Clonagem, Expressão e Purificação da Sinfilina-1 e da...
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UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA Clonagem, Expressão e Purificação da Sinfilina-1 e da Parkina Maria Helena Coelho de Sousa Franco Mestrado em Bioquímica Especialização em Bioquímica Médica 2010
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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Clonagem, Expressão e Purificação da
Sinfilina-1 e da Parkina
Maria Helena Coelho de Sousa Franco
Mestrado em Bioquímica
Especialização em Bioquímica Médica
2010
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
Clonagem, Expressão e Purificação da
Sinfilina-1 e da Parkina
Dissertação orientada por:
Prof. Doutor Alexandre Luís Quintas
Prof. Doutora Ana Ponces Freire
Maria Helena Coelho de Sousa Franco
Mestrado em Bioquímica
Especialização em Bioquímica Médica
2010
i
Resumo
A Doença de Parkinson (DP) é a doença neurodegenerativa mais comum a seguir à doença
de Alzheimer e está associada à degeneração dos neurónios dopaminérgicos da pars compacta da
substantia nigra (SNpc). Nesta doença, o misfolding, o unfolding e a agregação proteica, em conjunto
com uma resposta disfuncional da célula ao stress induzido pelas espécies parcialmente
desnaturadas, pode estar na origem de danos celulares que conduzem à degeneração dos neurónios
dopaminérgicos.
A DP é essencialmente idiopática, à excepção de um número reduzido de indivíduos que são
portadores de um gene mutante (<10 % dos casos de Parkinson) ou que foram expostos a agentes
indutores de parkinsonismo, como o MPTP.
A etiologia da DP resulta da interacção dinâmica de factores genéticos e ambientais, em que
a acumulação de proteínas parcialmente desnaturadas, a presença de agregados e de proteínas
ubiquitinadas nos corpos de Lewy, sugere um motivo comum a interrelacionar estes factores.
Dentro da DP hereditária, existe um grupo restrito cuja sintomatologia precoce e a ausência
de Corpos de Lewy é denominada como Parkinsonismo Juvenil Autossómico Recessivo. Neste
contexto, os estudos genéticos revelaram a presença de variadas mutações associadas ao gene da
Parkina, uma proteína com 465 resíduos de aminoácidos com uma massa molecular aparente de 52
kDa. A sua função está relacionada com as vias de degradação de proteínas, sendo considerada um
ligase entre a ubiquitina e a proteína alvo possuindo também um domínio N-terminal idêntico à
ubiquitina, cuja função permanece desconhecida.
Actualmente, os estudos in vitro desenvolvidos com a Parkina humana têm sido realizados
exclusivamente com domínios desta, uma vez que a purificação da Parkina de forma integral tem-se
revelado uma tarefa árdua. Esta dificuldade tem se observado devido à elevada complexicidade do
processo de folding, uma vez que a proteína apresenta variados domínios e complexa com iões
zinco.
A Sinfilina-1, uma proteína de interacção da α-sinucleína, é um dos substratos ubiquitinados
pela Parkina. Desde que foi descoberta, em 1999, têm sido desenvolvidos estudos que demonstram a
existência de uma relação entre a Sinfilina-1 e a doença de Parkinson. No entanto, apesar de ainda
não ser conhecido o seu papel na patologia está cientificamente aceite que a Sinfilina-1 é capaz de
promover a formação de inclusões semelhantes a corpos de Lewy.
O objectivo fundamental deste trabalho consistiu na expressão e purificação de duas
proteínas de relevância para a doença de Parkinson: a Parkina e a Sinfilina-1. A expressão e a
purificação destas proteínas potenciam estudos estruturais, estudos de folding e de estabilidade,
bem como as alterações da interacção entre a Parkina, Sinfilina-1 e α-sinucleína.
No presente estudo desenvolveu-se uma metodologia de purificação da Parkina e da
Sinfilina-1, de forma integrada, com o objectivo de elucidar o envolvimento da Parkina na patogénese
da Doença de Parkinson.
Palavras-chave: Corpos de Lewy, Parkina, PARK2, Parkinsonismo Juvenil Autossómico Recessivo,
purificação de proteínas, Sinfilina-1, Subclonagem.
ii
Abstract
Parkinson's Disease (PD) is the most common neurodegenerative disease after Alzheimer's
disease and is associated with degeneration of dopamine neurons in the substantia nigra pars
compacta (SNpc). In this disease, misfolding, unfolding and protein aggregation, together with a
dysfunctional response to cell stress induced by the partially denatured species, could cause cell
damage that, in turn, leads to degeneration of dopaminergic neurons.
PD is primarily idiopathic, with the exception of a few individuals who are carriers of a
mutated gene (<10% of cases of Parkinson's) or who were exposed to agents that induce
Parkinsonism, such as MPTP.
The etiology of PD results from the dynamic interplay of genetic and environmental factors
in the accumulation of partially denatured, aggregated and ubiquitinated proteins in Lewy bodies,
suggesting a common motif connecting these factors.
Within hereditary PD, a small group, known as autosomal recessive juvenile Parkinsonism, is
characterized by early symptoms and the absence of Lewy bodies. In this context, genetic studies
revealed the presence of various gene mutations associated with Parkin gene, a protein with 465
amino acid residues with an apparent molecular mass of 52 kDa. Parkin plays a role in protein
degradation, being considered an ubiquitin ligase and possesses an N-terminal domain similar to
ubiquitin, whose function remains unknown.
Currently, in vitro studies developed with human Parkin have been performed exclusively
with protein domains, since the purification of complete Parkin has proved to be an arduous task.
This difficulty has been observed due to the high complexity of folding, since the protein has
different domains and complexes with zinc ions.
Synphilin-1, an interaction protein of α-synuclein, is also a Parkin substrate. Since its
discovery in 1999, studies have been developed that demonstrate the existence of a relationship
between Synphilin-1 and Parkinson's disease. Although its contribution to the pathology is still
unknown, it is scientifically accepted that Synphilin-1 can promote the formation of inclusions similar
to Lewy bodies.
The basic aim of this work consisted in the expression and purification of two proteins of
relevance to Parkinson's disease: Synphilin-1 and Parkin. The expression and purification of these
proteins potentiate structural, folding and stability studies, as well as modifications in the interaction
between Parkin, Synphilin-1 and α-synuclein.
In this study a methodology was developed for purification os Parkin and Synphilin-1, as well
as protein with the aim of elucidating the involvement of Parkin in the pathogenesis of Parkinson´s
disease in future studies.
Keywords: Lewy bodies, Parkin, PARK2, Parkinsonism Juvenile Autosomal Recessive, protein
purification, Sinfilina-1, subcloning.
iii
Agradecimentos
Ao Professor Doutor Alexandre Quintas, orientador do projecto, pela total liberdade e todo o apoio ao logo do desenvolvimento do projecto. Obrigado pela amizade e compreensão.
À Professora Doutora Ana Ponces, orientadora interna, que sempre se mostrou disponível para apoiar e motivar. Pela inspiração ao longo da Licenciatura e Mestrado na Faculdade de Ciências da
Universidade de Lisboa. À FFCUL, pelo financiamento no âmbito do projecto PTDC/QUI/73430/2006.
À Ana Lajes, colega de tantas horas de trabalho, pelo suporte e companheirismo.
Ao Carlos Família e à Joana Couceiro, pela amizade. Ao Henrique Neves pelas brincadeiras.
Ficarám sempre na minha memória os passeios fantásticos, pensados e marcados à última da hora. Com vocês, quaisquer 5 minutos de pausa podem ser uma verdadeira aventura…
À Susana Bandarra, pela amizade e orientações no campo da Biologia Molecular.
À Teresa Calejo, à Inês Cavaleiro e ao Paulo Mascarenhas pela boa disposição e amizade. À Professora Doutora Madalena Oom pela supervisão nos procedimentos de Biologia Molecular.
À minha família, pelo apoio incondicional que os fez atravessar Lisboa para me virem buscar a “altas”
horas da noite.
Dedico este trabalho ao meu pai, sempre presente na saudade. Der Mensch, der den Berg versetzte, war derjenige, der anfing, kleine Steine aus dem Weg zu räumen.
Chin.Sprichwort
Wer immer sich zum Schüler macht, wird immer einen Meister finden
Friedrich von Hagedorn
iv
Abreviaturas
CL – Corpos de Lewy
CSF – Common fragil site
DA – Doença de Alzheimer
DMJ - Doença de Machado-Joseph
DP – Doença de Parkinson
DP-AD – Doença de Parkinson Autossómica Dominante
DP-AR – Doença de Parkinson Autossómica Recessiva
DUB – Deubiquitinating Enzyme
EGF – Factor de crescimento epidermal
EGFR – Receptor do factor de crescimento epidermal
Eps15 – Epidermal growth factor receptor pathway substrate 15
ERAD – Mecanismo de degradação associado ao retículo endoplasmático
ERQC – Mecanismo de controlo de qualidade do retículo endoplasmático
HECT – Domínio Homologous to E6-Associated Protein (E6AP) C-Terminus
HSP70 - Heat shock protein 70
IBR – Domínio In-between-RING
K - Lisina
LN - Neuritos de Lewy
LRRK2 - Gene leucine-rich repeat kinase 2
NAC - Componente beta não-amilóide
NO - Óxido nítrico
PACRG - Gene co-regulador da Parkina
Pael-R - Parkin associated endothelin-like receptor
PI – Ponto isoeléctrico
PI3K - Fosfoinositol 3-cinase
PINK1 - PTEN-induced kinase 1
PJ-AR – Parkinsonismo Juvenil Autossómico Recessivo
RBR – Superdomínio RING-IBR-RING
RE – Retículo endoplasmático
RING – Domínio Really interesting new gene
ROS - Espécies reactivas de oxigénio
SN – Substância nigra
SNC – Sistema Nervoso Central
SNCAIP – SNCA Interacting Protein
SNpc – Pars compacta da substância nigra
SytXI – Sinaptotamina XI
U – Unidades enzimáticas (moles de substrato convertido por unidade de tempo). 1U corresponde 1
μmol min-1
UBC – Ubiquitin conjugation
UBL – Domínio do tipo ubiquitina
UIM – Motif de interacção com a ubiquitina
WT – Wild-type
αSp22 – α-sinucleína O-glicosilada
v
ÍNDICE:
Resumo ........................................................................................................ ii
Abstract ....................................................................................................... ii
Agradecimentos ......................................................................................... iii
Abreviaturas ............................................................................................... iv
1. Introdução ............................................................................................. 1
2. Aspectos Gerais da Doença de Parkinson ............................................ 3
2.1. Incidência ...................................................................................................................... 6
2.2. Etiologia ........................................................................................................................ 6
2.3. Mecanismos de Morte Celular ..................................................................................... 7
2.3.1. Disfunção mitocondrial ........................................................................................ 7
2.3.2. Stress oxidativo .................................................................................................... 8
2.3.3. Excitotoxicidade ................................................................................................... 8
2.4. Parkinson idiopática e hereditária ............................................................................... 8
3. Parkinson Juvenil Autossómico Recessivo (PJ-AR) ........................... 10
4. O locus PARK2: Estrutura e função .................................................. 13
5. Factores genéticos envolvidos na patogénese hereditária .............. 16
5.1. PARK1 e 4-SNCA (α-sinucleína) ................................................................................... 16
5.2. PARK2 (Parkina) .......................................................................................................... 16
5.3. PARK5 (UCH-L1) ........................................................................................................... 16
5.4. PARK6 (PINK1) ............................................................................................................. 17
5.5. PARK7 (DJ1) ................................................................................................................. 17
5.6. PARK8 (LRRK2) ........................................................................................................... 17
6. Estruturas e funções ........................................................................ 19
6.1. Estrutura da Parkina: Domínios .................................................................................. 19
6.1.1. Domínio UBL ............................................................................................................ 19
6.1.2. Super-domínio RING-IBR-RING (RBR) ................................................................... 20
6.1.3. In between RINGs .............................................................................................. 20
6.1.4. Domínio RING0 ........................................................................................................ 21
6.2. Função da Parkina ....................................................................................................... 22
6.2.1. Via de degradação pelo proteassoma ............................................................... 23
6.3. Estrutura da Sinfilina-1: Domínios .............................................................................. 27
6.3.1. Domínio ankyrin-like motifs ................................................................................... 27
6.4. Função da Sinfilina-1 ................................................................................................... 28
7. Substratos da Parkina ubiquitina ligase ............................................ 30
vi
7.1. A Ubiquitina como substrato ..................................................................................... 30
7.2. Sinfilina-1 ...................................................................................................................... 31
7.2.1. Complexo Parkina, α-sinucleína e Sinfilina-1 ...................................................... 31
7.3. Alfa-sinucleína.............................................................................................................. 31
7.4. HSP70 .......................................................................................................................... 33
7.5. Parkina associated endothelin-like receptor ............................................................ 34
7.6. CDCrel-1 e Sept5 .......................................................................................................... 35
7.7. LRRK2 .......................................................................................................................... 36
7.7.1. Complexo Parkina, PINK1 e DJ1 ......................................................................... 36
8. Importância funcional das mutações Parkina ............................... 38
9. Bioquímica da Parkina ..................................................................... 39
9.1. Parkina na via do Fosfatidilinositol / Akt ................................................................... 39
9.2. Parkina na via IKK/NFkb .............................................................................................. 41
9.7. S-Nitrosilação .............................................................................................................. 44
9.8. Formação de Agressomas ......................................................................................... 44
10. A Parkina noutras Patologias ......................................................... 45
10.1. Susceptibilidade à lepra ............................................................................................. 45
10.2. Supressor tumoral ...................................................................................................... 45
Metodologia, resultados e discussão ...................................................... 46
1. Parkina ................................................................................................. 47
1.1. Subclonagem .............................................................................................................. 47
1.1.1. Procedimentos e Considerações ........................................................................... 48
1.2. Expressão e Purificação .............................................................................................. 51
1.2.1. Lise celular e Purificação dos corpos de inclusão ................................................. 52
1.2.2. Refolding proteico ............................................................................................. 53
2. Sinfilina-1 .............................................................................................. 55
2.1. Expressão e Purificação ............................................................................................. 56
2.1.1. Lise celular e Purificação dos corpos de inclusão ................................................. 57
2.1.2. Refolding proteico ............................................................................................. 58
2.1.3. Purificação da Sinfilina-1 ..................................................................................... 59
3. Considerações finais ........................................................................... 61
4. Anexos ............................................................................................. 63
4.1. Anexo 1 ........................................................................................................................ 63
4.2. Anexo 2 ....................................................................................................................... 64
vii
ÍNDICE DE FIGURAS:
Figura 1 – Os Corpos de Lewy do tronco cerebral e do proencéfalo basal apresentam um diâmetro superior a 15µm e são constituídos por um centro hialinico esférico e um halo distinto. Os CL corticais, por sua vez, possuem dimensões mais reduzidas, não apresentam um core disto sendo facilmente observados com coloração anti-ubiquitina. A imagem A mostra um CL no citoplasma de um neurónio dopaminérgico pigmentado na substancia nigra (hematoxylin-eosin and Luxol fast blue, X100). A imagem B mostra um exame ultra-estrutural de um Corpo de Lewy onde é visível a acumulação de filamentos e material granular com um centro denso e filamentos periféricos soltos (X21,560). Adaptado de Lang e A M Lozano (Lang & A M Lozano 1998). ____________________________________________ 4
Figura 2 - Loci envolvidos na genética da DP, localização cromossómica, gene, hereditariedade e função provável adaptado de Gil (Gil 2009). ______________________________________________________ 15
Figura 3- Estrutura modular da Parkina. UBL: Domínio semelhante à ubiquitina; R0: Domínio RING 0; R1: Domínio RING 1; R2: Domínio RING 2; IBR: Domínio In-Between-RING. Adaptado de Mata, von Coelln e Hristova (Mata et al. 2004; von Coelln et al. 2004; Hristova et al. 2009) __________________________ 19
Figura 4 – Sequencia especifica característica de domínios RING em que X representa qualquer aminoácido. Retirado de Borden, Morett e Bork (Borden 2000; Morett & Bork 1999). ______________ 20
Figura 5 - Estrutura do domínio IBR (307-384) na zona 320-377 (NMR). A zona N-terminal 307-319 e C-terminal 378-384 não surgem representadas devido à falta de estrutura. (a) Sobreposição do backbone de 20 estruturas usando CYANA. Local I de ligação do zinco compreende as extensas regiões em loop L1 (azul) e L2 (verde), e o local II de ligação do zinco encontra-se a vermelho. (b) Representação do IBR da Parkina, demonstrando a posição dos resíduos coordenados com os zincos. Adaptado de Beasley, Hristova e Shaw (Beasley, Hristova & Shaw 2007a). __________________________________________ 21
Figura 6 - Ilustração da degradação associada ao retículo endoplasmático. (a) Proteínas misfolded intramembranares do citoplasma e lúmen do RE são reconhecidas por chaperones citoplasmáticos e do lúmen do RE e por factores associados, como membros da família das Hsp70, calnexina e calreticulina, e isomerases de ligações persulfureto. (b) Marcação proteica. Substratos do ERAD são retrotranslocados, após marcação, para a maquinaria de retrotranslocação (o translocão) e/ou E3 ligases. (c) Iniciação da retrotranslocação. A retrotranslocação do substrato para o citoplasma é iniciada pelo complexo Cdc48 (cell-division cycle-48) ou outros componentes, como chaperones moleculares ou proteassoma. A energia proveniente da hidrólise do ATP pelo Cdc48, que é um AAA+ ATPase, é usada na retrotranslocação. (d) Ubiquitinação e finalização da retrotranslocação. Após a passagem pelo translocão, a proteína é poliubiquitinada por uma E3 ligase de ubiquitina. A reacção finaliza a translocação com o auxílio de complexos citoplasmáticos que ligam ubiquitina a proteínas. (e) Marcação e degradação proteassomal. Após a poliubiquitinação, o substrato disponível no citoplasma é reconhecido pelos receptores do topo 19S pertencentes ao proteassoma 26S. Os enzimas envolvidos na desubiquitinação (não apresentados) removem a marcação e a N-glicase de péptidos (não apresentado) que é potencialmente necessária para uma degradação eficiente. O substrato é introduzido no core catalítico do proteassoma onde é degradado em péptidos. A ubiquitina proveniente do processo de degradação pode ser reciclada. Adaptado de Vembar e Brodsky (Vembar & Brodsky 2008). _________ 24
Figura 7 - Via da ubiquitina-proteassoma. O enzima E1 adenila o C-terminal do resíduo Glicina da ubiquitina com hidrolise de ATP. O adenilato de ubiquitina intermediário liga-se ao grupo tiol da cisteína do centro activo do enzima E1 formando um tioéster de ubiquitina e AMP livre. Seguidamente, o tioéster de ubiquitina é transferido para o resíduo de cisteína do centro activo do E2, um enzima de conjugação da ubiquitina. Posteriormente o enzima E2 transfere a cadeia de ubiquitinas directamente para o substrato ou, em alternativa, para o E3 que se encarrega de a ligar ao substrato (dependendo do E3). Várias moléculas de ubiquitina são ligadas sequencialmente pelo E3 ligase, formando uma cadeia de poliubiquitinas. Os substratos poliubiquitinados são degradados pelo complexo proteolítico denominado de proteassoma 26S, num processo dependente de ATP. A ubiquitinação é um processo reversível em que as DUBs degradam a cadeia de poliubiquitinas prevenindo a degradação do substrato necessário, reciclando a ubiquitina. Ubiquitina – círculos vazios com caudas; ubiquitina activada – círculos preenchidos. De referir que a conjugação da ubiquitina pode ocorrer, independentemente da via da ubiquitina-proteassoma, de uma forma não canónica (por activação da UBL, activação do híbrido E1-
viii
E2 ou E2-E3 ou por elongação das cadeias curtas de ubiquitina pela E4) Adaptado de Hegde e Upadhya (Hegde & Upadhya 2007). ______________________________________________________________ 26
Figura 8 - Vista esquemática da proteína Sinfilina-1, com comparação de sequências entre a variante humana e a de murganho. Retirado de Marx (Marx 2003). ____________________________________ 27
Figura 9 - (a) Modelo proposto sobre a interacção da Parkina com o Esp15. O EGF estimula a ligação entre a Parkina e o Eps15 numa interacção dependente de UBL e UIM (esquerda). A ligação ao Eps15 estimula a actividade E3 ligase da Parkina e promove a ubiquitinação do Eps15 (centro). A ligação intramolecular da ubiquitina no Eps15 pelo UIMs interfere com a ligação de Ubl por parte da Parkina e destrói a interacção entre a Parkina e o Eps15 (direita). (b-c) O modelo explica como é que a ubiquitinação mediada pela Parkina consegue regular o trafficking e sinalização do EGFR. (b) Na presença de Parkina, a ubiquitinação do Eps15 previne a sua ligação ao complexo EGFR, o que atrasa a endocitose do receptor e prolonga a sinalização via neuronal de sobrevivência PI3K-Akt. (c) Na ausência de Parkina: Defeitos na ubiquitinação mediada pela ubiquitina, como é o caso de DP associada à Parkina, aumenta a disponibilidade de Esp15 capaz de se ligar ao complexo EGFR, o que por sua vez acelera a endocitose e menospreza a sinalização via PI3K-Akt. Adaptado de Fallon (Fallon et al. 2006). ________________________________________ 40
Figura 10 - Modelo do papel funcional da Parkina na via de sinalização IKK/NFkB. Durante o stress e em condições fisiológicas a Parkina promove regulação por ubiquitinação do TRAF2 e IKKγ, levando à activação do NF-κB. Consequentemente, a transcrição de genes prosurvival é upregulated. A actividade da Parkina pode ser modelada pelo stress. Sob stress moderado, a Parkina é upregulated. Para uma resposta imediata, é possível que a actividade da Parkina possa ser regulada por modificações pos-traducionais. Em contraste, no caso de um severo stress proteotoxico, induzido por exemplo por dopamina oxidada, ocorre misfolding e inactivação da Parkina. Mutações no gene da Parkina, relacionado com parkinsonismo juvenil autossómico recessivo, também interferem com a capacidade da Parkina de estimular a via de sinalização IKK/NFkB. Adaptado de Henn e Bouman (Henn et al. 2007).__ 42
Figura 11 - A: Mapa do vector circular pCI-neo (Promega). B: Mapa do vector circular pGEX-4T-1 (Amersham) _________________________________________________________________________ 47
Figura 12 - Primer Forward (A) e Primer Complementary Reverse (B) usados para amplificar a região codificante do gene PARK2 no processo de subclonagem. (A) apresenta um Tm a 61,6ºC e (B) a 65, 6ºC. Os enzimas Bam HI e EcoR I não possuem local de restrição na sequência da PARK2. O Bam HI permite uma introdução em frame da PARK2 no pGEX-4T-1. O design dos primers teve em conta a adição de um conteúdo “GC” no início da sequência de forma a facilitar a ligação deste à cadeia de DNA molde e a posterior actuação da polimerase. _______________________________________________________ 48
Figura 13 - Multiple cloning site do vector de destino pGEX-4T-1 (Amersham) _____________________ 48
Figura 14 - Condições do PCR para amplificação da região codificante do gene PARK2. ______________ 49
Figura 15 – Controlo da eficácia da subclonagem por restrição do DNA plasmídico resultante com os enzimas Bam HI e EcoR I, utilizados no passo da restrição. Poços 2 a 10: restrição do DNA plasmídico de 9 colónias independentes resultante da subclonagem, obtiveram-se dois fragmentos de tamanhos correspondentes ao vector digerido (≈4900pb) e Parkina (1395pb); Poços 11 a 19: verificação da integridade dos plasmídeos obtidos a partir das 9 colónias respectivas. _________________________ 50
Figura 16 - Primers externos pGEX_For (A) pGEX_Rev (B) usado para sequenciação do plasmídeo clonado com a região codificante do gene PARK2 no processo de subclonagem __________________________ 50
Figura 17 - Gel SDS-PAGE 12% contendo aliquotas provenientes da fracção solúvel da indução de expressão. M: marcador; T0: 0h; T1: 1h; T2:2h; T3:3h; T4:4h; T5:6h; T6:8h. As setas a vermelho indicam a banda a aproximadamente 80kDa. _______________________________________________________ 51
Figura 18 - Gel SDS-PAGE 12% contendo aliquotas provenientes da fracção insolúvel da indução de expressão após a sonicação. M: marcador; T0: 0h; T1: 1h; T2:2h; T3:3h; T4:4h; T5:6h; T6:8h __________ 52
Figura 19 - Sequência de diálises utilizadas no refolding da proteína de fusão GST-Parkina. Condições de diálise I, II e III. _______________________________________________________________________ 53
Figura 20 - Gel SDS-Page a 12% com amostras cujo pellet foi previamente ressuspenso após as diálises com diferentes tempos de indução. M: marcador; T0: 0h; T1: 1h; T2:2h; T3:3h; T4:4h; T5:6h. _____________ 54
ix
Figura 21 – Mapa do vector pET30A (Novagen) _____________________________________________ 55
Figura 22 - Multiple cloning site do vector pTE30A (Novagen) __________________________________ 55
Figura 23 - Gel de agarose com digestão simples e dupla de duas amostras de plasmídeo pET30A. 1) Marcador; 2) pET30A digerido com Xho I (amostra 1); 2) pET30A digerido com XhoI e BamHI (amostra 1); 3) pET30A digerido com Xho I (amostra 2); 4) pET30A digerido com XhoI e BamHI (amostra 2). ______ 56
Figura 24 - Gel SDS-PAGE 12% contendo aliquotas provenientes da fracção solúvel da indução de expressão. M: marcador; T0: 0h; T1: 2h; T2: 4h; T3: 6h; T4: 8h __________________________________ 57
Figura 25 - Sequência de diálises utilizadas no refolding da Sinfilina-1. Condições de diálise I, II e III. ___ 58
Figura 26 - Gel SDS-Page a 12% com amostras de Sinfilina-1 após diálises I, II e III. ___________________ 59
Figura 27 – Fragmento dos resultados da chapa fotográfica proveniente do Western Blot com detecção da Sinfilina-1 com Anticorpo Anti-Sinfilina-1 aos diferentes tempos. ____________________________ 59
Figura 28 - Cromatograma proveniente da coluna de caudas de Histidina após injecção da amostra de Sinfilina-1. ___________________________________________________________________________ 60
Figura 29 - Gel SDS-Page a 12% com fracções recolhidas na cromatografia de afinidade. M: marcador; A1: fracção recolhida após injecção da amostra (0-5mL); A2: fracção recolhida ao equilibrar da coluna com a amostra (5-10 mL); A3: fracção recolhida antes da troca do tampão para o Elution Buffer (100-105mL); A4: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (105-110mL); A5: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (110-115mL) A6: fracção após a adição do Elution Buffer (115-120mL); A7: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (120-125mL); A8: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (125-130mL) A9: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (135-140mL). ______________________ 60
1
1. Introdução
Rudolf Virchow descreveu pela primeira vez, em 1854, uma substância eosinófila depositada
em diversos tecidos com aparência hialina quando observada em microscopia óptica e com algumas
características de coloração histoquímica semelhantes ao amido, que designou por substância
amilóide (semelhante ao amido). Embora Friedrich e Kekule tenha demonstrado que estes
compostos tinham natureza proteica, a designação “amilóide” perdurou e ainda hoje é usada para
denominar depósitos de fibras resultantes da agregação de proteínas características de determinada
doença (Costa 1994).
Em 1971, Glenner e colaboradores caracterizaram pela primeira vez uma proteína
responsável pela formação de depósitos amilóides (G. G. Glenner et al. 1971). Desde então, observou-
se que muitas proteínas solúveis podem produzir depósitos amilóides. Actualmente, existem cerca
de várias amiloidoses conhecidas entre as quais a doença de Alzheimer (DA), a doença de Parkinson
(DP), a Encefalopatia Espongiforme Bovina e a Polineuropatia Amiloidótica Familiar.
As amiloidoses dividem-se em localizadas, quando os depósitos ocorrem num único órgão,
como é o caso do cérebro na DP, ou sistémicas quando a deposição afecta múltiplos órgãos. Apesar
da heterogeneidade das amiloidoses, todas apresentam características comuns como depósitos
amilóides com elevada resistência à proteólise e insolúveis, estruturalmente apresentam
predominantemente folhas β ({ excepção das redes de neurofibrilhas), possuem propriedades
cromóforas e ópticas comuns, como coloração verde após coloração com vermelho do Congo e a
fluorescência característica da ligação à tioflavina T, para além da capacidade de associação a outras
proteínas (Ghiso et al. 1994).
Uma característica importante dos depósitos amilóides é a estrutura secundária
predominante de folha-β, com as cadeias β das proteínas orientadas perpendicularmente ao longo
do eixo das fibrilhas (GLENNER et al. 1968) cuja análise por espectroscopia de infra-vermelhos
revelou que a orientação das proteínas polimerizadas é antiparalela (Termine et al. 1972).
Genericamente as fibras amilóides resultam da formação de agregados insolúveis a partir de
proteínas nativas ou suas variantes que produzem intermediários com elevado potencial de
agregação no processo de folding ou de unfolding (Chiti et al. 1999; Chiti et al. 2000; Jaenicke 1995;
Taubes 1996; Uversky 1998; WETZEL 1996); de proteínas nativas ou variantes que sofrem alterações
conformacionais após o processo de folding (Booth et al. 1997; Carrell & Gooptu 1998; Perutz 1997;
Telling et al. 1996); a partir da superprodução de proteínas que devido à elevada quantidade tendem
a agregar (Benson & Wallace 1989; Guela et al. 1998; Gupta et al. 1998); ou proteólise de uma
proteína precursora (C Haass 1993; Kosik 1999).
2
As várias proteínas amiloidogénicas (precursoras dos depósitos amilóides nas várias
amiloidoses) não apresentam qualquer homologia estrutural ou sequencial relevante, mas originam
fibrilhas amilóides in vivo com conformação similar. Este facto sugere a existência de um mecanismo
comum na formação dos depósitos amilóides a partir das diferentes proteínas precursoras (Massimo
Stefani 2008). Os mecanismos moleculares de agregação proteica têm sido objecto de atenção
crescente devido ao seu papel central em diversas patologias degenerativas. A abordagem mais
directa a este problema, apesar dos diversos factores celulares presentes e específicos de cada
patologia, consiste em estabelecer relações entre a estrutura, estabilidade e dinâmica das proteínas
mutantes, modificadas pós-traducionalmente, ou intermediários potencialmente amiloidogénicos
com a proteína normal.
3
2. Aspectos Gerais da Doença de Parkinson
Originalmente descrita por James Parkinson, em 1817, no ensaio intitulado “An Essay of the
Shaking Palsy” (Parkinson 2002) a DP é a doença degenerativa com maior incidência depois da
doença de Alzheimer, afectando cerca de 4 milhões de pessoas em todo o mundo (Bushnell & M. L.
Martin 1999). Esta pode ser caracterizada por três sintomas fundamentais: bradicinesia (lentidão
anormal dos movimentos voluntários), tremor de repouso e rigidez muscular (Fahn 2003),
sintomatologia que se manifesta como consequência da perda progressiva e selectiva dos neurónios
dopaminérgicos no sistema nervoso central.
Na DP vários grupos de neurónios são afectados. No entanto, esta patologia é caracterizada
pela perda selectiva e em grande escala de neurónios dopaminérgicos pigmentados com
neuromelanina, atingindo valores de 80% num universo de cerca 450.000 neurónios dopaminérgicos
presentes na SNpc humana (Lang & A M Lozano 1998), e em menor escala, perda dos neurónios não
pigmentados da área ventral tegmental vizinha, impulsionados pela diminuição dos níveis de
dopamina (E Hirsch et al. 1988; German et al. 1989). O facto de apenas neurónios específicos serem
vulneráveis à DP é uma questão ainda em aberto e crítica no contexto da desordem. Uma explicação
poderá residir na capacidade de certos neurónios assimilarem os compostos tóxicos endógenos e
extrínsecos através e mecanismos transportadores selectivos, como é o caso do transportador de
dopamina. Outras hipóteses incluem o aumento do stress metabólico, elevados níveis fisiológicos de
proteína oxidada, degeneração selectiva de toxinas ou falha no sistema de destoxificação ou
orientação desta (possivelmente devido à presença de neuromelanina) bem como a necessidade de
requisitos específicos para o suporte neurotrófico (Lang & A M Lozano 1998).
A morte neuronal observada tem tipicamente duas origens: 1) no decréscimo da dopamina
disponível no corpo estriado, ou 2) no numero reduzido de receptores de dopamina no mesmo local,
sendo que o primeiro caso constitui cerca de 80% dos casos existentes e é genericamente
denominado de doença de Parkinson (Fahn 2003; Sulzer 2007).
A actividade normal da função motora depende da síntese e libertação de dopamina pelos
neurónios dopaminérgicos na substância nigra que incidem sobre o striatum (Chase et al. 1998).
Fisiologicamente a morte gradual dos neurónios dopaminérgicos da SNpc ocorre com a idade,
acompanhado pela redução dos níveis de dopamina no striatum. No entanto, a degeneração
aumentada dos neurónios dopaminérgicos localizados na substância nigra pars compacta (SNpc) e a
subsequente perda dos nervos dopaminérgicos terminais no striatum são responsáveis pela maior
parte dos distúrbios de movimento (Chase et al. 1998; Nagatsu et al. 2000). Desta forma, o controlo
sintomático da DP com levodopa e outras drogas dopaminérgicas dominam a actual terapia, sendo
eficazes no controlo das discinesias, apenas nas fases iniciais da doença. No entanto, a longo prazo,
estas terapias perdem eficácia com reincidência dos distúrbios de movimento e psicoses. Com o
4
propósito de melhorar a terapia a longo prazo, foram desenvolvidos vários fármacos não-
dopaminérgicas, que se verificou serem eficazes na redução das discenisias quando aplicadas em
modelos animais da DP, são actualmente discutidas como potenciais drogas terapêuticas (Bibbiani et
al. 2003).
Outra característica patológica da DP são os neuritos distróficos, designados “neuritos de
Lewy” (LNs) e as inclusões intraneurais eosinófilas citoplasmática, conhecidas por corpos de Lewy
(CLs) (L. S. Forno 1996; FEARNLEY & LEES 1991) (Figura 1). Os CL encontram-se localizados a nível das
células nervosas na substancia nigra e de outras regiões do sistema nervoso e estão presentes nos
vários estágios da doença.
Apesar de, à semelhança com os agregados de proteínas, os CL serem tóxicos para as
células neuronais uma vez que sequestram proteínas relevantes para a sobrevivência celular, pensa-
se que poderão ter um efeito neuroprotector pois capturam agregados proteicos prejudiciais à célula
(F. J. S. Lee & F. Liu 2008) impedindo a sua toxicidade. Desta forma o diagnóstico patológico da DP
requer a presença de corpos de Lewy, apesar de continuar a não ser evidente a participação destes
na patologia, e a perda de neurónios dopaminérgicos na substancia nigra (Thomas & Beal 2007; Paul
S. Fishman & G. a Oyler 2002).
Figura 1 – Os Corpos de Lewy do tronco cerebral e do proencéfalo basal apresentam um diâmetro superior a 15µm e são constituídos por um centro hialinico esférico e um halo distinto. Os CL corticais, por sua vez, possuem dimensões mais reduzidas, não apresentam um core disto sendo facilmente observados com coloração anti-ubiquitina. A imagem A mostra um CL no citoplasma de um neurónio dopaminérgico pigmentado na substancia nigra (hematoxylin-eosin and Luxol fast blue, X100). A imagem B mostra um exame ultra-estrutural de um Corpo de Lewy onde é visível a acumulação de filamentos e material granular com um centro denso e filamentos periféricos soltos (X21,560). Adaptado de Lang e A M Lozano (Lang & A M Lozano 1998).
A B
5
Os mecanismos moleculares subjacentes à formação de DP ainda não são totalmente
conhecidos. Existem factores genéticos associados ao desenvolvimento da patologia, uma vez que
indivíduos com mutações pontuais em genes relevantes para a DP, desenvolvem parkinsonismo
juvenil (referencia). No entanto, estes factores parecem apenas ter influência na aceleração do
processo patológico, visto que indivíduos que possuem mutações desenvolvem a doença num
período significativamente mais curto. Por outro lado, estudos epidemiológicos têm demonstrado
que vários factores aumentam o risco de desenvolver DP (C. M. Tanner & Langston 1990).
Numerosas toxinas exógenas têm sido associadas com o desenvolvimento de parkinsonismo, no
entanto nenhuma delas foi encontrada no cérebro de doentes com DP. Desta forma, esta patologia é
definida como multifactorial, resultando da acção de factores ambientais sobre indivíduos
geneticamente predispostos e idosos (Riess & R Krüger 1999). Mas, a relação entre factores
genéticos e ambientais não se encontra estabelecida, para além de que a maioria dos modelos de DP
apresenta uma abordagem redutora do problema, focando apenas determinado gene ou toxina.
Desta forma, um dos grandes desafios da biologia pós-genómica é relacionar os mecanismos
moleculares modificados pelos alelos associados à doença e os factores ambientais susceptíveis de
provocar DP (Dauer et al. 2002).
Apesar da progressão lenta da DP, a ausência de tratamento tende a que a sintomatologia
característica da DP evolua para um estado acinético-rígido. Em alguns casos, o quadro clínico evolui
para demência podendo na sequência de complicações relacionadas com a imobilidade levar à morte
do doente (Lang & A M Lozano 1998).
Presentemente, a diminuição de dopamina no corpo estriado, característica desta patologia,
poder quantificada por técnicas de imagiologia in vivo (Eckert et al. 2007), contudo não existe
qualquer tipo de marcador biológico que confirme inequivocamente a DP, pelo que recorre-se
vulgarmente a exames neuropatológicos (L. S. Forno 1996; FEARNLEY & LEES 1991; F. J. S. Lee & F.
Liu 2008). Por outro lado, algumas das características clínicas presentes na DP podem ser facilmente
encontradas noutras doenças, sendo obrigatório observar um conjunto de sintomas típicos para que
seja possível confirmar o diagnóstico. Por outro lado, patologias como o parkinsonismo secundário e
o parkinsonismo atípico podem dificultar o diagnóstico de DP pois apresentam quadros clínicos
semelhantes, exigindo por isso despiste (Lang & A M Lozano 1998).
O parkinsonismo secundário pode ter origem medicamentosa, sendo potencialmente
reversível, ou pode estar relacionado com doenças como encefalites, meningites, tumores e
complicações vasculares, enquanto o parkinsonismo atípico é incapacitante e o processo de
degeneração não se limita à substantia nigra, afectando outras regiões do cérebro e evoluindo para
desordens como a Demência com Corpos de Lewy e a Atrofia Multi-Sistémica (Lang & A M Lozano
1998).
6
A investigação das formas de parkinsonismo hereditário levou a revelações sobre os
mecanismos moleculares da morte dos neurónios dopaminérgicos subjacente à DP idiopática. Após
uma prenunciada perda neuronal, característica de estágios intermédios da doença, assiste-se à
neurodegeneração generalizada do sistema nervoso central (SNC) (H. Braak et al. 2003).
Independentemente das diferentes manifestações da DP, todas convergem para a formação de CL e
posterior morte dos neurónios dopaminérgicos da SNpc (Sulzer 2007). Estudos genéticos e
moleculares da DP hereditária permitirão a uma melhor compreensão da relação entre os corpos de
Lewy e perda de células neuronais dopaminérgicas (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
É ainda de realçar que as características clínicas dos doentes com DP incluem tanto as
incapacidades motoras, anteriormente referidas, como sintomas autonómicos, cognitivos e
psiquiátricos (Thomas & Beal 2007). Especificamente, dentro dos sintomas autónomos surge ainda a
seborreia frontal, a sialorreia, a hiperhidrose e a retenção urinária.
2.1. Incidência
A DP é uma patologia neurodegenerativa esporádica e idiopática descrita como complexa e
multifactorial que presentemente não tem cura, apesar de ser possível atenuar os seus sintomas,
nomeadamente através da terapia com levodopa (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
A incidência da DP encontra-se sobretudo correlacionada com a idade e sexo. Verifica-se um
aumento da prevalência em idades compreendidas entre 44 e 85 anos (Fahn & Sulzer 2004) em que a
afectação varia de 1 a 2% da população com idade superior a 65 anos (de Rijk et al. 1997) aumentando
para 4%-5% por volta dos 85 anos (L. S. Forno 1996; Kachergus et al. 2005). Relativamente à incidência
nos diferentes sexos, vários estudos apontam para uma prevalência superior nos homens na razão
de uma vez e meia face às mulheres, sendo esta tendência geralmente explicada pelo efeito
neuroprotector do estrogénio e dos factores genéticos de risco associados ao cromossoma X, entre
outros (Wooten 2004).
2.2. Etiologia
Os resultados provenientes da etiologia da DP ainda estão em discussão. Presentemente,
vários estudos sugerem que a degeneração neuronal associada à patologia encontra-se estritamente
relacionada com o stress oxidativo, disfunções mitocondriais, uma anormal degradação de
proteínas, a acção de excitotoxinas, o deficiente suporte neurotrófico e com mecanismos de
imunidade associados à inflamação (Muqit et al. 2004; Lang & A M Lozano 1998; D. J. Moore, Andrew
B West, et al. 2005; Abou-Sleiman et al. 2006; M. T. Lin & Beal 2006; Wersinger & Sidhu 2006). A
ênfase na etiologia idiopática tenderá a diminuir com o tempo, enquanto os mecanismos genéticos e
ambientais da morte neuronal na DP são definidos.
7
2.3. Mecanismos de Morte Celular
A DP é caracterizada por uma degeneração progressiva de neurónios dopaminérgicos da
SNpc. No entanto, o mecanismo de morte celular não está bem compreendido. Diferentes formas de
morte celular devem contribuir para a perda de células dopaminérgicas: apoptose, necrose ou
degeneração autofágica, tendo sido demonstrado que neurónios da SNpc de doentes com DP
apresentam características de apoptose e degeneração autofágica (Anglade et al. 1997; William G
Tatton et al. 2003). No entanto, são necessários mais estudos para elucidar as cascatas intracelulares
que conduzem à morte celular nesta doença neurodegenerativa crónica e progressiva.
Recentemente, tem sido dada especial atenção a vários mecanismos conceptualmente
distintos, com participação activa na indução da morte celular, a disfunção mitocondrial, o stress
oxidativo e a excitotoxicidade. É possível que todos eles interajam e se amplifiquem (Dunnett &
Bjorklund 1999), conduzindo a uma disfunção neuronal e atrofia que culmina na morte celular.
2.3.1. Disfunção mitocondrial
Diversos estudos equacionam a hipótese de a disfunção mitocondrial estar na origem ou ser
um factor importante no desenvolvimento de DP. Um defeito no complexo I, com diminuição da
actividade do mesmo, poderá estar na origem da diminuição na síntese de ATP. Na verdade,
mutações no complexo I estão directamente relacionadas com a agregação da α-sinucleína, uma
proteína envolvida na DP, que contribui para a diminuição do número de neurónios dopaminérgicos
(Ted M Dawson & Valina L Dawson 2003).
A toxicidade do MPP+, o metabolito neurotóxico derivado do 1-metil-1-4-fenil-1,2,3,6-
tetrahidropiridina (MPTP), inibe a formação de NADH, o que resulta na inibição do complexo I do
mitocôndrio, levando a uma insuficiência energética da célula (Nicklas et al. 1987). Além disso, a
toxina rotenona também actua ao nível do mitocôndrio, inibindo selectivamente o complexo I (P
Jenner 2001; J T Greenamyre et al. 1999) e a cadeia transportadora de electrões (E. R. D. L. T. Gil
2009). No entanto, parece que a disfunção mitocondrial não está exclusivamente relacionada com os
neurónios dopaminérgicos da SNpc, visto ser também observada a nível do striatum e outros tecidos
(W D Parker et al. 1989; Cardellach et al. 1993; W Davis Parker & Swerdlow 1998).
A Dieldrina e Maneb são dois pesticidas que inibem de forma selectiva o complexo III e a
cadeia transportadora de electrões. Estudos comprovam que a concentração de Dieldrina em
cérebros de doentes com DP é maior que os respectivos controlos e que a exposição crónica ao
Maneb provoca o síndrome parkinsónico crónico (E. R. D. L. T. Gil 2009).
8
2.3.2. Stress oxidativo
Diversas observações têm suportado a hipótese do stress oxidativo, através da peroxidação
lipídica, contribuir para a DP (T. Yoshikawa 1993). O cérebro depende fundamentalmente da energia
produzida nos mitocôndrios, associado à produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Existem
várias fontes potenciais indutoras de stress oxidativo, incluindo a disfunção mitocondrial, níveis de
ferro livre aumentados e mecanismos de defesa contra radicais livres danificados (Foley & Riederer
2000). Sob circunstâncias específicas, o stress oxidativo, poderá desenvolver-se ao nível da
substantia nigra, provocando danos nas células e conduzindo à morte celular (Olanow & W G Tatton
1999). O herbicida Paraquat é um dos exemplos que incrementam o risco de DP actuando através da
produção de ROS.
2.3.3. Excitotoxicidade
Os danos causados pelo excesso de glutamato, resultantes de uma alteração da
permeabilidade das células ao cálcio, através dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDAr), são
considerados como fazendo parte da neurodegeneração. Pensa-se que a excitotoxicidade induzida
pelo glutamato representa um importante papel na isquémia (Rothman & Olney 1986; Ikonomidou &
Turski 1996) e epilepsia (Olney et al. 1986) e deverá ser um importante factor na DP. A activação
massiva de receptores de glutamato poderá resultar em aumentos excessivos da pool de Ca2+, que
em última instância provoca morte neuronal (Mody & MacDonald 1995). A morte celular induzida
pelo excesso de glutamato ocorre por dois mecanismos fundamentais: formação excessiva de óxido
nítrico (NO)(Peter Jenner 2003) e disfunção neuronal (Schinder et al. 1996). A suportar a importância
deste mecanismo de excitotoxicidade na DP existem dados que demonstram que antagonistas do
NMDA protegem os neurónios dopaminérgicos da morte celular, induzida pelo tratamento de ratos
e primatas (Turski et al. 1991; J T Greenamyre et al. 1994) com MPTP.
2.4. Parkinson idiopática e hereditária
As vias metabólicas subjacentes ao quadro patológico da DP não são bem conhecidas, no
entanto, sabe-se que podem resultar da combinação de factores ambientais e genéticos. Os casos
idiopáticos e hereditários de DP apresentam características semelhantes, mas os casos hereditários
surgem em idades precoces (<40 anos) e encontram-se associados a características clínicas atípicas,
como é o caso do Parkinsonismo Juvenil Autossómico Recessivo (PJ-AR) (Yamamura et al. 1993).
Estudos epidemiológicos revelam que menos de 10% dos doentes com DP apresentam uma estrita
etiologia hereditária (DP mendelianas), apresentando DP autossómica recessiva (DP-AR) ou
dominante (DP-AD), no entanto, na maioria dos doentes os casos são idiopáticos (Thomas & Beal
2007).
9
Apesar da raridade dos casos de DP hereditária, a descoberta de cada vez mais genes
envolvidos nesta patologia tem vindo a confirmar a importância e o papel dos factores genéticos no
desenvolvimento da doença, fornecendo pistas essenciais na compreensão da patogénese molecular
da DP idiopática (Thomas Gasser 1998; Thomas & Beal 2007). Apesar da relação mencionada ser
pouco clara, o facto de partilharem das mesmas características patofisiológicas sugere o
envolvimento de mecanismos patogénicos comuns (John Hardy 2003).
10
3. Parkinson Juvenil Autossómico Recessivo (PJ-AR)
O PJ-AR é uma doença neurodegenerativa, inserida na DP hereditária, que surge antes dos
40 anos manifestando-se de forma lenta e progressiva (H Takahashi et al. 1994). Esta doença é
sintomaticamente diferente da DP idiopática, no entanto, apresenta características clínicas
semelhantes. Os doentes com PJ-AR apresentam um leve parkinsonismo com resposta ao
tratamento com levodopa, sendo os principais sintomas a instabilidade da postura, distonia do pé,
hiperreflexia, óbvias flutuações diurnas dos sintomas parkinsónicos e uma melhoria dos sintomas
após um sono ocasional que pode durar algumas horas (Ishikawa & Tsuji 1996).
A condição autossómica recessiva, sendo encontrada em doentes cujos progenitores
partilham consanguinidade e é observada numa única geração. A média de idades de início da
doença ronda os 25 anos (24.6 ±3.2 [mean ± SEM, range; 8 a 38, n=9]) nos homens e 23 anos (22.5
±2.7 [mean ± SEM, range; 8 a 43, n=17]) nas mulheres (M. Saito et al. 1998) sendo que a manifestação
clínica ocorre por volta dos 40 anos (E. R. D. L. T. Gil 2009).
Esta condição encontra-se descrita predominantemente na população Japonesa, podendo
ter diferentes denominações, das quais se destaca o parkinsonismo autossómico recessivo de inicio
precoce com flutuações diurnas, forma hereditária de parkinsonismo e parkinsonismo juvenil
(Yamamura et al. 1973; Takubo et al. 1996).
Alterações no gene PARK2 (MIM 602544) foram identificadas como preponderantes para o
desenvolvimento do PJ-AR (MIM 600116), estando descritas mais de cem alterações onde as mais
graves levam ao consequente misfold e perda de função da proteína codificada (Shimura et al. 2000).
O estudo do gene indutor do PJ-AR, permitirá elucidar os mecanismos moleculares
subjacentes à degeneração selectiva dos neurónios dopaminérgicos da SNpc no PJ-AR e
impulsionará a compreensão dos mecanismos de degeneração neuronal na DP (M. Saito et al. 1998).
A nível histológico, os doentes apresentam uma perda neuronal óbvia, com uma marcada
despigmentação da SNpc, resultante da diminuição dos neurónios que contêm neuromelanina nesta
zona. Para além desta perda neuronal, é observada a deposição extraneuronal de melanina e gliose
na zona central e ventrolateral da SNpc (van de Warrenburg et al. 2001). A zona cerebral do cerúleo,
que possui a maior densidade de neurónios dopaminérgicos, apresenta também um acentuado
decréscimo neuronal e uma diminuição do conteúdo em neuromelanina.
Apesar de estas características também estarem presentes em doentes com DP, no caso dos
doentes com PJ-AR (e contrariamente à DP) não é observada a presença de CLs no conteúdo celular
dos neurónios da substância nigra (SN) e cerúleo (SAITO 2000; H Takahashi et al. 1994) . A ausência
de CLs nesta doença sugere que a função da Parkina seja crucial na formação dos corpos de inclusão
(Sasaki et al. 2004). É no entanto importante referir a existência de uma excepção descrita na
literatura (M Farrer et al. 2001).
11
A relação entre a PJ-AR e a DP idiopática foi inicialmente questionada porque os doentes de
PJ-AR são atípicos quando comparados com os doentes de DP idiopática, nomeadamente na
sintomatologia e na idade do surgimento dos sintomas clínicos (21,9 vs 58 anos de idade,
respectivamente) (H. Mori et al. 1998; H Takahashi et al. 1994). A distonia e as flutuações diurnas
sintomáticas são frequentemente observadas em doentes com DP precoce, mesmo sem historial
hereditário (H. Mori et al. 1998). Algumas das características atípicas da PJ-AR podem estar
relacionadas com a idade do surgimento da patologia em vez de uma PJ-AR particular.
Mutações no gene da Parkina foram estabelecidas como base na genética da PJ-AR assim
como com os casos mais típicos de DP, e a PJ-AR cumpre uma definição comummente utilizada da
DP hereditária (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002). Estudos iniciais em cérebros post-mortem com
PJ-AR contribuem para a polémica sobre a relação entre a PJ-AR e a DP idiopática. A análise de um
número restrito de cérebros com PJ-AR mostra duas características comuns: 1) a perda de neurónios
dopaminérgicos na substantia nigra e 2) o tronco cerebral gliose não apresentar corpos de Lewy (H.
Mori et al. 1998; H Takahashi et al. 1994). Autópsias de doentes de PJ-AR com mutações na Parkina
também revelam ausência de corpos de Lewy, com uma excepção (Portman et al. 2001; Hayashi et al.
2000; M Farrer et al. 2001). Embora a ausência de corpos de Lewy na PJ-AR exclua esse distúrbio
patológico de cumprir os critérios estabelecidos para o diagnóstico da DP, a PJ-AR e o gene da
Parkina subjacentes são susceptíveis de ter um relacionamento próximo com DP idiopática (Paul S.
Fishman & G. a Oyler 2002).
A ausência de Corpos de Lewy na PJ-AR impulsionou o interesse na relação da PJ-AR
heredit|ria e a DP causada por mutações na α-sinucleína. Quando as famílias com mutações de α-
sinucleína foram descritas, a relevância das formas hereditárias de parkinsonismo esporádico com
resposta à levodopa tornou-se evidente (Polymeropoulos et al. 1997). A descoberta de que a α-
sinucleína era um dos principais componentes de Corpos de Lewy estabeleceu uma característica
comum entre parkinsonismo hereditário responsivo à levodopa e à DP idiopática (Spillantini et al.
1997). Esta constatação reforçou a ideia de que formas hereditárias de parkinsonismo responsivo à
levodopa deveriam ser definidas como DP hereditária, e ilustram a importância de identificar genes
para a DP hereditária, mesmo entre grupos restritos de doentes que apresentam características
atípicas.
Alguns estudos revelam ainda que ocasionalmente são observadas inclusões basofílicas,
diferentes dos CLs, com uma forma esférica que apresentam na sua constituição α-sinucleína e
ubiquitina (Sasaki et al. 2004), sendo de evidenciar que, a variedade de aberrações que se verificam
na Parkina poderá provocar diferenças patológicas tanto em grau como na distribuição da
neurodegeneração, incluindo a presença ou ausência de CLs. Esta hipótese vem reforçar uma
possível ligação entre parkinsonismo induzido pela Parkina e a DP idiopática (Sasaki et al. 2004).
12
Estudos de imagiologia de doentes de PJ-AR mostram uma perda da função no transporte
de dopamina semelhante à DP típica, apoiando a relevância da PJ-AR para a DP típica, determinando
a perda da função dos neurónios dopaminérgicos (Broussolle et al. 2000; Hilker et al. 2001).
13
4. O locus PARK2: Estrutura e função
Desde a identificação do locus PARK2, o conhecimento genotípico e fenotípico das
mutações genéticas da Parkina tem expandido (Abbas et al. 1999; C B Lücking et al. 2001). O gene
Park2 encontra-se entre os maiores genes humanos, com um comprimento de 1.380.245pb, possui 12
exões e várias formas de splicing alternativo (E. R. D. L. T. Gil 2009). Encontra-se localizado no
cromossoma 6q25.2-q27 (Matsumine et al. 1997) e foi identificado por clonagem posicional em 1998
(T Kitada et al. 1998). O seu elevado tamanho deve-se aos extensos intrões que resultam numa open
reading frame de apenas 1395pb que codifica para uma proteína de 465 aminoácidos com um peso
molecular aparente de 52kDa (T Kitada et al. 1998). Ao estudar este gene verificou-se codificar uma
proteína de origem anteriormente desconhecida denominada de Parkina (T Kitada et al. 1998), uma
proteína evolutivamente conservada que está presente, com elevado grau de homologia, em
Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Rattus rattus e em outras espécies
(Culetto & Sattelle 2000; Tohru Kitada et al. 2000; Horowitz et al. 1999; Y.-J. Bae et al. 2003).
O promotor do gene da Parkina é um promotor bidireccional, regulando a transcrição da
Parkina e do gene upstream antissense (Andrew B. West et al. 2003) que possui 5 exões e um
comprimento total de 0.6Mb. O gene upstream antissense constituí o gene co-regulador da Parkina
(PACRG), no entanto, a sua relevância fisiológica ou patofisiológica é desconhecida.
As mutações no gene da Parkina foram as primeiras a serem associadas ao PJ-AR hereditário
(T Kitada et al. 1998). Ao contr|rio da α-sinucleína, uma proteína envolvida na DP, as mutações na
Parkina parecem ser relativamente comuns na DP hereditária e são responsáveis por muitos casos de
incidência precoce da DP (C B Lücking et al. 2000; Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002) uma vez que
cerca de 50% dos doentes com DP precoce apresenta mutações na Parkina (C B Lücking et al. 2000).
As primeiras mutações no locus PARK2 que levaram à identificação do gene correspondem a
grandes delecções homozigóticas, de um e cinco exões respectivamente (Tohru Kitada et al. 2000).
Desde então, uma variedade de mutações foi identificada, entre elas, delecções de um ou vários
exões, duplicações ou triplicações de exões, mutações em frame-shift, mutações pontuais que
podem ser subdivididas em mutações missense (substituição de um resíduo de aminoácido por
outro), non-sense (resultando num codão stop) e splice-site (intrónicas) (A. West et al. 2002; C B
Lücking et al. 2000; Abbas et al. 1999; E. R. D. L. T. Gil 2009).
Delecções homozigóticas na Parkina, semelhantes às do Japão, foram encontradas em
linhagens da Europa, juntamente com a identificação de linhagens contendo delecções adicionais
(exão 8-9, na Argélia) e mutações pontuais homozigóticas (Paisán-Ruíz et al. 2004; Zimprich et al.
2004; Thomas & Beal 2007). Na Europa foram identificadas 35 famílias com DP de início precoce,
possuindo um padrão autossómico recessivo com mutações na Parkina. A partir dessas linhagens,
14
outras nove famílias portadoras de novas mutações, sobretudo mutações pontuais, foram
descobertas com idade de início tardio (38 ± 12 anos) manifestando um fenótipo mais parecido com a
DP idiopática (Abbas et al. 1999).
Juntamente com os doentes que apresentavam mutações heterozigóticas na Parkina e a
combinação de mutações pontuais ou delecções com uma mutação pontual, foi identificada uma
família com uma herança pseuso-dominante onde a mutação no segundo alelo não foi identificada,
mesmo após o screening de todos os exões da Parkina, sugerindo que mutações no promotor ou nos
intrões da Parkina também poderão originar a doença (C Klein et al. 2000). Fica, no entanto, por
determinar se esses doentes expressam Parkina funcional (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
Quando o interesse se centrou sobre os casos com início precoce, sem histórico hereditário
conhecido, as mutações homozigóticas da Parkina também foram detectadas. No Japão, 2% dos
doentes de DP aparentemente idiopática, com incidência precoce (6,3% abaixo de 50 anos de idade),
são portadores de mutações na Parkina. Apesar da vasta gama de sintomas que foram observados
nestes doentes, eles tendem a ser jovens e a ter um quadro clínico atípico descrito para PJ-AR,
apresentando distonia, apresentação simétrica e excelente resposta inicial a levodopa, mas com
aparecimento precoce de discinesia.
As mutações na Parkina associadas à PJ-AR ocorrem tanto na forma homozigótica como
heterozigótica apresentando os alelos com diferentes mutações. Por outro lado, sendo o PJ-AR uma
condição autossómica recessiva, é espectável que ambos os alelos se encontrem afectados por uma
mutação que interfira com a expressão ou função da proteína. No entanto, foram reportados alguns
casos onde apenas um dos alelos surge mutado, mesmo após um intenso screening (M Farrer et al.
2001; A. West et al. 2002), sendo estes casos explicados por um modelo de haploinsuficiência (M
Farrer et al. 2001) ou pelo facto da Parkina poder ser inibida pós-traducionalmente. Um exemplo da
inibição pós-traducional observa-se com a S-nitrosilação in vivo da Parkina, que leva à inibição da
actividade E2 ligase removendo a sua acção protectora (K. K. K. Chung et al. 2004). Assim sendo,
uma mutação heterozigótica associada ao stress nitrosativo pode promover a manifestação da
haploinsuficiência, reforçando a observação das mutações heterozigóticas associadas à doença. Um
ganho de função tóxica ou um efeito negativo dominante transportando algumas mutações
missense é também uma hipótese plausível. No entanto, descobertas de que proteínas truncadas não
são expressas a níveis detectáveis em cérebros de doentes com delecções dos exões 3 ou 4 (Shimura
et al. 1999; Shimura et al. 2001) reforça o conceito da ocorrência de mutações que levam à perda de
função como sendo o mecanismo patológico predominante no PJ-AR.
Globalmente, as formas monogénicas de DP são raras entre os genes identificados até à
data, sendo que as mutações na Parkina parecem ser a causa mais comum de PJ-AR. Num estudo
europeu, com doentes com idade de surgimento da doença até aos 45 anos de idade ou indivíduos
com um irmão afectado pela mesma condição, foram identificadas mutações na Parkina em cerca de
50% dos casos hereditários e em 18% de casos idiopáticos de DP (C B Lücking et al. 2000). Em doentes
sem historial hereditário, foram observadas mutações na Parkina em 44% dos doentes que tinham
15
idade de surgimento inferior aos 30 anos e apenas em 3% dos que tinham idade de surgimento
superior aos 30 anos de idade (Martin Kann et al. 2002). Outros relatórios suportam esta ordem de
magnitude, sendo as variações descritas atribuídas aos diferentes critérios usados.
Em geral os irmãos gémeos heterozigóticos de indivíduos com PJ-AR não são afectados, no
entanto, alguns desses irmãos têm resultados parcialmente discrepantes na tomografia de
fluorodopa por emissão de positrões (PET), sugerindo que indivíduos com um gene Parkina anómalo
podem ter mudanças pré-clínicas na DP (Broussolle et al. 2000). Note-se que alguns doentes têm
apenas uma mutação na Parkina identificada sendo provável que os doentes portadores de uma
mutação no locus da Parkina não tenham sido identificados por razões técnicas ou porque a mesma
se encontra numa região não-exónica, como o promotor de Parkina. No entanto, é possível que
alguns desses doentes tenham de facto a doença associada a apenas um alelo de Parkina mutante (C
Klein et al. 2000; J. Satoh & Y Kuroda 1999; Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
Ao longo de vários anos, treze loci foram identificados e relacionados com os casos DP
hereditária, apresentando um traço mendeliano autossómico dominante ou recessivo.
Existem, no entanto, seis causas genéticas claramente definidas (figura 2) associadas aos
genes da α-sinucleína (PARK1) (Polymeropoulos et al. 1997), Parkina (PARK2) (T Kitada et al. 1998),
UCHL-1 (PARK5)(Leroy et al. 1998), PINK1 (PARK6)(Valente et al. 2004), DJ-1 (PARK7) (Vincenzo
Bonifati et al. 2003) e LRRK2/dardarina (PARK8) (Zimprich et al. 2004; Paisán-Ruíz et al. 2004;
Thomas & Beal 2007).
Locus Cromossoma Gene Hereditariedade Função provável
PARK1/4-SNCA 4q21.3 α-sinucleína AD Proteína pre-sináptica/ Chaperone
PARK2 6q25.2-27 Parkina AR Ligase E3 ubiquitina
PARK5 4p14 UCH-L1 AD Hidrolase c-terminal ubiquitina
PARK6 1p35-36 PINK-1 AR Cinase
PARK7 1p36 DJ-1 AR Chaperone
PARK8 12p11.2q-13.1 LRRK2 AD Cinase
Figura 2 - Loci envolvidos na genética da DP, localização cromossómica, gene, hereditariedade e função provável
adaptado de Gil (Gil 2009).
O fenótipo associado à Parkina não é consistente o suficiente para permitir a identificação
dos doentes caso a caso. Uma grande variedade de genótipos resultantes de mutações da Parkina
parece causar fenótipos semelhantes na população europeia, com 19 diferentes rearranjos exónicos
(e uma delecção intrónica) e 16 mutações pontuais exónicas diferentes identificadas nessas famílias,
apesar dos sintomas semelhantes (C B Lücking et al. 2000; M Periquet et al. 2001). O rastreio dos
vários tipos de mutações associadas a DP, em diversos grupos hereditários, sugere uma origem
comum para as mutações pontuais. Já os rearranjos exónicos mais prováveis ocorrerão de forma
independente nas diferentes famílias (M Periquet et al. 2001).
16
5. Factores genéticos envolvidos na patogénese hereditária
5.1. PARK1 e 4-SNCA (α-sinucleína)
Os genes PARK1 e 4-SNCA codificam para a α-sinucleína, sendo o principal constituinte dos
CLs devido ao elevado potencial para a agregação, formando agregados insolúveis e tóxicos para a
célula, induzindo stress proteolítico, neurodegeneração (Thomas & Beal 2007) e pensa-se que
poderá estar envolvida na patogénese da DP e da Demência com CLs. Espécies mutadas
incrementam a propensão para agregar em diferentes graus, sendo que, diferentes tipos de
mutações nos genes produzem manifestações diferentes da doença (Polymeropoulos et al. 1997).
Os genes que codificam para a α-sinucleína foram a primeira causa genética identificada
associada à DP hereditária, estando esta relacionada com um fenótipo autossómico dominante.
Contudo, foi a identificação de todos estes genes e da relação entre as suas mutações e a forma
hereditária de DP que veio fornecer uma ajuda considerável na compreensão da patogénese da DP
(Portman et al. 2001).
A identificação da α-sinucleína como o principal componente dos Corpos de Lewy, tanto na
forma da DP hereditária como na idiopática, guiou a investigação para o estudo do papel da α-
sinucleína na patogénese da DP. Uma tendência semelhante de generalizar as conclusões para a
função da Parkina na PJ-AR à DP idiopática também está a ocorrer (Paul S. Fishman & G. a Oyler
2002).
5.2. PARK2 (Parkina)
Mutações no gene da Parkina (PARK2) surgem com elevada frequência, sendo observadas
em cerca de 50% dos casos de DP hereditária (Betarbet et al. 2005). Quando o gene se encontra
mutado manifesta-se um fenótipo autossómico recessivo juvenil da DP. Uma vez que o tema do
presente trabalho recai especificamente sobre este gene e proteína, ao longo deste capítulo, mais
informação será apresentada relativamente a este assunto.
5.3. PARK5 (UCH-L1)
O UCH-L1 encontra-se associado a várias doenças neurodegenerativas, entre elas a DP
hereditária e a DA (Betarbet et al. 2005). Este gene codifica para a proteína homónima que pertence
ao grupo de enzimas desubiquitinadores responsáveis pela hidrólise de cadeias de poliubiquitina em
monómeros de ubiquitina (Pickart 2000) encontrando-se exclusivamente em neurónios. Quando
apresenta mutações a sua actividade sofre uma redução em cerca de 50% levando à diminuição da
ubiquitinação e consequente deposição de proteínas anormais nos neurónios (Pickart 2000).
17
5.4. PARK6 (PINK1)
O gene codifica para a PTEN-induced kinase 1 (PINK1), uma proteína com um domínio de
serina/treonina presente no mitocôndrio e que actua como protector celular em situações de stress
oxidativo. As suas mutações são a segunda causa mais comum de DP-AR, a seguir à Parkina. Infere-se
que mutações neste gene afectam a função mitocondrial e o processo de fosforilação proteica,
causando neurodegeneração devido à resposta anormal ao stress oxidativo (Valente et al. 2004).
5.5. PARK7 (DJ1)
A DJ1 é uma proteína homodimérica de grande relevância na protecção contra lesões
provocadas pelo stress oxidativo. Esta proteína encontra-se associada à DP-AR e possivelmente
apresenta actividade antioxidante, co-activador transcripcional e chaperone (Thomas & Beal 2007).
Várias evidências suportam o seu carácter antioxidante, funcionando como scavenger de espécies
reactivas de oxigénio (Taira et al. 2004). A sua função como chaperone encontra-se relacionada com
a capacidade de impedir a formação de agregados de α-sinucleína evitando a subsequente morte
celular (Shendelman et al. 2004; W. Zhou et al. 2006). Para além disso, a DJ1 associa-se com a Parkina
durante o stress oxidativo, sugerindo um papel comum na neurodegeneração (D. J. Moore, L. Zhang,
et al. 2005). A capacidade de upregulate transcripcionalmente a expressão da tirosina hidroxilase,
através da supressão da sumoilação do pyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor é de
especial interesse para a função dos neurónios dopaminérgicos (Zhong et al. 2006).
5.6. PARK8 (LRRK2)
Mutações no gene leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) ou dardarina causam DP-AD (Doença
de Parkinson Autossómica Dominante), são frequentemente estudadas devido à elevada prevalência
nos casos de DP hereditária (E. R. D. L. T. Gil 2009). As mutações neste gene compreendem cerca de
6% dos casos de parkinsonismo hereditário e cerca de 2% dos casos esporádicos (E. R. D. L. T. Gil
2009). O gene codifica para uma proteína de 280 kDa com múltiplos domínios pertencente à família
de proteínas ROCO, possuindo um domínio LRR (Leucine Rich Repeat), um domínio Roc (Ras on
complex) seguido de um COR (C-terminal Roc), um domínio MAPKKK (Microtubule Associated Protein
Kinase Kinase Kinase) e um domínio WD40 (E. R. D. L. T. Gil 2009). A sua função precisa é ainda
desconhecida, mas a presença de múltiplos domínios funcionais sugere o envolvimento em várias
funções (Thomas & Beal 2007). Alguns estudos referem esta proteína como sendo citoplasmática,
especialmente localizada no complexo de Golgi, vesículas sinápticas, membrana plasmática,
lisossomas e associados à membrana mitocondrial externa (Biskup et al. 2006; Galter et al. 2006)
sendo expressa em diferentes regiões do cérebro (E. R. D. L. T. Gil 2009).
Mutações no gene levam à depleção de proteínas das vesículas sináptica, evidenciando a
participação na orientação polarizada das proteínas das vesículas sinápticas para os axónios
18
(Sakaguchi-Nakashima et al. 2007). Estudos recentes demonstraram a capacidade de se associar com
lipid rafts e de regularem o comprimento e ramificação dos neuritos, sugerindo que o LRRK2 modula
a reciclagem de vesículas sinápticas, crescimento dos neuritos e funções inerentes ao complexo de
Golgi, lisossomas e mitocôndrios, nos quais disfunções podem comprometer a sobrevivência
neuronal (C. Li & Beal 2005).
Permanece pouco claro como é que o aumento da actividade de cinase afecta a sinalização
levando à patogénese na DP, no entanto, estudos recentes demonstraram alterações significativas
na fosforilação de proteínas chave envolvidas na sinalização via MAPK em doentes com mutação
neste gene (L. R. White et al. 2007).
19
6. Estruturas e funções
6.1. Estrutura da Parkina: Domínios
A Parkina apresenta uma estrutura modular (Figura 3) contendo um domínio N-terminal do
tipo ubiquitina (UBL), uma região central característica constituída pelo domínio RING0 e um super-
domínio C-terminal denominado de RING-IBR-RING (RBR) constituído por dois domínios RING (RING1
e RING2) (Really Interesting New Gene) separados por um domínio “In between RINGs” (IBR) (Beasley,
Hristova & Shaw 2007a; Hristova et al. 2009).
Tanto as estruturas RING mencionadas como o IBR apresentam 2 locais de ligação a zinco
cada, sendo estes cruciais na manutenção da estrutura tridimensional da Parkina. A remoção dos
iões resulta na perda de estrutura de grande parte da proteína (Hristova et al. 2009).
Figura 3- Estrutura modular da Parkina. UBL: Domínio semelhante à ubiquitina; R0: Domínio RING 0; R1: Domínio
RING 1; R2: Domínio RING 2; IBR: Domínio In-Between-RING. Adaptado de Mata, von Coelln e Hristova (Mata et
al. 2004; von Coelln et al. 2004; Hristova et al. 2009)
6.1.1. Domínio UBL
A análise da sequência da Parkina sugere uma ligação com a via da ubiquitina-proteassoma.
O grupo amina terminal (N-terminal) da Parkina apresenta uma identidade significativa com a
ubiquitina (62% de homologia nos primeiros 76 aminoácidos) e uma estrutura tridimensional com
folhas beta e hélices alfa que facilita a distribuição e degradação de substratos ubiquitinados
(Hristova et al. 2009). Esta região da Parkina é designada como o domínio de homologia ubiquitina
(UbiHD). A Ubiquitina, uma proteína com uma sequência de 76 aminoácidos evolutivamente
conservada, tem a função de marcação de proteínas específicas para degradação pela via do
proteassoma, estabelecendo uma ligação covalente entre a ubiquitina e a proteína (Voges et al.
1999). O proteassoma consiste num core catalítico 20S, forrado com enzimas proteolíticas, e duas
subunidades 19S que se dispõem nos topos do core 20S, para formar o proteassoma completo de
26S. A ligação de pelo menos quatro moléculas de ubiquitina a uma proteína é essencial para o
encaminhamento desta para a subunidade 19S, facilitando a entrada da proteína no core do
proteassoma. Inicialmente, a ligação é estabelecida entre a extremidade carboxilica da ubiquitina e
um grupo ε-amina de um resíduo de lisina da proteína-alvo. As adições posteriores, de mais cadeias
20
de ubiquitina, são feitas estabelecendo ligação entre a nova cadeia de ubiquitina e o resíduo 48 da
lisina pertencente à ubiquitina anterior (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002; Voges et al. 1999).
6.1.2. Super-domínio RING-IBR-RING (RBR)
A análise do terminal carboxil (C-terminal) da Parkina também sugere uma participação da
Parkina no sistema ubiquitina-proteassoma e foi importante na previsão da função da Parkina. O C-
terminal da Parkina contém os dois motivos RING separados por uma região rica em cisteína
denominado domínio "In between RINGs" (IBR), com a estrutura do domínio C-terminal completo
denominado "RING-IBR-RING". Motivos RING são comuns no C-terminal da ubiquitina E3 ligase
(Lorick 1999).
O super-domínio C-Terminal RBR apresenta uma arquitectura evolutivamente conservada
com uma percentagem elevada de cisteínas e histidinas. Este domínio encontra-se unicamente em
proteínas de células eucariotas e é vulgarmente associada à actividade E3 ligase da Parkina (Beasley,
Hristova & Shaw 2007a), à semelhança das proteínas caracterizadas até à data que a contêm. Com
base na análise de sequências, a cada domínio RING do RBR da Parkina devem associam-se dois iões
zincos em forma de cinta cruzada usando o motivo C3HC4. No entanto, outros estudos sugerem que
apenas se deverá associar um único ião zinco, não existindo consenso (Beasley, Hristova & Shaw
2007a). O RBR é essencial para a ubiquitinação, em que os dois domínios RING medeiam a interacção
da Parkina com as proteínas E2 de conjugação UbcH7 e UbcH8 necessárias ao processo.
No geral, os domínios RING são caracterizados por possuir uma sequência específica (figura
4). Este domínio medeia a interacção proteína-proteína em enzimas E3 (Borden 2000; Morett & Bork
1999).
[Cys–X2–Cys–X9-39–Cys–X13–His–X23–Cys/His–X2–Cys X4-48–Cys–X2–Cys]
Figura 4 – Sequencia especifica característica de domínios RING em que X representa qualquer aminoácido.
Retirado de Borden, Morett e Bork (Borden 2000; Morett & Bork 1999).
6.1.3. In between RINGs
O domínio IBR da Parkina assiste no recrutamento de proteínas envolvidas na ubiquitinação,
orientando o RING1 e o RING2 de forma a facilitar a interacção de proteínas e subsequente
ubiquitinação. Por exemplo, a formação de complexos entre a Parkina e as proteínas UbcH7 e UbcH8
é aumentada na presença do domínio IBR (Beasley, Hristova & Shaw 2007a). Na ubiquitinação do
Sept5 (proteína associada a vesículas sinápticas), os domínios IBR-RING2 acentuam a ligação e
actividade do UbcH8 (Y. Zhang et al. 2000). De forma muito semelhante ocorrem as mesmas
observações para o caso da ligação da Sinfilina-1 à Parkina (K. K. Chung et al. 2001). O domínio IBR é
fundamental para a geometria do RBR, que por sua vez é crucial para o recrutamento do chaperone
Hsp70 (Y. C. Tsai et al. 2003), uma componente necessária para a apresentação de substratos
unfolded em vários complexos de ubiquitinação. Este domínio possui dois locais de ligação de iões
zinco, sendo este essencial para o folding da Parkina (Hristova et al. 2009).
21
As mutações na Parkina são frequentemente grandes delecções ou mutações frame-shift
que codificam a proteína sem ambos os domínios RING e actividade E3 in vitro (Shimura et al. 2000).
A Parkina não foi detectada nos primeiros doentes de PJ-AR avaliados o que sugere que a proteína
truncada é instável e não consegue acumular (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002; Shimura et al. 1999).
Figura 5 - Estrutura do domínio IBR (307-384) na zona 320-377 (NMR). A zona N-terminal 307-319 e C-terminal 378-384 não surgem representadas devido à falta de estrutura. (a) Sobreposição do backbone de 20 estruturas usando CYANA. Local I de ligação do zinco compreende as extensas regiões em loop L1 (azul) e L2 (verde), e o local II de ligação do zinco encontra-se a vermelho. (b) Representação do IBR da Parkina, demonstrando a posição dos resíduos coordenados com os zincos. Adaptado de Beasley, Hristova e Shaw (Beasley, Hristova & Shaw 2007a).
As perdas de função por mutações autossómicas recessivas, tais como aquelas encontradas
na Parkina, são pouco comuns em doenças neurodegenerativas de início em adulto. Mutações em
outros genes ligados a cada uma das principais doenças neurodegenerativas são herdadas num
padrão autossómico dominante. Esta lista inclui os genes das proteínas precursoras das amiloideses,
presenilinas, α-sinucleína, proteínas de poliglutamina expandida (poliQ), e a superóxido dismutase
Cu/Zn (SOD1), em que a proteína mutante codificada que induz a doença manifesta um "ganho de
função tóxico", onde o mecanismo de toxicidade tem pouca relação com a função normal da
proteína (formação de fibras amilóides).
6.1.4. Domínio RING0
Este domínio é específico da Parkina e localiza-se na sua região central característica. É
essencial para a função da proteína, existindo mutações descritas associadas ao PJ-AR. Este domínio
foi identificado recentemente (Hristova et al. 2009) e, à semelhança do RBR, é um domínio rico em
cisteínas e histidinas. Apresenta dois locais de ligação ao zinco separados por um fragmento de 26
resíduos de aminoácidos onde pode ocorrer splicing (Hristova et al. 2009) e que distingue o domínio
RING0 de todas as outras estruturas RING. Por sua vez, todas as mutações que ocorrem entre o
domínio UBL e o RBR, à excepção de uma, encontram-se localizadas no domínio RING0 (Hristova et
al. 2009).
22
6.2. Função da Parkina
Na sua forma canónica, esta ligase possui uma cadeia polipeptídica de 465 aminoácidos,
constituída por múltiplos domínios e caracterizada como sendo homóloga da família de proteínas de
ubiquitina, que se encontram envolvidas na patogénese de várias doenças neurodegenerativas,
sendo componentes dos CL na DP (Iwatsubo et al. 1996; Galloway et al. 1992; Love et al. 1988) e dos
filamentos emparelhados em hélice na DA (H. Mori et al. 1987; Morishima-Kawashima et al. 1993;
Fuchs 1995). Os CL contêm quantidades abundantes de cadeias multi-ubiquitinadas associadas a
proteínas, sendo que, a degradação incompleta das proteínas associadas ao CL pode estar na base
desta deposição nas inclusões (Iwatsubo et al. 1996). Assim sendo, a ubiquitina e/ou as proteínas
semelhantes à ubiquitina (ex. Parkina) apresentam-se como importantes alvos de estudo no
contexto da patogénese da DP (T Kitada et al. 1998).
A Parkina é expressa em vários tecidos humanos, incluindo o cérebro, coração, testículos e
músculos esqueléticos. Especificamente no cérebro, a expressão da Parkina observa-se em várias
regiões, incluindo a SN (T Kitada et al. 1998). Mas, a sua localização celular permanece pouco clara.
Observações apontam para que a Parkina se encontre em mais do que um compartimento celular
sendo que o grau de visualização varia com a especificidade do anticorpo utilizado (Mark R. Cookson
2003). De uma forma geral, tendo em conta os estudos realizados pode-se concluir que a Parkina se
localizada no citoplasma (Shimura et al. 1999), na zona perinuclear e no complexo de Golgi, assim
como no núcleo celular (Um & K. C. Chung 2006).
Apesar de a Parkina estar ausente nos neurónios dos doentes com PJ-AR, nos doentes com
DP os níveis fisiológicos de Parkina não diminuem, tendo sido observada neste último grupo ao nível
dos CL (Shimura et al. 1999).
A descoberta de que a Parkina é uma E3 ligase de ubiquitina envolvida na degradação de
proteínas, veio fornecer uma importante ligação entre a agregação de proteínas e o sistema
ubiquitina-proteassoma na patogénese da DP (Shimura et al. 2000; Y. Zhang et al. 2000) . Como E3
ligase, a Parkina é portanto responsável pela adição de cadeias de poliubiquitina a substratos
específicos (von Coelln et al. 2004), que por sua vez são reconhecidos pelo proteassoma para
degradação (Sakata et al. 2003). As ligases de ubiquitina controlam a especificidade da selecção do
substrato pela maquinaria do proteassoma, e colaboram com outras duas enzimas E1 e E2
responsáveis pela activação e conjugação da ubiquitina respectivamente (Hershko 1983). O UbcH7 e
o UbcH8 são dois exemplos de enzimas E2 que interagem com a Parkina. Os conjugados de
poliubiquitina gerados nesta cascata são subsequentemente reconhecidos e degradados pelo
complexo do proteassoma 26S. A Parkina surge como um enzima com actividade de ligase de
ubiquitina, sendo que as mutações neste enzima podem ser os responsáveis pela PJ-AR devido à
deficiente proteólise dos seus substratos resultando na acumulação de proteínas na célula sem que
ocorra a formação de CL (Mark R. Cookson 2003). A acumulação de um ou mais substratos da
Parkina é especialmente tóxico no caso dos neurónios catecolaminérgicos (Dong et al. 2003), sendo
23
portanto importante a sua identificação tanto no contexto do PJ-AR como na DP idiopática, dado
que neste ultimo desarranjo a Parkina encontra-se S-nitrosilada. A S-nitrosilação da Parkina inibe a
função de ubiquitinação e protecção, promovendo a acumulação dos seus substratos que também
contribuem para a neurodegeneração na DP (K. K. K. Chung et al. 2004; Yao et al. 2004) .
A porção de ubiquitina de várias proteínas conjugadas com ubiquitina actua como
chaperone para as restantes porções da proteína (Finley et al. 1989), assim sendo, o domínio UBL da
Parkina poderá estar envolvida na sua maturação funcional. Por outro lado, a porção C-terminal da
Parkina que contem os motivos RING finger poderá funcionar como uma proteína zinc-finger no
controlo do crescimento celular, diferenciação e desenvolvimento (Saurin et al. 1996).
A relação entre a função Parkina e a DP evidenciou-se com a primeira identificação de corpos
de Lewy num paciente com mutações na Parkina (M Farrer et al. 2001). Este paciente era um dos
muitos doentes heterozigóticos recentemente identificados com uma delecção num alelo e uma
mutação pontual no outro alelo. Enquanto a diversidade de mutações identificadas na Parkina se
expande, as suas implicações na função da Parkina torna-se mais complexa. Embora a maioria das
mutações afectem a porção catalítica da molécula, uma família afectada foi encontrada com uma
mutação pontual no UBL (Terreni et al. 2001). Estudos também estão em andamento para
determinar se as variações alélicas particulares no gene da Parkina são mais comuns em doentes
com DP idiopática. A Parkina e a α-sinucleína serão em breve juntas a outros genes identificados que
causam DP hereditária. O conhecimento sobre a função destes produtos génicos irá contribuir para
uma imagem mais clara de como os genes e factores ambientais interagem para provocar a
características clínicas e patológicas que nós associamos com a DP.
6.2.1. Via de degradação pelo proteassoma
A monotorização, a nível celular, do folding proteico é feita por mecanismos de controlo da
qualidade das proteínas que asseguram o bom funcionamento de todos os processos celulares.
Nos organismos eucariotas, encontram-se descritas quatro vias de proteólise, usadas na
degradação de proteínas misfolded e na eliminação de proteínas de regulação. Algumas vias
proteolíticas são específicas para determinados tipos de substratos, como é o caso das proteínas
integrais de membrana que sofrem a acção de proteases RIP e das proteínas mitocondriais, que são
degradadas por proteases homólogas às bacterianas. No entanto, a maioria das proteínas celulares
são degradadas essencialmente por dois processos, pela via endolisossomal ou pela via da
ubiquitina-proteassoma.
Neste contexto, coloca-se a hipótese de alterações no processo de degradação de proteínas
através da via do sistema ubiquitina-proteassoma estarem na base de várias síndromes
neurodegenerativas, incluindo a DP (Alves-Rodrigues 1998).
24
Na via de degradação pelo sistema endolisossomal a proteólise ocorre por acção de enzimas
hidrolíticos que actuam ao nível dos lisossomas. Esta via degradativa permite processos celulares
como a autofagia, fagocitose e pinocitose, ou a degradação de proteínas citoplasmáticas através da
microfagia. A via da ubiquitina-proteassoma, por sua vez, é um processo especialmente direccionado
para a degradação de proteína como as proteínas da via secretora e citoplasmáticas. Apresenta
especificidade para a degradação de alguns substratos e portanto é indispensável (directa ou
indirectamente) ao nível de alguns processos celulares (Ciechanover & Brundin 2003). O mal
funcionamento desta via encontra-se na base de várias patologias como é o caso do PJ-AR já
mencionado anteriormente.
Após a serem traduzidas para o interior do reticulo endoplasmático (RE), as proteínas da via
secretora passam por vários processos de controlo de qualidade (ERQC) (Figura 6). Inerente a este
sistema existe associado um mecanismo de degradação que permite a translocação das proteínas
misfolded para o citoplasma para posteriormente ser degradada pela via da ubiquitina-proteassoma.
Por sua vez, as proteínas produzidas no citoplasma pelos ribossomas livres caso apresentem um
folding incorrecto são reconhecidas (directamente ou por intermédio de chaperones) pela via da
ubiquitina-proteassoma e são degradadas. Comum a ambos os grupos de proteínas, a ubiquitinação
surge como reacção imprescindível na eliminação dos substratos proteicos misfolded (Vembar &
Brodsky 2008).
Figura 6 - Ilustração da degradação associada ao retículo endoplasmático. (a) Proteínas misfolded
intramembranares do citoplasma e lúmen do RE são reconhecidas por chaperones citoplasmáticos e do lúmen do
RE e por factores associados, como membros da família das Hsp70, calnexina e calreticulina, e isomerases de
ligações persulfureto. (b) Marcação proteica. Substratos do ERAD são retrotranslocados, após marcação, para a
maquinaria de retrotranslocação (o translocão) e/ou E3 ligases. (c) Iniciação da retrotranslocação. A
retrotranslocação do substrato para o citoplasma é iniciada pelo complexo Cdc48 (cell-division cycle-48) ou
outros componentes, como chaperones moleculares ou proteassoma. A energia proveniente da hidrólise do ATP
pelo Cdc48, que é um AAA+ ATPase, é usada na retrotranslocação. (d) Ubiquitinação e finalização da
retrotranslocação. Após a passagem pelo translocão, a proteína é poliubiquitinada por uma E3 ligase de
ubiquitina. A reacção finaliza a translocação com o auxílio de complexos citoplasmáticos que ligam ubiquitina a
proteínas. (e) Marcação e degradação proteassomal. Após a poliubiquitinação, o substrato disponível no
citoplasma é reconhecido pelos receptores do topo 19S pertencentes ao proteassoma 26S. Os enzimas envolvidos
na desubiquitinação (não apresentados) removem a marcação e a N-glicase de péptidos (não apresentado) que é
potencialmente necessária para uma degradação eficiente. O substrato é introduzido no core catalítico do
proteassoma onde é degradado em péptidos. A ubiquitina proveniente do processo de degradação pode ser
reciclada. Adaptado de Vembar e Brodsky (Vembar & Brodsky 2008).
25
A ubiquitina (IPR000626) é uma proteína constituída por 76 aminoácidos, resistente ao calor
e evolutivamente conservada. A ubiquitinação de substratos ocorre através da formação de uma
ligação isopeptídica entre o C-terminal do resíduo de Gly76 da ubiquitina e o grupo ε-amina de uma
Lys da proteína alvo. Por sua vez, a reacção de poliubiquitinação ocorre sucessivamente entre os
resíduos de Gly76 da nova ubiquitina e resíduo de Lys48 da molécula precedente. Existem ainda um
conjunto de proteínas, mencionadas como ubiquitin-like, semelhantes à ubiquitina que quando
ligadas a substratos proteicos específicos lhes confere novas funções a nível celular.
As reacções da via da ubiquitina-proteassoma ocorrem de forma sequencial e são cruciais no
processo de degradação de proteínas misfolded. Contudo, a especificidade mencionada relaciona-se
com o ultimo passo da via onde participa o enzima E3 ligase. Os enzima desta família apresentam
especificidade o substrato e participam na ligação da ubiquitina a este. Neste contexto, a Parkina,
com actividade E3 ligase específica para a α-sinucleína e Sinfilina-1, tem especial relevância a nível das
células neuronais. Proteínas da família das E3 ligases, como a Parkina (IPR000569, IPR003613),
juntamente com as da família das E1 (IPR018075), activadoras da ubiquitina, e E2 conjugadoras da
ubiquitina (IPR000608) representam a cascata enzimática da via da ubiquitina-proteassoma (Figura
7). Na via, o enzima E1 usa ATP para activar a ubiquitina e liga-se a ela através da cisteína presente no
seu centro activo, transferindo então a molécula de ubiquitina activada para a cisteína do centro
activo de um enzima E2. Existem vários E2 na célula apresentando todos eles um domínio
conservado (UBC - ubiquitin conjugation) com cerca de 150 resíduos de aminoácidos que contém a
cisteína envolvida na ligação à ubiquitina activada. Cada E2 interactua especificamente com o enzima
E3, permitindo a transferência directa da ubiquitina activada e sua ligação a um resíduo de Lys da
proteína alvo. Os enzimas da família E3 ligase podem dividir-se em duas classes distintas dependendo
da sua forma de actuação, intimamente relacionada com os domínios estruturais que possui e
condicionando o processo de transferência e de ligação da ubiquitina ao substrato, dependendo do
tipo de enzima. Num dos grupos a ubiquitina activada liga-se à cisteína do centro activo da E3 ligase,
pertencente ao domínio HECT, constituído por 80 resíduos de aminoácidos. Na forma alternativa, o
E3 ligase interactua com o enzima E2, através de um domínio RING finger, transferindo a ubiquitina
activada do enzima E2 para o substrato, sem envolver o intermediário E3-ubiquitina.
26
Figura 7 - Via da ubiquitina-proteassoma. O enzima E1 adenila o C-terminal do resíduo Glicina da ubiquitina com
hidrolise de ATP. O adenilato de ubiquitina intermediário liga-se ao grupo tiol da cisteína do centro activo do
enzima E1 formando um tioéster de ubiquitina e AMP livre. Seguidamente, o tioéster de ubiquitina é transferido
para o resíduo de cisteína do centro activo do E2, um enzima de conjugação da ubiquitina. Posteriormente o
enzima E2 transfere a cadeia de ubiquitinas directamente para o substrato ou, em alternativa, para o E3 que se
encarrega de a ligar ao substrato (dependendo do E3). Várias moléculas de ubiquitina são ligadas
sequencialmente pelo E3 ligase, formando uma cadeia de poliubiquitinas. Os substratos poliubiquitinados são
degradados pelo complexo proteolítico denominado de proteassoma 26S, num processo dependente de ATP. A
ubiquitinação é um processo reversível em que as DUBs degradam a cadeia de poliubiquitinas prevenindo a
degradação do substrato necessário, reciclando a ubiquitina. Ubiquitina – círculos vazios com caudas; ubiquitina
activada – círculos preenchidos. De referir que a conjugação da ubiquitina pode ocorrer, independentemente da
via da ubiquitina-proteassoma, de uma forma não canónica (por activação da UBL, activação do híbrido E1-E2 ou
E2-E3 ou por elongação das cadeias curtas de ubiquitina pela E4) Adaptado de Hegde e Upadhya (Hegde &
Upadhya 2007).
27
6.3. Estrutura da Sinfilina-1: Domínios
A Sinfilina-1, um dos substratos da Parkina, é uma proteína com 919 aminoácidos que
apresenta uma massa molecular entre 115 e 140 kDa (Rejko Krüger 2004). A homologia da Sinfilina-1
de ratinho com a humana é elevada sendo descrita como uma proteína evolutivamente conservada,
nomeadamente nas regiões que contêm os domínios ankyrin-like motifs e coiled-coil (Figura 8)
(O’Farrell et al. 2002).
O gene humano da Sinfilina-1 (SNCAIP – SNCA Interacting Protein), localizado no cromossoma
5q23.1-23-3, encontra-se actualmente mapeado. A ORF deste gene consiste em 10 exões sendo que o
intrão 5 possui uma repetição GT com elevado número de polimorfismos (S Engelender et al. 2000)
Além disso, a expressão da Sinfilina-1 de murganho, a nível dos tecidos, é semelhante à da Sinfilina-1
humana (O’Farrell et al. 2002).
Figura 8 - Vista esquemática da proteína Sinfilina-1, com comparação de sequências entre a variante humana e a
de murganho. Retirado de Marx (Marx 2003).
6.3.1. Domínio ankyrin-like motifs
O domínio ankyrin é uma sequencia de 33 aminoácidos que adquire estruturalmente uma
conformação de dupla hélice-alfa separadas por um loop. Descoberto na sinalização de proteínas
em leveduras Cdc10 e Drosophila Notch, o domínio ankyrin aparenta mediar interacções entre
proteínas, estando entre os motivos estruturais mais comuns.
O domínio ankyrin ocorre numa diversidade de proteínas que apresentam funções variadas,
tais como iniciadores de transcrição, reguladores do ciclo celular, citoesqueleto, transportadores de
iões, e transdutores de sinais (Bennett & Stenbuck 1979). Este domínio é frequentemente definido
pela sua estrutura, em vez da função, visto que não há uma sequência específica ou estrutura que
seja universalmente reconhecida por esta. A maioria das proteínas que contém este domínio tem 4-6
repetições, embora a sua estrutura prevalente contenha 24 repetições (Mosavi et al. 2004).
28
A sequência ankyrin foi estudada recorrendo ao alinhamento múltiplo de sequências para
determinar os resíduos de aminoácidos evolutivamente conservados e que são críticos para o folding
e para a estabilidade da estrutura. Os resíduos superficiais laterais, que apresentam características
geralmente hidrófobas, são variáveis e estão normalmente envolvidos na interacção entre proteínas
(J. Li et al. 2006).
6.3.2. Domínio Coiled-coil
Um domínio coiled-coil é um motivo estrutural em proteínas, em que 2 a 7 alfa-hélices (J. Liu
et al. 2006) são enroladas juntas como os fios de uma corda, sendo a conformação em dímeros ou
trímeros a mais comum. Muitas proteínas do tipo coiled-coil estão envolvidas em funções biológicas
importantes como a regulação da expressão genica. Exemplos notáveis são as onco-proteínas c-fos e
jun, e a proteína muscular tropomiosina. As Coiled-coil geralmente contêm um padrão repetido,
hxxhcxc, de aminoácidos h (hidrófobos) e c (carregados) (Mason & Arndt 2004), são geralmente
rotuladas de abcdefg, onde a e d são as posições muitas vezes ocupadas por isoleucina, leucina ou
valina.
O folding da sequência com este padrão de repetição num estrutura de alfa-helicoidal
secundária faz com que a resíduos hidrófobos sejam apresentados como uma "banda" em que os
aminoácidos se dispõem ao redor da hélice, formando uma hélice esquerda anfipática. A forma mais
favorável para a organização dessas duas hélices num ambiente cheio de água é envolver as zonas
hidrófobas umas contra as outras, externalizando os aminoácidos hidrofílicos. É, portanto, a
internalização das zonas hidrófobas que fornece a força motriz termodinâmica para a
associação (Mason & Arndt 2004).
6.4. Função da Sinfilina-1
Em tecidos não-patológicos de cérebro humano, a Sinfilina-1 é observada principalmente em
grandes neurónios, incluindo Purkinje, nigrais e piramidais (S Engelender et al. 2000; Ribeiro et al.
2002; Murray et al. 2003). A Sinfilina-1 de cérebros não-patológicos, co-imunoprecipita com vesículas
sinápticas, apresenta uma forte associação com estas estruturas. Existem estudos in vitro que
demonstram que é nas porções terminais dos nervos pré-sinápticos onde os níveis de expressão da
Sinfilina-1 são mais elevados durante o desenvolvimento (Ribeiro et al. 2002). Contudo, a função da
Sinfilina-1 não é conhecida. No entanto, a Sinfilina-1 é fosforilada in vitro pela glicogénio sintetase
cinase-3beta, o que sugere um envolvimento nos mecanismos de transdução de sinal e/ou
degradação proteica (Tanji et al. 2003).
Fisiologicamente, a Sinfilina-1 associa-se com a α-sinucleína e promove a formação de
inclusões citosólicas, sendo ela também um dos principais constituintes dos CLs em doentes de
Parkinson. Este facto foi verificado pela formação de corpos de inclusão em cultura de células, co-
29
transfectadas com α-sinucleína e Sinfilina-1, onde se observa a associação entre as porções C-
terminal de ambas as proteínas (Kawamata et al. 2001).
Através de um ensaio de duplo-híbrido em levedura observou-se que a Sinfilina-1 interage
com a ubiquitina ligase Siah-1 através da sua região N-terminal, sendo este o local proposto para a
ubiquitinação da Sinfilina-1 (Nagano et al. 2003). A degradação da Sinfilina-1 é fortemente aumentada
na presença da Siah-1, em comparação com a Parkina. Contudo, a Siah-1 não facilita a ubiquitinação e
degradação da α-sinucleína wild-type nem de suas formas mutadas (Nagano et al. 2003).
30
7. Substratos da Parkina ubiquitina ligase
A Parkina apresenta-se como uma ligase de ubiquitina multifacetada e única, consistente
com o papel de housekeeping na manutenção da integridade e sobrevivência dos neurónios
dopaminérgicos (D. Moore 2006). Enquanto E3 ligase, esta é responsável pela poliubiquitinação de
vários substratos, marcando-os e encaminhando-os para degradação no complexo proteassomal
26S, como referido anteriormente. Desta forma vários substratos da Parkina já foram identificados
dos quais se destaca a própria Parkina, a Sinfilina-1, a α-sinucleína O-glicosilada, o CDCrel-1, o CDCrel-2,
a β-tubulina, a ciclina E, a sinaptotamina XI (SytXI), a Pael-R (parkin associated endothelin-like
receptor) e a subunidade p38/JTV-1 complexo multi-tRNA sintetase (Y. Zhang et al. 2000; K. K. Chung
et al. 2001; Y Imai et al. 2001; Shimura et al. 2001; P. Choi 2003; Corti et al. 2003; Huynh et al. 2003; Ren
et al. 2003; Staropoli et al. 2003; Houbo Jiang et al. 2004).
Além de actuar nos substratos referidos anteriormente, estudos recentes demonstraram
que a Parkina se encontra envolvida em formas alternativas de ubiquitinação associadas a funções
reguladoras não degradativas (D. Moore 2006). Estas observações apontam para uma interacção
entre a Parkina e outros produtos genómicos relacionados com o parkinsonismo, incluindo a α-
sinucleína, LRRK2, DJ-1 e PINK1 em vias bioquímicas comuns de potencial relevância na patogénese
da doença.
7.1. A Ubiquitina como substrato
O domínio UBL da Parkina aparenta estar envolvido ligação dos diferentes substratos à
proteína (Shimura et al. 2000; P. Choi et al. 2000). Os resíduos de lisina (K) na Parkina
(correspondente a K27, 29 e 48 da ubiquitina), podem servir como locais para a auto-ubiquitinação e
estar envolvidos na regulação da própria degradação (P. Choi et al. 2000).
Apesar de a Parkina ser a única E3 que contém o domínio UBL, os outros E3s são capazes de
se auto-ubiquitinar na ausência deste domínio, tornando plausível a hipótese de que o domínio UBL
tenha funções para além de actuar como local para auto-ubiquitinação (Paul S. Fishman & G. a Oyler
2002). Desta forma, a análise da função do deste domínio noutras proteínas poderá contribuir para
elucidar a função do domínio UBL da Parkina.
A Rad23 é uma das proteínas com um domínio UBL melhor estudada. Originalmente
identificada como um componente do mecanismos de reparação do DNA em levedura, a Rad23
parece ter múltiplas funções. O domínio UBL da Rad23 está envolvido na ligação ao proteassoma,
enquanto um domínio independente se liga a uma heat shock protein 70 (HSP70) (T. Suzuki et al.
2001). Pesquisas recentes sobre Rad23 sugerem que ambas as interacções podem ser
funcionalmente significativas na Rad23 e na compreensão da função Parkina. A Rad23 forma um
complexo com a Png-1 (T. Suzuki et al. 2001), que remove grupos glicina de glicoproteínas misfolded
31
translocando-as para o exterior do RE onde sofrem degradação pela via do proteassoma (T. Suzuki
et al. 2001). A Parkina pode funcionar de forma semelhante para aliviar o stress do RE. Com base
nesta informação são sugeridas três funções para a Parkina na eliminação de proteínas aberrantes: 1)
ubiquitinação de proteínas misfolded aberrantes (actividade E3), 2) recrutamento do chaperone
molecular HSP70 para ajudar no unfolding dos substratos aberrantes e 3) ligação com a tampa do
proteassoma apresentando directamente a proteína aberrante para degradação no proteassoma
(Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
7.2. Sinfilina-1
A Sinfilina-1 foi descrita por Engelender e colaboradores como sendo uma proteína com
capacidade de interacção com a α-sinucleína. No entanto, a Parkina também ubiquitina a proteína de
interacção da α-sinucleína (K. K. K. Chung et al. 2004). A co-expressão de α-sinucleína, Sinfilina-1 e
Parkina wild-type pode resultar em inclusões semelhantes a corpos de Lewy nas células, estando por
isso aí presentes (K. K. Chung et al. 2001). A ubiquitinação de Sinfilina-1, pela Parkina, pode induzir a
formação de corpos de Lewy na DP idiopática e tem em conta a ausência dos mesmos na PJ-AR. Por
outro lado, a sequestração de Parkina nos corpos de Lewy na DP idiopática pode originar um défice
relativo de Parkina funcional livre e contribuir para a morte celular dos neurónios dopaminérgicos,
mesmo na DP idiopática (K. K. Chung et al. 2001).
7.2.1. Complexo Parkina, α-sinucleína e Sinfilina-1
A α-sinucleína é uma proteína neuronal envolvida no transporte de vesículas sinápticas que
interactua com a Sinfilina-1 e potencia a formação de inclusões que possivelmente apresentam
implicações para a formação dos CL (Y.-Y. Xie et al. 2010). A Sinfilina-1 é substrato da Parkina (K. K.
Chung et al. 2001), no entanto, no caso da α-sinucleína apenas a sua forma O-glicosilada (αSp22)
pode ser ubiquitinada pela Parkina (Shimura et al. 2001). A função da Sinfilina-1 é ainda desconhecida
bem como o papel da sua interacção com a α-sinucleína e ubiquitinação por parte da Parkina.
Possivelmente a Sinfilina-1 serve para ligar a α-sinucleína e/ou Parkina a proteínas intracelulares
envolvidas no transporte de vesículas ou citosqueleto (S Engelender et al. 1999).
7.3. Alfa-sinucleína
A α-sinucleína pertence a uma família de proteínas, expressas no cérebro de humanos e
roedores (Giasson et al. 2001; Galvin 2001), com 10 a 20 kDA (Kahle et al. 2002), actualmente
constituída por três membros diferentes: α-sinucleína, β-sinucleína e γ-sinucleína (Clayton & George
1998). A sua localização sub-celular ainda não foi estabelecida em detalhe. No entanto, são sugeridos
como locais de acção os terminais pré-sinápticos, o envelope nuclear e o citoplasma (Maroteaux &
Scheller 1991; Lavedan 1998). Pensa-se que, em condições fisiológicas, a α-sinucleína deverá actuar a
32
nível da modulação do turnover das vesículas sinápticas e na plasticidade sináptica (Clayton & George
1998).
Vários estudos mostram que a agregação anormal da α-sinucleína forma o maior
componente filamentoso dos CLs e LNs, afectando não são só os neurónios, mas também as células
da glia, os astrócitos e os oligodendrócitos (H Takahashi & K Wakabayashi 2001). Sob condições
normais, a α-sinucleína deverá apresentar propriedades neuroprotectoras. Em concentrações
nanomolares ela protegerá os neurónios, em culturas de células neuronais primárias, contra o stress
oxidativo e excitotoxicidade, através do mecanismo de sinalização PI3/Akt, por outro lado, em
concentrações na ordem dos micromolares, deverá exercer um efeito neurotóxico nas culturas (Seo
et al. 2002). Estes resultados sugerem que os neurónios dopaminérgicos da substantia nigra são
vulneráveis a níveis elevados de α-sinucleína. Contudo, ainda não foi possível concluir se são os
elevados níveis de α-sinucleína solúvel ou os corpos de inclusão positivos para a α-sinucleína que
causam a morte celular no SN.
Uma visão mais recente dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da DP
aponta a formação de oligómeros solúveis (protofibras) de α-sinucleína (e não as suas fibras
amilóides) como as espécies citotóxicas responsáveis pela morte dos neurónios dopaminérgicos.
Famílias que apresentem uma mutação no gene da α-sinucleína desenvolvem Parkinson precoce o
que se poderá dever à maior facilidade das mutantes em formar protofibras. Por outro lado, foi
demonstrado que as catecolaminas (como a dopamina ou Levodopa) são agentes estabilizadores
das protofibras, o que pode explicar porque são os neurónios dopaminérgicos os afectados na DP,
visto que a α-sinucleína é expressa em vários tecidos.
Como tanto a ubiquitina como a α-sinucleína estão presentes nos corpos Lewy, a α-
sinucleína é uma candidata directa a substrato da Parkina ubiquitina ligase, reforçada ainda pela
ausência de corpos de Lewy no cérebro de doentes de PJ-AR. A hipótese directa que emergiu da
ubiquitinação de α-sinucleína pela Parkina é pré-requisito para a formação de um corpo de Lewy na
DP (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002). A α-sinucleína, na forma prevalente, não parece ser
substrato da Parkina embora a Parkina esteja associada com corpos de Lewy por imunohistoquímica.
Por outro lado, a α-sinucleína o-glicosilada (αSp22), que se associa com a Parkina no cérebro
humano, foi identificada juntamente com o enzima E2 (UbcH7)(Shimura et al. 2001), acumulando-se
no cérebro de doentes PJ-AR sendo ubiquitinada pela Parkina wild-type mas não pela mutante, in
vitro (Shimura et al. 2001). O significado da α-sinucleína o-glicosilada tanto para doentes PJ-AR como
de DP idiopática está sob investigação activa (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
33
7.4. HSP70
Está comprovado que chaperones moleculares, como a HSP70, tendem a reduzir a
toxicidade das proteínas aberrantes nas células e a melhorar a sobrevivência neuronal em modelos
de Drosophila transgénica para a doença de Huntington e DP (Cummings et al. 1998; H.Y. E. Chan
2000; Auluck et al. 2002). Estudos sugerem que a Parkina desempenha um papel importante na
ligação de diversos componentes celulares de resposta a proteínas misfolded ao formar um
complexo entre a HSP70, o proteassoma, e proteínas parcialmente desnaturadas (Paul S. Fishman &
G. a Oyler 2002).
Estudos de Parkina impulsionaram a via da ubiquitina-proteassoma para a vanguarda da
investigação da DP, demonstrando novamente a importância de identificar os genes na DP
hereditária para a compreensão da DP idiopática. O papel do sistema ubiquitina-proteassoma na DP
foi reforçado pela identificação de uma família onde as mutações no gene do enzima ubiquitina-
carboxyl terminal hidrolase (UCH-L1) terem sido associadas à DP (Leroy et al. 1998). Este enzima é
necessário na libertação e reciclagem da ubiquitina das cadeias poliubiquitinadas e de produtos de
degradação de péptidos do proteassoma. O papel das variações alélicas no UCH-L1 de humanos
observadas na DP está actualmente em estudo (D. M. Maraganore et al. 1999). Mutações no UCH-L1
causam uma doença genética em ratos (distrofia axonal gracile) com inclusões de ubiquitina mas não
um fenótipo de DP (Saigoh et al. 1999).
Relacionado com a ligação da Parkina ao proteassoma está ainda descrita uma interacção
com a subunidade Rpn 10 do proteassoma 26S através do seu domínio UBL. Esta interacção é fraca
mas permite o endereçamento dos substratos da Parkina para o proteassoma (Sakata et al. 2003).
A Bcl-2-associated athalogene 5 (BAG5) interactua directamente com a Parkina e com o
chaperone Hsp70, formando um complexo. Detectada nos CL, esta aumenta o sequestro da Parkina
dentro dos agregados de proteínas, atenuando a preservação dependente de Parkina da função
proteassomal. A BAG5 inibe a acção da HSP70, essencial na manutenção da função celular, induzindo
agregação. Esta proteína promove assim o aumento da morte neuronal dopaminérgica (Kalia et al.
2004).
34
7.5. Parkina associated endothelin-like receptor
A técnica do híbrido duplo também ajudou a identificar um segundo substrato da Parkina
por homologia para o receptor endotelial denominado “Parkina associated endothelin-like receptor”
(Pael-R). O pael-R associa-se com a Parkina in vivo, é ubiquitinado pela Parkina e a sobre-expressão
de Parkina pode acelerar a degradação do Pael-R (Y Imai et al. 2001).
Quando sobre-expressa, a Parkina protege as células de toxinas, como a tunicamicina e β-
mercaptoetanol que induzem stress oxidativo no retículo endoplasm|tico (RE) e na “unfolded
protein response” (UPR) (Y Imai et al. 2000). O stress do RE leva ao aumento da expressão
transcricional de Parkina e dos chaperones associados aos RE e cessa a tradução de vários mRNAs (Y
Imai et al. 2000).
O Pael-R perde a estrutura facilmente, e em níveis elevados é neurotóxico devido ao
aumento do stress do RE e do UPR. Durante o stress do RE, as proteínas exportadas do RE para o
complexo de Golgi desdobram-se e tornam-se insolúveis. A acumulação de proteínas insolúveis
interfere com a função do RE e induz a morte celular (Y Imai et al. 2000). Mesmo durante o
funcionamento normal das células, uma fracção das proteínas traduzidas no RE encontram-se
unfolded e têm de ser refolded pela interacção com chaperones moleculares ou, em alternativa,
translocadas para o citoplasma para serem degradadas pelo sistema ubiquitina-proteassoma
(Friedlander et al. 2000).
A UPR é um mecanismo de protecção da célula que reduz o stress do RE. No entanto, se o
UPR é incapaz de reduzir o nível de proteínas unfolded através das duas vias possíveis, a célula entra
em apoptose (Nakagawa et al. 2000). Formas insolúveis da Pael-R estão aumentadas no cérebro de
PJ-AR, de acordo com a acumulação de Pael-R, na ausência de Parkina (Y Imai et al. 2001). A pael-R é
expressa no cérebro, e apresentando-se em níveis elevados especialmente na células
dopaminérgicas da substancia nigra. O aumento da expressão de Pael-R nesses neurónios pode
explicar em parte a sensibilidade à PJ-AR (Y Imai et al. 2001) . A activação do stress do RE e do UPR
têm sido implicados na patogénese de doenças neurodegenerativas com a activação de proteínas de
sinalização da apoptose, caspase-12 (Nakagawa et al. 2000). Neurónios de ratos que não apresentam
expressão de caspase-12 são resistentes { toxicidade β-amilóide (Nakagawa et al. 2000).
A Parkina elimina o PAEL-R unfolded em cooperação com o chaperone molecular Hsp70 e a
proteína U box conhecida como CHIP (Y Imai et al. 2000). Por sua vez, a acumulação do PAEL-R no
estado unfolded no reticulo endoplasmático, quando a Parkina se encontra inactiva, resulta na morte
neuronal pelo stress causado pela proteínas unfolded, sugerindo que esta proteína é importante na
patogénese da DP (Y Imai et al. 2001; Y. Yang et al. 2003) . O PAEL-R, que se encontra sobre-expressa
nos neurónios dopaminérgicos da SN, é um receptor acoplado a uma proteína G cujo ligando é ainda
desconhecido (Y Imai et al. 2001; Donohue et al. 1998). Algumas evidências sugerem que o sinal do
PAER-L regula a quantidade de dopamina nos neurónios dopaminérgicos e que a expressão
35
excessiva desta proteína faz com que estes neurónios fiquem susceptíveis à toxicidade crónica da
dopamina.
7.6. CDCrel-1 e Sept5
A CDCrel-1 e a Sept5 são duas septinas que interactuam com a Parkina. A CDCrel-1 está
associada às vesículas sinápticas apresentando funções em eventos de transporte, fusão e
reciclagem de vesículas sinápticas no cérebro, onde a Parkina regula o seu turnover, interagindo e
ubiquitinando-a através da via da ubiquitina-proteassoma (Y. Zhang et al. 2000). Esta proteína,
maioritariamente expressa no sistema nervoso, encontra-se associada a fracções membranares
(Beites et al. 1999) e tem a capacidade de regular a dinâmica das vesículas sinápticas através da sua
interacção com a sintaxina (Beites et al. 1999). No entanto, nada se sabe quanto à capacidade de
regular a libertação de dopamina. Uma falha na degradação de CDCrel-1, por falha na função da
Parkina, leva ao aumento dos seus níveis e poderá potencialmente inibir a libertação de dopamina,
contribuindo para um estado de parkinsonismo (Y. Zhang et al. 2000).
A técnica de screening do duplo híbrido em levedura permitiu detectar interacções entre as
duas proteínas, ficando demonstrado que a Parkina se liga e ubiquitina proteínas de membrana
sináptica como a CDCrel-1 (Y. Zhang et al. 2000), uma septina que pode funcionar na regulação do
armazenamento e liberação de neurotransmissores (Beites et al. 1999). Estas proteínas são
potencialmente importantes no controle da toxicidade da dopamina citosólica livre (Paul S. Fishman
& G. a Oyler 2002).
Outra septina que interactua com a Parkina é a Sept5 e apresenta função na exocitose e
divisão celular (Beites et al. 1999). A Parkina ubiquitina a Sept5 e em doentes com PJ-AR esta
apresenta-se em valores mais elevados, demonstrando assim o papel da Parkina no turnover desta
proteína (P. Choi 2003). A capacidade das septinas se associarem com determinadas vesículas sugere
que estas podem direccionar a Parkina para determinados organelos, o que poderá ser importante
no controlo das interacções realizadas com a Parkina (P. Choi 2003).
Uma outra proteína, que é ubiquitinada e enviada para degradação proteassomal (Huynh et
al. 2003), e que está envolvida na libertação das vesículas sinápticas é a sinaptotagmina XI. Pertence
à família das sinaptotagminas, a interacção sugere a participação da Parkina na regulação das
proteínas envolvidas no controlo do tráfego de neurotransmissores no terminal pré-sináptico (Huynh
et al. 2003). Assim sendo, a perda de função da Parkina poderá afectar a libertação e recaptação dos
neurotransmissores, explicando assim a perda de função dopaminérgicas no PJ-AR (Huynh et al.
2003).
36
7.7. LRRK2
A LRRK2 é uma proteína citoplasmática expressa em baixas quantidades em muitos tecidos.
Esta proteína interage com a Parkina através do domínio RING2, mas não se associa com a α-
sinucleína, DJ1 nem com a proteína tau (W. W. Smith et al. 2005). Quando expressa em células, a
LRRK2 apresenta tendência para agregar e a co-expressão com Parkina leva a um aumento destes
agregados (W. W. Smith et al. 2005). No entanto, segundo alguns estudos, a Parkina não pode agir,
pelo menos directamente, contra a toxicidade da LRRK2 (W. W. Smith et al. 2005) uma vez que a
LRRK2 não pode ser ubiquitinada por esta.
7.7.1. Complexo Parkina, PINK1 e DJ1
Mutações na Parkina, PINK1 e DJ1 encontram-se individualmente relacionadas com o PJ-AR.
No entanto, apesar de estas mutações conduzirem à mesma patologia, as relações funcionais entre
proteínas, as suas mutações e a origem da DP é ainda desconhecida (Xiong et al. 2009). Sabe-se
contudo que a três proteínas formam um complexo (Complexo PPD) que promove a ubiquitinação e
degradação de vários substratos da Parkina aberrantemente expressos, incluindo a própria Parkina e
a Sinfilina-1. A ausência de PINK1 ou Parkina funcionais representam um impedimento na degradação
de Parkina e substratos desta, induzidos por choque térmico, como a Sinfilina-1, sugerindo que o
Complexo PPD (Parkina/PINK/DJ-1) desempenha um papel importante na degradação de substratos
aberrantes da Parkina, promovendo a sua acumulação.
Desta forma, o complexo funcional promove a degradação de proteínas unfolded e
misfolded relacionados com a Parkina e sugere que mutações numa das proteínas do complexo PPD
poderão prejudicar a actividade E3 ligase da Parkina, constituindo um mecanismo associado à
patogénese da DP (Xiong et al. 2009).
Outros substratos da Parkina foram identificados, como é o caso da ciclina E, β-tubulina,
RanBP2 e CASK. No entanto, a informação disponível e o modo interacção ainda está pouco
esclarecida.
Sabe-se que a Parkina é regulada transcripcionalmente de forma dependente do factor de
crescimento e encontra-se envolvida na regulação da expressão da ciclina E (Ikeuchi et al. 2009). Nas
células do cancro do cólon a ausência de Parkina funcional leva à não degradação da ciclina E. Uma
vez que, a sobre-expressão de ciclina E está associada ao encurtamento da fase G1 do ciclo celular, ao
aumento da proliferação celular e à indução de instabilidade cromossomal, a ausência de Parkina
funcional irá activar todos estes mecanismos (Ikeuchi et al. 2009).
A Parkina é uma proteína que se liga tanto { β-tubulina como aos microtúbulos. Esta
apresenta a capacidade de estabilizar os microtúbulos e de se ancorar a estes. Uma vez que muitas
proteínas misfolded são transportadas nos microtúbulos, esta sua localização sugere um importante
37
ambiente para a actividade E3 ligase sobre os substratos misfolded, apresentando assim um papel
importante na protecção neuronal (F. Yang et al. 2005).
O extremo C-terminal de resíduos da Parkina aparenta ainda mediar a ligação à CASK, uma
proteína submembranar estrutural que organiza as densidades de pós-sinápticas (Fallon et al. 2002).
No entanto, o papel da Parkina na função pós-sináptica é pouco claro, sobretudo porque a Parkina
foi inicialmente localizada nos terminais pré-sinápticos (Shimura et al. 2001; Shimura et al. 1999).
A Parkina, rica em resíduos de cisteína (34 resíduos em 465 aminoácidos totais) que contêm
grupos sulfidril, é particularmente susceptível à oxidação. O enriquecimento de cisteínas na Parkina
pode torná-la ainda mais vulnerável ao stress oxidativo, incluindo o comprometimento por factores
ambientais. Ainda não é claro quais as combinações dos substratos identificados da Parkina são
cruciais para o desenvolvimento de PJ-AR. No entanto, é possível que haja participação de ambos os
substratos identificados e de outros substratos ainda por serem descobertos na morte de celular
(Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
38
8. Importância funcional das mutações Parkina
Devido à variedade de mutações são poucos os estudos que procuram correlacionar as
mutações da Parkina com a alteração de função. Frequentemente são estudados doentes de PJ-AR
que apresentam grandes delecções ou mutações frame-shift que produzem uma proteína truncada
(T Kitada et al. 1998). Nestes doentes a Parkina não apresenta actividade E3 ou valores de expressão
detectáveis através de métodos imunodetecção (H. Mori et al. 1998; Shimura et al. 1999).
Provavelmente porque a proteína truncada é instável e rapidamente degradada.
A maioria mutações pontuais dos doentes de PJ-AR localiza-se nos domínios RING-IBR-RING
da Parkina e codificam proteína sem actividade ubiquitina ligase (Shimura et al. 2001; Y Imai et al.
2001; M Periquet et al. 2001), no entanto, as mutantes recentemente descritas não foram avaliadas
funcionalmente. Estes ensaios com a Parkina são tecnicamente exigentes e requerem a
reconstituição da via de ubiquitinação in vitro com outros enzimas (E1, E2) e o resultado final é
normalmente a auto-ubiquitinação da Parkina ou ubiquitinação de um dos substratos descritos. Até
agora, tanto os testes quantitativos das mutações da Parkina, como os realizados para outras
doenças, ainda não foram publicados (Paul S. Fishman & G. a Oyler 2002).
39
9. Bioquímica da Parkina
A Parkina funciona como uma E3 ligase, à semelhança com outras proteínas que contêm o
domínio RING finger, e é responsável pelo targeting de proteínas misfolded para degradação através
da via da ubiquitina-proteassoma. Mutações com a consequente perda da actividade E3 ligase deste
enzima é a principal causa associada ao PJ-AR (Y. Zhang et al. 2000; Shimura et al. 2000; T Kitada et
al. 1998). Vários substratos da Pakina foram já identificados e a acumulação de um ou vários
substratos nas células neuronais encontra-se implicado na neurodegeneração. Em contexto
neuronal, especificamente nos neurónios dopaminérgicos, a Parkina medeia vários mecanismos
neuroprotectores cruciais para a sobrevivência celular, englobando mecanismos de sinalização
importantes para o estímulo e sobrevivência celular (Henn et al. 2007), modelação de funções chave
ao nível mitocondrial (I. E. Clark et al. 2006; Yukiko Kuroda et al. 2006; J. Park et al. 2006; Y. Yang et
al. 2006; Riparbelli & Callaini 2007; Stichel et al. 2007) bem como mecanismos fundamentais de
degradação de proteínas (K. K. K. Chung et al. 2004; C. Wang et al. 2005; W. W. Smith et al. 2005;
LaVoie et al. 2005; Avraham et al. 2007; Wong et al. 2007). Assim sendo, a presença da Parkina em
todos estes mecanismos, que de alguma forma se encontram associados à etiologia da DP, vem
reforçar toda a sua importância no contexto desta desordem.
Este enzima apresenta assim um carácter neuroprotector multifacetado, no entanto, vários
estudos sugerem ainda que a eficiência da sua protecção é bastante selectiva (Sang et al. 2007; von
Coelln et al. 2006; Perez et al. 2005; Stichel et al. 2007) e que a descoberta destas vias
neuroprotectoras especificas, afectadas devido à deficiência de Parkina, irá ajudar a identificar o seu
papel na patogénese da DP (Thomas & Beal 2007).
9.1. Parkina na via do Fosfatidilinositol / Akt
Encontra-se descrita uma interacção reguladora da Parkina com o Eps15 (epidermal growth
factor receptor pathway substrate 15), um adaptador proteico envolvido na endocitose e trafficking
da cinase de tirosina EGFR (EGF receptor). Nesta via, a Parkina monoubiquitina o Esp15 e interfere
com a capacidade deste se ligar ao EGFR ubiquitinado. Assim sendo, ocorre um atraso na
internalização e degradação do EGFR que vai promover a via de sinalização de pro-sobrevivência
fosfoinositol 3-cinase (PI3K-Akt). A ligação do domínio UBL da Parkina ao ubiquitin-interacting motif
(UIM) do Eps15 é necessária para a ubiquitinação deste, mediada pela Parkina (Figura 9) (Mark R
Cookson et al. 2007).
A endocitose e degradação do EGFR, em células deficientes em Parkina, encontra-se
acelerada, enquanto, na sua ausência a sinalização do EGFR via PI3K-Akt encontra-se reduzida.
Considerando a importância do Akt para a sobrevivência neuronal, o estudo desta regulação é
importante para a compreensão da patogénese da DP (Fallon et al. 2006).
40
Figura 9 - (a) Modelo proposto sobre a interacção da Parkina com o Esp15. O EGF estimula a ligação entre a
Parkina e o Eps15 numa interacção dependente de UBL e UIM (esquerda). A ligação ao Eps15 estimula a
actividade E3 ligase da Parkina e promove a ubiquitinação do Eps15 (centro). A ligação intramolecular da
ubiquitina no Eps15 pelo UIMs interfere com a ligação de Ubl por parte da Parkina e destrói a interacção entre a
Parkina e o Eps15 (direita). (b-c) O modelo explica como é que a ubiquitinação mediada pela Parkina consegue
regular o trafficking e sinalização do EGFR. (b) Na presença de Parkina, a ubiquitinação do Eps15 previne a sua
ligação ao complexo EGFR, o que atrasa a endocitose do receptor e prolonga a sinalização via neuronal de
sobrevivência PI3K-Akt. (c) Na ausência de Parkina: Defeitos na ubiquitinação mediada pela ubiquitina, como é o
caso de DP associada à Parkina, aumenta a disponibilidade de Esp15 capaz de se ligar ao complexo EGFR, o que
por sua vez acelera a endocitose e menospreza a sinalização via PI3K-Akt. Adaptado de Fallon (Fallon et al. 2006).
41
9.2. Parkina na via IKK/NFkb
Em estudos recentes sobre o papel da Parkina nas vias de resposta ao stress, foi
demonstrado que a proteína activa especificamente a via de sinalização do factor nuclear kB (NF-κB)
e que esta via é essencial para a acção neuroprotectora da Parkina. Ao nível celular, a activação do
NF-κB promove a produção dos respectivos factores de transcrição que por sua regulam vários
processos biológicos como a apoptose, a diferenciação e imunidade (Henn et al. 2007). Por sua vez, a
inibição das proteínas NF-κB ocorre por associação destas com proteínas IκBs que são igualmente
expressas (Hayden & Ghosh 2004). A activação do NF-κB, após o estímulo, pode ocorrer segundo
vias upstream distintas que convergem no complexo IκB cinase (IKK) constituído por duas
subunidades catalíticas (IKKα e IKKβ) e uma reguladora [IKKγ/NEMO (NFkB essencial modifier)]. A
sinalização clássica IKK/NF-κB envolve a fosforilação de IκBs mediada por IKKβ/γ que direcciona
estes inibidores para ubiquitinação e posterior degradação proteassomal. A ubiquitinação apresenta-
se assim como um importante passo na regulação da via IKK/NF-κB (Ravid & Hochstrasser 2004; Z. J.
Chen 2005; Haglund & Dikic 2005; Krappmann & Scheidereit 2005). Para além do conhecido papel da
poliubiquitinação da lisina 48 (K48) na regulação da degradação do IκB e proteólise do precursor, a
activação do complexo IKK e de outros reguladores upstream, tais como TRAF2 e TRAF6 [tumor
necrosis factor (TNF) receptor-associated factor], é dependente da associação de cadeias de
ubiquitina na lisina 63 (K63) (Figura 10) (Henn et al. 2007).
O NF-κB encontra-se presente por todo o sistema nervoso e existem cada vez mais
evidências de que a sua via de sinalização apresenta um papel central na integridade neuronal e
plasticidade sináptica (Karin & A. Lin 2002). Recentemente vários modelos estabeleceram o papel do
NF-κB na prevenção da morte neuronal induzida por stress oxidativo, excitotoxicidade, isquémia ou
privação à glucose (B. Kaltschmidt et al. 2005; Mattson et al. 2000).
42
Figura 10 - Modelo do papel funcional da Parkina na via de sinalização IKK/NFkB. Durante o stress e em condições fisiológicas a Parkina promove regulação por ubiquitinação do TRAF2 e IKKγ, levando à activação do NF-κB. Consequentemente, a transcrição de genes prosurvival é upregulated. A actividade da Parkina pode ser modelada pelo stress. Sob stress moderado, a Parkina é upregulated. Para uma resposta imediata, é possível que a actividade da Parkina possa ser regulada por modificações pos-traducionais. Em contraste, no caso de um severo stress proteotoxico, induzido por exemplo por dopamina oxidada, ocorre misfolding e inactivação da Parkina. Mutações no gene da Parkina, relacionado com parkinsonismo juvenil autossómico recessivo, também interferem com a capacidade da Parkina de estimular a via de sinalização IKK/NFkB. Adaptado de Henn e Bouman (Henn et al. 2007).
9.3. Parkina em vias chave ao nível mitocondrial
A Parkina encontra-se também envolvida na modelação de funções chave ao nível
mitocondrial, o que inclui um papel na morfogénese mitocondrial durante a espermiogénese
(Riparbelli & Callaini 2007), bem como no reforço da biogénese mitocondrial nas células
proliferativas através da transcrição e replicação do DNA mitocondrial (Yukiko Kuroda et al. 2006).
Apesar de não ser conhecida a relação exacta entre a Parkina e a cinase de serina/treonina
mitocondrial (PINK1), sabe-se que a sobre-expressão de um homólogo da primeira em Drosophila
permite o resgate da disfunção mitocondrial, degeneração muscular e perda dopaminérgica
características da inactivação da segunda. Estas observações sugerem que a PINK1 e a Parkina
apresentam uma função comum na mesma via, com a PINK1 funcionando upstream relativamente à
Parkina. O papel da via PINK1-Parkina na regulação da função mitocondrial evidencia a importância
da disfunção mitocondrial como sendo um mecanismo central na patogénese da DP (I. E. Clark et al.
2006; J. Park et al. 2006; Y. Yang et al. 2006).
43
A disfunção mitocondrial pode ainda ser induzida pelo α-sinucleína, no entanto, alguns
estudos demonstram que a falta de actividade da Parkina tem a capacidade de reforçar esse mesmo
quadro patológico. Assim sendo, evidencia-se o papel crucial da Parkina na modelação das funções
mitocondriais na DP induzida pela α-sinucleína (Stichel et al. 2007).
9.4. Impedimentos na degradação de proteínas
A Parkina encontra-se estritamente associada à degradação de algumas proteínas celulares
principalmente através da via da ubiquitina proteassoma. Nesta via, a Parkina apresenta-se com um
enzima específico envolvido na ubiquitinação de alguns substratos importantes no contexto
neuronal, sendo que se pode auto-ubiquitinar e controlar o seu próprio envio para degradação. A
acumulação de determinados substratos da Parkina potencia uma elevada toxicidade celular sendo o
seu papel como ligase de ubiquitina bastante importante na sobrevivência celular. Assim sendo,
qualquer alteração na proteína que conduza à perda de sua função poderá conduzir à morte celular
(C. Wang et al. 2005).
As modificações na Parkina descritas são principalmente resultantes de mutações no gene
da PARK2, no entanto, as modificações pós-traducionais e o stress oxidativo e nitrosativo também
podem comprometer a sua função protectora prejudicando a sua actividade como E3 ligase (K. K. K.
Chung et al. 2004; LaVoie et al. 2005).
9.5. Modificações pos-traducionais
Um caso específico de modificações pós-traducionais que tornam as células vulneráveis é o
caso da cinase 5 dependente de ciclina (Cdk5). Os neurónios dopaminérgicos são especialmente
vulneráveis à sua activação uma vez que este apresenta a capacidade de fosforilar a Parkina (P. D.
Smith et al. 2003). Ou seja, o Cdk5 ao interagir e fosforilar a Parkina na Ser131 (região de ligação)
bloqueia a sua capacidade de autoubiquitinação e permite a agregação da Parkina (Avraham et al.
2007).
9.6. Danos oxidativos
Os danos oxidativos que ocorre sobre ligases de ubiquitina do tipo RING-IBR-RING
semelhantes à Parkina, sobre a Parkina e as suas mutantes associadas ao PJ-AR, são susceptíveis à
alteração da solubilidade e tornam-se citotóxicas com o decorrer do processo, podendo induzir a
morte celular (Wong et al. 2007; C. Wang et al. 2005) .
44
9.7. S-Nitrosilação
A Parkina pode também ser alvo de S-nitrosilação, resultado do stress nitrosativo, sendo o
efeito na actividade alterado de diferentes formas ao longo do tempo (Lipton et al. 2005). Chung e
colaboradores demonstraram que a S-nitrosilação produz uma diminuição da actividade ligase e
portanto da função protectora, contribuindo para o processo neurodegenerativo na DP (K. K. K.
Chung et al. 2004). Por outro lado, Yao e colaboradores nesse mesmo ano, demonstraram o efeito
contrário, com um aumento da actividade da Parkina (Yao et al. 2004). Esta diferença de
observações foi posteriormente esclarecida comprovando-se que, na realidade, inicialmente a S-
nitrosilação da Parkina produz um aumento abrupto na sua actividade que vai diminuindo ao longo
do tempo. Os resultados de Chung foram mais tarde confirmados, demonstrando assim o carácter
degenerativo da S-nitrosilação (CHUNG et al. 2005).
9.8. Formação de Agressomas
A Parkina participa na formação dos agressomas, encontrando-se no seu interior no caso de
stress celular. Estas inclusões citoplasmáticas resultam da deposição de proteínas aberrantes e
tóxicas às células. A sua formação é comum à dos CL, podendo ser induzida por vários factores,
entre eles a acção da dopamina, inibição do proteassoma e estímulos pro-apoptóticos (Muqit et al.
2004). A sobre-expressão da Parkina leva à redução da formação destes agregados, podendo assim,
ser responsável pela sua formação nas células neuronais (Muqit et al. 2004).
45
10. A Parkina noutras Patologias
A proteína Parkina encontra-se envolvida na patogénese de outras doenças para além da DP
e da PJ-AR. São exemplos de algumas interacções a susceptibilidade à lepra e a sua acção na
supressão tumoral.
10.1. Susceptibilidade à lepra
Polimorfismos de único nucleótido (SNPs) em zonas reguladoras partilhadas pela PARK2 e o
PACRG foram já identificados como principais factores de risco na susceptibilidade para a leprose em
duas populações de etnias distintas, sendo que esta susceptibilidade pode variar em diferentes
populações (Mira et al. 2004; Malhotra et al. 2006). O papel destes dois genes na patologia da lepra
(hanseníase) encontra-se ainda indefinida, mas dever-se-á relacionar com o sistema ubiquitina-
proteassoma (Malhotra et al. 2006).
10.2. Supressor tumoral
Estudos demonstraram que o gene PARK2 localiza-se no terceiro common fragil site (CSF)
observado mais frequentemente em humanos, a região de instabilidade FRA6E. Os CSF são locais
cromossómicos susceptíveis a sofrer mutações (Denison et al. 2003). O gene da Parkina é assim um
forte candidato a supressor tumoral e a sua inactivação ou expressão reduzida em alguns tumores,
devido a delecções, sugere um papel importante deste na carcinogénese do peito e dos ovários e em
outros tumores humanos (Cesari et al. 2003). Para se poder compreender o verdadeiro papel da
Parkina na génese tumoral irá ser necessário identificar os seus substratos enquanto E3 ligase e
compreender as suas potenciais relações com a apoptose e proliferação celular (Cesari et al. 2003).
46
Metodologia, resultados e discussão
Nas células neuronais, a Parkina apresenta-se como uma proteína de elevada importância,
cuja função é essencial para o normal funcionamento celular. Mutações no gene desta proteína
foram relacionados com patologias neurodegenerativas como o PJ-AR, no entanto a sua relevância
patológica e os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento desta patologia estão ainda pouco
compreendidos.
Apesar de se conhecerem processos biológicos e interacções proteicas onde a Parkina está
envolvida, a sua estrutura tridimensional ainda não se encontra estabelecida. Esta lacuna tem origem
sobretudo na dificuldade de purificar Parkina, devido à sua elevada massa molecular e à
multiplicidade e complexidade dos seus diferentes domínios que envolvem a complexação com iões
de zinco. Actualmente apenas se conhecem as estruturas tridimensionais dos seus domínios,
determinadas de forma independente.
A purificação da forma integral da Parkina (a partir do cDNA) e a sua caracterização
estrutural potenciam a compreensão das funções em que esta proteína está envolvida. Em paralelo,
o conhecimento da estrutura e estabilidade conformacional resultantes das mutações relacionadas
com a PJ-AR e DP podem contribuir para a melhor compreensão desta doença e dos mecanismos
envolvidos.
Desta forma, o objectivo deste trabalho centrou-se no desenvolvimento de um protocolo
que permite expressar e purificar a forma integral da Parkina, recorrendo a um sistema de expressão
e purificação de proteínas de fusão, refolding proteico e caracterização estrutural. Em paralelo,
desenvolveu-se uma metodologia que permite a purificação e refolding da Sinfilina-1, um dos
substratos da Parkina.
47
1. Parkina
1.1. Subclonagem
A região codificante do gene humano da isoforma 1 (forma canónica) da Parkina humana wt
(PARK2) foi gentilmente cedido pelo Dr. Kumlesh K. Dev (Novartis Pharma AG, Basileia – Suiça),
encontrando-se clonado no vector de expressão em células de mamíferos pCI-neo (Figura 11 A).
Assim, para aplicar a estratégia idealizada foi necessário subclonar o cDNA da Parkina no vector de
expressão de E. Coli pGEX-4T-1 (Figura 11 B) a partir do pCI-neo.
Figura 11 - A: Mapa do vector circular pCI-neo (Promega). B: Mapa do vector circular pGEX-4T-1 (Amersham)
Para amplificar o cDNA de interesse desenharam-se os primers representados na figura 12
contendo, nas extremidades, locais de restrição para os enzimas Bam HI e EcoR I, para que o cDNA
amplificado pudesse ser inserido em frame no multiple cloning site do vector de destino pGEX-4T-1
(Figura 13).
48
A
Primer Forward
GCG GAT CCA TGA TAG TGT TTG TCA GGT TCA
G GAT CC – Local de restrição do Bam HI
B
Primer Reverse
GCG AAT TCT TAT TAC TAC ACG TCG AAC CAG TGG TCC
G AAT TC – Local de restrição do EcoR I
Figura 12 - Primer Forward (A) e Primer Complementary Reverse (B) usados para amplificar a região codificante
do gene PARK2 no processo de subclonagem. (A) apresenta um Tm a 61,6ºC e (B) a 65, 6ºC. Os enzimas Bam HI e
EcoR I não possuem local de restrição na sequência da PARK2. O Bam HI permite uma introdução em frame da
PARK2 no pGEX-4T-1. O design dos primers teve em conta a adição de um conteúdo “GC” no início da sequência
de forma a facilitar a ligação deste à cadeia de DNA molde e a posterior actuação da polimerase.
Figura 13 - Multiple cloning site do vector de destino pGEX-4T-1 (Amersham)
1.1.1. Procedimentos e Considerações
Para amplificar o cDNA correspondente à Parkina realizou-se um PCR segundo as condições
apresentadas na figura 14, tendo sido produzidos aproximadamente 22µg de fragmento que foi
purificado através do kit DNA extration kit - Fermentas. Por sua vez, o plasmídeo de destino pGEX-4T-1
foi obtido por um procedimento de extracção de DNA plasmídico, aproximadamente 12µg,
(GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit- Fermentas) a partir de E.coli DH5α (Invitrogen) em meio selectivo LB
(LB Broth – Sigma Aldrich) com ampicilina ([Ampicilina]final=100µg/mL - Sigma Aldrich).
49
Concentração Final
DNA molde 1395 pb 16 µg/µl
Primer Complementary Reverese Tm = 65,6ºC 2,3 pmol/µl
Primer Forward Tm = 61,6ºC 7,0 pmol/µl
DNA polimerase mix (BioX act – Bioline) 2x 1x
Condições PCR
Melting phase 95ºC 5 min
Anneling 42ºC 1 min
Elongação 72ºC 1 min 25 seg
Ciclos 30 2 min
Figura 14 - Condições do PCR para amplificação da região codificante do gene PARK2.
Procedeu-se à digestão com ambos os enzimas de restrição, BamH I (Rapid Digest BamH I -
Fermentas) e EcoR I (Rapid Digest EcoR I – Fermentas), em simultâneo usando 1U de enzima por cada
µg de plasmídeo e 1U de enzima por cada 0.2µg de produto de PCR. O tempo de digestão utilizado
foi alargado relativamente ao recomendado pelo fabricante de forma a assegurar uma digestão
completa do DNA, tendo em consideração a ausência de actividade STAR por parte dos enzimas.
Os fragmentos digeridos, produto de PCR e pGEX-4T-1, foram purificados através de um gel
de agarose low melting (SeaPlaque® GTG® Agarose - Lonza), por um procedimento de excisão da
banda correspondente e posterior extracção do DNA (DNA extration kit - Fermentas).
A ligação entre o fragmento de interesse e o vector de destino foi realizada numa razão de
5:1 (Gene:Vector), utilizando 2U de ligase (T4 DNA ligase - Fermentas) por cada 0.5µg de DNA
plasmídico, a 16ºC overnight.
O material genético clonado foi usado para transformar E.coli BL21+, tendo as colónias
transformadas sido seleccionados em meio selectivo com ampicilina. A competência das células
utilizadas foi realizada com recurso a um método clássico, usando uma solução fria de cloreto de
cálcio.
Após crescimento das células transformadas, foram seleccionadas algumas colónias das
quais se procedeu à extracção do DNA plasmídico (GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit- Fermentas). A
eficácia da subclonagem foi comprovada por digestão dos plasmídeos obtidos anteriormente com os
enzimas usados na restrição (Figura 15).
50
Figura 15 – Controlo da eficácia da subclonagem por restrição do DNA plasmídico resultante com os enzimas Bam
HI e EcoR I, utilizados no passo da restrição. Poços 2 a 10: restrição do DNA plasmídico de 9 colónias
independentes resultante da subclonagem, obtiveram-se dois fragmentos de tamanhos correspondentes ao
vector digerido (≈4900pb) e Parkina (1395pb); Poços 11 a 19: verificação da integridade dos plasmídeos obtidos a
partir das 9 colónias respectivas.
Posteriormente, atestou-se a qualidade da clonagem por sequenciação usando primers que
se ligam ao pGEX-4T-1, a montante (primer pGEX_for) e a juzante (primer pGEX_rev) da inserção
(Figura 16). O serviço de sequenciação foi assegurado por uma empresa credenciada para o efeito
(Stabvida-Portugal) e a análise do resultado da sequenciação foi feita com o software BioEdit
Sequence alignment editor versão 7.0.5 (T. Hall 2001) e atráves da ferramenta BLAST, disponível on-
line (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
Os resultados de sequenciação indicam que a região codificante do gene se encontra em
frame e não apresenta mutações, devendo por isso expressar uma proteína de fusão
correspondente à GST- Parkina com massa molecular de aproximadamente 78kDa, na presença do
indutor de transcição IPTG.
A
Primer pGEX_For
5´-GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG-3´
B
Primer pGEX_Rev
5´-CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG-3´
Figura 16 - Primers externos pGEX_For (A) pGEX_Rev (B) usado para sequenciação do plasmídeo clonado com a
região codificante do gene PARK2 no processo de subclonagem
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 pB 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 800 600 400 200
51
1.2. Expressão e Purificação
A sobre-expressão da Parkina foi realizada em células de E.coli BL21+ (GE Healthcare), por um
período de 8 horas a 37ºC, utilizando o indutor de transcrição IPTG a uma concentração de 1mM. Para
avaliar a expressão da Parkina em fusão com o GST recolheram-se amostras em diferentes tempos
de expressão. As células foram lisadas com tampão de lise ([PBS 1x (NaCl 13.7mM, KCl 0.27mM,
Na2HPO4 0.43mM, KH2PO4 0.14 mM), PMSF 2mM e Triton X-100 0.1%]) e congeladas durante 24 horas.
Após a lise celular as amostras foram centrifugadas a 30000xg durante 20 minutos (OptimaTM LE-80K
ultracentrifuge Beckman Coulter) e o sobrenadante, correspondente à fracção solúvel do extracto
proteico da E.coli foi analisado num gel de SDS-PAGE 12% (Figura 17).
Na indução da expressão da Parkina observou-se o aparecimento de uma banda com
aproximadamente 80kDa após as 3 horas de indução. Para verificar se a banda corresponde à
proteína de fusão GST-Parkina foi realizado um Western Blot com anticorpo de Cabra Anti-GST (GE
Healthcare), no entanto, os resultados do Western blot não indicou a presença de qualquer proteína
com GST. Desta forma conclui-se que a proteína não é expressa na fracção solúvel. A Parkina, na
ausência de zinco, é incapaz de adquirir a sua conformação tridimensional, ou seja, mantém-se no
seu estado desnaturado, agregando e tornando-se insolúvel (Hristova et al. 2009). Assim sendo, a
complexidade do processo de folding pode estar entre os factores que promoveram o estado
unfolded da Parkina e o consequente direccionamento para os corpos de inclusão, como mecanismo
de protecção celular.
Figura 17 - Gel SDS-PAGE 12% contendo aliquotas provenientes da fracção solúvel da indução de expressão. M:
marcador; T0: 0h; T1: 1h; T2:2h; T3:3h; T4:4h; T5:6h; T6:8h. As setas a vermelho indicam a banda a
aproximadamente 80kDa.
kDa
52
1.2.1. Lise celular e Purificação dos corpos de inclusão
Para isolar os corpos de inclusão, recolheram-se células BL21+, após 10 horas de expressão a
37ºC, as quais foram centrifugadas a 3000g durante 5 minutos a 4ºC e ressuspensas em tampão de
lise [PBS 1x (NaCl 13.7mM, KCl 0.27mM, Na2HPO4 0.43mM, KH2PO4 0.14 mM), PMSF 2mM e Triton X-100
0.1%] com adição de lisozima (0.4mg por cada 400µL de tampão de lise). A mistura foi incubada
durante 30 min em gelo, e seguidamente sonicada (Branson) aplicando 10 ciclos de 10 segundos a
uma potência de 100W intercalados por 1 minuto de incubação em gelo. Após a sonicação, o lisado
foi centrifugado a 30000xg durante 20 minutos a 4ºC (OptimaTM LE-80K ultracentrifuge Beckman
Coulter). Repetiu-se o procedimento de sonicação e centrifugação (K. Nagai & Thøgersen 1987).
Após a última sonicação, antes da centrifugação, foram recolhidas aliquotas dos diferentes
tempos de indução que foram analisadas num gel SDS-PAGE a 12% (Figura 18) para controlo da
indução da expressão proteica, após a quantificação proteica pelo método de Bradford.
O pellet resultante da centrifugação foi resuspenso numa solução a pH 8 contendo KCl 1.5 M,
EDTA 5 mM, Triton X-100 0.5 % e Tris 10 mM e centrifugado novamente a 30 000g durante 20 min a
4ºC. Repetiu-se este procedimento tendo-se utilizado na resuspenção uma solução a pH 8 contendo
NaCl 0.15 M, EDTA 5 mM e Tris 10 mM (K. Nagai & Thøgersen 1987). Da purificação dos corpos de
inclusão obteve-se um precipitado flocular.
Figura 18 - Gel SDS-PAGE 12% contendo aliquotas provenientes da fracção insolúvel da indução de expressão
após a sonicação. M: marcador; T0: 0h; T1: 1h; T2:2h; T3:3h; T4:4h; T5:6h; T6:8h
kDa
53
1.2.2. Refolding proteico
O precipitado proteico, referido anteriormente, foi redissolvido utilizando tampão a pH 8
contendo ureia 9.5M, EDTA 5 mM, β-mercaptoetanol 1 % e 10 mM Tris. De seguida procedeu-se a um
conjunto de diálises sucessivas, a 4ºC e overnight, contra tampões com concentrações decrescentes
de ureia com o objectivo de promover o refolding das proteínas de acordo com o esquema
apresentado na figura 19.
Figura 19 - Sequência de diálises utilizadas no refolding da proteína de fusão GST-Parkina. Condições de diálise I,
II e III.
Nas diálises realizadas diminuiu-se progressivamente a concentração de ureia presente em
solução de uma forma lenta para assegurar uma correcta incorporação do zinco e consequente
refolding proteico. Por sua vez, a adição de iões de zinco, cruciais para o refolding, resultou da adição
do sal ZnSO4.
Na primeira diálise utilizou-se uma solução a pH 8 contendo Ureia 4.5M, Zn2+ 10mM, 0.5M
NaCl, 2,5 % glicerol, 50mM Tris, suplementado com 0.04% azida e 2mM PMSF. Na segunda diálise
diminuiu-se a concentração de ureia para 1M e a concentração de Zn2+ para 2mM. A última diálise, por
sua vez, foi realizada contra tampão Tris 50mM com KCl 100mM a pH9 para solubilizar a proteína.
Relativamente ao valor de pH utilizado na última diálise, o tampão final teve em conta o
ponto isoeléctrico (PI) da Parkina. Assim sendo, o valor de PI estimado para a Parkina é de
aproximadamente 7.06 e portanto a pH 9 a proteína encontra-se solúvel e com carga global negativa
(-32) (PROTEIN CALCULATOR v3.3 – scripps.edu). O valor de pH afecta a solubilidade de uma proteína,
podendo esta apresentar carga global positiva se o pH<PI ou negativa se pH>PI. pHs próximos do PI
de uma proteína aumentam a propensão para a agregação e precipitação da proteína, sendo este
um factor importante a ter em conta no processo de purificação proteica.
No final das diálises e após a amostra permanecer durante 24 horas a 4ºC, observou-se a
formação de um precipitado translúcido que se dissolvia facilmente com agitação. No sentido de
Diálise I•Ureia 4,5M
•ZnSO4 10 mM
•NaCl 0,5 M
•Glicerol 2,5%
•Tris 50 mM
•Azida 0,04%
•PMSF 2 mM
•a pH 7.6
Diálise II•Ureia 1 M
•ZnSO4 2 mM
•NaCl 0,5 M
•Glicerol 10%
•Tris 50 mM
•Azida 0,04%
•PMSF 2 mM
•a pH 7.6
Diálise III•Tris 50 mM
•NaCl 250 mM
•a pH 9
54
contornar o problema da precipitação de proteína procedeu-se a vários testes com diferentes sais de
zinco, contudo, todas apresentaram um precipitado no final.
Para localizar a Parkina, se esta se encontrava em solução ou no precipitado, foram
realizados dois géis SDS-Page a 12%. No primeiro gel a amostra foi previamente centrifugada a
5000xg durante 5 minutos a 4ºC, enquanto que, para o segundo gel o pellet foi resuspenso. O gel
contendo a amostra previamente centrifugada não apresentou qualquer banda, em contraste com o
gel em que o pellet foi ressuspenso (Figura 20) que apresentou várias bandas coincidentes com os
géis obtidos anteriormente, não tendo sido identificada a banda que corresponderia à proteína de
fusão GST-Parkina de 78kDa.
Figura 20 - Gel SDS-Page a 12% com amostras cujo pellet foi previamente ressuspenso após as diálises com diferentes tempos de indução. M: marcador; T0: 0h; T1: 1h; T2:2h; T3:3h; T4:4h; T5:6h.
kDa
55
2. Sinfilina-1
A região codificante do gene da Sinfilina-1 humana (SNCAIP) foi gentilmente cedido pela Dra
Virginia Lee (Center of Neurodegenerative Rechearch Department of Pathology and Laboratory
Medicin and Institute on Aging University of Pensilvania, Filadelfia) encontrando-se clonado no
vector de expressão em E.coli pET30A (Figuras 21 e 22).
Figura 21 – Mapa do vector pET30A (Novagen)
Figura 22 - Multiple cloning site do vector pTE30A (Novagen)
O plasmídeo pET30A, com a região codificante do gene SNCAIP, foi usado para transformar
E.coli BL21+, tendo os transformantes sido seleccionados num meio selectivo com kanamicina a
56
50µg/ml. A competência das células utilizadas foi realizada com recurso ao método clássico, usando
uma solução fria de cloreto de cálcio.
Após crescimento das células transformadas, foram seleccionadas algumas colónias das
quais se procedeu à extracção do DNA plasmídico (GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit- Fermentas). A
eficácia da subclonagem foi comprovada por digestão dos plasmídeos com Bam HI (Rapid Digest Bam
HI – Fermentas) e Xho I (Rapid Digest Xho I – Fermentas) (Figura 23).
Figura 23 - Gel de agarose com digestão simples e dupla de duas amostras de plasmídeo pET30A. 1) Marcador; 2) pET30A digerido com Xho I (amostra 1); 2) pET30A digerido com XhoI e BamHI (amostra 1); 3) pET30A digerido com Xho I (amostra 2); 4) pET30A digerido com XhoI e BamHI (amostra 2).
O serviço de sequenciação foi assegurado por uma empresa credenciada (Stabvida-Portugal)
e a análise do resultado da sequenciação foi realizada com base no software BioEdit Sequence
alignment editor versão 7.0.5 (T. Hall 2001). Os resultados da sequenciação revelaram que o inserto
se encontra em frame, possuindo uma mutação silenciosa no codão 894 (do tipo TTGTTA) que
codifica para a leucina.
2.1. Expressão e Purificação
A sobre-expressão da Sinfilina-1 foi realizada em células de E.coli BL21+ (GE Healthcare), por
um período de 8 horas a 37ºC, utilizando o indutor de transcrição IPTG a uma concentração de 1mM.
Para avaliar a expressão da Sinfilina-1 recolheram-se amostras em diferentes tempos de indução da
mesma. As células foram lisadas com tampão de lise ([PBS 1x (NaCl 13.7mM, KCl 0.27mM, Na2HPO4
0.43mM, KH2PO4 0.14 mM), PMSF 2mM e Triton X-100 0.1%]) e congeladas 24 horas. Após a lise celular as
amostras foram centrifugadas a 30000xg durante 20 minutos (OptimaTM LE-80K ultracentrifuge
Beckman Coulter) e o sobrenadante, correspondente à fracção solúvel do extracto proteico da E.coli
pB 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 800 600 400 200
1 2 3 4 5
57
foi analisado num gel de SDS-PAGE 12% (Figura 24), após quantificação proteica pelo método de
Bradford.
A indução da expressão da Sinfilina-1 não revelou qualquer alteração no padrão de
expressão das proteínas da fracção solúvel da célula. Desta forma conclui-se que a proteína não é
expressa na fracção solúvel.
Figura 24 - Gel SDS-PAGE 12% contendo aliquotas provenientes da fracção solúvel da indução de expressão. M: marcador; T0: 0h; T1: 2h; T2: 4h; T3: 6h; T4: 8h
2.1.1. Lise celular e Purificação dos corpos de inclusão
Para isolar os corpos de inclusão, células BL21+ foram recolhidas, ao longo de 8 horas de
expressão a 37ºC, 30000xg durante 20 minutos a 4ºC (OptimaTM LE-80K ultracentrifuge Beckman
Coulter) e ressuspensas em tampão de lise [PBS 1x (NaCl 13.7mM, KCl 0.27mM, Na2HPO4 0.43mM,
KH2PO4 0.14 mM), PMSF 2mM e Triton X-100 0.1%] com adição de lisozima (0.4mg por cada 400µL de
tampão de lise). A mistura foi incubada durante 30 min em gelo e seguidamente sonicada (Branson),
aplicando 10 ciclos de 10 segundos a uma potência de 100W intercalados por 1 minuto de incubação
em gelo. Após a sonicação, o lisado foi centrifugado a 30000xg durante 20 minutos (OptimaTM LE-80K
ultracentrifuge Beckman Coulter) a 4ºC. Repetiu-se o procedimento de sonicação e centrifugação (K.
Nagai & Thøgersen 1987).
O pellet resultante da última centrifugação foi resuspenso numa solução a pH 8 contendo
KCl 1.5 M, EDTA 5 mM, Triton X-100 0.5 % e Tris 10 mM e centrifugado a 30 000g durante 20 min a 4ºC.
Repetiu-se a centrifugação ressuspendendo o pellet numa solução a pH 8 contendo NaCl 0.15 M,
EDTA 5 mM e Tris 10 mM (Anon 2004; K. Nagai & Thøgersen 1987). Da purificação dos corpos de
inclusão obteve-se um precipitado flocular de proteínas.
kDa
58
2.1.2. Refolding proteico
O precipitado proteico referido anteriormente foi redissolvido utilizando tampão a pH 8
contendo ureia 9.5M, EDTA 5 mM, B-mercaptoetanol 1 % e 10 mM Tris. De seguida procedeu-se a um
conjunto de diálises sucessivas, a 4ºC e overnight, contra tampões com concentrações decrescentes
de ureia com o objectivo de promover o refolding das proteínas de acordo com o esquema
apresentado na figura 25.
Figura 25 - Sequência de diálises utilizadas no refolding da Sinfilina-1. Condições de diálise I, II e III.
Nas diálises realizadas diminuiu-se progressivamente a concentração de ureia presente em
solução de forma a permitir o refolding proteico correcto. Na primeira diálise utilizou-se uma solução
a pH 8 contendo Ureia 4.5M, Zn2+ 10mM, 0.5M NaCl, 10 % glicerol, 50mM Tris, suplementado com
0.04% azida e 2mM PMSF. Na segunda diálise diminuiu-se apenas a concentração de ureia para 1M. A
última diálise, por sua vez, foi realizada contra tampão Tris 50mM com KCl 100mM a pH7,6 para
solubilizar a proteína. Seguidamente foi feita uma electroforese SDS-PAGE a 12% com aliquotas
provenientes da última diálise após quantificação pelo método de Bradford (Figura 26).
Diálise I•Ureia 4,5M
•NaCl 0,5 M
•Glicerol 10%
•Tris 50 mM
•Azida 0,04%
•PMSF 2 mM
•a pH 7,6
Diálise II•Ureia 1 M
•NaCl 0,5 M
•Glicerol 10%
•Tris 50 mM
•Azida 0,04%
•PMSF 2 mM
•a pH 7,6
Diálise III•Tris 10 mM
•NaCl 250 mM
•a pH 7,6
59
Figura 26 - Gel SDS-Page a 12% com amostras de Sinfilina-1 após diálises I, II e III.
A figura 24 apresenta um gel SDS-Page a 12% em que é visível uma banda comum às amostras
T1 a T4 com uma massa molecular aproximadamente 130 kDa que corresponde à massa molecular
estimada para a Sinfilina-1. A confirmação de que esta banda corresponde à Sinfilina-1 foi feita por
Western Blot com Anticorpo Anti-Sinfilina-1 (ABCAM) (Figura 27).
Figura 27 – Fragmento dos resultados da chapa fotográfica proveniente do Western Blot com detecção da
Sinfilina-1 com Anticorpo Anti-Sinfilina-1 aos diferentes tempos. Estes resultados sugerem que a Sinfilina-1, inicialmente localizada nos corpos de inclusão, foi
redissolvida e que se encontra nesta fase na fracção solúvel tendo por isso ocorrido um refolding da
proteína em questão.
2.1.3. Purificação da Sinfilina-1
Para a purificação da Sinfilina-1 recorremos a um sistema em que a proteína é expressa
acoplada a uma cauda de histidina, que consiste numa forma versátil de purificação de proteínas
produzidas em E. coli. As proteínas produzidas desta forma podem ser purificadas rapidamente por
cromatografia de afinidade. Assim, após a dissolução das proteínas presentes nos corpos de
inclusão, as amostras foram dialisadas e feito o load na coluna de histidinas previamente equilibrada
com Binding buffer [20mM Na2HPO4, 0,5M NaCl, 65mM Imidazole a pH 7,6]. As colunas utilizadas são
colunas pré-empacotadas de 5mL de HisTrapTM HP, da Amersham. A eluição da amostra foi feita com
o Elution buffer [20mM Na2HPO4, 0,5M NaCl, 500mM Imidazole a pH 7,6] mantendo um fluxo
kDa
60
constante de 1 mL/min (Figura 28). Durante a cromatografia foram recolhidas aliquotas de 5 mL que
foram analisadas em gel SDS-Page a 12%.
Figura 28 - Cromatograma proveniente da coluna de caudas de Histidina após injecção da amostra de Sinfilina-1.
Do gel de SDS-Page (Figura 29), contendo as aliquotas recolhidas da cromatografia,
evidencia-se uma banda correspondente à Sinfilina-1 (±130 kDA) que é recolhida entre os 105 e 115mL.
Contudo, juntamente com a Sinfilina-1 observa-se um conjunto de outras proteínas. Provavelmente
estas proteínas correspondem a proteínas de E.Coli que possuem caudas de histidina com afinidade
para a coluna, sendo por isso necessário proceder à optimização da cromatografia de afinidade.
Figura 29 - Gel SDS-Page a 12% com fracções recolhidas na cromatografia de afinidade. M: marcador; A1: fracção recolhida após injecção da amostra (0-5mL); A2: fracção recolhida ao equilibrar da coluna com a amostra (5-10 mL); A3: fracção recolhida antes da troca do tampão para o Elution Buffer (100-105mL); A4: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (105-110mL); A5: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (110-115mL) A6: fracção após a adição do Elution Buffer (115-120mL); A7: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (120-125mL); A8: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (125-130mL) A9: fracção recolhida após a adição do Elution Buffer (135-140mL).
kDa
61
3. Considerações finais
A Parkina é uma proteína que possui múltiplos domínios, coordenados com iões de zinco
que condicionam o seu folding tornando a purificação, solubilização e refolding da proteína um
processo complexo.
A metodologia descrita neste trabalho surge como uma estratégia na purificação da Parkina
com o intuito da realização de estudos estruturais e funcionais. Contudo, esta precisa ainda de ser
optimizada. A expressão da proteína de fusão, em células de E.coli, na ausência de zinco gera uma
proteína unfolded que é acumulada em corpos de inclusão, dificultando a sua purificação. A
extracção da proteína unfolded dos corpos de inclusão é um dos pontos-chave na optimização da
metodologia.
Por outro lado, a renaturação proteica é um processo multifactorial, no qual se destacam
factores como a velocidade do processo de folding, a solubilidade proteica e a concentração de iões
zinco disponíveis para interagir com a proteína. Qualquer um destes factores necessita de estudos
mais detalhados no sentido de solubilizar a proteína e simultaneamente permitir que a proteína
adquira o folding nativo e permaneça estável, tendo em conta que esta possui variados domínios
para além da proteína GST que se lhe encontra associada.
No essencial, a metodologia envolve a dissolução dos corpos de inclusão, diálise contra iões
zinco que permitem o refold da proteína, seguido da sua purificação através de uma coluna de GST
que permitirá separar a proteína de fusão das restantes proteína existentes nos corpos de inclusão.
No entanto, é necessário proceder à confirmação da expressão da proteína de fusão e à sua
detecção através de Western Blot que não foi possível até à conclusão do trabalho. Isto devido a
complicações que se observaram após a sequência de diálises, uma vez que as amostras com a
proteína de fusão apresentavam um precipitado, ainda que fácil de dissolver. Deverá também ser
testado se o folding proteico, conseguido através das diferentes diálises, deve ser feito antes ou
após a purificação na coluna de GST uma vez que a recolha da proteína envolve a digestão com
trombina separando o GST da Parkina e permitindo que a Parkina proceda ao refold mais facilmente
em comparação com a proteína de fusão, nomeadamente porque a GST é uma proteína solúvel e a
solubilização da Parkina, por si só, é complexa devido à multiplicidade de domínios. Após a
purificação e refolding proteico, a disponibilidade proteica permitirá a realização de estudos
estruturais, estabilidade e função.
No que diz respeito à purificação da Sinfilina-1, realizada de modo semelhante à da Parkina
mas envolvendo um grau de complexidade aparentemente inferior, permitirá estudos estruturais
sobre uma segunda proteína envolvida na DP. Mais uma vez o processo de purificação necessita de
optimização uma vez que após a cromatografia de afinidade para caudas de histidinas, a amostra
recolhida apresenta ainda outras proteínas. A optimização da composição dos Binding e Elution
Buffers deverá por isso ser iniciada diminuindo a concentração de imidazole, concentração esta que
62
diminui a capacidade da coluna reter as cadeias com caudas de histidina, sem esquecer que os
próprios tampões devem também ser alvo de optimização. Fica também por testar se, em alternativa
à diálise, a purificação da amostra realizada através da coluna de afinidade com tampões com
elevada concentração em ureia, uma vez que a coluna de afinidade utilizada está preparada para
este tipo de abordagem.
A purificação da Parkina e da Sinfilina-1, em simultâneo, permitirá ainda estudos de
interacção entre a Parkina e um dos seus substratos. Estes estudos complementam o conhecimento
estrutural e funcional da Parkina para além de potenciar desenvolvimentos no processo de formação
dos Corpos de inclusão e na PJ-AR.
63
4. Anexos
4.1. Anexo 1
Figura i - Sequencia da região codificante do gene PARK2 e da proteína Parkina com referência a possíveis reacções
e exões alternativos (azul) e aminoácidos codificados através de uma junção de splice (vermelho).
Sequência de Nucleótidos (1398 b): ATGATAGTGTTTGTCAGGTTCAACTCCAGCCATGGTTTCCCAGTGGAGGTCGATTCTGACACCAGCATCTTCCAGCTCAAGGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGGGGGTTCCGGCTGACCAGTTGCGTGTGATTTTCGCAGGGAAGGAGCTGAGGAATGACTGGACTGTGCAGAATTGTGACCTGGATCAGCAGAGCATTGTTCACATTGTGCAGAGACCGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATGAATGCAACTGGAGGCGACGACCCCAGAAACGCGGCGGGAGGCTGTGAGCGGGAGCCCCAGAGCTTGACTCGGGTGGACCTCAGCAGCTCAGTCCTCCCAGGAGACTCTGTGGGGCTGGCTGTCATTCTGCACACTGACAGCAGGAAGGACTCACCACCAGCTGGAAGTCCAGCAGGTAGATCAATCTACAACAGCTTTTATGTGTATTGCAAAGGCCCCTGTCAAAGAGTGCAGCCGGGAAAACTCAGGGTACAGTGCAGCACCTGCAGGCAGGCAACGCTCACCTTGACCCAGGGTCCATCTTGCTGGGATGATGTTTTAATTCCAAACCGGATGAGTGGTGAATGCCAATCCCCACACTGCCCTGGGACTAGTGCAGAATTTTTCTTTAAATGTGGAGCACACCCCACCTCTGACAAGGAAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCAACAAATAGTCGGAACATCACTTGCATTACGTGCACAGACGTCAGGAGCCCCGTCCTGGTTTTCCAGTGCAACTCCCGCCACGTGATTTGCTTAGACTGTTTCCACTTATACTGTGTGACAAGACTCAATGATCGGCAGTTTGTTCACGACCCTCAACTTGGCTACTCCCTGCCTTGTGTGGCTGGCTGTCCCAACTCCTTGATTAAAGAGCTCCATCACTTCAGGATTCTGGGAGAAGAGCAGTACAACCGGTACCAGCAGTATGGTGCAGAGGAGTGTGTCCTGCAGATGGGGGGCGTGTTATGCCCCCGCCCTGGCTGTGGAGCGGGGCTGCTGCCGGAGCCTGACCAGAGGAAAGTCACCTGCGAAGGGGGCAATGGCCTGGGCTGTGGGTTTGCCTTCTGCCGGGAATGTAAAGAAGCGTACCATGAAGGGGAGTGCAGTGCCGTATTTGAAGCCTCAGGAACAACTACTCAGGCCTACAGAGTCGATGAAAGAGCCGCCGAGCAGGCTCGTTGGGAAGCAGCCTCCAAAGAAACCATCAAGAAAACCACCAAGCCCTGTCCCCGCTGCCATGTACCAGTGGAAAAAAATGGAGGCTGCATGCACATGAAGTGTCCGCAGCCCCAGTGCAGGCTCGAGTGGTGCTGGAACTGTGGCTGCGAGTGGAACCGCGTCTGCATGGGGGACCACTGGTTCGACGTGTAG
Tradução (465 aa): MIVFVRFNSSHGFPVEVDSDTSIFQLKEVVAKRQGVPADQLRVIFAGKELRNDWTVQNCDLDQQSIVHIVQRPWRKGQEMNATGGDDPRNAAGGCEREPQSLTRVDLSSSVLPGDSVGLAVILHTDSRKDSPPAGSPAGRSIYNSFYVYCKGPCQRVQPGKLRVQCSTCRQATLTLTQGPSCWDDVLIPNRMSGECQSPHCPGTSAEFFFKCGAHPTSDKETSVALHLIATNSRNITCITCTDVRSPVLVFQCNSRHVICLDCFHLYCVTRLNDRQFVHDPQLGYSLPCVAGCPNSLIKELHHFRILGEEQYNRYQQYGAEECVLQMGGVLCPRPGCGAGLLPEPDQRKVTCEGGNGLGCGFAFCRECKEAYHEGECSAVFEASGTTTQAYRVDERAAEQARWEAASKETIKKTTKPCPRCHVPVEKNGGCMHMKCPQPQCRLEWCWNCGCEWNRVCMGDHWFDV
64
4.2. Anexo 2
Figura ii - Sequencia da região codificante do gene SNCAIP e da proteína Sinfilina-1.
Sequência de Nucleótidos (2802 b): CAAAATGTGCAAGGAAGAATAATGGAAGCCCCTGAATACCTTGATTTGGATGAAATTGACTTTAGTGATGACATATCTTATTCAGTCACATCACTCAAGACGATCCCAGAACTGTGCCGAAGATGTGATACGCAAAACGAAGACAGATCAGTTTCTAGCTCTAGCTGGAATTGTGGCATCTCAACTCTTATTACAAACACGCAAAAGCCCACAGGAATCGCTGATGTGTACAGTAAGTTCCGCCCAGTGAAGCGGGTTTCGCCACTGAAACATCAGCCAGAGACTCTGGAGAACAATGAAAGTGATGACCAAAAGAACCAGAAAGTGGTTGAGTACCAGAAAGGGGGTGAGTCTGACCTGGGCCCCCAGCCTCAGGAGCTTGGCCCTGGAGATGGAGTGGGCGGCCCACCAGGTAAGAGCTCTGAGCCCAGCACATCGCTGGGTGAACTGGAGCACTACGACCTCGACATGGATGAGATTCTGGATGTGCCTTATATTAAATCCAGTCAGCAGCTTGCCTCTTTTACCAAGGTGACTTCAGAAAAAAGAATTTTGGGCTTATGCACAACCATCAATGGCCTTTCTGGCAAAGCCTGCTCTACAGGAAGTTCTGAGAGCTCATCATCCAACATGGCACCATTTTGTGTTCTTTCTCCCGTGAAAAGCCCTCACTTGAGAAAAGCATCAGCTGTCATCCACGACCAGCACAAGCTGTCCACTGAAGAAACCGAGATCTCACCTCCTCTGGTTAAATGTGGCTCTGCATATGAGCCTGAAAACCAGAGTAAAGACTTCCTAAACNAGACATTTAGTGATCCTCATGGTCGAAAAGTTGAGAAGACAACAGACTGCCAGCTCAGGGCCTTCCACCTACAATCCTCAGCAGCAGAATCCAAACCAGAAGAGCAGGTCAGTGGCCTAAACCGGACCAGCTCCCAAGGCCCAGAAGAAAGGAGTGAGTATCTGAAAAAAGTGAAAAGCATCTTGAACATTGTTAAAGAAGGACAGATCTCTCTCCTGCCACACCTAGCTGCAGACAATCTAGACAAAATTCACGACGAANATGGAAACAATCTATTACATATTGCGGCGTCACAGGGACACGCAGAGTGTCTACAGCACCTCACTTCTTTGATGGGAGAAGACTGCCTCAATGAGCGCAACACTGAGAAGTTGACTCCAGCANGCCTGGCCATTAAGAATGGTCAGTTGGAGTGCGTACGCTGGATGGTGAGCGAAACAGAAGCCATTGCAGAACTGAGTTGTTCTNANGATTTTCCAAGCCTTATTCATTACGCAGGTTGCTATGGCCAGGAAAAGATTCTTCTGTGGCTTCTTCAGTTTATGCAAGAACAGGGCATCTCGTTGGATGAAGTAGACCAGGATGGCAACAGTGCCGTTCACGTAGCCTCACAGCATGGCTACCTTGGATGCATACAGACCTTGGTTGAATATGGAGCAAATGTCACCATGCAGAACCACGCTGGGGAAAAGCCCTCCCAGAGCGCCGAGCGGCAGGGGCACACCCTGTGCTCCAGGTACCTGGTGGTGGTGGAGACCTGCATGTCGCTGGCCTCTCAAGTGGTGAAGTTAACCAAGCAGCTAAAGGAACAAACAGTAGAACGTGTCACGCTGCAGAACCAACTCCAACAATTTCTAGAAGCCCAGAAATCAGAGGGCAAGTCACTCCCTTCTTCACCCAGTTCACCATCCTCACCTGCCTCCAGAAAGTCCCAGTGGAAATCTCCAGATGCAGATGATGATTCTGTAGCCAAAAGCAAGCCAGGAGTCCAAGAGGGGATTCAGGTTCTTGGAAGCCTGTCAGCCTCCAGCCGGGCTAGACCCAAAGCAAAAGATGAAGATTCTGATAAAATCTTACGCCAGTTATTGGGAAAGGAAATCTCAGAAAATGTCTGCACCCAGGAAAAACTGTCCTTGGAATTCCAGGATGCTCAGGCTTCCTCTAGAAATTCTAAAAAGATCCCACTGGAGAAGAGGGAACTGAAGTTAGCCAGGCTGAGACAGCTGATGCAGAGGTCACTGAGTGAGTCTGACACAGACTCCAACAACTCTGAGGACCCCAAGACTACCCCAGTGAGGAAGGCTGACCGACCAAGGCCGCAGCCCATTGTAGAAAGCGTAGAGAGTATGGACAGCGCAGAAAGCCTGCACCTGATGATTAAGAAACACACCTTGGCATCAGGGGGACGCAGGTTTCCTTTCAGCATCAAGGCCTCCAAATCCCTGGATGGCCACAGCCCATCTCCCACCTCAGAGAGCAGCGAACCAGACTTAGAATCCCAGTATCCAGGCTCAGGGAGTATTCCTCCAAACCAGCCCTCTGGTGACCCTCAGCAGCCCAGCCCTGACAGTACTGCTGCCCAGAAAGTTGCCACAAGTCCCAAGAGTGCCCTCAAGTCTCCATCTTCCAAGCGTAGGACATCTCAGAACTTAAAACTGAGAGTTACCTTTGAGGAGCCTGTGGTGCAGATGGAGCAGCCTAGCCTTGAACTGAATGGAGAAAAAGACAAAGATAAGGGCAGGACTCTCCAGCGGACCTCCACAAGTAACGAATCGGGGGATCAACTGAAAAGGCCTTTTGGAGCCTTTCGATCTATCATGGAGACACTAAGTGGCAACCAAAACAATAATAATAACTACCAGGCAGCCAACCAGCTGAAAACCTCTACATTACCCTTGACCTCACTTGGGAGGAAGACAGATGCCAAGGGAAACCCTGCCAGCTCCGCTAGCAAAGGAAAGAATAAGGCAGCATAA
Tradução (919 aa): MEAPEYLDLDEIDFSDDISYSVTSLKTIPELCRRCDTQNEDRSVSSSSWNCGISTLITNTQKPTGIADVYSKFRPVKRVSPLKHQPETLENNESDDQKNQKVVEYQKGGESDLGPQPQELGPGDGVGGPPGKSSEPSTSLGELEHYDLDMDEILDVPYIKSSQQLASFTKVTSEKRILGLCTTINGLSGKACSTGSSESSSSNMAPFCVLSPVKSPHLRKASAVIHDQHKLSTEETEISPPLVKCGSAYEPENQSKDFLNKTFSDPHGRKVEKTTPDCQLRAFHLQSSAAESKPEEQVSGLNRTSSQGPEERSEYLKKVKSILNIVKEGQISLLPHLAADNLDKIHDENGNNLLHIAASQGHAECLQHLTSLMGEDCLNERNTEKLTPAGLAIKNGQLECVRWMVSETEAIAELSCSKDFPSLIHYAGCYGQEKILLWLLQFMQEQGISLDEVDQDGNSAVHVASQHGYLGCIQTLVEYGANVTMQNHAGEKPSQSAERQGHTLCSRYLVVVETCMSLASQVVKLTKQLKEQTVERVTLQNQLQQFLEAQKSEGKSLPSSPSSPSSPASRKSQWKSPDADDDSVAKSKPGVQEGIQVLGSLSASSRARPKAKDEDSDKILRQLLGKEISENVCTQEKLSLEFQDAQASSRNSKKIPLEKRELKLARLRQLMQRSLSESDTDSNNSEDPKTTPVRKADRPRPQPIVESVESMDSAESLHLMIKKHTLASGGRRFPFSIKASKSLDGHSPSPTSESSEPDLESQYPGSGSIPPNQPSGDPQQPSPDSTAAQKVATSPKSALKSPSSKRRTSQNLKLRVTFEEPVVQMEQPSLELNGEKDKDKGRTLQRTSTSNESGDQLKRPFGAFRSIMETLSGNQNNNNNYQAANQLKTSTLPLTSLGRKTDAKGNPASSASKGKNKAA
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