Con˜ra os destaques do ano. - sbte.org.br · Paula de Carvalho Papa (USP): Diretora Científica...

Con�ra os destaques do ano.

Re�exos de um periodo de turbulência e o mercado de embriões CENÁRIO ATUAL

OS MELHORES MOMENTOS Veja as fotos que marcaram nosso XXX encontro

Edição 58 ano XXX / 2º Semestre 2016

A cinética das primeiras clivagens influência o padrão de metilação de DNA de embriões bovinos

Ultrassonografia em modo Doppler colorido como substituta à laparoscopia na contagem de CLs em ovelhas superovuladas

OS MELHORES MOMENTOS Veja as fotos que marcaram nosso XXX encontro

ARTIGO TÉCNICO

José BuratiniPresidente da SBTE – Gestão 2016/2017

PALAVRADO PRESIDENTE

Caros amigos, Em primeiro lugar, quero agradecer a todos os participantes da nossa XXX Reunião Anual e a todos aqueles que contribuíram para o seu sucesso. Nossa diretoria está extremamente feliz e gratificada com o retorno positivo que recebeu dos participantes sobre a programação científica e social. Estamos também bastante satisfeitos com o número de participantes (403) e saúde financeira do evento, considerando-se o momento econômico difícil que atravessamos. Nunca é demais lembrar que as empresas parceiras foram fundamentais para isso. Por isso, reforço nosso agradecimento a todas elas, especialmente, às integrantes do condomínio. Nossa diretoria reconhece que o sucesso do evento depende da participação dos sócios, parceiros comerciais, estudantes e de todos os demais congressistas. Por isso, em seguida, já tentarei seduzi-los a participarem do nosso próximo encontro, com a expectativa de fazermos juntos uma Reunião ainda melhor.

Agradeço também aos sócios que participaram da nossa Assembleia por suas valiosas sugestões e por seu apoio para avançarmos na organização do workshop “SBTE de Porteira Aberta”. Acredito que o workshop “Aplicação Comercial das Biotecnologias Reprodutivas”, realizado neste ano, tenha sido uma experiência muito bem sucedida nessa direção. Espero que a “SBTE de Porteira Aberta” incremente a interação entre nossos técnicos e cientistas com agentes de diversos setores da cadeia produtiva pecuária, gerando projetos e negócios que contribuam para o desenvolvimento econômico e social. Essa é, a meu ver, uma missão fundamental da nossa Sociedade, especialmente em momentos de turbulência como este. Aliás, convido-os a ler nessa edição o brilhante artigo do Dr. João Henrique Viana (responsável pelo Comitê de Estatística da SBTE e nosso representante junto ao “Data Retrieval Committee” da IETS) e da Dra. Ana Cristina Silva

de Figueiredo, que aborda a turbulência recente no mercado nacional de embriões, suas causas, bem como novos mercados e oportunidades para a PIVE nacional.

Como antecipado acima, quero agora anunciar a sede e data de nossa próxima Reunião Anual e estimulá-los a reservar desde já essa data em sua agenda. A XXXI Reunião Anual da SBTE será realizada de 17 a 19 de agosto de 2017, no Sheraton Reserva do Paiva Hotel & Convention Center, Recife. Trata-se de um hotel de altíssimo padrão recém-inaugurado, provido de um centro de convenções que nos atende perfeitamente e localizado em uma área belíssima. É importante frisar que os custos, tanto da logística do evento, quanto da estadia, serão muito semelhantes aos oferecidos pelo Recanto das Cataratas em Foz do Iguaçu neste ano. Além disso, estamos negociando um valor de hospedagem bastante convidativo no Hotel Tryp – Jaboatão dos Guararapes, também muito confortável e recém-inaugurado, bastante próximo ao Sheraton, que deverá atender os congressistas que optarem por uma estadia mais econômica.

Aproveito ainda essa oportunidade para reforçar as boas-vindas ao Dr. Marcelo Seneda, nosso novo vice-presidente, conforme anunciado em nossa última Assembleia. Agradeço a valiosa colaboração até aqui do Dr. Luiz Sérgio de Almeida Camargo, que em função de mudanças imprevistas na sua agenda profissional, precisou solicitar sua substituição. Nossa diretoria certamente compreende seus motivos e se alegra com a disponibilidade do Dr. Seneda, que garante a administração de nossa sociedade em alto nível nos próximos anos.

Finalmente, espero que aproveitem a leitura dessa edição e que aprovem a escolha do Sheraton Reserva do Paiva Hotel & Convention Center como sede para nossa próxima Reunião. Conto com a sua presença desde já, para que possamos fazer um evento de grande sucesso, mantendo a identidade e o vigor de nossa Sociedade.

ÍNDICE Jornal O Embrião

Jornal O Embrião - 5

CENÁRIO ATUALPRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS EM 2014 E 2015: REFLEXOS DE UM PERÍODO DE TURBULÊNCIAS

SBTE 2016 PROGRAMAÇÃO DE QUALIDADE

ARTIGO TÉCNICOA CINÉTICA DAS PRIMEIRAS CLIVAGENS INFLUÊNCIA O PADRÃO DE METILAÇÃO DE DNA DE EMBRIÕES BOVINOS

PREMIAÇÃO OS MELHORES DA SBTE 2016

RADAR SBTE NOTÍCIAS E NOVIDADES

ARTIGO TÉCNICOULTRASSONOGRAFIA EM MODO DOPPLER COLORIDO COMO SUBSTITUTA À LAPAROSCOPIA NA CONTAGEM DE CLS EM OVELHAS SUPEROVULADAS

DICA DE LIVROATLAS DE MORFOLOGIA ESPERMÁTICA BOVINA

EXPEDIENTEJosé Buratini Junior

UnespPresidente

Marcelo SenedaUEL

Vice-presidente

Claudia Maria B. Membrive (Unesp):1º SecretáriaLindsay Unno Gimenes (Unesp): 2ª Secretária

Guilherme de Paula Nogueira (Unesp): 1º TesoureiroAlexandre Rossetto Garcia (Embrapa): 2º Tesoureiro

Felipe Perecin (USP): Diretor CientíficoPaula de Carvalho Papa (USP): Diretora Científica

José de Oliveira Carvalho (UFES): Diretor de ComunicaçãoJosé Eduardo Portela Santos (UFL): Diretor científico

Anthony César de Souza Castilho (UNOESTE): Colaborador de comunicação Mauricio Antonio Silva Peixer (Bio Biotecnologia Animal): Diretor Comercial

Edmundo Rocha Vilel (Lageado): Representante dos Veterinários de Campo

PROJETO GRÁFICO E DIAGRAMAÇÃO:BRIX COMUNICAÇÃO E EVENTOS

Diretor de Arte: Marcelo Francelin

JORNALISTA RESPONSÁVEL:Thaís Cieglinski/MTb: 4352/02-DF)

Tel: (61) [email protected]

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6 - Jornal O Embrião

CENÁRIO ATUAL

PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS EM 2014 E 2015: REFLEXOS DE UM PERÍODO DE TURBULÊNCIAS

Os dados levantados pelo censo estatístico realizado pela Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões (SBTE) confirmam o que antecipamos em nosso último artigo. Os anos de 2014 e 2015 foram marcados por um conjunto de eventos que, associados, tiveram impacto negativo na indústria de embriões bovinos. O dado mais simbólico deste impacto foi o fato de que, pela primeira vez desde que a produção in vitro de embriões (PIVE) emergiu comercialmente no início dos anos 2000, houve uma redução significativa no total absoluto de embriões produzidos pelo uso desta tecnologia no país. Ainda que a variação nos totais gerais seja relativamente pequena, as flutuações em segmentos específicos foram bastante acentuadas. O detalhamento dos dados estatísticos referentes aos anos-base de 2014 e 2015, e a análise conjuntural, estão apresentados a seguir.

João Henrique M Viana - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - [email protected] Ana Cristina Silva de Figueiredo - Universidade de Alfenas

A indústria de embriões em números

Os totais de embriões bovinos produzidos em 2014 e 2015, estratificados por segmento (zebuínos e taurinos, corte e leite) e por metodologia (in vivo [TE] e in vitro [PIVE]), estão apresentados nas Tabelas 1 e 2. A variação negativa no total de embriões produzidos, em relação aos anos anteriores (-9,9% no período 2013-2015, sendo de -6,0% em 2014 e de -4,1% em 2015), foi relativamente pequena, e poderia ser considerada normal levando-se em conta um cenário de estabilização no uso das tecnologias de embriões, e também a flutuação normal que ocorre ano a ano em função de fatores aleatórios. Essa flutuação ocasional nos números totais quase não ocorreu na última década em função do vigor da expansão no uso da PIVE, mas pode ser constatada observando-se especificamente o extrato relativo à produção de embriões in vivo (por superovulação) na Figura 1.

Contudo, a pequena variação no total geral esconde mudanças significativas em segmentos específicos. O uso das tecnologias de embriões segue em crescimento no segmento leite (+12,8% entre 2013 e 2015), conforme tendência já observada nos anos anteriores, apesar da oscilação negativa observada em 2015 (-23,0%). Analisando-se por grupamento racial, observou-se uma redução consistente na participação das raças zebuínas leiteiras (-21,5% em 2014 e -9,6% em 2015). Já nas raças taurinas leiteiras, a tendência do período 2013-2015 foi de alta nas raças com números mais significativos (+44,4% no Holandês, +253,3% no Pardo Suíço e +14,3% no Girolando), apesar da redução negativa em algumas raças em 2015 (-36,5% no Holandês e -21,4% no Girolando).

O segmento corte, por outro lado, apresentou mudanças mais significativas. Após um período relativamente longo

Tabela 1. Produção de embriões bovinos no Brasil em 2014, estratificada por segmento e por tecnologia adotada (in vivo [TE] ou in vitro [PIVE]).

Tabela 2. Produção de embriões bovinos no Brasil em 2015, estratificada por segmento e por tecnologia adotada (in vivo [TE] ou in vitro [PIVE]).

de estabilização, entre 2006-2012 (variação de -0.2%), observou-se uma retração acentuada em 2014 (-47,7%), que anulou o efeito da alta no segmento leite naquele ano e resultou na redução nos números totais. Avaliando-se por segmento, em 2014, houve uma variação negativa na produção de embriões tanto em taurinos (-29,0%) quanto em zebuínos (-53,5%), que só não foi observada em raças com menos expressão no mercado (<1,5% do total do segmento). Apesar da redução da produção de embriões ter sido uma tendência generalizada no corte, merece destaque a queda observada na raça Nelore (-54,0%), particularmente considerando-se que a raça ainda responde pela maior fatia

do segmento corte. Além disso, o Nelore foi durante muitos anos a principal força do mercado de embriões do Brasil, e a raça chegou a corresponder sozinha, em 2005, por 90,0% do segmento corte e 82,7% do total de embriões produzidos no país. Em 2015, houve uma recuperação do segmento, com alta de 38%. Curiosamente, esta recuperação não foi devido ao segmento zebu, que permaneceu relativamente estável (+1.5%), mas ao crescimento no segmento taurino, no qual tradicionalmente o uso da PIVE tinha pouca expressão. Se esta variação foi circunstancial ou não só será possível definir no futuro, mas o aumento no uso da PIVE em raças taurinas é uma tendência consistente no segmento leite já a alguns anos.

De maneira geral, o cenário atual parece consolidar algumas mudanças importantes no mercado nacional. A indústria de embriões no Brasil, que até 2007 poderia ser considerada como tipicamente voltada aos segmentos zebuínos e corte (94,5% e 89,3%, respectivamente), gradualmente migrou para outros segmentos e hoje vem ganhando espaço predominantemente em taurinos e/ou cruzamentos e no leite (Figuras 2 e 3). Contudo, as fortes oscilações observadas em 2014 e 2015 no segmento leite e, principalmente, no corte, sugerem não tendências de mercado, mas sim uma forte influência de fatores externos, podendo, portanto, ser apenas circunstanciais.

Figura 2. Proporção do total de embriões bovinos produzidos no Brasil em 2014 e 2015 provenientes de raças leiteiras (Leite) ou de corte (Corte).

Figura 1. Produção de embriões bovinos no Brasil no período 1995-2015, total e por tecnologia adotada (in vivo [TE] ou in vitro [PIVE]).


CENÁRIO ATUAL

Influência dos fatores conjunturais

De maneira geral, as variações observadas entre 2013-2015 ocorreram de forma consistente tanto para produção de embriões in vivo quanto in vitro, sugerindo que elas foram determinadas por fatores externos e de mercado, e não pela eficiência das diferentes tecnologias de embriões. A produção in vitro continua sendo a técnica de eleição, representando 88,9% dos embriões produzidos em 2014 e 94.1% em 2015 (Figura 4), e a maioria dos embriões continua

Figura 4. Proporção do total de embriões bovinos produzidos no Brasil em 2014 e 2015 in vivo (TE) ou in vitro (PIVE).

Figura 3. Proporção do total de embriões bovinos produzidos no Brasil em 2014 e 2015 provenientes de raças taurinas (Bos taurus) ou zebuínas (Bos indicus).

sendo transferidos a fresco (78.9% e 77.2% em 2014 e 2015, respectivamente). Contudo, o período foi caracterizado por um conjunto de fatores com influência direta no desempenho da indústria de embriões.

Um fator que contribuiu decisivamente para a retração na atividade foi a grave estiagem entre 2013-2014 [1], com efeitos particularmente drásticos na Região Sudeste, que concentra um grande número de criatórios e de centrais de produção de embriões. A seca prolongada afetou não apenas


CENÁRIO ATUAL

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CENÁRIO ATUAL

a produção rural, mas também o abastecimento de água de alguns dos principais centros urbanos do país, com grande repercussão na imprensa. Para a indústria de embriões, o efeito mais perceptível foi na disponibilidade de receptoras, em grande parte provenientes de rebanhos manejados a pasto, o que obrigou vários programas a desacelerarem ou eventualmente até suspenderem temporariamente as atividades. Mesmo nos sistemas de semiconfinamento, a redução na produção e o consequente aumento nos custos dos volumosos utilizados na suplementação impactaram na viabilidade dos projetos. Em boa parte das regiões afetadas, o regime hídrico só se normalizou após o verão 2014-2015, muito tarde para reverter as consequências para o mercado de embriões.

Paralelamente, o período 2013-2015 também foi (um ano) marcado por incertezas políticas e econômicas. Este cenário não é excepcional em anos de eleição presidencial. Observando-se a série histórica, a última retração no total de embriões produzidos (ainda que não no total de embriões PIV) ocorreu entre 2006-2007, coincidindo com a reeleição do presidente Luiz Inácio Lula da Silva, pouco após emergirem as denúncias do escândalo conhecido por “Mensalão”, e também associadas à flutuação acentuada do câmbio. A diferença agora é que o cenário político não se estabilizou após a eleição e as incertezas persistiram com a perspectiva da abertura do processo de impeachment, que só culminou em 2016.

O terceiro componente da equação, a economia em recessão, também já era evidente em 2014, ano que terminou com o PIB próximo de zero [2], e se tornou evidente em 2015, com um PIB negativo de -3.8%, o dólar atingindo cotação recorde e um déficit das contas públicas acima de R$ 100 Bilhões. Ainda que o agronegócio como um todo tenha sido o setor menos afetado pela crise, algumas áreas específicas, como a indústria de embriões, são mais sensíveis às oscilações do mercado. O melhoramento animal, particularmente em bovinos, é um investimento de longo prazo, e, por isso, diretamente influenciado pelas projeções futuras da economia.

Desta forma, a retração observada era esperada e já vinha sendo antecipada pelo mercado. Contudo, uma análise estratificada da produção de embriões em 2014 e 2015 mostra que estes fatores, ainda que importantes, parecem ter tido pesos diferentes para cada segmento do mercado. No caso do corte, por exemplo, o segmento vinha de um cenário de estabilização, que indicava equilíbrio entre oferta e demanda. Desta forma, era esperado que qualquer retração no mercado tivesse um impacto direto na produção de embriões. Já no caso do leite, a abertura de novos mercados, com expansão do uso da PIVE na produção de cruzamentos e em raças taurinas, vinha alavancando o crescimento da indústria de embriões desde 2010-2011, e podem ter dado maior fôlego ao segmento, compensando parcialmente os efeitos da conjuntura macroeconômica desfavorável.

A quebra de paradigma

Variações na participação relativa dos segmentos corte e leite não chegam a caracterizar um fato excepcional (,) e já ocorreram no período anterior ao uso da PIVE. Contudo, a forte predominância dos zebuínos de corte no período inicial do crescimento da PIVE no Brasil criou um paradigma de que a tecnologia só era viável em função do grande número de oócitos recuperados destas raças, ou seja, o sucesso comercial da PIVE no Brasil era considerado um fato excepcional e localizado, em relação ao mercado mundial de embriões. A mudança recente mostra o contrário, e aproxima o mercado nacional do perfil predominante no mercado internacional (taurinos, leite). De fato, o uso da PIVE também está em expansão na Europa e nos EUA [3] e é possível que se observe nos próximos anos uma substituição gradual da TE convencional pela PIVE nestas regiões, assim como ocorreu no Brasil. Esta poderá ser uma oportunidade importante para abertura de novos mercados pelas empresas nacionais, e consequentemente propiciar um novo ciclo de crescimento da produção de embriões no Brasil.

Referências[1] http://br.reuters.com/article/topNews/idBRKCN0SO2P220151030[2] http://economia.uol.com.br/noticias/redacao/2015/03/27/pib-2014.htm[3] 2013 Statistics of Embryo Collection and Transfer in Domestic Farm Animals. Embryo Transfer Newsletter, p.14, December, 2014.


CENÁRIO ATUAL


SBTE 2016

FOZ DO IGUAÇU - PR

2016TECNOLOGIA DE EMBRIÕES

XXXREUNIÃO ANUAL DASOCIEDADE BRASILEIRA DE


Entre os dias 25 e 27 de agosto, foi realizada a trigésima Reunião Anual da SBTE na belíssima cidade de Foz do Iguaçu. Mais de 400 inscritos participaram de extensa programação com os principais temas de interesse do setor de tecnologia de embriões, seja em pesquisa ou em campo. A programação também contou com a presença das empresas do condomínio empresarial, apresentação de posters, com apresentação de 249 resumos e debates com a possibilidade de troca de conhecimento e de integração entre profissionais da academia e mercado.

O evento reuniu 45 palestrantes e 12 empresas líderes em diferentes setores relacionadas à reprodução animal. As palestras foram apresentadas durante três dias, durante workshops, plenárias e áreas temáticas da SBTE Ciência e SBTE Tecnologia. O formato do evento ainda incluiu e mesas redondas com os palestrantes, nas quais os participantes tiveram a oportunidade de interagir com os diferentes oradores.

APROVEITE E VEJA ALGUMAS FOTOS DA REUNIÃO NESTA EDIÇÃO DO JOE, OU ACESSE O SITE DA SBTE PARA VISUALIZAR TODAS AS FOTOS DO EVENTO

www.sbte.org.br


SBTE 2016

FOZ DO IGUAÇU - PR

2016TECNOLOGIA DE EMBRIÕES

XXXREUNIÃO ANUAL DASOCIEDADE BRASILEIRA DE



ARTIGO TÉCNICO


A CINÉTICA DAS PRIMEIRAS CLIVAGENS INFLUENCIA O PADRÃO DE METILAÇÃO

DE DNA DE EMBRIÕES BOVINOSIspada, J1; Annes, K2; de Lima, CB1; Sirard, MA3; Milazzotto, MP1,2.

1 Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2 Centro de Ciências Naturais e Humanas, Universidade Federal do ABC; 3 Centre de recherche en biologie de la reproduction, Faculté des sciences de l’agriculture et de

l’alimentation, Université Laval.

A produção in vitro (PIV) de embriões é uma biotécnica que permite que seja produzida uma maior quantidade de embriões de um animal matriz de interesse zootécnico ou comercial1. Na pecuária bovina, a utilização desta técnica tem apresentado crescimento ao longo dos anos. No entanto, em cada uma das etapas ocorre redução nas taxas de sucesso obtidas fazendo com que a razão gestação/oócitos tenha valor abaixo do ideal2. Atualmente, são obtidas taxas de 30–45% de oócitos maturados in vitro que atingem o estágio de blastocisto e, destes embriões, cerca de 40–60% são capazes de produzir gestação após transferência3. Com a finalidade de aumentar o sucesso da PIV, cada uma das etapas desse processo e o modo de seleção de embriões vêm sendo aprimoradas, sendo que o cultivo in vitro (CIV) embrionário é um dos principais alvos de pesquisas, visto que neste período ocorre grande queda de produção de embriões3.

Um dos métodos recentemente incorporados na seleção embrionária é a morfocinética, que consiste na seleção de embriões através da morfologia e velocidade de clivagens4. No entanto, esse método ainda é controverso e pode apresentar diferenças entre espécies. Por exemplo, em humanos, os embriões com maior taxa de implantação são aqueles que clivam mais cedo5,6. Inicialmente, acreditou-se que embriões de camundongos PIV com alta cinética de desenvolvimento também apresentavam maior qualidade e eram mais semelhantes aos produzidos in vivo. Porém, recentemente, foi relatado que o padrão epigenético e morfológico de embriões de cinética lenta

de desenvolvimento in vitro são mais semelhantes aos produzidos in vivo do que embriões de clivagem rápida7.

Embriões bovinos com alta cinética de desenvolvimento apresentam metabolismo elevado; maiores danos ao DNA8; alto consumo de piruvato e glutamato na fase de mórula; acúmulo de lipídios no estágio de blastocisto9; maior ativação de mecanismos de sobrevivência10. Embriões bovinos de baixa cinética de desenvolvimento apresentam altos níveis de enzimas antioxidantes; menor metabolismo e índice glicolítico; menor reversão de aminoácidos11; secreção de glutamato na fase de mórula; aumento no consumo de glicose na fase de ativação do genoma embrionário; pouco acúmulo de lipídios e acúmulo de glicogênio no estágio de blastocistos9.

Também já foi relatado que o consumo e a secreção (produção) de metabólitos globais são diferentes entre embriões rápidos e lentos nas fases de clivagem, mórula e blastocisto12. Além disso, a análise de transcritos de embriões de desenvolvimento lento é mais semelhante aos produzidos in vivo do que os embriões rápidos na fase de blastocisto9. Essa diferença sugere que, entre os embriões bovinos produzidos in vitro, possam existir padrões epigenéticos distintos, visto que este é um importante mecanismo regulatório da transcrição gênica13.

Baseado nas informações anteriores, este trabalho objetivou identificar o padrão de metilação de DNA de


ARTIGO TÉCNICO

embriões bovinos produzidos in vitro com diferentes cinéticas de desenvolvimento.

Metodologia

Delineamento experimental - A coleta de amostras foi realizada no Laboratório de Biologia Celular e Molecular do Centro de Ciências Naturais e Humanas da Universidade Federal do ABC, São Paulo, Brasil. A análise das amostras e dos resultados foram feitas no Laboratório de Genômica Funcional de Embrionário de Desenvolvimento Inicial do Instituto de Nutracêuticos e Alimentos Funcionais da Faculdade de Ciências Agrárias e de alimentos, Universidade Laval, Quebec, Canadá. Embriões bovinos foram produzidos in vitro e, às 40 horas pós-inseminação (hpi), eles foram classificados em embriões rápidos (4 células ou mais) e lentos (2 ou 3 células). Esses grupos de embriões foram avaliados no estágio de blastocisto (168 hpi). Os grupos foram avaliados em relação a regiões do DNA com hipo e hipermetilações.

Coleta e maturação in vitro (MIV) de oócitos - Ovários de animais oriundos de abatedouro comercial foram transportados para o laboratório em solução salina estéril. Os Complexos Cumulus-Oócito (CCOs) foram coletados pela técnica de aspiração folicular com o auxílio de seringa e agulha e selecionados de acordo com as características morfológicas14 em estereomicroscopio. Os CCOs foram lavados em meio Pré-MIV [Tissue Culture Medium-199 (TCM-199) - HEPES contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 50μg/mL de gentamicina e 0,2mM de piruvato de sódio] e meio MIV [TCM-199 - Bicarbonato contendo 10% de soro fetal bovino, 50μg/mL de gentamicina, 0,2mM de piruvato de sódio, 1μg/mL de estradiol, 10μg/mL de hormônio folículo estimulante (FSH) e 1μg/mL de hormônio luteinizante (LH)], sendo, posteriormente, divididos em grupos de 25-30 CCOs e submetidos a maturação em gotas de 90µL do meio MIV, sob óleo mineral por 22-24 horas a 38,5°C em 5% de CO2 em ar e alta umidade.

Fertilização in vitro (FIV) - Os meios de cultura TALP (Tyrode’s albumin-lactate-pyruvate) utilizados para

purificação do sêmen e FIV foram preparados segundo Parrish et al. (1988)15. Após 22-24 horas de maturação, os CCOs foram lavados e grupos de 30 CCOs e transferidos para gotas de 70μL de meio FIV composto pela solução TALP modificada com 6 mg/mL de Albumina Sérica Bovina (BSA) - livre de ácidos graxos, 50μg/mL de gentamicina, 0,2mM de piruvato de sódio, 17.500 USP/mL de heparina e 0,044μL/mL de PHE (Penicilamina 2μM, hipotaurina 1μM, epinefrina 0,25μM). O sêmen foi descongelado durante 30 segundos à 37°C e purificada em gradiente de Percoll (Percoll 80% e Percoll 40%) pela centrifugação a 6.000g por 6 minutos. O sedimento foi centrifugado a 3.000g por 3 minutos em meio FIV. A fertilização foi feita utilizando sêmen sexado (fêmeas), sendo que cada palheta de sêmen foi utilizada para inseminar 7-8 gotas por 18 horas.

Cultivo in vitro (CIV) - Após a FIV, os presumíveis zigotos foram submetidos à técnica de denudação para a remoção das células do cumulus com auxílio de micropipeta. Depois desta etapa, os presumíveis zigotos foram transferidos para microgotas de 90µL de meio de cultivo 1 [Potassium Simplex Optimization Medium (KSOM), suplementado com 10% de SFB, 50µg/ml de gentamicina e 0,18% de aminoácidos não essenciais] e meio de cultivo 2 [Synthetic Oviduct Fluid (SOF), suplementado com 2% de aminoácidos essenciais, 1% de aminoácidos não essenciais e 5% de SFB] cobertas por óleo mineral e cultivados em incubadora a 38,5°C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, onde permaneceram até o momento da coleta das amostras. Os embriões foram classificados como “clivagem rápida” (4 células ou mais) ou “clivagem lenta” (2 ou 3 células) com 40hpi e coletados após 150 horas do início do CIV (168 hpi) e classificados como “blastocisto rápido” (blastocistos derivados do grupo de “clivagem rápida”) e “blastocisto lento” (blastocistos derivados do grupo de “clivagem lenta”). Nesse momento, os blastocistos foram retirados do cultivo e armazenados a -80ºC para análise posterior.

Embryogene DNA Methylation Array (EDMA) - A análise de metilação do DNA foi realizada como descrito por Shojaei Saadi, et al. (2014)16 utilizando Embryogene DNA Methylation Array (EDMA), desenvolvida para análise de


ARTIGO TÉCNICO

elevado rendimento para o perfil metilômico de pequenas quantidades de amostras de DNA bovino. Para isso, foi realizada (1) a fragmentação de DNA com a enzima de restrição MseI; (2) a adição de adaptadores; (3) fragmentação com enzimas sensíveis à metilação do DNA; (4) amplificação exponencial dos fragmentos metilados; (5) e identificação dos fragmentos usando microarray. Resumidamente, o DNA genômico é isolado com Allprep DNA/RNA micro kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) e fragmentado com a enzima MseI, seguido da união de MseLig21 e MseLig12 aos fragmentos. Para a clivagem de regiões não metiladas de fragmentos MseI-MseI do DNA, foram utilizadas as enzimas HpaII, AciI, e Hinp1I. O DNA genômico foi então submetido a duas rodadas de PCR mediada por ligação (LM-PCR) e as amostras foram amplificadas e marcadas com ULS Fluorescent gDNA labelling kit (Kreatech Biotechnology BV, Amsterdam, The Netherlands). Em seguida, foi realizada a marcação das amostras com Cy-3 ou Cy-5 utilizando o Universal Linkage System Fluorescent gDNA labelling kit (Kreatech Biotechnology). As amostras foram hibridizadas, as lâminas digitalizadas utilizando Agilent's High-Resolution C Scanner (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) e analisadas com Array-Pro Analyzer 6.3 software (MediaCybernetics). Para controle positivo e negativo, foram utilizados fragmentos de DNA de Solanum lycopersicum artificialmente metilados (positivo) ou não metilados (negativo).

Análise dos Dados

Os dados obtidos foram analisados utilizando o pacote Limma de Bioconductor. Primeiramente, os dados foram normalizados, ajustados a um modelo linear e a metilação diferencial obtida por estatística bayesiana. Diferenças na metilação do DNA foram consideradas significativas quando o valor P <0,05 e log2(fold-change) 1,5 absoluto. As comparações entre os embriões de cinética rápida e lenta foram realizadas com base nos valores Eigen, utilizando o pacote MADE4 do Bioconductor. Diferentes plotagens, incluindo plotagens Volcani, foram geradas para visualização da quantidade de regiões diferencialmente metiladas (DMRs)

entre os grupos. A análise de diferentes enriquecimentos foi realizada por meio de de uma série de scripts integrados que categorizam as informações com base em densidade de ilhas CpG, comprimento da ilha CpG, distância de ilhas CpG, a localização genômica e tipos de elementos repetitivos, visando a observação da metilação do DNA em escala genômica. Foi realizada análise de anotação funcional em David Functional Annotation.

Resultados

A plataforma EDMA indica maiores e menores diferenças em metilações, consequentemente sondas com p < 0.05 e log2(fold-change) 1,5 absoluto entre os grupos foram consideradas regiões diferencialmente metiladas. Das sondas utilizadas para microarray, 9.082 foram expressas acima do background apenas em blastocistos rápidos (FBL), 20670 em blastocistos lentos (SBL) e 47713 observadas em ambos. A análise geral das regiões diferencialmente metiladas apresentou que FCB (7976) possuíam maior quantidade de regiões hipermetiladas do que SCB (3608) (Figura 1).

Figura 1: Gráfico de Volcano Plot demonstrando as DMRs hipermetiladas em FBL (Direita – 7976) e hipermetiladas em SBL (Esquerda – 3608). Cada ponto representa uma DMR, sendo localizada de acordo com seus valores de log2 (Fold Change) e p valor. Foram consideradas DMRs hipermetiladas regiões com log2 (fold-change) absoluto ≥1, 5 e p valor <0,05.


ARTIGO TÉCNICO

A análise de regiões gênicas diferencialmente metiladas mostrou que blastocistos do grupo rápido apresentam mais hipermetilações nas regiões intrônica, exônica, promotora próxima, promotora, promotor distal e regiões não próximas a genes do que o observado em blastocistos lentos (Figura 2A). Com relação aos elementos de repetição, foi observado que short-interspersed repetitive elements (SINEs), long-interspersed repetitive elements (LINEs), long-terminal-repeat (LTR) retrotransposons, elementos repetitivos de baixa complexidade e repetições simples também apresentaram maiores hipermetilações em embriões rápidos do que lentos (Figura 2B).

Embriões lentos, entretanto, exibiram mais hipermetilações em ilhas CpGs do que embriões rápidos, enquanto estes apresentaram maior hipermetilação nas regiões CpG Shore, CpG Shelf e Open Sea (Figura 2C). Analisando as ilhas CpGs, foram observadas mais hipermetilações em embriões lentos em ilhas CpGs com densidade maior, intermediária e menor (Figura 2D) e de

comprimento longo, intermediário e curto (Figura 2E) do que em blastocistos rápidos.

À análise em David Functional Annotation revelou que 101 vias de processos biológicos, 44 componentes celulares e 49 funções moleculares foram hipermetiladas em embriões rápidos e 27 vias de processos biológicos, 8 componentes celulares e 27 funções moleculares estavam hipermetiladas em lentos. As principais anotações hipermetiladas observadas em FBL (Tabela 1) e SBL (Tabela 2) encontram-se representadas de acordo com o número de genes envolvidos em cada anotação.

A análise por meio do programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA-Quiagen) permitiu a identificação de 25 Networks que continham 33-35 genes diferencialmente metilados entre embriões de cinética rápida e lenta (Tabela 3). O IPA forneceu ainda a possibilidade de analisar o perfil de metilação em nível gênico, em que foram identificados genes que compõem vias específicas relacionadas ao controle epigenético, ao

Figura 2: DMRs hipermetiladas em FBL (Fast - azul escuro) e em SBL (Slow - azul claro) em A) regiões gênicas (próximo de promotor [PP] e distal de promotor [DP]); B) elementos de repetição (baixa complexidade [LC], long-terminal-repeat[LTR], repetição simples [SR], long-interspersed repetitive elements [LINEs] e short-interspersed repetitive elements [SINEs]); C) proximidade de CpG; D) densidade de CpG; E) Comprimento de CpG. Foram consideradas DMRs hipermetiladas regiões com log2(fold-change) absoluto ≥1.5 e p valor < 0.05.


ARTIGO TÉCNICOTabela 1: Principais anotações hipermetiladas em embriões de clivagem rápida.


ARTIGO TÉCNICO

desenvolvimento de blastocisto, à implantação embrionária, à pluripotência celular ou ao imprint em um dos alelos (materno ou paterno) (dados não apresentados).

Discussão

Durante o desenvolvimento embrionário normal, ocorre a desmetilação de forma ativa do DNA no pró-núcleo masculino e desmetilação passiva no pró-núcleo feminino ainda nas primeiras clivagens, exceto para alguns genes imprinted e elementos de repetição17. Esse evento é responsável por

gerar blastômeros totipotentes (altamente desmetilados) a partir do material genético proveniente dos gametas (altamente metilados)18. O uso de técnicas de reprodução assistida, tais como protocolos de superovulação, etapas da produção in vitro de embriões e criopreservação, podem afetar o padrão epigenético em gametas, embriões e da prole oriunda dessas técnicas13.

Com os resultados obtidos até o momento, foi possível verificar que blastocistos provenientes de embriões com cinéticas de desenvolvimento distintas apresentam

Tabela 2: Principais anotações hipermetiladas em embriões de clivagem lenta.


ARTIGO TÉCNICO


RE-SINCRONIZAÇÃO TETF/TETF - GESTRAN PLUS

Resumos. XXIX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões, Gramado, 2015

Programa TETF + TETF

Consultar o Médico Veterinário para avaliação das femeas e maiores informações.Blaschi et al, 2015.

Programa TETF Tradicional – Vacas Paridas Programa TETF TETF+TETF

( 21 dias)

Nº Animais Nº Prenhez /TE % Concepção /TE % Aprov % Concepção /TE % Prenhez % PAC

1.062 617 58,1 (391/445)87,8

(154/391)39,3

(154/445)34,6

771/1.062)72.5

An.Gestran_Plus.indd 1 10/5/15 3:56 PM


ARTIGO TÉCNICO

Tabela 3: Networks que continham 33-35 genes diferencialmente metilados entre embriões de cinética rápida e lenta.


ARTIGO TÉCNICO


ARTIGO TÉCNICO

diferentes padrões de metilação do DNA e que essas diferenças podem influenciar diversas vias relacionadas à qualidade embrionária. Já se sabe que embriões produzidos in vitro, que apresentam qualidade inferior, apresentam maior quantidade de metilações ao longo do DNA do que embriões produzidos in vivo, que apresentam qualidade superior19.

Além disso, embriões produzidos in vitro apresentam maior quantidade DMRs (hipo e hipermetilações) em regiões gênicas, como promotores, exons e introns, elementos de repetição como LINE, SINE, LTR e repetições de baixa complexidade, quando comparado a embriões produzidos in vitro. Curiosamente, estes embriões produzidos in vitro apresentaram poucas diferenças de metilação em ilhas CpGs e regiões próximas a elas19. Essas informações sugerem que, enquanto o ambiente de cultivo afeta principalmente o padrão de metilação em regiões gênicas e elementos de repetição, ele exerce pouco efeito em regiões conhecidas (ilhas CpGs) por desempenharem papel regulador da expressão gênica20.No presente estudo, embriões de cinética rápida apresentaram maior quantidade de hipermetilações em todas as regiões gênicas estudadas, assim como elementos de repetição, enquanto os embriões lentos apresentam maior quantidade de hipermetilações em ilhas CpGs. Essas informações sugerem que embriões rápidos parecem sofrer maior efeito do ambiente de cultivo, visto que seu padrão de metilação assemelha-se menos aos padrões descritos na literatura para embriões produzidos in vivo.

Sabe-se que embriões de camundongos com alta cinética apresentam maiores perturbações no imprinting genômico do que aqueles com baixa cinética de desenvolvimento. Embriões que se desenvolvem lentamente apresentaram maiores semelhanças aos produzidos in vivo, exibindo quantidades semelhantes de células, volume embrionário e metilação de genes que devem ser silenciados7. Esses dados corroboram os resultados obtidos neste artigo, demonstrando a possível relação entre a cinética embrionária e a existência de padrões epigenéticos aberrantes. Além disso, uma revisão de literatura recente relacionou alguns trabalhos sobre cinética de desenvolvimento embrionário

em bovinos e camundongos, relatando que embriões de cinética lenta/moderada apresentam maior potencial para desenvolvimento do que embriões de cinética rápida21.

Diversas causas podem explicar as diferenças observadas em embriões de cinética rápida e lenta. Essas podem ser resultantes da incapacidade em promover a desmetilação durante as primeiras clivagens ou ativação precoce ou tardia das metiltransferases responsáveis pela metilação de novo. Além disso, mais estudos são necessários para entender como esses diferentes padrões de metilação, associados à outras vias epigenéticas, refletem-se no perfil de transcritos e viabilidade embrionária.

Referências Bibliográficas

1 HALL, V; Hinrichs, K; Lazzari, G; Betts, DH; Hyttel, P. 2013, Veterinary journal, 2: 128.2 SIQUEIRA, LGB; Fonseca. JF; Camargo, LSA; Viana, JHM. 2012, Spermova, 2(1): 10 – 12.3 KANE, MT. 2003, Animal Reproduction Science, 79(3–4): 171–190.4 APARICIO, B; Cruz, M; Meseguer, M. 2013, Reproductive BioMedicine Online, 27(6): 654–663.5 FENWICK, J. Platteau, P; Murdoch, AP; Herbert, M. 2002, Human Reproduction, 17: 407-12.6 SALUMETS, A, Hydén-Granskog, C; Mäkinen, S; Suikkari, AM; Tiitinen, A; Tuuri T. 2003, Human Reproduction, 18: 821–5. 7 MARKET VELKER, BA; Denomme, MM; Mann, MRW. 2012, Biology of Reproduction, 86: 143, 1 16.8 BAUMANN, CG; Morris, DG; Sreenan, JM; Leese, HJ. 2007, Molecular Reproduction and Development, 74: 1345-53.9 MILAZZOTTO, MP; Goissis, MD; Chitwood, JL; Annes, K; Soares, CA; Ispada, J; Assumpção, MEOA; Ross, PJ. 2016, Molecular Reproduction and Development, 83(4): 324-336.10 SILVA, T; Dos-Santos, EC; Annes, K; Soares, CA; Leite, RF; Lima, CB; Milazzotto, MP. 2016, Theriogenology, 86(5): 1308–17.11 LEESE, HJ. 2001, BioEssays, 24: 845-9.12 DOS-SANTOS, EC; Martinho, H; Annes, K; da Silva, T; Soares, CA; Leite, RF; Milazzotto, MP. 2016, Journal of Biomedical Optics, 21(7): 75002.13 URREGO, R; Rodriguez-Osorio, N; Niemann, H. 2014, Epigenetics, 9: 803-815.14 LEIBFRIED, L; First, NL.1979, Journal of Animal Science, 48: 76-86.15 PARRISH, JJ; Susko-Parrish, J; Winer, MA; First, NL. 1988, Biology of reproduction, 38: 1171-80.16 SHOJAEI SAADI, HA; O’Doherty, AM; Gagné, D; Fournier, E; Grant, RJ; Sirard, MA; Robert, C. 2014, BMC Genomics, 15: 451.17 LANE, N; Dean, W; Erhardt, S; Hajkova, P; Surani, A; Walter, J; Reik, W. 2003, Genesis, 35: 88-93.18 BESTOR, TH. 2000, Human Molecular Genetic, 9: 239519 SALILEW-WONDIM, D; Fournier, E; Hoelker, M; Saeed-Zidane, M; Tholen, E; Looft, C; Neuhoff, C; Besenfelder, U; Havlicek, V; Rings, F; Gagné, D; Sirard, MA; Robert, C; Shojaei Saadi, HA; Gad, A; Schellander, K; Tesfaye, D. 2015, PLoS One, 10(11): e0140467 20 DEATON, AM; Bird, A. 2011, Genes & Development 25:1010–1022.21 GUTIERREZ-ADAN, A; White, CR; Soom, AV; Mann, MRW. 2015, Reproduction, Fertility and Development, 27: 765–775.


ARTIGO TÉCNICOXXXI Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões

17 a 20 de agosto de 2017

“Localizado a 40 quilômetros de Recife fica o paraíso natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza cultural e belezas naturais de tirar o fôlego. “

Praia de Itapuamã

“Localizado a 40 quilômetros de Recife fica o paraíso “Localizado a 40 quilômetros de Recife fica o paraíso “Localizado a 40 quilômetros de Recife fica o paraíso “Localizado a 40 quilômetros de Recife fica o paraíso natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza

Porto de Galinhas

Cabo do Santo Agostinho

“Localizado a 40 quilômetros de Recife fica o paraíso “Localizado a 40 quilômetros de Recife fica o paraíso natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza natural Cabo de Santo Agostinho, com imensa riqueza cultural e belezas naturais de tirar o fôlego. “cultural e belezas naturais de tirar o fôlego. “cultural e belezas naturais de tirar o fôlego. “

Recife

“Com nove praias de águas claras, recifes, manguezais e piscinas naturais, Cabo de Santo Agostinho encanta a todos pela natureza privilegiada.”

“Com facil acesso a Porto de Galinhas você não pode deixar de se encantar com a exuberancia da cidade e suas praias de águas quentes e tranquilas.”

Brasileira de Tecnologia de Embriões

17 a 20 de agosto de 2017


PREMIAÇÃO 2016

26 - Jornal O Embrião26 - Jornal O Embrião

DESTAQUE DO ANO NA ÁREA CIENTÍFICAPRÊMIO ASSIS ROBERTO DE BEM

Guilherme de Paula Nogueira

DESTAQUE DO ANO NA ÁREA APLICADAPRÊMIO ROBERTO JORGE CHEBEL

Edmundo Rocha Vilela

MELHOR TRABALHO ÁREA APLICADA Jéssica Ispada

A cinética das primeiras clivagens in�uencia o padrão de metilação de DNA de embriões bovinos

Jéssica Ispada; Kelly Annes; Camila Bruna De Lima; Roberta Ferreira Leite; Marc-André Sirard; Marcella Pecora Milazzotto

MELHOR RELATO TÉCNICO (PROFISSIONAL DE CAMPO)Marcos Henrique Colombo Pereira

Taxa de concepção, perdas de gestação e proporção de fêmeas nascidas em rebanhos leiteiros, que utilizam inseminação arti�cial ou transferência de embriões in vitro como técnica reprodutiva para vacas em lactação.

Marcos Henrique Colombo Pereira; Maúricio Silveira Coelho

COMPETIÇÃO DE ESTUDANTES – ÁREA BÁSICA1º LUGARThiago Simões Machado

Mitofusina 1 é essencial para a fertilidade oocitária, enquanto que a mitofusina 2 é necessária para a eliminação de DNA mitocondrial mutante em oócitos de camundongos.

Thiago Simões Machado; Carolina Habermann Macabelli; Karen Freire Carvalho; Bruna Martins Garcia; Fernanda Karina da Silva Ribeiro; Mariana Trevisan; Fabiana de Dio Sarapião; Marcelo Marcondes Seneda; Francisco Eduardo Gontijo Guimarães; Marcos Roberto Chiaratti

2º LUGARMariana Sponchiado

O embrião bovino modula a função do endométrio 7 dias após o estro in vivo

Mariana Sponchiado; Nathália Souza Gome1; Patrícia Kubo Fontes; Maressa Izabel Santos Da Silva; Thiago Martins; Guilherme Pugliesi; Maite Del Collado; Athos De Assumpção Pastore; Marcelo Fabio Gouveia Nogueira; Mario Binelli

3º LUGARAlinne Gloria Curcio

A regulação da proteína Quinase B (akt) in�uência na maturação in vitro de ovócitos bovinos

Alinne Gloria Curcio; Tainara Iorrani Silva Ribeiro; Roger Cardozo Maia; Carla Sobrinho Paes De Carvalho; Célia Raquel Quirino; Bruna Lomba Dias; Angelo José Burla Dias

COMPETIÇÃO DE ESTUDANTES – ÁREA APLICADA

1º LUGARRogério Fonseca Guimarães Peres

Efeito da suplementação à base de milho por 41 dias durante o início do protocolo de IATF no per�l metabólico e desempenho reprodutivo de fêmeas Nelore.

Rogerio Fonseca Guimaraes Peres; Rafael Carvalho; Hugo Borges Graff; Jose Humberto Furlan Junior; Adnan Darin Pereira Rodrigues; Gessica Araujo Franco; Duane Keisler; Michael F Smith; Ky Pohler; Jose Luiz Moraes Vasconcelos

2º LUGARLuis Henrique de Aguiar

Avaliação da qualidade de oócitos caprinos e seus efeitos sobre a e�ciência da clonagem após maturação in vivo ou in vitro.

Luis Henrique De Aguiar; Carlos Enrique Mendez Calderón; Saul Gaudencio Neto; Rafael Rossetto; Leonardo Tondello Martins; Kaio César Simiano Tavares; Felipe Ledur Ongaratto; Cicera Regina Lazzarotto; Luciana Relly Bertolini; Marcelo Bertolini

3º LUGARRodolfo Daniel Mingoti

Taxa de Prenhez à IATF de vacas nelore (bos indicus) submetidas ao protocolo de 3 ou 4 manejos com Cidr® ou Sincrogest® novos e reutilizados

Rodolfo Daniel Mingoti; Bruno Gonzalez De Freitas; Roney Santos Ramos; Michele Richeri Bastos; Alessandra Ambrósio Teixeira; Marcus Luciano Guimarães Rezende; Marcio Wasilewski De Castro; Anderson Faquim; Manoel Francisco Sá Filho; Pietro Sampaio Baruselli

MELHOR TRABALHO ÁREA BÁSICAPedro Henrique Nicolau Pinto

Ultrassonogra�a modo doppler colorido como substituta à laparoscopia na contagem de cl em ovelhas superovuladas.

Pedro Henrique Nicolau Pinto; Gláucia Mota Bragança; Ceci Ribeiro Leite; Gustavo Bervian Santos; Rômulo Mendonça Da Rosa; Vivian Angélico Pereira Alfradique; Loara Helena Santana Gonçalves; Mário Felipe Alvarez Balaro; Jeferson Ferreira Da Fonseca; Felipe Zandonadi Brandão.

PREMIAÇÃO 2016


PREMIAÇÃO 2016

DESTAQUE DO ANO NA ÁREA CIENTÍFICAPRÊMIO ASSIS ROBERTO DE BEM

Guilherme de Paula Nogueira

DESTAQUE DO ANO NA ÁREA APLICADAPRÊMIO ROBERTO JORGE CHEBEL

Edmundo Rocha Vilela

MELHOR TRABALHO ÁREA APLICADA Jéssica Ispada

A cinética das primeiras clivagens in�uencia o padrão de metilação de DNA de embriões bovinos

Jéssica Ispada; Kelly Annes; Camila Bruna De Lima; Roberta Ferreira Leite; Marc-André Sirard; Marcella Pecora Milazzotto

MELHOR RELATO TÉCNICO (PROFISSIONAL DE CAMPO)Marcos Henrique Colombo Pereira

Taxa de concepção, perdas de gestação e proporção de fêmeas nascidas em rebanhos leiteiros, que utilizam inseminação arti�cial ou transferência de embriões in vitro como técnica reprodutiva para vacas em lactação.

Marcos Henrique Colombo Pereira; Maúricio Silveira Coelho

COMPETIÇÃO DE ESTUDANTES – ÁREA BÁSICA1º LUGARThiago Simões Machado

Mitofusina 1 é essencial para a fertilidade oocitária, enquanto que a mitofusina 2 é necessária para a eliminação de DNA mitocondrial mutante em oócitos de camundongos.

Thiago Simões Machado; Carolina Habermann Macabelli; Karen Freire Carvalho; Bruna Martins Garcia; Fernanda Karina da Silva Ribeiro; Mariana Trevisan; Fabiana de Dio Sarapião; Marcelo Marcondes Seneda; Francisco Eduardo Gontijo Guimarães; Marcos Roberto Chiaratti

2º LUGARMariana Sponchiado

O embrião bovino modula a função do endométrio 7 dias após o estro in vivo

Mariana Sponchiado; Nathália Souza Gome1; Patrícia Kubo Fontes; Maressa Izabel Santos Da Silva; Thiago Martins; Guilherme Pugliesi; Maite Del Collado; Athos De Assumpção Pastore; Marcelo Fabio Gouveia Nogueira; Mario Binelli

3º LUGARAlinne Gloria Curcio

A regulação da proteína Quinase B (akt) in�uência na maturação in vitro de ovócitos bovinos

Alinne Gloria Curcio; Tainara Iorrani Silva Ribeiro; Roger Cardozo Maia; Carla Sobrinho Paes De Carvalho; Célia Raquel Quirino; Bruna Lomba Dias; Angelo José Burla Dias

COMPETIÇÃO DE ESTUDANTES – ÁREA APLICADA

1º LUGARRogério Fonseca Guimarães Peres

Efeito da suplementação à base de milho por 41 dias durante o início do protocolo de IATF no per�l metabólico e desempenho reprodutivo de fêmeas Nelore.

Rogerio Fonseca Guimaraes Peres; Rafael Carvalho; Hugo Borges Graff; Jose Humberto Furlan Junior; Adnan Darin Pereira Rodrigues; Gessica Araujo Franco; Duane Keisler; Michael F Smith; Ky Pohler; Jose Luiz Moraes Vasconcelos

2º LUGARLuis Henrique de Aguiar

Avaliação da qualidade de oócitos caprinos e seus efeitos sobre a e�ciência da clonagem após maturação in vivo ou in vitro.

Luis Henrique De Aguiar; Carlos Enrique Mendez Calderón; Saul Gaudencio Neto; Rafael Rossetto; Leonardo Tondello Martins; Kaio César Simiano Tavares; Felipe Ledur Ongaratto; Cicera Regina Lazzarotto; Luciana Relly Bertolini; Marcelo Bertolini

3º LUGARRodolfo Daniel Mingoti

Taxa de Prenhez à IATF de vacas nelore (bos indicus) submetidas ao protocolo de 3 ou 4 manejos com Cidr® ou Sincrogest® novos e reutilizados

Rodolfo Daniel Mingoti; Bruno Gonzalez De Freitas; Roney Santos Ramos; Michele Richeri Bastos; Alessandra Ambrósio Teixeira; Marcus Luciano Guimarães Rezende; Marcio Wasilewski De Castro; Anderson Faquim; Manoel Francisco Sá Filho; Pietro Sampaio Baruselli

MELHOR TRABALHO ÁREA BÁSICAPedro Henrique Nicolau Pinto

Ultrassonogra�a modo doppler colorido como substituta à laparoscopia na contagem de cl em ovelhas superovuladas.

Pedro Henrique Nicolau Pinto; Gláucia Mota Bragança; Ceci Ribeiro Leite; Gustavo Bervian Santos; Rômulo Mendonça Da Rosa; Vivian Angélico Pereira Alfradique; Loara Helena Santana Gonçalves; Mário Felipe Alvarez Balaro; Jeferson Ferreira Da Fonseca; Felipe Zandonadi Brandão.

PREMIAÇÃO 2016



RADAR SBTE

43ª REUNIÃO ANUAL DA IETS ACONTECERÁ EM AUSTIN, TEXAS/EUA

Acontecerá entre os dias 14 a 17 de janeiro de 2017 a

Reunião Anual da International Embryo Technology (IETS) no

Renaissance Austin Hotel, Texas. O evento terá como tema

central: “Das moléculas aos animais: pequenas coisas fazem

grandes coisas acontecerem”.

O embrião da Sociedade Internacional de Tecnologia foi

formado em 1974, em Denver, Colorado, EUA, para servir

como um fórum profissional para a troca de informações

entre os profissionais, cientistas, educadores, funcionários

de órgãos reguladores, criadores de gado, fornecedores de

medicamentos e equipamentos e estudantes.

O objetivo do IETS é promover a ciência de transferência de

embriões animais através do estímulo à pesquisa mais eficaz,

divulgação a informação científica e educacional, mantendo

elevados padrões de educação e ética cooperando com

outras organizações que têm objetivos semelhantes.

Mais informações: http://www.iets.org/2017/.

CIENTISTAS JAPONESES TRANSFORMAM CÉLULAS DA PELE DE RATO EM CÉLULAS GERMINATIVAS E PRODUZEM FILHOTES FÉRTEIS

in vitro (FIV), nasceram 26 filhotes saudáveis, sendo alguns a partir de células da pele reprogramadas, segundo o autor alguns desses animais já deram à luz a uma segunda geração de camundongos.

Fonte: http://www.nature.com/news/mouse-eggs-made-from-skin-cells-in-a-dish-1.20817

Recentemente foi relatada a primeira criação de ovócitos

inteiramente fora do organismo de roedores, com a

possibilidade de ser feito em outras espécies. Katsuhiko

Hayashi, biólogo reprodutivo da Universidade Kyushu,

Fukuoka, liderou o grupo que anunciou a descoberta em 17 de

outubro, na revista Nature. Com a utilização de fertilização


RADAR SBTE

BRASIL JÁ PODE EXPORTAR SÊMEN BOVINO PARA ISRAEL

O governo de Israel aceitou a proposta de certificado veterinário que estava em negociação com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Com a decisão, o Brasil poderá exportar sêmen bovino congelado para Israel. O comunicado do governo israelense foi enviado pelo Serviço de Quarentena do Ministério da Agricultura e Desenvolvimento Rural de Israel ao Departamento de Saúde Animal (DSA) do MAPA. A abertura do mercado israelense para o sêmen bovino congelado do Brasil é resultado da atuação do MAPA, em parceria com o setor produtivo, especialmente com a Confederação da Agricultura e Pecuária do Brasil (CNA) e com a Associação Brasileira de Criadores de Zebu (ABCZ). Em 2015, o Brasil exportou sêmen bovino para Argentina, Bolívia, Colômbia, Congo, Costa Rica, Equador, Quênia, Panamá, Paraguai, Peru, Emirados Árabes, Uruguai e Tanzânia. As vendas totalizaram cerca de US$ 1,4 milhão.

Fonte: http://www.agricultura.gov.br/comunicacao/noticias/2016/10/brasil-ja-pode-exportar-semen-bovino-para-israel

CONSORCIO BILATERAL ENTRE BRASIL E DINAMARCA PROMOVE SIMPÓSIO INTERNACIONAL EM SELEÇÃO GENÔMICA E PRODUÇÃO DE EMBRIOES IN VITRO

No dia 6 de Setembro de 2016, pesquisadores, estudantes,

representantes de negócios, líderes universitários e

representantes governamentais se reuniram na Universidade de

Copenhagen para realização do “Symposium on Modern Cattle

Breeding: Genomic Selection and Screening of In vitro Produced

Embryos”. O simpósio apresentou os resultados do acordo bi-

lateral Brasil-Dinamarca (Genomic Improvement of Fertilization

Traits in Cattle). O encontro faz parte do projeto GIFT é uma

grande iniciativa colaborativa entre agências de fomento

dinamarquesas e brasileiras, liderado pelo Professor Haja

Kadarmideen (Dinamarca) e Dr. Marcelo Fábio Gouveia Nogueira

(UNESP-Assis, Brasil).

Fonte e maiores informações: http://gift.ku.dk/

ACORDO BILATER AL ENTR E BR ASIL E URUGUAI BENEFICIA EMBRIÕES PRODUZIDOS IN VITRO

Em outubro deste ano, Brasil e Uruguai fecharam acordo para o comércio bilateral de embriões bovinos produzidos in vitro. Em setembro, o Brasil assinou acordo com o mesmo objetivo com a Bolívia. Hoje, os embriões de bovinos brasileiros, produzidos in vitro, já são exportados para o Paraguai, Costa Rica, Botswana, Moçambique, República Dominicana e Etiópia, mercados estes iniciados em 2015. De acordo com o Departamento de Saúde Animal (DSA) do MAPA, a ampliação das exportações de embriões de bovinos produzidos in vitro foi debatida durante a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Transferência de Embriões (SBTE), em agosto de 2014. Naquela ocasião, representantes do MAPA, da SBTE e da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) se comprometeram a contribuir na discussão de acordos sanitários voltadas ao aumento do comércio internacional de embriões de bovinos produzidos in vitro.

Fonte: www.agricultura.gov.br


ARTIGO TÉCNICO

ULTRASSONOGRAFIA EM MODO DOPPLER COLORIDO COMO SUBSTITUTA À LAPAROSCOPIA NA CONTAGEM DE CLS EM OVELHAS SUPEROVULADAS

Pedro H. N. Pinto1;Gláucia M. Bragança1; Ceci R. Leite1; Joanna M. G. de Souza-Fabjan2; Gustavo B. Santos1; Rômulo M. Rosa1; Vivian A. P. Alfradique1; Loara H. S. Gonçalves1; Mário F. A. Balaro1; Jeferson F. Fonseca3; Felipe Z. Brandão1.

1Universidade Federal Fluminense, Niterói (RJ), Brasil. 2Universidade do Grande Rio, Duque de Caxias (RJ), Brasil. 3Embrapa Caprinos e Ovinos, Sobral (CE), Brasil.

Introdução

A tecnologia de múltipla ovulação e transferência de embrião (MOET) é uma ferramenta poderosa para o melhoramento genético de rebanhos (Bruno-Galarraga et al, 2014). Várias etapas precisam ser bem conduzidas para que se obtenha sucesso em um programa MOET, como por exemplo, seleção de doadoras, protocolo superovulatório, fertilização das doadoras, colheita e posterior inovulação dos embriões (Varago et al., 2009). No entanto, pode-se considerar a superovulação como etapa chave (Rubianes et al., 1995), pois, a partir do resultado da superovulação avalia-se a continuidade ou não do animal na próxima etapa do processo, a colheita de embriões.

Atualmente, a verificação da resposta superovulatória em ovelhas é feita por meio da técnica de laparoscopia. Essa técnica permite que se faça a contagem do número de corpos lúteos por meio da observação direta dos ovários (Oliveira, 2011). Trata-se de uma técnica semi-cirúrgica, necessariamente invasiva, que demanda tempo, jejum hídrico-alimentar, uso de medicação anestésica e contenção física criteriosa do animal. Por fim, mesmo que o animal não seja submetido à colheita de embriões, ele estará mais susceptível à formação de aderências (Brandão et al., 2010).A busca por técnicas mais eficientes, seguras, que demandem menos tempo e sejam menos estressantes para os animais é uma constante no desenvolvimento das biotecnologias da reprodução. Seguindo essa tendência, a eliminação de uma etapa cirúrgica na técnica MOET seria um relevante avanço para esta biotecnologia.

A ultrassonografia (US) em tempo real (modo B) tem facilitado o entendimento dos processos reprodutivos em animais desde a década de 80 (Pierson e Ginther, 1984; Pierson e Ginther, 1988). Contribuições igualmente importantes têm surgido também com o uso da ultrassonografia modo Doppler colorido, a partir do final da década de 90 (Ginther et al., 2014) e até os dias de hoje, expandindo seu uso para diferentes estudos de reprodução animal.

Assim, dadas as limitações que as etapas cirúrgicas impõem à MOET em ovinos, vislumbrando as potencialidades das técnicas de US, e na tentativa de tornar a MOET menos traumática para os animais, objetivou-se avaliar o uso da ultrassonografia modo Doppler colorido como substituta à laparoscopia na avaliação de ovelhas da raça Santa Inês superovuladas.

Material e Métodos

Local e condições experimentais

Este estudo foi realizado na Unidade de Pesquisa Experimental em Caprinos e Ovinos (UniPECO) localizada na Fazenda Escola da Universidade Federal Fluminense, no estado do Rio de Janeiro, e foi previamente aprovado pela Comissão de Ética no uso de animais (processo 699/15).

Animais, protocolo superovulatório e coberturas

Vinte e cinco ovelhas nulíparas da raça Santa Inês (11,9 ± 1,1 meses de idade; ECC: 2,8 ± 0,3) foram superovuladas,


ARTIGO TÉCNICO

utilizando-se o conceito do protocolo Dia 0, proposto por Menchaca, et al. (2009).

Para sincronização prévia da emergência folicular, manteve-se por seis dias um implante vaginal contendo 60mg de acetato de medroxiprogesterona (Progespon®, Zoetis, Campinas-SP, Brasil), 24 horas antes da remoção do implante aplicou-se 300 UI de eCG (Novormon®, Schering Plough, São Paulo, Brasil) e 0,24mg de cloprostenol sódico (Estron®, Tecnopec, São Paulo, Brasil). Trinta e seis horas após a remoção da esponja, os animais receberam 0,025mg de lecirelina (Gestran Plus®,

As coberturas foram realizadas por meio de monta natural

controlada, a cada 12 horas, iniciando-se após a última dose

de FSH e estendidas até a não aceitação de monta pela

fêmea. Foram utilizados quatro machos adultos da raça Santa

Inês, pré-aprovados em exame andrológico, e o número de

montas foi dividido igualmente entre os reprodutores.

Ultrassonografia e Laparoscopia

Doze horas antes da coleta de embriões, estimou-se o número

de corpos lúteos (CLDOPPLER) por meio da ultrassonografia

modo Doppler colorido e modo B concomitantemente

(Sonoscape S6®, SonoScape, Shenzhen, China), com

Figura 1: Desenho esquemático do protocolo de superovulação utilizado, com indicação dos momentos de avaliação ultrassonográfica e laparoscópica.

Tecnopec, São Paulo-SP, Brasil). A superovulação foi iniciada 80 horas após a retirada da esponja. Utilizou-se 200mg de FSH por animal (Folltropin-V®, Bioniche Animal Health, Ontario, Canadá) em seis doses decrescentes a cada 12 horas (50/50, 30/30, 20/20 mg). Na última dose de FSH, aplicou-se 0,24mg de cloprostenol (Estron®, Agener União, São Paulo-SP, Brasil) e, 24 horas após, 0,025mg de lecirelina (Gestran Plus®, Tecnopec, São Paulo-SP, Brasil). Em paralelo, na primeira dose de FSH uma nova esponja (Progespon®, Zoetis, Campinas-SP, Brasil) foi inserida e removida na penúltima dose deste hormônio (figura 1).

transdutor linear de 7,5MHz acoplado a um suporte plástico

rígido para o acesso transretal.

Para realização da laparoscopia os animais foram

submetidos a jejum alimentar de 36 horas e hídrico de 24

horas, sedados com acepromazina (0,1mg/kg) (Acepran®

1%, Vetnil, São Paulo – SP, Brasil) associada à diazepan

(0,4mg/Kg) (Diazepam, União química, São Paulo – SP,

Brasil), ambas aplicadas IV. Realizou-se ainda um bloqueio

local com Lidacaína 2% (1ml) (Lidovet®, Bravet, Rio de

Janeiro – RJ, Brasil) no local de inserção dos trocartes.

Após a laparoscopia, os animais mantidos baias coletivas,

com água e alimentação ad libitum, receberam uma dose de


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oxitetraciclina IM (20 mg/kg) (Tetradur® LA-300, Merial, São Paulo-SP, Brasil) e meloxican s.i.d IM (0,5 mg/kg) (Maxicam® 2%, Ourofino, São Paulo-SP, Brasil), por três dias.

Análise estatística

As variáveis CLDOPPLER e CLLAPARO foram comparadas entre si por meio do Índice de Correlação de Person, análise de regressão linear simples, e índice de correlação intraclasse (ICC). Para todos os testes, considerou-se 1% de significância. Os dados foram analisados por meio do

software SAEG® (Sistema para análise estatística - SAEG®, versão 9.1, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa - MG, Brasil).

Resultados

Obteve-se uma alta correlação entre o número de Cls contados por ultrassonografia (CLDOPPLER) e o número de Cls contados por laparoscopia (CLLAPARO) (r=0,92; r2=0,86; p<0,01), conforme figura 2, e um excelente índice de correlação intraclasse, 0,93 (p<0,01).

Figura 2 :Correlação entre o número de CLs contados via laparoscopia e CLs contados por ultrassonografia modo Color Doppler.

Os dados referentes ao número de CLs contados pelas duas

técnicas (laparoscopia ou ultrassonografia modo Doppler

colorido) estão descritos na tabela 2.

Discussão

Conforme pode ser observado na figura 2, foi encontrado

uma alta correlação (r=0,92; r2=0,86) entre as duas técnicas

realizadas, atestada também pelo elevado ICC (0,93). A

ultrassonografia ovariana em pequenos ruminantes já vem

sendo realizadas de longa data, inclusive para avaliação de

corpo lúteo. Arashiro et al., (2009) concluíram que a avaliação

ultrassonográfica em modo B do corpo lúteo em cabras não

só é possível como de fácil caracterização quando realizada

cinco dias após o início do estro. No presente estudo, de

forma similar, porém com intervalo de tempo maior (sete dias

após o estro), foi possível avaliar e quantificar o número de

corpos lúteos em ovelhas.


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ultrassonografia é utilizada massivamente na pesquisa em

reprodução animal e também para tomada de decisão em

rebanhos comerciais (Perry e Cushman, 2016). Acredita-

se que os resultados aqui divulgados apontam para mais

uma aplicabilidade de uma já conhecida e importante

ferramenta. Vale ressaltar ainda, que esta nova indicação

de aplicabilidade da ultrassonografia, permite eliminar um

procedimento cirúrgico de uma importante biotécnica. Isso

leva a uma diminuição de custos, tempo e complexidade na

avaliação de ovelhas superovuladas. Adicionalmente, pode

diminuir o estresse e o grau de injúria ao quais os animais

são submetidos.

Uma importante vantagem em se associar a ultrassonografia

modo Doppler colorido e modo B na avaliação de corpos lúteos

é a possibilidade de se determinar a funcionalidade luteal

pela vascularização. Essa característica é especialmente

importante em ovelhas superovuladas, já que nestes animais

a taxa de regressão prematura do corpo lúteo pode chegar a

75% (Fukui et al., 1998).

Até a década de 1970 para o estudo de alguns eventos

reprodutivos como ovulação, por exemplo, era necessário

submeter os animais a procedimentos cirúrgicos em

mais de um momento (Dufouret al., 1972). Atualmente, a

Tabela 1: Média, desvio padrão (DP) de CLs contados via laparoscopia, CLs contados por ultrassonografia modo Doppler colorido e índice de correlação intraclasse (ICC)

Figura 3: A- Corpo lúteo observado por laparoscópio; B – Imagem ultrassonográfica de ovário superovulado em modo Doppler colorido

A B


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Conclusão

A alta eficiência da ultrassonografia modo Doppler colorido para a estimação do número de CLs em ovelhas superovuladas configura-se como um avanço importante, pois elimina a necessidade de uma intervenção laparoscópica invasiva, jejum, uso de fármacos e manipulação desnecessária de animais não responsivos. Isso sugere que a ultrassonografia modo Doppler colorido pode substituir a laparoscopia para a avaliação de resposta superovulatória em ovinos.

Agradecimentos

Apoio financeiro: Capes, CNPq, Faperj e Embrapa (Projeto 02.13.06.026.00.00)

Referências

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DICA LIVRO

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