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Universidade de São Paulo – Escola de Engenharia de Lorena
Desenvolvimento de uma nova metodologia de extração para análise do teor de
Pilocarpina das folhas do Jaborandi (Pilocarpus microphyllus) utilizando fatoriais
fracionados
Jonas Oliveira de Mello
Lorena – São Paulo
Novembro de 2011
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Jonas Oliveira de Mello
Desenvolvimento de uma nova metodologia de extração para análise do teor de
Pilocarpina das folhas do Jaborandi (Pilocarpus microphyllus) utilizando fatoriais
fracionados
Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva
Lorena – São Paulo
Novembro de 2011
Trabalho de Conclusão de Curso de
Engenharia Química ministrada pela
Escola de Engenharia de Lorena –
Universidade de São Paulo, como
parte dos requisitos para a graduação
em Engenharia Química.
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DEDICATÓRIA
Primeiramente a Deus, pois sem ele nada existiria.
Aos meus pais que me apoiaram desde o início de minha vida em todas as etapas.
A minha família por sempre estar ao meu lado.
Aos meus amigos que nestes anos conviveram comigo bons e maus momentos, me
apoiaram e me deram muitas sugestões.
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AGRADECIMENTOS
A Deus por todas as bênçãos que recebi e desafios que me ajudou a superar
Ao Professor Messias Borges da Silva por ter acreditado na minha idéia e pela orientação.
Ao Professor Antonio Aarão Serra e a Professora Jayne Carlos de Souza Barbosa que de
maneira indireta me ajudaram muito no desenvolvimento deste projeto.
À empresa Sourcetech Química e todos os seus funcionários por todo suporte que foi
dado a esta pesquisa e a oportunidade de estar aplicando meus conhecimentos.
A todos os meus amigos que cansaram de ouvir sobre o tema deste projeto e todos os
momentos que passamos juntos.
A todos de forma direta ou indireta ajudaram a concluir meu trabalho de graduação.
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EPÍGRAFE
“Não basta ter belos sonhos para realizá-los. Pois ninguém realiza grandes obras se não
for capaz de sonhar grande. Podemos mudar o nosso destino se nos dedicarmos à luta
pela realização de nossos ideais. É preciso sonhar, mas com a condição de crer em nosso
sonho, de examinar com atenção a vida real, de confrontar nossa observação com nosso
sonho, de realizar escrupulosamente nossa fantasia. Sonhos: acredite neles.”
LENIN
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RESUMO
Jaborandi é o nome comumente dado a diversas árvores pertencentes à família
Rutaceae, do gênero Pilocarpus, nativa do Brasil (Oliveira et al., 1991; Pinheiro, 2002). As
folhas dessas plantas são utilizadas pelos indígenas como medicamento natural que
auxilia na produção de secreções (Corrêa, 1984). Essa característica ocorre devido a um
alcalóide presente em suas folhas, a Pilocarpina (Scheerer, 2001). Contudo este alcalóide
não se encontra isolado, possuindo isômeros e estruturas semelhantes, sendo eles a
Epiisopiloturina, Isopilocarpina, Pilosina e Isopilosina (Merck, 1983). A Pilocarpina possui
alto valor agregado no mercado farmacêutico, sendo utilizada no combate ao Glaucoma
(Migdal, 2000; Webster et al., 1993), e no tratamento de Xerostomia, também conhecido
como boca seca (Davies et al., 2001 e Wynn, 1996). Os demais alcalóides presentes não
possuem utilidade comercial. O processo convencional de extração de Pilocarpina usa
como solventes Clorofórmio e Soluções alcalinas e ácidas, utilizando a técnica de
alternância de extremos de pH (Sternitzke et al., 1992). Esta técnica requer muito tempo,
em torno de 4 horas, e muita atenção do pesquisador, pois erros são facilmente
cometidos.
Esta pesquisa tem como objetivo o desenvolvimento de uma nova metodologia de
extração para análise do teor de Pilocarpina das folhas do Jaborandi utilizando o método
dos fatoriais fracionados com 4-1 fatores.
A extração utilizada nesta dissertação é uma extração ácida com agitação vigorosa
e constante. Em meio ácido, a Pilocarpina é extraída devido à boa solubilidade do sal de
Pilocarpina formado. Este patamar foi alcançado por um misturador do tipo Turrax, que é
responsável por rotações de até 15.000 RPM. As folhas serão colocadas em um frasco de
amostra, com o intuito de extrair os alcalóides presentes, separando-os dos óleos
estruturais, graxas e clorofila. Este método se contrapõe as extrações tradicionais o qual
consiste nas etapas de preparo da matéria-prima, seguida de extração e purificação dos
princípios ativos através da alternância de pH, se assemelhando ao processo industrial,
contudo em escala laboratorial.
Os fatores investigados foram à variação da velocidade de agitação em dois
patamares pré-estabelecidos, assim como o tempo desta agitação, novamente em dois
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patamares, um de curta duração e um de longa duração, dois volumes distintos de ácidos
na amostra, um com grande concentração de ácido para as amostras e outro com pouca
concentração de ácido e influência da temperatura ambiente e a mistura submetida a
uma temperatura controlada.
A variável resposta será o teor de Pilocarpina presente na folhas. O método de
análise continuará sendo o mesmo apresentada na literatura, utilizando cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) para análise do extrato diluído (Avancini, 2003).
A redução do tempo de preparo das amostras foi de 50% em relação ao método
convencional. Contudo o método se mostrou eficiente para folhas com teor nominal de
até 0,9% de Pilocarpina, acima deste valor o método se mostrou ineficiente, não extraindo
toda a Pilocarpina presente nas folhas. O consumo de reagentes alcançou um patamar
muito melhor que vislumbrávamos, essa redução foi superior a 90% em relação ao
método convencional, além da eliminação de diversas etapas dispendiosas, simplificando
a análise, diminuindo os possíveis erros experimentais.
Palavras chaves: Jaborandi, Pilocarpina, extração, degradação
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ABSTRACT
Jaborandi is the name commonly given to several trees belonging to the family
Rutaceae, genus Pilocarpus, a native of Brazil (Oliveira et al. 1991; Pinheiro, 2002).The
leaves of these plants are used by Indians as a natural medicine that assists in the
production of secretions (Corrêa, 1984). This characteristic is due to an alkaloid present in
their leaves, Pilocarpine (Scheerer, 2001). However this alkaloid is not isolated, and
isomers possessing similar structures, and they Epiisopiloturine, Isopilocarpine, and
Pilosina Isopilosina (Merck, 1983). The Pilocarpine has high value in the pharmaceutical
market, being used to fight glaucoma (Migdal, 2000, Webster et al., 1993), and treatment
of Xerostomia, also known as dry mouth (Davies et al., 2001 and Wynn, 1996). The other
alkaloids do not have commercial utility. The conventional process of extraction of
Pilocarpine used as solvents chloroform and alkaline and acid solutions, using the
technique of alternating extremes of pH (Sternitzke et al., 1992). This technique requires a
long time, around 4 hours, and the researcher's attention, because mistakes are easily
made.
This research aims to develop a new extraction methodology for analyzing the
content of the leaves of Pilocarpine Jaborandi using the method of fractional factorial
designs with factors 4-1.
The extraction used in this dissertation is an acid extraction with vigorous stirring
and constant. In an acid medium, Pilocarpine is extracted due to good solubility of the salt
formed Pilocarpine. This threshold was reached by a Turrax mixer type, which is
responsible for rotations of up to 15,000 RPM. The leaves are placed in a sample bottle, in
order to extract the alkaloids present, separating them from the structural oils, greases
and chlorophyll. This method contrasts the traditional extraction which consists of the
steps of preparing the raw material, followed by extraction and purification of the active
ingredients by alternating pH, similar to the industrial process, yet at the laboratory scale.
The factors investigated were the variation of agitation speed on two pre-
established thresholds, as well as the time of this agitation, again in two levels, one short
and one long-term, two different volumes of acid in the sample, with a large acid
concentration for samples and other low acid concentration and the influence of ambient
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temperature and the mixture subjected to a controlled temperature.
The response variable is the amount of Pilocarpine present in the leaves. The
method of analysis remains the same presented in the literature, using high performance
liquid chromatography (HPLC) for analysis of the diluted extract (Avancini, 2003).
Reducing the time of preparation of the samples was 50% compared to the
conventional method. However the method has proved effective for sheets with nominal
content of up to 0.9% of Pilocarpine, above this value the method proved inefficient, not
drawing any Pilocarpine present in the leaves. The reagent consumption reached a level
much better than glimpsed; this reduction was greater than 90% over the conventional
method, in addition to eliminating several costly steps, simplifying the analysis, reducing
the possible experimental errors.
Keywords: Jaborandi, Pilocarpine, extraction, degradation
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Pilocarpus microphyllus pág. 18
Figura 2 – Estrutura molecular da Pilocarpina pág. 20
Figura 3 – Degradação da Pilocarpina pág. 21
Figura 4 – Estrutura dos alcalóides isômeros a Pilocarpina pág. 23
Figura 5 – Extração convencional de alcalóides do Jaborandi pág. 25
Figura 6 – Fluxogramas dos procedimentos de extração da Pilocarpina das
folhas de Jaborandi pág. 32
Figura 7 – Cromatograma da primeira extração convencional pág. 43
Figura 8 – Cromatograma da segunda extração convencional pág. 44
Figura 9 – Cromatograma da terceira extração convencional pág. 45
Figura 10 – Cromatograma da quarta extração convencional pág. 46
Figura 11 – Cromatograma da Primeira Extração, série 1 pág. 47
Figura 12 – Cromatograma da Primeira Extração, série 2 pág. 48
Figura 13 – Cromatograma da Primeira Extração, série 3 pág. 49
Figura 14 – Cromatograma da Segunda Extração, série 1 pág. 50
Figura 15 – Cromatograma da Segunda Extração, série 2 pág. 51
Figura 16 – Cromatograma da Segunda Extração, série 3 pág. 52
Figura 17 – Cromatograma da Terceira Extração, série 1 pág. 53
Figura 18 – Cromatograma da Terceira Extração, série 2 pág. 54
Figura 19 – Cromatograma da Terceira Extração, série 3 pág. 55
Figura 20 – Cromatograma da Quarta Extração, série 1 pág. 56
Figura 21 – Cromatograma da Quarta Extração, série 2 pág. 57
Figura 22 – Cromatograma da Quarta Extração, série 3 pág. 58
Figura 23 – Cromatograma da Quinta Extração, série 1 pág. 59
Figura 24 – Cromatograma da Quinta Extração, série 2 pág. 60
Figura 25 – Cromatograma da Quinta Extração, série 3 pág. 61
Figura 26 – Cromatograma da Sexta Extração, série 1 pág. 62
Figura 27 – Cromatograma da Sexta Extração, série 2 pág. 63
Figura 28 – Cromatograma da Sexta Extração, série 3 pág. 64
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Figura 29 – Cromatograma da Sétima Extração, série 1 pág. 65
Figura 30 – Cromatograma da Sétima Extração, série 2 pág. 66
Figura 31 – Cromatograma da Sétima Extração, série 3 pág. 67
Figura 32 – Cromatograma da Oitava Extração, série 1 pág. 68
Figura 33 – Cromatograma da Oitava Extração, série 2 pág. 69
Figura 34 – Cromatograma da Oitava Extração, série 3 pág. 70
Figura 35 – Cromatograma da primeira extração da comprovação do método pág. 71
Figura 36 – Cromatograma da segunda extração da comprovação do método pág. 72
Figura 37 – Cromatograma da terceira extração da comprovação do método pág. 73
Figura 38 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método pág. 74
Figura 39 – Cromatograma da primeira extração da comprovação do método
modificado pág. 75
Figura 40 – Cromatograma da segunda extração da comprovação do método
modificado pág. 76
Figura 41 – Cromatograma da terceira extração da comprovação do método
modificado pág. 77
Figura 42 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método
modificado pág. 78
Figura 43 – Cromatograma da primeira extração da comprovação do método
modificado, redução de massa de folhas pág. 79
Figura 44 – Cromatograma da segunda extração da comprovação do método
modificado, redução de massa de folhas pág. 80
Figura 45 – Cromatograma da terceira extração da comprovação do método
modificado, redução de massa de folhas pág. 81
Figura 46 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método modificado,
redução de massa de folhas pág. 82
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Patamares pág. 30
Tabela 2 – Matriz de Experimentos pág. 31
Tabela 3 – Porcentagem de Pilocarpina proveniente da extração
convencional pág. 33
Tabela 4 – Matriz de Experimentos pág. 33
Tabela 5 – Monitoramento da Primeira série de extrações pág. 34
Tabela 6 – Monitoramento da Segunda série de extrações pág. 34
Tabela 7 – Monitoramento da Terceira série de extrações pág. 34
Tabela 8 – Matriz de Experimentos com Variáveis Respostas pág. 35
Tabela 9 – Matriz de Efeitos pág. 35
Tabela 10 – Melhor ajuste do Método pág. 36
Tabela 11 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do
método pág. 36
Tabela 12 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do
método modificado pág. 37
Tabela 13 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do
método, redução de massa de folhas pág. 38
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SUMÁRIO
1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 14
1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 14
1.2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 14
2. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 15
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 18
3.1. Jaborandi .................................................................................................................. 18
3.2. Pilocarpina ................................................................................................................ 19
3.3. Epiisopiloturina, Pilosina, Isopilosina e Epiisopilosina ........................................... 22
3.4. Extração Convencional ............................................................................................. 24
3.5. Extração Proposta .................................................................................................... 26
4. MATERIAIS ................................................................................................................ 28
4.1. Matéria Prima ........................................................................................................... 28
4.2. Padrões de Pilocarpina ............................................................................................. 28
4.3. Fase móvel ................................................................................................................ 28
4.4. Reagentes ................................................................................................................. 28
4.5. Solventes................................................................................................................... 28
4.6. Equipamento de extração e extração ...................................................................... 29
4.7. Equipamento de identificação e quantificação ....................................................... 29
5. MÉTODO ................................................................................................................... 30
5.1. Extração da Pilocarpina ............................................................................................ 30
5.2. Análise do teor de Pilocarpina via HPLC .................................................................. 31
5.3. Fluxogramas do Processo ......................................................................................... 31
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 33
7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 39
13
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 40
APÊNDICE A – CROMATOGRAMAS DAS EXTRAÇÕES CONVENCIONAIS ............................ 43
APÊNDICE B – CROMATOGRAMAS DO MÉTODO EXPLORATÓRIO ..................................... 47
APÊNDICE C – CROMATOGRAMAS DE COMPROVAÇÃO DO MÉTODO .............................. 71
APÊNDICE D – CROMATOGRAMAS DA COMPROVAÇÃO DO MÉTODO MODIFICADO ...... 75
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1. OBJETIVO GERAL
Esta pesquisa tem como objetivo o desenvolvimento de uma nova metodologia de
extração para análise do teor de Pilocarpina das folhas do Jaborandi utilizando o método
dos fatoriais fracionados com 4-1 fatores.
1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Redução do tempo de análise;
- Simplificação da análise;
- Redução dos gastos de reagentes.
1.2. JUSTIFICATIVA
A pesquisa no campo da Pilocarpina se mostra de grande interesse na indústria
farmacêutica, pois se trata de um produto de alto valor agregado no mercado mundial.
As extrações realizadas em laboratórios requerem muito tempo e muita atenção
dos operadores, além de consumirem elevados volumes de reagentes.
O trabalho tem por finalidade criar uma nova metodologia, sendo ela simplificada,
econômica e com menor tempo gasto.
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2. INTRODUÇÃO
As plantas desde a antiguidade são principalmente utilizadas como fonte de
alimentos, contudo alguns vegetais também apresentam características medicinais usados
para combater enfermidades desde o Alto Império Egípcio, passando pela Grécia, Roma e
até mesmo pelos indígenas americanos, como os Incas, Maias, Astecas e os Tupis-
Guaranis. Além de serem usados como cosméticos, perfumes e até como armas, na
fabricação de venenos (Agra et al., 1994). Plantas medicinais são aquelas que exercem
funções farmacológicas, quando administradas de forma correta, ao homem ou a animais.
Este fato ocorre devido à presença de princípios ativos, presentes na estrutura das
plantas, que são utilizadas como matéria prima para a indústria farmacêutica (Rizzini e
Mors, 1995).
Os princípios ativos se encontram em elementos estruturais das plantas na forma
de alcalóides, flavonóides, glicosídeos, mucilagens, óleos essenciais e taninos. Podendo
ser encontrados nas folhas, sementes, raízes e cascas (Bentley, 1965). O grupo químico o
qual os alcalóides pertencem apresentam um amplo emprego farmacológico, tornando
muito importante as proposições e novas metodologias que envolvam sua obtenção e
purificação. O Brasil apresenta cerca de 20% da biodiversidade do planeta, constituindo
um mercado economicamente atraente, pois possibilita a pesquisa de novos
medicamentos que podem ser a cura de diversas doenças como malária, câncer e AIDS.
Em 1999, os fitofármacos, medicamentos produzidos a partir de princípios ativos das
plantas, foram responsáveis por 30% do mercado de medicamentos. Neste mesmo ano, a
indústria farmacêutica brasileira movimentou 9 bilhões de dólares, ocupando o décimo
maior mercado do mundo. (Petrovick et al., 1999). Para o desenvolvimento de um
produto farmacêutico, cosmético ou alimentício a partir de produtos naturais são
necessários processos de extração, concentração e/ou purificação do princípio ativo.
Utilizando folhas como matéria prima, a dificuldade aumenta, pois a concentração do
principio ativo é baixa, sendo necessária grande demanda de material para produção
desejada. Os processos tradicionais de extração e purificação utilizam, em sua maioria,
solventes químicos e que por muitas vezes são os mesmos utilizados há muitas décadas,
consomem muito tempo produtivo, em alguns casos utilizam e/ou produzem substâncias
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tóxicas e, em sua maioria, utilizam condições severas de processo, facilitando a
degradação do produto final, podendo oferecer riscos de acidentes operacionais e ao
meio ambiente. (Luque de Castro e Garcia-Ayuso, 1998.)
O conhecimento prévio do teor dos princípios ativos presentes nos vegetais é de
suma importância para indústria farmacêutica, pois se trata de um composto com grande
variabilidade externa, devido a umidade do solo, volume de pluviosidade, temperaturas e
a sazonalidade das estações do ano. Desta forma é possível calcular, com grande exatidão,
as concentrações e quantidades de reagentes necessários para o processo, evitando
desperdícios e geração de resíduos.
Tratando-se de um processo antigo, leva-se muito tempo para o preparo e análise
deste teor. O método de extração convencional é, em suma, uma miniaturização do
processo produtivo o qual consiste nas etapas de preparo da matéria-prima, seguida de
extração e purificação dos princípios ativos através da alternância de pH (Avancini, 2003).
A Pilocarpina é um alcalóide presente nas folhas do Jaborandi (Pilocarpus
microphyllus), que é uma árvore nativa da flora brasileira, que vem sendo importante a
algumas décadas para indústria farmacêutica, sendo explorada comercialmente (Pinheiro,
2002). A Pilocarpina possui alto valor agregado, sendo utilizada no combate ao glaucoma
(Migdal, 2000; Webster et al., 1993). E no tratamento de xerostomia, também conhecido
como boca seca (Davies et al., 2001 e Wynn, 1996).
A importância da Pilocarpina como principio ativo dos medicamentos utilizados no
tratamento do glaucoma e xerostomia pode ser avaliada através dos dados
disponibilizados pela ABIQUIF (2008), os quais mostram que em 2007, o cloridrato e o
nitrato de Pilocarpina ocuparam o segundo lugar entre os produtos brasileiros
farmacêuticos mais exportados, atingindo 8,6 milhões de dólares.
A extração convencional utiliza como solventes clorofórmio e soluções de
hidróxido de amônia e ácido sulfúrico através da alternância de pH. Este quadro favorece
a degradação da Pilocarpina, transformando-a em Isopilocarpina e ácido isopilocárpico
(Sternitzke et al.1992), além de ser lento, como foi dito anteriormente. Não foi
encontrado nenhum processo de extração que possuísse um tempo de extração curto,
com custos semelhantes aos dos processos convencionais. Foram encontrados trabalhos
utilizando fluídos em estado supercrítico (Saldanã, 2002 e Barnabé, 2008), mas devido ao
elevado custo inviabiliza o projeto em escala laboratorial.
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O objetivo desta pesquisa é o desenvolvimento de uma nova metodologia de
extração para análise com a finalidade de reduzir o tempo de extração para a análise do
teor de Pilocarpina presente nas folhas do Jaborandi (Pilocarpus microphyllus), utilizando
o método dos fatoriais fracionados com 4-1 fatores, conseqüentemente uma simplificação
do processo e ter respostas sólidas sobre o teor do alcalóide, este fato pode gerar
melhorias futuras para o processo produtivo.
18
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Jaborandi
Jaborandi é o nome popular para um grupo de espécies pertencentes à família
Rutaceae, do gênero Pilocarpus sendo que as principais espécies são microphyllus,
Jaborandi e pennatifolius. Contudo estão presentes outras treze espécies (Kaastra, 1982).
O Jaborandi pode ser classificado como um arbusto, medindo entre 3 a 7,5 m de altura,
com folhas claras de 2 a 6 cm de comprimento apresentando bordas variando de
lanceolado a oval, como mostrado na Figura 1 (Oliveira et al., 1991; Pinheiro, 2002).
Figura 1 – Pilocarpus microphyllus
Na língua Tupi guarani Jaborandi, ou ia-mbor-endi, significa “que faz babar”, pois
induz a produção de secreções, no caso quando mastigada a salivação (Corrêa, 1984).
Dentre as três espécies conhecidas, a microphyllus e a Jaborandi, foram as mais
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estudadas, pois a Pilocarpina apresenta em maior quantidade nas suas folhas, e pela sua
vasta distribuição geográfica, que engloba praticamente todo o território nacional, desde
o Pará até o Rio Grande do Sul (Avancini, 2003; Pinheiro, 2002), contudo a região onde
essas espécies produzem maiores proporções de Pilocarpina são as regiões de clima
quente e úmido o ano inteiro, sendo a floresta amazônica no território brasileiro.
O Jaborandi é uma espécie nativa da flora brasileira, sendo o único produtor no
mundo (DECEX, 1994). Dessa forma foi muito explorada nas últimas décadas, sendo o
Maranhão o estado que participa com 95% da produção nacional (Pinheiro, 2002). A
exploração desta árvore era realizada de forma extrativista e de forma descontrolada,
sendo podados vários galhos e muitas vezes destruindo a árvore. Desde 1992, porém, a
planta faz parte da Lista Oficial de Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção,
publicada pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis,
devido à sua exploração descontrolada (IBAMA, 1992).
Em 1970 foram implantadas duas importantes indústrias na região para produção
de Pilocarpina uma em São Luiz, no estado do Maranhão, pelo grupo MERCK e outra na
Parnaíba pelo grupo KLABIN – PLANTEX. A inovação destes grupos foi a criação de
fazendas regulamentadas para a produção de folhas de Jaborandi, controlando assim o
desmatamento da árvore nativa.
3.2. Pilocarpina
A característica de induzir a produção de secreções ocorre devido a um alcalóide
presente em suas folhas, a Pilocarpina. Este alcalóide apresenta concentrações entre 0,4 e
1,2% da sua massa total. A concentração da Pilocarpina é dependente de fatores
climáticos e também do solo local. As folhas mais jovens apresentam maior quantidade de
Pilocarpina que as folhas mais velhas, pois é na fase jovem da planta que ocorre a
formação de enzimas para o desenvolvimento dos processos de diferenciação nos tecidos,
esta fase é dependente deste alcalóide (Scheerer, 2001).
Alcalóides são substâncias de caráter básico, devido a pelo menos um átomo de
nitrogênio presente em usa estrutura, definidos pela função amina, podendo ser de
origem vegetal ou animal (Costa, 1975 e Dewick, 1997).
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A Pilocarpina possui um núcleo imidazólico e outro pentagonal lactônico sendo um
alcalóide derivado, provavelmente do aminoácido histidina (Dewick, 1997). Este alcalóide
foi isolado em 1875, por Hardy. A sua constituição foi proposta por Pinner e a primeira
síntese realizada em 1933 pelo químico Preobrashenski (Mingoia, 1967).
Este alcalóide pode ser obtido na forma de cristais puros ou como óleos viscosos,
cristalizando em baixa temperatura, sendo altamente higroscópicos (Pinner, 1902),
contudo este alcalóide não se encontra isolado, possuindo isômeros e estruturas
semelhantes, sendo eles a Epiisopiloturina, Isopilocarpina, Pilosina e Isopilosina. A
Pilocarpina é solúvel em água, álcool e clorofórmio (Hardy, 1875; Jowett, 1900), bastante
solúvel em benzeno (Petit, 1897) e pouco solúvel em éter ou éter de petróleo (Jowett,
1900). Sua estrutura molecular é apresentada na Figura 2. Sua fórmula química é
C11H16N2O2, e sua massa molecular é 208,26 g/gmol. Seu ponto de fusão é 34ºC e o de
ebulição é 260ºC, sendo acima de 34ºC inicia-se uma conversão parcial da Pilocarpina em
Isopilocarpina. A Pilocarpina é solúvel em água, álcool e clorofórmio (MERCK, 1983).
Figura 2 – Estrutura molecular da Pilocarpina
A degradação da Pilocarpina ocorre devido a temperaturas superiores a 35ºC e a
mudanças de pH. Além desses dois meios, em solução aquosa ocorre a hidrolise da
molécula e a epimerização. Esses meios de degradação são dependentes dos fatores
como mostra a Figura 3. Sua estabilidade decresce com aumento do pH e a elevação da
temperatura. (Bundgaard et al. 1986; Neville et al., 1975; Fan et al. 1966). Elevadas
temperaturas favorecem a epimerização (Nevile et al., 1975).
A isomerização pode ocorrer na própria planta, devido a sua idade. Para evitar
21
esse tipo de degradação as folhas são processadas assim que colhidas. (Petit, 1987).
Figura 3 – Degradação da Pilocarpina (Chung et al., 1970).
A Pilocarpina hidroclorada em fase de etanol foi mantida por três semanas a uma
temperatura de 21ºC e não houve degradação da sua estrutura (Saldaña, 2002).
O efeito de induzir secreções, sendo elas salivares, sudoríparas, entre outras é
causado pela estrutura imidazólica da Pilocarpina. (Mingoia, 1967; Swan, 1967). A
aplicação farmacêutica mais importante da Pilocarpina é na produção de colírios para o
tratamento de glaucoma, pois apresenta a capacidade de reduzir a pressão intra-ocular,
por causar a constrição da pupila, também é utilizada em cirurgias oculares, pelo mesmo
motivo (Migdal, 2000; Webster et al., 1993). O glaucoma é a segunda causa de cegueira
nos EUA, essa doença se manifesta de forma lenta, degenerativa e gradual (Di Stasi, 1996).
Além desta aplicação, a Pilocarpina tem sido recomendada para o tratamento de
xerostomia, popularmente conhecido como boca seca, que é a redução da produção de
saliva, comum em paciente que foram submetidos à radioterapia e quimioterapia, assim
como pacientes com síndrome de Sjögren (Davies et al., 2001 e Wynn, 1996), pois ativa as
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glândulas salivares.
A Pilocarpina é um fármaco cujos efeitos estimulam de forma direta e involuntária
os receptores responsáveis pela liberação neurotransmissores. Alguns dos produtos
contendo sais de Pilocarpina (cloridrato e nitrato) disponíveis no mercado são
encontrados com os nomes de Adsorbocarpine, Akarpine, Almocarpine, I-pilocarpine,
Isopto carpine, Minims Pilocarpine, Miocarpine, Ocu-carpine, OcusertPilo, Pilocar, Pilokair,
Pilopine HS, Piloptic, Pilostat, P.V. Carpine, P.V. Carpine Liquifilm, Spectro-pilo,
Spersacarpine (Cosentino, 1998).
3.3. Epiisopiloturina, Pilosina, Isopilosina e Epiisopilosina
A Pilocarpina não é o único alcalóide presente nas folhas do Jaborandi, são
encontrados a Pilosina, Isopilosina, Epiisopiloturina, além de óleos essenciais (Merck,
1983).
Até os dias de hoje os demais alcalóides presentes nas folhas do Jaborandi não
apresentam utilidade comercial. As estruturas deles são apresentadas na figura 4. Estes
isômeros são de difícil separação, mas recentemente foram separados, identificados e
quantificados por Abreu (2007).
23
Figura 4 – Estrutura dos alcalóides isômeros a Pilocarpina (Scheerer, 2001).
O processo industrial de extração de Pilocarpina das folhas do Jaborandi gera um
resíduo semi-sólido rico em Epiisopiloturina, mas que contém também os outros
isômeros.
A Epiisopiloturina é uma base cristalina opticamente ativa, solúvel em benzeno ou
clorofórmio e pouco solúvel em éter. Cristaliza em água, álcool ou acetona (Pyman, 1912),
sem nenhum valor comercial até hoje.
O alcalóide Epiisopiloturina foi isolado e identificado em 1978. Sua fórmula é
C15H18N2O3 e sua massa molecular é 274,32 (Voigtlander et al., 1978). Nas folhas do
Jaborandi também são encontrados óleos essenciais, que são constituídos por 2-
tridecanona, β-cariofileno, 2-pentadecanona, óxido de cariofileno, D-germacreno, entre
outros (Taveira et al., 2003).
Para alcançar o produto final é necessária a reação com ácido clorídrico e nítrico,
para produzir o cloridrato de Pilocarpina e nitrato de Pilocarpina. Além de serem de difícil
24
separação, todos os alcalóides reagem com ácido clorídrico e ácido nítrico, gerando um
gasto excessivo de reagentes, assim como dificultam a separação nas etapas posteriores
ao processo de purificação, pois todos se transformam em sais solúveis em etanol.
3.4. Extração Convencional
Os processos usados podem ser separados em duas grandes partes: a extração e a
purificação.
Ambas são baseadas em propriedades físico-químicas da Pilocarpina e dos demais
alcalóides. A maioria dos alcalóides é pouco solúvel em água, contudo são solúveis na
maioria dos solventes orgânicos. Entretanto os sais provenientes dos alcalóides são
solúveis em água, tanto quanto etanol e pouco solúveis em solventes orgânicos.
A Figura 5 apresenta o fluxograma de uma extração convencional de alcalóides de
Jaborandi, a qual consiste nas etapas de preparo da matéria-prima, seguida de extração e
purificação dos princípios ativos através da alternância de pH. Este tipo de extração é
caracterizado por ser demorado, além de utilizar grande quantidade de solventes
orgânicos (Saldaña, 2002).
Um trabalho realizado por Avancini (2003) avaliou métodos de extração
convencional, em escala industrial, de Pilocarpina das folhas de Jaborandi, o qual se
resume no fluxograma a seguir (Avancini, 2003).
25
Figura 5 – Extração convencional de alcalóides do Jaborandi (Saldaña, 2002).
A etapa de extração consiste nas seguintes etapas:
I. Moagem das folhas em um diâmetro médio pré-determinado para o
processo. Este diâmetro foi determinado através de testes experimentais
de produção, cujos dados serão omitidos por sigilo empresarial.
II. Adição de volume pré-determinado de hidróxido de amônia. E deixar em
repouso por um tempo pré-determinado.
III. Agitação do meio em um reator específico para extração de alcalóides por
tempo pré-determinado.
IV. Transferência para um segundo reator com volume pré-determinado de
ácido clorídrico diluído. Com a finalidade de realizar a alternância de pH do
26
meio. Esta etapa é onde ocorre a separação dos alcalóides presentes nas
folhas.
V. Centrifugação do meio reacional para separar os alcalóides que são menos
densos que a clorofila, graxas, óleos essenciais e material particulado.
VI. É realizada uma decantação para separar materiais mais densos ainda
presentes na solução e para separar a fase orgânica da inorgânica. A fase
orgânica contém os alcalóides presentes nas folhas.
VII. É então adicionado clorofórmio em meio alcalino, sendo utilizado hidróxido
de amônia para este fim, para separar impurezas dos alcalóides presentes.
A partir desta etapa existem apenas solventes e os cinco alcalóides.
VIII. É realizada concentrações para reduzir os volumes dos solventes. Esta é a
última etapa do processo de extração.
As etapas de purificação serão omitidas, pois o trabalho tem como objetivo
desenvolver um novo método de extração de Pilocarpina. De forma resumida, são
realizadas várias lavagens, concentrações e adição de ácido clorídrico ou ácido nítrico,
para produzir o cloridrato de Pilocarpina e o nitrato de Pilocarpina.
3.5. Extração Proposta
O método de extração proposto consiste em utilizar ácido clorídrico que é o
responsável pela retirada dos alcalóides presentes nas folhas utilizando, e ao invés da
alternância de pH realizada no método convencional, utilizar a força de colisões
mecânicas.
Estas colisões são geradas por um equipamento chamado TURRAX, o qual é
constituído de um motor elétrico capaz de alcançar altas rotações por minuto, até um
limite de 15000 RPM. O material exposto passa pelas aberturas no material, onde é
submetido a fortes colisões, o sistema também atua como uma bomba centrífuga para
recircular o líquido e os sólidos suspensos.
Através das colisões é retirado tanto a Pilocarpina e demais alcalóides, como parte
da clorofila e óleos essenciais. Contudo o intuito é obter um novo método de extração de
27
Pilocarpina, sem a importância de sua separação do meio.
Até o momento nenhum estudo foi realizado nesta área, utilizando uma extração
ácida por colisões. Existem estudos diferentes na área de extração da Pilocarpina, como a
extração em fluídos supercríticos realizada por Saldaña (2002) e Barnabé (2008).
28
4. MATERIAIS
4.1. Matéria Prima
Folhas de Jaborandi provenientes da cidade de Barra da Corda-MA, fornecidas pela
empresa Quercegen®, com teores nominais variando de 0,80% à 1,10%.
4.2. Padrões de Pilocarpina
Os padrões utilizados foram da USP, United State Pharmacopeial.
4.3. Fase móvel
Trietilamina, solução ácida e álcool, dados omitidos por sigilo industrial.
4.4. Reagentes
Soluções ácidas e alcalinas de diferentes concentrações e empresas, que por
motivos de sigilo industrial todas as informações serão omitidas.
4.5. Solventes
Água destilada
29
4.6. Equipamento de extração e extração
Homogeneizador ULTRA TURRAX T25 Digital IKA
Bomba de vácuo
4.7. Equipamento de identificação e quantificação
Cromatógrafo de Alta Eficiência Líquida.
Coluna: Duratech – AnalysentechnikGmbH Multospher 120RP 18 HP
Detector: Knauer detector UV K-2001
30
5. MÉTODO
5.1. Extração da Pilocarpina
O procedimento experimental de extração consiste em pesar cerca de 1g de folhas
de Jaborandi previamente trituradas, provenientes de uma operação unitária ocorrida na
produção.
Depositá-las em um frasco de amostra com 7 cm de diâmetro e 12 cm de altura,
juntar a ela água e ácido necessário para extração (o ácido será omitida por sigilo
industrial), pré-determinados pelos patamares na tabela 1 e pela matriz de experimentos
na tabela 2, afim de completar o volume para 50 mL de solução.
As folhas foram submetidas à agitação constante realizada por um
Homogeneizador ULTRA TURRAX T25, em tempos pré-determinados pelos patamares na
tabela 1 e pela matriz de experimentos na tabela 2.
O extrato foi filtrado em um funil de Büchner, com auxílio de papel de filtro.
O filtrado foi armazenado e a torta de filtração foi colocada novamente no frasco
de amostra, para realizar mais duas extrações, sendo utilizado 25mL na segunda e na
terceira extração.
O filtrado proveniente das três extrações será medido e analisado em HPLC, para
determinar o teor de Pilocarpina presente nas folhas.
Tabela 1 – Patamares do experimento proposto
Parâmetros Valor Alto (+) Valor Baixo (-)
Velocidade (A) Agitação vigorosa Agitação moderada
Tempo (B) Tempo longo Tempo curto Temperatura (C) Temperatura controlada Temperatura ambiente
Volume de ácido (D) Volume alto Volume baixo
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Tabela 2 – Matriz de Experimentos
Experimentos
Parâmetros
Velocidade Tempo Temperatura Volume do ácido
1 - + - +
2 - - - - 3 + + + +
4 - + + -
5 - - + +
6 + - - + 7 + + - -
8 + - + -
5.2. Análise do teor de Pilocarpina via HPLC
Foi retirada uma alíquota proveniente da solução, que é composta das três
extrações, que foi diluída em um balão volumétrico de 25mL. Foram colocados 2mL de
solução e o balão foi completado com água destilada. Depois de realizada a
homogeneização, a solução diluída foi injetada no cromatógrafo, onde após um tempo
predeterminado ocorreu a separação de todas as substâncias presentes na amostra.
A Pilocarpina foi quantificada através de um padrão interno no próprio
equipamento. Utilizando os valores de massa real das folhas, volumes provenientes das 3
extrações e o valor das áreas fornecidas pelo equipamento foi possível calcular a
concentração real das folhas.
Fórmula do cálculo do teor de Pilocarpina real:
5.3. Fluxogramas do Processo
Na figura 6 são mostrado o fluxograma do procedimento analítico de extração de
Pilocarpina das folhas de Jaborandi e o procedimento proposto para melhoria, assim
32
como o tempo aproximado de cada etapa.
Figura 6 – Fluxogramas dos procedimentos de extração da Pilocarpina das folhas
de Jaborandi
33
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram realizadas 4 extrações da maneira convencional, com a finalidade de
comparar os valores com o procedimento proposto. O sinal resposta esta expresso em
cromatogramas, estes em APÊNDICE. Os anexos correspondentes a estas análises são os
cromatogramas de 1 a 4, presentes no APÊNDICE A.
Como teor nominal deste lote é de 0,79% de Pilocarpina, valor fornecido pelo
produtor. E os valores das 4 extrações convencionais são expostos na tabela 3.
Tabela 3 – Porcentagem de Pilocarpina proveniente da extração convencional
Extração Porcentagem de Pilocarpina 1 0,7921%
2 0,6972%
3 0,8043%
4 0,7937%
Desta forma o teor das folhas de Jaborandi, calculado pelas extrações
convencionais foi de (0,7967+0,0001)%. O valor em negrito foi descartado por se tratar de
um ponto muito distante dos demais. Esta média apresenta-se muito próxima do valor
nominal fornecido pelo produtor.
Utilizando a metodologia de fatoriais fracionados a tabela apresenta 8
experimentos independentes, com o monitoramento de 4 parâmetros em 2 patamares
cada um. Segue a tabela 4, que mostra os parâmetros adotados em cada experimento.
Tabela 4 – Matriz de Experimentos
Experimentos Parâmetros
Velocidade (A) Tempo (B) Temperatura (C) Volume do ácido (D)
1 - + - +
2 - - - -
3 + + + + 4 - + + -
5 - - + +
6 + - - +
7 + + - - 8 + - + -
34
Foram monitorados valores de pH e os volumes finais de cada uma das extrações
assim como as temperaturas iniciais e finais de cada extração, estes valores são expressos
nas tabelas 5, 6 e 7.
Tabela 5 – Monitoramento da Primeira série de extrações
Extração m (g) pH T0(°C) T(°C) V(mL)
1 1,0011 1,8 20 30 85
2 1,0691 2 24 27 93
3 1,0844 1,8 0 11 95
4 1,0615 2,1 0 11 97
5 1,0544 1,6 0 14 14
6 1,0060 1,8 24 27 27
7 1,0087 2,1 20 30 30
8 0,9833 2,2 0 16 16
Tabela 6 – Monitoramento da Segunda série de extrações
Extração m (g) pH T0(°C) T(°C) V(mL)
1 1,0182 1,8 26 30 95
2 0,9755 2 26 29 97
3 0,9715 1 0 10 94
4 1,0582 1 0 9 97
5 0,9557 1,2 0 8 95
6 0,9935 1,6 23 28 98
7 1,021 2 18 21 94
8 0,9898 2 0 10 97
Tabela 7 – Monitoramento da Terceira série de extrações
Extração m (g) pH T0(°C) T(°C) V(mL)
1 1,0457 1,7 18 23 94
2 1,0073 1,9 19 23 97
3 1,0113 1,7 0 19 98
4 1,0457 1,9 0 17 96
5 1,0074 1,7 0 14 96
6 1,0251 1,7 20 29 95
7 0,9961 2 21 35 96
8 1,083 2 0 13 93
35
As variáveis repostas para cada experimento e suas replicatas estão expressas na
tabela 8 e os cromatogramas que representas as análises estão em anexo, sendo os
cromatogramas de 1 a 24, no APÊNDICE B.
Tabela 8 – Matriz de Experimentos com Variáveis Respostas
Experimentos Parâmetros Teor de Pilocarpina
A B C D 1a Extração 2a Extração 3a Extração
1 - + - + 0,7404 0,8351 0,7524
2 - - - - 0,5559 0,5399 0,5903
3 + + + + 0,7517 0,7779 0,7956
4 - + + - 0,7996 0,7879 0,7956 5 - - + + 0,7994 0,7360 0,8548
6 + - - + 0,4812 0,7073 0,7312 7 + + - - 0,7655 0,6812 0,7421
8 + - + - 0,7186 0,6684 0,7145
Os valores em preto foram descartados, pois se tratam de valores divergentes dos
valores reais apresentados para o mesmo experimento.
O objetivo é identificar a condição experimental onde ocorre a extração mais
eficaz da Pilocarpina presente nas folhas de Jaborandi.
Utilizando a teoria de Efeitos e Influências de Design de Experimentos, foram
determinados os parâmetros e as interações que são relevantes para o modelo.
Tabela 9 – Matriz de Efeitos
Efeitos Respostas
EA 0,01628333 tA 0,561826797
EB 0,06876667 tB 2,372668746 Relevante +
EC 0,07530833 tC 2,598377055 Relevante +
ED 0,05267500 tD 1,817455058
EAB -0,02223333 tAB -0,767120724
EAC -0,06602500 tAC -2,278072524 Relevante -
EAD -0,04069167 tAD -1,40399194
EBC -0,04069167 tBC -1,40399194
EBD -0,06602500 tBD -2,278072524 Relevante -
ECD -0,02223333 tCD -0,767120724
Os valores utilizados como base para determinar se o efeito é relevante foram os
36
graus de liberdade, assim como a confiança. Este experimento apresenta 12 graus de
liberdade (GL) e foi adotada uma confiança de 95%. Desta forma os níveis dos parâmetros
fora: a temperatura controlada e o tempo de extração longo, a interação entre velocidade
e temperatura e a interação tempo e volume.
Desta maneira a melhor situação ocorreu no experimento 4 e está apresentada na
tabela 10.
Tabela 10 – Melhor ajuste do Método.
Velocidade Agitação moderada
Tempo Tempo longo Temperatura Temperatura controlada
Volume de Ácido Volume baixo de acido
Para comprovação do método foram realizados 4 testes em duplicatas com folhas
de teor nominal de 1,02% Pilocarpina. A mudança no teor foi adotada, pois se trata de
uma pesquisa com caráter industrial e as folhas processadas abrangem concentrações de
0,70% à 1,10% de Pilocarpina presente em folhas. Os cromatogramas destes testes podem
ser observados nos cromatogramas 1 à 4, no APÊNDICE C. Na tabela 11, podem ser
observadas as porcentagens de Pilocarpina extraída das folhas pelo método.
Tabela 11 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do método
Experimento Sinal Resposta
1 0,9537 2 1,1003
3 1,0028
4 0,7976
Os resultados não foram satisfatórios, pois não houve um padrão obedecido, não
ocorrendo à extração por completo, as causas eram diversas desde influência de material
inerte no meio de extração devido à baixa massa utilizada, aumento da temperatura da
solução, ocasionando a degradação da Pilocarpina extraída, ocorrida pelo baixo volume
de solução, dificultando a troca térmica, baixa quantidade de Pilocarpina a ser extraída,
entre outros.
37
Como rota alternativa trabalhou-se nos valores de massa e volumes da solução. A
alternativa foi tornar o meio de extração mais robusto. A massa utilizada passou a ser 4
vezes maior que a anterior (de 1g para 4g), o volume de extração 2 vezes maior (de 100
mL totais para 200 mL totais) e o aumento do tempo de extração de sendo na segunda
extração este tempo foi dobrado, os tempos da primeira e a terceira extração foram
mantidos.
A massa foi alterada para reduzir a influência de materiais inertes no meio, sendo
que com uma massa maior alguma parte da folha não processada ou que não contenha
alcalóides não influenciem muito na resposta final.
O aumento no volume se deu por estudo de temperatura, quanto maior o volume,
menor será o aumento de temperatura submetido a um mesmo tempo. Desta forma a
temperatura não chega a um patamar para degradar a Pilocarpina presente no meio.
O acréscimo no tempo de extração foi utilizado para ocorrer à extração completa
da folha, sendo que algumas folhas apresentavam-se intactas após o período inicial,
seguindo este ponto houve um aumento geral de 25% do tempo de extração.
Foram realizados 4 testes para comprovação das mudanças, utilizando folhas com
o mesmo teor de Pilocarpina (1,02%). Os cromatogramas referentes a esta etapa estão
presentes em anexo, sendo os cromatogramas de 1 a 4, no APÊNDICE D. Na tabela 12,
podem ser observadas as porcentagens de Pilocarpina extraída das folhas pelo método.
Tabela 12 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do método
modificado
Experimento Sinal Resposta 1 1,1156%
2 1,1860%
3 1,1304%
4 1,1710%
Desta maneira os resultados se mostraram satisfatórios. Obedecendo a uma
margem de erro de 3,5%. Contudo tornou-se dispendioso o tempo, devido à grande
quantidade de massa de folhas, dificultando a filtração. Esta etapa se mostrou a mais
dispendiosa em comparação com as demais etapas do processo. Tendo em vista o tempo
38
total da análise foi de aproximadamente 2 horas e 30 minutos.
Como ganho adicional observou-se que a Pilocarpina presente nas folhas foi
extraída com maior eficácia, pois folhas com teor nominal de 1,00% apresentaram um
ganho de 10% na sua extração. O que mostra que o método é mais eficaz que o utilizado
pela própria produtora.
Sabendo que os parâmetros de tempo e volume foram satisfatórios, aplicou-se
uma segunda proposta para melhoria, neste caso específico a redução no tempo de
filtração. Como artifício reduziu-se a massa utilizada. Ao invés de 4 gramas de folha, foram
utilizados 3 gramas de folhas.
Para comprovar se a mudança no processo era efetiva, foram realizados 4 testes
com os patamares descritos anteriormente. Este testes podem ser observados nos
cromatogramas de 1 a 4, no APÊNDICE E. As folhas utilizadas foram as mesmas dos
experimentos anteriores, com teor de 1,02% de Pilocarpina. Na tabela 13, podem ser
observadas as porcentagens de Pilocarpina extraída das folhas pelo método.
Tabela 13 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do método,
redução de massa de folhas
Experimento Sinal Resposta
1 1,1584%
2 1,1516%
3 1,1320% 4 1,1297%
Os resultados obtidos foram satisfatórios, as folhas foram extraídas por completo.
O tempo de extração e análise foi aproximadamente 2 horas.
O método ainda apresentou a mesma particularidade que o método anterior, as
extrações foram mais eficazes, na mesma ordem, sendo 10% de ganho.
39
7. CONCLUSÃO
O novo método se mostrou eficaz ao que foi proposto que era ser uma alternativa
mais rápida e simples sem deixar de ser confiável para análise de folhas de Jaborandi. Em
relação à redução de tempo o método reduziu o tempo de preparo em 2 horas
aproximadamente, principalmente nas etapas de extração e preparo da amostra para
injeção no HPLC. Anteriormente era de 210 minutos em contrapartida o novo método
possui tempo de extração e preparo inferior a 70 minutos.
A robustez do método evita erros crassos, pois diminui o número de etapas de
manuseio da amostra e mistura com outros reagentes. Esta simplificação reduziu também
o gasto com solventes e reagentes.
Como vantagem não descrita inicialmente no processo o rendimento da extração
se mostrou superior à extração convencional sendo em torno de 10%. Este fator se dá,
pois as condições de extração do meio são mais eficazes comparadas ao do meio
convencional.
Desta maneira a proposta se mostrou totalmente viável para a aplicação no
Laboratório de Controle de Qualidade e no monitoramento do processo industrial.
40
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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SCHEERER, J., Untersuchungen zum Einfluss exogener und endogener Faktoren auf den Pilocarpingehalt von Pilocarpus microphyllus Stapf ex Wardleworth unter natürlichen Bedingungen. Bayerischen Julius-Maximilians Universität Würzburg. Tese de Doutorado. 2001.
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SWAN, G. A., An Introduction to the alkaloids. Blackwell Sc. Publ., Inglaterra, 188 - 192, 1967.
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WYNN, R. L., Oral pilocarpine (salagen): a recently approved salivary stimulant. Gen. Dent. 44: 29 – 30, 1996.
43
APÊNDICE A – CROMATOGRAMAS DAS EXTRAÇÕES CONVENCIONAIS
Cromatograma 1 - Primeira Extração Convencional
Figura 7 – Cromatograma da primeira extração convencional
Sinal: 0,0878
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7921%
44
Cromatograma 2 - Segunda Extração Convencional
Figura 8 – Cromatograma da segunda extração convencional
Sinal: 0,0641
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,6972%
45
Cromatograma 3 – Terceira Extração Convencional
Figura 9 – Cromatograma da terceira extração convencional
Sinal: 0,0863
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,8043%
46
Cromatograma 4 – Quarta Extração Convencional
Figura 10 – Cromatograma da quarta extração convencional
Sinal: 0,0821
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7937
47
APÊNDICE B – CROMATOGRAMAS DO MÉTODO EXPLORATÓRIO
Cromatograma 1 – Extração 1, série 1
Figura 11 – Cromatograma da Primeira Extração, série 1
Sinal: 0,0872
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7404%
48
Cromatograma 2 – Extração 1, série 2
Figura 12 – Cromatograma da primeira extração, série 2
Sinal: 0,0895
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,8351%
49
Cromatograma 3 – Extração 1, série 3
Figura 13 – Cromatograma da primeira extração, série 3
Sinal: 0,0837
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7524%
50
Cromatograma 4 – Extração 2, série 1
Figura 14 – Cromatograma da segunda extração, série 1
Sinal: 0,0639
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,5559%
51
Cromatograma 5 – Extração 2, série 2
Figura 15 – Cromatograma da segunda extração, série 2
Sinal: 0,0543
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,5399%
52
Cromatograma 6 – Extração 2, série 3
Figura 16 – Cromatograma da segunda extração, série 3
Sinal: 0,0613
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,5903%
53
Cromatograma 7 – Extração 3, série 1
Figura 17 – Cromatograma da terceira extração, série 1
Sinal: 0,0856
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7517%
54
Cromatograma 8 – Extração 3, série 2
Figura 18 – Cromatograma da terceira extração, série 2
Sinal: 0,0888
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7779%
55
Cromatograma 9 – Extração 3, série 3
Figura 19 – Cromatograma da terceira extração, série 3
Sinal: 0,0821
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7956%
56
Cromatograma 10 – Extração 4, série 1
Figura 20 – Cromatograma da quarta extração, série 1
Sinal: 0,0875
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7996%
57
Cromatograma 11 – Extração 4, série 2
Figura 21 – Cromatograma da quarta extração, série 2
Sinal: 0,0887
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7879%
58
Cromatograma 12 – Extração 4, série 3
Figura 22 – Cromatograma da quarta extração, série 3
Sinal: 0,0815
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7482%
59
Cromatograma 13 – Extração 5, série 1
Figura 23 – Cromatograma da quinta extração, série 1
Sinal: 0,0869
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7994%
60
Cromatograma 14 – Extração 5, Série 2
Figura 24 – Cromatograma da quinta extração, série 2
Sinal: 0,0800
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7360%
61
Cromatograma 15 – Extração 5, série 3
Figura 25 – Cromatograma da quinta extração, série 3
Sinal: 0,0897
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,8549%
62
Cromatograma 16 – Extração 6, série 1
Figura 26 – Cromatograma da sexta extração, série 1
Sinal: 0,0515
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,4812%
63
Cromatograma 17 – Extração 6, série 2
Figura 27 – Cromatograma da sexta extração, série 2
Sinal: 0,0717
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7073%
64
Cromatograma 18 – Extração 6, série 3
Figura 28 – Cromatograma da sexta extração, série 3
Sinal: 0,0789
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7312%
65
Cromatograma 19 – Extração 7, série 1
Figura 29 – Cromatograma da sétima extração, série 1
Sinal: 0,0796
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7655%
66
Cromatograma 20 – Extração 7, série 2
Figura 30 – Cromatograma da sétima extração, série 2
Sinal: 0,0740
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,6812%
67
Cromatograma 21 – Extração 7, série 3
Figura 31 – Cromatograma da sétima extração, série 3
Sinal: 0,0770
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7421%
68
Cromatograma 22, Extração 8, série 1
Figura 32 – Cromatograma da oitava extração, série 1
Sinal: 0,0736
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7186%
69
Cromatograma 23 – Extração 23, série 2
Figura 33 – Cromatograma da oitava extração, série 2
Sinal: 0,0682
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,6684%
70
Cromatograma 24 – Extração 8, série 3
Figura 34 – Cromatograma da oitava extração, série 3
Sinal: 0,0832
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7145%
71
APÊNDICE C – CROMATOGRAMAS DE COMPROVAÇÃO DO MÉTODO
Cromatograma 1 – Primeira Extração
Figura 35 – Cromatograma da primeira extração da comprovação do método
Sinal: 0,1009
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,9537%
72
Cromatograma 2 – Segunda Extração
Figura 36 – Cromatograma da segunda extração da comprovação do método
Sinal: 0,1146
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1003%
73
Cromatograma 3 – Terceira Extração
Figura 37 – Cromatograma da terceira extração da comprovação do método
Sinal: 0,1014
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,0028%
74
Cromatograma 4 – Quarta Extração
Figura 38 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método
Sinal: 0,0931
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7976%
75
APÊNDICE D – CROMATOGRAMAS DA COMPROVAÇÃO DO MÉTODO MODIFICADO
Cromatograma 1 – Primeira Extração
Figura 39 - Cromatograma da primeira extração da comprovação do método modificado
Sinal: 0,0963
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1156%
76
Cromatograma 2 – Segunda Extração
Figura 40 - Cromatograma da segunda extração da comprovação do método modificado
Sinal: 0,1047
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1860%
77
Cromatograma 3 – Primeira Extração
Figura 41 - Cromatograma da terceira extração da comprovação do método modificado
Sinal: 0,1096
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1304%
78
Cromatograma 4 – Quarta Extração
Figura 42 - Cromatograma da quarta extração da comprovação do método modificado
Sinal: 0,1081
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1710%
79
APÊNDICE E – CROMATOGRAMAS DA COMPROVAÇÃO DO MÉTODO MODIFICADO
REDUÇÃO DE MASSA DE FOLHAS
Cromatograma 1 – Primeira Extração
Figura 43 - Cromatograma da primeira extração da comprovação do método modificado,
redução de massa de folhas
Sinal: 0,0967
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1584%
80
Cromatograma 2 – Segunda Extração
Figura 44 - Cromatograma da segunda extração da comprovação do método modificado,
redução de massa de folhas
Sinal: 0,0954
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1516
81
Cromatograma 3 – Terceira Extração
Figura 45 - Cromatograma da terceira extração da comprovação do método modificado,
redução de massa de folhas
Sinal: 0,0912
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1320%
82
Cromatograma 4 – Quarta Extração
Figura 46 - Cromatograma da quarta extração da comprovação do método modificado,
redução de massa de folhas
Sinal: 0,0915
Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1297%