram investigadas

as condições de operação em termos de caudal de circulação e pressão transmembranar conducentes

à minimização da polarização de concentração, respectivamente de 0,79 L/min e 1,2 bar. Esta

optimização da UF foi realizada com um vinho branco que apresentava nas condições acima referidas

um fluxo de 22 kg/(m2 h bar).

Posteriormente foram processados, nas condições optimizadas de UF, vinhos brancos instáveis sob

o ponto de vista proteico. A selecção dos vinhos brancos para estes ensaios foi realizada através da

avaliação da estabilidade proteica pelo teste térmico com adição de taninos em seis vinhos brancos

(Arinto, Encruzado, Moscatel Galego, Moscatel Graúdo, Viosinho e Lote). Foram escolhidos os vinhos

Viosinho, Moscatel Graúdo e Lote, os três mais instáveis sob o ponto de vista proteico.

A instabilidade proteica destes três vinhos foi ainda confirmada através de um segundo teste

baseado na desnaturação térmica das proteínas e avaliação da turbidez, de maior aplicabilidade.

As fracções de UF, com destaque para o Permeado, correspondente ao vinho tratado, foram

caracterizadas em termos de composição físico-química geral, teor em polissacáridos totais, teor em

proteínas totais, índice de fenóis totais, estabilidade proteica e turbidez.

Como seria de esperar, envolvendo macromoléculas, foi observado efeito significativo da UF no teor

de polissacáridos totais, teor de proteínas totais, índice de fenóis totais e turbidez, parâmetros para os

quais foram encontrados valores significativamente mais baixos no vinho tratado (permeados).

Relativamente aos restantes parâmetros analíticos foi igualmente observado efeito significativo da

UF em algumas características da composição físico-química, de acordo com cada vinho. Entre estas,

verificou-se uma diferença entre as fracções de Alimentação e Permeado no teor em substâncias

redutoras nos vinhos Moscatel Graúdo e Viosinho de 8,6 e 16%, respectivamente, no teor de ácido

málico no vinho Viosinho de 16% e nos restantes parâmetros em que a UF teve um efeito significativo,

segundo a análise estatística, verificou-se uma diferença inferior a 3% entre estas fracções.

Quanto à estabilidade proteica dos vinhos, esta foi avaliada após UF nas fracções resultantes,

nomeadamente, alimentação inicial, concentrado e permeado, através do teste térmico com avaliação

da turbidez e do teste térmico com adição de taninos e avaliação da absorvância. Os resultados obtidos

para os dois testes nem sempre conduziram aos mesmos resultados, sendo que no teste térmico as

fracções de precipitado de todos os vinhos encontraram-se estáveis, enquanto no teste térmico com

adição de taninos as mesmas fracções se apresentaram instáveis. Estes resultados podem ser

explicados pela presença de potenciais interferentes, apresentados na bibliografia (Sarmento et al.,

2000a) e porque os testes se baseiam em princípios diferentes, que levam à preferência pela utilização

do teste térmico.

58

A operação de UF conduziu à clarificação dos vinhos brancos, sendo notável o decréscimo da

turbidez no vinho tratado relativamente à alimentação inicial, superior a 80%.

Conclui-se que a operação de UF é eficaz na clarificação dos vinhos brancos. No que diz respeito

à estabilidade proteica dos vinhos, este estudo constitui um significativo contributo, no entanto

considera-se necessário reunir mais informação acerca dos efeitos da UF, uma vez que esta operação

terá de assegurar que as características físico-químicas e sensoriais do vinho não sejam

significativamente alteradas e para esse fim, seria necessário realizar uma avaliação sensorial dos

vinhos após processamento por UF.

Com base nas conclusões anteriores os seguintes aspectos deverão ser objecto de trabalho futuro:

a) Perfil das macromoléculas removidas, polissacáridos e polifenóis, na estabilidade proteica.

b) Investigação dos mecanismos de floculação e precipitação de proteínas.

c) Não sendo possível em todas alcançar-se a estabilidade proteica dos vinhos, desenvolvimento

de um processo de tratamento envolvendo UF e colagem com bentonite.

O desenvolvimento de um processo envolvendo UF para estabilização proteica obrigará

necessariamente à avaliação do efeito do tratamento nas características físico-químicas e sensoriais

do vinho.

59

VI. Referências Bibliográficas

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69

VII. Anexos

A1

Anexo A: Características da membrana de UF, FS61PP (AlfaLaval)

Tabela 17: Características da membrana de UF, FS61PP (AlfaLaval).

Fonte: AlfaLaval.

FS61PP

Processo Ultrafiltração

Composição Fluoro polímero

MWCO 20 000

Gama pH 1 – 11

Pressão de trabalho (bar) 1 – 10

Temperatura (ºC) 0 – 60

Gama pH (limpeza) 1 – 11,5

Pressão de limpeza (bar) 1 – 5

Temperatura (limpeza) (ºC) 0 – 65

B1

Anexo B: Elementos adicionais sobre vinificação dos vinhos brancos

utilizados no estudo.

Tabela 18: Informações adicionais sobre a vinificação dos vinhos brancos.

Arinto Encruzado Moscatel Galego

Moscatel Graúdo

Viosinho Lote

Castas Monocasta Monocasta Monocasta Monocasta Monocasta Alvarinho, Arinto e Viosinho

Ano de colheita 2016

Duração da fermentação (dias)

16 15 15 13 14 -

Temperatura durante a fermentação (ºC)

18 18 24 – 25 23 – 24 18 -

C1

Anexo C: Curvas de calibração

As Figuras 20, 21 e 22 correspondem às rectas de calibração utilizadas dos solutos de referência PEG

10000, 20000 e 35000.

As Figuras 23 e 24 correspondem às rectas de calibração de BSA utilizadas na determinação do teor

em proteínas totais.

A Figura 25 corresponde à recta de calibração da glucose utilizada na determinação do teor em

polissacáridos totais.

Figura 20: Recta de calibração do PEG 10000. [PEG 10000](ppm) = 0,1959 × TOC(ppm), R2 = 0,9996

Figura 21: Recta de calibração do PEG 20000.

[PEG 20000](ppm) = 0,2051 × TOC(ppm), R2 = 0,9995

y = 0,1959xR² = 0,9996

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 1000 2000 3000 4000

Co

ncen

tração

PE

G 1

0000

(pp

m)

TOC (ppm)

y = 0,2051xR² = 0,9995

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Co

ncen

tração

PE

G 2

0000

(pp

m)

TOC (ppm)

C2

Figura 22: Recta de calibração do PEG 35000.

[PEG 35000](ppm) = 0,2014 × TOC(ppm), R2 = 0,99986

Figura 23: Curva de calibração da BSA - gama de altas concentrações.

A595(u. a. ) = 2 × 10−13 × [BSA]4(mg L⁄ ) − 8 × 10−10 × [BSA]3(mg L⁄ ) + 9 × 10−7 × [BSA]2(mg L⁄ ) + 0,0001 × [BSA](mg L⁄ ) , R2 = 0,9935

Figura 24: Curva de calibração da BSA - gama baixas concentrações.

A595(u. a. ) = −1 × 10−6 × [BSA]4(mg L⁄ ) + 1 × 10−4 × [BSA]3(mg L⁄ ) − 0,0028 × [BSA]2(mg L⁄ ) + 0,0521 × [BSA](mg L⁄ ) ,

y = 0,2014xR² = 0,9998

0

100

200

300

400

500

600

0 500 1000 1500 2000 2500

Co

ncen

tração

PE

G 3

5000

(pp

m)

TOC (ppm)

y = 2E-13x4 - 8E-10x3 + 9E-07x2 + 0,0001xR² = 0,9935

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 500 1000 1500 2000

A 5

95 n

m

[BSA] (mg/L)

y = -1E-06x4 + 1E-04x3 - 0,0028x2 + 0,0521xR² = 0,9923

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20 25

A 5

95 n

m

[BSA] (mg/L)

C3

R2 = 0,9923

Figura 25: Recta de calibração da Glucose.

A495(u. a. ) = 0,01147 × [Glucose](mg L⁄ )

y = 0,011147x

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Ab

so

rvân

cia

495 n

m

[Glucose] (mg/L)

D1

Anexo D: Determinação do volume morto da instalação de ultrafiltração

Celfa P-28

Figura 26: Recta de calibração do NaCl. [NaCl](g L⁄ ) = 4,769 × 10−4 × Condutividade(μS cm⁄ ), R2 = 0,99994

Tabela 19: Determinação do volume morto da instalação Celfa P-28: ensaio de UF em modo recirculação total da solução de NaCl 300 ppm à pressão transmembranar de 0,5 bar e velocidade de recirculação de 0,79 L/min.

Condutividade (μS/cm) Temperatura (ºC) Concentração (g/L) Volume (mL)

Solução inicial 643 25,6 0,306 500,0

Solução final 618 27,0 0,295 519,8

y = 4,769E-04xR² = 9,994E-01

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 200 400 600 800 1000 1200

Co

ncen

tração

NaC

l (g

/L)

Conductividade (μS/cm)

E1

Anexo E: Determinação do MWCO da membrana FS61PP: condições

experimentais e concentração dos solutos de referência

Tabela 20: Condições experimentais obtidas na determinação do MWCO da membrana. Ensaio realizado à pressão transmembranar de 0,5 bar e à velocidade de recirculação de 0,79 L/min.

PEG 10000 PEG 20000 PEG 35000

Temperatura da alimentação inicial (ºC) 23,0 23,0 24,0

Temperatura da alimentação antes permear e após 10 min de estabilização (ºC)

24,0 24,0 25,5

Temperatura da alimentação após tempo de permeação (ºC)

24,5 24,0 26,0

Tempo permeação (tp) (min) 13,6 14,9 14,4

Massa permeado (g) 9,73 9,00 8,93

Fluxo permeação (kg h-1 m-2) 16,8 14,2 18,6

Tabela 21: Determinação do TOC para os solutos de referência PEG 10000, 20000 e 35000.

PEG 10 000 PEG 20 000 PEG 35 000

TOC (ppm) Concentração (ppm) TOC (ppm) Concentração (ppm) TOC (ppm) Concentração (ppm)

C 2450 475,1 2442 502,7 2538 512,7

Cai 2316 448,4 2274 468,1 2356 476,0

Caf 2317 449,2 2300 473,3 2402 485,2

Cp 915,3 177,5 659,7 135,8 342,0 69,1

Onde C é a concentração da solução carregada na instalação de UF, Cai é a concentração da solução de alimentação inicial após 10 minutos de estabilização, Caf é a concentração da solução de alimentação no final do ensaio e Cp é a concentração

do permeado.

F1

Anexo F: Avaliação da estabilidade proteica dos vinhos – testes térmicos

Tabela 22: Estabilidade proteica das fracções de UF: teste térmico com avaliação da turbidez (NTU).

(AI – Alimentação Inicial; C – Concentrado; P – Permeado; T.T. – Tratamento térmico)

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

AI C P AI C P AI C P

Antes T.T. 9,9 ± 0,9 12,3 ± 3,4 1,8 ± 0,1 5,5 ± 0,5 6,3 ± 0,4 1,9 ± 0,4 2,7 ± 0,2 2,2 ± 0,1 1,8 ± 0,4

Após T.T. 9,8 ± 0,1 14,4 ± 0,2 1,9 ± 0,2 9,1± 1,4 11 ± 3 1,9 ± 0,1 7,0 ± 1,0 5,0 ± 0,4 2,7 ± 0,1

Diferença antes e após T.T.

- 0,1 2,1 0,1

3,6 4,7 0

4,3 2,8 0,9

Tabela 23: Estabilidade proteica das fracções de UF: teste térmico com adição de taninos e avaliação da absorvância (u.a.).

(AI – Alimentação Inicial; C – Concentrado; P – Permeado)

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

AI C P AI C P AI C P

Amostra sem tanino

0,022 ±

0,004

0,024 ±

0,001 0,029

0,014 ±

0,001

0,015 ±

0,001

0,023 ±

0,001

0,003 ±

0,001

0,003 ±

0,001

0,036 ±

0,001 Amostra com tanino

0,523 ±

0,002

0,504 ±

0,003

0,507 ±

0,001

0,476 ±

0,001

0,369 ±

0,002

0,396 ±

0,003

0,873 ±

0,003

0,742 ±

0,004

0,756 ±

0,005

Diferença entre amostras

0,501 0,480 0,478

0,462 0,354 0,373

0,870 0,439 0,720

G1

Anexo G: Turbidez, Teor de Proteínas Totais, Teor de Polissacáridos

Totais e Índice de Fenóis Totais das fracções de UF

Tabela 24: Leitura da Turbidez das fracções de UF.

(AI – Alimentação Inicial; C – Concentrado; P – Permeado)

Turbidez (NTU)

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

AI C P AI C P AI C P

46 ± 2 63 ± 1 2,1 ± 0,2 17 ± 1 23 ± 1 1,7 4,7 ± 0,1 6,6 ± 0,1 1,7 ± 0,2

Tabela 25: Teor de Proteínas Totais das fracções de UF obtido através do método de Bradford.

(AI – Alimentação Inicial; C – Concentrado P – Permeado)

Teor de Proteínas Totais (mg/L)

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

AI C P AI C P AI C P

54,9 ± 19,1 46,0 ± 20,6 5,9 ± 0,6 119,2 ± 24,4 135,2 ± 8,7 5,5 ± 0,2 82,3 ± 12,7 124,6 ± 4,3 5,4 ± 0,7

Tabela 26: Teor de Polissacáridos Totais das fracções de UF.

(AI – Alimentação Inicial; C – Concentrado; P – Permeado)

Teor de Polissacáridos Totais (mg/L)

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

AI C P AI C P AI C P

361 ± 21 360 ± 12 106 ± 8 155 ± 49 89 ± 7 53 ± 4 153 ± 2 115 ± 2 90 ± 8

Tabela 27: Índice de Fenóis Totais das fracções de UF.

(AI – Alimentação Inicial; C – Concentrado P – Permeado)

Índice de Fenóis Totais

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

AI C P AI C P AI C P

6,44 ± 0,01 6,9 ± 0,1 5,7 ± 0,1 4,0 ± 0,1 4,6 ± 0,2 3,73 ± 0,02 2,5 ± 0,1 2,77 ± 0,01 2,38 ± 0,02

H1

Anexo H: Análise de variância

Tabela 28: Análise estatística: p-values para os parâmetros da caracterização físico-química dos vinhos usados

nos ensaios de UF.

Efeito da Ultrafiltração

Viosinho Lote Moscatel Graúdo

Massa volúmica a 20 C n.d. 0,016655 0,033272

Teor alcoólico a 20 °C 0,000759 0,000299 0,000428

Extracto seco 0,000229 0,075338 0,001133

Substâncias redutoras 0,032151 0,221571 0,024910

Acidez total 0,005738 0,315284 0,002292

Acidez volátil 0,006189 0,464758 0,649519

pH 0,482675 0,866188 0,239806

Cinzas 0,096234 0,588077 0,126351

Ácido tartárico 0,737082 0,292316 0,278927

Ácido málico 0,007991 0,696999 0,271214

Sulfatos 0,105525 0,063113 0,038283

Cloretos n.d. 0,221290 n.d.

Turbidez 6,51x10-9 0,000078 0,000149

Teor em Proteínas Totais 0,004653 0,000001 1,47x10-8

Teor em Polissacáridos Totais 2,26x10-12 0,036833 0,000009

Índice de Fenóis Totais 4,67x10-9 0,000039 0,000047

(n.d. – não determinado; células a cinzento escuro – efeito muito significativo da Ultrafiltração (p-value<0,01);

células a cinzento claro – efeito significativo da Ultrafiltração (p-value<0,05);

células a branco – efeito não significativo da Ultrafiltração)