CONTRIBUIÇÃO PARA A CARACTERIZAÇÃO “IN VIVO” DE

RECEPTORES SEROTONINÉRGICOS E NEUROPEPTIDÉRGICOS

E DO SISTEMA DO ÓXIDO NÍTRICO EM VASOS PERIPAPILARES

RETINIANOS DO COELHO: IMPORTÂNCIA NAS ALTERAÇÕES

VASCULARES DA DOENÇA ISQUÉMICA

3

Dissertação de Doutoramento apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de Coimbra

4

A Faculdade de Medicina de Coimbra não aceita qualquer responsabilidade em

relação à doutrina e à forma desta dissertação

(Reg. da Fac. de Med. de Coimbra, 1931. Art.108º § único)

5

“Mas deixarei o pouco que aprendi ser divulgado para que alguém possa

melhor do que eu adivinhar a verdade, e com o seu trabalho provar e rebater o

meu erro. Então sentirei a satisfação de saber que foi através de mim que essa

verdade chegou à luz do dia”

Albrecht Dürer citado por K. Popper

6

Trabalho efectuado em Coimbra, durante a vigência de uma Bolsa de

Doutoramento concedida pela Junta Nacional de Investigação Científica

(JNICT), nos seguintes locais:

- Instituto de Farmacologia e Terapêutica Experimental da Faculdade de

Medicina da Universidade de Coimbra, Coimbra (Directora: Profª Doutora Tice

Macedo).

- Centro de Oftalmologia do Instituto Biomédico de Investigação da Luz e

Imagem (IBILI), Coimbra (Director: Prof. Doutor José Cunha-Vaz).

Apoio científico de treino e supervisão nos Estados Unidos da América

no:

- Departamento de Oftalmologia (Physiology and Pharmacology Research

Unit) do The Mount Sinai Medical Center, Nova Iorque (Director: Prof. Doutor

Oscar Candia).

- Departamento de Vítreo-Retina do Wilmer Eye Institute (Johns Hopkins

School of Medicine) – Baltimore (Director: Prof. Doutor Morton Goldberg).

7

Aos meus Pais, aos meus Tios Manuel Gaspar M. da Rosa e Jesuína Ascensão

Nunes Rosa e aos meus filhos Alexandra Sofia e Francisco Maria. Foi por eles e

com eles que realizei este trabalho.

8

A todos os meus Mestres, com profunda gratidão. Sem eles nada seria possível.

9

PREFÁCIO

Sendo tradicional apresentar na dissertação de doutoramento um

preâmbulo que engloba as motivações do estudo concretizado, as determinantes

da sua forma e o reconhecimento a todos quantos contribuíram para a sua

execução, não nos escusaremos naturalmente a esta tarefa.

Desde cedo nos entusiasmou a análise interpretativa dos fenómenos

biológicos e a sua integração no campo da fisiologia, circunstâncias essenciais

para uma melhor percepção da patologia e necessariamente para uma profícua

utilização da técnica terapêutica.

O facto de termos ingressado numa especialidade médico-cirúrgica

(Oftalmologia) dum Serviço (Hospitais da Universidade de Coimbra) com larga

tradição no estudo dos vasos retinianos em condições normais e patológicas, e

pela sua complexidade fisiológica aliada às dificuldades de tratamento das

patologias vasospásticas, que apresentam na sua maioria, um envolvimento

também neuronial de significativa importância e ainda sem solução terapêutica

de eficácia comprovada, acicatou o desejo de conhecer mais profundamente a

natureza da complexa fenomenologia vascular retiniana. Situam-se, a este nível,

patologias como as oclusões da artéria e veia centrais da retina, a neuropatia

óptica glaucomatosa (onde se enquadra o glaucoma normotenso, referenciado

por alguns autores como coincidente com outro tipo de patologia vasospástica

como a enxaqueca), a neuropatia óptica da pré-retinopatia diabética e outras

vasculopatias retinianas.

Quando, em 1993, procurámos desenvolver os estudos de caracterização

farmacológica dos vasos da retina na sequência do desenvolvimento da

metodologia e técnica necessárias a este estudo, concretizadas com uma tese de

10

Mestrado em Oftalmologia entitulada “Estudos da permeabilidade dos vasos

retinianos in vivo por técnicas de micropunção - desenvolvimento da

metodologia e técnica”, considerámos então a área bastante atractiva e

merecedora de um estudo interessante, mais alargado, que possibilitasse um

melhor conhecimento e a caracterização destes vasos sob o ponto de vista

farmacológico e de eventuais perspectivas terapêuticas oftalmológicas. O

presente trabalho representa ainda o prolongamento de ensaios experimentais

anteriores integrados no mesmo domínio, nomeadamente nos que eclodiram na

citada tese de Mestrado. Os meus Mestres, Professores Doutores Tice Macedo e

José Cunha-Vaz, incentivaram o desenvolvimento do plano de actividades que a

concessão de uma Bolsa de Doutoramento, possibilitou. A execução do trabalho

experimental decorreu em Portugal com deslocações frequentes a diversos

países europeus e em particular aos Estados Unidos da América para

apresentação e discussão dos resultados parciais, onde trabalhámos com grupos

de investigação da mesma área.

Assim, para o desenvolvimento da técnica cirúrgica necessária ao trabalho

experimental, foi de capital importância o contacto directo com a equipa de

investigação da secção de retina cirúrgica superiormente dirigida pelos

Professores Doutores Eugene De Juan Jr. e Peter Campochiaro, no Wilmer Eye

Institute da Johns Hopkins School of Medicine, em Baltimore (Estados Unidos

da América).

Também a prestimosa colaboração do Professor Doutor Oscar Candia-

Mount Sinai School of Medicine e Mount Sinai Hospital, Nova Iorque- também

nos Estados Unidos da América, nas vertentes de fisiologia, farmacologia e

terapêutica oftalmológicas, foi-nos particularmente gratificante, dada a sua

longínqua experiência no campo, de reconhecimento internacional.

A motivação inerente à execução de tão árduo e vasto trabalho decorrido

durante uma década (com interrupções pontuais decorrentes do trabalho

11

profissional em geral e especificamente na área do glaucoma), foi além do

entusiasmo e do fascínio que este campo das ciências fisiológicas sempre nos

despertou, o desejo de contribuir, ainda que de forma modesta, para o desvendar

de algumas interrogações que a Natureza ainda nos reserva no dealbar do

terceiro milénio.

Na prática, a investigação não constitui motivo de revolução no âmbito da

farmacoterapia. Contudo, as conclusões procedentes da análise crítica dos

resultados obtidos, permitirão, admitimos, ilustrar certos dados essenciais à

melhor compreensão dos sistemas de regulação vascular retiniana e fornecem

elementos para estudos complementares de índole fisiológica, de natureza

farmacológica e com repercussão terapêutica.

Apesar dos apoios citados que possibilitaram o trabalho exequível, quer

de ordem humana quer material, não foi sem dificuldades que o desenvolvemos

e concluímos, já que as dúvidas, por vezes, sobrelevaram as certezas, os

materiais, de elevado custo, nem sempre estiveram à nossa inteira disposição e a

ocupação clínica e o dever familiar retiraram-nos algum desse precioso tempo.

No entanto, não poderíamos terminar este preâmbulo sem uma palavra de

reconhecimento a quantos contribuíram, directa ou indirectamente, para que esta

pequena obra se concretizasse. Em particular:

À Senhora Professora Doutora Tice Macedo, que desde sempre orientou a

nossa formação em Farmacologia com o saber de Mestre insigne e com

reconhecida competência na área, e a quem devemos, como homem, o exemplo

de um labor sério e contínuo e a Amizade que sempre nos honrou e que

desejamos merecer;

Ao Senhor Professor Doutor José Cunha-Vaz que nos orientou para esta

área das ciências da visão e nos concedeu todas as facilidades para maior

12

aproveitamento do trabalho, prestando apoio incondicional desde o princípio,

com o seu conhecimento científico e Amizade;

Ao Senhor Professor Doutor Fontes Ribeiro, e de forma especial, por

todos os ensinamentos que nos ministrou, pelo seu incentivo e paciência

constantes desde a primeira hora, apesar dos nossos atarefados trabalhos na área

clínica oftalmológica, pela sua inteira disponibilidade e ajuda preciosa na

elaboração dos artigos científicos, a quem ficamos devedores de elevado apoio

científico e também grande testemunho de Amizade;

Ao Senhor Professor Doutor Oscar Candia que nos concedeu todas as

facilidades para maior aproveitamento do trabalho aquando das nossas

deslocações ao seu Serviço nos Estados Unidos da América, pelas revisões dos

trabalhos publicados, e a quem ficamos a dever provas inestimáveis de calor

humano, acolhimento generoso e rigor científico;

Ao Senhor Professor Doutor Eugen De Juan Jr, nosso Mestre em cirurgia

intraocular e grande humanista, pelos conhecimentos que nos transmitiu na

metodologia aplicada a nível intraocular para o desenvolvimento deste trabalho;

À Junta Nacional de Investigação Científica (JNICT) agradeçemos a Bolsa de

Doutoramento que nos concedeu graças à qual foi possível este trabalho.

13

CAPÍTULO I

I N T R O D U Ç Ã O

14

CAPÍTULO I

I N T R O D U Ç Ã O

O fluxo sanguíneo na microcirculação oftálmica que se processa

através da artéria oftálmica para as artérias ciliares anteriores e

posteriores (curtas e longas), alimenta a circulação coroideia e uveal. A

artéria central da retina e as cílio-retinianas asseguram a circulação

retiniana. Neste leito vascular é essencial um controlo regulador do

fluxo sanguíneo para a circulação normal da retina. A circulação

coroideia exerce um papel importante no suporte metabólico da retina,

em condições normais e patológicas, em particular no descolamento

exudativo da retina e nas situações de isquémia como a degenerescência

macular relacionada com a idade, o glaucoma e a retinopatia diabética

(Albert et al., 1993; Jarajapu et al., 2004). É, porém, conhecida a

dificuldade de acesso experimental da coróide e a sua interferência na

circulação retiniana, que não têm permitido um melhor conhecimento

dessa interrelação entre a coróide e a retina.

Não existindo inervação nos vasos retinianos e no sistema

vascular que alimenta a cabeça do nervo óptico, a circulação da retina é

maioritariamente controlada por mecanismos auto-reguladores,

desempenhando as células endoteliais um papel importante na regulação

do tónus vascular, pela secreção de factores contracturantes e relaxantes

(Hardy et al., 2001; Okuno et al., 2002). Outros factores

locais libertados por células vizinhas adjacentes (Yu et al., 2003), tais

como o óxido nítrico (NO) (Donati et al., 1997), prostaglandinas

(Pournaras et al., 1997), endotelina-1 (Polak et al., 2003), histamina

15

(Prieto et al., 1991), adenosina (Blazynski e Perez, 1998), lactato (Wang

et al., 2001), neuropéptidos (Ye et al., 1998) e o factor relaxante

endotelial da retina, estariam de igual modo envolvidos.

Persiste alguma controvérsia sobre os mecanismos de controlo da

circulação coroideia porque o fluxo sanguíneo nestes vasos sofre a

influência da inervação autónoma perivascular, que depende: do sistema

simpático com origem no gânglio cervical superior; do sistema

parassimpático com origem no gânglio ciliar; e ainda, do sistema

sensorial proveniente do gânglio trigémio (Silva-Carvalho et al., 2008).

A estimulação do nervo parassimpático induz vasodilatação mediada

pelo óxido nítrico, que parece ser selectiva para os vasos da coróide

anterior, e a estimulação dos nervos simpáticos desencadeia

vasoconstrição nos vasos coroideos, por mecanismos noradrenérgicos.

Os nervos do sistema nervoso autónomo exercem, porém, efeito

regulador de curta duração no fluxo sanguíneo coroideo, por alteração

do tónus do músculo liso vascular, tornando-se necessário o

conhecimento dos outros mecanismos auto-reguladores locais de

controlo da circulação sanguínea ocular.

A microcirculação retiniana é a primeira a ser afectada em

doenças vasculares. O estudo da reactividade dos vasos da retina, quer

no estado normal quer no diabético ou no glaucomatoso, reveste-se,

assim, da maior importância para a compreensão da fisiologia da retina e

das alterações precoces que ocorrem na Barreira Hemato-Retiniana

nas fases iniciais da neuropatia óptica diabética e glaucomatosa e no

desenvolvimento de medidas terapêuticas apropriadas.

16

A importância dos estudos que têm vindo a ser desenvolvidos

sobre as alterações isquémicas da Diabetes resulta desta afecção

representar a principal causa de cegueira mundial (150 milhões de

pessoas), através da Retinopatia Diabética (RD). Em Portugal, um

estudo populacional realizado no Cartaxo (1991) indica que 28,5% de

casos de cegueira ocorreram em indivíduos com retinopatia não-

proliferativa na Diabetes Tipo I e em 10,7% dos portadores de

retinopatia proliferativa. Nos Estados Unidos, por exemplo, 12% da

população de cegos perdeu completamente a visão devido à Diabetes

Mellitus. A nível mundial estima-se que esta doença é ainda responsável

por cerca de 20% de todos os novos casos de cegueira que ocorrem entre

os 45 e os 74 anos de idade (Klein, 1974) e que 91% dos diabéticos com

doença de evolução superior a 21 anos, apresentam retinopatia diabética

(Jerneld, 1980). A prevalência da doença em Portugal é de cerca de 5-

7%. Calcula-se em cerca de 200.000 o número de doentes portugueses

em risco de desenvolver complicações oculares potencialmente graves,

de entre os cerca de 500.000 diabéticos existentes no país.

Todas as medidas terapêuticas de que dispomos actualmente são

dirigidas às fases tardias da doença e impedem apenas a sua progressão.

Existe, portanto, necessidade urgente de entender a fisiopatologia da RD

logo nas fases iniciais de pré-retinopatia, de modo a poder modificar o

seu prognóstico com medidas preventivas e novas terapêuticas (Cunha-

Vaz, 2005). Sendo assim, o conhecimento dos mecanismos envolvidos

nas alterações da permeabilidade da Barreira Hemato Retiniana (BHR)

na fase de pré-retinopatia, através da análise morfofuncional dos vasos

retinianos, quando sujeitos a variações quantitativas e qualitativas de

17

substâncias endógenas e de síntese, permitirá, num futuro próximo,

sugerir possíveis aproximações terapêuticas.

O actual estado de conhecimentos sobre as lesões anatómicas e

funcionais que existem a nível vascular retiniano, em modelos de

diabetes experimental de mamíferos é já considerável. Para a sua

indução utilizam-se normalmente dois tipos de substâncias: a

estreptozotocina e a aloxana (Christiansson et al., 1958). A ruptura da

BHR (transporte através de vesículas pinocíticas e interendotelial via

tight junctions) em coelhos com diabetes induzida pela aloxana, foi

avaliada pela perda de substância de contraste vascular por análise de

imagem. Trata-se de um modelo reprodutível, principalmente quando

usado na fase de pré-retinopatia diabética (Herse, 1994).

Alterações a nível endotelial, pericítico e muscular liso foram já

amplamente demonstradas por vários autores nas últimas quatro décadas

(Flage, 1977; Riva, 1981; Kaiser, 1997; Orgul, 2007). Existe, de facto,

uma degenerescência selectiva dos pericitos retinianos, típica da RD,

bem como o espessamento da membrana basal em múltiplos tecidos

humanos e animais, neste modelo de diabetes experimental (Osborne,

1990). Foi ainda comprovado que o estado permanente de hiperglicémia

durante 2-3 meses após indução de diabetes com aloxana (100 mg/Kg)

em dose única durante 3 meses, provoca modificação selectiva da

expressão de receptores para as endotelinas, por exemplo, em pericitos

retinianos de bovinos, o que se traduz por modificações do fluxo

sanguíneo retiniano na hiperglicémia e na diabetes, por vasodilatação

das arteríolas retinianas (Herse, 1994). A hiperglicémia moderada e

permanente (mimetizando uma diabetes do tipo I) produz alterações do

fluxo sanguíneo retiniano (com vasodilatação) cuja fisiopatologia

18

permanece por esclarecer (Skimmer, ISOPT, 2006). O estado induzido

corresponde a um stress hipóxico, através de um aumento da relação

NADH/NAD+ (Williamson et al., 1997). A proteína ZO-1 existente na

BHR interna encontra-se substancialmente reduzida nas tight junction de

ratos diabéticos, aumentando a permeabilidade da BHR (Khin et al.,

1997). A diabetes como doença neurovascular compreende: leakage

(exudato) vascular, apoptose neuronal das celulas ganglionares,

inflamação e disfunção astrocitária (células de Muller) (Gardener,

2004).

O aumento da dilatação arteriolar e venosa ocorre bastante cedo

na diabetes, um fenómeno atribuído, em parte, ao efeito do óxido nítrico

(NO) sintetizado no endotélio vascular pela sintetase respectiva e depois

libertado para os pericitos e células musculares lisas. Recorda-se que

nos últimos anos foi possível confirmar este efeito modulador in vivo do

óxido nítrico (Stitt e McDonald, 1997; Pournaras et al., 1997). Convém,

no entanto, recordar que as células endoteliais de diferentes espécies

apresentam normalmente uma grande heterogeneidade in vitro nos

aspectos morfológico, funcional e bioquímico com resultados distintos,

não homogéneos, de qualquer estudo funcional efectuado nestas

condições (Yan et al., 1998). Este mediador endógeno está implicado

nas alterações verificadas entre as células de suporte retiniano e o

endotélio vascular da retina na patologia isquémica.

A retinopatia diabética (RD) nos seus múltiplos estadios, continua

a ser um problema grave de saúde pública, como já foi referido, e os

métodos terapêuticos usados no seu tratamento são ainda paliativos e

bastante agressivos, como a laserterapia, não se prespectivando ainda a

possibilidade de uso de fármacos ideais para a sua prevenção e

tratamento e desconhecendo-se a melhor via de administração dos

19

disponíveis (tópica, intravítrea, retrobulbar ou outras), face à dificuldade

de acesso ao meio intraocular. A existência das duas barreiras (BHR e

BHE) semelhantes do ponto de vista funcional e anatómico, reporta-nos

também para os fenómenos de natureza vasospática, relacionados com

patologia do tipo migraine.

Conhecem-se hoje alguns dos fenómenos inflamatórios

subjacentes à patologia diabética. Do ponto de vista clínico o maior

interesse dirige-se ao tipo de patologia intraocular que envolve as

alterações vasculares, como as oclusões vasculares retinianas, com a sua

problemática hiperpermeabilidade e neovascularização, presentes na

neuropatia óptica isquémica. Admite-se que as respostas aos mediadores

envolvidos no controlo do tónus vascular estão alteradas na diabetes tipo

I: o aumento da permeabilidade consecutivo ao maior transporte inter e

paracelular (através da abertura das tight junctions) e intra e transcelular

(pelas vesículas intracitoplasmáticas e das fenestrações) justificaria

essas alterações (Murta, 1990; Flammer, ISOPT, 2006). Na retinopatia

diabética as células endoteliais apresentam um número reduzido de

vesículas pinocitóticas e de transportadores específicos. Duas classes de

moléculas transmembranares estão aí presentes: as ocludinas e as

claudinas (Grieshaber, 2007), com funções de barreira (gate). Por outro

lado, as células murais microvasculares, referidas como pericitos, são

cruciais para a sobrevivência das células endoteliais em situações de

stress oxidativo, como acontece na diabetes. Esta patologia, mesmo de

início recente, acelera a morte das células endoteliais por um processo

semelhante à apoptose, admitindo-se a necessidade da presença de um

substracto genético para a sua concretização, como o TP53 ou outros

(MYC, BCL2 e RAS) (Ridley M, 1999).

20

A diminuição de NO e de VEGF são os responsáveis pelas

oclusões arteriolares na doença diabética, com perda de pericitos

anterior à perda de células endoteliais, vasodilatação subsequente e

espessamento da membrana basal. Desconhece-se a causa da sua perda,

já que nenhum deles necessita de insulina para o transporte da glicose.

Posteriormente verifica-se um aumento do VEGF, da proliferação

endotelial compensatória e ainda da permeabilidade, com diminuição da

Tensão Intraocular (TIO), edema macular compensatório e

neovascularização. No diabético a resposta surge com um aumento da

insulina, da L-Arginina e do NO. Porém, a NG-nitro-L-arginina, um

inibidor da sintetase do óxido nítrico, reduz também o fluxo coroideu 60

e 120 minutos depois da administração do fármaco mas não aumenta,

todavia, o fluxo na retina, na íris e no corpo ciliar (Chiou, 1995).

O Glaucoma é, como se referiu, a segunda causa de cegueira no

mundo. A sua incidência é de 1-2% da população com mais de 45 anos

correspondendo a cerca de 70 milhões de pessoas envolvidas, das quais

aproximadamente 7 milhões já cegaram. Os dados disponíveis na

literatura estimam que, só nos USA, 2,22 milhões de pessoas sofrem de

Glaucoma. Cerca de 12% cegam aos 20 anos de doença. A redução das

TIOs abaixo dos 22-25 mmHg (dependendo dos critérios) têm sido a

única solução terapêutica. O Glaucoma apresenta alterações vasculares

retinianas importantes (Flammer et al., 2005). A abordagem

hemodinâmica em relação à sua etiologia vascular passou nos últimos

vinte anos da simples medição de diâmetros vasculares em doentes

glaucomatosos (ainda sem conclusões consistentes à vista) até às

avaliações directas quantitativas do fluxo sanguíneo.

21

Na sua vertente congénita com a descoberta do gene CYP1B1,

OPTN e o MYOC, na vertente inflamatória com o pseudoesfoliativo, ou

ainda no glaucoma de ângulo fechado ou o de pressão normal (todos de

difícil solução clínica e de prognóstico reservado), tem-se procurado

solucionar estes padrões patológicos pelo recurso a novos fármacos

baseados no RNA curto de transferência ou utilizando células mãe

(estaminais), multiplicando-se os estudos multicêntricos internacionais e

protocolos terapêuticos com algoritmos de tratamento médico-cirúrgico,

com base na análise clínica e em provas funcionais e morfológicas para

a sua avaliação (Fernandez Vila, 2008).

Os doentes com glaucoma de pressão normal relacionado com a

migraine (Corbett, 1985) ao contrário do glaucoma primário de ângulo

aberto, têm um risco elevado de perda de visão e apresentam

vasospasmo periférico (Alon Harris, Mónaco, ISOPT, 2004).

Nas doenças vasculares que se iniciam com vasospasmo, são as

artérias com menos de 200 µm as que mostram maior resistência (Riva,

1987). Verifica-se uma grande variabilidade inter-individual, em termos

de resistência arteriolar, provavelmente pela dificuldade de avaliar em

simultâneo este parâmetro em dois pontos distintos do vaso, e ainda

porque a medida dos fluxos e volumes sanguíneos na retina e nervo

óptico está limitada a vasos de pequeno calibre (Flammer et al., 1996).

De entre os factores de risco mais importantes na redução do

fluxo sanguíneo ocular salientam-se: a migraine, a diabetes e as

síndromes designadas outrora de vasospásticas, entre as quais a

Síndroma de Raynaud. No glaucoma o fluxo também é reduzido,

provavelmente por vasoconstrição (Flammer, 2005). Durante o período

nocturno a pressão arterial diastólica baixa, o que induz um aumento da

tensão intraocular com um valor de pico cerca das 24 horas. Só 50% dos

22

glaucomatosos (glaucoma de pressão normal) têm problemas vasculares

(Greve et al., 1995). Existe evidência directa de que factores vasculares

contribuem para o desenvolvimento da neuropatia óptica glaucomatosa

(Harris, 2005). Nesta neuropatia, a redução de fluxo compromete

naturalmente o fornecimento de oxigénio e de glicose à célula

endotelial. Este fluxo pode ser alterado por modificação da produção de

ATP e da actividade da ATPase Na+, K+ responsável pelo controlo

iónico intracelular. O excesso de sódio intracelular conduz, como é

conhecido, à entrada directa de cálcio para o interior da célula e

indirectamente, à activação do sistema excitatório de aminoácidos

(glutamato-aspartato) ou à desactivação do inibitório (GABA/Glicina)

(Miller, 2008). A presença exagerada de cálcio intracelular activa várias

enzimas com formação de radicais livres, subsequente autodigestão

celular e morte por apoptose (Flammer et al., 2005).

A vasoconstrição no glaucoma hipertenso, com diminuição da

permeabilidade, hipoxia, morte das células ganglionares e perda de

pericitos é compensada com um aumento da adenosina, conduzindo a

vasodilatação compensatória (via receptores A1). A vasodilatação

produz um aumento da permeabilidade com uma reposição dos níveis da

TIO que diminuem e, depois, estabilizam (Osborne, ISOPT, 2006).

1.1-Importância da componente interna da Barreira Hemato-

Retiniana nos mecanismos de auto-regulação intrínseca da

vascularização retiniana e da componente extrínseca, através de

mediação por fármacos.

23

A BHR está localizada a dois níveis, formando uma barreira

externa, o epitélio pigmentar retiniano (responsável pela maior parte da

produção do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF)) cujos

polimorfismos se responsabilizam pelos fenómenos de angiogénese e de

isquémia retinana através de factores de transcrição como o MEF2C,

presente nas células endoteliais (Churchill et al., 2008; Maiti et al.,

2008), utilizado em terapia génica; e uma barreira interna, o endotélio

dos vasos retinianos (Cunha-Vaz, 1978). Existem numerosos estudos de

investigação sobre a primeira, pelo que nos decidimos debruçar sobre a

última, uma vez conhecida a origem neurológica comum das células

vasculares e de suporte da retina e do Sistema Nervoso Central (SNC).

O VEGF é um factor mitogénico das células endoteliais de

elevada potência e está implicado na retinopatia diabética proliferativa e

outras doenças isquémicas retinianas neovasculares (Elliot et al., 1996).

Induz vasodilatação capilar retiniana e quebra da BHR em primatas

(Ozaki et al., 1996), comprovados em estudos in vitro (Caldwell e Feng,

1996) e in vivo (Duh et al., 1996). Os receptores desta glicoproteína (fit-

1 e fik-1) foram já identificados a nível das células endoteliais (Chen et

al., 1996). Porém, os resultados até ao presente, com recurso a

antagonistas do VEGF na neovascularização não foram encorajadores

(Ozaki et al., 2000; Campochiaro, 2004).

O ácido glutâmico (glutamato) tem sido mais recentemente

implicado na patogénese de múltiplas doenças do SNC e na isquémia

retiniana. O estudo do seu efeito sobre a integridade da BHR foi já

efectuado, com recurso a injecção intraocular e radioisótopos. Os

resultados apontam para uma ruptura da BHR através de uma acção

directa sobre as células endoteliais ou, por efeito indirecto, através das

24

populações neuronais e/ou gliais constituintes da retina humana

(Greenwood et al., 1996). Os fenómenos de apoptose após a isquémia

retiniana e envolvimento do N-metil-D-aspartato (NMDA) com

expressão do gene pró-apoptose p53 estão largamente documentados

(Joo et al., 1999). O glutamato, actuando sobre o receptor NMDA,

aumenta o sódio intracelular que promove a morte celular directa por

lise celular e indirecta por estimulação de enzimas intracelulares, como a

proteina cinase C, cinases dependentes do sistema da calmodulina,

proteases, fosfolipases, sintetases do óxido nítrico, endonucleases,

xantinoxidase e descarboxilase da ornitina. Todas promovem apoptose,

por inibição da translação ou transcrição. No entanto, é o glutamato o

neurotransmissor que estabelece a ligação entre o neurónio e a glia.

Surgiram, consequentemente, várias questões: será a isquémia

consequência ou origem da patologia citada? Serão os fenómenos

vasospásticos nestas patologias devidos maioritariamente a processos de

natureza inflamatória ou de origem multifactorial? Será a

neuroprotecção no glaucoma uma utopia ou passa também pela

resolução dos fenómenos isquémicos com subsequente aporte directo

retiniano de substâncias antioxidantes e/ou nutritivas que minimizem a

apoptose das celulas ganglionares via stress oxidativo? O agente

neuroprotector é, como se sabe, uma substância que reduz ou impede a

morte (apoptose) neuronal provocada pelo stress oxidativo. Existe

actualmente abundante bibliografia sobre os processos subjacentes à

morte celular: traumáticos, doenças degenerativas e isquémicas (Joo et

al., 1999).

Resultados recentes publicados por diversos autores (Flammer,

Harris, Jonas, 2007) indicam uma resposta afirmativa às duas últimas

questões. E foi esse o desafio que nos foi colocado quando iniciámos o

25

nosso projecto. Acreditámos que, ao contribuirmos para o

esclarecimento dos fenómenos isquémicos, por deposição peri ou justa-

papilar de moléculas de sinalização, na proximidade dos vasos e células

das estruturas envolvidas e usando como medida os diâmetros

vasculares à distância de um disco, com a análise da variação desses

diâmetros e da dinâmica de perfusão ocular em estudos clínicos,

poderíamos concretizar algumas das respostas as estas questões.

De entre as substâncias já estudadas, com capacidade reactiva a

nível dos vasos retinianos e possuidoras de um efeito vasomotor

imediato, em estudos fundamentalmente in vitro situam-se a

Noradrenalina e a Adrenalina, o Carbacol, a Histamina, a Vasopressina,

a Angiotensina II, as Prostaglandinas, o Óxido Nítrico e Endotelinas

(Lutty et al., 1998, Gaspar et al., 2001). Algumas destas substâncias são

secretadas pelo endotélio vascular (óxido nítrico e endotelinas) e os seus

efeitos a nível dos vasos retinianos têm sido objecto de estudo em

experimentação, recorrendo a animais normais e com patologias

diversas como a obstrução da artéria e veia centrais da retina (Osborne

et al., 1988).

Alguns receptores adrenérgicos do tipo β2, α1 e α2 e também

colinérgicos foram identificados no ser humano a nível ocular (Sole et

al., 1992; Furukawa, 1987; Denis et al., 1989; Hoste et al., 1989) e,

recentemente, também no coelho in vivo, em modelo experimental

validado (Delgado et al., 2008). O sistema serotoninérgico mereceu

alguma atenção dos investigadores relativamente a alguns dos seus

receptores, tendo sido encontrados resultados curiosos a nível da artéria

oftálmica (Jarapaju et al., 2004). A opção de estudar a expressividade de

alguns receptores do sistema serotoninérgico a nível dos vasos

retinianos baseou-se no facto de pretendermos esclarecer a sua

26

participação nos fenómenos vasospásticos e não se encontrar descrito na

literatura, à data do início do trabalho experimental, nenhum estudo

equivalente, utilizando metodologia e técnica in vivo, a que se associou

o facto de ainda ser discutível a existência de inervação sensorial

(avaliada pelo sistema neuropeptidérgico) a nível dos vasos retinianos,

bem como da inervação simpática (vasoconstrictora) e parassimpática

(vasodilatadora).

Das aminas libertadas localmente, a histamina encontra-se

armazenada nos mastócitos ou basófilos e noutras células não

mastocitárias que se encontram em vários tecidos, incluindo o cérebro.

Como neurotransmissor endógeno, participa em algumas funções

cerebrais como o controlo neuroendócrino, regulação cardiovascular,

térmica, do peso corporal e do sono. A participação nos processos

imunológicos constitui, no entanto, a função fisiopatológica mais

importante da histamina após a sua libertação a partir dos mastócitos e

basófilos, não se conhecendo uma função de relevo no controlo

vascular.

A serotonina é uma amina biológicamente activa com efeitos

fisiológicos e patológicos complexos através de múltiplos subtipos de

receptores é um neurotransmissor importante, uma hormona local no

intestino, um componente plaquetar do processo de coagulação, um dos

mediadores dos sinais e sintomas do sindrome carcinóide e é aceite

como agente importante na enxaqueca. Conjuntamente com peptídeos

endógenos, prostaglandinas, leucotrienos e citocinas, designados como

substâncias autacoides (do grego “auto-curativo”) ou hormonas locais,

devido a estas propriedades, ocupam hoje um lugar de relevo no

controlo de funções diversas nos tecidos (Comtois e Katzung, 2008).

27

Também os derivados do endotélio, incluindo substâncias com

actividade vasodilatadora (PGI2 e Óxido Nítrico) e vasoconstritora

(família das endotelinas) mereceram a atenção dos investigadores na

área ocular, por actuarem localmente de modo parácrino ou autócrino,

mais do que como hormonas circulantes.

Receptores serotoninérgicos e neuropeptidérgicos responsáveis

por fenómenos isquémicos, via NO, já foram detectados em vasos não

retinianos de coelhos normais. A comparação com a sua expressividade

in vivo em coelhos diabetizados nunca foi realizada. Assim, a

necessidade de identificar este tipo de receptores a nível vascular

retiniano prende-se também com o facto da maioria das lesões

vasculares na diabetes e no glaucoma serem irreversíveis. Dos

fenómenos mais importantes que ocorrem, as dilatações arteriolar,

venosa e capilar em terrenos coroideus e principalmente retinianos, são

as mais características da diabetes. O glaucoma, hoje rotulado como

uma uma neuropatia isquémica, apresenta-se com duas vertentes: a

isquémica, com vasoconstrição e redução do fluxo sanguíneo arteriolar

que conduz à atrofia óptica com lesões nos axónios da lamina cribosa e

à apoptose das células ganglionares (Yoshida et al., 2008) e a

traumática, por aumento de pressão intraocular (Harris, Jonas, ISOPT,

2006).

No processo de análise de sistemas auto-reguladores, o sistema

serotoninérgico pareceu-nos da maior importância. Jonas et al. (ISOPT,

2006), citam-no como um dos sistemas que pretensamente se encontra

envolvido na fisiopatologia vascular do glaucoma, graças às

semelhanças entre as duas barreiras anátomo-fisiológicas anteriormente

referidas (BHR e BHE). Sheriff et al. (ARVO, 2008) apontam-no como

promissor de entre os antiglaucomatosos, com base em experiências em

28

macaco, pela facilitação do escoamento do humor aquoso a nível da

malha trabecular que os seus derivados proporcionam.

Partindo do conhecimento de que a 5-HT é um dos principais

moduladores da função sináptica na retina, Nilsson et al. (1996) em

experiências in vivo com fármacos agonistas 5-HT1B/1D conseguiram

bloquear o efeito vasodilatador cerebral provocado por activação do

sistema nervoso trigemial, em ratos (Osborne et al., 1990; Pierce et al.,

1996). A activação deste sistema parece ter importância na

fisiopatologia da enxaqueca: recorda-se que o factor de risco de

desenvolvimento de glaucoma em doentes com este tipo de cefaleia é de

2,58 vezes superior ao dos indivíduos sem enxaqueca, levando a que a

associação glaucoma / enxaqueca se revele interessante do ponto de

vista vascular (Harris, 2005).

O núcleo supraquiasmático, responsável pelo relógio biológico

circadiano nos mamíferos e, indirectamente, pelas variações circadianas

da tensão intraocular, possui o mais denso complexo terminal

serotoninérgico do cérebro. Este núcleo recebe ramos aferentes

glutaminérgicos e serotoninérgicos da retina e do cérebro médio. A

demonstração da existência de receptores serotoninérgicos a nível

arteriolar retiniano seria interessante, nomeadamente pela possibilidade

de se comparar o seu papel modulador em afecções oculares com a

patogenia da enxaqueca.

O efeito vasoconstrictor da 5-HT processa-se através de

receptores localizados morfológicamente a três níveis: terminais

nervosos simpáticos, endotélio vascular e células musculares lisas da

rede vascular dos mamíferos.

Estudos in vitro levaram a admitir que a 5-HT pode actuar através

do “endotelium derived relaxing factor “ (EDRF) quando provoca, por

29

vezes, relaxamento vascular (Hoyer et al., 1996), inclusivamente no

coelho (Leff et al., 1987). É também um vasoconstrictor relativamente

potente, em particular nas vénulas pós-capilares e nos vasos do pulmão

(Hoyer et al., 1996).

Presente no SNC e com uma distribuição localizada às áreas

cerebrais filogeneticamente mais arcaicas, o seu comportamento a nível

dos vasos retinianos nunca foi estudado. Sabe-se que as concentrações

cerebrais do seu precursor, o triptofano, dependem das suas

concentrações plasmáticas, existindo variações circadianas. Do

triptofano ingerido, apenas cerca de 1% será transformado em 5-HT. O

seu papel na génese da enxaqueca está demonstrado, existindo uma

abundante rede de receptores 5-HT nos vasos extracranianos, sendo aí

mais potente que a noradrenalina. Os agonistas dos receptores 5-HT

possuem verdadeiro efeito profiláctico e curativo na enxaqueca

(Pauwels et al., 1998). A 5-HT apresenta também uma ligação estreita

com as perturbações do sono e as depressões. Os núcleos dos neurónios

serotoninérgicos estão maioritariamente localizados no tronco cerebral;

um segundo grupo distribui-se pelo bolbo raquidiano e um terceiro, nas

áreas dorsais da protuberância e do tegmen dorsalis. Conhece-se a

capacidade destes neurónios influenciarem as características afectivas

dos fenómenos dolorosos, “pela integração de estímulos sensitivos de

proveniência medular com a actividade de centros superiores, como os

do sistema límbico” (Hoyer et al., 1996).

O interesse crescente pelas substâncias que medeiam as acções

dos neurotransmissores e hormonas tem vindo a ressurgir nos estudos de

reactividade vascular e é visível nas frequentes actualizações da

nomenclatura destes receptores por parte de peritos da International

Union of Pharmacologists (IUPHAR). A classificação proposta em 1986

30

por Bradley et al. e que incluia a existência de três famílias de receptores

5-HT designados por 5-HT1-“like”, 5-HT2 e 5-HT3, com base em

critérios funcionais, constituiu o ponto de partida para a classificação

actual. O uso crescente de técnicas de radioligandos em membranas e

células, a auto-radiografia de fatias de tecido cerebral e o estudo dos

segundos mensageiros em células e tecidos conduziu à descrição de

subtipos de receptores 5-HT1. Tornou-se também evidente que o

receptor 5-HT1C, encontrado no plexo coroideo, está mais próximo da

família do receptor 5-HT2 pela semelhança de perfis farmacológicos e de

características do segundo mensageiro (estímulo da produção de fosfato

de inositol e sinalização pelo cálcio) o que levou também à sugestão da

existência de subtipos de receptores 5-HT2 (Hannon e Hoyer, 2008).

Uma vez iniciada a biologia molecular (1986-1988) com a clonagem do

receptor 5-HT 1A, rapidamente se chegou à clonagem dos receptores 5-

HT. Este trabalho levou à identificação de “outros” receptores

tentativamente designados 5-ht1E, 5-HT1F, 5-HT2F, 5-HT5A, 5-HT 5B, 5-

HT6 e 5-HT7, os quais “requeriam integração num esquema de

classificação aceitável” (Hannon e Hoyer, 2008). Como é conhecido

agora, todos os receptores 5-HT pertencem à família de tipo A dos

Receptores Acoplados à Proteína G (GPCR), mostram sequência

homóloga significativa com a rodopsina, e também com os receptores

adrenérgicos e dopaminérgicos e contêm o “DRY motif” na terceira

região em parafuso transmembranar. Com base na informação

operacional, estrutural, transducional e nos novos achados, a Comissão

de Nomenclatura de Receptores do Clube da Serotonina (Humphrey et

al.,1994) propôs um novo sistema de nomenclatura. Os princípios atrás

enunciados foram posteriormente aplicados a um número de famílias de

receptores pela Comissão de Nomenclatura de Receptores da União

31

Internacional de Farmacologia (NC-IUPHAR). A última publicação

indica que os receptores 5-HT podem ser classificados em 7 classes: 5-

HT1 (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-ht 1E, 5- HT1F), 5-HT2 (5-HT2A, 5-HT2B

e 5-HT2C), 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5 5-HT6, 5-HT7 e recombinantes (5-

ht5A,5-ht5B) e ainda outros receptores, designados por “órfãos”.

(Alexander et al., 2008). Para quase todas as classes é possível hoje

dispor de agonistas e antagonistas com maior ou menor especificidade,

possibilitando a caracterização dos subtipos de receptores existentes nas

diversas estruturas celulares.

Os peptídeos, elevados à categoria de neurotransmissores no final

do século XX com base em técnicas de imunocoloração, encontram-se

na retina em diferentes tipos de células, com funções a nível dos

neurónios e da rede vascular (Brecha et al., 1984). Aplicados por

iontoforese ou adicionados ao meio do banho, numa preparação de

retina perfundida de coelho, mostraram contribuir para a regulação do

fluxo sanguíneo da retina e influenciar as funções das células

ganglionares e vasculares, após libertação a partir de neurónios

retinianos, ao funcionar como neuromediadores / neurotransmissores ou

estabelecendo contacto com outros mecanismos de comunicação de

sistemas diferentes: metabólico, glial e neuronal, de modos ainda não

totalmente conhecidos (Miller, 2008).

A libertação de mediadores peptídicos pelas terminações nervosas

sensitivas vasculares, modificam o fluxo sanguíneo local, a

permeabilidade vascular e a actividade do músculo liso adjacente e,

também, a inflamação intraocular (Saria et al., 1985; O’Saughnessy,

1994; Lee et al., 1997; Schmid et al., 2005). Em papilas de coelho

32

perfundidas, foi possível confirmar a sua existência e utilidade em

neurónios retinianos distribuidos em rede (Zalutsky et al., 1990).

As taquicininas são uma família de peptídeos que partilham o

mesmo grupo carboxilo terminal na sequência aminoácida (Erspamer,

1981). Pertencem a esta família a Substância P (SP), a Neurocinina A

(NKA) e a Neurocinina B (NKB) cujas acções são mediadas por três

receptores: NK1, NK2 e NK3 acoplados a proteínas G (Kimura et al.,

1993; Tatemoto, 1985).

A SP, um dos péptidos presentes no SNC onde é um

neurotransmissor, é um dilatador arteriolar potente, cujo efeito

hipotensor foi descrito por Euler e Gaddum há sessenta anos, traduzida

por uma vasodilatação generalizada. Este efeito não é bloqueado pela

atropina, o que pressupõe a sua co-libertação não associada a agonistas

colinérgicos, como acontece como o péptido vasoactivo intestinal (VIP)

(Uddman et al., 1987), embora o efeito vasodilatador do VIP possa não

envolver receptores colinérgicos nem adrenérgicos, uma vez que locais

de ligação específicos, de alta e baixa afinidade, saturáveis e reversíveis,

foram detectados em artérias cerebrais bovinas por Suzuki et al., em

1985. A SP, cujo efeito vasodilatador é dependente da dose, tem a

propriedade de aumentar a permeabilidade capilar por activação directa

da fibra muscular lisa, ou por libertação indirecta de catecolaminas, já

que este efeito é revertido pela fentolamina (Eklund, 1977). Outra

hipótese sugerida quanto ao seu mecanismo de acção foi a proposta por

Kimura em 1993, que identificou através de estudos de

imunorreactividade, dois genes diferentes para a SP e a NKA, parecendo

serem libertadas simultaneamente (Mishuaddin e Nakanishi, 1986). A

acção vasodilatadora ocorre via AMPc e é mediada pela libertação de

NO a partir do endotélio. Este péptido tem maior afinidade para o

33

receptor NK1, o receptor que predomina no cérebro humano, e as

neurocininas A e B mostram também afinidade para o mesmo receptor;

a NKA é um ligando preferido para o receptor NK2 e a NKB para o

receptor NK3. A NKA e o CGRP estimulam as fibras primárias

aferentes do trigémio com sensibilidade para a capsaicina, libertando

neuropeptídeos que, por sua vez, activam receptores NK1 (McClellan e

Hazlett, 2008). A sua coexistência com outras neurocininas e com o

CGRP foi demonstrada por Stjarne em 1989 e, posteriormente, por

Wharton em 1994. Quando libertados por agentes químicos ou por

impulsos eléctricos, estes neuropeptídeos produzem vasodilatação e

aumentam o fluxo sanguíneo (Stjarne, 1989). Além de ser bastante

potente, o efeito vasodilatador da SP é de curta duração quando

comparado, por exemplo, com o do CGRP (Uddman, 1983). Prevê-se

para a SP, que continua numa fase preliminar de estudo, um papel

relevante nos mecanismos de comunicação dos diferentes sistemas,

incluindo o metabólico, glial, neuronial e vascular (Miller et al., 2008).

O peptídeo relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), um

membro da família da calcitonina que também inclui a calcitonina,

adrenomedulina e amilina; está largamente distribuído nas células C da

glândula tireóide, nos sistemas cardiovascular, gastrointestinal,

urogenital, sistema nervoso central e periférico. As suas acções são

mediadas por dois receptores designados CGRP1 e CGRP2. Têm-se

acumulado provas de que o CGRP se liberta dos nervos trigémios,

desempenhando um papel central na fisiopatologia da enxaqueca. O

péptido é libertado durante uma crise de enxaqueca, que pode ser

aliviada com antagonistas selectivos da serotonina, os quais normalizam

também os teores de CGRP intracranianos (Olesen et al., 2006). Quando

34

injectado na circulação sistémica causa hipotensão e taquicardia, por

vasodilatação acentuada, sendo conhecido como o vasodilatador mais

potente descoberto até ao presente. Efeitos relaxantes acentuados foram

observados nas artérias retinianas isoladas de bovino (Prieto et al., 1991)

e é capaz de causar uma vasodilatação acentuada nas arteríolas

retinianas do coelho in vivo (Gaspar et al. 2004), encontrando-se entre

os peptídeos que podem ser libertados pelos nervos sensoriais, porque os

seus efeitos são reproduzidos pela Capsaicina (Boussery et al., 2005).

A libertação deste tipo de mediadores peptídicos, SP, NKA,

CGRP e glutamato (GLU) a partir das fibras sensoriais do nervo

trigémio que inerva o globo ocular (ramo sensitivo oftálmico) capacita

as células neuronais a exercer o seu efeito in loco, tais como variações

no fluxo sanguíneo retiniano, alterações da permeabilidade vascular

retiniana e aumento da actividade muscular lisa (Holzer et al., 1991;

Maggi et al., 1992). Estas células que existem a nível cerebral de várias

espécies de mamíferos, incluindo o cobaio, o cão, o porco, o coelho e o

Homem (Heuring e Peroutka, 1987; Maura et al., 1993) têm os corpos

celulares na medula espinal e outros gânglios viscerais e enviam ramos

periféricos para os diversos orgãos e tecidos com arborizações varicosas

próximas das células efectoras. Reside aqui uma base anatómica para as

respostas reflexas com libertação destes peptídeos, face a agentes e

situações patológicas como a isquémia, a inflamação, a infecção, o

trauma e outras agressões.

Os ramos centrais destes neurónios sensoriais projectam-se para o

cérebro onde estabelecem sinapses com os neurónios sensoriais de

segunda ordem. Apesar dos receptores AMPA e NMDA serem aí os

mais comuns, os NK1 e NK2 facilitam a transmissão nervosa. A

presença de grandes quantidades de cálcio activa o sistema da sintetase

35

do óxido nítrico e a COX-1 no SNC, com formação subsequente de NO

e prostaglandinas, respectivamente, que se difudem nos tecidos. A

activação pré-juncional de receptores opióides, alfa-2 e GABAB inibe a

libertação destes mediadores a nível sensorial. As células neuronais

sensoriais periféricas podem serem activadas também por substâncias

endógenas como a histamina, o óxido nítrico, protões H+, ATP,

bradicinina e inúmeras prostaglandinas que são formadas nos tecidos

atingidos ou/e libertadas por células inflamatórias. Esta activação leva à

despolarização, formação do potencial de acção e propagação do

impulso nervoso aos axónios reflexos e finalmente ao SNC (Lundberg et

al., 1996). Alguns fenómenos oculares de natureza isquémica e

inflamatória, poderão ser assim explicados.

O óxido nítrico (NO), designado anteriormente por Factor

Relaxante Derivado do Endotélio (EDRF), é uma molécula de

sinalização gasosa altamente reactiva gerada no meio endógeno, que se

difunde rapidamente através das membranas celulares e participa em

variadas acções fisiológicas e patológicas (Jaffrey, 2007). É sintetisado

nas células neuroniais, endoteliais, algumas células imunitárias e outras,

por uma das três isoformas da sintetase relacionada com o NO: 1.a

sintetase neuronal, nNOS ou NOS-1; 2. a macrofágica ou indutível,

iNOS ou NOS-2; e 3. a sintetase endotelial, eNOS ou NOS-3. Estas

isoformas originam NO a partir do aminoácido L-arginina, numa

reacção dependente de O2- e de NADPH e que envolve vários co-

factores enzimáticos (heme, tetrahidropterina e o dinucleótido adenina

flavina). No caso do nNO e eNO, a síntese é evocada por agentes e

processos que aumentam a concentração citosólica de cálcio. Muitas

células neuronais e particularmente as células da glia são capazes de

36

expressar a iNOS em quanidades até 1000 vezes as produzidas pela

nNOS e eNOS. Uma vez formado tem vários alvos: liga-se à

guanililciclase solúvel (sGC), activa a enzima e estimula a produção de

guanosina monofosfato cíclico (cGMP); este segundo mensageiro

fosforila a proteína cinase G (PKG) que tem várias funções celulares,

incluindo a fosforilação de canais iónicos, com redução consecutiva do

cálcio intracelular. Nas células do músculo liso vascular o NO exerce

relaxamento e efeitos vasodilatadores e nos neurónios tem funções

variadas (Olesen, 2006).

Apesar de possuir um electrão livre, o NO não é tóxico por si

mesmo. É inactivado pela oxihemoglobina que catalisa a oxidação do

NO até nitrato, que é transportado através dos vasos; também é

inactivado pelo superóxido, formando peroxinitrito, um radical livre

altamente reactivo, com efeitos lesivos nos tecidos, um mecanismo

usado na defesa contra a infecção, quando a iNO é activada e produz

níveis elevados do neurotransmissor. As substâncias que captam o anião

superóxido, como a superóxido dismutase, podem aumentar a sua

potência e prolongar a sua duração de acção.

A manipulação farmacológica do NO é conseguida com

inibidores da síntese do NO ou com dadores do NO. Além dos efeitos

significativos no tónus do músculo liso vascular e na pressão sanguínea,

por aumentar os níveis de cálcio intracelular que induz a sua síntese, o

NO é conhecido por proteger ainda contra a trombose e aterogénese,

através de vários mecanismos. Tem um papel importante na protecção

da retina e da coroide na doença isquémica, pelas suas acções

vasodilatadoras, ao prevenir a hipoperfusão pós-isquémica, via GMPc

no músculo liso e por aumento da PGI2 (endotelial) que abre os canais

de Ca2+/K+, via AMPc.

37

Como mediador entre a inflamação e as patologias de natureza

isquémica, o NO é parte integrante do sistema de auto-regulação do

fluxo sanguíneo ocular. Implicado na vasodilatação, após administração

de inibidores da anidrase carbónica, de bloqueadores dos canais de

cálcio ou da inalação de carbogénio, o NO apesar de importante na

isquémia retiniana é, por outro lado, prejudicial quando libertado de

forma anómala (Harris et al., 2003). Parece que o efeito vasoconstritor

do O2 predomina sobre o efeito do CO2, vasodilatador na arteríola

retiniana, ao contrário do que ocorre na artéria cerebral média

(Kisilevsky et al., 2008). Experiências efectuadas por Kotikoski et al.

(2002) levaram a admitir que a sintetase induzível do NO, a isoforma

encontrada nos astrócitos do nervo óptico de pacientes com glaucoma,

poderia produzir NO em excesso, modificar a pressão intraocular e

induzir a morte selectiva das células ganglionares retinianas.

As características referidas para o NO levaram-nos a induzir

experimentalmente no modelo animal escolhido, uma simulação de

glaucoma agudo (ou talvez melhor, hipertensão intraocular) e efectuar

estudos com modificadores da libertação de NO, tentando recolher

alguns dados que fossem sugestivos de eventual utilização na

terapêutica antiglaucomatosa.

Já foi referido que as células neuronais expressam a iNOS em

quantidades consideráveis. Esta isoforma é independente do cálcio e

exerce efeito citotóxico e citostático, não somente nas células

patológicas, mas também nas células saudáveis. Induzida em diversas

células como fibroblastos, macrófagos e no epitélio do corpo ciliar,

especialmente após libertação de TGF-B2 e estimulação por citocinas

como a interleucina-1, o TNF-α e lipopolissacarídeos (LPS), a iNOS

38

conduziria a níveis elevados de NO (Berger et al., 2008). Alguns estudos

são sugestivos de que a iNOS se encontra nos astrócitos do nervo óptico

de pacientes com glaucoma, podendo aí conduzir à superprodução de

NO, vasodilatação associada com a inflamação aguda ou crónica,

alterando a pressão intraocular, agravamento das lesões dos tecidos com

morte selectiva de células ganglionares e degenerescência dos axónios

destas células (Liu e Neufeld, 1999). Somos levados a admitir que um

inibidor selectivo da iNOS teria um efeito protector nos astrócitos, por

reduzir a actividade enzimática, criando condições para desempenhar

um efeito protector, ao baixar a pressão intraocular (TIO), relaxar o

músculo ciliar e aumentar o fluxo ocular do sangue. A dificuldade

advém do facto de não dispormos de isoformas selectivas da iNOS.

A iNOS é sómente induzida em circunstâncias patológicas por

endotoxinas, inflamação, e determinadas citocinas, tais como a

interleucina-1 (IL-1), IL-6 e o TNFα. Uma vez induzida, a iNOS

produzirá grandes quantidades de NO por períodos de tempo longos,

levando a que seja convertido em NO2, nitritos, peroxinitritos e radicais

livres que induzem acções patofisiológicas como a atrofia do nervo

óptico e lesões da retina posterior, com degenerescência e reacções

inflamatórias crónicas, que estão associadas ao glaucoma, à doença

macular relacionada com a idade, a miopia, cataratas senis e uveites

(Chiou, 1995).

A interrelação entre o NO e o glaucoma establece-se desta forma:

sendo o glaucoma uma neuropatia óptica com “cupping” do disco

óptico, degenerescência das células retinianas ganglionares, e perda

característica do campo visual (Neufeld et al., 1999) relacionado com a

hipertensão ocular e/ou mau funcionamento do fluxo ocular do sangue,

particularmente na retina, na coróide e no nervo óptico, o seu tratamento

39

médico tem utilizado os tradicionais antihipertensores oculares, agentes

que facilitam o fluxo sanguíneo ocular. Alguns resultados indicam que

ambas as sintetases do NO e os dadores de NO poderiam ser usados para

o tratamento do glaucoma, através da redução do processador de

entrada/saída e/ou da melhoria do fluxo ocular do sangue (Nathanson,

1992; Liu, 1995, 1997; Chiou, 1995; Varma, 1995). Posteriomente

ganhou relevo a hipótese de que o glaucoma podia estar associado aos

efeitos neurotóxicos directos do NO na papila e áreas adjacentes

retinianas do nervo, com perda celular e do campo visual. Este novo

conceito do tratamento do glaucoma poderia recorrer ao uso dos

inibidores da iNOS e/ou da sua actividade (Chiou, 1995). Estamos

empenhados na definição do papel do NO na patogénese do glaucoma,

através da administração intra-ocular de inibidores da sintetase do NO

ou de dadores do NO, por medição da pressão intraocular, com base na

hipótese de que o NO possa estar envolvido na formação do humor

aquoso a nível os processos ciliares (Fleischhauer et al., 2000).

A toxicidade retiniana causada pela aplicação intravítrea de

dadores de NO tem sido referida também em coelhos. O tónus vascular é

principalmente regulado pela eNOS, e é conhecido que uma deficiência

na nNOS previne a morte celular retardada dos neurónios após

isquémia, enquanto uma deficiência na eNOS agrava o dano neuronal

isquémico. Por outro lado, a activação da NOS constitutiva com um

aumento do Ca2+ intracelular é seguida por um aumento tardio da

actividade da iNOS (Okuno et al., 2002). As alterações patofisiológicas

dos níveis de NO na retina interna poderiam afectar directamente a

sinalização do cálcio nas células ganglionares. Se a actividade do canal

de cálcio estiver suficientemente aumentada que possa conduzir à

40

acumulação de níveis destrutivos de cálcio intracelular, talvez em

conjunto com outras acções que levam à despolarização das células

ganglionares, a consequência desta sobrecarga pode ser a perda de

função das células ganglionares e dano visual a longo termo (Hirooka et

al., 2000).

Nas doenças oculares, como a RD e as oclusões venosas e

arteriais, o envolvimento vascular tem sido largamente estudado, não

acontecendo o mesmo com o glaucoma e a doença macular relacionada

com a idade (DMI), onde a compreensão dos fenómenos

hemodinâmicos está a emergir lentamente (Harris, 2005; Flammer,

2008). Factores como as necessidades metabólicas, a cedência de

nutrientes, os produtos do metabolismo, a pressão de perfusão e os gases

do sangue, bem como a diminuição do O2, do metabolismo oxidativo e

aumento da glicólise anaeróbica estão sendo cada vez mais apontados

como determinantes da doença (Rechtman, 2005), aos quais se devem

acrescentar as modificações bioquímicas retardadas consecutivas a

produtos da hidrólise de fosfolípidos (ácidos gordos polinsaturados,

eicosanoides, etc), de monoaminas (5-HT), neuropeptídeos, radicais

livres , catiões e aminoácidos, com um papel autodestrutivo nos tecidos

nervosos da retina, de modo análogo ao que ocorre em todo o SNC

(Bartlett,1994). A neuroprotecção, objectivo primário nestas patologias,

terá de assentar sobre os dados a conseguir com o estudo aturado de

todos estes intervenientes.

A terapêutica experimental já utilizou numerosos compostos que

abarcam praticamente fármacos de todos os grupos de uso comum

incluindo esteróides, modificadores do metabolismo do ácido

araquidónico, anti-oxidantes e inibidores de radicais livres (Mesilato de

41

Tirilazad, e Melatonina), moduladores das monoaminas (Clonidina),

agonistas de receptores opióides, gangliosídeos, hormona lbertadora de

tirotropina (TRH), antagonistas dos receptores NMDA (Memantina,

Cetamina, Dextromorfano, Fenciclidina, MK-801), antagonistas dos

canais de cálcio Flunarizina, Nimodipina) e do PAF, sem resultados

notáveis. Alguns destes agentes possuem propriedades neuroprotectoras

documentadas, como os inibidores da libertação pré-sináptica do

glutamato (Riluzol e Idrocilamida) e ainda outros são moduladores das

monoaminas (Clonidina) ou agonistas selectivos alfa2 (Brimonidina) e

beta 1 (Betaxolol), todos já usados como anti-glaucomatosos, sem

vantagens evidenciáveis.

1.2 - REVISÃO ANATÓMICA ACTUALIZADA DA INERVAÇÃO

AFERENTE, SIMPÁTICA E PARASSIMPÁTICA DO GLOBO

OCULAR.

Para uma melhor compreensão da importância da inervação

interna do globo ocular a nível interno e sua correlação com os fármacos

a utilizar em investigação, descreve-se sumariamente a sua inervação.

O olho mantém-se como um orgão especializado, de difícil acesso

sistémico dada a existência das Barreiras Hemato-Retiniana, Hemato-

Aquosa e Hemato-Vítrea já referidas. (Cunha-Vaz, 1972; Raviola,

1977). Este isolamento anatómico confere-lhe a propriedade de um

óptimo “laboratório farmacológico” de estudo, por exemplo, do sistema

nervoso autónomo.

42

O sistema nervoso simpático desce ao longo da medula espinal

nas colunas celulares médiolaterais (D1 a L2). Os axónios destes

neurónios saem da coluna por via anterior, através dos ramos

comunicantes brancos, sobem e fazem sinapse no gânglio cervical

superior, depois de passarem pelas artérias subclávias. Estas fibras, ao

deixarem o gânglio, seguem no plexo carotídeo interno ou ao longo da

artéria oftálmica no seu plexo periarterial. Ao caminharem desta forma,

entram na órbita através da fissura superior e formam a via simpática do

gânglio ciliar. Passam por este, sem estabelecerem sinapse, e

incorporam-se nos 7-10 nervos ciliares curtos. Outras fibras juntam-se

ao nervo oftálmico (divisão do nervo trigémio) ou ao seu ramo

nasociliar e inervam o músculo dilatador da íris, através dos ramos

ciliares longos. As fibras longas e curtas contêm fibras aferentes da

córnea, íris e coróide. Algumas fibras dos nervos ciliares curtos passam

do gânglio ciliar para o nervo nasociliar (via sensitiva do gânglio ciliar).

Estudos de Nilsson (1996) em coelhos, confirmam a inervação

trigeminal e ganglionar cervical superior da artéria oftálmica interna.

O sistema parassimpático inclui fibras pré-ganglionares

provenientes dos núcleos de Edinger-Westphal e de Perlia, que entram

no olho conjuntamente com as fibras do terceiro (III) par craniano e

estabelecem sinapses na via motora do gânglio ciliar. As fibras pós-

ganglionares caminham junto ao nervos ciliares curtos que inervam a

íris, o músculo ciliar e vasos sanguíneos (Mauger, Craig, 1994). A

activação do núcleo de Edinger-Westphal, via III par craniano, provoca

dilatação também nos vasos coroideus de algumas aves, como foi

demonstrado no pinto (Murray e Fitzgerald, 1990).

43

A inervação aferente do olho e da face, depende de um complexo

centrípeto de receptores, neurónios aferentes, núcleos do tronco cerebral

e de um conjunto de conexões com o tálamo e o córtex cerebral. O nervo

trigémio (V par craniano), com a sua raíz sensitiva, é a principal via

aferente somática. Tem a sua origem no primeiro arco braquial.

Toda a sensibilidade converge da face e do olho para o gânglio de

Gasser e depois para o cérebro, através dos ramos sensitivos do nervo

trigémio: ramo oftálmico, ramo maxilar superior e ramo maxilar

inferior. O ramo oftálmico é o mais pequeno, sendo responsável pela

inervação sensitiva de todo o globo ocular, região frontal, glândula

lacrimal e saco lacrimal, pálpebras superiores, seios frontais e região

nasal da face lateral (Kerr, 1963). Nasce do lado antero-interno do

gânglio de Gasser, entra no seio cavernoso, abaixo do nervo patético,

dando ramos para os nervos motor ocular comum, patético e motor

ocular externo. Ainda a este nível dá ramos recorrentes para o tectorium

cerebelli e para a duramater que cobre o polo occipital (Ryan et al.,

1994) e divide-se em três nervos: lacrimal, frontal e nasociliar, os quais

penetram na órbita através da fenda órbitária superior. Como já descrito,

ramos simpáticos juntam-se ao nervo oftálmico, a partir do plexo

cavernoso em redor da artéria carótida interna.

É o nervo nasociliar aquele que tem um especial interesse na

nossa investigação, por ser o nervo responsável pela inervação sensitiva

do globo ocular. São ramos deste nervo: a raíz longa (sensitiva) que

caminha para o gânglio ciliar e os nervos ciliares longos que rodeiam o

nervo óptico e se dirigem para a íris, corpo ciliar e córnea. Não existem,

até ao presente, referências quanto à inervação vascular retiniana,

própriamente dita.

44

O núcleo motor do trigémio está situado na zona média da

protuberância, junto aos núcleos dos III, IV e VI pares, a meio dos

núcleos sensitivos principais. Os centros sensitivos trigemiais formam

um conjunto de núcleos que se estende ao longo do tronco cerebral,

desde os pedúnculos cerebrais e medula até à extremidade rostral do

mesencéfalo. Dividem-se normalmente em três partes: superior, com o

núcleo mesencefálico; médio, com o núcleo sensitivo superior e

principal; inferior, com o núcleo do feixe espinhal do trigémio. É no

gânglio semilunar (Gasser) que as fibras aferentes sensitivas do trigémio

têm os seus corpos celulares. Após entrada na protuberância, caminham

em direcção dorsomediana e a sua maior parte dicotomiza-se,

originando ramos curtos ascendentes e ramos longos descendentes. Este

conjunto de fibras descendentes constitui o feixe espinhal do trigémio,

que termina numa coluna de células, longitudinal e medial ao feixe, o

núcleo do feixe espinhal do trigémio.

O núcleo principal do V par craniano recebe ramos ascendentes

curtos do gânglio semilunar e constitui a continuação rostral do núcleo

do feixe espinhal, embora com uma estrutura diferente.

Em último lugar, o núcleo mesencefálico, cuja função ainda se

encontra mal esclarecida, é constituído por uma pequena coluna celular

situada em posição imediatamente rostral em relação ao núcleo principal

(Brody, 1996).

A região mais inferior do núcleo do feixe espinhal parece ser a

que se encontra mais relacionada com a transmissão álgica (e térmica)

do nervo oftálmico (Armstrong et al., 1986). Aliás, a designada

teratomia medular, aplicada no tratamento da nevralgia do trigémio,

parece basear-se neste esquema de distribuição de fibras.

45

1.3 - INERVAÇÃO E VASCULARIZAÇÃO DA RETINA

HUMANA E DA RETINA DO COELHO.

A retina é uma estrutura fina, transparente, extraordinariamente

bem organizada, constituída por neurónios, foto-receptores, células

gliais e vasos sanguíneos. De todas as estruturas do globo ocular, a

retina neurosensorial é, sem dúvida, aquela a que se dedicou maior

número de estudos. Não obstante já terem sido detectados

neurotransmissores como a serotonina e diversos tipos de

neuropeptídeos, desconhece-se a sua função a este nível (Brody, 1996;

Hayreh, 1999). Fig.I

A retina vascular continua sendo um campo de estudo aberto a um

vasto conjunto de iniciativas que tenham como objectio principal

esclarecer o papel dos neurotransmissores, e o modo como poderão ser

modificados nas suas funções. Só então esse conhecimento permitirá, no

futuro, grandes expectativas no domínio da terapia localizada para

algumas das doenças hereditárias retinianas) em relação à retina

neurosensorial, e, no campo das doenças isquémicas, em relação à retina

vascular (Miller et al., 2008).

46

Fig.1 Estrutura da retina dos mamíferos e sua conexão com os vasos retinianos e

coroideus (notar o posicionamento dos vasos peripapilares em relação à divisão

topográfica das células retinianas, nomeadamente ganglionares e de suporte).

47

A inervação sensitiva (nervo trigémio), simpática (gânglio

cervical superior) e parassimpática (gânglio ciliar) no coelho, encontra-

se largamente estudada (Nilsson et al., 1996). A interacção entre estes

três sistemas está demonstrada através da plasticidade indutiva dos seus

neuromediadores / neurotransmissores (Kitamura, 1993). A substância P

(SP) tem sido utilizada como índex da inervação sensorial trigemial em

estudos in vivo, na íris de ratos. Furukawa et al. (1987) em vasos

retinianos do coelho e com recurso a técnicas enzimáticas, indiciaram a

presença de terminais nervosos ao longo e em redor destas arteríolas até

9 mm a partir do centro do disco óptico (única região vascularizada da

retina do coelho) e estão descritas combinações de inervação simultânea

sensorial e simpática para estruturas oculares diversas (Kitamura, 1993).

Deve-se, todavia, acrescentar que a existência de diferenças

morfológicas e funcionais entre diferentes espécies de mamíferos, no

que respeita à inervação vascular retiniana, é uma realidade comprovada

(Nilsson, 1996).

No coelho albino adulto, da raça Nova Zelândia, o sistema

vascular retiniano possui uma arquitectura especial (Fig.2): pertence ao

grupo dos Merangióticos, isto é, apenas parte da retina é vascularizada,

segundo a classificação de Leber (1903). Os vasos não se distribuem

uniformemente por toda a retina, antes se confinam a duas áreas de

tecido nervoso mielinizado, espalhando-se horizontalmente para o lado

nasal e temporal do disco óptico. A parte restante desta estrutura parece

ser avascular (De Juan Jr, 1987).

48

De entre as espécies de mamíferos mais frequentemente utilizadas

como modelos experimentais diabéticos situam-se o Homem, o gato, o

cão, o coelho e o rato (Guérin et al., 1996).

Fig.2- Retinografia digital (preto e branco) de coelho albino.

A artéria central da retina e a veia dividem-se em dois ramos

principais que se deslocam para a periferia das áreas referidas em forma

de asa; por vezes cruzam-se ou correm paralelas, apresentando calibres

diferentes entre si e ao longo das regiões mielinizadas. Ambas dão

49

ramos dicotómicos na área central, equatorial e periférica (Davis, 1929).

Estes ramos tornam-se finos à medida que se caminha para a periferia.

Formam redes capilares terminais, com tamanhos e configurações

diferentes do disco para a periferia. Os capilares não se apresentam

como uma rede uniforme, variando em tamanho, forma, origem e

terminação. Por exemplo, a nível central são tortuosos, mas à periferia

são paralelos, alguns formando anastomoses entre si.

No coelho, a principal fonte de nutrientes do globo ocular e da

órbita deriva de um ramo maxilar interno da carótida externa. A artéria

oftálmica externa divide-se em vários ramos que, além de nutrirem os

músculos e os tecidos orbitários, comunicam com as artérias ciliares

longas e curtas que entram no globo ocular.

A artéria visada no presente estudo é a artéria oftálmica interna

que é pequeníssima e que, derivando do círculo de Willis e

indirectamente da carótida interna, corre através do foramen óptico para

o interior do olho, enviando um ramo anastomótico para a artéria ciliar

nasal longa e entra no disco óptico para nutrir a retina, como artéria

central da retina (Krause, 1868; Davis, 1929).

50

Fig.3- Pormenor da arquitectura neurovascular da hemiretina temporal

esquerda do coelho albino (salienta-se a visualização na retinografia de vasos

peripapilares, retinianos e coroideus).

1.4- EMBRIOGÉNESE E ESTRUTURA DOS VASOS RETINIANOS

NO HOMEM E NO COELHO.

A embriogénese da retina do coelho tem sido estudada através de

microscopia de luz e electrónica a partir do 16 º dia de gestação,

utilizando amostras entre lâmina e lamela do polo posterior central da

retina (Greiner,1982). Neste grau de diferenciação, o disco óptico

encontra-se já formado assim como o neuroepitélio e todas as estruturas

vasculares, podendo-se observar diversas figuras mitóticas entre massas

de células neuroblásticas e de futuros fotoreceptores.

51

No Homem, cerca da 4ª semana de vida, a artéria hialoide que

deriva da artéria carótida interna, penetra na cúpula óptica para ir

vascularizar o cristalino. Dela se originam as células angioformadoras

de origem mesenquimatosa que irão dar origem aos capilares retinianos.

Vão proliferar e migrar para a zona do disco óptico para,

secundariamente, se diferenciarem em artérias e veias. Dá-se de seguida

a atrofia de alguns capilares primitivos, de forma a manter uma pressão

positiva dentro dos novos vasos. Pelo 7º mês de gestação, a

vascularização retiniana já se encontra a nível do equador. A maturação

secundária dos capilares dá-se ao nascimento, com o aparecimento dos

primeiros pericitos, e a formação definitiva de membranas ocorre apenas

ao 3º ano de vida (Greiner, 1982).

No presente trabalho desenvolveu-se uma técnica onde a

substância farmacológica a estudar se coloca periarteriolarmente (cerca

de 30µm do vaso) e entre um a dois diâmetros de disco, com difusão

obrigatória para o vítreo adjacente (que serve de suporte mecânico e de

nutrição às arteriolas retinianas), pelo que nos pareceu pertinente,

apresentar ainda que sumariamente, algumas características desta

substância (vítreo).

O vítreo é um hidrogel com um volume aproximado de 3,9 ml no

adulto humano jovem (Tolentino et al., 1976), rico em colagénio, ácido

hialurónico e água (99% do seu peso). As duas primeiras substâncias são

responsáveis pela sua viscosidade e consistência, formando o colagénio

uma malha densa que dá suporte ao ácido hialurónico. Hamburg, em

1959, teria já descrito estas fibrilhas de colagénio do vítreo, sendo mais

finas e sem a estriação característica de outros tecidos. A sua

concentração em glicoproteínas (Jaffe, 1969) é diferente do colagénio

habitual, podendo ser degradadas por enzimas proteolíticas (Hogan e

52

Zimmerman, 1962). A neutralização do ácido hialurónico pode originar

o colapso do colagénio e, em consequência, a diminuição do volume do

vítreo. Além destes três constituintes encontram-se ainda, no vítreo,

glicoproteínas e albumina, glicose, aminoácidos livres e electrólitos que,

dentro da cavidade vítrea, estão em contacto directo com as arteríolas

retinianas.

A composição do humor vítreo apresenta bastantes semelhanças

com a do humor aquoso e parece existir uma difusão relativamente livre

quer entre estas estruturas e através do vítreo (Cunha-Vaz e Maurice,

1967). A sua estreita relação morfológica com a retina, o cristalino e o

humor aquoso, leva à existência de trocas de substâncias que são, em

última instância, determinantes da sua composição química (Adler,

1998).

O humor vítreo do coelho apresenta analogias morfo-funcionais

com o do ser humano do qual difere apenas por se encontrar em contacto

directo com os vasos retinianos (Cunha-Vaz, 1967).

A componente principal das arteríolas retinianas são as células

endoteliais. Histologicamente, no Homem, o seu núcleo varia em

tamanho e forma. As células são, de um modo geral irregulares, ovais ou

planas com partículas de cromatina, e coram de azul. Outro tipo celular,

as células murais, são indiferenciadas: o seu núcleo não é esférico e

varia em forma, podendo ser oval e alongado. Observadas em

microscopia óptica são mais escuras, mais pequenas que as endoteliais e

com partículas cromatínicas mais grossas. Não se encontram distribuídas

regularmente pelas paredes capilares. Como os vasos coroideus, as

arteríolas retinianas apresentam três túnicas: íntima, média e adventícia.

A íntima é formada por uma membrana basal na qual assenta o

53

endotélio. A média, próximo da papila, apresenta 5-7 camadas de células

musculares lisas, com miofilamentos bastante desenvolvidos, rodeadas

também de uma membrana basal. Entre as células musculares

encontramos numerosas fibras de colagénio. A adventícia é uma camada

espessa de fibras de colagénio, em contacto directo com a membrana

basal (Adler et al., 1998).

O endotélio vascular retiniano do coelho foi comparado ao

humano em estudos de microscopia de varrimento e, mais recentemente,

utilizando Ressonância Magnética Nuclear (RMN) com contraste em

tempo real (real-time contrast). Este endotélio é estrutural e

funcionalmente diferente dos restantes do organismo. Os estudos com

recurso à RMN (De Juan et al., 1987) confirmam outros anteriores,

informando que o endotélio dos vasos retinianos do coelho é do tipo não

fenestrado que resiste à passagem de pequenas moléculas como a

albumina, inulina e fluoresceína para o vítreo (fenómeno idêntico ao que

ocorre na espécie humana) (De Juan, 1992). As células endoteliais dos

vasos retinianos e do cérebro demonstraram apresentar características

histoquímicas diferentes de outras células endoteliais vasculares: as

membranas abluminais do endotélio cerebral contém grande quantidade

de Na+/K+ ATPase e elevada concentração de mitocôndrias, cerca de 5-

6 vezes mais do que no músculo esquelético (Murta, 1990).

As arteríolas humanas apresentam um calibre inferior a 300µm,

sem lâmina elástica interna, com uma camada muscular descontínua e

com uma íntima reduzida à camada endotelial (Friendwald et al., 1952).

De salientar que a noção da existência, na retina, apenas de arteríolas e

não de artérias, embora contestada por Hogan e Feeney (1963) e outros

autores, é de especial importância para uma interpretação mais correcta

54

da patologia arteriolar retiniana no estudo que nos propomos

desenvolver.

Localizadas na camada de fibras nervosas e células ganglionares,

as arteríolas retinianas, quando examinadas ao microscópio electrónico,

apresentam: uma camada interna de células endoteliais orientadas de

modo paralelo ao eixo do vaso; uma camada de células musculares lisas

orientadas circular e longitudinalmente; uma adventícia composta por

fibras colagénicas dispostas obliquamente ao eixo do vaso. No lado

externo, as arteríolas estão separadas da camada de células nervosas

pelas membranas basais das células da glia e de Muller (Hogan e

Feeney, 1962; Missoten, 1964). Aparecem com frequência células

musculares lisas na adventícia. As células endoteliais encontram-se

separadas da primeira camada de células musculares por uma membrana

basal comum, que apresenta pequenos aglomerados de fibras

colagénicas, mas são isentas de elastina. As restantes camadas de células

musculares encontram-se separadas umas das outras por membranas

basais com quantidades crescentes de fibras de colagénio, e uma

espessura crescente à medida que se caminha para a adventícia. A

laminação e a cavitação da membrana basal são evidentes para o lado do

lúme do vaso, apresentando-se alguns agregados osmiofílicos em

algumas destas cavitações (Murta, 1990).

As células musculares lisas que envolvem as arteríolas não

apresentam estrutura diferente das restantes de outros tecidos orgânicos.

De entre os animais mais frequentemente utilizados em estudos

experimentais (macaco, coelho, gato e rato), as suas arteríolas retinianas

apresentam uma estrutura bastante semelhante à do Homem, à excepção

de uma menor quantidade de camadas de células musculares,

membranas basais de menor espessura e menor número de cavitações,

55

sem depósitos densos, e adventícias mais finas; no rato, por exemplo,

não se encontra qualquer camada adventicial (Hogan e Feeney, 1962).

56

CAPÍTULO II

O B J E C T I V O S

57

CAPÍTULO II

2.1- JUSTIFICAÇÃO E DEFINIÇÃO DOS OBJECTIVOS

Fundamentos para a definição dos objectivos

A circulação retiniana é uma complexa estrutura de artérias,

arteríolas, veias, vénulas e capilares provenientes do disco óptico, que

nutre a retina desde a camada nuclear interna até às fibras do nervo

óptico (Leber, 1903). Apresenta valores tensionais elevados, existindo

valores idênticos entre a artéria oftálmica e a artéria carótida interna

(Pournaras, 1999). A retina é uma estrutura muito vulnerável a

obstruções de fluxo, traduzidas por isquémia. Este fluxo é regulado pelo

sistema nervoso autónomo, com excepção dos vasos retinianos. A

artéria oftálmica é ricamente enervada por fibras simpáticas até à lâmina

crivosa. A partir desta estrutura, não existe controlo da circulação

retiniana através do sistema nervoso. Apenas a coróide apresenta

controlo simpático, embora com uma flutuação de respostas a agonistas

simpáticos que, paradoxalmente, não é sempre idêntica (Dollery, 1963;

De Laye, 1998). No entanto, a administração sublingual de

nitroglicerina, por exemplo, aumenta o calibre das arteríolas retinianas.

O orgão efector do controlo autonómico é o músculo liso, cujo tónus

controla os diâmetros vasculares retinianos e a circulação sanguínea

(Alm, 1992). A falência deste mecanismo de auto-regulação é

responsável pela maior parte das doenças, como a RD e a retinopatia

58

hipertensiva (RH). A reactividade vascular vai-se degradando,

diminuindo com o avançar da idade, o que condiciona uma evolução

mais rápida da patologia citada nos idosos (Alm, 1992).

O efeito negativo de algumas doenças, como a Diabetes Mellitus,

sobre a BHR é ainda objecto de alguma polémica (Cunha-Vaz, 1979,

2004; Klein, 1980). As modificações no fluxo sanguíneo retiniano

associadas a este tipo de Diabetes são controversas e a relação destas

modificações de fluxo entre artérias, veias e capilares retinianos sempre

permaneceu também algo confusa (Blair, 1983; Grunwald, 1986;

Flammer, 2008).

O terço externo da retina, o corpo ciliar e algumas porções do

nervo óptico são irrigados pela circulação coroideia (Flammer, 2008). O

fluxo para a coróide provém das artérias longas e curtas posteriores, que

são ramos directos da artéria oftálmica, por sua vez ramo da carótida

interna (Chambers, 1994).

Na RD e nas oclusões venosas e arteriais, o envolvimento

vascular está razoavelmente estudado, não acontecendo o mesmo para o

glaucoma e a doença macular relacionada com a idade (DMI), onde a

compreensão dos fenómenos hemodinâmicos está a emergir só

lentamente (Harris, 2005; Flammer, 2008). Factores como as

necessidades metabólicas, a cedência de nutrientes, os produtos

metabólicos de passagem, a pressão de perfusão, os gases do sangue, a

diminuição do O2 e do metabolismo oxidativo com aumento da glicólise

anaeróbica estão sendo cada vez mais apontados como determinantes da

doença (Rechtman, 2005). No mesmo sentido operam as modificações

bioquímicas retardadas que ocorrem na sequência de produtos

resultantes da hidrólise de fosfolípidos (ácidos gordos polinsaturados,

eicosanoides, etc.), de monoaminas (5-HT), neuropeptídeos, radicais

59

livres, catiões e aminoácidos que têm um papel autodestrutivo nos

tecidos do SNC e na retina (Bartlett, 1994).

Os estudos in vivo no olho procuram esclarecer o comportamento

vasomotor e modulador de um conjunto de substâncias vasoactivas

endógenas e de outras exógenas sobre a circulação retiniana, em

condições de normalidade e em situações patológicas onde estarão

eventualmente modificadas qualitativa e quantitativamente (Pardridge,

1977; Brazitikos, Pournaras, 1996). Numa primeira fase recorremos a

um modelo experimental normal e, posteriormente, a modelos de

diabetes aloxânica e de glaucoma, para comparar as diferenças

encontradas.

A identificação dos mediadores com papel na regulação desta

homeostase é de capital importância para a estabilização numa fase

precoce, ou mesmo reversão das patologias já indicadas, através de

fármacos administrados por via sistémica ou aplicados in situ, mediante

o recurso a técnicas de micropunção vítrea e vascular. Embora o

interesse do estudo da circulação coroideia na diabetes pareça ser de

valor relativo, uma vez que a esse nível as alterações são inespecíficas

(Cunha-Vaz, 2004), justifica-se a nossa preocupação em estudar a

reactividade vascular retiniana. Os produtos das células endoteliais são

os principais responsáveis pela auto-regulação em resposta ao stress

fisiológico, na retina e na coróide.

As tentativas de tratamento farmacológico de várias doenças

retinianas provocadas por condições de isquémia com agentes

vasodilatadores administrados por via sistémica, têm sido infrutíferas.

Existem, no entanto, estudos sugestivos de que os fármacos

60

administrados por via endovenosa e intraocular podem ter algum efeito

sobre a circulação retiniana (Alon Harris, 2008) e é conhecida a

possibilidade de se induzir um espasmo arteriolar retiniano através da

aplicação tópica (intraocular) e endovenosa de papaverina, tolazolina e

benzoato sódico de cafeína (De Santis, 1994). Estes factos adquirem

maior consistência quando se sabe que pequenas moléculas, de peso

molecular entre 400-500 daltons, podem passar a BHR (Flammer,

2008). Parece importante referir que o peptídeo relacionado com o gene

da calcitonina (CGRP) dilatou as arteríolas retinianas, um dado obtido

em estudos experimentais in vivo (Prieto et al., 1991).

A maioria dos receptores vasculares, em grande parte dos órgãos,

situa-se a nível das células musculares lisas. No entanto, a nível dos

vasos retinianos, alguns autores situam-nos nos pericitos (Khoner,

1994), células que apresentam uma semelhança morfo-funcional com as

células musculares contrácteis. Não obstante os pericitos serem células

contrácteis análogas às do músculo liso, o estímulo fisiológico para a

sua contracção permanece desconhecido (Kohner, 1994). Estudos auto-

radiográficos demonstraram a existência de receptores adrenérgicos β2

nos vasos retinianos humanos (Denis, 1990) bem como a presença de

receptores histaminérgicos H1. Alm, em 1992, fazendo uma revisão

teórica sobre a regulação fisiológica e farmacológica do fluxo sanguíneo

do nervo óptico, afirmou que o endotélio dos vasos retinianos e dos que

se situam em redor do disco óptico, produzem substâncias

vasoconstritoras potentes e vasodilatadoras e que a BHR protege os

receptores do músculo liso de agentes não dependentes do endotélio.

61

Estudos de Ressonância Magnética Nuclear com ácido gadolinium

dietilenetriaminopenta-acético (Gd-DTPA) como traçador,

demonstraram a ruptura da BHR em coelhos in vivo (Eugen de Juan,

1992; Berkowitz, 1992; Sato, 1993). A retina vascular do coelho

apresenta, segundo estes estudos, uma BHR análoga à dos humanos,

constituída por endotélio com tight junctions de tipo não fenestrado, que

restringe a passagem de pequenas moléculas, como a albumina e a

fluoresceína para o vítreo. É nutrida pela circulação coroideia, da qual

está separada pelas tight junctions do epitélio pigmentar retiniano

(RPE), de maneira idêntica à BHR externa no homem (Vinores et al.,

1992).

Já em 1966, Shakib et al. haviam demonstrado que as junções

interendoteliais dos vasos da retina eram diferentes daquelas

encontradas em outros vasos. Foram descritas como zonulae occludens

que, pela sua extensão, selavam o espaço intercelular; seriam mais tarde

confirmadas no cérebro e na retina, utilizando a peroxidase (Reese,

1967; Shiose, 1970) e a microperoxidase (Abdel e Smith, 1975) como

substâncias marcadoras. Estas junções estabelecem gradientes de

concentração através das membranas em que se localizam e estão

geralmente associadas a mecanismos de transporte activo

extraordinariamente selectivos, através das membranas celulares, que

contêm ocludinas e claudinas. Os aniões orgânicos e a glicose, por

exemplo, são transportados activamente através do endotélio retiniano,

um aspecto importante para a homeostase retiniana (DiMattio, 1981). As

características morfofuncionais da componente vascular da BHR são de

importância elevada, pois a alteração funcional desta barreira

desempenha um papel fundamental na fisiopatologia das doenças da

retina (Cunha-Vaz, 1979; Tornquist, 1979).

62

A utilização da fluorofotometria do vítreo (método quantitativo e

sensível de avaliação da permeabilidade da BHR) demonstrou alterações

da permeabilidade desta barreira, antes do aparecimento das alterações

patológicas retinianas, nomeadamente na Diabetes Mellitus (DM). Este

conhecimento foi determinante porque direccionou as atenções da

investigação para as alterações precoces nesta patologia. Ficou

demonstrado que doentes com DM tipo I e RD não detectável

clinicamente, mostravam alterações funcionais da BHR, que podia ser

revertida pelo controlo rigoroso da hiperglicémia com insulina

(Waltman, 1979). Ficou ainda cientificamente comprovado que a

deterioração progressiva da BHR nos diabéticos em fase inicial de

retinopatia diabética poderia ser estabilizada pela administração de

novos fármacos (Cunha-Vaz et al., 1992; 2004; Nilsson, 1996).

A regulação do fluxo sanguíneo retiniano, quando sujeito a

varições metabólicas e iatrogénicas, foi estudado com recurso ao

“Heidelberg Retina Flowmeter” em adultos jovens, após exercício

moderado, por Lanzl et al. (1996; 1999) que confirmaram a existência

de mecanismos de auto-regulação a nível da retina e disco óptico. Zheng

e Kanamoto (1996) mostraram que o bloqueio do gânglio ciliar em

humanos aumenta o fluxo sanguíneo retiniano, mas não altera o

diâmetro vascular e Rosenblatt et al. (2005) demonstraram que o CGRP

aumenta o fluxo sanguíneo retiniano através de mecanismos

vasodilatadores.

Diversos outros trabalhos, versando a influência dos factores

metabólicos sobre o débito sanguíneo retiniano têm já comprovado as

alterações morfofuncionais que aí ocorrem. Estas alterações

vasomotoras traduzem assim, indirectamente, a acção da BHR com o

seu papel regulador da homeostase retiniana (Tsacopoulos, 1997).

63

Na Diabetes a velocidade de fluxo está aumentada, por

vasodilatação; no Glaucoma diminuída, por vasoconstrição; o

estreitamento vascular foi inclusivé demonstrado, além da hipertensão

ocular, como factor preditivo do glaucoma (Angélica et al., 2001). É a

desregulação vascular (que precede o aparecimento do glaucoma) que

leva à diminuição da pressão de perfusão e à auto-regulação, já

insuficiente na doença. Esta instabilidade de perfusão conduz à isquémia

e danos de reperfusão, o designado síndrome primário de desregulação

vascular que ocorre no glaucoma, segundo este autor e que deve ser

substituido pela anterior designação de síndrome vasospástico. O

síndroma secundário resulta de uma desregulação geral sistémica,

devido a patologia diversificada como acontece na esclerose múltipla, a

arterite de células gigantes e outras (Flammer et al., 2005, 2007).

2.2- OBJECTIVOS ESPECÍFICOS

A contribuição da farmacologia clássica para o estudo da

reactividade vascular retiniana, pelo recurso a métodos baseados em

respostas contrácteis ou relaxantes das arteríolas a vários agonistas,

utilizando o clássico banho de órgãos e registador acoplado para a sua

avaliação, não é exequível, dada a fragilidade e reduzidas dimensões dos

vasos retinianos. Também a obtenção de dados in vivo no olho tem sido

limitada por problemas anatómicos associados à dificuldade de acesso

aos vasos, sem lesar estruturas adjacentes nem perturbar o equilíbrio

homeostático dos modelos, apesar dos vasos retinianos do coelho serem

64

particularmente indicados para este tipo de estudo, porque as suas

paredes estão completamente livres de tecido glial e em contacto directo

com o vítreo (Cunha-Vaz, 1967). Estudos ultraestruturais e de

permeabilidade demonstraram que estes vasos apresentam as

características próprias dos vasos humanos (Murta, 1990).

O estudo que pretendemos efectuar sobre os vasos retinianos

justa-papilares in vivo no coelho, em condições normais e em duas

patologias subjacentes, a Diabetes Mellitus e o Glaucoma,

respectivamente a primeira e segunda causa de cegueira no Mundo, foi

desenvolvido com recurso a metodologia que considerámos adequada à

satisfação dos objectivos. Propusémo-nos desenvolver um modelo de

avaliação do diâmetro arteriolar que permitisse o estudo do efeito

vasoactivo de substâncias endógenas e de síntese, aplicadas por via

intra-vítrea, junto aos vasos da retina, com a finalidade de apreciar as

possíveis modificações arteriolares e a capacidade de modulação do

tónus vascular. Uma das dificuldades da concretização deste método

assenta no modo de execução das medidas vasculares, que acreditamos

ter conseguido ultrapassar. A identificação de mediadores com papel na

regulação desta homeostase vascular seria de grande importância para a

tentativa de estabilização ou reversão das patologias referidas

anteriormente, numa fase inicial da doença, mediante o recurso a

fármacos eventualmente aplicados por micropunção vítrea ou vascular.

Os resultados obtidos com técnicas orientadas para o cálculo do

débito circulatório retiniano têm sido contraditórios, porque as

condições de observação foram sendo modificadas pelos diferentes

investigadores (Pournaras et al., 1996). Aos vários tipos de medida

65

propostos como o método de diluição com fluoresceína (Kohner, 1992),

o laser doppler (LDV)- Riva et al., (1986), o oftalmoscópio de

varrimento por laser (SLO), entre outros, que permitem também a

avaliação rigorosa dos diâmetros vasculares (Canon, 2004), associaram-

se técnicas quantitativas e qualitativas de análise morfológica e

fisiológica em vasos retinianos de que se destacam:

- Fotografia do fundo ocular directa (simples) com retroprojector

de imagem (após utilização de angiógrafo para angiografia

fluoresceínica simples ou após processamento de imagem);

- Videomicroscopia com sistema de processamento de imagem

digitalizada;

- Utilização de lipossomas (incorporação e encapsulamento de

corantes fluorescentes como medida da velocidade eritrocitária);

- Calorimetria;

- Desintegração radioactiva de Krypton-85;

- Microsferas marcadas com isótopos radioactivos;

- Polarografia (clearance de hidrogénio);

- Laser Doppler Flowmetry;

-Oftalmoscópio de Varrimento (Scannig Laser Ophthalmoscope-

SLO) simples ou associado a vídeo;

- Tomografia de Varrimento por Laser Confocal (Confocal

Scanning Laser Tomography);

- Ressonância Magnética Nuclear (RMN) com partículas de óxido

de ferro;

- Heidelberg Retinal Flowmeter (HRF);

- Color Doppler Image (CDI);

- GDX-VCC polarometria.

66

As duas primeiras desta listagem têm permitido, a um vasto grupo

de investigadores na área, medir e comparar diâmetros vasculares.

Todavia, a falta de exactidão nestas medições, originando erros de

leitura estatisticamente significativos, fizeram-nos optar, numa primeira

fase, pelo sistema digitalizado angiográfico (IMAGEnet 1024 da

TOPCON e do modelo 450 IFR ZEISS) que, além da sua alta

sensibilidade, permite decompor e efectuar um tratamento e análise da

imagem obtida em vasos retinianos sob diversos ângulos e de formas

diversas (por exemplo, em relevo), aumentando a especificidade do

método, a sua reprodutibilidade e, consequentemente, uma maior

exactidão nestas medições (Bursell et al., 1992). Oferece ainda a

possibilidade de optar por uma de duas formas de quantificação dos

diâmetros vasculares: em pixeis ou em escala aritmética (milimicras).

O desenvolvimento de um modelo experimental que permitisse a

manipulação directa dos vasos retinianos in vivo teve um interesse

básico e clínico imediatos. Com recurso a técnicas de microinjecção

perivascular nos vasos da retina em coelhos normais, diabéticos e

glaucomatosos, procurou-se estudar in vivo, pelo recurso a técnica de-

senvolvida no nosso laboratório, a reactividade vascular a fármacos

específicos, no coelho albino. A acessibilidade directa aos vasos da

retina e a exequibilidade desta técnica foi já reproduzida em publicações

anteriores (De Juan Jr et al., 1987; Tornquist et al., 1979; Gaspar et al.,

1992; 2004). Os vasos retinianos do coelho são particularmente

apropriados para este estudo em virtude da sua localização, ao nível da

superfície da retina, em contacto directo com o vítreo, permitindo assim

o acesso fácil, visualização directa e consequente análise

67

morfofuncional (sem alterar o meio fisiológico), quando expostos a

variações qualitativas e quantitativas de diversos compostos.

A identificação farmacológica de receptores processou-se pelo

recurso a agonistas e antagonistas selectivos para os diferentes subtipos

de receptores. A análise do sistema do segundo mensageiro pelo recurso

a fármacos activos a nível das proteínas G e enzimas ligadas às

membranas não foi efectuada (Movahedi et al., 1997).

O sistema serotoninérgico, recentemente implicado na regulação

vascular de patologias como o glaucoma normotenso, bem como o

sistema neuropéptidérgico, pela sua acção vasodilatadora ainda pouco

conhecida em certos domínios oculares, mas com funções na regulação

vasomotora cerebral, incluindo os fénomenos de isquémia (Cohen et al.,

1999; Brust et al., 2000, Flammer et al., 2008) constituiram o ponto de

partida do nosso trabalho experimental. Com base na evidência

funcional de que o relaxamento das artérias cerebrais induzido pela

estimulação de nervos não adrenérgicos e não colinérgicos é mediado

pelo NO (Toda e Okamura, 1993) e do conhecimento, por

imunohistoquímica, de que a NOS está concentrada nas fibras nervosas

autonómicas na retina e vasos sanguíneos (Bredt et al., 1990),

pretendemos identificar qual a sintetase (NOS) responsável pelo

controlo da tensão intraocular (TIO) em animais com glaucoma

experimental induzido, associando o uso de inibidores da NOS.

Estudámos:

1. O efeito da Serotonina (5-HT) e de agonistas dos vários

subtipos de receptores 5-HT e recorremos ao uso de antagonistas

68

específicos para a identificação dos vários subtipos de receptores

envolvidos;

2. A presença de receptores para os componentes do grupo das

Taquicininas (péptidos vasoactivos que regulam a função neuronal

sensorial) e incluimos: a Substância P (SP), um transmissor importante

nos neurónios sensoriais; a Neurocinina A (NKA) e a Neurocinina B

(NKB), ambas responsáveis pela mediação neurogénica sensorial em

vários orgãos e em processos de natureza inflamatória (Flammer et al.,

2005; Wong et al., 2006); o Peptídeo Relacionado com o Gene da

Calcitonina (CGRP) que se encontra com a SP em fibras nervosas

sensoriais e cuja libertação do nervo trigémio desempenha um papel

central na fisiopatolgia da enxaqueca.

3. A participação do Óxido Nítrico na patogenia do glaucoma;

4. Em animais diabetizados com aloxana tentámos reproduzir o

efeito dos neurotransmissores e comparar os resultados obtidos com os

de estudos indicados em alíneas anteriores;

5. Após criação de um modelo experimental de glaucoma,

registámos as alterações observadas comparativamente aos dos animais

controlo;

6. Tendo presente que os estudos de vasomotricidade ocular

através da medição de diâmetros vasculares, implicam também estudos

hemodinâmicos de fluxo sanguíneo em paralelo (Flammer et al., 1996,

2005, 2008; Harris et al., 2004, 2005) propusémo-nos analizar as

69

diferenças de fluxo retiniano em algumas arteriolas estudadas, com

recurso a um dos meios de cálculo das velocidades de fluxo em

experimentação básica, o Ecodopler Oftálmico, utilizando o Color

Dopller Image (CDI) (Pourcelot, 1975; Harris, Arend, 1994), que

continua a ter relevância clínica em estudos como o ”Baltimore Eye

Survey-2007/2008”. A investigação clínica analiza já velocidades e

resistências, além de diâmetros vasculares retinianos a um ou dois

discos de diâmetro em crianças, adultos e em diferentes etnias (Harris e

Schimetterer, ISOPT, 2006).

70

CAPÍTULO III

M A T E R I A L E M É T O D O S

71

CAPÍTULO III

3.1 MATERIAL E MÉTODOS

Todas as experiências foram conduzidas em respeito pelas

normas da Comunidade Europeia para a Experimentação Animal,

Normas Nacionais (publicadas em Diário da República- DR, Série I,

nº145 de 26.06.95) e ainda da Association for Research on Vision and

Ophthalmology (ARVO) dos Estados Unidos da América, para a

utilização de Animais em Experimentação Oftálmica e da Visão. As

experiências decorreram segundo as normas citadas e ouvida a

Comissão de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de

Coimbra.

3.1.1- Modelo animal utilizado e avaliação de parâmetros

Para a concretização dos objectivos referidos servimo-nos de um

animal largamente utilizado em farmacologia oftalmológica

(Oryctolagus cuniculus)- o coelho albino, raça Nova Zelândia (Candia et

al., 2005; Herok et al., 2008; Paulus et al., 2008; Chang et al., 1999;

Cong et al., 2008) de ambos os sexos, da mesma ninhada (foram usados

pelo menos 6 animais para cada dose de fármaco a ser avaliado), com

72

peso inicial variando entre o 2 e os 3 Kg (atingindo após a indução de

diabetes aloxânica valores de 4,5 Kg), fornecido por um criador dos

mesmos.

A manutenção e preparação dos animais foram efectuadas em

Biotério que possui instalações e meios adequados para o efeito. Para as

experiências a efectuar dispusemos de um laboratório de cirurgia

experimental com excelentes condições, encontrando-se equipado para

realizar este tipo de ensaios e usado, em cada experiência,

exclusivamente para este tipo de estudo.

Utilizou-se um sistema de microeléctrodos sensíveis ao pH

ArrowLabb (TM) Systems que foi colocado intraocularmente em

posição justa arteriolar, possibilitando a medição do pH antes e após as

experiências, com intenção de manter os valores fisiológicos exigidos na

área a avaliar. Quando estes foram utilizados conjuntamente com o

sistema de microinjecção vítrea dos fármacos a testar, fez-se uma

segunda esclerotomia para a sua inserção dentro do globo ocular (a

primeira esclerotomia é a que se realiza para introdução do sistema de

microinjecção com pipetas de diferentes calibres, descrita em pormenor

mais adiante). Esta intervenção não foi isenta de riscos (o trabalho

executado in vivo assim o determina), mas permitiu-nos assegurar a

vigilância estreita de todos os parâmetros fisiológicos, facto necessário

para a reprodutibilidade da técnica. Todas as experiências foram

realizadas entre as 9:00 e as 12:00 horas.

Colheram-se amostras de sangue arterial dos animais para

gasometria:

pH:7,40±0,03

PaO2:104,2mmHg

PaCO2:41±0,2mmHg

73

HCO3:28±0,5mEq/L

SaO2: igual ou superior a 95%

antes e após cada experiência, no sentido de observar eventuais

variações destes valores. Os coelhos em que os valores observados se

situavam fora do intervalo de valores considerados normais para a idade

e peso dos animais segundo tabelas estandartizadas, eram rejeitados. O

registo de ECG foi obtido por colocação de eléctrodos nos membros. A

pressão arterial foi avaliada continuamente após canulação da artéria

carótida sob sedação do animal (valores médios: 110 mmHg sistólica e

60 mmHg diastólica).

3.1.2- Preparação e experimentação de vários tipos de micropipetas

de microinjecção

A preparação das micropipetas para a realização das experiências

foi executada no nosso laboratório, utilizando sofisticadas técnicas

micrométricas sob visualização microscópica. As pipetas de

micropunção foram preparadas a partir de pipetas de vidro "Pirex" não

filamentoso, com cerca de 1,2 mm de diâmetro externo e 1,0 mm de

diâmetro interno (Drummond Scientific, Broomall Pa.). Estas pipetas

foram inicialmente estiradas numa extremidade até ficarem com cerca

de 80 µm de diâmetro, num estirador de micropipetas (Stoelting Co,

Chicago lll), para que pudéssemos aproximar em segurança do vaso

pretendido sem lesionar qualquer estrutura adjacente e para que a sua

progressão no interior do humor vítreo fosse facilitada.

Depois, com o auxílio de uma microforja (Stoelting Co, Chicago

lll) foram moldadas as pontas e as formas das micropipetas. As pontas

dessas pipetas com diâmetros externos compreendidos entre 20 e 30 µm

74

podem conter cerca de 10-20 µl de solução a injectar. A pressão de ar a

utilizar é cerca de 50 psi aplicada conjuntamente com a substância a

injectar em 5 segundos (bólus).

A pressão intraocular foi medida recorrendo a tonómetro de

Schiotz (tonometria de indentação) com 3 medições consecutivas

intercaladas por períodos de trinta minutos. Parece importante referir

que não houve variação da pressão intraocular (média±erro padrão:

22mmHg±0,3) durante todas as experiências, apesar do somatório de

líquido injectado atingir valores entre os 50 e os 100 µl. O volume

intraocular do humor vítreo (100 µl) manteve-se constante, dada a

rapidez de autoregulação verificada nos coelhos normais e a execução

técnica. Na necessidade de aumentar o número de doses crescentes a

injectar a nível do vítreo, optou-se por realizar uma vitrectomia

localizada junto ao local da ferida escleral, para diminuir o conteúdo

vítreo a nível da pars plana mantendo, contudo, o vítreo justa-

arteriolar íntegro, sem modificar o meio interno do globo ocular,

qualitativa e quantitativamente. Foram realizadas paquimetrias antes

das avaliações de TIO com aparelho portátil PachPen® da

Accoutome (valores médios de 457±2 µm).

3.1.3- Padronização das técnicas de microinjecção intraocular in

vivo, a nível dos vasos retinianos

Os coelhos foram anestesiados com Cetamina, 25 mg /Kg por via

intramuscular, suplementando posteriormente a anestesia geral, sempre

que necessário, sem ultrapassar 50 mg / Kg. Após imobilização do globo

75

ocular com um dispositivo estereotáxico a uma distância fixa da lente da

câmara, as pupilas foram dilatadas através da instilação tópica de duas

gotas de ciclopentolato (0,5%) uma por cada olho, que proporciona uma

midríase por tempo suficiente, uma vez que cada experiência, após

visualização dos vasos retinianos, se desenrola num espaço de tempo

curto (30 minutos). Fixou-se a cabeça a suporte adequado (Stoelting Co,

Chicago lll) com grampos de apoio mandibulares. Uma vez exposta a

esclera, foi efectuada uma incisão na pars plana, para permitir a

introdução de micropipetas que possibilitaram a administração das

substâncias em estudo.

A temperatura corporal foi mantida entre os 38-39º (temperatura

rectal) com o auxílio de uma manta térmica colocada sobre o animal,

durante todas as experiências. O coelho foi, depois, posicionado no

suporte estereotáxico já referido (que pode ser movimentado

independentemente em três planos XYZ) e fixo a nível mandibular

através de grampos, de modo a que o globo ocular fique voltado para o

operador e imobilizado a distância fixa da lente da câmara que procederá

à obtenção de imagens (Fig. 6).

A microinjecção intravítrea e perivascular de fármacos nos vasos

da retina foi conseguida através de um sistema de micropipetas

concêntricas, fixado num microavançador mecânico especialmente

concebido para o efeito, e que se encontra acoplado a um

micromanipulador inclinado do tipo "Prior". O microavançador contém

dois suportes circulares de micropipetas e permite realizar movimentos

micrométricos independentes de cada pipeta.

76

Fig.4-Fotografia do sistema de micropipetas a inserir intraocularmente.

77

Fig.5- Esquema do “locus” de microinjecção dos fármacos a testar.

O suporte mais anterior, montado mais próximo do globo ocular,

segura uma pipeta externa que é usada como manga protectora daquela

que efectua a microinjecção. Esta pipeta é montada no suporte seguinte

e pode ser movimentada independentemente, no interior da pipeta

externa. A pipeta de microinjecção é, então, introduzida dentro do globo

ocular após incisão cirúrgica, via pars plana, e colocada, mediante

visualização por angiógrafo, junto à arteríola que se pretende estudar,

sendo depois fixada e mantida nessa posição a uma distância sempre

78

idêntica para cada conjunto de experiências. Uma terceira pipeta

concêntrica, fixada no último suporte, pode mover-se no interior da

pipeta de microinjecção, podendo ser utilizada para a recolha de

amostras do vítreo nela contido. Utilizou-se apenas na avaliação

qualitativa do humor vítreo. Este sistema permitiu inicialmente uma

maior segurança na execução experimental. Contudo, com o

desenvolvimento da técnica impondo precisão de movimentos da parte

do operador, as micropipetas externas deixaram de ser necessárias.

Foram efectuadas de seguida duas incisões esclerais a cerca de 2-

4 mm do limbo. A distância horizontal de 2 mm entre as duas suturas,

uma vez cauterizada com diatermia, foi aberta com a ponta de um

bisturi. Após a incisão da esclerotomia (sempre inferior, de forma a

facilitar o acesso à medição de fluxos por doppler) foi colocada uma

pequena pipeta dentro do globo ocular, através da abertura escleral, e

posicionada manualmente para visualizar o melhor ângulo para a

microinjecção. A pipeta externa do sistema de micropipetas foi então

alinhada de modo a ficar paralela à pipeta introduzida manualmente.

Esta última é posteriormente removida e substituída pelo sistema de

micropipetas já anteriormente referido, fixas ao micromanipulador.

A pipeta de microinjecção é então avançada cuidadosamente sob

visualização do angiógrafo, usando o movimento fino do mecanismo de

avanço do micromanipulador. Os ajustes mais finos da sua posição são

realizados com o micromanipulador que suporta o sistema de

micropipetas. A restante circulação retiniana e coroideia, facilmente

visualizada sob o angiógrafo, é evitada. É possível, então, o estudo

directo, objectivo, in vivo, da microcirculação retiniana.

79

Após um período de equilíbrio de aproximadamente quinze

minutos procedeu-se à avaliação do efeito dos diferentes agentes

farmacológicos sobre o tónus arteriolar. Curvas de dose-resposta para

estes agentes foram obtidas pela injeção cumulativa de doses crescentes

de agonistas em bólus, aplicadas com pressão e sempre no mesmo

volume (10 µl), via pars plana, através da micropipeta de vidro com a

ponta localizada 10-30 µm do vaso a ser avaliado. Com agonistas

vasodilatadores as curvas só foram efectuadas após contracção prévia do

vaso com sumatriptano (SUM; 1 mmole/l) por via intravítrea. Quinze

minutos antes da administração do SUM, foi administrado o antagonista

ou o seu solvente. Depois cada agonista foi adicionado

cumulativamente. Em todas as experiências foi efectuada a

microinjecção (bólus de 10 µl de cada vez) da solução polielectrolítica

estéril, no olho adelfo de cada coelho, como controlo.

3.1.4- Análise de fluxos com CDI (collor doppler image)

As experiências foram efectuadas com o recurso ao aparelho

doppler Siemens/Sonoline G50-MCMDO 1AA, com transducer de 6.0

Hz.

As velocidades de fluxo nas arteríolas (com diâmetro médio de

50±6 µm) foram efectuadas em áreas de 10X10 pixéis (área necessária

para o cálculo da velocidade). Foi necessário optimizar todas as

medições através da calibração e análise de intervalos de confiança. O

que se mediu foram valores relativos e não absolutos de fluxos (Alm,

2004 e Flammer, 2005) afirmam, por exemplo, referindo-se a este tipo

de estudos que o que se mede é o índice de resistência e não

80

propriamente fluxos; a velocidade, o fluxo, calculado a partir desta, e a

pressão de perfusão são os dados mais importantes a obter.

O estudo com o doppler (CDI) permite, em acréscimo, a análise

morfológica (pulsatilidade, calibre, espessamento, preenchimentos

endoluminais e assimetrias de calibres), além da medição de fluxos e sua

orientação, espectros laminares, zonas de turbulência e aceleração de

velocidades.

No coelho normal os estudos espectrais com triplo varrimento

(scan-triplex) revelam normalmente fluxos bifásicos normais, arteríolas

permeáveis e de calibre normal, sem alterações hemodinâmicas; o fluxo

costuma ser laminar, sem alteração da espessura da parede e das

velocidades arteriolares em condições de repouso. A velocidade de fluxo

(em coelhos a nível das arteríolas peripapilares da retina) é em média de

15,1±2,3 cm/s. Por exemplo, após a administração de Indometacina i.v.

(20 mg/Kg) na veia marginal da orelha do coelho para inibição de

agentes pró-inflamatórios (concretizada em algumas experiências por

alguns autores), a velocidade ou se reduz por vasoconstrição (Bill, 1984)

ou se mantém, não existindo um consenso. No Homem os valores

genéricos das velocidades sistólicas são: artéria oftálmica: 45-31 cm/s;

artéria central da retina: 15 cm/s (que é similar, por extrapolação

algorítmica, às retinianas justapapilares (Cantaloube, 1996; Lee, 2000)

ou ainda (de difícil medição) às ciliares curtas posteriores (Barbosa et

al., 2004).

O fluxo = distância/ tempo (velocidade) x diâmetro (área)

volume

81

O calibre só deve ser valorizado até aos 30 primeiros minutos,

tempo necessário para a auto-regulação imediata que se inicia logo nos

primeiros minutos (Quaranta, 1994). Por ser difícil a medição

volumétrica precisa, utilizam-se os valores das velocidades (Alm, 1992).

3.1.5- Análise de Imagem

As imagens foram registadas cinco minutos antes de cada

experiência e depois cada sessenta segundos, utilizando um angiógrafo

digital de alta resolução para vasos retinianos e coroideus: de início o

angiógrafo IMAGEnet H 1024 da TOPCON e, posteriormente, o

angiógrafo 450 IFR da Zeiss, com resultados sobreponíneis. O registo

das imagens foi obtido a uma distância de três milímetros do local da

injecção. O sistema IMAGEnet contém múltiplos componentes

integrados, incluindo câmaras de filmagem e de vídeo, monitores de

imagem, aparelhos de registo e armazenagem e processamento em

computador. Mais de 90% das experiências foram capturadas em vídeo.

O sistema melhorou a claridade da retina, com modificação das

aberturas para aumentar a clareza e a sensibilidade e um sinal luminoso

sincronizado para imobilizar os movimentos oculares do animal, reduzir

a falta de clareza com o movimento, aumentar a resolução visual dos

diâmetros dos vasos e prolongar a duração dos estudos (Yannuzzi et al.,

1992). As características deste sistema de imagem digital proporcionam

um maior grau de resolução da imagem arteriolar, contraste e

sensibilidade e ainda a oportunidade para uma avaliação mais extensa

das imagens captadas. A câmara é capaz de obter fotografias do fundo

82

ocular a preto-e-branco e a cores, e registo digital e estandartizado de

angiografias com fluoresceína. Este aparelho encontra-se programado

para a medição de diâmetros vasculares após tratamento prévio de

imagem, recorrendo a software do mesmo (Weinberger et al., 1999). As

variações dos diâmetros dos vasos foram analizadas separadamente por

dois observadores para a mesma imagem de retinografia à distância de

dois diâmetros do disco óptico. O registo vídeo de cada segmento

arteriolar foi tomado durante 15 minutos por uma câmara de alta

resolução (Sony; ampliação 2 x 25) incorporada no sistema IMAGEnet.

As imagens foram registadas em videotape (registador U-matic; Sony).

As medidas do diâmetro arteriolar foram efectuadas a partir de um

segmento seleccionado por um analizador de extensão semi-automático,

que digitalizava gravuras cinzentas, na ordem de 1,024 x 1,024 píxeis.

Foi seleccionada uma janela na imagem por um cursor guiado pelo rato

para incluir a arteríola e parte da retina adjacente. O computador

calculou o perfil médio do cinzento para incluir a arteríola e parte da

janela pré-seleccionada e a área calculada e a largura média do segmento

arteriolar escolhido nas figuras sequenciais. É normal um coeficiente de

variação < 5% quando se comparam medidas de vasos da retina obtidos

por computador ou por observador (Newsom et al.,1992). A

variabilidade intra-observadores foi sempre de 5%.

83

Fig.6 – Imagem do angiógrafo IMAGEnet 1024

3.1.6- Indução da diabetes experimental

A indução da diabetes foi efectuada pela injecção de aloxana (Herse et

al., 1994). O fármaco foi dissolvido em tampão citrato-fosfato 0,05 M

(pH=4,5) imediatamente antes da sua administração. Os coelhos em

número de 12, após 12 horas de jejum e indução anestésia inalatória com

éter embebido em algodão, foram injectados na veia marginal da orelha,

com a dose única de 100mg/kg de peso. Coelhos não injectados, com a

84

mesma idade e da mesma ninhada, mantidos sob as mesmas condições,

serviram como controlo. Nos dois dias que se seguiam à injecção de

aloxana foi adicionada dextrose a 5% na água de beber dos animais. Os

animais foram alimentados com rações para coelhos e beberam água ad

libidum. Observou-se uma baixa mortalidade (≤ 3%) com a utilização

deste protocolo (morreram quatro coelhos e dois deles não se

conseguiram diabetizar).

QuadroI- Relação entre o peso e os níveis de glicémia em coelhos normais e

diabéticos ao longo de 12 semanas.

O peso corporal, a glicémia, a glicosúria e a diurese foram avaliadas

às 24 horas, 4 dias, 1 semana, 4 semanas, 8 semanas e 12 semanas após

85

administração da aloxana. A glicémia foi determinada a partir de amostras

sanguíneas colhidas na veia marginal da orelha e a glicosúria determinada

por métodos colorimétricos. O princípio básico da maioria das medidas

colorimétricas consiste na comparação, sob condições definidas, da cor

produzida pela substância em quantidade desconhecida com a mesma cor

produzida por uma quantidade conhecida do material a ser determinado. A

comparação quantitativa dessas duas soluções pode, em geral, ser conduzida

por um ou mais de seis métodos. Não é essencial preparar-se uma série de

padrões com o espectrofotómetro; o coeficiente de absorção molar pode ser

determinado de uma das medidas da absorvância ou transmitância da

solução padrão, para se fazer a determinação da concentração desconhecida

com o auxilio deste coeficiente de absorção molar e o valor obtido da

absorvância ou transmitância da amostra. O método utilizado foi o da

Diluição: a amostra e a solução padrão estão contidas em tubos de vidro do

mesmo diâmetro e são observadas horizontalmente através dos tubos. A

solução mais concentrada é então diluída até que as cores fiquem idênticas

em intensidade quando observadas horizontalmente através da mesma

espessura de solução. As concentrações relativas das soluções originais são

então proporcionais às alturas das soluções comparadas nos tubos. A

variação da cor de um sistema, com a modificação da concentração de um

certo componente, constitui a base do que os químicos denominam análise

colorimétrica. A cor é provocada pela formação de um composto corado,

resultante da adição de um reagente apropriado, ou pode ser intrínseca ao

constituinte analisado. A intensidade da cor pode ser comparada com a que

se obtém pelo tratamento idêntico de uma quantidade conhecida da

substância. A colorimetria visa determinar a concentração de uma substância

pela medida da absorção relativa de luz, tomando como referência à

absorção da substância numa concentração conhecida. Na colorimetria

86

visual usa-se, em geral, como fonte de luz, uma fonte natural ou artificial de

luz branca. As de terminações são feitas num instrumento simples,

denominado colorímetro, ou comparador de cores. Quando a observação

directa for substituída por uma célula fotoeléctrica (o que elimina em grande

parte os erros devidos às características pessoais de cada observador), o

instrumento é um colorímetro fotoeléctrico. Neste instrumento emprega-se a

luz que está numa banda estreita de comprimentos de onda, que se consegue

pela passagem da luz através de filtros, isto é, de materiais coloridos na

forma de placas de vidro, ou de gelatina, etc., que só transmitem a luz numa

região espectral limitada. A principal vantagem dos métodos colorimétricos

e espectrofotométricos, é a de proporcionarem um meio simples para

determinar quantidades diminutas de substâncias. O limite superior dos

métodos colorimétricos é, em geral, a determinação dos constituintes que

estão presentes em quantidades relativas inferiores a 1 ou 2%. A

sensibilidade pode ser, no entanto, aumentada mediante a técnica da

espectrofotometria derivada.

O estado diabético foi estabelecido pela existência de

hiperglicémia persistente (> 350 mg/100ml), glicosúria, poliúria,

polidipsia (medidos através da quantidade de urina eliminada e água

ingerida) e perda de peso. Os animais foram mantidos diabéticos durante

um período de 3 meses, após o qual se iniciaram os estudos descritos

com animais diabéticos.

87

3.1.7- Indução de glaucoma experimental

Estudos com modelos animais têm-nos ajudado a compreender os

mecanismos de formação e de drenagem do humor aquoso, bem como

a manutenção da homeostase da pressão intraocular. Muitas vezes,

esses estudos levaram ao conhecimento da etiologia do glaucoma e no

desenvolvimento de terapêutica adequada. Através da diversidade da

estrutura e função do ângulo de drenagem de cada espécie animal, os

estudos comparativos com o homem permitiram estender os conceitos

limitados ao segmento anterior, na doença humana. No

desenvolvimento da hipertensão e glaucoma espontâneo ou induzido,

os modelos animais têm conduzido a estratégias terapêuticas que, de

outra forma, teriam sido difíceis de implementar.

Ao longo do tempo foram observados vários modelos de

glaucoma espontâneo em diferentes animais. Numa forma precoce

Kolker descreveu um grupo de 60 coelhos albinos da raça Nova

Zelândia que, naturalmente, mostraram uma alteração no

desenvolvimento da malha trabecular (Kolker et al., 1999). A

descrição das anomalias anatómicas que apresentaram (redução no

número de lamelas, aumento do espaço intercelular entre as lamelas,

vacuolização das células endoteliais e fragmentação da lâmina basal),

permitiu levantar a hipótese de que a causa da elevação da pressão

intra-ocular podia ter sido uma redução do apoio estrutural das

trabéculas. Também foram encontrados níveis elevados de fibrina no

88

humor aquoso, o que sugere que a fibrina poderia dificultar a

evacuação do humor aquoso e, assim, aumentar a pressão intra-ocular.

No entanto, a ausência de lâmina crivosa e mielinização parcial das

células ganglionares da retina em estudos ultraestruturais, juntamente

com a existência de uma proeminente rede vascular fizeram do coelho

um modelo animal adequado para estudar alterações na retina ou

vascularização do glaucoma.

No final das 60 observações feitas por veterinários

oftalmologistas em cães com glaucoma espontâneo, descobriu-se a

existência de determinadas raças (Beagles, Cocker, BaseT e

caçadores) mais suscetíveis para esta patologia. Todavia como

acontece nos coelhos, é o tipo de glaucoma de ângulo aberto o critério

que prevalece, enquanto que os cães mostram glaucoma de ângulo

fechado.

A elevação crónica da TIO de 30 a 40 mmHg, utilizando estes

animais com hipertensões espontâneas ou induzidas por cauterização

das veias perilímbicas, pode levar a escavação patente da cabeça do

nervo óptico. O glaucoma nestes animais é susceptível ao tratamento

farmacológico com vários medicamentos usados em seres humanos.

Em 1993, foi descrita pela primeira vez uma colónia de macacos,

localizado em Cayo Santiago. Em nove famílias destes macacos tem

sido descrita uma herança materna, com uma incidência de 40% da

elevação da pressão intra-ocular. Nos animais afectados foi a perda de

células ganglionares da retina, a escavação do nervo óptico e provas

eletrofisiológicas que poderam provar a existência de danos na retina

periférica. Recentemente, o aparecimento do rato DBA/2J, que

desenvolve um aumento gradual da TIO por induzir a morte de células

89

ganglionares, tem gerado inúmeros estudos para estabelecer a

existência de homologias com algum tipo de glaucoma em seres

humanos. A elevação da pressão intraocular nestes animais parece ter

início na idade de 6 meses ficando cronicamente elevada até à sua

morte. No entanto, existem factores, como o tamanho reduzido do

globo ocular ou a ausência de lâmina crivosa que limitam a utilização

dos animais para esses estudos. Os modelos experimentais agora

referidos, com a elevação crónica da pressão intra-ocular, por si só,

são ideais para o estudo do glaucoma. No entanto, com excepção dos

ratos DBA/2J, outros animais com glaucoma espontâneo, são difíceis

de obter comercialmente e ainda mais difícil de obter grupos com a

mesma fase da doença. Portanto, a fim de facilitar os testes e o

desenvolvimento de conhecimentos de glaucoma, ao longo da história

foram desenvolvidos modelos glaucoma induzidos

experimentalmente.

Assim, em 1974, Gaasterland e seus colegas desenvolveram o

primeiro modelo de laser em primatas, o que tem sido amplamente

utilizado posteriormente por outros autores. Como no homem, após

uma trabeculoplastia laser argon, produz-se uma elevação transitória

da pressão intra-ocular que parece ser causada pela formação de

fibrina obstruindo a malha trabecular. As grandes flutuações da

pressão intraocular determinam que na maioria dos casos, sejam

necessárias várias sessões de laser, com inflamação grave no globo

ocular. Embora estes problemas existam, este modelo experimental de

glaucoma em primatas têm sido amplamente utilizado para melhorar o

quadro clínico inicial de indicadores das lesões da papila no

glaucoma.

90

Em nossa opinião, o estudo do glaucoma tem sido impulsionado

pela possibilidade de desenvolvimento desta patologia em coelhos.

Estes animais são de custo reduzido e mais acessíveis na manutenção

e causam menor impacto relativamente aos problemas éticos. Em

1995, o grupo de Shareef et al., desenvolveu o modelo epiescleral

com cauterização das veias do rato e do coelho como processo de

desencadear aumento da pressão intra-ocular crónica. Este modelo

permite manter a completa estrutura trabecular, não afectando os

nervos ciliares, como no modelo laser. Além disso, a pressão intra-

ocular pode ser mantida até 6 meses, o que para o tempo de vida do

coelho representa muito. O desenvolvimento deste modelo animal

permitiu o estudo de diferentes combinações e concentrações de

fármacos hipotensores e neuroprotectores como um prelúdio para o

estudo em animais de maior porte antes de ensaios clínicos. O mesmo

grupo, no mesmo ano, descreveu pela primeira vez a morte por

apoptose das células ganglionares da retina no glaucomatoso. Isto

permitiu-nos realizar estudos em artérias retinianas, usando a mesma

tecnologia a que se recorre em oftalmologia humana.

Os progressos no diagnóstico do glaucoma têm sido

acompanhados pela evolução tecnológica e o seu tratamento

associado ao desenvolvimento de modelos animais.

O glaucoma experimental foi obtido através da cauterização dos

vasos perilímbicos, com cautério descartável (Bovie, AAron medical,

Florida, USA), num dos olhos do coelho, servindo o olho adelfo como

controlo. Este procedimento induz uma hipertensão ocular alta,

estável e duradora (até 30 dias), sem inflamação ou infecção

91

induzidas (apenas se observou ligeira hiperémia conjuntival em dois

animais) de forma a possibilitar a experimentação.

Sequencialmente foram registados os valores de tensão

intraocular (TIO), diâmetros vasculares e fluxos sanguíneos (picos

sistólicos e diastólicos; expressos apenas os sistólicos uma vez que os

segundos acompanharam as variações dos primeiros de forma

homogénea) das arteríolas justa-papilares, num processo de quinze

minutos consecutivos (fluxos e diâmetros foram avaliados a cada

minuto). Não se registaram velocidades venulares, conforme descritas

por alguns autores, por não apresentarem expressividade.

3.1.8- Protocolo experimental

1. Avaliação do efeito de diferentes agentes farmacológicos sobre

o tónus miogénico de arteriolas retinianas, justapapilares. Para os

fármacos vasoconstritores foram obtidas curvas de dose-resposta (CDR)

pela adição cumulativa destes agentes, por microinjecção intravítrea de

volumes de 10µl cada, contendo a substância farmacológica vasoactiva

em concentração logarítmica crescente (peri-retinal, peripapilar, 1-2

diâmetros de disco, justa-arteriolar (30µm da arteríola) e análise cada 60

segundos depois de atingir o “steady-state” (15 minutos); duração total

= 30 minutos. Para os agentes vasodilatadores a curva de dose-resposta

foi obtida após contracção prévia do vaso com 10 nmol de sumatriptano

intra-vítreo, justa-arteriolar; uma vez atingido um patamar, os

vasodilatadores foram injectados de modo idêntico e com a mesma

ordem de grandeza e sequência indicada para as curvas de contracção.

92

2. Realização das curvas de dose-resposta in vivo, contrácteis ou

relaxantes, 15 minutos após injecção de um antagonista específico para

o agonista respectivo; de novo, para os agonistas relaxantes foi

administrado sumatriptano (10 nmol), para contrair o vaso sanguíneo

antes da obtenção da curva dose-resposta para agonistas do sistema

neuropéptidérgico.

3.Repetição de algumas experiências anteriores (com

modificadores da 5-HT e neuropeptídeos), utilizando animais com

diabetes aloxânica.

4. Com a mesma metodologia, utilizando os agonistas respectivos

em coelhos com glaucoma experimental para o estudo dos

modificadores do NO e sua correlação com os resultados obtidos com

coelhos normais.

3.1.9- Fármacos utilizados e soluções

A aloxana e a indometacina foram obtidas através da Sigma

Chemical Co. (St. Louis, MO; U.S.A.); a Cetamina foi obtida da Parke-

Davis Inc. (Don Mills, Canada) e o ciclopentolato 0.5% foi obtido da

Edol-Portugal. Todos os restantes fármacos:

93

3.1.9.a-Modificadores do Sistema Serotoninérgico:

Agonistas / Nome químico / Receptores / Referências

a) Serotonina (5-HT) (agonista da maioria dos receptores 5-HT) (em

anexo)

b) Sumatriptano (SUM) 3-[2-(Dimethylamino)ethyl]-N-methyl-1H-indole-

5-methanesulfonamide succinate (5-HT1B/1D); Peroutka and McCarthy (1989)

Sumatriptan (GR 43175) interacts selectivity with 5-HT1B and 5-HT1D binding sites.

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d)2-metil-serotonina (5-HT3, 5-ht6); Wilson et al (1990) 5-Hydroxytryptamine3

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Naunyn.Schmied.Arch.Pharmacol. 342 9. Glennon et al (2000) 2-substituted tryptamines:

agents with selectivity for 5-HT6 serotonin receptors. J.Med.Chem. 43 1011

94

e) 8-OH-DPAT (±)-8-Hydroxy-2-dipropylaminotetralin hydrobromide (5-

HT1A); Middlemiss et al (1983) 8-OH-DPAT discriminates between subtypes of the 5HT1

recognition site. Eur.J.Pharmacol. 105 365. Helton and Colbert (1994) Alteration of in-vitro

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f)Cisapride(±)-4-Amino-5-chloro-N-[1-[(3R*,4S*)-3-(4-

fluorophenoxy)propyl]-3-methoxy-4-piperidinyl]-2-methoxybenzamide

(5-HT4); Schuurkes et al (1985) Motor-stimulating properties of cisapride on isolated

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76,186, are 5-hydroxytryptamine4 (5-HT4) receptor agonists on the guinea-pig colon

ascendens. Naunyn-Schmied.Arch.Pharmacol. 347 464.

g) L-694,247 2-[5-[3-(4-Methylsulfonylamino)benzyl-1,2,4-oxadiazol-5-

yl]-1H-indol-3-yl]ethanamine (5-HT1B/1D); Street et al (1993) Synthesis and

serotonergic activity of 5-(oxadiazoyl)tryptamines: potent agonists of 5-HT1D receptors.

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presynaptic location of inhibitory 5-HT1D� -like autoreceptors in the guinea-pig brain cortex.

Naunym-Schmied.Arch.Pharmacol. 353 281.

Antagonistas / Nome químico / Receptores / Referências

a) Cetanserina (5-HT1D/5-HT2/5-HT2A); (ver anexo)

95

b) Espiperona (5-HT1A//1B/1D/2A/2B); (ver anexo)

c) BRL15572 3-[4-(4-Chlorophenyl)piperazin-1-yl]-1,1-diphenyl-2-

propanol hydrochloride (5-HT1D) (agonista parcial 5-HT2B); Hagan et al

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Schmied.Arch.Pharmacol. 356 321. Saxena et al (1998) 5-HT1-like receptors: a time to bid

goodbye. TiPS 19 311.

d) GR127935 N-[4-Methoxy-3-(4-methyl-1-piperazinyl)phenyl]-2'-

methyl-4'-(5-methyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl)-1,1'-biphenyl-4-carboxamide

hydrochloride (5-HT2; 5-HT1B/1D) (agonista parcial 5-HT2B); Clitherow et al

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as the first selective 5-HT1D antagonists. J.Med.Chem. 37 2253. De Vries et al (1996)

Blockade of porcine carotid vascular response to sumatriptan by GR 127935, a selective 5-

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e) SB 224,284 (5-HT1B /2B); (ver anexo)

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3.1.9.b-Péptidos:

Agonistas / Receptores / Referências

a) Substância P, Trp-Arg-Gln-Ala-Ala-Phe-Val-Asp-Ser-Tyr (SP)

(NK1); (em anexo)

b) Péptido relacionado com o gene da calcitonina, (CGRP); Poyner et al

(2002) International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related

peptides, adrenomedullin, amylin, and calcitonin receptors. Pharmacol.Revs. 54 233.

c) Neurocinina A (NKA) (NK2); Nawa et al (1983) Nucleotide sequences of cloned

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f) Capsaicina, (E)-N-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methyl]-8-methyl-6-

nonenamide (CAPS); Bevan and Szolcsani (1990) Sensory neuron-specific actions of

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Antagonistas / Nome químico / Receptores / Referências

a) L668,169 (NK1); (ver anexo)

b) L659,877 (NK2); (ver anexo)

c) CGRP8-37 (CGRP); Poyner (1995) Pharmacology of receptors for calcitonin gene-

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phenylpiperidine hydrochloride (NK1); Seabrook et al (1996) L-733,060, a novel

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Septide and neurokinin A are high-affinity ligands on the NK-1 receptor: evidence from homologous

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Comparison of the functional blockade of rat substance P (NK1) receptors by GR205171, RP67580,

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Pharmacological profile of the novel mammalian tachykinin, hemokinin 1.

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Pharmacological characterization of ZD6021: a novel, orally active antagonist of the tachykinin

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NKP608: a selective NK-1 receptor antagonist with anxiolytic-like effects in the social interaction and

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101

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[3H]LY303870, a novel nonpeptide radioligand for the NK-1 receptor.

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Pharmacological properties of peptides derived from an antibody against the tachykinin NK1 receptor

for the neuropeptide substance P.

Eur J Pharmacol, 468, 175 - 182.

3.1.9.c- Modificadores do Óxido Nítrico:

a) L-Arginina (substracto endógeno para as NOS) (Sigma Aldrich

Company, St Louis, MO, USA),

b) SNAP (análogo endógeno) (S-nitroso-N-acetyl-D,L-penicillamine,

WPI, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA),

102

c) L-NAME (inibidor não selectivo da eNOS, nNOS e iNOS) (NG-nitro-L-

arginine methyl ester hydrochloride, Sigma Aldrich Company, St Louis,

MO, USA),

d) L-NNA (inibidor não selectivo também de todas as isoformas de NOS)

(NG-nitro-L-arginine, Tocris, Bristol, UK),

e) Aminoguanidina (inibidor irreversível da iNOS) (Sigma Aldrich

Company, St Louis, MO, USA); utilizados em soluções preparadas com

água destilada e desionizada.

Referências: 1. Chiou, G.C.Y., Liu, S.X.L., Li, B.H.P., Varma, R.S., and Chiang, C.H., (1995). Ocular hypotensive effects of arginine compounds and their actions on ocular blood flow. J. Ocul.Pharmacol. Ther. 11, 1-10. 2. Chiou, G.C.Y., (2001). Review: Effects of Nitric Oxide on Eye Diseases and Their Treatment.J. Ocul. Pharmacol. Ther. 17, Nº.2, 189-198. 3. Hattenbach, L., Allers, A., Klais, C., Koch, F. and Hecker, M., (2000). L-Arginine-Nitric Oxide Pathway-Related Metabolites in the Aqueous Humor of Diabetic Patients. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 213-217. 4. Kim, J.C., Park, G.S., Kim, J.K., Kim, Y.M., (2002). The Role of Nitric Oxide in Ocular Surface Cells. J. Korean Med. Sci. 17, 389-394. 5. Kotikoski, H., Alajuuma, P., Moilanen, E., Salmenperä, P., Oksala, O., Laippala, P. and Vapaatalo, H. (2002). Comparison of Nitric Oxide Donors in Lowering Intraocular Pressure in Rabbits: Role of Cyclic GMP. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 18, 11-23. (a) 6. Kotikoski, H., Moilanen, E., Vapaatalo, H., and Aine, E., (2002). Biochemical markers of the L-arginine-nitric oxide pathway in the aqueous humour in glaucoma patients. Acta Ophthalmol. Scand. 80, 191-195. (b) 7. Kowluru, R.A., (2001). Diabetes-induced elevations in retinal oxidative stress, protein kinaseC and nitric oxide are interrelated. Acta Diabetol. 38, 179-185. 8.Liu, S.X.L., Chiou, G.C.Y., and Varma, R.S., (1995). Improvement of retinal function after ischemia with L-arginine and its derivatives. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 11, 263-268.

103

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A solução salina polielectrolítica (mmol/l) colocada nos olhos

controlo apresentava a seguinte composição: NaCl 118,7; KCl 4,7; Ca

Cl2 1,8; KH2PO4 1,2; NaHCO3 24,8 e glucose 10,1; pH 7,4; a

concentração da solução-mãe (10-5M), a sua solubilidade (100mM

água, 1eq. NaOH ou DMSO); todas as soluções permaneceram

estáveis.

3.1.10- Análise dos Dados e Estatística

A eficácia dos diferentes agonistas foi expressa como a resposta

máxima, quer se tratasse de uma resposta contráctil ou de relaxamento.

Foram calculados os valores de Emax que representam a resposta

máxima obtida por um agonista.

A potência dos diferentes agonistas foi expressa como pED50 (o

logaritmo negativo na base 10 da concentração do agonista que produz

104

50% do efeito máximo). Os valores de pED50 foram calculados pela

análise das curvas dose resposta. No estudo do efeito contracturante do

sistema da 5-HT, utilizou-se como referência o diâmetro basal após

estabilização com indometacina em algumas experiências.

A quantificação do efeito relaxante foi expresso em percentagem do

diâmetro vascular basal após prévia contracção com SUM (100%). A

dose que produz 50% do efeito máximo a um fármaco (ED50) também

foi calculada.

Os resultados foram expressos em percentagens (média ± erro padrão)

e para análise das diferenças estatísticas os valores médios foram

analizados, utilizando o teste-t de Student. Uma probabilidade de 0,05

ou inferior foi considerada significante. A variabilidade média

interobservador foi de 5%. O valor de n indica o número de

experiências independentes, que é igual ao número de animais usado

para cada tratamento, sempre ≥ 6. Na análise estatística utilizou-se o

programa informático GraphPad Prism 5.0.

105

CAPÍTULO IV

R E S U L T A D O S

106

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

Demonstrou-se através do estudo dos dois sistemas diferentes

(contracturante e relaxante), mas interligados na resposta neurogénica

(serotoninérgico e neuropeptidérgico) que, após microinjecção

intravítrea dos diferentes agonistas ou após a sua administração com

microinjecção prévia de antagonista, existe um efeito arteriolar

dependente da dose. Ao contrário de Pietscher et al., (1996) antes de

iniciarmos estes estudos, não foram encontradas variações circadianas

do diâmetro vascular no nosso modelo experimental.

107

4.1- Estudos com vasoconstritores

Estudo do Sistema Serotoninérgico

Efeito da 5-HT e de agonistas selectivos dos subtipos de receptores antes

e após tratamento prévio com antagonistas

A constricção produzida por diferentes agonistas da 5-HT nas

arteríolas retinianas foi expressa em percentagem da eficácia ou

contracção máxima produzida pelos diferentes agonistas após injecção

periarteriolar.

Injectou-se dentro do humor vítreo 10µl de solução (10 nmol/l) de

Serotonina (5-HT), observando-se um aumento do tónus arteriolar com

redução do diâmetro (efeito vasoconstritor) com doses crescentes;

obteve-se uma contracção dependente da dose. O efeito contráctil

máximo (Emax), expresso em % de variação do diâmetro basal, obtido

com 10 nmol, foi de 29,4±1,5%, (média±erro padrão) (n=6) (Fig.7). No

entanto, após administração endovenosa na veia marginal da orelha do

coelho (n=4) a 5-HT originou apenas uma contracção muito discreta,

traduzida numa ligeira elevação da linha basal.

O Sumatriptano (SUM), 10 nmol, agonista dos receptores 5-

HT1B/1D, induziu o efeito vasoconstrictor mais potente (Emax ± erro

padrão 44,8 ± 1,0%).

O efeito contráctil produzido pela 5-HT ou SUM foi inibido por

10 nmol de GR127935, 10 nmol de BRL15572 e 10 nmol de SB

224289, respectivamente antagonistas dos receptores 5-HT1B/1D, 5-HT1B

e 5-HT1D. O antagonista 5-HT1D, BRL15572, desviou para a direita as

curvas contrácteis da 5-HT e do SUM.

108

O L694247, outro agonista potente dos receptores 5-HT1B/1D,

produziu uma contracção significativa (Emax± erro padrão=39,0±2,5)

antagonizada pelo BRL15572.

A alfa-metil-5-HT (α-Me-5-HT), agonista 5-HT2, adicionado

cumulativamente até 10 nmol, desencadeou efeito contráctil mais

reduzido (Emax ±erro padrão 19,4±1,9%) que foi parcialmente

antagonizado pela cetanserina (que também inibiu a resposta contráctil

induzida pelo SUM). A espiperona, um antagonista dos receptores 5-

HT2, quase inibiu a resposta contráctil da α-Me-5-HT (Fig.8).

Foram ainda estudados o 8-OH-DPAT, um agonista 5-HT1A,

injectado cumulativamente até 10 nmol, não provocou um efeito

significativo (Emax ± erro padrão 2,8±0,7%), o mesmo ocorrendo com a

2-Me-5-HT, agonista parcial 5-HT3 (classificação anterior) (Emax ±

erro padrão 2,1±0,8%) ou o cisapride, agonista parcial 5-HT4

(Emax±erro padrão 8,9±1,5%) (Fig.).

Todos os efeitos contrácteis induzidos pelos agonistas 5-HT

diminuíram a hemodinâmica ocular, com redução estatisticamente

significativa da velocidade sanguínea (ver quadros).

109

Fotografia a cores a) - Fundo ocular normal de coelho albino, com

visualização do disco óptico, vasos retinianos e coroideos, no início de uma

experiência.

Fotografia a cores b)- O mesmo olho, após injecção intravítrea de Sumatriptano

110

(note-se a extensa vasoconstrição, sobretudo arteriolar papilar e justapapilar).

A Fig.7 mostra traçados representativos das variações no diâmetro

externo da arteriola oftálmica de coelhos após injecção cumulativa dos

volumes de fármacos agonistas, reproduzindo curvas dose-efeito.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 2 3 4 5 6-log dose (nmoles)

% v

aria

ção

do d

iam

etro

vas

cula

r (co

ntra

ção)

2-ME-5-HT

5-HT

SUM

ALPHA-ME-5-HT

CISAPRIDE

L694,247

8-OH-DPAT

Fig.7- Curvas dose-resposta de todos os agonistas testados em coelhos

normais. Os valores são expressos em termos de média ± erro padrão; n≥6 para

cada agonista testado. Valores de p < 0,05 em relação ao controlo.

111

Procurámos de seguida testar outros agonistas serotoninérgicos

uma vez que já possuíamos uma resposta satisfatória à 5-HT. Um outro

agonista a α-Metil-5-hidroxitriptamina (α-Metil-5-HT), na dose de 10

nmol, contraíu todas as arteríolas nas quais foi testado, induzindo,

contudo, uma contracção menor do que a do SUM. Este efeito foi

parcialmente antagonizado por 10 nmol de Espiperona, o que permitiu

concluir sobre a possível existência de receptores 5-HT2 (Fig.8).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 2 3 4 5 6-log dose (nmoles)

% v

aria

ção

do d

iâm

etro

vas

cula

r (co

ntra

cção

)

ESPIPERONA+ALFA-ME-5-HT

CETANSERINA+ALFA-ME-5-HT

SUM

ALFA-ME-5-HT

CETANSERINA+SUM

Fig.8- Curvas dose-resposta para a α-Metil-5-HT em administração isolada e

após pré-injecção de antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1/2 na dose de 10

nmol e de Cetanserina (antagonista não selectivo de receptores 5-HT2 / 5-HT1D) na

112

mesma concentração. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥

6.Valores de p < 0,05 em relação ao controlo.

Um dado importante para a análise que vimos realizando foi o

facto de o Sumatriptano (SUM), um agonista dos receptores 5-HT1D,

quando administrado por via intravítrea (10 nmol) apresentar o maior

efeito de vasoconstrição de todos os agonistas serotoninérgicos (média±

erro padrão = 44,8±1,0% do diâmetro basal), inclusivé em relação à 5-

HT (Fig.8). Porém, administrado por via sistémica na mesma

concentração modificou só ligeiramente (com vasoconstrição) o

diâmetro vascular das arteríolas retinianas do coelho normal (dados não

apresentados). O efeito contráctil quer do SUM quer da 5-HT foi

revertido pela administração intravítrea de GR127935 em doses

semelhantes (Fig.9).

113

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 2 3 4 5 6

-log dose (moles)

% v

aria

ção

do d

iâm

etro

bas

al (c

ontr

acçã

o)5-HT

SUM

L-694,247

BRL15572+5-HT

BRL15572+L-694,247BRL15572+SUM

*

*

*

Fig.9- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT e L-694,247 em administração

isolada e após pré-injecção de antagonista selectivo dos receptores 5-HT1D (BRL15572),

na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥6.

Valores de p <0,05 em relação ao controlo.

114

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 2 3 4 5 6

-log dose (moles)

% v

aria

ção

do d

iâm

etro

bas

al (c

ontr

acçã

o)GR127,935+SUM

SUM

SB224,284+5-HT

5-HT

SB224,284+SUM

Fig.10- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT em administração isolada e

após pré-injecção de antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1B (GR127,935 e

SB224,284), na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em termos de média±erro

padrão; n≥6. Valores de p <0,05 em relação ao controlo.

Em algumas experiências utilizaram-se antagonistas diferentes para o

mesmo receptor com a intenção de enfatizar a presença desse receptor, uma

vez que não foram efectuados estudos de imunohistoquímicos.

Foram também realizadas experiências em coelhos diabéticos, testando a

expressividade dos receptores serotoninérgicos e sem a influência de

indometacina. Como se pode observar na Fig.11, os resultados não foram

115

semelhantes aos encontrados para os coelhos normais: respostas débeis ou

mesmo ausentes e paradoxais face às diferentes doses avaliadas.

Fig.11- Curvas dose-resposta de todos os agonistas 5-HT testados em coelhos diabéticos.

Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥6 para cada agonista

testado.

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5 6

log dose (nmol)

%va

riaçã

o do

diâ

met

ro b

asal

2-Me-5-HT

5-HT

SUM

Alfa-Me-5-HT

CISAPRIDE

METERGOLINA

8-OH-DPAT

116

4.2- Estudos com vasodilatadores

Estudo do Sistema Neuropeptidérgico

No estudo do sistema neuropeptidérgico procurámos envidenciar

a presença de receptores NK1, NK2, NK3 e NK4 de acordo com a

classificação mais recente da International Union of Pharmacology

(IUPHAR, 2008).

Após contracção com 10 nmol de SUM, a microinjecção

intravítrea de SP induziu um relaxamento arteriolar dependente da dose,

com um efeito dilatador máximo (Emax) obtido com 10 nmol (média±

erro padrão 21,3±2,3% (Fig.12). O pED50 foi de 12,5 ±0,11 (Quadro II).

A curva dose-efeito foi deslocada para a direita após pré-tratamento,

seguido de um período de estabilização de 15 minutos, com 10 nmol L-

668,169, um antagonista dos receptores NK1 (Maggi, 1992); as mesmas

doses de L-733,060, também um antagonista NK1, de L659,877, um

antagonista NK2 (Mcknight, 1990), ou de CGRP8-37, um antagonista do

receptor CGRP (Poyner, 1992), também inibiram a resposta induzida

pela SP, mas com menor intensidade.

A NKA induziu o efeito relaxante mais potente de todos os

neuropeptídeos (após contracção com SUM), com efeito dilatador

máximo de 53,3 +2,5% e com um valor de pED50 de 12,52+ 0,31. A

administração prévia de antagonistas dos receptores NK2, L-659,877 e

GR159897, fez deslocar a curva dose-efeito para a direita, sendo os

valores de pED50 evocados de 10,60+ 2,5 e 10,26+ 1,1,

respectivamente. Ambos, CGRP8-37 e L-668,169, também inibiram o

efeito da NKA (Fig. 13); valores de Emax 48,0+3,5 e 45,3+2,5%,

117

respectivamente, mas de novo em menor grau. Este efeito foi

antagonizado pela injecção prévia do antagonista dos receptores NK1,

L668,169, 10 nmol (média±erro padrão 15,2±1,2%) do diâmetro basal e,

de forma menos acentuada, pelo antagonista de receptores NK2

L659,877, bem como pelo antagonista dos receptores CGRP, o CGRP8-

37. (Fig.14)

-log dose (mol/l)

Fig.12- Curvas de dose-resposta para a SP (10 nmol), um agonista dos receptores

NK1, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L-733,060 (ambos antagonistas

selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol); após tratamento com L659,877

e GR159,897 (ambos antagonistas selectivos dos receptores NK2, na dose de 10

nmol) e de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP) na dose de 10 nmol.

Os dados referem-se a médias±erro padrão; n≥6 ; *valor de p entre cada conjunto de

experiências e relativamente ao controlo <0,05.

% variação

do diâmetro

vascular

(relaxamento)

118

Doses cumulativas de CGRP, até 10 nmol desencadearam uma

vasodilatação arteriolar marcada (média±erro padrão = 41,1±0,4% do

diâmetro basal; pED50 11,88±0,04) antagonizada pela pré-injecção

perivascular de CGRP8-37 (média±erro padrão 2,4±0,7% do diâmetro

basal). Ambos os antagonistas NK1 e NK2 demonstraram um

antagonismo fraco e relativo (Fig.13).

-log dose (mol/l))

Fig.13- Curvas dose-resposta cumulativas para o CGRP (10 nmol) após contracção

prévia por 10 nmol/l de SUM e pré-tratamento com 10 nmol de L668,169 , L-733,060

ou de ambos (antagonistas selectivos dos receptores NK1); após tratamento prévio com

L659,877 , GR159,897 ou ambos ( antagonistas selectivos dos receptores NK2, na dose

de 10 nmol) e de CGRP8-37 (antagonista dos receptores do CGRP- na dose de 10 nmol).

% variação do diâmetro vascular (relaxamento)

119

Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n≥6 ; *valor de p entre cada conjunto de

experiências e relativamente ao controlo <0,05.

Obtivemos a maior expressividade em termos de vasodilatação

com a NKA, em doses cumulativas também na dose máxima de 10 nmol

(média ± erro padrão 53,3 ± 2,5% do diâmetro basal; pED50 11,96 ±

0,10). Este efeito foi antagonizado pela administração prévia de

L659,877 (média±erro padrão 19,2±1,0% do diâmetro basal). Nem o

CGRP8-37 ou o L668,169 reduziram significativamente o efeito

vasodilatador da NKA (Fig.14).

120

Fig.14- Curvas dose-resposta para a NKA (10 nmol), um agonista dos

receptores NK2, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L733,060 (ambos

antagonistas selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol), de CGRP8-37

(antagonista de receptores para o CGRP- na dose de 10 nmol) e de L659,877 e

GR159897 (ambos antagonistas selectivos dos receptores NK2). Os dados referem-

se a médias ± erro padrão; n≥6 ; * valor de p entre cada conjunto de experiências e

relativamente ao controlo <0,05.

O efeito relaxante arteriolar provocado pela NKB (agonista NK3)

foi bastante menor (média ±erro padrão 5,3 ± 1,2% do diâmetro basal)

(Fig.15) do que os obtidos com as outras neurocininas. Como

pretendíamos confirmar a inexistência de receptores NK3 na parede

arteriolar dos vasos retinianos do coelho, utilizámos ainda outro

agonista NK3, o Senquetide. Os resultados foram similares aos obtidos

com a NKB. O efeito de relaxamento máximo foi de 3,8±1,0% (Fig.15).

% variação do diâmetro vascular (relaxamento)

121

Fig.15- Curvas dose-resposta cumulativas para a NKB e Senquetide (10 nmol),

agonistas dos receptores NK3. Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n≥6 ; *valor

de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao controlo <0,05.

A eficácia da Capsaicina (CAPS) como vasodilatador foi

significativamente mais elevada do que a de todos os outros fármacos

dilatadores usados (média ± erro padrão 43,0 ± 2,9% do diâmetro basal).

Como o gráfico mostra, o efeito antagonista máximo foi obtido com a

pré-injecção em conjunto de todos os antagonistas anteriormente

ensaiados (Fig.16).

-10-9-8-7-6-5-4-3-2-10

1

-log dose (moles/l)

% v

aria

ção

do d

iãm

etro

bas

al

(rel

axam

ento

)

NKB

SENKTIDE

9101112130

122

Fig.16- Curvas dose-resposta para a CAPS (10 nmol), antes e após pré-injecção de

L668,169 e de L733,060 (ambos os antagonistas selectivos dos receptores NK1, na dose

de 10 nmol), de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP, na dose de 10 nmol),

de L659,877 e de GR159897 (antagonistas dos receptores NK2) e combinações dos

antagonistas das taquicininas isolados ou associados ao CGRP8-37. Os dados referem-se a

médias ± erro padrão; n ≥ 6 ; *valor de p entre cada conjunto de experiências e

relativamente ao controlo <0,05.

.

% variação do diâmetro vascular (relaxamento)

123

Neuropeptídeos Valor de pED50

Quadro II- Sustância P (SP), Neurocinina A (NKA), Péptido relacionado

com o gene da Calcitonina (CGRP) e Capsaicina (CAPS) antes e após administração

intraocular de antagonista (1 nmol/l). Valores expressos em média ± erro padrão

(n=7-x). *p <0,05.

124

Nas experiências realizadas em coelhos diabetizados, todas as

taquicininas, o CGRP e a CAPS revelaram um efeito vasodilatador

inferior a 4% em relação ao diâmetro basal (Fig.17). Perante um

endotélio disfuncional, o efeito relaxante destas substâncias foi quase

nulo.

Fig.17- Curvas dose-resposta para todas as taquiquininas, CGRP e a CAPS (10

nmol), em coelhos diabetizados pela aloxana. Os dados referem-se a médias ± erro

padrão; n≥6.

-5

-4

-3

-2

-1

00 13 12 11 10 9

-log dose(moles/l)

% v

aria

ção

do d

iâm

etro

bas

al (r

elax

amen

to)

CGRP

SP

CAPS

NKA

125

4.3- Resultados obtidos com os modificadores do óxido nítrico

(NO).

Determinação do diâmetro arteriolar

(% de variação do diâmetro basal)

Fármaco Max ± s.e.m.

(intraocular)

Aminoguanidina 34,0 ± 1,1% *

L-NAME 22,7 ± 0,7% *

L-NNA 8,3 ± 0,2% *

SNAP 47,0 ± 1,6% *

L-arginina 65,2 ± 0,8% *

BSS(controlo) ±0,0

Quadro III– Determinação do diâmetro arteriolar para os diferentes

fármacos estudados quando aplicados intraocularmente. Verificou-se uma

constrição, e diminuição do diâmetro do vaso com a aminoguanidina (inibidor da

iNOS), o L-NAME (inibidor da nNOS) e o L-NNA ( inibidor da eNOS ). A

administração isolada de SNAP ou de L-arginina induziu vasodilatação com

aumento do diâmetro arteríolar. Este estudo ocorreu em simultâneo com a

determinação da TIO pelo que as concentrações utilizadas são as referidas para esse

estudo.* p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo (BSS).

A aminoguanidina (um inibidor da iNOS) e o inibidor da

sintetase do NO, L-NAME, produziu uma constrição sustentada,

reversível e dependente da concentração, até 10 nmol dos segmentos

arteriolares, com um valor máximo de 34,0± 1,1%. A indometacina, um

126

inibidor da cicloxigenase (COX), reduziu o tónus dos segmentos

arteriolares.

De acordo com os resultados da TIO, o L-NAME, a

aminoguanidina e o L-NNA promoveram vasoconstrição, enquanto a L-

arginina e o SNAP originaram vasodilatação.

Após administração tópica destes fármacos nos olhos dos animais,

não se verificou alteração dos diâmetros arteriolares.

127

Quadro IV– Determinação do diâmetro arteriolar após administração

sucessiva de dois fármacos por via intraocular.* p < 0,05 (teste t de Student)

em relação ao controlo (BSS+L-arginina)# ; p < 0,05 (teste t de Student) em

relação ao controlo (BSS+SNAP).

Com o L-NAME (inibidor das três NOS), registou-se uma menor

vasodilatação quando comparada com a aminoguanidina (inibidor

relativamente selectivo da iNOS).

Determinação do diâmetro arteriolar

(% variação do diâmetro basal)

Fármacos Max ± s.e.m.

(intraocular)

BSS+L-arginina 21 ± 1,6

L-NAME+L-

arginina 3,6 ± 1,6 *

Aminoguanidina+L

-arginina 6 ± 0,5 *

L-NNA+L-arginina 19,5 ± 2,1

BSS+SNAP 19,4 ± 5,2

Aminoguanidina+SNAP 2,7 ± 0,5 #

L-NNA+SNAP 28,2 ± 2,2

128

5060708090

100110120130140150

0 50 100 150

tempo (minutos)

% T

IO

Aminoguanidine

BSS

Snap

L-NNA

L-arginine

L-Name

Quadro V- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após

administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO.

020406080

100120

0 20 40 60 80 100tempo (minutos)

% T

IO

L-arginina 100 nmolL-NAME 100 nmolBSS

Quadro VI- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após

administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO em coelhos com

glaucoma induzido.

129

Am

inog

uani

dine

Am

inog

uani

dine

+L-A

rg

L-N

AM

E

L-N

AM

E+L

-Arg

L-N

NA

L-N

NA

+L-A

rg

BS

S

BS

S+L

-Arg

0

20

40

60

80

100

120

140

60 min 135 min

tempo (minutos)

% T

IO

Quadro VII- Quadro comparativo da variação percentual da TIO em função

do tempo (minutos), após administração intraocular de 100 nmoles de cada

modificador do NO e da sua associação com L-Arginina.

4.3.1- Resultados com EcoDoppler

Os resultados seguintes exprimem os estudos complementares

com ecodopler em algumas das experiências com os agonistas e

antagonistas 5-HT e das taquicininas (não se efectuaram estudos de

fluxos com os modificadores do NO por estarem amplamente difundidos

em trabalhos da área).

130

Quadro VIII- Determinação da velocidade de fluxo(Emax ± sem) após administração

sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema neuropeptidérgico, por via intravítrea,

em coelhos normais. * p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo.

Fármacos Max ± s.e.m.

(veloc:cm/s)

CAPS 32 ± 0,8

CGRP 39 ± 1,0 *

SP 2 6 ± 2,5

NKA 49,5 ± 0,1*

NKB 13,4 ± 1,7

CGRP8-37 + CGRP 22,9 ± 0,6

L659,877 + NKA 28,1 ± 1,2*

131

.

Quadro XIX– Determinação da velocidade de fluxo (Emax ± sem) após administração

sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema serotoninérgico por via intravítrea, em

coelhos normais. * p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo.

Fármacos Max ± s.e.m.

(veloc:cm/s)

2-Me-5-HT 13,7 ± 0,3*

5-HT 8,0 ± 0,6

SUM 5,1 ± 0,2 *

Alfa-Me-5-HT 9,5 ± 1,1

8-OH-DPAT 1,1±0,4

SB224,289+SUM 11,0 ± 0,5 *

Espiperona+ Alfa-Me-5-HT 12,1 ± 0,1

Cetanserina+SUM 13,2 ± 0,8*

BRL15572 + SUM 12,2 ± 0,3

132

Observando o Quadro XIX podemos constatar que, concomitantemente com

a vasoconstrição provocada pelos agonistas 5-HT, a velocidade de fluxo

também diminuiu. Com a administração intraocular prévia de antagonistas

5-HT as velocidades de fluxo não se alteraram significativamente em relação

aos valores de origem. Paralelamente, os resultados esperados com a

adminstração de vasodilatadores (sistema neuropeptidérgico) indicaram uma

resposta previsível de aumento franco das velocidades de fluxo nas

arteriolas do coelho (Quadro VIII).

Não se registaram alterações nas medições de fluxos nos coelhos

diabetizados e com glaucoma experimental pela inconsistência dos

resultados que atribuímos a uma dificuldade de execução técnica.

Fig. 18- Exemplo de imagem obtida por CDI na análise de fluxos da artéria

central da retina

133

CAPÍTULO V

D I S C U S S Ã O E C O N C L U S Õ E S

134

CAPÍTULO V

DISCUSSÃO

Pareceu-nos importante detectar um número elevado de

receptores 5-HT nos vasos da retina do coelho uma vez que, face ao

actual desenvolvimento da farmacologia, poderemos futuramente

empreender estudos com mais de um tipo de antagonistas (ou agonistas)

no controlo da vasomotricidade retiniana. A medição dos diâmetros

vasculares retinianos com recurso ao retinógrafo digital proporcionou

uma melhor precisão do trabalho experimental e também a resolução das

variações de diâmetro, o que constitui a principal vantagem deste

dispositivo. A escolha do coelho albino de raça neo-zelandesa justificou-

se pela facilidade de visualização dos vasos retinianos (Osborne, 1993).

5.1-Respostas vasoconstritoras

Os resultados apresentados mostram, in vivo, evidência qualitativa

das propriedades miogénicas da arteríola retiniana do coelho por

autorregulação, isto é, pela capacidade intrínseca do tecido vascular de

manter o seu fluxo sanguíneo em resposta às variações da pressão de

perfusão, dentro de uma margem relativamente larga. Esta resposta

reside principalmente nas células do músculo liso da parede vascular

(autorregulação miogénica) e é posteriormente modulada pelas

necessidades do tecido (autorregulação metabólica) e por factores

neurohumorais. A autorregulação assegura a constância da perfusão, não

135

obstante as variações da pressão intra e extraocular (Jarajapu et al.,

1994).

O estudo efectuado sobre o papel da serotonina na autorregulação

miogénica da arteríola retiniana in vivo, em coelho saudável, mostrou

evidência de que a arteríola possibilita a manutenção de uma perfusão

constante, uma vez que a pressão sanguínea se manteve dentro dos

valores normais. Esta propriedade oferece protecção frente à exposição a

valores superiores da pressão sistémica que poderiam causar

hemorragia. A anatomia única do leito vascular intraocular, em

particular a transição súbita da artéria oftálmica para as arteríolas

retinianas requer uma autorregulação fisiologicamente eficiente do fluxo

sanguíneo dentro das arteríolas retinianas. Embora esta autorregulação

miogénica na arteríola retiniana seja essencial para uma perfusão

constante e para o músculo liso arteriolar, não é necessariamente

indicativa das suas propriedades autorreguladoras, que podem variar ou

operar a um nível mais elevado (por ex. em resposta ao exercício

dinâmico), uma vez que recebem apenas uma porção do fluxo sanguíneo

da artéria oftálmica (Nemeth et al., 2002).

Relativamente aos resultados obtidos na avaliação do sistema

serotoninérgico, encontrámos algumas surpresas face ao

comportamento dos diferentes agonistas in vivo, nas arteríolas

retinianas do coelho, quando comparados com os resultados obtidos in

vitro por outros investigadores, e em arteríolas de outros tecidos do

globo ocular, nomeadamente as da íris e do corpo ciliar (Osborne et al.,

1990, 2008).

136

De todos os receptores 5-HT, talvez os subtipos 5-HT1D, 5-HT1B

sejam os que melhor se encontram caracterizados (Bradley et al., 1986;

Saxena and Villalon, 1990), especialmente a nível das células

musculares lisas perivasculares (Feniuk et al., 1983; Trevethick et al.,

1984, 1986; Connor et al., 1997; Martin et al., 1994). Encontram-se

distribuídos por regiões vasculares bastante diversificadas, entre as

quais a artéria carótida e seus ramos (Saxena et al., 1986, 1989) e a veia

jugular do coelho (Martin et al., 1994).

Os receptores 5-HT1D existem a nível do SNC de vários

mamíferos como o cobaio, o cão, o porco, o coelho e o ser humano

(Maura et al., 1993). A título de exemplo refira-se que o relaxamento da

artéria coronária do porco é mediado por este tipo de receptores

(Schoeffter e Hoyer, 1990; Hamel et al., 1990). Hamel e seus

colaboradores confirmaram também a sua presença a nível das artérias

cerebrais bovinas e humanas.

Os nossos resultados demonstram a existência provável de

receptores 5-HT1B a nível arteriolar, uma vez que houve uma resposta

vasoconstrictora à 5-HT, ao SUM, confirmada pelo antagonismo

verificado com a administração prévia de GR127,935 e de SB224,284.

Os receptores 5-HT2 que se encontram descritos no músculo liso da

aorta do coelho (Hoyer, 1994) e no corpo ciliar do macaco (Sheriff,

2008), existem também em múltiplas áreas do córtex cerebral do

Homem (Pazos et al., 1985). Escolhemos a cetanserina, de entre os

agentes selectivos, por apresentar uma selectividade razoável, segundo

Teitler (1990). Ao encontrarmos uma reactividade vascular para a α-

metil-5-HT, associado a um antagonismo nítido pela cetanserina e pela

espiperona, podemos inferir sobre a presença daqueles receptores, nos

137

vasos retinianos do coelho. É possível que a resposta menos acentuada

deste tipo de receptores se deva a uma menor percentagem dos mesmos

a esse nível, ao contrário do corpo ciliar onde são abundantes.

As respostas contrácteis obtidas com os agonistas

serotoninérgicos em coelhos normais foram, por vezes, quase nulas

quando comparadas com as obtidas em coelhos diabéticos. É que, além

do endotélio vascular, toda a restante estrutura morfo-funcional da

parede arteriolar retiniana e das células gliais se encontra alterada em

patologia como na diabetes (Valentin et al., 1998).

Não encontrámos respostas significativas para a 2-metil-5-HT

nem para o cisapride, o que exclui a presença de receptores 5-HT4. Não

encontrámos uma resposta nítida para outro agonista 5-HT, o 8-OH-

DPAT, (pA2=8.2 na ordem de potência).

Como a cetanserina é uma antagonista de ambas as substâncias 5-

HT e SUM, embora a sua potência de bloqueio seja menor que para os

receptores 5-HT2A, comprova a existência de receptores 5-HT1D que

medeiam a contracção, embora haja diferenças de espécie para espécie

(Martin, 1994; Humphrey et al., 1994).

Os receptores 5-HT2B são, segundo Hoyer extraordinariamente

difíceis de detectar em material vascular. A ordem de potência é a

seguinte: 5-HT=α-Metil-5HT>2-Metil-5-HT>SUM>8-OH-DPAT

(Hoyer et al., 1996).

Os trabalhos desenvolvidos para a detecção de 5-HT2A indicam

a necessidade de um efeito antagonista (mesmo que não selectivo) entre

a espiperona e a α-metil-5-HT e a cetanserina e este mesmo agonista.

Encontrámos uma resposta favorável no primeiro caso mas que não se

repetiu no segundo, o que, face à exiguidade de resultados, nos permite

138

confirmar apenas que nas respostas vasculares os receptores serão do

tipo 5-HT2.

Os fármacos com actividade vasoconstritora usados, todos

agonistas dos receptores 5-HT1 e 5-HT2 mostraram uma regulação

heterogénea do tónus da arteríola retiniana em condições normais. O

receptor 5-HT1B e o receptor 5-HT1D têm características estruturais

muito semelhantes e comportamento farmacológico idêntico. Alguns

receptores pré-sinápticos que inibem a libertação de 5-HT no cérebro de

roedores têm propriedades farmacológicas de um agonista 5-HT1B,

inibem a produção de cAMP na substância nigra e foram originalmente

definidos de acordo com critérios operacionais, admitindo-se serem

receptores específicos dos roedores. Quanto aos receptores 5-HT1D,

limitados aos não-roedores, teriam variações do seu perfil

farmacológico e uma localização divergente da dos receptores 5-HT1B

(Hannon e Hoyer, 2008). Contudo, as semelhanças nas características

transducionais, nas funções e na distribuição levaram à aceitação de que

os receptores 5-HT1B e 5-HT1D eram espécies homólogas (Hoyer, 1989

e Middlemiss, 1998). Com recurso a agentes de deslocação adequados e

um novo radioligando 5-HT1B/1D, [3H] GR-125743, foi possível

discriminar os locais de ligação sináptica 5-HT1B e 5-HT1D em roedores

e não roedores (Meneses, 2007). Os receptores 5-HT1B estão

localizados a nível pré-sináptico e pós-sináptico, especulando-se que

possam estar ainda em terminais não nervosos onde seriam sintetisados

e depois transportados de corpos celulares para outras regiões. Além de

tudo a localização anatómica dos receptores 5-HT1B proporciona forte

evidência de que possam ter um papel de ambos, autorreceptor e

heterorreceptor, isto é, de controlo da libertação de transmissor. Nos

não roedores exibem características farmacológicas de 5-HT1D (Hannon

139

e Hoyer, 2008). Os receptores 5-HT1B também foram encontrados nas

artérias cerebrais e outros tecidos vasculares. Por outro lado, admite-se

que o receptor possa estar silencioso, tornando-se capaz de responder

em condições como a ateroesclerose. A nível periférico os receptores 5-

HT1B medeiam a contracção das artérias caudais de rato.

Todos os fármacos antimigraine da série dos triptanos actuam via

receptor 5-HT1B. O sumatriptano (SUM), não distingue entre os

receptores 5-HT1B e 5-HT1D, mas o agonista dos receptores 5-HT1D,

PNU109291, desempenha um papel significativo na supressão da

inflamação meníngea neurogénica e nocicepção do trigémio no cobaio,

sugerindo o envolvimento do receptor 5-HT1D nas cefaleias da

migraine. Estes resultados estão de acordo com a detecção deste

receptor nas fibras do trigémio e no feixe espinhal do trigémio. Estudos

de imunorreactividade destes dois receptores permitiu localizá-los no

gânglio trigémio humano onde co-localizam com o CGRP, SP e NOS.

Todavia os agonistas selectivos 5-HT1D são destituídos de actividade

vascular, confirmando que é o receptor 5-HT1B que medeia a

vasoconstrição produzida pelo SUM. Em conjunto, estes dados são

sugestivos de que ambos, o componente vascular e neuronal são

necessários para os triptanos actuarem na migraine, mas não explicam

tudo (Hannon e Hoyer, 2008). Os receptores 5-HT1B e 5-HT1D têm sido

descritos serem modulados pela modulina 5-HT (um tetrapéptido,

LSAL) (Roussele et al., 1998). Os receptores 5-HT1B e 5-HT 1D podem

formar homo ou heterodímeros (Lee et al., 2000) o que não é

surpreendente dada a forte co-localização que tem sido referida a nível

do mRNA de várias espécies, embora com expressão muito mais

reduzida para o 5-HT1D. A serotonina (5-HT) induziu uma contracção

arteriolar dependente da dose, mas foi menos eficaz que o SUM uma

140

vez que correspondeu apenas a cerca de 60% do efeito máximo do

SUM. Estando os receptores 5-HT1 presentes tanto nas arteríolas como

nos neurónios do trigémio (Poyner, 1992) é improvável que o

sumatriptano na retina do coelho actue apenas na vasculatura.

5.2-Respostas vasodilatadoras

Também foram estudados diferentes péptidos vasodilatadores. A

existência de inervação peptidérgica já havia sido demonstrada nos

vasos oftálmicos de rato, em estudos de Ye et al., (1990) bem como as

respostas de vasodilatação induzidas pelo CGRP na artéria da retina de

boi in vitro (Prieto et al., 1991) e pelos VIP e SP na artéria oftálmica de

porco (Vincent, 1997). Até à presente data de entre os neuropeptídeos

identificados em fibras nervosas perivasculares aferentes, os que

apresentam maior distribuição são o CGRP e as taquicininas (Franco-

Cereceda et al., 1989, 1999, 2000); do ponto de vista funcional,

algumas destas substâncias possuem um papel de transmissor e/ou

modulador (Franco-Cereceda et al., 1988; Holzer, 1988).

A SP foi descoberta inicialmente no cérebro e no intestino por

Von Euler e Gaddum (1931). Existe praticamente em todos os vasos

sanguíneos do organismo humano nas fibras nervosas terminais.

Substâncias P-like estudadas por imunorreactividade estão presentes

numa pequena porção de células endoteliais (Milner et al., 1988).

141

Tendo presente este conceito, a justificação duma resposta

vascular à SP poderia aqui encontrar alguma explicação. No entanto,

parece-nos mais provável a sua libertação a nível das terminações

nervosas sensitivas trigemiais do músculo liso arteriolar retiniano.

A presença de neurocininas em vasos cerebrais humanos

(Uddman, 1983), apoia a hipótese da libertação de neuropeptídeos na

musculatura lisa ou a nível da adventícia média das arteriolas e vénulas,

permitindo a sua acção a nível endotelial ou a nível das fibras

musculares lisas (Regoli, 1998) e tendo um importante papel no

controlo vasoactivo do fluxo retiniano e na inflamação de origem

neurogénica. Pareceu-nos por isso importante a análise do

comportamento vascular retiniano em situação patológica que

comprometesse a rede vascular da retina. Por exemplo, o CGRP parece

ser importante na formação de neovasos durante patologia isquémica

(caso da diabetes experimental), inflamatória e cicatrizante

(Haegerstrand et al., 1990). Estas substâncias podem actuar a nível do

local de libertação, que para os grandes vasos se situa ainda longe do

endotélio, mas que está bastante perto em vasos como os da retina com

diâmetros menores (Regoli, 1998).

Os neuropeptídeos estudados encontram-se já descritos em

diversos segmentos vasculares (arteriolares e venulares) do nosso

modelo experimental (coelho). Assim, em alguns segmentos vasculares

arteriais do coelho (artéria pulmonar e aorta) foi descrito um efeito

bifásico dos neuropeptídeos (Constantine, 1990; DÓrléans-Juste, 1986)

– relaxamento e contracção. A remoção do endotélio deixou uma

resposta contráctil sensível à NKA. A veia jugular do coelho, por

exemplo, contrai na presença de SP. O motivo da opção experimental

por segmentos arteriolares e não venosos ou venulares deveu-se ao

142

facto da densidade de fibras musculares lisas em redor das artérias ser

superior às das veias (Furness et al., 1970; Barja et al., 1983; Uddman

et al., 1988; Gibbins et al., 1988). Sabendo que Edvinsson et al. (1988),

não encontraram diferenças de respostas de relaxamento (em potência e

em eficácia máxima) para o CGRP, a SP e a NKA na circulação

mesentérica, os nossos resultados, pelo contrário, demonstraram alguma

diferença que nos pareceu significativa.

Relativamente ao conjunto de hipóteses formuladas por outros

autores quanto ao mecanismo de acção dos neuropeptídeos estudados,

poderemos apenas afirmar com eles, que o efeito relaxante da SP em

artérias isoladas do coelho é devido à activação do receptor NK1

presente nas células endoteliais, o que por sua vez estimula a libertação

de Ca2+ e o sistema da calmodulina, levando à síntese e libertação de

um factor vasodilatador derivado do endotélio (EDRF), identificado

com o óxido nítrico (NO) (Busse et al., 1990). O NO por sua vez

penetra no músculo liso e activa uma guanilatociclase solúvel e a

produção de GMPc (Ignarro, 1986), relaxando as fibras musculares

lisas e favorecendo então a vasodilatação.

O neuropeptídeo CGRP é composto por 37 aminoácidos

codificados pelo gene da calcitonina. Estudos recentes parecem indicar

a presença de diferentes tipos de receptores. Duas das suas formas que

derivam de genes alfa e beta (CGRPα e CGRPβ) foram identificadas no

rato (Amara et al., 1985) e no ser humano (Steenbergh et al., 1985).

Foram também identificados fragmentos de CGRP que possuem efeitos

antagonistas (Donoso et al., 1990). A SP e o CGRP coexistem em

populações de neurónios sensoriais na circulação coronária e da aorta

(Gulbenkian et al., 1990). Em 1994 este mesmo investigador

demonstrou que a SP e a NKA derivam do mesmo percursor molecular.

143

Lesões do nervo trigémio produzem diminuição dos stocks de CGRP e

SP (estudos de imunoreactividade), nas terminações nervosas

perivasculares dos vasos cerebrais (Matsuyama et al., 1986; Wanaka et

al., 1986). O α-CGRP humano demonstrou ser um potente

vasodilatador em artérias mesentéricas humanas e do coelho. A resposta

a esta substância parece ser mais potente do que inclusivamente a

demonstrada pelo nitroprussiato de sódio (Helke et al., 1990). Todos

estes factos nos parecem verosímeis quando aplicados aos vasos

retinianos do coelho.

Dada a semelhança estrutural e funcional do endotélio vascular

retiniano e do SNC, poderemos, sem exagerar, mencionar alguns

estudos neuropeptidérgicos em vasos do SNC. Assim, a maioria das

artérias cerebrais (anteriores, médias, posteriores, vertebrais e

basilares), e as arteríolas da piamater na superfície do córtex cerebral,

são revestidas por finas varicosidades de fibras nervosas contendo

CGRP (Rosenfeld et al., 1983; McCulloch et al., 1988). A sua

colibertação pode ser explicada mais facilmente pelo facto do CGRP e

da SP serem dois neuropeptídeos que demonstraram ser vasodilatadores

cerebrais em muitas espécies animais (Edvinsson et al., 1987; Jansen et

al., 1992).

A potência do CGRP varia consideravelmente com a espécie

estudada: no gato, o CGRP provoca maior relaxamento vascular que a

SP em células musculares lisas dos vasos cerebrais. No entanto os

valores de EC 50 são similares. No Homem, estes valores também são

similares, mas o CGRP dilata apenas em baixas concentrações (Jansen,

1992). Por outro lado, não tem praticamente algum efeito nas veias da

piamater humana em estudos in vivo.

144

Os locais de ligação para o CGRP foram encontrados na média

e íntima das artérias coronárias do rato e na aorta (Sigrist et al., 1986).

Esta noção está de acordo com a hipótese de que o CGRP está

implicado no controlo do tonus vasomotor coronário. Sugere-se ainda

que esta substância pode exercer este controlo circulando nos vasos

(Matsuyama et al., 1986). De facto, ele foi detectado no plasma

sanguíneo humano, proveniente das terminações nervosas

perivasculares (Zaide et al., 1985). Estudos diferentes sugerem que esta

resposta vasodilatadora esteja não só associada ao NO como às

prostaglandinas (Brain et al., 1985) e até às catecolaminas (Fisher et al.,

2003), através da acção directa sobre a média com a activação da

adenilciclase (Edvinsson et al., 1987). Se, de facto, a vasodilatação

induzida pelo CGRP é dependente de endotélio intacto ou não,

permanece controverso. A sua potente acção vasodilatadora quer in vivo

quer in vitro não é modificada por bloqueio adrenérgico, colinérgico ou

histaminérgico (Edvinsson et al., 1988).

Os estudos sobre o comportamento farmacológico do CGRP

parecem indicar que, quer a vasodilatação (Brain e Williams, 1985),

quer a inibição da degradação da SP (Lee Greves et al., 1985), quer

ainda o aumento da sua libertação (Okuno et al., 1987) podem

constituir parte dos mecanismos segundo os quais o CGRP potencia a

resposta às taquicininas. Este comportamento pode, sem dúvida ser

extrapolado para a fenomenologia reguladora do tónus vascular

arteriolar retiniano.

A ordem de potência que encontrámos para as taquicininas

estudadas foi a seguinte: NKA≥SP>>NKB. Para a caracterização NK1

de receptores a ordem de potência é a seguinte: SP>NKA>NKB; e para

os receptores NK2: NKA>NKB>>SP (IUPHAR, 2008). A explicação

145

para os resultados encontrados é provavelmente a coexistência de

receptores NK1 e NK2, uma hipótese com base no antagonismo

selectivo do L668,169 e do L659,877.

É, no entanto, interessante verificar o diferente comportamento

de cada antagonista de per si, seguido da injecção perivascular de

CAPS (este antagonismo misto foi já descrito em outros tecidos

vasculares do coelho (veia safena, artéria pulmonar) por Osborne

(1990).

Os resultados obtidos no presente estudo mostraram um efeito

vasodilatador evidente e mensurável da SP, CGRP e NKA neste leito

vascular no coelho normal. Obteve-se uma resposta relaxante menos

acentuada após a injecção intra-vítrea periarteriolar de NKB e

senquetide. Uma vez que as fibras neuroniais que contêm CGRP estão

presentes no gânglio trigémio de todas as espécies já estudadas,

incluindo o homem e o coelho (Stjernschantz, 1984), alguns estudos

são sugestivos de que o CGRP e a SP ocorrem em subpopulações

específicas de nervos aferentes que vão prover o sistema vascular dos

mamíferos. Nas nossas experiências o CGRP e a SP produziram

respostas semelhantes, o que leva a admitir poderem ser libertadas pelas

mesmas terminações nervosas. De facto exitem provas de que uma

taquicinina pode ser sintetisada e libertada juntamente com o CGRP

pelo mesmo neurónio sensorial (Holzer, 1988; 1991). As lesões do

gânglio trigémio induzem diminuição da imunorreactividade de ambos,

CGRP e SP, nas fibras nervosas que vão inervar os vasos sanguíneos

cerebrais. Além disso, o CGRP e a SP, mas também a NKA estão

expressas e são possivelmente libertadas pelos mesmos neurónios

146

(D´Orleans-Juste et al., 1986; Holzer, 1988). Estudos anteriores revistos

por Holzer (1988) haviam demonstrado que a SP e a NKA são

derivadas de uma molécula precursora comum. A hipótese desta co-

libertação é confirmada pelos resultados das experiências que

realizámos, uma vez que os antagonistas dos receptores destes

neuropeptídeos inibiram a resposta à capsaicina.

Foi demonstrado ainda que a SP é mais potente que a NKA, mas

de duração de acção mais curta que o CGRP (Holzer, 1991). No nosso

modelo, a NKA pareceu ser menos potente do que a SP (pED50 12,52

+ 0,31 e 12,50+ 0,11) para valores de Emax de 53,3 + 2,5% e 21,3+

2,3%, respectivamente. A SP e taquicininas relacionadas podem actuar

perto do localda sua libertação, que pode ser bastante afastado do

endotélio, como acontece nos grandes vasos ou talvez não muito longe,

nos vasos pequenos, como os retinianos (D`Orleans-Juste et al., 1986).

Têm sido identificados três receptores das taquicininas, NK1,

NK2 e NK3 (IUPHAR, 2008). A SP mostra maior afinidade para o

receptor NK1, a NKA para o receptor NK2, a NKB e o Senquetide para

o receptor NK3 (Holzer, 1991). Os resultados que descrevemos

anteriormente são demonstrativos de que na circulação retiniana do

coelho NZW, a ordem de potência das taquicininas é NKA > SP >>

NKB. Uma vez que este último neuropeptídeo e senquetide exibem

baixa eficácia, é possível que exista apenas uma baixa densidade de

receptores NK3. O reduzido efeito obtido com a NKB e o senquetide

podem ser também explicados através de outros receptores: NK1 e/ou

NK2. A ordem de potência para os receptores NK1 deve ser SP > NKA

> NKB e, para o receptor NK2 seria NKA > NKB >> SP ( IUPHAR,

2008). Os resultados que obtivemos nas experiências efectuadas são

sugestivos da coexistência de receptores NK1 e NK2, uma hipótese

147

sustentada pelo antagonismo selectivo evidenciado pelos compostos L-

668,169, GR 159897 e L-659,877 (Saria et al. 1985; Mcknight,1990;

Maggi et al., 1992). O antagonista do CGRP, CGRP8-37, reduz o efeito

da SP e da NKA, tornando plausível a possibilidade de que o CGRP

endógeno esteja desempenhando um papel na resposta. A injecção

periarteriolar do antagonista isolado (dos não mostrados) suportam esta

hipótese.

Dos resultados que apresentámos podemos concluir, pela

existência de receptores NK1, NK2 e CGRP nas artériolas retinianas do

coelho. Os resultados com a capsaicina após o uso de antagonistas dos

receptores NK1, NK2 e do CGRP são também sugestivos da existência

de terminações nervosas sensitivas adjacentes às artériolas retinianas

que contêm SP, CGRP e NKA. Além disso, estes péptidos podem ter

um papel relevante na homeostasia vascular, de modo idêntico a outros

agentes como o óxido nítrico, endotelinas e prostaglandinas. Muito

embora diversos estudos anteriores tenham comprovado a presença de

receptores de neuropeptídeos na circulação retiniana, bem como os seus

efeitos em vasos sanguíneos oculares isolados, este estudo parece ser

significativo porque proporciona a primeira evidência in vivo dos

efeitos dos neuropeptídeos na retina.

A importância clínica do conjunto dos nossos resultados leva a

aceitar que a microinjecção dos antagonistas selectivos dos receptores

das taquicininas e do CGRP poderá providenciar um modo de alívio da

dor, inflamação e degradação do endotélio (em doentes com diabetes ou

outras doenças isquémicas da retina), que ocorrem sob actividade

excessiva de fibras sensoriais do trigémio.

148

5.3-Respostas aos Inibidores da NOS

É bem conhecido que o endotélio pode mediar a regulação do

tónus vascular através da libertação de óxido nítrico (NO) e de outros

relaxantes do músculo liso. Ambos, o inibidor da NOS, a L-NNA, e o

inibidor da guanililciclase solúvel, ODQ, têm um efeito inibidor sobre o

relaxamento induzido pelo CGRP nas artérias retinianas isoladas de

bovino (Boussery et al., 2005).

O aspecto que nos pareceu mais importante deste trabalho,

reside, sem dúvida, na identificação de respostas a um conjunto de

substâncias vasoactivas a nível do Sistema Nervoso Central (SNC) e

que ainda não foram alvo de estudo a nível vascular retiniano,

concretamente a nível arteriolar e justa-papilar, através da análise

metódica da variação do diâmetro vascular e velocidades de fluxo

destes vasos quando são submetidos in vivo a concentrações crescentes

destas substâncias.

Parece relevante salientar que, ao contrário de Pietscher et al.,

(1996), antes de iniciarmos estes estudos, não encontrámos variações

circadianas do diâmetro vascular no nosso modelo experimental, o que

facilitou a execução do mesmo.

Não parece existir expressividade de receptores NK3, o que

corresponde ao achado de outros investigadores de uma percentagem

baixa de presença deste tipo de receptores nas espécies de mamíferos.

Os resultados sugerem ainda um envolvimento preferencial de

receptores NK2 versus NK1 e provavelmente a sua estimulação

simultânea na parede das arteríolas retinianas. São necessários estudos

149

imunocitoquímicos, para evidenciar a sua presença a nível endotelial ou

a nível das células musculares lisas que revestem o endotélio.

Em algum momento do nosso estudo averiguámos a reactividade

das vénulas a estas substâncias (dados não mencionados). Ao contrário

de outros investigadores encontrámos respostas do mesmo tipo nestes

vasos retinianos, embora muito menos intensas (de tal forma que

decidimos não as incluir neste trabalho).

Em conjunto, os resultados parecem indicar que aparentemente,

microinjecções de antagonistas selectivos NK e do CGRP poderão

diminuir os processos inflamatórios, a dor e a disfunção endotelial (na

diabetes e outras doenças isquémicas) que ocorrem sob uma actividade

excessiva das fibras sensoriais do trigémio. Além disso, podemos

inferir outras conclusões: tal como Hoyer (1994) havia demonstrado, a

SP possui apenas um efeito moderado sobre os pequenos vasos como as

arteríolas.

Não foi propósito do nosso estudo detectar a presença de

inervação serotoninérgica ou neuropeptidérgica (sensorial) a nível das

arteríolas retinianas justa-papilares do coelho. Procurámos sim, poder

sugerir que a esse nível existem, de facto, receptores para estes dois

sistemas, e que poderão contribuir para a regulação do tonus vasomotor

da circulação retiniana, além de poderem participar em fenómenos de

natureza inflamatória, álgica e espástica.

Na diabetes e no glaucoma experimentais, procurámos estudar o

comportamento destes receptores, de forma a poder contribuir

experimentalmente, de alguma forma, para o desenvolvimento de novas

abordagens na terapêutica. A via(s) de administração a utilizar, invasiva

150

(intravítrea), tópica em colírio ou por via transescleral através de

sistema de libertação prolongado, será um critério posterior a

equacionar de acordo com as características farmacodinâmicas da

substância a ensaiar. Sob a forma de colirio ou utilizando dispositivos

polimerizados para implante subconjuntival, a difusão do segmento

anterior para o posterior, incluindo os processos ciliares e os vasos

retinianos, é, como se sabe, bastante rápida (Havener, 1994). Os

resultados obtidos pareceram-nos esclarecedores quanto à disfunção

endotelial induzida pela diabetes e o glaucoma. Como se observou, toda

a resposta à estimulação de receptores se encontrou prejudicada,

questionando-nos se existem diferenças de membrana ou dos

mecanismos transdutores/efectores.

Sabendo, no entanto, da possibilidade de extrapolação destes

resultados experimentais para o ser humano (mencionado por vários

autores em estudos comparativos anátomo-fisiológicos entre o coelho e

o Homem), trabalhos posteriores nossos (não publicados) de

estimulação directa do gânglio de Gasser (n=3) induziram

vasodilatação ainda que discreta a nível das arteríolas retinianas do

coelho, o que confirma de algum forma a presença de capsaicina nas

terminações nervosas sensitivas do nosso modelo experimental,

conforme demonstrado. Especula-se se, apesar dum endotélio

disfuncional, a acção farmacológica de substâncias serotoninérgicas ou

neuropeptidérgicas com relativa selectividade para determinados

receptores localizados na célula muscular lisa arteriolar, do próprio

endotélio ou da glia que o circunda, poderá ter efeitos benéficos na

patologia referenciada.

Não injectámos todos os agonistas por via endovenosa pela

elevada toxicidade (taxa de mortalidade alta) observada no decurso

151

deste tipo de experiências mesmo quando administrados em doses não

letais. Conseguímos concretizá-lo, no entanto, com o SUM, que revelou

parcial inibição da contracção o que poderá reforçar talvez o conceito

de Barreira Hemato-Retiniana (BHR) interna (endotélio dos vasos

retinianos) e|ou associado ao conceito de inexistência de receptores

sensitivos ao SUM (Saxena et al., 1998). Como a injecção sistémica de

SUM não alterou os diâmetros vasculares, conclui-se que,

possivelmente esta substância, como aliás todos os agonistas 5-HT

testados no conjunto de experiências, não atravessa a BHR. Este facto

poderá indicar que os receptores não se localizam a nível endotelial mas

a nível miogénico liso.

Em análise, provavelmente a teoria trigémio-vascular da

migraine e do glaucoma normotenso poderá ter a mesma origem: um

aumento do CGRP com a colaboração da SP e da NKA provocam

vasodilatação e inflamação locais (por aumento do NO), através da

estimulação de receptores 5-HT 1B/1D e 5-HT2.

O NO é um mediator importante das funções homeostáticas do

olho, incluindo a regulação da dinâmica do humor aquoso,

processamento neuronial visual, modulação local do fluxo ocular do

sangue e controle da morte, por apoptose, das células ganglionares. As

mudanças na quantidade de NO podem contribuir para patologia

diversa como a uveite, retinite e o glaucoma (Kotikoski et al., 2002).

Alguns resultados indicam que o NO possui um papel no

autorregulação da circulação no nervo óptico durante o processamento

de entrada/saída elevada de humor aquoso. Isto significaria que o NO

fornece alguma neuroprotecção durante uma fase aguda da doença

152

isquémica do nervo (Okuno, 2002). É crescente a evidência de que o

NO seja um agente antiproliferativo e citotóxico para as células

retinianas. Diversos estudos experimentais recentes indicam que NO

medeia as acções neurotóxicas do glutamato que são responsáveis pela

doença isquémica retinana. Em acréscimo, a neurotoxicidade do

glutamato foi demostrada ser atenuada pela inibição da actividade das

NO sintetases (Hattenbach et al, 2000). Este gás endógeno possui um

papel na regulação de funções vasculares retinianas contribuindo assim

para a patofisiologia da retinopatia. As células endoteliais vasculares

retinianas e os pericitos (de origem monocítica) sintetizam a iNOS sob

circunstâncias estimuladas, e níveis elevados de L- Arginina são

observados no humor aquoso de pacientes diabéticos. Demostrou-se

este acontecimento pela administração de aminoguanidina a ratos

diabéticos e consequente inibição do desenvolvimento de retinopatia

diabética. O NO tem um intermediário altamente reactivo, o

peroxinitrito, que está ligado à lesão na diabetes.

Os modificadores do NO (L-NAME e a aminoguanidina), ao

inibirem as NOS promovem um aumento da pressão intraocular. Este

facto leva a supor que a iNOS é responsável pelo controlo da TIO

através da produção de NO: pela inibição da iNOS (com a

aminoguanidina) e aplicação de L-arginina há redução da TIO, o que

pode significar que as outras isoformas estão activas ou que não houve

uma inactivação total da iNOS (neste caso, com base nos resultados

observados, parece não ter ocorrido uma inibição completa desta

enzima). Pelo contrário, a inibição da eNOS e da nNOS (com L-NNA)

não impede a diminuição da TIO pela L-arginina pelo que a iNOS está

a produzir NO. O L-NAME (inibidor das três isoformas), é o que se

153

mostra mais eficaz dado que a L-arginina não consegue sobrepor esta

inibição.

Outros autores aplicaram por via intravitrea SNAP (20 nmol) e

verificaram que este farmaco aumentava o calibre da artéria retiniana na

margem da cabeça do nervo óptico 60 a 120 minutos mais tarde e o

fluxo capilar na cabeça do nervo óptico 90 a 135 minutos mais tarde.

Verificou-se a existência de uma relação dose-resposta entre 2 a 20

nmol. O SNAP reduziu inicialmente a resistência dos vasos sanguíneos

na cabeça do nervo óptico e a pressão de perfusão na cabeça do nervo

óptico, seguida de um aumento do fluxo sanguíneo capilar na cabeça do

nervo óptico (Lapa, 2004)).

A administração tópica de nitrovasodilatadores reduz

marcadamente a TIO em coelhos e macacos por um mecanismo que

envolve principalmente o aumento do fluxo de humor aquoso do olho.

A menor produção de NO foi observada em pacientes com glaucoma

primário de ângulo aberto. O L-NAME tem efeito bloqueador

muscarínico (Oswald et al., 1995) e provoca redução da inflamação.

Em relação à aminoguanidina, a sua relação com a entidade diabética

baseia-se no facto de ser um composto que é um inibidor potente da

formação do produto final da glicação avançada induzida por

hiperglicémia associada à diabetes (Lapa, 2004).

Uma vez que o fluxo sanguíneo retiniano está diminuído em

condições de TIO elevada, é possível que a pressão elevada despolete a

actividade da NOS que se destina a restaurar o fornecimento basal de

sangue. Além disto, Neufeld et al. (1999) mostraram que a aplicação de

aminoguanidina (inibidor da iNOS) reduziu o dano nas células

ganglionares retinianas em retinas com elevada TIO para menos de

154

10% em 6 meses (Lapa, 2004).

No estudo presente, o óxido nitrico parece ser um regulador

importante do fluxo ocular do sangue, provavelmente pela via da iNOS.

De acordo com estes resultados, a L-Arginina, um precursor do NO,

diminuiu provavelmente o processador de entrada/saída do humor

aquoso. O L-NAME, inibidor de todas as isoformas das NO sintetases,

aumentou o processador de entrada/saída do mesmo, de um modo

significativo.

O mesmo aconteceu com a aminoguanidina, um inibidor do

iNOS, mas não com o L-NNA, um inibidor da eNOS e da nNOS.

Assim, neste modelo experimental, a iNOS pode ser envolvida na

produção e/ou drenagem do humor aquoso. No modelo experimental do

glaucoma, a L-arginina podia diminuir o processador de entrada/saída.

O L-NAME indicou uma tendência para diminuir o processador de

entrada/saída, embora este efeito pudesse ser devido ao facto deste

processo se encontrar num nível tão elevado que este composto não o

poderia aumentar mais. Consequentemente, o NO contribui para a

diminuição do processador de entrada/saída, embora em excesso, como

demonstrado em outros estudos experimentais, pode conduzir à

degenerescência das células gaglionares no glaucoma.

Algumas observações inferem que a produção de NO parece

estar aumentada nos olhos de doentes diabéticos embora sem

retinopatia. Este dado suporta a hipótese que os efeitos mediados pela

citoquina ocorrem antes do início das mudanças morfológicas da

vasculatura. Há uma probabilidade razoável que situações patológicas

tais como a diabetes mellitus em que a expressão da iNOS depende da

existência de concentrações elevadas do NO podem ser um factor

155

significante no regulamento das funções vasculares retinianas e nas

modificações proliferativas intraoculares (Hattenbach et al., 2000).

Uma vez que a iNOS é induzida, pode também ser inibida

directamente por inibidores da iNOS, tais como a L-arginina ou

análogos (L-NMMA, NG- amino-hemo-arginina, NG- amino-L-

arginina, arginina- dimetil, oxihemoglobina, azul de metileno e NG-

nitro-L-arginina), aminoguanidina e a S-metilisotiourea (Chiou, 2001).

O L-NAME, como se sabe, inibe as três NOS, sendo apenas a iNOS

inibida pela aminoguanidina (as outras duas estão disponíveis para

sintetizar NO e, assim, promoverem um efeito vasodilatador).

Constatou-se que a L-arginina, o percussor da formação de NO,

dose-dependente, baixa o processador de entrada/saída de humor

aquoso. Este estudo mostra claramente que os NO-dadores e os cGMP-

activadores baixam a pressão intraocular quando são absorvidos ou

injectados directamente no olho (Kotikoski et al., 2002)

Chiou e seus colaboradores patentearam e publicaram o uso da

L-arginina e seus análogos para baixar a TIO, baixando os níveis do

processador de entrada/saída de humor aquoso e aumentando o fluxo

ocular do sangue nos olhos do coelho. Sugeriram ainda mais: que estes

percursores de NO podem também ser utilizados para tratar retinopatias

isquémicas e mesmo patologia isquémica cerebral. Ao mesmo tempo,

Nathanson (1992) relata que os dadores de NO, como o nitroprussiato,

o isossorbido, o minoxidil, a hidralazina, o nitrato de sódio e a

nitroglicerina, baixam também o processador de entrada/saída sem

produzir efeitos sistémicos cardiovasculares. Estes resultados indicam

que ambos os percussores e dadores de NO podiam ser usados para o

tratamento do glaucoma através da redução do processador de

156

entrada/saída de humor aquoso e/ou melhoria do fluxo ocular do sangue

(Chiou, 2001).

Como em outros formulários da neurodegenerescência, um

desenvolvimento do tratamento neuroprotector eficaz no glaucoma

parece ser complicado devido às interações complexas de diversas

linhas celulares que determinam o destino final da célula neuronal. É

provável que mesmo se um dos caminhos identificados que possa se

encontrar associado à neurodegenerescência glaucomatosa estiver

obstruído, a morte da célula endotelial possa ser mediada ainda por

outros circuitos alternativos. Consequentemente, as estratégias

neuroprotectoras podem passar por impedir uma escala larga de

circuitos para a apoptose e não apenas um único ou alguns.

Alternativamente, as estratégias de neuroprotecção podem ser dirigidas

realçando os mecanismos protectores intrínsecos (Harris, 2008).

Parece que há um denominador comum, o NO, na etiologia das

doenças oculares e no seu tratamento, impedindo a sua manifestação.

Propõe-se que a produção maciça de NO em consequência da indução

da iNOS poderia minimizar lesões posteriores retinianas centrais

degenerativas que podem conduzir ao glaucoma, inflamação ocular,

degenerescência macular, retinopatia, miopia e catarata senile. É

altamente possível que o uso dos inibidores da actividade da iNOS e da

indução da iNOS possa resultar na prevenção/tratamento da maioria, se

não todas, estas doenças oculares (Chiou, 2001).

Estudos recentes apresentados em congressos (ARVO, 2008)

atribuem um futuro promissor à terapêutica oftalmológica que

preconiza, além de técnicas de terapia génica de que é exemplo a

utilização do CD59 por adenovirus humano para o tratamento da fase

precoce da doença macular relacionada com a idade (DMI), outras

157

abordagens terapêuticas, tendo como alvos selectivos receptores

específicos em vasos retinianos, que, uma vez estimulados, alterem uma

função tecidular específica, já anteriormente postulado por Moroi e

Lichter (1999). Considera-se assim da maior importância o

desenvolvimento de técnicas de administração intraocular com

dispositivos médicos “medical devices”, associada à microinjecção ou

microimplante de fármacos in vivo (Juhl et al., 2006), com o propósito

terapêutico ou profiláctico, no sentido da neuroprotecção (Kwan et al.,

2006), como a aplicação recente de um promotor retiniano (VMD2) que

impede a neovascularização coroideia. A utilização `a posteriori de

dispositivos médicos, contendo substâncias farmacológicamente

activas, com suporte da engenharia biomédica na área da

nanotecnologia (em concreto com polímeros), será uma consequência

imediata desejável.

CONCLUSÕES

1. Os nossos resultados demonstram a existência provável de receptores 5-

HT1B/1D a nível arteriolar retiniano, dada a resposta vasoconstrictora à 5-

HT, ao SUM, confirmada pelo antagonismo verificado com a

administração prévia de GR127,935 e de SB224,284.

2. A reactividade vascular para a α-metil-5-HT, associada a um antagonismo

nítido pela cetanserina e pela espiperona, pode inferir sobre a presença de

receptores 5-HT2, nos vasos retinianos do coelho.

3. Sugere-se também a coexistência de receptores NK1 e NK2, uma hipótese

com base no antagonismo selectivo do L668,169 e do L659,877. Conclui-

158

se ainda da existência de receptores CGRP nas artériolas retinianas do

coelho. Os resultados com a capsaicina após o uso de antagonistas dos

receptores NK1, NK2 e do CGRP são também sugestivos da existência de

terminações nervosas sensitivas adjacentes às artériolas retinianas que

contêm SP, CGRP e NKA.

4. Os resultados obtidos pareceram-nos esclarecedores quanto à disfunção

endotelial induzida pela diabetes e o glaucoma experimentais. Como se

observou, toda a resposta à estimulação de receptores se encontrou

prejudicada.

5. Nestes ensaios, o L-NAME mostrou uma tendência para diminuir a IOP,

relativamente ao controlo BSS; neste caso a pressão intraocular está

eventualmente no máximo pelo que este fármaco não tem qualquer efeito.

A L-arginina mostrou ser capaz de diminuir a IOP em coelhos

“glaucomatosos”. No modelo experimental do glaucoma, a L-arginina

podia diminuir o processador de entrada/saída. O L-NAME indicou uma

tendência para diminuir o processador de entrada/saída alterando a TIO,

reduzindo o fluxo sanguíneo arteriolar. Consequentemente, o NO parece

contribuir para a diminuição do processador de entrada/saída. Pode

concluir-se que o L-NNA (mesmo em alta concentração) não tem efeito.

A curva é muito semelhante à do ensaio com BSS e L-arginina.

6. O L-NAME e a aminoguanidina, ao inibirem as NOS promovem um

aumento da pressão intraocular; nestes casos a L-arginina teve um efeito

parcial uma vez que o abaixamento provocado não foi semelhante ao do

BSS + L-arginina.Após administração intraocular dos vários compostos

em estudo,verificou-se que o L-NAME e a aminoguanidina, inibidor das

159

três NOS e da iNOS, respectivamente, aumentaram a pressão intraocular

enquanto o SNAP (dador de NO) e a L-arginina (precursor de NO)

tiveram um efeito hipotensor ocular. O L-NNA (inibidor da cNOS)

provocou apenas um ligeiro aumento da IOP.

7. Os receptores para estes dois sistemas (serotoninérgico e

neuropeptidérgico) poderão contribuir para a regulação do tonus

vasomotor da circulação retiniana via NO entre outras, além de poderem

participar em fenómenos de natureza inflamatória, álgica, espástica e

isquémica existente na diabetes e no glaucoma.

160

CAPÍTULO VI

R E S U M O , B I B L I O G R A F I A , Í N D I C E

161

CAPÍTULO VI

6.1-RESUMO

O conhecimento farmacológico das substâncias relacionadas com o

sistema serotoninérgico e neuropeptidérgico é presentemente bastante

vasto, embora ainda controverso (Osborne, ARVO, 2008). Concretamente,

em relação à serotonina (5-HT), conhecemos bem a sua origem bem como

a sua distribuição no organismo humano, assim como a sua degradação

enzimática e as suas acções farmacológicas mesmo em situações de

patologia. No entanto, novos conceitos se vão abrindo quanto ao seu papel

fisiológico, nomeadamente a nível vascular cerebral e retiniano.

A existência de uma barreira hemato-retiniana (BHR) interna e externa

pressupõe uma regulação do fluxo sanguíneo e por consequência do aporte

nutricional para a retina, que é autoregulado nos vasos retinianos. A

implicação secundária deste dado é a da alteração dos mecanismos

fisiológicos do endotélio vascular que constitui a BHR-interna, em

situações normais ou patológicas (como na pré-retinopatia diabética ou o

glaucoma, por exemplo). É de extrema importância compreender quais as

substâncias envolvidas nestes mecanismos, quer em situações normais quer

162

patológicas, e de que forma elas poderão influenciar os resultados

espectantes.

Neste contexto decidiu-se estudar os sistemas serotoninérgico e

neuropeptidérgico in vivo no coelho albino da raça Nova Zelândia, em

arteríolas retinianas justa-papilares, através da quantificação da

reactividade vascular avaliada pela variação de diâmetros vasculares

(captada por angiografia digitalizada e por vídeo) e de fluxos arteriolares

(através do sistema doppler), em coelhos normais e diabéticos.

Os resultados permitiram concluir da existência de receptores 5-HT

1B/1D e 5-HT2 a este nível, responsáveis por fenómenos de vasoconstrição

arteriolar retiniano com diminuição de fluxos sanguíneos, assim como

receptores NK1, NK2 e do CGRP (classificação da NC-IUPHAR -União

Internacional de Farmacologia- de 2008) com expressividade

vasodilatadora e consequentemente aumento dos fluxos arteriolares

retinianos.

Permitiram ainda sugerir a existência de inervação sensitiva a nível das

arteríolas retinianas do coelho, com implicação provável na resposta

neurogénica e inflamatória a este nível, além da falta de expressividade

vascular dos receptores citados perante um endotélio retiniano

disfuncional quer em coelhos diabetizados pela aloxana quer em coelhos

com hipertensão ocular.

Conclui-se ainda, da possível importância de alguns mediadores do

óxido nítrico (NO) como agentes na expressividade dos receptores

descobertos em patologias como o glaucoma e a diabetes.

Para o tratamento sintomático de algumas doenças oculares de origem

vascular, um doador de NO ao ser administrado por uma determinada via,

aumentaria quantidades pequenas de NO que activariam a guanilciclase na

163

produção de GMPc, baixando o processador de entrada/saída do humor

aquoso, aumentando o fluxo ocular do sangue, relaxando o músculo ciliar,

etc. (Chiou, 2001). De acordo com os resultados obtidos, a terapêutica anti-

glaucomatosa, por exemplo, visaria a associação de um dador de óxido

nítrico (que promove a diminuição do processador de entrada/saída de

humor aquoso) com um inibidor da iNOS que impede efeitos nocivos do

excesso de NO na neurodegenerescência retiniana.

6.2-SUMMARY

The characterization of retinal vessel receptors as well as their specific

function is not completely clarified. The serotonergic system is one of the

systems that are not completely characterized on retinal vessels.

Controversy still also exists for the neuropeptidergic system which is not

completely characterized on retinal vessels of some mammalian species.

This work studied in vivo the retinal serotonergic, neuropeptidergic and NO

modifier systems by studying the vascular response (vasodilation and/ or

vasoconstriction) of New Zealand White (NZW) rabbit retinal vessels.

Data was obtained by direct measure of vascular diameters (retinal

arterioles at 2 discs of ONH) using digital angiography after intravitreous

perivascular microinjection of drugs into the eye ball (n≥6 for each

experience), as well as measurements of arteriolar blood flows with a CDI

device. Quantification is expressed in percentage relaxation (increase) or

contraction of basal vascular diameter (%).

After the intravitreal microinjection of 10 nmol serotonin (5-HT), an

initial slight vasodilator effect was observed, followed by a dose-dependent

164

arteriolar constriction; the maximal contractile effect was obtained with 10

nmol 5-HT (the maximal vascular diameter reduction (Emax±SEM) was

29.4±1.5% at the arteriolar level. Sumatriptan, a 5-HT1B/1D receptor

agonist, when given by intravitreal injection (10 nmol) had the most potent

vasoconstrictor effect at the arteriolar (Emax±SEM =44.8±1.0%) level with

a strong decrease of blood flow. No significant effect was verified when the

same doses of sumatriptan were administered intravenously. The

contractile effect induced by 5-HT or sumatriptan was reversed by the

intravitreal injection of all serotonergic antagonists. α-Methyl-5HT (10

nmol), a 5-HT1 receptor agonist, also caused vasoconstriction, an effect

antagonized by 10 nmol of ketanserin. 8-OH-DPAT, a 5-HT1A receptor

agonist, did not show a significant effect and neither did 2-Methyl-5HT (5-

HT3 agonist) and cisapride (5-HT4 agonist). Rabbits diabetized with

alloxane showed no response to 5-HT modifiers and neuropeptides.

Our results also suggest the presence of 5-HT2 and 5-HT1B/1D

receptors on the arteriolar retinal circulation of the rabbit. They also

suggest that sumatriptan probably does not cross the blood-retinal barrier

(endothelium of retinal vessels) and that there is no specific response to 5-

HT agonists on alloxan-induced diabetic rabbits.

The characterization of retinal vessel responses to specific

compounds such as calcitonin gene-related peptide (CGRP) and related

tachykinins as well as their specific function at this level has not been yet

unequivocally identified. This work also aimed to study in vivo the

response to Substance P (SP), Neurokinin-A (NKA), Neurokinin-B (NKB),

Senktide, Capsaicin (CAPS) and CGRP. Microinjection of Substance P

(NK1 receptor agonist) induced a dose-dependent arteriolar dilating effect,

being Emax obtained with 1 nmol (the maximal vascular diameter

enlargement (means ± SEM) was 21.3± 2.3% at the arteriolar level). After

165

perivascular preinjection of 1 nmol L-668,169, a NK1 antagonist, the

vascular diameter enlargement was 15.2+3.2% at the arteriolar level. As

for CGRP, doses up to 10 nmol induced a marked vasodilation (means±

SEM: 41.1±0.4% at the arteriolar level). The same type of response was

obtained with 10 nmol of NKA (NK2 receptor agonist) which induced the

most potent effect of all neuropeptides used (means±SEM: 53.3±2.5% for

arterioles). After perivascular preinjection of the NK2 antagonist L-

654,877 (10 nmol) the vascular diameter enlargement was 37.0±0.7% at the

arteriolar level.

Capsaicin, a vanilloid agonist responsible for the release of

neuropeptides from peripheral endings of afferent neurons, showed a

marked vasodilating effect (means±SEM: 43.0±2.9%) with an increase of

arteriolar blood flow. After perivascular microinjection of NK3 agonists

(senktide and NKB) a less prominent vasodilating effect was observed

(means±SEM: 6.8±0.7%; 14.3±1.2%, respectively).

These results suggest the presence of neuropeptide receptors (NK1,

NK2 and CGRP receptors) on the ONH of the retina vascular wall of the

rabbit, probably contributing to the vasomotor auto regulation and

neurogenic inflammation at this level. They also suggest the existence of

endothelial dysfunction on diabetic retinal vessels, characterized by an

impaired response to all tested neuropeptides.

A possible approach to neuroprotection and reduction of IOP may

be accomplished by NO modulators which were also characterized in the

studies (iNOs), especially in our experimental glaucoma model. A

correlation between these three group of modulators (serotoninergic,

neuropeptidergic and NO) may be possible to establish and be useful for

knew therapeutic challenging approaches to the isquemic ocular diseases.

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234

ÍNDICE pag. Prefácio……………………………………………………………………9

Capítulo I

I-Introdução……………………………………………………...............13 1.1-Importância da componente interna da Barreira Hemato-Retiniana nos

mecanismos de auto-regulação intrínseca da vascularização retiniana e da componente

extrínseca, através da mediação por fármacos...............……………………………..22

1.2-Revisão anatómica actualizada da inervação aferente,

simpática e parassimpática do globo ocular…………………………………….........41

1.3-Inervação e vascularização da retina humana e da retina do coelho..........45

1.4-Embriogénese e estrutura dos vasos retinianos no Homem e no coelho....50

Capítulo II

II-Objectivos………………………………………………………….…56

2.1-Justificação e definição dos objectivos………………………………......57

2.2-Objectivos específicos…………………………………… ………......….63

Capítulo III

III-Material e Métodos………………………………………………......70

3.1.1-Modelo animal utilizado e avaliação de parâmetros……………….......71

3.1.2-Preparação e experimentação de vários tipos de micropipetas de

microinjecção…………………………………………………………………………73

235

3.1.3-Padronização das técnicas de microinjecção intraocular in vivo a nível

dos vasos retinianos………………………………………………..............................74

3.1.4-Análise dos fluxos com CDI………………………...............................79

3.1.5-Análise de Imagem…………………………………………..................81

3.1.6-Indução de Diabetes experimental……………………………………..83

3.1.7-Indução de Glaucoma experimental……………………………….......87

3.1.8-Protocolo experimental……………………………………...................91

3.1.9-Fármacos utilizados e soluções…………………………………….......92

3.1.9a-Modificadores do Sistema Serotoninérgico……………..........93

3.1.9b-Peptídeos…………………………………………..................97

3.1.9c-Modificadores do NO…………………………….................101

3.1.10-Análise dos dados e estatística………………………………............103

Capítulo IV

IV-Resultados…………………………………….................................105

4.1-Estudos com vasoconstrictores…………………………………………107

4.2-Estudos com vasodilatadores…………………………………………...116

4.3-Estudos com os modificadores do NO………………………………….125

4.3.1-Resultados com CDI………………………………………….129

Capítulo V

V-Discussão e Conclusões ……………………………….....................133

5.1-Respostas vasoconstrictoras.....................................................................134

5.2-Respostas vasodilatadoras........................................................................140

5.3-Respostas aos inibidores da NOs.............................................................148

236

Capítulo VI

6.1- Resumo………………………………………………………........161

6.2- Summary…………………………………………..........................163

6.3- Bibliografia………………………………………………………..166

6.4- Publicações relevantes…………………………………………….228

6.5- Índice………………………………………………………….......234

ADENDA

Índice de Figuras e Quadros

ADENDA Índice de Figuras e Quadros Pág Fig.1 Estrutura da retina dos mamíferos e sua conexão com os vasos retinianos e

coroideus (notar o posicionamento dos vasos peripapilares em relação à divisão

topográfica das células retinianas, nomeadamente ganglionares e de

suporte)…………………………………………………………………………………….46

Fig.2- Retinografia digital (preto e branco) de coelho albino…………………..….48

Fig.3- Pormenor da arquitectura neurovascular da hemiretina temporal esquerda

do coelho albino (salienta-se a visualização de vasos peripapilares, retinianos e

coroideus)…………………………………………………………………………………50

Fig.4-Fotografia do sistema de micropipetas a inserir intraocularmente……….76

Fig.5- Esquema do “locus” de microinjecção dos fármacos a testar…………....77

Fig.6- Imagem do angiógrafo IMAGEnet 1024……………………………………..83

Fotografia a cores a) - Fundo ocular normal de coelho albino com visualização do

disco óptico, vasos retinianos e coroideos, no início de uma

experiência……………….......................................................................................109

Fotografia a cores b)- O mesmo olho, após injecção intravítrea de Sumatriptano

(note-se a extensa vasoconstrição, sobretudo arteriolar papilar e

justapapilar)……...................................................................................................109

Fig.7- Curvas dose-resposta de todos os agonistas testados em coelhos normais.

Os valores são expressos em termos de média ± erro padrão; n≥6 para cada

agonista testado. Valores de p < 0,05 em relação ao controlo. ……………......110

Fig.8- Curvas dose-resposta para a α-Metil-5-HT em administração isolada e

após pré-injecção de antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1/2 na dose de 10

nmol e de Cetanserina (antagonista não selectivo de receptores 5-HT2 / 5-HT1D) na

mesma concentração. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão;

n≥6.Valores de p < 0,05 em relação ao controlo……………………………………111

Fig.9- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT e L-694,247 em

administração isolada e após pré-injecção de antagonista selectivo dos receptores

5-HT1D (BRL15572), na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em termos de

média±erro padrão; n≥6. Valores de p <0,05 em relação ao controlo…………113

Fig.10- Curvas dose-resposta para o Sumatriptano, 5-HT em administração

isolada e após pré-injecção de antagonistas selectivos dos receptores 5-HT1B

(GR127,935 e SB224,284), na dose de 10 nmol. Os valores são expressos em

termos de média±erro padrão; n≥6. Valores de p <0,05 em relação ao

controlo………………….......................................................................................114

Fig.11- Curvas dose-resposta de todos os agonistas 5-HT testados em coelhos

diabéticos. Os valores são expressos em termos de média±erro padrão; n≥6 para

cada agonista testado…………………………………………………………............115

Fig.12- Curvas de dose-resposta para a SP (10 nmol), um agonista dos receptores

NK1, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L-733,060 (ambos antagonistas

selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol); após tratamento com

L659,877 e GR159,897 (ambos antagonistas selectivos dos receptores NK2, na

dose de 10 nmol) e de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP) na dose

de 10 nmol. Os dados referem-se a médias±erro padrão; n≥6 ; *valor de p entre

cada conjunto de experiências e relativamente ao controlo <0,05……………....117

Fig.13- Curvas dose-resposta cumulativas para o CGRP (10 nmol) após

contracção prévia por 10 nmol/l de SUM e pré-tratamento com 10 nmol de

L668,169 , L-733,060 ou de ambos (antagonistas selectivos dos receptores NK1);

após tratamento prévio com L659,877 , GR159,897 ou ambos ( antagonistas

selectivos dos receptores NK2, na dose de 10 nmol) e de CGRP8-37 (antagonista dos

receptores do CGRP- na dose de 10 nmol). Os dados referem-se a médias ± erro

padrão; n≥6 ; *valor de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao

controlo <0,05.……………………………...............................................................119

Fig.14- Curvas dose-resposta para a NKA (10 nmol), um agonista dos receptores

NK2, antes e após pré-injecção de L668,169 e de L733,060 (ambos antagonistas

selectivos dos receptores NK1, na dose de 10 nmol), de CGRP8-37 (antagonista de

receptores para o CGRP- na dose de 10 nmol) e de L659,877 e GR159897 (ambos

antagonistas selectivos dos receptores NK2). Os dados referem-se a médias ± erro

padrão; n≥6 ; * valor de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao

controlo <0,05……………………………………………………………….................120

Fig.15- Curvas dose-resposta cumulativas para a NKB e Senquetide (10 nmol),

agonistas dos receptores NK3. Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n≥6 ;

*valor de p entre cada conjunto de experiências e relativamente ao controlo

<0,05.………………………………………………….................................................121

Fig.16- Curvas dose-resposta para a CAPS (10 nmol), antes e após pré-injecção

de L668,169 e de L733,060 (ambos os antagonistas selectivos dos receptores NK1,

na dose de 10 nmol), de CGRP8-37 (antagonista de receptores para o CGRP, na

dose de 10 nmol), de L659,877 e de GR159897 (antagonistas dos receptores NK2)

e combinações dos antagonistas das taquicininas isolados ou associados ao

CGRP8-37. Os dados referem-se a médias ± erro padrão; n ≥ 6 ; *valor de p entre

cada conjunto de experiências e relativamente ao controlo

<0,05……………………........................................................................................122

Fig.17- Curvas dose-resposta para todas as taquiquininas, CGRP e a CAPS (10

nmol), em coelhos diabetizados pela aloxana. Os dados referem-se a médias ± erro

padrão; n≥6………………………………………………………………………............124

Fig.18- Exemplo de imagem obtida por CDI na análise de fluxos da artéria central

da retina………………………………………………………………………….............132

Quadro I- Relação entre o peso e os valores de glicémia………………………84

Quadro II- Sustância P (SP), Neurocinina A (NKA), Péptido relacionado com o

gene da Calcitonina (CGRP) e Capsaicina (CAPS) antes e após administração

intraocular de antagonista (1 nmol/l). Valores expressos em média ± erro padrão

(n=7-x). *p <0,05……………………………………………………………..…123

Quadro III– Determinação do diâmetro arteriolar para os diferentes fármacos

estudados quando aplicados intraocularmente. Verificou-se uma constrição, e

diminuição do diâmetro do vaso com a aminoguanidina (inibidor da iNOS), o L-

NAME (inibidor da nNOS) e o L-NNA ( inibidor da eNOS ). A administração

isolada de SNAP ou de L-arginina induziu vasodilatação com aumento do diâmetro

arteríolar. Este estudo ocorreu em simultâneo com a determinação da TIO pelo que

as concentrações utilizadas são as referidas para esse estudo.* p < 0,05 (teste t de

Student) em relação ao controlo (BSS)……………………………………..…..125

Quadro IV– Determinação do diâmetro arteriolar após administração sucessiva de

dois fármacos por via intraocular.* p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao

controlo (BSS+L-arginina)# ; p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao controlo

(BSS+SNAP)…………………………………………………………………....127

Quadro V- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após

administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO………....128

Quadro VI- Variação percentual da TIO em função do tempo (minutos), após

administração intraocular de 100 nmoles de cada modificador do NO em coelhos

com glaucoma induzido………………………………………………………....128

Quadro VII- Quadro comparativo da variação percentual da TIO em função do

tempo (minutos), após administração intraocular de 100 nmoles de cada

modificador do NO e da sua associação com L-Arginina………………………129

Quadro VIII- Determinação da velocidade de fluxo (Emax ± sem) após

administração sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema neuropeptidérgico,

por via intravítrea, em coelhos normais. * p < 0,05 (teste t de Student) em relação

ao controlo………………………………………………………………………130

Quadro XIX– Determinação da velocidade de fluxo (Emax ± sem) após

administração sucessiva de agonistas e antagonistas do sistema serotoninérgico por

via intravítrea, em coelhos normais. * p < 0,05 (teste t de Student) em relação ao

controlo………………………………………………………………………….131