24/07/12

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Ampliação de escala do cultivo de células-tronco pluripotentes empregando sistemas agitados

Leda Castilho

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) COPPE – Programa de Engenharia Química

Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares (LECC)

I Curso Teórico-Prático em Células-Tronco Pluripotentes LaNCE-UFRJ - Julho de 2012

Resumo da apresentação

n  Processos biotecnológicos baseados na cultura de células de mamíferos n  Produtos obtidos destes processos n  Características em comum

n  Ampliação de escala n  Biorreatores n  Modos de operação n  Experiência adquirida com outras células

n  Cultivo de células-tronco pluripotentes em sistemas agitados n  Utilizando microcarregadores n  Na forma de agregados suspensos

Processos biotecnológicos baseados em células

de mamíferos

Produtos biotecnológicos de células de mamíferos

Vacinas virais e recombinantes

Terapia gênica Células-tronco e terapias celulares

Diagnóstico (in vitro e in vivo)

Proteínas terapêuticas, incluindo

ant. monoclonais

Produtos para a saúde humana

baseados em células de mamíferos

ProteinsPolypeptides

VP 2

VP 1

VirusesCapsidsCapsidomers

DNAPlasmids

Antibiotics and othersecundary metabolites

O

N

H

N

S CH3

MeOO

H H

Products  of  Bio(techno)logical  Origin

Examples for product specific downstream purification methodesProduct Method Additional action of the method

Plasmid DNA Alkaline lysis + detergents Protein hydrolysisProtein Mechanical cell disruption DNA splitting due to shear forces

Distinct Demands on Downstream Purification Methods

Células para terapia celular (células-tronco embionárias em frascos T (esq.) e em microcarregadores, marcadas com DAPI e OCT-4)

Vírus VLPs

Vetores

Produtos biotecnológicos de células de mamíferos

Proteínas

n  Geralmente proteínas grandes e complexas n  Diversas modificações pós-tradução n  Muitas delas de fácil degradação

n  Usadas no tratamento de várias doenças: n  Esclerose múltipla (β-interferon) n  Câncer (anticorpos monoclonais) n  Anemia (eritropoetina, EPO) n  Hemofilia (fatores VIII e IX recombinantes) n  Neutropenia (estimulantes hematopoéticos: G-CSF e GM-CSF) n  Doenças cardíacas (ativador de plasminogênio tecidual, t-PA)

Source: http://www.rpc.msoe.edu/cbm/smartteams/smartprojects04.php

Erythropoietin

Proteínas terapêuticas

Quiméricos ~30% murinos

Humanizados ~5-10% murinos

Murine monoclonal

antibody

Anticorpos monoclonais

Anticorpos murinos Fonte: Tamashiro e Augusto (2008)

Maranhão e Brígido (2001)

Anticorpos recombinantes

n  Em especial vacinas virais n  Evolução da tecnologia:

n  Animais e ovos embrionados n  Culturas de células primárias n  Uso de linhagens estabelecidas ou de partículas pseudo-virais

Vacinas Terapias gênicas

n  Objetivam corrigir defeitos genéticos bloqueando, corrigindo ou substituindo genes defeituosos

n  Ex-vivo ou in-vivo

Lima et al. (2008), In: Moraes, Augusto e Castilho, Tecnologia do Cultivo de Células Animais: de Biofármacos a Terapia Gênica. Cap. 19. Editora Roca, São Paulo.

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n  Diversos vetores e alvos…

Lima et al. (2008), In: Moraes, Augusto e Castilho, Tecnologia do Cultivo de Células Animais: de Biofármacos a Terapia Gênica. Cap. 19. Editora Roca, São Paulo.

Terapias gênicas Células-tronco e terapias celulares

n  Terapias celulares: diversas já estabelecidas para restabelecer a estrutura e função de tecidos n  Doenças cardíacas, queimaduras, transplantes autólogos de

medula óssea

n  Células-tronco pluripotentes n  Aplicações na pesquisa n  Aplicações industriais (descoberta e teste de novas drogas) n  Aplicações clínicas (terapias celulares)

n Desafios n  Pureza n  Qualidade n  Consistência n  Reprodutibilidade

Aplicações: Ensaios toxicológicos Descoberta de drogas Terapias celulares

Fonte: Trends in Biotechnology

Células-tronco e terapias celulares

Células-tronco e terapias celulares

n  Necessidade de ampliação de escala para fornecer o produto aos consumidores

n  Desafios n  Manter as características das células inalteradas até escala

final de produção n  Obter a qualidade do produto requerida e a produtividade do

processo necessária

107 células

1012 -1013 células

Características em comum

Formulação e envase

Cultivo

ACTIVE

INGREDIENT

PRODUTO

FINAL

Purificação

Obtenção através de um processo biotecnológico

Ampliação de escala

Biorreatores

O que é um biorreator?

n  Definição mais ampla: Sistema de cultivo destinado a manter as condições adequadas para cultura de células in vitro n  Engloba desde pequenos frascos até biorreatores de larga

escala

n  Definição mais usada na prática: n  O termo biorreator é usado para sistemas de cultivo com nível

de sofisticação que permita controle de temperatura, pH e oxigênio dissolvido

O que é um biorreator?

n  Vários tipos, com diferentes características n  Ambiente asséptico n  Suprimento de nutrientes n  Controle de temperatura n  Controle de pH n  Suprimento e remoção de gases para fornecimento de O2 e

injeção/remoção de CO2

n  Controle de formação de espuma n  Células aderentes: suporte sólido para adesão celular

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3

n  Sistemas multifásicos n  Fase sólida: células n  Fase líquida: meio de cultivo n  Fase gasosa: oxigenação, controle de pH

n  Classificação n  Heterogêneos

n  A fase sólida não está distribuída uniformemente no meio líquido

n  Homogêneos n  A fase sólida está uniformemente

distribuída no meio líquido

Biorreatores

Linhagem CHO.K1 aderente

Linhagem CHO.K1 em suspensão

Determinante para seleção: cultivo aderente x suspensão

24h

48h

72h

0h

Cultvo de células Vero em microcarregadores para produção de vírus da febre amarela

Sistemas de cultivo estacionários

n  Frascos T, placas de Petri ou multipoços n  Sistemas com múltiplas placas ou múltiplas

bandejas n  Para células aderentes n  Ambiente heterogêneo: gradientes de

concentrações de nutrientes, O2 e metabólitos n  Monitoramento de pH, pO2, etc. dificultado

Cell Factory

Cell Cube

n  Intensivas em manipulação n  Intensivas em mão-de-obra n  Risco de contaminação mais elevado n  Monitoramento dificultado n  Ambiente mais homogêneo

Garrafas rotatórias (roller bottles)

Biorreatores com superfícies semi-permeáveis

n  Superfícies permeáveis a nutrientes/metabólitos e/ou a O2/CO2

n  Em alguns casos, compartimentalização n  Em sua maioria descartáveis

i-MAb, até 3 L

mini-PERM

Biorreatores de fibras ocas

CellMax

n  Para cultivos em suspensão ou em microcarregadores

frascos spinner:

Frascos agitados: tubos, spinners, erlenmeyers

Leda Castilho:

inserir filminho

n  Ambiente homogêneo n  Escalas intermediárias possíveis n  Amostragem para monitoramento off line possível n  Monitoramento on line de algumas variáveis possível tubos agitados: frascos erlenmeyer:

Frascos agitados: tubos, spinners, erlenmeyers

Leda Castilho:

inserir filminho Biorreatores do tipo tanque agitado

n  Sistemas homogêneos, amostragem possível n  Muito populares para operação em todas as escalas n  Monitoramento e controle possíveis (pH, pO2, T…) n  Operação automatizada, menores riscos de

contaminação n  Sempre acompanhados de um sistema de

controle

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Biorreatores do tipo tanque agitado

Biorreatores do tipo tanque agitado

n  Aço inoxidável AISI 316L (grau farmacêutico) n  Rugosidade baixíssima: 0,6-0,8 Ra (0,4-1µm) eletropolimento

Biorreatores do tipo tanque agitado

Biorreatores com bolsas descartáveis: Wave

Biorreator Wave, até 1000 L

Leda Castilho:

inserir filminho Biorreatores com bolsas descartáveis: PBS Biotech

PBS80

PBS15

Biorreatores com bolsas descartáveis: Hyclone

Leda Castilho:

inserir filminho

Hyclone SUB 50 L

Modos de operação de biorreatores

Batelada Batelada alimentada Contínuo simples Perfus ão

Alimentação Suspensão de células

Perfundido Equipamento de retenção celular

Alimentação Alimen- ta ç ão

0.1

1

10

100

0 5 10 15 20 25Time (days)

Xv (1

0^6

cells

/mL)

.

Batch

Fed-batchContinuous

Perfusion

Batelada

Batelada alimentada Contínuo

Perfusão

n  Cultivos contínuos n  Estado estacionário: nutrientes e metabólitos permanecem em

níveis contantes n  Mimetiza condições fisiológicas in vivo

Batelada x Perfusão Leda:

Redesenhar

ü Para uma dada escala de producão, diferentes volumes requeridos…

Batelada x Perfusão

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5

0

6

12

18

24

0 20 40 60 80 100Time (days)

Xv

(10^

6 ce

lls/m

L)

.

Fed-batch

Perfusion

Batelada x Perfusão n Cultivo de células rCHO em meio livre de soro (Teutocell-42)

a 37oC, 50% pO2 e 80 rpm (volume útil: 750 mL)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5 6

Viab

ility (%)

VC

D (

10

^6

/mL)

, g

luco

se (

g/L

),

lact

ate

(g/L

), a

mm

on

ium

(m

M)

Time (days)

VCD Glucose Lactate Ammonium Viability

Experiência adquirida com outras células

n Cultivo de células rCHO em meio livre de soro (Teutocell-42) a 37oC, 50% pO2 e 80 rpm (volume útil: 750 mL)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 1 2 3 4 5 6

Am

ino

acid

co

nce

ntr

atio

n (µM

)

Time (days)

ASP GLU ASN SER GLN HIS GLY THR ARG ALA TYR MET VAL TRP PHE ILE LEU

Experiência adquirida com outras células

Quantificação de variáveis associadas aos processos

n Quantificações relevantes (µ, integral of VCD, qglc, etc.)

y = 0,2467x R² = 0,99274

0

2

4

6

8

0 10 20 30 Pro

du

ct (

arb

itra

ry

un

its/

mL)

IVC (10^6 cells.day/mL)

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5 6

VC

D (

10

^6

/mL)

, g

lc (

g/L

),

pro

du

ct (

arb

itr.

un

its/

mL)

Time (days)

VCD Glucose Product

y = 0,3801e0,7962x R² = 0,99093

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5

VC

D (

10

^6

/mL)

Time (days)

µ=0.796d-1

=0.033h-1

tD=0.87d

qP=0.247 µu/cell/d

Cálculos análogos para outros qs

Cultivo de células-tronco pluripotentes em sistemas agitados

Trabalho conjunto do LaNCE/ICB/UFRJ e do LECC/COPPE/UFRJ

USP-1

H9

Células murinas (USP-1)

118 h

Cultura estática

100 µm

163 h

Cultivo agitado

500 µm

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 30 60 90 120Time (h)

Cel

l con

cent

ratio

n pe

r ar

ea (1

05 cel

ls/c

m2 )

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 Cell concentration per

volume (10

6 cells/mL)

Cell concentration per area per volume of medium

02468

1012

0 50 100 150 200Time (h)

Cel

l con

cent

ratio

n pe

r ar

ea (1

05 cel

ls/c

m2 )

024681012 C

ell concentration per volum

e (106 cells/m

L)

Cell concentration per area per volume of medium

Cultura estática

Cultivo agitado

Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.

n  Morfologia das colônias

After spinner culture (replated)

50 µm

Before spinner culture

50 µm

01234567

Mea

n ar

ea o

f col

onie

s(1

03 µm

2 )

Before spinner cultureAfter spinner culture

Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.

Células murinas

n  Formação de corpos embrióides

Após

Antes

250 µm

β -tu

bulin

-III (

ecto

derm

)

Antes do cultivo em spinner

100 µm

04080

120160200

1Mea

n EB

dia

met

er (µ

m)

Before spinner culture After spinner culture

Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.

Células murinas

Após o cultivo em spinner

SOX-2 Oct-4 / SSEA-1

97.2±3.8

98.1±2.5

95.6±6.299.4±1.4

97.4±5.5/ 98.5±2.5

A B

C D

E F

SOX-2 Oct-4 / SSEA-1

97.2±3.8

98.1±2.5

95.6±6.299.4±1.4

97.4±5.5/ 98.5±2.5

A B

C D

E F

n  Avaliação de marcadores de pluripotência

Bef

ore

D

uri

ng

Aft

er

Marinho et al. (2010), Biotechnology Progress.

Células murinas

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6

0.00

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

0 30 60 90 120Time (h)

Cel

l con

cent

ratio

n pe

r ar

ea (1

06 cel

ls/c

m2 )

0.00

0.12

0.24

0.36

0.48

0.60 Cell concentration per

volume (10

6 cells/mL)

Cell concentration per area per volume of medium

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0 100 200 300 400Time (h)

Cel

l con

cent

ratio

n pe

r ar

ea (1

06 cel

ls/c

m2 )

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 Cell concentration per

volume (10

6 cells/mL)

Cell concentration per area per volume of medium

Células humanas (H9)

Cultivo estático

Cultivo agitado

Fernandes et al. (2009), Braz. J. Med. Biol. Res, v. 42, p. 515-522 . Fernandes et al. (2009), Braz. J. Med. Biol. Res, v. 42, p. 515-522 .

Scale-up of human embryonic stem cells in stirred vessels

n  Avaliação de marcadores de pluripotência

n  Avaliação de cariótipo

n Capacidade de diferenciação: formação de corpos embrióides e avaliacão de AFP (endoderma), α-SMA (mesoderma) e nestina (ectoderma)

Fernandes et al. (2009), Braz. J. Med. Biol. Res, v. 42, p. 515-522 .

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Concentração do inóculo em spinner Serra et al. (2010)

Nível de O2 dissolvido (biorreator) Serra et al. (2010)

Nível de O2 dissolvido (biorreator) Serra et al. (2010)

SSEA-4 TRA-1-60

Perfusão (biorreator) Serra et al. (2010)

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Obrigada!

Para quem quiser ler mais: capítulo 9 - biorreatores

www.editoraroca.com.br www.taylorandfrancis.com