Definição e Manuseio das Amostras€¦ · Cell Free DNA Circulante • Fragmentos de DNA...
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Definição e Manuseio das Amostras Mirian Yumie Nishi Pesquisadora Científica Laboratório de Hormônios e Genética Molecular LIM42 Hospital das Clínicas da FMUSP E-mail [email protected]
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Definiccedilatildeo e Manuseio das
Amostras
Mirian Yumie Nishi
Pesquisadora Cientiacutefica
Laboratoacuterio de Hormocircnios e Geneacutetica Molecular LIM42
Hospital das Cliacutenicas da FMUSP
E-mail minishiuspbr
Tipos de amostras para estudos geneacuteticos
Estudo Cromossocircmico (Carioacutetipo)
Obtenccedilatildeo de ceacutelulas para cultura
bull Punccedilatildeo Venosa
bull Bioacutepsia de Pele
Preacute Natal
Biopsia vilosidade coriocircnica 12ordf a 14ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 1
Amniocentese 15ordf a 20ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 05
Cordocentese A partir da 20ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 1
Estudo Molecular
DNA genocircmico e mitocondrial
RNA
RNA mensageiro
RNA transportador
RNA de interferecircncia
micro RNA etc
Proteiacutenas
Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE)
bull Descriccedilatildeo da pesquisa de modo compreensiacutevel e
objetivo
bull Procedimentos e os riscos
bull Quais os benefiacutecios
bull Confidencialidade
bull Participaccedilatildeo voluntaacuteria com alternativa de sair da
pesquisa a qualquer momento sem prejuiacutezo
DNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos pelos
cabelos etc
bull Esfregaccedilo de mucosas (oral vaginal etc)
bull Saliva
bull Tecidos congelados
bull Tecidos parafinados
bull Cultura de ceacutelulas
Sangue DNA de muito boa
qualidade e quantidade
bull Anticoagulante EDTA ou Citrato de
Na (natildeo usar heparina)
bull Manter refrigerado e esteacuteril por 1
semana
bull Evitar congelamento do sangue
total
Tubo com citrato de Na
Tubo com EDTA Cartatildeo FTA
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
quimicalinewordpresscom
Cell Free DNA Circulante
bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Tipos de amostras para estudos geneacuteticos
Estudo Cromossocircmico (Carioacutetipo)
Obtenccedilatildeo de ceacutelulas para cultura
bull Punccedilatildeo Venosa
bull Bioacutepsia de Pele
Preacute Natal
Biopsia vilosidade coriocircnica 12ordf a 14ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 1
Amniocentese 15ordf a 20ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 05
Cordocentese A partir da 20ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 1
Estudo Molecular
DNA genocircmico e mitocondrial
RNA
RNA mensageiro
RNA transportador
RNA de interferecircncia
micro RNA etc
Proteiacutenas
Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE)
bull Descriccedilatildeo da pesquisa de modo compreensiacutevel e
objetivo
bull Procedimentos e os riscos
bull Quais os benefiacutecios
bull Confidencialidade
bull Participaccedilatildeo voluntaacuteria com alternativa de sair da
pesquisa a qualquer momento sem prejuiacutezo
DNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos pelos
cabelos etc
bull Esfregaccedilo de mucosas (oral vaginal etc)
bull Saliva
bull Tecidos congelados
bull Tecidos parafinados
bull Cultura de ceacutelulas
Sangue DNA de muito boa
qualidade e quantidade
bull Anticoagulante EDTA ou Citrato de
Na (natildeo usar heparina)
bull Manter refrigerado e esteacuteril por 1
semana
bull Evitar congelamento do sangue
total
Tubo com citrato de Na
Tubo com EDTA Cartatildeo FTA
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
quimicalinewordpresscom
Cell Free DNA Circulante
bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Preacute Natal
Biopsia vilosidade coriocircnica 12ordf a 14ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 1
Amniocentese 15ordf a 20ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 05
Cordocentese A partir da 20ordf semana gestaccedilatildeo Risco de aborto 1
Estudo Molecular
DNA genocircmico e mitocondrial
RNA
RNA mensageiro
RNA transportador
RNA de interferecircncia
micro RNA etc
Proteiacutenas
Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE)
bull Descriccedilatildeo da pesquisa de modo compreensiacutevel e
objetivo
bull Procedimentos e os riscos
bull Quais os benefiacutecios
bull Confidencialidade
bull Participaccedilatildeo voluntaacuteria com alternativa de sair da
pesquisa a qualquer momento sem prejuiacutezo
DNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos pelos
cabelos etc
bull Esfregaccedilo de mucosas (oral vaginal etc)
bull Saliva
bull Tecidos congelados
bull Tecidos parafinados
bull Cultura de ceacutelulas
Sangue DNA de muito boa
qualidade e quantidade
bull Anticoagulante EDTA ou Citrato de
Na (natildeo usar heparina)
bull Manter refrigerado e esteacuteril por 1
semana
bull Evitar congelamento do sangue
total
Tubo com citrato de Na
Tubo com EDTA Cartatildeo FTA
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
quimicalinewordpresscom
Cell Free DNA Circulante
bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Estudo Molecular
DNA genocircmico e mitocondrial
RNA
RNA mensageiro
RNA transportador
RNA de interferecircncia
micro RNA etc
Proteiacutenas
Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE)
bull Descriccedilatildeo da pesquisa de modo compreensiacutevel e
objetivo
bull Procedimentos e os riscos
bull Quais os benefiacutecios
bull Confidencialidade
bull Participaccedilatildeo voluntaacuteria com alternativa de sair da
pesquisa a qualquer momento sem prejuiacutezo
DNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos pelos
cabelos etc
bull Esfregaccedilo de mucosas (oral vaginal etc)
bull Saliva
bull Tecidos congelados
bull Tecidos parafinados
bull Cultura de ceacutelulas
Sangue DNA de muito boa
qualidade e quantidade
bull Anticoagulante EDTA ou Citrato de
Na (natildeo usar heparina)
bull Manter refrigerado e esteacuteril por 1
semana
bull Evitar congelamento do sangue
total
Tubo com citrato de Na
Tubo com EDTA Cartatildeo FTA
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
quimicalinewordpresscom
Cell Free DNA Circulante
bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE)
bull Descriccedilatildeo da pesquisa de modo compreensiacutevel e
objetivo
bull Procedimentos e os riscos
bull Quais os benefiacutecios
bull Confidencialidade
bull Participaccedilatildeo voluntaacuteria com alternativa de sair da
pesquisa a qualquer momento sem prejuiacutezo
DNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos pelos
cabelos etc
bull Esfregaccedilo de mucosas (oral vaginal etc)
bull Saliva
bull Tecidos congelados
bull Tecidos parafinados
bull Cultura de ceacutelulas
Sangue DNA de muito boa
qualidade e quantidade
bull Anticoagulante EDTA ou Citrato de
Na (natildeo usar heparina)
bull Manter refrigerado e esteacuteril por 1
semana
bull Evitar congelamento do sangue
total
Tubo com citrato de Na
Tubo com EDTA Cartatildeo FTA
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
quimicalinewordpresscom
Cell Free DNA Circulante
bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
DNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos pelos
cabelos etc
bull Esfregaccedilo de mucosas (oral vaginal etc)
bull Saliva
bull Tecidos congelados
bull Tecidos parafinados
bull Cultura de ceacutelulas
Sangue DNA de muito boa
qualidade e quantidade
bull Anticoagulante EDTA ou Citrato de
Na (natildeo usar heparina)
bull Manter refrigerado e esteacuteril por 1
semana
bull Evitar congelamento do sangue
total
Tubo com citrato de Na
Tubo com EDTA Cartatildeo FTA
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
quimicalinewordpresscom
Cell Free DNA Circulante
bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Sangue DNA de muito boa
qualidade e quantidade
bull Anticoagulante EDTA ou Citrato de
Na (natildeo usar heparina)
bull Manter refrigerado e esteacuteril por 1
semana
bull Evitar congelamento do sangue
total
Tubo com citrato de Na
Tubo com EDTA Cartatildeo FTA
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
quimicalinewordpresscom
Cell Free DNA Circulante
bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
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Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
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do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
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AAAn
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5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Esfregaccedilos de Mucosas e Saliva quantidade
de amostra limitada
bull Faacutecil obtenccedilatildeo e faacutecil armazenamento
bull Cuidados para evitar contaminaccedilatildeo
bull DNA de qualidade boa
bull Amostras de pacientesfamiliares que moram longe
bull Bebecircs muito novos eou pequenos
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
bull Difiacutecil manutenccedilatildeo do tecido estrutura
do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
bull DNA de boa qualidade dependendo do tecido
bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
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extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
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bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
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RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
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imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
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Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
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RNAses
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bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
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5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
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cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
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5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
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bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Cultura de Ceacutelulas ou Tecidos
Congelados
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do laboratoacuterio
bull DNA de qualidade e quantidade boas
Tecidos Parafinados
bull Faacutecil obtenccedilatildeo manutenccedilatildeo dos
tecidos e transporte
bull DNA de qualidade ruim com
muitas impurezas e degradado
Kits comerciais diversos
bull tempo de 30 minutos a algumas horas
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bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
bull tempo 2 dias
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bull custo menor
Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
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extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
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avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
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RNA
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bull Tecidos congelados
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RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
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imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
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bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
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bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
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RNAses
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bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
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1 2
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- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
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5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
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cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
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5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
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splicing etc
Obrigada
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bull custo maior
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1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
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Poccedilo 8 DNA genocircmico
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Meacutetodo natildeo invasivo
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Coleta
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RNA
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Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
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AWAY)
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Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
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Transcriccedilatildeo Reversa
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5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
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5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Kits comerciais diversos
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bull quantidade variaacutevel (depende do kit)
bull custo maior
Meacutetodo ldquocaseirordquo
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Extraccedilatildeo de DNA
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
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parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
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bull Fragmentos de DNA circulantes no sangue
bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
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avaliar o estaacutegio
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- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
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RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
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bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
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Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
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Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
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do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Avaliaccedilatildeo do DNA
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo
e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
1 2 4 5 6 7 8
Poccedilos 1-7 DNAs genocircmicos
extraiacutedos de tecidos
parafinados
Poccedilo 8 DNA genocircmico
extraiacutedo de tecido fresco
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bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
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Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
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bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
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Extraccedilatildeo do RNA
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Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
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do DNA complementar (cDNA)
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cDNA
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cDNA
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bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
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e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Cell Free DNA Circulante
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bull Descrito pela primeira vez por Mandel e Metais em 1948
Meacutetodo natildeo invasivo
- Biomarcador de tumores identificar a presenccedila de tumores e
avaliar o estaacutegio
- Medicina fetal identificar o sexo cromossocircmico aneuploidias
e variantes aleacutelicas patogecircnicas no feto
- Trauma doenccedilas cardiacuteacas sepse etc
Coleta
- Plasma ou soro sanguiacuteneo
- Liquor urina escarro etc
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
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bull Tecidos frescos sangue pele oacutergatildeos
bull Tecidos congelados
bull Cultura de ceacutelulas
bull Tecidos parafinados
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
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Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
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Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
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Transcriccedilatildeo Reversa
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do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
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5rsquo 3rsquo mRNA
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5rsquo 3rsquo mRNA
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Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
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Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
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e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Vymetalkova V et al Int J Mol Sci 2018 Nov 19(11) 3356
Cell Free DNA Circulante (cfDNA)
RNA
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bull 7 dias a 18 ndash 25degC
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Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
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do DNA complementar (cDNA)
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AAAn
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5rsquo 3rsquo mRNA
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Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
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RNA
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transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
RNA moleacutecula instaacutevel exige muitos cuidados durante
a coleta
bull Coleta e congelamento em nitrogecircnio liacutequido do tecido
imediatamente apoacutes a retirada durante a cirurgia para o
transporte
bull Extraccedilatildeo RNA imediatamente apoacutes a coleta do tecido
bull Tecidos devem ser congelados em nitrogecircnio liacutequido
para armazenamento
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Estabilizador e protetor de RNA (RNA Later)
bull 1 dia a 37degC
bull 7 dias a 18 ndash 25degC
bull 4 semanas a 2 ndash 8degC
bull Indefinidamente a ndash 30 ou ndash 80 oC
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Extraccedilatildeo do RNA
RNAses
bull materiais esteacutereis vidrarias secas em forno a 200 oC
bull descontaminante de RNAses em superfiacutecies (RNAse
AWAY)
Kits para extraccedilatildeo comerciais e ldquocaseirordquo
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Avaliaccedilatildeo do RNA
18 S
28 S
1 2
Armazenamento do RNA - 80 oC
- Leitura no espectrofotocircmetro concentraccedilatildeo e pureza
- Eletroforese em gel de agarose integridade
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
Transcriccedilatildeo reversa
TTTn
cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Transcriccedilatildeo Reversa
- RNA mensageiro eacute utilizado como molde para a siacutentese
do DNA complementar (cDNA)
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
cDNA
5rsquo 3rsquo mRNA
AAAn
TTTn
5rsquo 3rsquo mRNA
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Transcriccedilatildeo reversa
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cDNA
Hibridaccedilatildeo dos oligos
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Estudo do RNA tecido especiacutefico pesquisa
bull Expressatildeo gecircnica (microarrays qPCR etc)
bull Sequenciamento do cDNA ndash alteraccedilotildees no splicing
e variantes aleacutelicas
bull Sequenciamento em larga escala do RNA variantes
no RNAm expressatildeo gecircnica alteraccedilotildees de
splicing etc
Obrigada
Obrigada
