DAIANA SILVA LOPES

AÇÃO DA JARARAGINA NA EXPRESSÃO GÊNICA E

PROTÉICA DE MEDIADORES PRÓ-INFLAMATÓRIOS POR

CÉLULAS ENDOTELIAIS HUMANAS

São Paulo

2011

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto

Butantan/ IPT, para a obtenção do Título de Doutor

em Biotecnologia.

Área de concentração: Biotecnologia

Orientadora: Dra. Patricia Bianca Clissa

RESUMO

LOPES, D. S. Ação da jararagina na expressão gênica e protéica de mediadores

pró-inflamatórios por células endoteliais humanas. 2011. 126 f. Tese (Doutorado em

Biotecnologia) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São

Paulo, 2011.

As metaloproteases presentes nos venenos ofídicos (SVMPs) são toxinas-chave

envolvidas na patogênese do envenenamento, causando hemorragia e inflamação. A

jararagina é uma metaloprotease hemorrágica da classe PIII isolada a partir do veneno

de Bothrops jararaca, que em modelo experimental animal possui um efeito pró-

inflamatório caracterizado principalmente por edema, liberação de citocinas e migração

celular. Compreender como é a resposta inflamatória desencadeada por SVMPs,

estabelecendo os principais mediadores inflamatórios no desenvolvimento do dano

tecidual, pode contribuir de forma significativa com o tratamento dos efeitos locais dos

envenenamentos ofídicos. Neste estudo nós avaliamos e quantificamos por PCR em

tempo real a expressão de 9 genes envolvidos com a resposta inflamatória desencadeada

pela ação da jararagina em células endoteliais humanas (HUVECs). Estes genes foram

selecionados a partir de um experimento prévio de Microarray. Nossos resultados

confirmaram um significante aumento na expressão da quimiocina IL-8, moléculas de

adesão (E-Selectina, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, Angiopoetina-2 e MMP-10. Nós

também investigamos o efeito da jararagina na expressão protéica de moléculas de

adesão e da quimiocina IL-8. A molécula de adesão PECAM-1 foi expressa na

superfície das HUVECs em todos os tratamentos e intervalos de tempo analisados.

Entretanto não observamos aumento da expressão das moléculas E-selectina e VCAM-

1, na superfície de HUVECs tratadas com a jararagina. A jararagina também não

induziu a liberação de IL-8 no sobrenadante de HUVECs. Uma vez que a jararagina

pode se ligar a plaquetas e fibroblastos desencadeando diferentes respostas celulares nós

também investigamos a interação da jararagina com as HUVECs através da integrina

α2β1. Nossos resultados sugerem que a jararagina se liga nas células endoteliais, mas o

receptor celular envolvido neste efeito ainda não está claro. Este trabalho contribui com

a literatura na medida em que elucida a participação de importantes genes dentro do

contexto inflamatório desencadeado pela jararagina em células endoteliais, resultante do

envenenamento botrópico.

Palavras-chave: Veneno de serpente. Jararagina. Inflamação. Moléculas de adesão.

ABSTRACT

LOPES, D. S. Action of jararhagin in gene and protein expression of

proinflammatory mediators by human endothelial cells. 2011. 126 p. Ph. D. thesis

(Biotechnology) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São

Paulo, 2011.

Snake venom metalloproteinases (SVMPs) are important toxins involved in local tissue

damage and play a relevant role in the complex and multifactorial inflammatory

response characteristic of viperide envenomings. Jararhagin, a SVMP from Bothrops

jararaca venom, causes a local reaction manifested by hemorrhage, edema, cytokine

release and inflammatory cells recruitment. Understanding how the inflammatory

response is triggered by SVMPs, establishes the key inflammatory mediators in the

development of tissue damage and can contribute significantly to the treatment of local

effects of snake envenoming. In this study we evaluated and quantified by real time

PCR the expression of 9 genes involved in inflammatory response, triggered by

jararhagin in human endothelial cells (HUVECs). These genes were selected from a

previous Microarray experiment. Our results confirmed a significant increase in the

gene expression of chemokine IL-8, adhesion molecules (E-selectin, V-CAM-1, I-

CAM-1), CD-69, angiopoietin-2 and MMP-10. We also investigated the effect of

jararhagin on expression of adhesion molecules in the surface of HUVECs by flow

cytometry. We did not observe increased expression of E-selectin and VCAM-1

molecules on the surface of HUVECs compared with control. Jararhagin did not

increase the release of soluble chemokine IL-8 and E-selectin in HUVECs supernatant.

Since jararhagin can bind to platelets and fibroblasts triggering different cellular

responses, we also investigated the interaction of HUVECs with jararhagin through

integrin α2β1. Our results suggest that jararhagin binds to endothelial cells, but the

cellular receptor involved in this effect remains unclear. This work contributes to the

literature highlighting the participation of important genes within the inflammatory

context triggered by jararhagin on endothelial cells.

Key words: Snake venom. Jararhagin. Inflammation. Adhesion molecules.

1 INTRODUÇÃO

1.1 Inflamação

Quando ocorre uma lesão tecidual, vários eventos se seguem, desde a formação

do coágulo de fibrina, resposta inflamatória, formação de tecido granular incorporando

uma re-epitelialização e angiogênese até a formação da matriz extracelular e o

remodelamento tecidual (XUE et al., 2006).

A inflamação é uma resposta do tecido vascularizado à infecções por diferentes

agentes, à exposição a toxinas ou à lesão celular, envolvendo o acúmulo extravascular

de proteínas plasmáticas e leucócitos. Ela tem como objetivo destruir ou isolar o agente

agressor e o tecido danificado e assim, recompor a homeostase do tecido lesado

(GALLIN; GOLDSTEIN; SNYDERMAN, 1992; PAUL, 1998). Embora a inflamação

tenha uma função protetora no controle de infecções e na promoção de reparo das

lesões, quando ocorre de forma exacerbada pode causar dano tecidual e doenças, como

a artrite reumatóide e lúpus eritematoso.

O processo inflamatório culmina com os eventos celulares mediados pelas

células endoteliais e pelos leucócitos. Além da participação das moléculas de adesão e

citocinas, várias outras moléculas atuam como mediadores inflamatórios, tais como:

prostaglandinas, radicais do oxigênio, NO (óxido nítrico), tromboxanos, leucotrienos,

PAF (fator de ativação plaquetária) e mediadores plasmáticos produzidos pelos sistemas

de coagulação, das cininas, fibrinolítico e complemento (VORONOV; APTE; SOFER,

1999).

A resposta inflamatória inicia-se com fenômenos vasculares mediados

principalmente pela histamina. O resultado é um aumento localizado e imediato da

irrigação sangüínea causando hiperemia ou rubor. Em seguida, tem início a produção

local de mediadores inflamatórios que promovem o aumento da permeabilidade capilar

e a quimiotaxia, processo químico pelo qual células polimorfonucleares, neutrófilos e

macrófagos são atraídos para o foco da lesão. Estas células, por sua vez, realizam a

fagocitose dos elementos que estão na origem da inflamação e produzem mais

mediadores químicos, dentre os quais estão as citocinas (como, por exemplo, o fator de

necrose tumoral e as interleucinas), quimiocinas, bradicinina, prostaglandinas e

leucotrienos. Nessa etapa, as plaquetas e o sistema de coagulação do sangue também

são ativados visando conter possíveis sangramentos. Além disso, diversos fatores de

adesão são expressos na superfície das células endoteliais que revestem os vasos

sanguíneos internamente. Estes fatores irão mediar a adesão e a diapedese de monócitos

circulantes e outras células inflamatórias para o local da lesão.

A dor, outro sintoma característico da inflamação, é causada primariamente pela

estimulação das terminações nervosas por algumas destas substâncias liberadas durante

o processo inflamatório como pelas prostaglandinas e pela bradicinina, mas também em

parte por compressão relacionada ao edema.

1.1.1 Células endoteliais

O endotélio vascular é formado por uma monocamada de células (células

endoteliais) que revestem o lúmen dos vasos separando o sangue dos tecidos. A

integridade funcional e estrutural do endotélio é fundamental para manutenção da

homeostasia e função circulatória (NEREN et al., 1993) desempenhando um papel

crítico em um grande número dos processos fisiológicos e patológicos (CINES, 1998).

As células endoteliais são alongadas e achatadas, possuem núcleo alongado e

poucas organelas. No citoplasma são encontrados os grânulos de Weibel- Palade, que

constituem o sítio de síntese do fator de Von Willebrand, importante para a adesão de

plaquetas à matriz extracelular e um marcador de células endoteliais. Na superfície

externa, as células endoteliais estão em contato com a membrana basal, e na superfície

oposta, com as células circulantes e os componentes plasmáticos.

Estas células estão integralmente envolvidas na regulação do fluxo sanguíneo,

coagulação, tráfico de leucócitos, na formação de edema, cicatrização de feridas, e

angiogênese.

Em condições fisiológicas normais, as células endoteliais vasculares promovem

uma superfície antiinflamatória e anticoagulante, regulando o fluxo sangüíneo,

controlando a permeabilidade vascular e mantendo os leucócitos circulantes. Em

resumo, a fluidez do sangue é mantida pelas células endoteliais por vários mecanismos

que inibem a coagulação, entre eles, a expressão de inibidores da via do fator tecidual

(TFPIs), que bloqueiam o início da coagulação; a expressão de proteoglicanos de

heparan sulfato que se ligam à anti-trombina III e inativam a trombina, e também pela

capacidade dessas células de degradar ou mascarar sinais que ativam as plaquetas. Além

disso, as células endoteliais produzem o óxido nítrico (NO) e a prostaglandina D2

(PGI2) que sinergicamente inibem a adesão e agregação plaquetária. O fluxo sangüíneo

é regulado por um balanço de sinais que aumentam ou diminuem o tônus das camadas

em torno das células da musculatura lisa vascular (POBER; SESSA, 2007).

Células endoteliais em repouso não interagem com leucócitos. Nessa condição,

proteínas como a P-selectina e quimiocinas permanecem armazenadas nos grânulos de

Weibel-Palade. Além disso, está suprimida a transcrição de moléculas de adesão, tais

como E-selectina, VCAM1e ICAM1 (WU et al., 1996). Outro fato relevante é a

produção da enzima óxido nítrico sintase (isoformas eNOS e NOS3), que leva a

produção de NO, um potente mediador antiadesivo que previne a adesão leucócito-

célula endotelial em condições basais, atraves da inibição da ativação de leucócitos e da

expressão gênica. A importância do NO na prevenção da adesão leucocitária, em

condições fisiológicas normais, foi demonstrada, quando a N-monometil-arginina foi

usada para bloquear a produção de NO, resultando em um aumento de 15 vezes na

adesão de neutrófilos (KUBES; SUZUKI; GRANGER, 1991).

Entretanto, no caso de uma injúria ou infecção, as células endoteliais controlam

a migração de leucócitos pela expressão de moléculas de adesão e liberação de

quimiocinas e outros mediadores inflamatórios (MIDDLETON et al., 2002).

1.1.2 Leucócitos e moléculas de adesão

O recrutamento de leucócitos para os tecidos lesados é um evento característico

da resposta inflamatória, sendo a interação dos leucócitos circulantes com o endotélio

vascular, o passo fundamental para este evento (Figura 1).

Durante a inflamação os fagócitos promovem o recrutamento ativo de células

inflamatórias para o local da infecção, o reconhecimento dos microorganismos e a

fagocitose. Além disso, produzem citocinas que possuem importantes papéis na resposta

inflamatória. Os neutrófilos (leucócitos polimorfonucleares) medeiam as fases iniciais

na resposta inflamatória. Na ausência de infecção eles circulam no sangue e não migram

para dentro dos tecidos.

Os macrófagos respondem ao estímulo quase tão rapidamente quanto os

neutrófilos, mas persistem por mais tempo nos locais da inflamação. Eles não são

terminalmente diferenciados como os neutrófilos e podem sofrer divisão celular em um

local inflamatório. Portanto, são as células efetoras nos estágios mais tardios da resposta

imunológica natural (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008).

As moléculas de adesão celular são glicoproteínas expressas na superfície da

célula, que medeiam o contato entre duas células ou entre as células e o endotélio. O

processo de adesão é essencial para os vários eventos biológicos, como morfogênese,

crescimento, organização e estabilidade tecidual, inflamação, resposta do hospedeiro às

infecções e injúria, cicatrização e resposta imune celular (ALBELDA et al., 1994;

FARSKY; MELLO, 1995). As moléculas de adesão estão divididas em quatro

superfamílias: selectinas, integrinas, superfamília das imunoglobulinas e caderinas.

As selectinas são uma família de glicoproteínas de superfície celular que

possuem um domínio lectina N-terminal (expresso extracelularmente) que se liga à

resíduos de carboidrato, um domínio transmembranar e uma pequena cauda

citoplasmática. A família de selectinas é formada por três proteínas: L-selectina, P-

selectina, E-selectina, e representa uma família de receptores expressos em leucócitos

(L), plaquetas e células endoteliais (P) ou apenas em células endoteliais (E)

respectivamente, (TEDDER et al., 1995). Elas medeiam interações iniciais de adesão

entre leucócitos intravasculares e o endotélio vascular em áreas de inflamação

(MCEVER et al., 1995), e estão envolvidas com o comportamento de rolling de

leucócitos (BEVILACQUA; NELSON, 1993; FARSKY; MELLO, 1995).

As integrinas são glicoproteínas transmembranares, heterodiméricas, formadas

por duas subunidades associadas não-covalentemente (α e β). Nos vertebrados, a família

é composta por 18 subunidades α e 8 subunidades β, o que resulta em 24 heterodímeros

diferentes (TAKADA et al., 2007). Elas participam na organização tissular, atuam como

receptores para outras moléculas de adesão, (DIAMOND, 1994) e também estão

associadas à firme adesão leucocitária à parede do vaso.

A superfamília das imunoglobulinas abrange um grupo de moléculas de adesão

caracterizadas pela presença de duas a sete unidades semelhantes às imunoglobulinas G

no seu domínio extracelular (ALBELDA; BUCK, 1990; ALBELDA et al., 1994). Cinco

membros desta família estão envolvidos na firme aderência entre célula endotelial e

leucócitos: Moléculas de adesão intercelular 1 (ICAM-1 ou CD56) e 2 (ICAM-2 ou

CD102), molécula de adesão da célula vascular (VCAM-1 ou CD106), Molécula 1 de

adesão celular endotelial à plaqueta (PECAM-1 ou CD31) e Molécula 1 de adesão da

célula de adressina mucosal (MadCAM-1). Estas proteínas são expressas em diferentes

tipos celulares, sendo que a expressão de ICAM-1 e VCAM-1 no endotélio quiescente é

baixa, mas na presença de estímulos inflamatórios, suas concentrações na membrana

endotelial são extremamente aumentadas. Por outro lado, as moléculas de adesão

ICAM- 2 e PECAM-1 apresentam uma significativa expressão constitutiva em células

endoteliais (HUO; LEY, 2001). A PECAM-1 localiza-se nas junções endoteliais e

participa da transmigração dos leucócitos através do endotélio (MULLER et al., 1993).

As caderinas são moléculas de adesão dependentes do cálcio que permitem a

ligação entre células vizinhas. Cada uma das células que são ligadas possui sempre o

mesmo tipo de caderina que a outra, sendo as interações entre elas homofílicas. Essas

moléculas possuem função de formação e manutenção da integridade dos tecidos

(TAKEICHI, 1995; TEPASS, 1999).

Figura 1- Etapas da interação leucócito-endotélio.

Fonte: Adaptado de Petri, Phillipson e Kubes (2008).

1.1.3 Citocinas

Citocinas são um diverso grupo de proteínas, de baixa massa molecular (8-

25KDa) envolvidas na comunicação entre as células durante o desencadeamento das

respostas imunes. Estas moléculas regulam importantes processos biológicos, como

crescimento, diferenciação e ativação celular, inflamação, imunidade, reparo de tecidos,

fibrose e morfogênese. A ação das citocinas envolve uma ligação de alta afinidade com

receptores na superfície das células alvo. As citocinas são pleiotrópicas, podendo atuar

sobre diferentes tipos celulares; e também possuem uma ação redundante, influenciando

na síntese e ação de outras citocinas (AKIRA et al., 1990; BLACKWILL; BURKE,

1989). Em geral, as citocinas possuem uma vida média curta, assim a ativação

transcricional das citocinas é transitória e elas não são armazenadas como moléculas

pré-formadas.

As citocinas são sintetizadas por várias células como monócitos, macrófagos,

linfócitos, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares e

plaquetas (FURIE; RANDOLPH, 1995; MILLER; KRANGEL, 1992). As diferentes

citocinas podem ser enquadradas em diversas categorias: interferons (IFN),

interleucinas (IL), quimiocinas, fator estimulador de colônias (CSF), fator de necrose

tumoral (TNF- e TNF- ), e fator de transformação de crescimento (TGF- ).

As citocinas participam de todas as fases da resposta inflamatória. As principais

citocinas envolvidas na regulação da inflamação são TNF-α, IL-1β, IL-18, IL-6 e IL-8.

A citocina TNF-α é produzida por macrófagos e linfócitos, e suas células alvos

são os fibroblastos e as células endoteliais. O TNF-α atua na inflamação, fibrose,

produção de outras citocinas (IL-1, IL-6, GM-CSF) e indução de moléculas de adesão

(BEMELMANS; VAN TITS, BUURMAN, 1996; VORONOV; APTE; SOFER, 1999).

A IL-1β é um importante mediador da resposta inflamatória, e está envolvida

em uma variedade de atividades celulares, incluindo proliferação, diferenciação e

apoptose (AKIRA et al., 1990). Esta citocina é produzida por monócitos, macrófagos,

células dendríticas, algumas células B, fibroblastos e células endoteliais. Ela atua

sinergicamente com o TNF-α e induz a expressão de moléculas de adesão e o

recrutamento leucocitário.

A IL-6 é produzida por macrófagos, células T e B, fibroblastos e células

endoteliais. Esta interleucina atua na resposta imune antígeno-específica e na

inflamação, sendo um mediador chave da resposta imune de fase aguda. Ela atua em

sinergismo com TNF-α e IL-1 na indução de proteínas de fase aguda (WHINCHER;

EVANS, 1990) e está relacionada com o recrutamento e ativação de neutrófilos

(HOPKINS et al., 2003).

As quimiocinas (citocinas quimiotáticas) são proteínas relativamente pequenas

(8-10 KDa) que regulam principalmente o tráfico de leucócitos através da interação com

receptores acoplados à proteína G. As quimiocinas foram originalmente descritas como

as citocinas que medeiam o recrutamento de leucócitos para o sitio de inflamação, mas

um subgrupo das quimiocinas, a família Cys-X-Cys (CXC), possui um importante papel

na regulação da angiogênese em condições inflamatórias, fibrose e câncer (KOCH et al.,

2001; MEHRAD et al., 2007). IL-8 é uma quimiocina CXC com ligação de alta

afinidade para receptores CXCR1 e CXCR2, ambos são abundantemente expressos em

células endoteliais. IL-8 é expressa principalmente por leucócitos, fibroblastos, células

endoteliais e células tumorais, e desempenha importante papel na quimiotaxia,

inflamação e angiogênese de tumores. Além disso, essa quimiocina atua diretamente na

célula endotelial induzindo a migração, proliferação e a formação de tubo (LI et al.,

2003).

1.1.4 Estímulos pró-inflamatórios

A inflamação pode ser desencadeada por diversos agentes, como

microorganismos (bactérias, vírus ou parasitas), agressores químicos e físicos (produtos

cáusticos, toxinas, traumatismos, calor, frio ou radiações) ou ainda por deficiente

vascularização da região provocando isquemia ou necrose e consequentemente a

inflamação. O lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) ou endotoxina é um componente do

envelope exterior de todas as bactérias gram-negativas altamente pró-inflamatória

(SALUK; WACHOWICZ, 2005). Diversos venenos de serpentes induzem resposta

inflamatória caracterizada por edema, recrutamento de leucócitos e liberação de

mediadores pró-inflamatórios (TEIXEIRA et al., 2005).

1.2 Envenenamentos ofídicos

As serpentes sempre despertaram a fascinação e o medo ao longo da história da

humanidade. Originadas há aproximadamente 135 milhões de anos (COATES; RUTA,

2000), as serpentes são caracterizadas como um grupo monofilético independente,

originado dos lagartos ou de algum ancestral destes (KOCHVA, 1986). Atualmente,

consistem em um dos grupos mais bem sucedidos dos vertebrados e apesar do formato

corporal altamente conservado, este grupo exibe uma grande riqueza de espécies e

conquistou uma enorme variedade de ambientes (LEE; SCANLON, 2002).

Na fauna brasileira existem 10 famílias, constituindo um total de 371 espécies

(BÉRNILS, 2010). Contudo, apenas 2 famílias, Elapidae e Viperidae, são consideradas

peçonhentas, produzindo toxinas e tendo aparelhos apropriados para inoculá-las. O

veneno produzido nas glândulas veneníferas possui a função de paralisar ou matar as

presas e defender contra predadores. A glândula de veneno teve origem pela

especialização de glândulas salivares, sendo assim, parte dos componentes do veneno

tem relação com enzimas digestivas (KOCHVA, 1986).

O ofídismo consiste em um importante problema de saúde publica no Brasil em

virtude de sua grande freqüência e gravidade. Nos últimos seis anos, o número de

acidentes com animais peçonhentos cresceu 32,7%, em todo o Brasil. Em 2003, foram

68.219 notificações, contra 90.558, em 2009. Dados preliminares indicam que acidentes

com esses animais foram responsáveis por 309 mortes no Brasil em 2009, sendo que as

serpentes foram responsáveis por 22.763 desses casos e 106 mortes (MINISTÉRIO DA

SAÚDE, 2010).

Da família Viperidae fazem parte os gêneros Bothrops (jararacas), Crotalus

(cascavéis) e Lachesis (surucucus). De acordo com o Ministério da Saúde (2010), as

serpentes do gênero Bothrops, popularmente conhecidas como jararacas, são

responsáveis por aproximadamente 88% dos acidentes ofídicos que ocorrem no país.

Vale ressaltar aqui que baseado em evidências morfológicas e moleculares, algumas

espécies que pertenciam ao gênero Bothrops, atualmente pertencem ao gênero

Bothropoides (FENWICK et al., 2009). As espécies mais conhecidas no Brasil são

Bothrops atrox na região Norte, Bothrops erythromelas no Nordeste, Bothrops moojeni

nas regiões Centro-Oeste e Sudeste, Bothrops jararaca na região Sul e Sudeste,

Bothrops jararacussu no Cerrado da região central e em florestas tropicais do Sudeste, e

Bothrops neuwiedi, encontrada em todo território nacional, exceto na Bacia Amazônica.

A composição do veneno de serpentes varia entre as diferentes espécies do

gênero Bothrops, mas em geral ele é composto por proteínas farmacologicamente e

bioquimicamente ativas e uma pequena fração não protéica, como íons metálicos e

aminas biogênicas (BJARNASON; FOX, 1994; MATSUI et al., 2000).

As diversas toxinas presentes no veneno botrópico podem provocar distúrbios

da hemostasia, como alterações na função plaquetária, na coagulação sanguínea e no

sistema fibrinolítico (MARKLAND, 1998). Nos casos mais graves podem ocorrer

complicações sistêmicas, como insuficiência renal aguda.

Os efeitos locais são caracterizados por edema, hemorragia, inflamação e

necrose (VORONOV; APTE; SOFER, 1999; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995a),

podendo também ocorrer complicações locais como abscesso e síndrome

compartimental.

Desde o desenvolvimento do soro antiofídico por Vital Brazil em 1901, a

imunoterapia constitui o principal tratamento para as vítimas dos acidentes ofídicos e

consiste da administração parenteral de antivenenos heterólogos preparados a partir do

plasma de cavalos imunizados com venenos. A eficácia deste tratamento está em

neutralizar os efeitos sistêmicos do envenenamento, entretanto possuem uma baixa

eficácia para prevenir o dano tecidual local induzido pelos venenos (GUTIÉRREZ et al.,

1998). A administração dos antivenenos pode gerar efeitos adversos como, por

exemplo: urticária, náuseas, vômitos, bronco espasmo, hipotensão, edema e choque

anafilático (WARRELL et al., 1995; LALLOO; THEAKSTON, 2003).

As proteínas responsáveis pelos efeitos do envenenamento botrópico são

metaloproteinases, serinoproteases, disintegrinas, lectinas tipo C, miotoxinas,

fosfolipases A2 (PLA2), L-amino ácido oxidases, fosfomonoesterases, fosfodiesterases,

acetilcolinesterases, arginina esterases, hialuronidases, 5’- nucleotidases e NAD-

nucleosidases (RUSSEL, 1980; TU, 1988; MEIER, 1990; STOCKER, 1990; BRAUD;

BOM; WISNER, 2000).

As fosfolipases (PLA2s) endógenas são enzimas que atuam sobre membranas

celulares clivando os fosfolipídios em ácidos graxos e lisofosfolipídios. Estas enzimas

apresentam um importante papel em várias funções celulares, incluindo manutenção dos

fosfolipídios celulares, geração de prostaglandinas (PGs) e leucotrienos, transdução de

sinais, proliferação celular e contração muscular. (DENNIS et al., 1991; SANTOS-

FILHO et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2009). As fosfolipases A2 presentes no veneno de

serpente apresentam uma variedade de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos, como

mionecrose, inibição da agregação plaquetária, neurotoxicidade, cardiotoxicidade,

hipotensão e indução de edema (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1995b; HARRIS et al.,

2000; SINGH et al., 2000; SOARES et al., 2004; SANTOS-FILHO et al., 2008).

As serinoproteases são enzimas proteolíticas que contribuem para o efeito

tóxico do envenenamento por afetarem muitos componentes da cascata de coagulação

sanguínea, podendo interferir na função plaquetária ou no sistema fibrinolítico (WHITE,

2005; KAMIGUTI, 2005; SWENSON et al., 2005). Algumas dessas enzimas são

denominadas “thrombin-like” por clivarem o fibrinogênio, mas apesar de possuírem

uma ação semelhante à trombina, permitem apenas a formação de um coágulo frouxo,

por não serem capazes de ativar o fator XIII, responsável pela estabilização do coágulo

de fibrina (BRAUD et al., 2000).

Dentre todas as toxinas presentes na complexa mistura de um veneno

botrópico, acredita-se que as metaloproteases sejam uma classe de toxinas-chave

envolvidas na patogênese local induzida pelo envenenamento (FOX; SERRANO,

2005).

1.3 Metaloproteases de veneno de serpentes (SVMP)

As metaloproteases do veneno de serpente (SVMP) fazem parte da super

família das Metzincinas. Todas as Metzincinas são zinco-dependentes e possuem um

resíduo de metionina na porção carboxi terminal na volta abaixo do sítio ligante de

zinco (met-turn). Por isso, estas toxinas podem ser inibidas pelos agentes quelantes

EDTA ou 1,10 fenantrolina (MATSUI; FUJIMURA; TITANI 2000). A seqüência de

aminoácidos HEBXHXBGBXH constitui o sítio de ligação do zinco e é comum a todas

as metaloproteases.

As Metzincinas compreendem 6 subfamílias, as Astacinas, Serralisinas,

Matrixinas, Snapalisinas, Reprolisinas (M12B) e Leishmanolisinas (HOOPER, 1994;

GOMIS-RUTH et al., 2003; RAMOS; ARAÚJO, 2006). A subfamilia M12B é

composta pelas SVMPs, pelas ADAMs (a disintegrin and metalloproteinase) e pelas

ADAMTSs (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) (FOX;

SERRANO, 2005)

As ADAMs (proteínas de mamíferos contendo os domínios disintegrina e

metaloproteinase) são proteínas trasmembrânicas que estão envolvidas em importantes

eventos fisiológicos como controle de fusão membranar, clivagem de citocinas e fatores

de crescimento, migração celular, bem como desenvolvimento muscular, fertilização e

determinação do destino da célula. Além disso, também estão envolvidas em patologias

como inflamação e câncer (SEALS; COURTNEIDGE, 2003).

As metaloproteases são sintetizadas na forma inativa ou zimogênio, e a

ativação dessas proteínas ocorre por um mecanismo chamado “cysteine-switch”. De

acordo com este mecanismo, o grupo tiol presente na seqüência conservada do pró-

domínio PKMGGVT, interage com o zinco presente no sitio ativo, bloqueando a

ligação do substrato. Desta forma, é necessária a remoção do grupo tiol do sítio ativo

para ativar a enzima. A ativação da enzima pode ocorrer por atividade catalítica residual

ou por ação de outras proteases do veneno, por um mecanismo ainda não elucidado

(GRAMS et al., 1993; SHIMOKAWA et al., 1996; RAMOS; ARAÚJO, 2006).

As SVMPs apresentam grande similaridade com as matrixinas (MMPs), que

são metaloproteases de mamíferos que degradam a matriz extracelular e participam de

importantes processos biológicos incluindo o desenvolvimento embrionário,

angiogênese e cicatrização de feridas, bem como nos processos patológicos, como

inflamação, câncer e destruição do tecido (WOESSNER, 1998; HEMONARD;

GRIMALD, 1990).

As SVMPs são sintetizadas como proteínas multimodulares, e de acordo com a

organização de seus múltiplos domínios, foram inicialmente classificadas em quatro

classes, designadas P-I, P-II, P-III e P-IV (BJARNASON; FOX, 1994). As

metaloproteases da classe P-I são compostas na forma madura apenas pelo domínio

metaloprotease, possuem baixa massa molecular (20-30 kDa), e fraca atividade

hemorrágica. As da classe P-II possuem um domínio metaloprotease e um domínio

disintegrina na região C-Terminal. Essas toxinas apresentam massa molecular de 30-60

kDa e geralmente sofrem processamento pós-traducional liberando o peptídeo

disintegrina, que são as disintegrinas clássicas encontradas nos venenos de serpentes.

Essas disintegrinas possuem a sequência RGD (Arg-Gly-Asp), que lhes confere alta

afinidade por receptores de plaquetas e, portanto atuam como potentes inibidores da

agregação plaquetária. A classe P-III contém além dos domínios metaloprotease e tipo-

disintegrina, um domínio rico em cisteína. O domínio tipo-disintegrina conserva os

resíduos de cisteína nas mesmas posições que as disintegrinas clássicas RGD

apresentando substituições nesses resíduos pela seqüência XXCD (XX-Cys-Asp). Esta

classe compreende metaloproteinases em geral altamente hemorrágicas e de massa

molecular de 60-110 kDa. As metaloproteases da classe P-IV possuem um domínio

adicional tipo-lectina e são toxinas de alta massa molecular (80-100 kDa).

Fox e Serrano (2008) propuseram uma reclassificação onde 11 subclasses de

SVMPs foram identificadas: P-Ia. P-IIa, P-IIb, P-IIc, P-IId, P-IIe, D-I, P-IIIa, P-IIIb, P-

IIIc e P-IIId (Figura 2). Nessa reclassificação, a classe P-IV foi incuída na classe P-III

por ser considerada como o resultado de uma modificação pós-traducional da classe P-

III.

Figura 2- Classificação das SVMPs. As SVMPs são sintetizadas na forma latente como

precursores multimodulares que sofrem diferentes estágios de processamento.

P: pré-domínio, Pro: pró-domínio, Proteinase: domínio metaloproteinase. S: seqüência de aminoácidos entre o domínio catalítico e disintegrina ou tipo-

disintegrina, Dis: disintegrina, Dis-Like: domínio tipo-disintegrina, Cys-Rich:

domínio rico em cisteínas, Lec: domínio ligante de lectina.

Fonte: Adaptado de Fox e Serrano (2008).

A diversidade estrutural das SVMPs confere às mesmas a capacidade de

interferir em diversos sistemas celulares provocando alterações no sistema hemostático

e outros efeitos como necrose, apoptose e inflamação, que caracterizam a lesão tecidual

que ocorre após o envenenamento (GUTIÉRREZ; RUCAVADO, 2000; MATSUI;

FUJIMURA; TITANI, 2000; LAING et al., 2003). De modo geral, o mecanismo de

ação das SVMPs está relacionado à proteólise de componentes da matriz extracelular

(GUTIÉRREZ et al., 2005), proteínas plasmáticas (SILVA et al., 2003; WANG et al.,

2008), proteínas de membrana celular e à interação com receptores específicos, como

integrinas de superfície de plaquetas (DE LUCA et al., 1995; YOU et al., 2006), células

endoteliais (SOUZA et al., 2000; COMINNETTI et al., 2004) e fibroblastos (ZIGRINO

et al., 2002), ativando ou inibindo a resposta celular. Esses efeitos podem resultar em

várias alterações fisiopatológicas tais como inflamação, inibição da agregação

plaquetária, apoptose e hemorragia (GUTIÉRREZ et al., 2005).

A resposta inflamatória desencadeada pelas SVMPs é caracterizada pela

formação de edema, recrutamento de leucócitos e liberação de mediadores inflamatórios

no local da picada. Entre estes mediadores estão prostaglandinas, leucotrienos, NO,

PAF, mediadores dos sistemas complemento, fibrinolítico e de coagulação) e diversas

citocinas tais como, TNF-α e IL-1β, que amplificam a resposta inflamatória

contribuindo com o processo de necrose (VORONOV; APTE; SOFER, 1999).

A metaloprotease da classe P-I neuwiedase provocou dano tecidual local com

mionecrose e reação inflamatória, evidenciada pelo recrutamento de leucócitos e

liberação de citocinas IL-8 (Interleucina-8), IL-1β e IL-6 e de MMP-9 (matrix

metalloproteinase 9) no músculo gastrocnêmio e liberação de IL-1β e IL-6 por cultura

de macrófagos peritoneais - MPAC (RODRIGUES et al., 2000; LOPES et al., 2009)

A BaP1, P-I isolada do veneno de Bothrops asper, também induz moderada

mionecrose e diferentes efeitos inflamatórios, como edema, infiltrado leucocitário,

liberação de citocinas, PGE2 e expressão de moléculas de adesão (GUTIÉRREZ et al.,

1995; RUCAVADO, 2002; FERNANDES, 2006).

A toxina HF3 isolada do veneno de Bothrops jararaca induziu fagocitose por

macrófagos dependente da integrina αmβ2 (SILVA et al., 2004). Vários trabalhos têm

demonstrado o papel inflamatório da jararagina, a metaloprotease P-III isolada do

veneno de Bothrops jararaca (MOURA-DA-SILVA et al., 1996; CLISSA et al., 2001).

1.4 Jararagina

Um bom modelo para estudar a resposta inflamatória que caracteriza o

envenenamento ofídico é a metaloproteinase jararagina. A jararagina é uma toxina de 52

kDa, isolada do veneno de Bothrops jararaca, que apresenta estrutura contendo os

domínios metaloproteinase, domínio tipo-disintegrina (ECD: Glu-Cys-Asp) e domínio

rico em cisteínas (PAINE et al., 1992), característicos de uma SVMP do tipo P-III. Ao

domínio carboxi-terminal rico em cisteína, tem sido atribuídas propriedades adesivas à

componentes plasmáticos e proteínas da MEC (SERRANO et al., 2006). Além da

similaridade estrutural com as MMPs, observada no domínio catalítico, a jararagina

apresenta similaridade estrutural com as ADAMs, proteínas envolvidas em

comunicação e regulação da função celular, principalmente nos domínios tipo-

disintegrina e rico em cisteínas (FOX; SERRANO, 2008).

Em geral, as toxinas pertencentes à esta classe são altamente hemorrágicas,

sendo esta atividade dependente do domínio metaloproteinase, entretanto, o domínio

tipo-disintegrina e o domínio rico em cisteínas também têm se mostrado importantes

nas funções biológicas destas toxinas (MOURA-DA-SILVA; BUTERA; TANJONI,

2007; SERRANO et al., 2006).

Desde seu isolamento, esta proteína vem sendo muito estudada e considerada

uma toxina de grande versatilidade e conseqüente importância médica. A jararagina é

capaz de promover hemorragia local e sistêmica (LAING; MOURA-DA-SILVA, 2005;

ESCALANTE et al., 2003). Este efeito hemorrágico, provavelmente é devido a sua ação

proteolítica sobre componentes da membrana basal vascular (MARKLAND, 1998) e a

inibição da agregação plaquetária pode acentuar este efeito (KAMIGUTI; HAY;

ZUZEL, 1996). Moura-da-Silva et al. (2008) demonstraram que a jararagina é capaz de

se ligar com alta afinidade ao colágeno I e ao colágeno IV, e que essa afinidade está

relacionada diretamente com a atividade hemorrágica desta toxina. Tanjoni et al. (2010)

atribuiram ao domínio tipo-disintegrina da jararagina a ligação ao colágeno e ao

domínio rico em cisteína a ligação à integrina α2β1; a existência desses dois diferentes

sítios de ligação, interfere na interação integrina-matriz com conseqüente apoptose das

células endoteliais. Recentemente, Baldo et al. (2010) demonstraram que a jararagina

localiza-se ao redor dos vasos sangüíneos e co-localiza-se com o colágeno IV e que a

forte hemorragia causada por metaloproteases da classe PIII está relacionada ao

acúmulo destas proteinas na membrana basal.

Um dos primeiros trabalhos que descreveram a participação da jararagina na

resposta inflamatória, induzida após o envenenamento, mostrou que a jararagina foi

capaz de processar o precursor do TNF-α recombinante (pró-TNF) na sua forma ativa,

exibindo uma atividade TACE-like (MOURA-DA-SILVA et al., 1996). Mais tarde,

Clissa et al. (2001) mostraram, que em modelo experimental de cultura de macrófagos,

a jararagina estimulou a produção de citocinas pró-inflamatórias, induzindo um

aumento na transcrição de mRNA que codifica para IL-1 , IL-6 e TNF- . Laing et al.

(2003), verificaram que a necrose induzida pela jararagina foi totalmente abolida em

animais deficientes em receptores de TNF (TNFR1 e TNFR2) e foi significantemente

reduzida em animais deficientes em IL-6, mostrando a importância das citocinas

inflamatórias na necrose tecidual que ocorre após o envenenamento. Além disso, a

jararagina induz dor quando injetada no coxim plantar de ratos (DALE et al., 2004) e

acúmulo de leucócitos no tecido sub-cutâneo murino, com predomínio de neutrófilos

(COSTA et al., 2002),

Além da ação da jararagina sobre células endoteliais culminando com o efeito

hemorrágico característico das SVMP, a jararagina também age sobre as células

endoteliais induzindo a produção de prostaglandinas, oxido nítrico e liberação de IL-8

(SCHATTNER et al., 2005). Alguns estudos realizados por nosso grupo têm se

concentrado em avaliar o efeito da jararagina sobre as células endoteliais vasculares e

verificar o seu mecanismo de ação, uma vez que esta toxina apresenta algumas

atividades seletivas a estas células. Foi observado por Tanjoni et al. (2005), que o

tratamento de células endoteliais murinas (Tend) com a jararagina resultou em uma

diminuição na viabilidade celular e na capacidade destas células se manterem aderidas

às placas de cultura, resultando em apoptose por anoikis. A atividade pró-apoptótica da

jararagina foi dependente da atividade catalítica e o tratamento destas células com a

jararagina por 10 minutos foi suficiente para causar uma rápida mudança na dinâmica

do citoesqueleto, com retrações celulares, acompanhadas pelo rearranjo das fibras de

actina e interferência no contato de adesão focal. Em concordância com estes resultados

também foi observado apoptose de células endoteliais isoladas do cordão umbilical

humano (HUVECs) após tratamento com a jararagina, sugerindo que também ocorra o

mecanismo de anoikis (BALDO et al., 2008).

No veneno de Bothrops jararaca são encontradas duas formas da jararagina, a

jararagina íntegra e a jararagina-C, uma molécula contendo apenas os domínios tipo-

disintegrina e rico em cisteínas, sendo esta um produto de clivagem proteolítica da

jararagina (MOURA-DA-SILVA et al., 2003). A molécula de jararagina-C mostrou-se

eficiente em desencadear a liberação local de citocinas e aumentou o rolamento de

neutrófilos na parede do endotélio, sugerindo que os domínios tipo-disintegrina e rico

em cisteínas também possuam papéis importantes nos eventos iniciais da resposta

inflamatória aguda (CLISSA et al., 2006). Entretanto, o papel dos domínios estruturais

das SVMPs na atividade pró-inflamatória ainda não está totalmente esclarecido.

O perfil da expressão gênica de células endoteliais submetidas a um tratamento

com a jararagina foi realizado recentemente por nosso grupo, em colaboração com o Dr.

Jay Fox, na Universidade de Virgínia (dados não publicados). A expressão gênica de

células HUVEC estimuladas com 10 g/mL de jararagina (200nM) por 24h, foi avaliada

pela técnica de Microarray (Affymetrix- chip HG-U133A contendo 22.283 pares de

sonda). Os resultados demonstram que HUVECS tratadas com jararagina tiveram 59

genes regulados positivamente, com um aumento na expressão maior ou igual a 1,5

quando comparados com as células controle tratadas com meio de cultura. Destes, 25

genes estavam relacionados direta ou indiretamente com a resposta inflamatória. Uma

regulação gênica negativa, com diminuição na expressão menor ou igual a -1,5 foi

observada em 11 genes e 7 destes correspondem a mediadores inflamatórios. Estes

genes estão envolvidos com diferentes efeitos biológicos, como por exemplo:

sinalização e interação célula-célula; morte celular; resposta imune ou doenças

inflamatórias, etc. Um resumo dos genes e as atividades biológicas em que estão

envolvidos pode ser visualizado na tabela 1 (A lista com a descrição dos genes

encontra-se no anexo A). Uma análise mais precisa, no sentido de quantificarmos a

expressão destes genes, poderia nos informar com maior nitidez quais genes expressos

possuem um papel mais relevante na resposta inflamatória desenvolvida após o

tratamento com a jararagina. Diante disso, nesse trabalho desenvolvemos um estudo da

expressão gênica de mediadores inflamatórios induzidos pela jararagina pela técnica de

PCR em tempo real, e também uma análise no padrão de expressão na superfície celular

de alguns destes genes.

Tabela 1- Lista de genes cuja expressão foi alterada após tratamento de HUVECs com 200nM de jararagina

por 24 horas em experimentos de Microarray realizados com GeneChip Affymetryx HgU133 probe

e analisados pelo programa Ingenuity analysis.

Gene Fold

change

Family Cell to Cell

signaling and

interaction

Cell

Death

Cellular

Movement

Immune

Response

Inflammatory

Disease

SELE 5,33 adhesion molecule ** ** ** **

CD69 3,39 transmembrane receptor ** ** **

SAT 3,23 Enzyme ** **

VCAM1 2,75 adhesion molecule ** ** ** **

IL8 2,23 Cytokine ** ** ** ** **

CEBPD 2,15 ** **

IL6 1,97 Cytokine ** ** ** ** **

THBD 1,97 transmembrane receptor ** **

SULF1 1,95 Enzyme ** ** **

CXCL6 1,91 Cytokine ** ** **

ANGPT2 1,88 growth factor ** ** ** **

CDKN1B 1,82 ** ** ** **

SOD2 1,78 Enzyme ** **

DTR 1,75 growth factor ** ** ** **

PEG10 1,74 **

MMP10 1,73 Peptidase **

ARG2 1,69 Enzyme ** **

GULP1 1,67 **

DAF 1,66 ** ** ** ** **

TLN1 1,64 **

CSF2RB 1,59 transmembrane receptor ** ** **

PLCB1 1,55 Enzyme **

IL1RL1 1,54 transmembrane receptor ** ** ** ** **

BTG1 1,54 **

SH3BP5 1,53 **

ANGPTL4 -1,51 **

HES1 -1,54 transcription regulator ** **

JAG2 -1,56 growth factor **

BGN -1,61 **

DDIT4 -1,63 **

JAG1 -2,2 growth factor ** ** **

BHLHB2 -2,3 transcription regulator **

6 CONCLUSÕES

Em nosso modelo, a jararagina foi capaz de induzir a expressão

de genes pró-inflamatórios. Entretanto esse estímulo não foi suficiente para

resultar na expressão protéica em concentrações detectáveis destas moléculas.

A eliminação do LPS das amostras foi de extrema importância

para estudarmos o mecanismo direto da ação da jararagina sobre as células

endoteliais.

As diferenças nos intervalos de tempos de expressão gênica

induzida pela jararagina em relação à expressão induzida pelo LPS sugere que

esta toxina ativa uma via de sinalização celular diferente da via de ativação

induzida pelo LPS.

A jararagina ligou-se diretamente na célula endotelial, mas o

receptor responsável por esta ligação deve ser melhor caracterizado.

Este trabalho contribui com a literatura na medida em que elucida

a participação de importantes genes dentro do contexto inflamatório

desencadeado pela jararagina em células endoteliais, resultante do

envenenamento botrópico.

REFERÊNCIAS 1

ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. Rio

de Janeiro: Elsevier, 2008.

AIDA, Y.; PABST, M. J. Removal of endotoxin from protein solutions by phase

separation using Triton X -114. J. Immunol. Methods., v. 132, p. 191-195, 1990.

AKIRA, S.; HIRANO, T.; TAGA, T.; KISHIMOTO, T. Biology of multi-functional

cytokines: IL-6 and related molecules (IL-1 and TNF). FASEB J., v. 4, p. 2860-2867,

1990.

ALBELDA, S. M.; BUCK, C. A. Integrins and other cell adhesion molecules. FASEB

J., v. 4, p. 2868-2880, 1990.

ALBELDA, S. M.; SMITH, C. W.; WARD, P. A. Adhesion molecules and

inflammation injury. FASEB J., v. 8, p. 504-512, 1994. Review.

ALEXANDER, J. S.; ELROD, J. W.; PARK, J. H. Roles of leukocyte and immune cell

junctional proteins. Microcirculation, v. 8, p. 169-179, 2001.

BALDO, C.; JAMORA, C.; YAMANOUYE, N.; ZORN, T. M.; MOURA-DA-SILVA,

A. M. Mechanisms of Vascular Damage by Hemorrhagic Snake Venom

Metalloproteinases: Tissue Distribution and In Situ Hydrolysis. PLoS Neglected

Tropical Diseases, v. 4, n. 6, p. 1-10, 2010.

BALDO, C.; TANJONI, I.; LEON, I. R.; BATISTA, I. F.; DELLA-CASA, M. S.;

CLISSA, P. B.; WEINLICH, R.; LOPES-FERREIRA, M.; LEBRUN, I.;

AMARANTES-MENDES, G. P.; RODRIGUES, V. M.; PARALES, J.; VALENTE, R.

H.; MOURA-DA-SILVA, A. M. BnP1, a novel P-1 metalloproteinase from Bothrops

neuwiedi venom: biological effects benchmarking relatively to jararhagin, a P-III

SVMP. Toxicon, v. 51, p. 54-65, 2008.

BEMELMANS, M. H.; VAN TITS, L. J.; BUURMAN, W. A. Tumor necrosis factor:

function, release and clearance. Crit. Rev. Immnunol., v. 16, p. 1-11, 1996.

* De acordo com: ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: Informação e

documentação: referências: elaboração. Rio de Janeiro, 2002.

BÉRNILS, R. S. (Org.). Brazilian reptiles – List of species 2010 Disponível em:

<http://www.sbherpetologia.org.br/>. Sociedade Brasileira de Herpetologia. Acesso em:

10 out 2010.

BEVILACQUA, M.; NELSON, R. M. Selectins. J. Clin. Invest., v. 91, p. 379-387,

1993.

BIERHAUS, A.; CHEN, J.; LILIENSIEK, B.; NAWROTH, P.P. LPS and cytokine-

activated endothelium. Semin. Thromb. Hemost., v. 26, n. 5, p. 571-87, 2000.

BJARNASON, J. B.; FOX, J. W. Hemorrhagic metalloproteinase from snake venoms.

Pharmac. Ther., v. 62, p. 325-372, 1994.

BLACKWILL, R. F.; BURKE, F. The cytokine network. Immunol. Today, v. 10, p.

299-304, 1989.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochemistry,

v. 72 , p. 248-254, 1976.

BRAUD, S.; BOM, C.; WISNER, A. Snake venom proteins acting on hemostasis.

Biochimie, v. 82, p. 851-859, 2000.

BRKOVIC, A.; PELLETIER, M.; GIRARD, D.; SIROIS, M.G. Angiopoietin

chemotactic activities on neutrophils are regulated by PI-3K activation. Journal of

Leukocyte Biology., v. 81, p. 1093-1101, 2007.

CASTELLANOS, M. C.; MUNOZ, C.; MONTOYA, M. C.; LARA-PEZZI, E.;

LOPEZ-CABRERA, M.; DE LANDAZURI, M. O. Expression of the leukocyte early

activation antigen CD69 is regulated by the transcription factor AP-1. The Journal of

Immunology, v. 159, n. 11, p. 5463-5473, 1997.

CHEN, C. H.; WALTERSCHEID, J. P. Plaque angiogenesis versus compensatory

arteriogenesis in atherosclerosis. Circ. Res., v. 99, p. 787-789, 2006.

CINES, D. B.; POLLAK, E. S.; BUCK, C. A.; LOSCALZO, J.; ZIMMERMAN, G. A.;

MCEVER, R. P.; POBER, J. S.; WICK, T. M.; KONKLE, B. A.; SCHWARTZ, B. S.;

BARNATHAN, E. S.; MCCRAE, K. R.; HUG, B. A.; SCHMIDT, A. M.; STERN, D.

M. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.

Blood, v. 91, p. 3527–3561, 1998.

CLISSA, P. B.; LAING, G. D.; THEAKSTON, R. D. G.; MOTA, I.; TAYLOR, M. J.;

MOURA-DA-SILVA, A. M. The effect of jararhagin, a metalloproteinase from

Bothrops jararaca venom, on pro-inflammatory cytokines releasaed by murine

peritoneal adherent cells. Toxicon, v. 39, p. 1567-1573, 2001.

CLISSA, P. B.; LOPES-FERREIRA, M.; DELLA-CASA, M. S.; FARSKY, S. H.;

MOURA-DA-SILVA, A. M. Importance of jararhagin disintegrin-like and cysteyne-

rich domains in the early events of local inflammatory response. Toxicon, v. 47, p. 591-

596, 2006.

COATES, M.; RUTA, M. Nice snake, shame about the legs. Trends Ecol. Evol., v. 14,

p. 503-507, 2000.

COMINETTI, M. R.; TERRUGGI, C. H.; RAMOS, O. H.; FOX, J. W.; MARIANO-

OLIVEIRA, A.; DE FREITAS, M. S.; FIGUEIREDO, C. C.; MORANDI, V.;

SELISTRE-DE-ARAUJO, H. S. Alternagin-C, a disintegrin-like protein, induces

vascular endothelial cell growth factor (VEGF) expression and endothelial cell

proliferation in vitro. J. Biol. Chem., v. 279, p. 18247-18255, 2004.

COSTA, E. P.; CLISSA, P. B.; TEIXEIRA, C. F. P.; MOURA-DA-SILVA, A. M.

Importance of metalloproteinases and macrophages in viper venoms-induced local

inflammation. Inflammation, v. 26, p. 13-17, 2002.

DALE, C. S.; GONCALVES, L. R.; JULIANO, L.; JULIANO, M. A.; DA SILVA A.

M.; GIORGI, R. The C-terminus of murine S100A9 inhibits hyperalgesia and edema

induced by jararhagin. Peptides, v. 25, p. 81-89, 2004.

DAVIS, S.; ALDRICH, T. H.; JONES, P. F.; ACHESON, A.; COMPTON, D. L.;

JAIN, V.; RYAN, T. E.; BRUNO, J.; RADZIEJEWSKI, C.; MAISONPIERRE, P.C.;

YANCOPOULOS, G. D. Isolation of angiopoetin-1, a ligand for the Tie2 receptor, by

secretion-trap expression cloning. Cell, v. 87, p. 1161-1169, 1996.

DE LUCA, M.; WARD, C. M.; OHMORI, K.; ANDREWS, R. K.; BERNDT, M. C.

Jararhagin and jaracetin: novel snake venom inhibitors of the integrin collagen receptor,

α2β1. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 206, p. 570-576, 1995.

DE MORAES, C. K.; FRITZEN M., CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M.; SELISTRE-

DE-ARAÚJO, H. S. rACLFaclf, a recombinant snake venom metalloprotease, activates

endothelial cells in vitro. J. Venom. Anim. Toxins incl. Trop. Dis., v. 14, n. 1, p. 113-

127, 2008.

DENNIS, E. A.; RHEE, S. G.; BILLAH, M. M.; HANNUN, Y. A. Role of

phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J.,

v. 5, p. 2068-2077, 1991.

DIAMOND, M. S.; SPRINGER, T. A. The dynamic regulation of integrin

adhesiveness. Current Biology, v. 4, p. 506, 1994.

DING, J. L.; HO, B. A. New era in pyrogen testing. Trends in Biotechnology, v. 19, p.

277-281, 2001.

DVORAK, H. F.; BROWN, L. F.; DETMAR, M.; DVORAK, A. M. Vascular

permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular

hyperpermeability, and angiogenesis. Am. J. Pathol., v. 146, p. 1029-1039, 1995.

EBLE, J. A.; NILAND, S.; BRACHT, T.; MORMANN, M.; PETER-KATALINIC, J.;

POHLENTZ, G.; STETEFELD, J. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a

cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J., v. 23, p. 2917–2927, 2009.

ESCALANTE, T.; NUÑEZ, J.; MOURA-DA-SILVA, A. M.; RUCAVADO, A.;

THEAKSTON, R. G. D.; GUTIÉRREZ, J. M. Pulmonary hemorrhage induced by

jararhagin, a metalloproteinase from Bothrops jararaca snake venom. Toxicol. Appl.

Pharmacol., v. 193, p.17-28, 2003.

FARSKY, S. P.; MELLO, S. B. V. Participação de moléculas de adesão no

desenvolvimento da resposta inflamatória. Rev. Hosp. Clin. Fac. Med. São Paulo, v.

50, n. 1, p. 80-89, 1995.

FENWICK, A.M.; GUTBERLET JR, R.L.; EVANS, J.A.; PARKINSON, C.L.

Morphological and molecular evidence for phylogeny and classification of South

American pitvipers, genera Bothrops, Bothriopsis, and Bothrocophias (Serpentes:

Viperidae). Zoological Journal of the Linnean Society, v. 156, p. 617-640, 2009.

FERNANDES, C. M.; ZAMUNER, S. R.; ZULIANI, P. J.; RUCAVADO, A.;

GUTIÉRREZ, J. M.; TEIXEIRA, C. F. Inflammatory effects of BaP1 a

metalloproteinase isolated from Bothrops asper snake venom: Leukocyte recruitment

and release of cytokines. Toxicon, v. 47, p. 549-559, 2006.

FIEDLER, U.; AUGUSTIN, H. G. Angiopoietins: a link between angiogenesis and

inflammation. Trends in Immunology, v. 27, n. 12, p. 552-558, 2006.

FIEDLER, U.; REISS, Y.; SCHARPFENECKER, M.; GRUNOW, V.; KOIDL, S.;

THURSTON, G.; GALE, N. W.; WITZENRATH, M.; ROSSEAU, S.; SUTTORP, S.;

SOBKE, A.; HERRMANN, M.; PREISSNER, K. T.; VAJKOCZY, P.; AUGUSTIN, H.

G. Angiopoietin-2 sensitizes endothelial cells to TNF- and has a crucial role in the

induction of inflammation. Nat. Med., v. 12, p. 235-239, 2006.

FOX, J. W.; SERRANO, S. M. T. Insights into and speculations about snake venom

metalloproteinase (SVMP) synthesis, folding and disulfide bond formation and their

contribution to venom complexity. FEBS J., p. 3016-3030, 2008. Review.

FOX, J. W.; SERRANO, S. M. T. Structural considerations of the snake venom

metalloproteinases, key members of the M12 reprolysin family of metalloproteinases.

Toxicon, v. 45, p. 969-985, 2005.

FURIE, M. B.; RANDOLPH, G. J. Chemokine and tissue injury. Am. J. Pathol., v.

146, p. 1287-301, 1995.

GALLAGHER, P. G.; BAO, Y.; SERRANO, S. M. T.; KAMAGUTI, A. S.;

THEAKSON, D. G.; FOX, J. Use of microarray for investigating the subtoxic effects of

snake venoms: insights vein endothelial cells. Toxicon, v. 41, p. 429-440, 2003.

GALLAGHER, P.; BAO, Y.; SERRANO, S. M. T.; LAING, G. D.; THEAKSTON, R.

D. G; MAUCH, C.; MOSKALUK, C.; FOX, J. W. Role of the snake venom toxin

jararhagin in proinflammatory pathogenesis: In vitro and in vivo gene expression

analysis of the effects of the toxin. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 45, p.

1-15, 2005.

GALLIN, J. I.; GOLDSTEIN, I. M.; SNYDERMAN, R. Inflammation: Basic

Principles and Clinical Correlates. New York: Ed. Raven Press, 1992.

GOMIS-RUTH, F. X. Structural aspects of the metzincin clan of

metalloendopeptidases. Mol. Biotechmol., v. 24, p. 157-202, 2003.

GRAMS, F.; HUBER, R.; KRESS, L. F.; MORODER, F.; MODE, W. Activation of

snake venom metalloptroteinase by a cysteine switch-like mechanism. FESB Lett., v.

335, p. 76-80, 1993.

GUTIÉRREZ, J. M.; LÉON, G.; ROJAS, G.; LOMONTE, B.; RUCAVADO, A.;

CHAVES, F. Neutralization of local tissue damage induced by Bothrops asper

(terciopelo) snake venom. Toxicon, v. 36, p. 1529-1538, 1998.

GUTIÉRREZ, J. M.; LOMONTE, B. Local pathological effects induced by Bothrops

snake venom, Mem. Inst. Butantan, v. 33, p. 1405-1474, 1995a.

GUTIÉRREZ, J. M.; LOMONTE, B. Phospholipase A2 myotoxins from Bothrops snake

venoms. Toxicon, v. 33, n. 11, p. 1405-1424, 1995b.

GUTIÉRREZ, J. M.; ROMERO, M.; NUNEZ, J.; CHAVES, F.; BORKOW, G.;

OVADIA, M. Skeletal Muscle Necrosis and Regeneration after Injection of BaH1, A

Hemorrhagic Metalloproteinase Isolated from the Venom of the Snake Bothrops asper

(Terciopelo). Experimental and Molecular Pathology, v. 62, p. 28-41, 1995.

GUTIÉRREZ, J. M.; RUCAVADO, A. Snake venom metalloproteinases: Their role in

the pathogenesis of local tissue damage. Biochemie, v. 82, p. 841-850, 2000.

GUTIÉRREZ, J. M.; RUCAVADO, A.; ESCALANTE, T.; DÍAZ, C. Hemorrhage

induced by snake venom metalloproteinases: biochemical and biophysical mechanisms

involved in microvessel damage. Toxicon, v. 45, p. 997-1011, 2005.

HARRIS, J. B.; GRUBB, B, D.; MALTIN, C. A.; DIXON, R. The neurotoxicity of the

venom phospholipase A2, notexin and taipoxin. Exp. Neurol., v. 161, p. 517-526, 2000.

HEMONARD, H.; GRIMAUD, J. A. Matrix metalloproteinases. Cell Mol. Biol., v. 36,

n. 2, p. 131-53, 1990. Review.

HOOPER, N. M. Families of zinc metalloproteases, FESBS Lett., v. 354, p. 1-6, 1994.

HOPKINS, S. J. The pathophysiological role of cytokines. Leg. Med., v. 5, n. 1, p. 45-

57, 2003.

HUO, Y.; LEY, K. Adhesion molecules and atherogenesis. Acta. Physiol. Scand.

Charlottesville, v. 173, n. 1, p. 35-43, 2001.

KAMIGUTI, A. S. Platelets as targets of snake venom metalloproteinases. Toxicon, v.

45, n. 8, p. 1041-1049, 2005. Review.

KAMIGUTI, A. S.; HAY, C. R. M.; ZUZEL, M. Inhibition of collagen-induced platelet

aggregation as the result of cleavage of α2β1 integrin by the snake venom

metalloproteinase jarararhagin. Biochem. J., v. 320, p. 635-641,1996.

KIM, I.; KIM, H. G.; MOON, S. O.; CHAE, S.W.; SO, J. N.; KOH, K. N.; AHN, B. C.;

KOH, G. Y. Angiopoietin-1 induced endothelial cell sprouting through the activation of

focal adhesion kinase and plasmin secretion. Circ. Res., v. 86, p. 952-959, 2000.

KOCH, A. E.; VOLIN, M. V.; WOODS, J. M.; KUNKEL, S. L.; CONNORS, M. A.;

HARLOW, L. A.; WOODRUFF, D. C.; BURDICK, M. D.; STRIETER, R. M.

Regulation of angiogenesis by the C-X-C chemokines interleukin-8 and epithelial

neutrophil activating peptide 78 in the rheumatoid joint. Arthritis Rheum., v. 44, p. 31-

40, 2001.

KOCHVA, E. The origin of snakes and evolutionary of the venom apparatus. Toxicon,

v. 25, n. 1, p. 65-106, 1986.

KUBES, P.; SUZUKI, M.; GRANGER, D. N. Nitric oxide: an endogenous modulator

of leukocyte adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 88, p. 4651-4655, 1991.

LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the asembly of the head of the

bacteriophage T4. Nature, v. 227, p .680-685, 1970.

LAING, D. G.; CLISSA, P. B.; THEAKSTON, R. D. G; MOURA-DA-SILVA, A. M.;

TAYLOR, M. J. Inflammatory pathogenesis of snake venom metalloprotease-induced

skin necrosis. Eur. J. Immunol., v. 33, p. 3458-3463, 2003.

LAING, G. D.; MOURA-DA-SILVA, A. M. Jararhagin and multiple effects on

hemostasis. Toxicon, v. 45, p. 987-996, 2005.

LALLOO, D.; THEAKSTON, R. D. G. Snake antivenoms. J. Toxicol. Clin. Toxicol.,

v. 41, p. 277-290, 2003.

LEE, M. S.; SCANLON, J. D. Snake phylogeny based on osteology, soft anatomy and

ecology. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc., v. 77, n. 3, p. 333-401, 2002

LEFER, A. M. Role of the beta-2 integrins and immnunoglobulin superfamily members

in myocardial ischemia-reperfusion. Ann. Trorac. Surg., v. 68, p. 1920-1923, 1999.

LEVIN, J.; BANG, F. B. Clottable protein in limulus: Its localization and kinetics of its

coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh., v. 19, p. 186, 1968.

LI, A.; DUBEY, S.; VARNEY, M. L.; DAVE, B. J.; SINGH, R. K. IL-8 directly

enhanced endothelial cell survival, proliferation, and matrix metalloproteinases

production and regulated angiogenesis. J. Immunol., v. 170, p. 3369-3376, 2003.

LIVAK, J. K.; SCHMITTGEN, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using

Real-Time Quantitative PC R and the 2-ΔΔCT

Method. Methods, v. 25, p. 402-408, 2001.

LOPES, D. S.; BALDO, C.; OLIVEIRA, C. F.; ALCÂNTARA, T. M.; OLIVEIRA, J.

D. D.; GOULART, L. R.; HAMAGUCHI, A.; HOMSI-BRANDEBURGO, M. I.;

MOURA-DA-SILVA, A. M.; CLISSA, P. B.; RODRIGUES, V. M. Characterization of

inflammatory reaction induced by neuwiedase, a P-I metalloproteinase isolated from

Bothrops neuwiedi venom. Toxicon, v. 54, p. 42-49, 2009.

MAISONPIERRE, P. C.; SURI, C.; JONES, P. F.; BARTUNKOVA, S.; WIEGAND, S.

J.; RADZIEJEWSKI, C.; COMPTON, D.; MCCLAIN, J.; ALDRICH, T. H.;

PAPADOPOULOS, N.; DALY, T. J.; DAVIS, S.; SATO, T. N.; YANCOPOULOS, G.

D. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.

Science, v. 277, p. 55-60, 1997.

MALIBA, R.; BRKOVIC, A.; NEAGOE, P. E.; VILLENEUVE, L. R.; SIROIS, M. G.

Angiopoietin-mediated endothelial P-selectin translocation:cell signaling mechanisms.

Journal of Leukocyte Biology, v. 83, p. 352-360, 2008.

MANDRIOTA, S. J.; PEPPER, M. S. Regulation of angiopoietin-2 mRNA levels in

bovine microvascular endhotelial cells by cytokines and hypoxia. Cirv. Res., v. 83, p.

852-859, 1998.

MANICONE, A. M.; MCGUIRE, J. K. Matrix metalloproteinases as modulators of

inflammation. Semin. Cell Dev. Biol., v. 19, n. 1, p. 34-41, 2008.

MARKLAND, F. S. Snake venoms and the hemostatic system. Toxicon, v. 36, p. 1749-

1800, 1998.

MARZIO, R.; MAUËL, J.; BETZ-CORRADIN, S. CD69 and Regulatiof the Immune

Function. Immunopharmacology and Immunotoxicology, v. 21, n. 3, p. 565–582,

1999.

MATSUI, T.; FUJIMURA, Y.; TITANI, K. Snake venom proteases affecting

hemostasis and thrombosis. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1477, p. 146-156, 2000.

MCEVER, R. P.; MOORE, K. L.; CUMMINGS, R. D. Leukocyte trafficking is

mediated by selectin-carbohydrate interactions. J. Biol. Chem., v. 270, p. 11025-11028,

1995.

MEHRAD, B.; KEANE, A. P,; STRIETER, R. M. Chemokines as mediators of

angiogenesis. Tromb. Haemost., v. 97, p. 755-762, 2007.

MEIER, J. Venomous snakes. In: STOCKER, K. F. Medical use of snake proteins.

Basel: Ed. CRC Press, 1990. p. 1-32.

MIDDLETON, J.; PATTERSON, A. M; GARDNER, L.; SCHMUTZ, C.; ASHTON,

B. A. Leukocyte extravasation: chemokine transport and presentation by the

endotelium. Blood, v. 100, p. 3853-3860, 2002.

MILLER, M. D.; KRANGEL, M. S. Biology and biochemistry of chemokines: a family

of chemotactic and inflammatory cytokines. Crit. Rev. Immnunol., v. 12, p. 17-46,

1992. Review.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Histórico do ofidismo. 2008. Disponível em:

<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/historico_ofidismo.pdf.> Acesso em: 12

maio 2010.

MOURA-DA-SILVA, A. M.; BUTERA, D.; TANJONI, I. Importance of snake venom

metalloproteinase in cell biology: effects on platelets, inflammatory and endothelial cell.

Current Pharmaceutical design. v. 13, p. 2893-2905, 2007.

MOURA-DA-SILVA, A. M.; DELLA-CASA, M. S.; DAVID, A. S.; ASSAKURA, M.

T.; BUTERA, D.; LEBRUN, I.; SHANNON, J. D.; SERRANO, S. M.; FOX, J. W.

Evidence for heterogeneous forms of the snake venom metalloproteinase jararhagin: a

factor contributing to snake venom variability. Arch. Biochem. Biophys., v. 409, p.

395-401, 2003.

MOURA-DA-SILVA, A. M.; LAING, G.; PAINE, D. M. J. I.; DENNISON, J. M. T. J.;

POLITI, V.; CRAMPTON, J. M.; THEAKSTON, R. D. G. Processing of pro-tumor

necrosis factor-α by venom metalloproteinases: a hypothesis explaining local tissue

damage following snake bite. Eur. J. Immunol., v. 26, p. 2000-2005, 1996.

MOURA-DA-SILVA, A. M.; MARCINKIEWICZ, C.; MARCINKIEWICZ, M.;

NIEWIAROWSKI, S. Selective recognition of alpha2beta1 integrin by jararhagin, a

Metalloproteinase/disintegrin from Bothrops jararaca venom. Thromb. Res., v. 102, p.

153-159, 2001.

MOURA-DA-SILVA, A. M.; RAMOS, O. H. P.; BALDO, C.; NILAND, S.; HANSEN,

U.; VENTURA, J. S.; FURLAN, S.; BUTERA, D.; DELLA-CASA, M. S.; TANJONI,

I.; CLISSA, P. B.; FERNANDES, I.; CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M.; EBLE, J. M.

Collagen binding is a key factor for the hemorrhagic activity of snake venom

metalloproteinases. Biochimie, v. 90, p. 484-492, 2008.

MUKAIDA, N.; KETLINSKI, S. A.; MATSUSHIMA, K. Interleukin-8 and other CXC

chemokines. In: THOMSON, A. W.; LOTZE, M. T. The cytokine handbook. London:

Academic Press, 1998.

MULLER, W. A.; WEIGL, S. A.; DENG, X.; PHILLIPS, D. M. PECAM-1 is required

for transendothelial migration of leukocytes. J. Exp. Med., v. 178, n. 2, p. 449-460,

1993.

NEREM, R. M.; HARRISON, D. G.; TAYLOR, W. R.; ALEXANDER, R. W. J.

Hemodynamics and vascular endothelial biology. Cardiovasc. Pharmacol. v. 21, n. 1,

p. 6-10, 1993.

NIKAI, T.; MORI, N.; KISHIDA, M.; SUGIHARA, H.; TU, A. T. Isolation and

Biochemical characterization of hemorrhagic toxin from the venom of Crotalus atrox.

Arch. Biochem. Biophys., v. 231, p. 309-311, 1984.

OKADA, M.; SUZUKI, K.; TAKADA, K.; NAKASHIMA, M.; NAKANSHI, T.;

SHINOHARA, T. Detection ofup-regulated genes in thrombin-stimulated human

umbilical vein endothelial cells. Thrombosis Research, v. 118, p. 715-721, 2006.

OLIVEIRA, C. F.; LOPES, D. S.; MENDES, M. M.; HOMSI-BRANDEBURGO, M. I.;

HAMAGUCHI, A.; ALCÂNTARA, T. M.; CLISSA, P. B.; RODRIGUES, V. M.

Insights of local tissue damage and regeneration induced by BnSP-7, a myotoxin

isolated from Bothrops (neuwiedi) pauloensis snake venom. Toxicon, v. 53, p. 560-569,

2009.

PAINE, M.; DESMOND, H.P.; THEAKSTON, R. D. G.; CRAMPTON, J. M.

Purification, cloning and molecular characterization of a high molecular weight

hemorrhagic metalloproteinase, jararhagin, from Bothrops jararaca venom. J. Biol.

Chem., v. 267, p. 22869-22879, 1992.

PAUL, W. E. Fundamental Immunology. Philadelphia: Ed. Lippincott-Raven, 1998.

PENBERTHY, T. W.; JIANG, Y.; GRAVES, D. T. Leukocyte Adhesion Molecules.

Critical Reviews in Oral Biology & Medicine, v. 8, p. 380-388, 1997.

PETRI, B.; PHILLIPSON, M.; KUBES, P. Brief Reviews: Physiology of leukocyte

recruitment. J. Immunol., v. 180, p. 6439-6446, 2008.

POBER, J. S.; SESSA, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation.

Nature Reviews Immunology, v. 7, p. 803-815, 2007.

RAMOS, O. H. P.; SELISTRE-DE-ARAÚJO, H. S. Snake venom metalloprotease-

structure and function of catalytic and desintegrin domains. Comparative

biochemistry and Physiology, v. 142, p. 328-346, 2006.

RODRIGUES, V. M.; SOARES, A. M.; GUERRA-SÁ, R.; RODRIGUES, V.;

FONTES, M. R.; GIGLIO, J. R. Structural and functional characterization of

neuwidase, a nonhemorrhagic fibrin(ogen)olytic metalloprotease from Bothrops

neuwiedi snake venom. Biophys, v. 381, p. 213-224, 2000.

ROVIEZZO, F.; TSIGKOS, S.; KOTANIDOU, A.; BUCCI, M.; BRANCALEONE, V.;

CIRINO, G.; PAPAPETROPOULOS, A. Angiopoietin-2 causes inflammation in vivo

by promoting vascular leakage. J. Pharmacol. Exp. Ther., v. 314, p. 738-744, 2005.

RUCAVADO, A.; ESCALANTE, T.; TEIXEIRA, C. F.; FERNANDES, C. M.; DIAZ,

C.; GUTIÉRREZ, J. M. Incrementes in cytokines and matrix metalloproteinases in

skeletal muscle after injection of tissue-damagin toxins from the venom of the snake

Bothrops asper. Mediators Inflamm., v. 11, p. 121-128, 2002.

RUSSEL, F. E. Venoms. In: RUSSEL, F. E. Snake Venoms Poisoning. Philadelphia:

Lippincott, 1980. p. 139-234.

SALUK-JUSZCZAK, J.; WACHOWICZ, B. The proinflammatory activity of

lipopolysaccharide. Postepy Biochem. v. 51, n. 3, p. 280–287, 2005.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: A Laboratory

Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

SANTOS-FILHO, N. A.; SILVEIRA, L. B.; OLIVEIRA, C. Z.; BERNARDES, C. P.;

MENALDO, D. L.; FULY, A. L.; ARANTES, E. C.; SAMPAIO, S. V.; MAMEDE, C.

C.; OLIVEIRA, F.; SOARES, A. M. A new acidic myotoxic, anti-platelet and

prostaglandin I2 inductor phospholipase A2 isolated from Bothops moojeni snake

venom. Toxicon, v. 52, p. 908-917, 2008.

SARÉN, P.; WELGUS, H. G.; KOVANEN, P. T. TNF-α and IL-1β selectively induce

expression of 92-kDa gelatinase by human macrophages. J. Immunol., v. 157, p. 4159-

4165, 1996.

SAUNDERS, W. B.; BAYLESS, K. J.; DAVIS, G. E. MMP-1 activation by serine

proteases and MMP-10 indices human capillary tubular network collapse and regression

in 3D collagen matrices. J. Cell. Sci., v. 118, p. 2325-2340, 2005.

SCHARPFENECKER, M.; FIEDLER, U.; REISS, Y.; AUGUSTIN, H. G. The Tie-2

ligand Angiopoetin-2 destabilizes quiescent endothelium through an internal autocrine

loop mechanism. J. Cell. Sci., v. 118, p. 771-780, 2005.

SCHATTNER, M.; FRITZEN, M.; VENTURA, J. S.; MODESTO, J. C. A.; POZNER,

R. G.; MOURA-DA-SILVA, A. M.; CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M. The snake

venom metalloproteases berythractivase and jararhagin activate endothelial cells. Biol.

Chem., v. 386, p. 369-374, 2005.

SEALS, D. F.; COURTNEIDGE, S. A. The ADAMs family of metalloproteases:

multidomain proteins with multiple functions. Genes Dev., v. 17, p. 7–30, 2003.

SELISTRE-DE-ARAUJO, H. S.; COMINETTI, M. R.; TERRUGGI, C. H.;

MARIANO-OLIVEIRA, A.; DE FREITAS, M. S.; CREPIN, M.; FIGUEIREDO, C. C.;

MORANDI, V. Alternagin-C, a disintegrin-like protein from the venom of Bothrops

alternatus, modulates alpha2beta1 integrin-mediated cell adhesion, migration and

proliferation. Braz. J. Med. Biol. Res., v. 38, n. 10, p. 1505-1511, 2005.

SERRANO, S. M.; KIM, J.; WANG, D.; DRAGULEV, B.; SHANNON, J. D.; MANN,

H. H.; VEIT, G.; WAGENER, R.; KOCH, M.; FOX, J. W. The cysteine-rich domain of

snake venom metalloproteinases is a ligand for von Willebrand factor a domains: role in

substrate targeting. J. Biol. Chem., v. 281, n. 52, p. 39746-39756, 2006.

SHIMOKAWA, K.; JIA, L. G.; WANG, X. M.; FOX, J. M. Expression, activation and

processing of the recombinant snake venom metalloproteinase, pro-atrolysin E. Arch.

Biochem. Biophys., v. 335, p. 283-294, 1996.

SILVA, C.A.; ZULIANI, J.P.; ASSAKURAA, M.T.; MENTELE, R.M.; CAMARGO,

A.C.M.; TEIXEIRA, C.F.P.; SERRANO, S.M.T. Activation of αMβ2-mediated

phagocytosis by HF3, a P-III class metalloproteinase isolated from the venom of

Bothrops jararaca. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 322,

n. 3, p. 950-956, 2004.

SILVA, M. B.; SCHATTNER, M.; RAMOS, C. R.; JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO, I.

L.; GUARNIERI, M. C.; LAZZARI, M. A.; SAMPAIO, C. A.; POZNER, R. G.;

VENTURA, J. S.; HO, P. L.; CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M. A prothrombin activator

from Bothrops erythromelas (jararaca-da-seca) snake venom: characterization and

molecular cloning, Biochem. J., v. 369, p. 129-139, 2003

SINGH, S. B.; ARMUGAM, A.; KINI, R. M.; KANDIAH, J. Phospholipase A2 with

platelet aggregation inhibitor activity from Austrelaps superbus venom: protein

purification and cDNA cloning. Arch. Biochem. Biophys., v. 375, p. 289-303, 2000.

SOARES, A. M.; FONTES, M. R. M.; GIGLIO, J. R. Phospholipase A2 myotoxins

from Bothrops snake venoms: structure-function relationship. Curr. Org. Chem., v. 8,

p. 1677-1690, 2004.

SOUZA, D. H.; IEMMA, M. R.; FERREIRA, L. L.; FARIA, J. P.; OLIVA, M. L.;

ZINGALI, R. B.; IEWIAROWSKI, S.; SELISTRE-DE-ARAUJO, H. S. The

disintegrin-like domain of the snake venom metalloprotease alternagin inhibits

alpha2beta1 integrin-mediated cell adhesion. Arch. Biochem. Biophys., v. 384, p. 341-

50, 2000.

STOCKER, K. F. Compositions of snake venoms. In: STOCKER, K. F. Medical use of

snake proteins. Basel: CRC Press, 1990. p 33-56.

STURN, D. H.; FEISTRITZER, C.; MOSHEIMER, B. A.; DJANANI, A.; BIJUKLIC,

K.; PATSCH, J. R.; WIEDERMANN, C. J. Angiopoietin affects neutrophil migration.

Microcirculation, v. 12, p. 393–403, 2005.

SWENSON, S.; MARKLAND, F. S. J. Snake venom fibrin(ogen)olytic enzymes.

Toxicon, v. 45, n. 8, p. 1021-1039, 2005. TAKADA, Y.; YE, X.; SIMON, S. The integrins. Genome Biol., v. 8, p. 215, 2007.

TAKEICHI, M. Morphogenetic roles of classic cadherins. Curr. Opin. Cell Biol., v. 7,

p. 619–627, 1995.

TANJONI, I.; BUTERA, D.; BENTO, L.; DELLA-CASA, M.S.; MARQUES-PORTO,

R.;

TAKEHARA, H.A.; GUTIÉRREZ, J.M.; FERNANDES, I.; MOURA-DA-SILVA,

A.M. Snake venom metalloproteinases: structure/function relationships studies using

monoclonal antibodies. Toxicon, v. 42, n. 7, p. 801-808, 2003.

TANJONI, I.; EVANGELISTA, K.; DELLA CASA, M. S.; BUTERA, D.;

MAGALHÃES, G. S.; BLADO, C.; CLISSA, P. B.; FERNANDES, I.; EBLE, J.;

MOURA-DA-SILVA, A. M. Different regions of the class PIII snake venom

metalloproteinase jararhagin are involved in binding to α2β1 integrin and collagen.

Toxicon, v. 55, n. 6, p. 1093-1099, 2010.

TANJONI, I.; WEINLICH, R.; DELLA-CASA, M. S.; CLISSA, P.B; SALDANHA-

GAMA, R.F; DE FREITAS, M.S.; BARJA-FIDALGO, C.; AMARANTE-MENDES,

G.P; MOURA-DA-SILVA, A.M. Jararhagin, a snake venom metalloproteinase, induces

a specialized form of apoptosis (anoikis) selective to endothelial cells. Apoptosis, v. 10,

n. 4, p. 851-861, 2005.

TEDDER, T. F.; STEEBER, D. A.; CHEN, A.; ENGEL, P. The selectins: vascular

adhesion molecules. FASEB J., v. 9, p. 866-873, 1995.

TEIXEIRA, C.F.; FERNANDES, C.M.; ZULIANI, J.P.; ZAMUNER, S.F.;

Inflammatory effects of snake venom metalloproteinases. Mem. Inst. Oswaldo Cruz,

v. 1 , p. 181-184, 2005.

TEPASS, U. Genetic analysis of cadherin function in animal morphogenesis. Curr.

Opin. Cell Biol., v. 11, p. 540–548, 1999.

TU, A. T. Snake Venoms: General background and composition. In: TU, A. T.

Venoms: Chemistry and Molecular Biology. New York: John Willey & Sons, 1988. p.

1-19.

VIEMANN, D.; GOEBELER, M.; SCHMID, S.; NORDHUES, U.; KLIMMEK, K.;

SORG, S.; ROTH, J. TNF induces distincti gene expression programs in microvascular

and macrovascular human endothelial cells. Journal of Leukocyte Biology, v. 80, p.

174-185, 2006.

VISSE, R.; NAGASE, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of

metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ. Res., v. 92, n. 8, p. 827-

839, 2003.

VORONOV, E.; APTE, R. N.; SOLER, S. The systemic inflammatory response

syndrome related to the release of cytokines following severe envenomation, J. Venom.

Anim. Toxins, v. 5, p. 5-33, 1999.

WALZOG, B.; GAEHTGENS, P. Adhesion molecules: The path to a new

understanding of acute inflammation. News Physiol., v. 15, p. 107-113, 2000.

WANG, R.; CAI, J.; HUANG, Y.; XU, D.; SANG, H.; YAN, G. Novel recombinant

fibrinogenase of Agkistrodon acutus venom protects against LPS-induced DIC.

Thrombosis Research.,v. 123, n. 6, p. 919-924, 2008.

WARRELL, D. A. Clinical Toxicology of snake bite in Asia. In: MEIER, J., WHITE J.

Handbook of Clinical Toxicology of Animal Venoms and Poisons. New York: CRC

Press, 1995. p. 493-594.

WHINCHER, J. T.; EVANS, S. W. Cytokines in disease. Clin. Chem, v. 38, n. 7, p.

1269-1281, 1990.

WHITE, J. Snake venoms and coagulopathy. Toxicon, v. 45, p. 951-967, 2005.

WOESSNER, J. F. The matrix metalloproteinase family. In: PARCKS, W. C.;

MECHAM, R. P. Matrix metalloproteinases. Califórnia: Academic Press, 1998. p. 1-14.

WU, K. K.; THIAGARAJAN, P. Role of endothelium in thrombosis and hemostasis.

Annu. Rev. Med., v. 47, p. 315–331, 1996.

XUE, M.; LE N. T.; JACKSON, C. J. Targeting matrix metalloproteinases to improve

cutaneous wound healing. Expert Opin. Ther. Targets, v. 1, p. 143-155, 2006.

YOU, W.K.; JANG, Y.J.; CHUNG, K.H.; JEON, O.H.; KIM, D.S.; Functional roles of

the two distinct domains of halysase, a snake venom metalloprotease, to inhibit human

platelet aggregation. Biochem. Biophys. Res., v. 339, p. 964-970, 2006.

ZAMUNÉR, R. S.; ZULIANI, J. P.; FERNANDES, C. M.; GUTIÉRREZ, J. M.;

TEIXEIRA, F. P. C. Inflammation induced by Bothrops asper venom: release of

proinflammatory cytokines and eicosanoids, and role of adhesion molecules in

leukocyte infiltration. Toxicon, v. 46, p. 806-813, 2005.

ZIGRINO, P.; KAMIGUTI, A. S.; EBLE, J.; DRESCHER, C.; NISCHT, R.; FOX, J.

W.; MAUCH, C. The reprolysin jararhagin, a snake venom metalloproteinase, functions

as a fibrillar collagen agonist involved in fibroblast cell adhesion and signaling, J. Biol.

Chem., v. 227, p. 40528-40535, 2002.