Vetores de Clonagem e de expressão BOM

7/28/2019 Vetores de Clonagem e de expresso BOM

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Tcnicos AnalisesClinicas

[email protected]


2/42

VETORES DE CLONAGEM

PCRSEQUENCIAMENTO


3/42


4/42

1970 - The Beginning of the Revolution

Descoberta de uma enzima de restrio em bactria

Haemophilus influenzae

1973 - ligao de fragmentos obtidos pela

clivagem com enzimas de restrio e ligao dos

mesmos com a enzima T4 DNA ligase (COHEN e

cols., 1973)


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FENOMENO DE RESTRIO MODIFICAO


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PRINCIPAIS CONCEITOS

CLONAGEM GNICA: isolamento, amplificao e purificao de um

gene ou de genes, a partir do material gentico de um dado

organismo

VETORES: veculos de clonagem que permitem que os fragmentosde DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em

uma clula hospedeira adequada

CLULA HOSPEDEIRA: clulas de fcil manipulao, crescimento

rpido e constituio gentica bem conhecida - ex: bactrias,

leveduras, clulas de cultura de tecidos de mamferos e insetos


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OBJETIVOS

DESENVOLVIMENTO DE MODELOS PARA:

Estudo da estrutura/funo de genes

Estudo da estrutura/funo de protenas

Produo de protenas recombinantes (importncia mdica)

Produo de organismos transgnicos

Melhoramento Gentico

Clonagem teraputica

Clonagem reprodutiva
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COMO FAZER???....

Isolamento

Amplificao

Digesto

Purificao do Fragmento alvo

Clonagem em vetores

Transformao de clulas hospedeiras e seleo dos clones

Replicao

Anlise

Expresso do DNA e da protena


9/42

ROMPIMENTO DAS BARREIRASENTRE AS ESPCIES

Possibilidade de reunir num s organismo qualidades de

seres diferentes:

ITAKURA e cols. (1977): conseguiu produzir interferon

humano em Escherichia coli

MULLIGAN e BERG (1980): xito obtido na expresso de

genes bacterianos em clulas de mamferos
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CLONAGEM GNICA

Gerar grande nmero de cpias de um determinado

DNA alvo

Insero de fragmentos de DNA em vetores

Replicao de vetores contendo o inserto Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores
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CLONAGEM GNICA

1. Clivagem do vetor e do DNA com enzimas de restrio

2. Ligao do vetor ao inserto

3. Replicao do vetor em clulas competentes

4. Purificao do inserto

1 2 3 4


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CARACTERSTICAS DOS VETORES DE DNA

Origem de replicao, que permite que sua replicaoindependentemente do cromossomo hospedeiro

Marca de seleo, que permite que as clulas contendo o vetor e o DNA inserido neste - sejam facilmente identificadas

Stios nicos para uma ou mais enzimas de restrio permiteque os fragmentos de DNA sejam inseridos em um local

definido dentro de um vetor, com as outras pores intactas


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CARACTERISTICAS DOS VETORES DE DNA


14/42

DIGESTO DO ALVO DO VETOR


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TIPOS DE VETORES EM BIOLOGIA MOLECULAR

VETOR HOSPEDEIRO TIPO DE CLONAGEM TAMANHO DOINSERTO

PLASMDEO Bactria Genmica / cDNA 5-10kb

BACTERIFAGO Bactria Genmica / cDNA


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PLASMDEOS


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pequenas molculas de DNA de cadeia dupla

contm os elementos necessrios sua replicao

um gene que confere resistncia a um antibitico

Podem estar presentes em duas ou mais cpias na clula

podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases)

PLASMDEOS
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18/42


19/42

um gene que codifique uma substncia que possa

distinguir uma clula transformada de uma

no transformada - resistncia a um

antibitico - clulas que possuem o gene so

capazes de crescer em meios com o

antibitico enquanto que as restantes no

sobrevivem

PLASMDEOS

ter uma origem de replicao - sequncia de DNA que

permite a replicao do vetor na clula hospedeira;

Mltiplos Stios de Clonagem - locais nicos declivagem para endonucleases de restrio - stio de

insero no vetor de clonagem

CLONAGEM EM PLASMDEOS
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.infoescola.com/files/2010/01/plasmideo.jpg&imgrefurl=http://www.infoescola.com/reino-monera/plasmideo/&usg=__Zk2Ih-PWLMjblE5WyaN5N5oAUpE=&h=319&w=360&sz=33&hl=pt-BR&start=68&itbs=1&tbnid=nT2aJB295Jf_MM:&tbnh=107&tbnw=121&prev=/images?q=plasmideos&start=60&hl=pt-BR&sa=N&gbv=2&ndsp=20&tbs=isch:1http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.infoescola.com/files/2010/01/plasmideo.jpg&imgrefurl=http://www.infoescola.com/reino-monera/plasmideo/&usg=__Zk2Ih-PWLMjblE5WyaN5N5oAUpE=&h=319&w=360&sz=33&hl=pt-BR&start=68&itbs=1&tbnid=nT2aJB295Jf_MM:&tbnh=107&tbnw=121&prev=/images?q=plasmideos&start=60&hl=pt-BR&sa=N&gbv=2&ndsp=20&tbs=isch:1


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CLONAGEM EM PLASMDEOS

Plasmdeo apresentando: origem de replicao

(ori), gene que confere resistncia a um antibitico

- ampicilina e stio(s) de restrio (stio de

restrio para a EcoRI), que pode ser usado para

inserir fragmentos de DNA

O DNA inserido ligado ao vetor e os

plasmdeos recombinantes so transformados em

bactrias

As bactrias so plaqueadas em meios contendo

o antibitico para o qual o plasmdeo confere

resistncia, como forma de selecionar as bactrias

resistentes (transformadas)

Desenvolvem-se colnias de bactrias com o

plasmdeo recombinante


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CLONAGEM

EMPLASMDEOS


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http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/phage1.jpg


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BACTERIFAGOS
http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/phage1.jpghttp://pathmicro.med.sc.edu/mayer/phage1.jpg


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BACTERIFAGOS

bacterifago que se comporta como um vrus da E. coli

uma partcula viral constituda por protenas e DNA em igual quantidade,

que se apresenta como uma molcula linear de cadeia dupla

injetado na clula hospedeira - particularidade das suas extremidades (stio

cos) serem de cadeia simples, constitudas por cerca de 12 nucletidos que,

sendo complementares na sequncia de bases, permitem ao DNA adquirir

uma forma circular antes da sua insero.

O genoma do fago codifica para 50 protenas, aproximadamente.


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CLONAGEM EM BACTERIFAGOS

O vetor contm um stio de restrio (EcoRI)para insero do DNA clonado

Adicionalmente, stios cos, para empacotar o

DNA nos fagos nas extremidades do vetor de

DNA - necessrio para lisogenia

DNA inserido ligado ao vetor e as molculas

recombinantes so empacotadas nos fagos

fagos recombinantes so usados para infectarbactrias como a E. coli

Cada fago recombinante, que carrega um

fragmento nico do DNA clonado, forma uma

placa nica no interior da cultura bacteriana


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CLONAGEM EM BACTERIFAGOS
http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/phage1.jpg


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COSMIDEOS

CLONAGEM EM COSMDEOS


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Ultrapassa algumas limitaes da clonagem em fagos e plasmdeos

No fago , os fragmentos de DNA a serem inseridos no podem ultrapassar os 15 kb -

na maior parte das vezes, os genes so maiores (35 a 40 kb) o que torna impossvel a

sua insero

Os cosmdeos so assim, plasmdeos (com origem de replicao e genes que

conferem resistncia a antibiticos), que contm um fragmento de DNA do fago

incluindo o local cos

Utilizados como veculos de clonagem molecular

As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distncia de 35 a 49

kb, o que limita o tamanho dos fragmentos passveis de serem empacotados.

O DNA clivado com enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA que

vo se ligar ao cosmdeo anteriormente clivado com enzima semelhante.




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Situao ideal - cada fragmento de DNA genmico possui um local cos nas

extremidades que, durante o empacotamento, vo ser reconhecidos por

enzimas

Uma vez injetado no interior da clula hospedeira, vai circularizar e replicar

como um plasmdeo normal, sem exprimir qualquer funo do fago, sendo

igualmente reconhecido com base na resistncia adquirida a um antibitico

especfico

COSMIDEOS


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COSMIDEOS

CLONAGEMEM

COSMDEO

VETORES DE EXPRESSO


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VETORES DE EXPRESSO

Permite no apenas aumentar o nmero de cpias de um determinado fragmento, como

os vetores de clonagem, mas tambm o produto desse fragmento clonado


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vetor de expresso deve apresentar:

Promotor forte e eficiente para produzir elevadas quantidades da protena

desejada e de baixo nvel basal para evitar toxicidade;

Terminador a fim de evitar a trascrio no desejada

Sequncia para o inicio da traduo

Repressor para evitar a produo de protena em quantidades txicas;


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A insero do DNA recombinante em clulas hospedeiras pode

ser efetuada de diferentes maneiras

Uma delas transformao

consiste na formao de clulas competentes

efetuado um tratamento com cloreto de clcio antes datransformao - Normalmente, a carga negativa do DNA (devidoao fosfato) repelida pela carga negativa da membrana dasbactrias (devido aos fosfolpidos), assim, o on Ca 2+ neutralizaestas foras, facilitando a entrada do DNA de interesse nasbactria


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BIBLIOTECA GENMICA


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Atualmente, os vetores mais utilizados na construo de

bibliotecas genmicas so fagos e cosmdeos

Em ambos os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por

fragmentao aleatria, ligam-se ao DNA do vetor para poderem

ser empacotados em partculas de fago .

BIBLIOTECA GENMICA

BIBLIOTECA GENMICA


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BIBLIOTECA GENMICA

Bibliotecas construdas com vetores so armazenadas e propagadas na forma de

fagos recombinantes

Estes vetores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais

O fragmento ou brao esquerdo, codifica as protenas da cpsula, e o brao

(fragmento) direito, tem a origem de replicao do fago e promotores de outros genes

essenciais

Entre o fragmento central e os dois braos esto os stios de restrio usados na

clonagem,

A extremidade de cada brao apresenta um segmento de cadeia simples (cos).

Estes segmentos so complementares entre si, permitindo assim a recircularizao

da molcula e consequente replicao do fago dentro da clula hospedeira.


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BIBLIOTECA GENMICA

Vetor de substituio

Fragmentos clonados so ligados aos braos do fago, previamente

preparados com a enzima, a mistura empacotada in vitro em partculas virais

Para selecionar apenas os fagos recombinantes, estes so infectados numa

bactria lisognica

A suspenso de fagos resultante pode ser armazenada durante vrios anos

em frigorfico, com algumas gotas de clorofrmio para prevenir crescimento

bacteriano


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APLICAES

Hormnio de crescimento

Insulina humana

Vacina da hepatiteB

Hormnios sexuais


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CLONAGEM TERAPUTICA


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Vetores de Clonagem e de expressão BOM

Documents

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