1

Desenvolvimento de nova metodologia com minimização de produtos químicos para diagnóstico de enteroparasitas em amostras de esgoto e lodo de esgoto Ariane F Almeida a, Victor M dos Santos a, Karina A A Tonani a, Angela Maria M Takayanagui b, Susana I Segura-Munoz* a a Departamento de Enfermagem Materno-Infantil e Saúde Pública da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Laboratório Ecotoxicologia e Parasitologia Ambiental. Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Avenida Bandeirantes 3900. CEP: 14040-902. Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil. ariane_riu@hotmail.com; susis@eerp.usp.br. b Departamento de Enfermagem Materno-Infantil e Saúde Pública da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Laboratóriode Saúde Ambiental. Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Avenida Bandeirantes 3900. CEP: 14040-902. Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil. ammtakay@eerp.usp.br * Autor para correspondência: Tel. (55) -016-3602.0530. Fax: (55) -016-3633.3271. susis@eerp.usp.br Palavras-chave: Metodologias Limpas, Técnica de diagnóstico, Parasitologia, Lodo de esgoto, Saúde Pública. Título Abreviado: Metodologia limpa para diagnóstico de parasitas.

1. ABSTRACT

Latin America, Africa and Asia have a wide spread and high prevalence of parasitic

diseases of running water. In this context, the parasite is a diagnostic tool of extreme

importance. Among the methods of parasitological diagnosis, is the Ritchie Method,

and used the formaldehyde and ether, toxicological importance of reagents that cause

damage to environmental and occupational health. The development of analytical

methods of diagnosis that minimizes the use of chemicals is an important tool in the

prevention of occupational diseases of workers exposed, as preserving the quality of the

environment by using clean techniques. The objective of this study was an adaptation of

the standard Ritchie Method with minimization of toxic substances for the diagnosis of

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intestinal parasites in sewage sludge. Samples of sludge were subjected to Method

Ritchie (MR) and the Method of Modified Ritchie by Régis Anécimo (MMRRA), in

which chemicals are replaced by water at 45 °C and neutral detergent. The results show

that the percentage of the MR Ancylostoma sp was 19%, Hymenolepis sp 79%, Ascaris

sp 2% and T. Trichuris 0% for a total of 1970 identified helminths. But in MMRRA the

percentage of Ancylostoma sp was 56%, Hymenolepis sp 40%, Ascaris sp 4% and T.

Tricuris trichiura 0% for a total of 397 identified helminths. Assessing quantitatively

the MMRRA was less efficient, taking into account a significant difference between

both methods. However, for qualitative analysis the technique can be considered valid,

since the quality of visualization of parasites is equivalent in both methods. Can be

conclude that the MMRRA is a simple method to perform and could be easily

implemented in routine laboratories and treatment plants sewage and is a clear

methodology.

1. RESUMO

A América Latina, África e Ásia apresentam uma ampla disseminação e alta prevalência das

doenças parasitárias de veiculação hídrica. Nesse contexto, o diagnóstico parasitário representa

um instrumento de extrema relevância. Dentre os métodos de diagnóstico parasitológico,

destaca-se o Método de Ritchie, sendo utilizados o formaldeído e o éter, reagentes de

importância toxicológica que causam danos à saúde ambiental e ocupacional. O

desenvolvimento de métodos analíticos de diagnóstico que minimize a utilização de produtos

químicos representa uma ferramenta importante na prevenção de doenças ocupacionais dos

profissionais expostos, assim como, na preservação da qualidade do meio ambiente através da

utilização de técnicas limpas. O objetivo do presente estudo foi padronizar uma adaptação do

Método de Ritchie com minimização de substâncias tóxicas para o diagnóstico de

enteroparasitas em lodo de esgoto. A amostra de lodo foi analisada pelo Método de Ritchie

(MR) e também, pelo Método Ritchie Modificado por Régis Anécimo (MRMRA), no qual

3

substâncias químicas são substituídas por água a 45°C e detergente neutro. Os resultados

demonstram que no MR a porcentagem de Ancylostoma sp foi de 19%, Hymenolepis sp 79%,

Ascaris sp 2% e Trichuris trichiura 0% em um total de 1970 helmintos visualizados. Porém no

MRMRA a porcentagem de Ancylostoma sp foi de 56%, Hymenolepis sp 40%, Ascaris sp 4% e

Tricuris trichiura 0% em um total de 397 helmintos. Avaliando quantitativamente o MRMRA

foi menos eficiente, pois esses resultados demonstram uma diferença significativa de helmintos

visualizados entre os métodos. Porém, enquanto análise qualitativa, a técnica pode ser

considerada válida, uma vez que a qualidade da visualização dos parasitas é correspondente em

ambos os métodos. Pode ser concluído que o MRMRA é um método simples de realizar e de

fácil implementação na rotina de laboratórios e estações de tratamento de esgoto, além de ser

uma metodologia limpa.

2. INTRODUÇÃO

Em países em desenvolvimento, os fatores ambientais predisponentes e as condições

socioeconômicas desfavoráveis para uma importante fração da população, bem como as

precárias condições de saneamento básico, favorecem as inter-relações entre o agente

etiológico e o hospedeiro de parasitoses intestinais. No continente americano, estima-se

que cerca de 200 milhões de pessoas estejam infectadas por algum tipo de parasita

intestinal, ocorrendo cerca de dez mil óbitos a cada ano devido somente ao parasitismo

por helmintos intestinais (Macedo, 2005). No Brasil, em função das diferenças

regionais, a contaminação do ambiente é intensa em determinadas regiões, e a

prevalência de parasitoses intestinais é elevada principalmente nas regiões norte e

nordeste em função, sobretudo, de saneamento básico deficiente, precária educação

sanitária da população associada ao baixo nível de renda e má qualidade dos serviços de

saúde (Oliveira, 2005).

O tratamento de esgoto tem como produto final o lodo, um resíduo de composição

4

variável e de altíssimo potencial poluidor. Gerba e Smith (2005) ressaltam que a

concentração de patógenos no esgoto e no lodo de esgoto está diretamente relacionada

com a incidência de infecções entéricas dentro da comunidade. Muita atençao é dada a

presença de ovos de helmintos em efluentes finais, efluentes usados para irrigação ou

lodo de esgoto pelo fato de sua resistência as condições ambientais adversas.

Dessa forma, as estações de tratamento de esgoto defrontam-se com problema: a

destinação a ser dada ao lodo de esgoto. Diversas alternativas têm sido buscadas, entre

elas a utilização de solos como meio de descarte para o lodo, situação em que há risco

de poluição ambiental, com possibilidade de contaminação da cadeia alimentar com

diversas substâncias e elementos nocivos como os metais pesados, compostos orgânicos

tóxicos, ou presença de patógenos como parasitoses intestinais que causem risco à saúde

humana ou animal.

Estudos visando a utilização do lodo de esgoto para aproveitamento como

adubo orgânico na agricultura ainda são muito recentes no Brasil. A agência de Proteção

Ambiental (EPA) dos EUA estabelece como padrão aceitável um número igual ou

inferior a um ovo viável de helmintos por 4 g de matéria seca para que o biossólido seja

usado para os mais variados fins (EPA, 1992). Já a Sanepar (1997) estabelece como

limite de patógenos presentes no lodo de esgoto para reciclagem agrícola um número de

0,25 ovos/g de matéria seca. Portanto, o uso do lodo de esgoto na agricultura deve

considerar a alternativa de desinfecção de forma a reduzir a quantidade de agentes

patogênicos e correlacionar restrições de uso segundo a qualidade alcançada, a fim de

permitir que as condições do meio garantam o uso seguro deste material (Sanepar, 1997).

Em muitas regiões, as parasitoses intestinais representam problemas médico-

sanitários de grande importância, devido à ampla disseminação e alta prevalência e,

5

especialmente, pela possibilidade de determinarem acometimentos orgânicos capazes de

incapacitar os indivíduos atingidos (Wright, 2000).

Dessa maneira, tanto se tratando da prevenção à doença quanto da promoção à

saúde, tem sido necessário o desenvolvimento de novas metodologias de análise

parasitológica, que sejam adaptadas as características do lodo de esgoto e possam ter

qualidade e sensibilidade suficientes para trazer índices seguros.

Dentre as diversas técnicas existentes para a análise parasitológica, destaca-se

o Método de Ritchie (1948) que tem base numa metodologia de reconhecida eficiência

para o diagnóstico de helmintos e protozoários nas fezes, através de uma centrífugo-

sedimentação com o uso do éter etílico (C4H10O) e formaldeído (HCHO), dois reagentes

tóxicos tanto para a saúde ambiental quanto para a ocupacional.

2.1. Diagnóstico Laboratorial: Método de Ritchie

O diagnóstico clínico de parasitoses humanas, geralmente é acompanhado do

diagnóstico laboratorial, para confirmação da suspeita. A sedimentação por

centrifugação apresentada por Ritchie em 1948, baseia-se na sedimentação através da

centrifugação e na lavagem do material com éter, que retém os artefatos vegetais e toda

gordura contida na amostra, durante a centrifugação da suspensão de fezes (Ritchie,

1948). A amostra de fezes é emulsionada em água e filtrada em um tubo cônico. Este

material é então centrifugado e o sedimento obtido é lavado até que o sobrenadante

fique límpido. A este sedimento é adicionado o formol a 7,5% e éter, que após agitação

do tubo previamente arrolhado, é novamente centrifugado. Ao final da operação,

observação a formação de quatro camadas distintas: a superior com éter, a seguinte com

detritos sólidos, a terceira aquosa e a quarta constituída pelo sedimento biológico. Este

último é corado pelo Lugol e examinado em lâmina ao microscópio ótico. Tal método é

amplamente utilizado em laboratórios de rotina.

6

O formaldeído e o éter são dois reagentes de importância toxicológica, cujas

características químicas e toxicológicas são descritas a seguir.

O Formaldeído (HCHO), denominado de aldeído fórmico, apresenta odor forte e

irritante que se liquefaz a uma temperatura de 21ºC. Um profissional exposto

ocupacionalmente pode apresentar irritação nos olhos e na garganta; que diminui com o

passar do tempo pelo processo de adaptação do corpo à exposição crônica, podendo

levar a uma superexposição. Em concentrações maiores pode causar severos danos no

trato respiratório com edema pulmonar (Golalipour et al, 2008). Em contato com a pele

nota-se irritação, dor, vermelhidão, queimaduras e alterações das unhas. Sob a ação do

formaldeído a pele torna-se seca (Universidade de São Paulo, 2005). O formaldeído,

quando eliminado no meio ambiente pode levar a graves conseqüências. No caso de ser

eliminado no solo, pode penetrar nas águas subterrâneas e ser tóxico para a vida

aquática, sendo que para os peixes o LC50/96 horas é de 10 mg/L a 100 mg/L. Os dados

de toxidade aquática do formaldeído são numerosos. Os efeitos aquáticos mais sensíveis

identificados foram observados para algas marinhas que tinham uma alta taxa de

mortalidade a uma pequena concentração de formaldeído. Para organismos terrestres, os

efeitos resultantes da exposição ao formaldeído no ar foi um aumento no crescimento

dos brotos, mais não das raízes, o que posteriormente foi comprovado que esse

desequilíbrio aumentava a vulnerabilidade das plantas ao stress ambiental, como a seca.

Portanto, antes de ser lançado no meio ambiente deverá passar por uma grande diluição

ou prévio tratamento (World Health Organization, 2000). Quando o formaldeído atinge

um sistema de tratamento biológico de águas residuárias, poderá comprometer a

biomassa pelo seu poder bactericida (Universidade de São Paulo, 2005).

O éter etílico [(C2H5)2O] é um líquido incolor de odor irritante e penetrante, em

determinadas concentrações torna-se explosivo quando misturado com o oxigênio ou

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óxido nitroso. O éter etílico é pouco solúvel em água e oxida-se lentamente pela ação

do ar, da umidade e da luz solar. A ingestão de éter causa excessiva salivação e os

sintomas são similares aos provocados pela overdose de etanol, porém, esses sintomas

aparecem mais rápido e sua duração é mais curta. Quando inalado pode provocar

vertigem, euforia, severa depressão do sistema respiratório e sistema nervoso. Os

registros de morte por exposição ocupacional são raros, porém, tem sido descritos

alguns sinais precoces, tais como: respiração irregular e hipotermia (Micromedex,

2005). Este material não apresenta alta toxicidade para o meio ambiente, porém, pode

causar incêndio pela sua alta inflamabilidade (New Jersey Department of Health and

Senior Services, 2007).

Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi padronizar uma adaptação do

Método de Ritchie com minimização do uso de substâncias tóxicas para o diagnóstico

enteropatasitoses no esgoto e lodo gerado nos na Estação de Tratamento de Esgoto de

Ribeirão Preto, São Paulo.

3. MATERIAL E MÉTODOS

O município de Ribeirão Preto apresenta duas estações de tratamento de esgoto,

a Estação de Tratamento de Esgotos Ribeirão Preto e a Caiçara. O Departamento de

Água e Esgoto de Ribeirão Preto (DAERP) e a Ambient-Serviços Ambientais de

Ribeirão Preto S. A. chegaram a um acordo para a conclusão das obras de interceptação

na rede de esgoto da cidade. Para atingir a meta de 100%, é preciso instalar cerca de 40

quilômetros de interceptores e emissários; estando o projeto previsto para terminar em

seis anos, ou seja, provavelmente a cidade apresentará 100% de esgoto tratado até 2015

(Tornatore, 2007).

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Ecotoxicologia e Parasitologia

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Ambiental da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

As amostras de lodo foram coletadas na Estação de Tratamento de Esgoto de

Ribeirão Preto. Foi realizada a análise de 100 amostras do logo de esgoto, segundo o

método de Ritchie (MR) e o Método de Ritchie Modificado por Régis Anécimo

(MRMRA). Para o desenvolvimento das técnicas foram utilizamos 10g da amostra

coletada. A amostra foi coletada com auxílio de uma espátula estéril e colocada em

frascos de boca larga e com tampa rosqueada. O tempo desde a coleta da amostra até o

início da análise não ultrapassou 48 horas (CETESB, 1989). Amostras positivas para a

técnica de sedimentação foram separadas durante esse período para a análise

comparativa do Método de Ritchie e o Método de Ritchie Modificado por Régis

Anécimo.

Os métodos foram desenvolvidos em condições semelhantes ao Método de

Ritchie em fezes humanas, seguindo as diretrizes analíticas. As lâminas foram

visualizadas no microscópio Nikon Eclipse E200, com o aumento de 100x e 400x no

Laboratório de Ecotoxicologia e Parasitologia Ambiental da EERP.

Foi realizada a análise qualitativa, mediante a identificação das estruturas

parasitárias observadas e, também, foi realizada a análise quantitativa através da

varredura completa do campo nas lâminas fixadas. Os resultados foram expressos pelo

número de ovos e/ou larvas de helmintos e/ou cistos de protozoários.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O lodo de esgoto é um resíduo de composição variável e de altíssimo potencial

poluidor, obtido do tratamento de águas residuárias. Ovos de helmintos, principalmente

ovos de ascarídeos, têm sido utilizados como indicadores da qualidade sanitária do lodo,

por apresentarem elevada resistência em lodos tratados (EPA, 1992). Assim, a alta taxa

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de sobrevivência de patógenos, a ubiquidade em amostras de esgoto e a alta prevalência

são fatores que ressaltam a importância de estudar também a ocorrência de ovos de

parasitas em amostras de lodo de esgoto (Campos et al., 2002).

As águas residuárias produzidas no meio urbano apresentam risco

epidemiológico, uma vez que essas águas são procedentes da atividade humana. Por

esse motivo, a avaliação de patógenos em águas residuárias e também no lodo,

subproduto gerado nas Estações de Tratamento de Esgoto, é considerada prioridade na

atualidade.

Nas amostras analisadas por ambos os métodos foram observados infecções

múltiplas e as estruturas parasitárias encontradas no lodo do esgoto foram os seguintes

helmintos: Ancylostoma sp, Hymenolepis sp, Ascaris sp, Tricuris trichiura (Figura 1).

Figura 1. Exemplares de ovos encontrados nas amostras, segundo o Método de Ritchie (MR) e Método de Ritchie Modificada por Regis Anécimo (MRMRA).

Amostra/Parasito MR MRMRA

Ancylostoma sp

Hymenolepis sp

Ascaris sp

Tricuris trichiura

Não encontrado

10

A Figura 1 mostra que no presente estudo, não foram identificados cistos e

oocistos como estruturas parasitárias, sendo identificados unicamente ovos de

helmintos. A visualização unicamente de ovos de helmintos, pode estar justificada pelo

fato desses ovos serem mais facilmente detectados que cistos e oocistos de alguns

protozoários devido ao seu maior tamanho e ao fato dos ovos serem mais facilmente

obscurecidos pela técnica de tinção utilizada (Carraro et al., 2000). Durante o

tratamento do esgoto, a remoção de diferentes organismos patogênicos depende não só

do tamanho, mas também da capacidade de absorção ou adesão, da densidade e da

velocidade de sedimentação destas estruturas. Sabe-se que a taxa de sedimentação do

ovo de um helminto é cerca de 1 metro/hora, enquanto que para protozoários como a

Giardia sp, essa taxa é de 1 metro/5 horas, o que favorece, portanto, a presença de ovos

de helmintos no lodo de esgoto quando comparados com cistos (Udeh et al., 2003).

Durante a avaliação do estudo, percebeu-se que na maioria dos métodos, a

identificação dos mesmos ocorre através da observação das características

morfológicas. Basicamente, os métodos podem ser divididos em dois princípios, o de

sedimentação para concentração de ovos de helmintos e o de flotação para detectar

cistos de protozoários como Giardia e Entamoeba e ovos de alguns helmintos que não

sedimentam facilmente. Geralmente, nestes métodos são empregadas soluções com

densidades maiores ou menores que os ovos e cistos, dado que a densidade é um fator

que influencia diretamente na eficiência do método, tanto na concentração como na

preservação das características morfológicas. Dessa forma, percebeu-se que no Método

de Ritchie Modificado por Régis Anécimo a adição da água, substância menos densa

comparada ao formaldeído utilizado no Método de Ritchie, influenciou na maior

deposição desse sedimento, dificultando, assim, a visualização dos parasitas.

11

Atualmente, os métodos de detecção de enteroparasitas em águas residuárias e lodo não

estão padronizados, mas o estudo dos enteroparasitas se torna cada vez mais necessário,

tanto para pesquisa de novos métodos mais precisos como para diagnóstico das

amostras ambientais.

Os resultados obtidos da leitura da freqüência parasitária nas amostras analisadas

pelo MR e pelo MRMRA demonstram diferentes porcentagens. No MR a porcentagem

de Ancylostoma sp foi de 19%, Hymenolepis sp 79%, Ascaris sp 2% e Trichuris

trichiura 0% em um total de 1970 helmintos visualizados. Porém no MRMRA a

porcentagem de Ancylostoma sp foi de 56%, Hymenolepis sp 40%, Ascaris sp 4% e

Tricuris trichiura 0% em um total de 397 helmintos.

A Figura 2 apresenta a comparação entre a quantidade de ovos de parasitas

segundo os dois métodos analíticos explorados.

Figura 2. Comparação entre a quantidade de ovos de parasitas encontrados nas 100 amostras do Método de Ritchie e Método de Ritchie Modificado por Régis Anécimo.

A quantidade de ovos de helmintos visualizados no MR sobressai em relação ao

MRMRA, o que pode ser identificado na Figura 2, que demonstra a grande diferença

entre o número de parasitas identificados, principalmente ao analisar os ovos de

Hymenolepis sp que ultrapassa o valor de 1400 ovos identificados no Método de Ritchie

12

e poco mais de 100 ovos identificados no Método de Ritchie Modificado por Régis

Anécimo. A baixa eficiência quantitativa na identificação de ovos, cistos e oocistos em

amostras de lodo analisadas pelo MRMRA, pode então ser devido, como foi

mencionado anteriormente, à grande quantidade de partículas presentes nesses tipos de

amostras, assim como, de lipídios, fazendo com que a padronização do Método de

Ritchie Modificado por Régis Anécimo em fezes não seja aplicável para a análise

quantitativa de parasitas em amostras de lodo de esgoto (McCuin e Clancy, 2005).

No trabalho de identificação de parasitas em Esgoto bruto e tratado na Estação

de Tratamento de Ribeirão Preto, Tonani (2008) relata uma maior concentração de ovos

de Hymenolepis sp no efluente de esgoto tratado do que no esgoto bruto. Isso pode estar

relacionado com a menor concentração de sólidos em suspensão no esgoto tratado, por

serem ovos mais leves ou ainda por fatores ligados ao seu ciclo, já que na sua fase

adulta apresenta-se na forma de tênia (proglotes repletas de ovos), de modo que o

esgoto passa pelo reator biológico recebe oxigênio, fazendo com que elas se rompam e

liberarem os ovos; aumentando sua densidade no esgoto após o tratamento.

É interessante notar ainda que em ambos os métodos os parasitas com maior

freqüência foram o Ancylostoma sp e Hymenolepis sp. Isso pode sugerir que as

parasitoses sejam endêmicas da região de Ribeirão Preto e que tenham uma maior

prevalência do que as demais helmintíases. Por outro lado, pode-se levantar a hipótese

de que esses ovos sejam mais resistentes a biodegradação ocorrida em todo o processo

de tratamento das águas residuais do que os outros ovos de helmintos, e por isso estão

em maior número. Particularmente, caso a primeira hipótese seja verdadeira, é preciso

lembrar que o Hymenolepis sp é um helminto de relativa importância na saúde pública,

pois não leva a nenhuma alteração orgânica e em geral o verme é eliminado, sem

tratamento anti-helmíntico, em dois meses (Neves, 2005).

13

5. CONCLUSÕES

A possibilidade de se diagnosticar quantitavamente as infecções por espécies

parasitárias passíveis de serem detectadas através do Método de Ritchie, como

helmintos e protozoários, faz do Método de Ritchie Modificado por Régis Anécimo um

método que merece ser mais bem avaliado e aperfeiçoado, considerando a baixa

eficiência na quantificação de parasitos. Em contrapartida, analisando qualitativamente,

a técnica pode ser considerada eficaz, uma vez que a qualidade da visualização dos

parasitas é correspondente em ambos os métodos (Figura 1). Assim, pode ser concluído

que o MRMRA é um método simples de realizar, possui baixo custo e de fácil

implementação na rotina de laboratórios de Parasitologia Ambiental e estações de

tratamento de esgoto, especialmente em países em desenvolvimento, pois é eficaz como

técnica qualitativa, além de ser uma metodologia que tem eliminaçao total de produtos

químicos e apresenta vatagens em relação a outras modificações com diminuição da

ação tóxica.

Diante dos resultados, é interessante do ponto de vista da Saúde Pública, investigar

a ocorrência desses parasitas em amostras de lodo de esgoto, considerando que o esgoto

é uma fonte de patógenos e que esse subproduto do tratamento de esgoto, tem como

principal destino o aterro sanitário ou solos usados para agricultura. Além disso, há uma

escassez de dados no Brasil em relação à presença desses parasitos patogênicos em lodo

de esgoto, bem como uma metodologia adequada para sua detecção. Assim, o lodo de

esgoto pode, portanto, conter grande quantidade e variedade de patógenos, o que

ressalta a importância de um tratamento adequado, assim como o desenvolvimento de

técnicas que permitam sua identificação e ao mesmo tempo minimize a utilização de

produtos químicos, reduzindo os ricos ambientais associados a sua utilização.

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6. REFERÊNCIAS

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