RÚBENS PRINCE DOS SANTOS ALVES

DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA DE SUBUNIDADE CONTRA

O SOROTIPO 2 DO VÍRUS DENGUE BASEADA NA PROTEÍNA NÃO

ESTRUTURAL 5 (NS5).

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Microbiologia do

Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade de São Paulo, para obtenção

do título de Mestre em Ciências.

Área de Concentração: Microbiologia

Orientador: Prof. Dr. Luís Carlos de Souza

Ferreira

Versão original

São Paulo

2015

RESUMO

ALVES, R. P. S. Desenvolvimento de uma vacina de subunidade contra o sorotipo 2 do

vírus dengue baseada na proteína não estrutural 5 (NS5). 2015. 69 f. Dissertação de

(Mestrado em Microbiologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo,

São Paulo, 2015.

A dengue é uma doença causada por quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV 1-4), com

milhões de pessoas afetadas em todo o mundo e um número significativo de mortes. Não há

nenhum tratamento eficaz ou abordagens vacinais capazes de prevenir a infecção. As estratégias

vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais como antígenos têm

demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. Além disso,

respostas imunes celulares direcionadas a proteínas não estruturais desempenham um papel

importante no controle da replicação viral. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é

a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na

replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli

em quantidades elevadas e com propriedades antigênicas preservados em relação à proteína

nativa. As condições de cultura foram optimizadas, a fim de permitir a expressão dessa proteína

na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação

com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos imunizados

após desafio intracraniano com a linhagem JHA1 de DENV2. A combinação da NS5 com poli

(I:C) emulsionado em Montanide 720 induziu a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Em

conjunto, os resultados indicam que a proteína recombinante NS5 preserva determinantes

antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do

DENV, busca de drogas anti-viriais e desenvolvimento de vacinas.

.

Palavras-chave: Dengue. Vírus dengue. NS5. Vacinas. Adjuvantes imunológicos.

ABSTRACT

ALVES, R. P. S. Development of a subunit vaccine against dengue virus serotype 2 based

on the non-structural protein 5 (NS5). 2015. 69 p. Master thesis (Microbiology) – Instituto

de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

Dengue fever is a disease caused by four dengue virus serotypes (DENV 1-4), affecting millions

of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective

treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine

strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those

based on structural proteins. In addition, anti-DENV cellular immune responses against

nonstructural proteins have shown to play a major role in controlling viral replication. The

DENV nonstructural protein 5 (NS5), the most conserved protein among the four serotypes,

plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of

DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with

regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of

NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in

combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the

DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide

720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate

that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and

may be a useful tool for studies dealing with the DENV's biology, search for anti-viral drugs

and vaccine development.

Keywords: Dengue fever. Dengue virus. NS5. Vaccines. Immunologic adjuvants.

1 INTRODUÇÃO

1.1 O vírus e a doença

A febre da dengue é uma doença de caráter agudo, causada pelo virus Dengue (DENV),

um arbovírus componente do gênero Flavivirus pertencente à família Flaviviridae transmitido

por mosquitos do gênero Aedes (BHATT et al., 2013; GUZMAN et al., 2010). No ciclo urbano,

o DENV circula na forma de quatro tipos imunologicamente distinguíveis (sorotipos): DENV-

1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, que apresentam aproximadamente 30% de divergência na

sequência de nucleotídeos dos seus genomas (BLOK, 1985; CHAN et al., 1965; DIERCKS,

1959; MYERS et al., 1964; SMITH, 1956). A infecção por um deles confere resposta

imunológica protetora permanente contra o mesmo sorotipo e de curta duração contra os outros

sorotipos (GUZMAN et al., 2010; GUZMAN; HARRIS, 2014; SABIN, 1952; WHITEHEAD

et al., 2007).

Figura 1. Representação esquemática do genoma do vírus dengue. O genoma do vírus dengue é

composto por um RNA de fita simples com orientação positiva e possui aproximadamente 11 kB que

codifica 10 proteínas maduras, três estruturais: Capsídeo (C), Membrana (M) e Envelope (E) e sete

proteínas não estruturais (NS): NS1, NS2 A e B, NS3, NS4 A e B e NS5. Há duas regiões não traduzíveis

em ambas as extremidades da fita de RNA chamadas de UTR (do inglês Untranslated Region). Fonte:

Guzman, et al., 2010.

O DENV possui RNA genômico com aproximadamente 11 kb de fita simples com

orientação positiva flanqueada por duas UTR’s (do inglês Untranslated Region). Na

extremidade 5’ há uma estrutura de CAP tipo I (N7meGpppA2’Ome), responsável pela

iniciação da replicação em células eucarióticas e proteção contra RNA exonucleases

(HENDERSON et al., 2011; ZHOU et al., 2007). Outras estruturas conservadas na UTR da

extremidade 5’ é o large e short stem loop (SLA e SLB, respectivamente), sendo que a SLA

age como promotor da replicação sendo crucial na síntese do RNA viral, e a SLB medeia a

interação das extremidades 5’ com a 3’, induzindo a ciclização do RNA, situação fundamental

para replicação viral (YAP et al., 2007). Eletromicrografias demonstram que o vírion é esférico,

possuindo diâmetro de aproximadamente 500 Å, apresentando um núcleo eletrondenso

circundado por uma bicamada lipídica (KUHN et al., 2002). O genoma viral (figura 1) codifica

três proteínas estruturais: do capsídeo (C), do envelope (E), e a proteína precursora de

membrana (prM), a qual sofre clivagem e origina a proteína de membrana (M); e sete proteínas

não-estruturais que são: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5 (RODENHUIS-ZYBERT

et al., 2010). Quando o mosquito transfere o vírus para o homem, ocorrem as etapas do processo

infeccioso e replicação viral (figura 2). Durante a infecção natural, as principais células-alvo de

infecção pelo vírus dengue são monócitos, macrófagos e células dendríticas (HALSTEAD et

al., 1980).

Figura 2. Etapas do processo de replicação do DENV. A primeira etapa no processo de infecção do

DENV é a ligação (1) ao receptor viral, seguido de endocitose mediada por receptor (2). O pH no interior

do endossomo é reduzido à medida que se aproxima do centro celular, o que induz a fusão da membrana

do vírus com a do endossomo (3), permitindo a liberação do RNA no citoplasma da célula (4). Em

seguida, a poli proteína viral é traduzida e maturada, e o RNA replicado pelo complexo de replicação

(5), resultando finalmente na morfogênese de novas partículas virais e liberação dessas partículas no

meio extracelular. RER: retículo endoplasmático rugoso; (+) ssRNA: RNA de fita simples com

orientação positiva; (-) ssRNA: RNA de fita simples com orientação negativa. Fonte: Amorim; Alves;

Ferreira, 2009.

O início do ciclo infeccioso do DENV depende, principalmente, da interação entre a

glicoproteína de envelope (E) e o receptor de membrana da célula alvo (BIELEFELDT-

OHMANN et al., 2001; CHEN, Y. et al., 1997; CRILL; ROEHRIG, 2001). Após a ligação, o

vírion é endocitado e dentro do endossomo tardio, com a redução do pH, há indução de

mudanças conformacionais da proteína E (ZHANG et al., 2015), o que consequentemente

proporciona a fusão do envelope viral com a membrana do endossomo e liberação do capsídeo

para o citoplasma celular (RODENHUIS-ZYBERT et al., 2010). Posteriormente, há

dissociação do capsídeo, liberação do RNA no citoplasma celular, tradução da poliproteína

viral, que é processada por um conjunto de proteases virais e celulares, dando origem ás

proteínas supracitadas na forma madura. A replicação do material genético é realizada pelo

domínio RNA-polimerase-RNA-dependente (RpRd) da NS5, porém, o processo como um todo

depende do domínio MTAse da NS5, que juntamente com a NS3, participam da síntese do CAP

tipo I na porção 5’ da fita de RNA e desenovelamento do dsRNA (ACKERMANN; LUO et al.,

2008b; PADMANABHAN, 2001). Por fim, há morfogênese viral e liberação de novas

partículas infectantes (KUHN et al., 2002).

A infecção pelo DENV, após 4-8 dias de incubação, pode ser assintomática ou com

sintomatologia de caráter subclínico. No entanto, a doença se manifesta abruptamente em três

fase: febril, crítica e de recuperação. A fase crítica se inicia após a febre e o quadro patológico

que pode se manifestar por sinais como: dores de cabeça, mialgia, artralgia, vômitos e dor

abdominal aguda, bem como, o aumento da permeabilidade vascular, que podem gerar desde

raches cutâneos a choque hipovolêmico, coagulação intravascular disseminada e hemorragia

grave (GUZMAN; HARRIS, 2014; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Devido ao

amplo espectro de sinais e sintomas que podem ser desenvolvidos na dengue, a organização

mundial de saúde (WHO, 2009), substituiu os termos febre hemorrágica da dengue (FHD) e

síndrome de Choque da dengue (SCD), pela classificação de dengue com sinais de alerta e

dengue com sinais de gravidades (WHO, 2009). Essa nova recomendação de classificação

possibilitou que a triagem em áreas endêmicas fosse melhorada, visto que, instituiu o uso de

outros sinais clínicos como indicativo de suspeita de dengue. Além disso, a decisão clínica para

o tratamento da dengue com sinais de gravidade se tornou mais rápida, visto que o

extravasamento de plasma deixou de ser uma característica sine qua non de dengue grave, de

modo que o início precoce de tratamento em dengue com sinais de gravidade reduz o risco de

morte de 20% para 1% (HORSTICK et al., 2012; SRIKIATKHACHORN et al., 2011).

Estudos recentes mostram que 96 milhões de casos anuais podem ter sintomas com

severidade suficiente para alterar a rotina do indivíduo infectado (BHATT et al., 2013) e

segundo estudos anteriores, cerca de 500 mil casos evoluem para forma grave. A taxa de

mortalidade nestes grupos chega a 10% (50 mil) em indivíduos hospitalizados e 30% (150 mil)

em indivíduos não hospitalizados (BARRETO; TEIXEIRA, 2008; GUZMAN et al., 2010

PONGSUMPUN et al., 2008; WHITEHEAD et al., 2007). Estas informações deixam clara a

urgente necessidade de desenvolvimento de uma vacina para controle desta doença.

1.2 O desenvolvimento de vacinas contra a dengue

Diversas estratégias têm sido exploradas para produzir uma vacina efetiva na prevenção

da dengue. No entanto, o desenvolvimento de uma vacina eficaz tem como principais limitações

a necessidade e a dificuldade de se produzir uma vacina tetravalente eficiente e segura. Essa

característica é um fator crucial no desenvolvimento dessa vacina, visto o grande número de

evidencias experimentais e epidemiológicas que indicam que numa infecção secundária por um

sorotipo diferente da primeira infecção, a replicação viral seria exacerbada pela facilitação de

infecção de células imunológicas por uma via dependente de anticorpos sub-neutralizantes

gerados durante a primeira infecção (figura 3). Este processo denominado ADE (do inglês

Antibody Dependent Enhancement) proporciona o aumento da carga viral e intensifica a

resposta inflamatória, sendo associado também ao desenvolvimento das formas de dengue com

sinais de gravidade (HALSTEAD et al., 1977, 1980; HALSTEAD; O’ROURKE, 1977;

HALSTEAD, 1979). Logo, vacinas monovalentes oferecem riscos quanto à segurança frente a

infecções por DENV diferente do sorotipos vacinal.

Figura 3. Modelo do aumento da infecção do vírus dengue mediada por anticorpo. Esse fenômeno ocorre

quando anticorpos heterotípicos, formados durante uma infecção primaria com o DENV, ligam-se à

partícula viral de outro sorotipo de DENV numa infecção subsequente. Os anticorpos da infecção

primária não podem neutralizar o vírus eficazmente. Em vez disso, o complexo anticorpo-vírus se liga

aos receptores chamados receptores Fcγ (FcγR) em monócitos circulantes. Os anticorpos ajudam o vírus

infectar estas células de forma mais eficiente resultando num aumento global da carga viral. Adaptado

de Whitehead, et al., 2007.

Estratégias vacinais variadas foram desenvolvidas para o controle da dengue (tabela 1).

A utilização de partículas virais atenuadas fez parte dos primeiros esforços no desenvolvimento

da vacina, entretanto, a possibilidade de indução de uma resposta imunológica desequilibrada

contra os quatro sorotipos virais e o risco de reversão das cepas vacinais atenuadas de DENV

para as formas virulentas e o risco claro de ADE são preocupações significativas

(WHITEHEAD et al., 2007). As abordagens utilizando vírus quimérico vivo são as estratégias

vacinais mais aprimoradas atualmente. Entretanto, os resultados de um teste clínico recente

demonstraram a geração de proteção parcial não equilibrada entre os sorotipos e a compreensão

de que a soroconverção não é isoladamente um correlato de proteção (DURBIN et al., 2013;

GUZMAN; HARRIS, 2014; MLADINICH et al., 2012; WEISKOPF et al., 2014).

Tabela 1. Diferentes tipos de candidatos vacinais contra a dengue e seus desenvolvedores.

Diversos grupos empenham-se no desenvolvimento de abordagens baseadas nas vacinas

de DNA (COSTA; FREIRE; ALVES, 2006; COSTA et al., 2007, 2011; WU et al., 2003a),

porém, os riscos de geração de autoimunidade bem como a geração de tolerância ao antígeno

continuam sendo os principais riscos associados a esse tipo de abordagem (KLINMAN et al.,

2000). Já as vacinas de subunidade, embora, por definição, necessitem de adjuvantes para

desencadear efeito protetor, induzem respostas imunológicas consideráveis e fornecem

flexibilidade quanto às vias de administração (AMORIM et al., 2012; PANG, 2003). Portanto,

as vacinas de subunidade, como as usadas neste trabalho, são mais seguras e de mais fácil

aprovação quando comparadas às vacinas de DNA e com o vírus.

Tipo de Candidato Vacinal Referências

1.Virus vivo atenuado

1.1 Vírus atenuado por cultura de células (BHAMARAPRAVATI; YOKSAN,

1989; VAUGHN et al., 1996;

KANESA-THASAN et al., 2003;

SANCHEZ et al., 2006)

1.2 Vírus atenuado por mutagênese (MEN et al., 1996; DURBIN et al.,

2001; TROYER et al., 2001;

WHITEHEAD; FALGOUT; et al.,

2003)

2. Vírus quimérico

2.1 Vírus quimérico com Vírus da febre amarela (CAPEDING et al., 2011; GUY;

SAVILLE; LANG, 2010; GUY et

al., 2011; MORRISON et al., 2010)

2.2 Vírus dengue inter-sorotipo (BLANEY et al., 2004, 2008;BRAY;

LAI, 1991; OSORIO et al., 2011;

WHITEHEAD et al., 2003b)

3. Vírus inteiro inativado e purificado (PUTNAK et al., 1996; SIMMONS

et al., 2010)

4. Vacinas de subunidade (CHIANG et al., 2011 CLEMENTS

et al., 2010; GUZMÁN et al., 2003;

KELLY et al., 2000)

5. Vacinas de DNA (APT et al., 2006; BECKETT et al.,

2011; DANKO; BECKETT;

PORTER, 2011; RAVIPRAKASH et

al., 2006)

6. Vetores virais expressando antígenos da dengue (BRANDLER et al., 2007;

HOLMAN et al., 2007; RAJA et al.,

2007; RAVIPRAKASH et al., 2008;

WHITE et al., 2007;)

7. VLP (ARORA et al., 2013; MANI et al.,

2013; TANG et al., 2012;)

As proteínas não estruturais são interessantes como antígenos alvos para uma vacina,

visto o alto grau de conservação entre os sorotipos, a grande imunogenicidade das mesmas, e o

risco nulo de indução de ADE, visto que essas proteínas não compões o vírion. As principais

proteínas não estruturais do DENV são: NS1, NS3 e NS5. A NS1 é uma glicoproteína de 46-

55 kDa, que pode ser associada à membrana citoplasmática, ou ainda, ser secretada para o meio

extracelular e apesar de sua função biológica não ter sido totalmente elucidada, sabe-se que é

altamente imunogênica (AVIRUTNAN et al., 2007a, 2011b; GAO et al., 2008). Dentro dos 26

anos desde o primeiro relato da NS1 em uma formulação vacinal, diversos trabalhos

demonstram a capacidade dessa proteína em gerar proteção em modelo murino (AMORIM et

al., 2012a; FALGOUT et al., 1990; HENRIQUES et al., 2013; WU et al., 2003b; ZHANG et

al., 1988). É válido ressaltar que há algumas evidencias in vitro e in vivo que em condições

altamente inflamatórias, a NS1 pode estar envolvida em fenômenos de autoimunidade, o que

torna questionável o uso dessa proteína em formulações vacinais (AMORIM et al., 2014;

AVIRUTNAN et al., 2007b, 2011a; MLADINICH et al., 2012).

A NS3 tem massa molecular de aproximadamente 70 kDa apresentando um domínio

serino-protease (~18kDa) na região N-terminal e helicase (~ 52 kDa) na região C-terminal

(LESCAR et al., 2008). A sua função biológica é vital para o ciclo viral, visto que há atuação

tanto na clivagem da poli proteína resultante da tradução do RNA viral, bem como na função

helicase que em conjunto com a NS5 promovem a replicação viral, sendo portanto, primordiais

na biologia do patógeno (LUO; XU; HUNKE; et al., 2008). A NS3H se estende entre os

aminoácidos 169-618, apresenta um sítio ATPase e por ser solúvel (diferente do domínio

protease da NS3 e da proteína inteira) pode ser mais facilmente obtida (COSTA et al., 2011).

Um fato relevante é que a NS3H conserva epítopos capazes de gerar uma resposta celular

citotóxica (SPAULDING et al., 1999a) como foi visto no uso de linhagens vacinais de

Salmonella Typhimurium como vetor para plasmídeos que continham um epítopo CTL

específico presente na NS3H que se estendia entre os aminoácidos 298 e 306.

A NS5 do DENV é uma proteína de aproximadamente 109 kDa que apresenta no

mínimo dois domínios: os resíduos de 1 a 368 da região N-terminal que compõem a 2’-O-

metiltransferase, e os resíduos de 405 a 900 que compõem uma RNA polimerase dependente

de RNA (BHATTACHARYA et al., 2009). A região inter-domínios possui duas NLS (do inglês

Nuclear Localization Sequence) bem caracterizadas que direcionam a proteína para o núcleo

(TAY et al., 2013; FRASER et al., 2014a). Ela é processada pela via de proteassoma, quando

então são produzidos e apresentados os epítopos específicos para linfócitos T, os quais são bem

conservados entre os quatro sorotipos virais. De fato, foi visto que formulações vacinais

tetravalentes com vírus dengue atenuado levam à resposta citotóxica direcionada

principalmente a essa proteína (WEISKOPF et al., 2014). A referida proteína não está associada

a partículas virais livres e, provavelmente, não induz a formação de anticorpos anti-DENV

facilitadores de infecção. Há ainda evidências relacionadas ao reconhecimento da NS5 como

importante alvo na geração resposta imune celular em macacos Rhesus infectados com o

DENV-2. Linfócitos capazes de reconhecer especificamente epítopos da NS5 exibiam perfil

polifuncional (MLADINICH et al., 2012). Esse estudo foi pioneiro no uso da NS5 na forma

recombinante como antígeno alvo em formulações vacinais contra a dengue.

1.3 Os adjuvantes vacinais

No geral, um adjuvante pode ser definido como um aditivo ou veículo que melhora a

resposta imune adaptativa ou estimula o sistema imunológico inato de forma a induzir

eficientemente os efeitos imunológicos desejados (SCHIJNS; LAVELLE, 2011). Os adjuvantes

podem ser classificados em 3 tipos baseados no seu modo de ação (BRUNNER et al., 2010):

Os adjuvantes do tipo A são, em sua maioria, derivados de patógenos e atuam por uma via

imunoestimulatória específica nas células apresentadoras de antígenos (APC’s) pela indução de

sinais de perigo. Idealmente, pela escolha do sinal correto de perigo, as APC’s podem ser

programadas a induzirem uma resposta imunológica ajustada ao patógeno ao qual pertence o

antígeno vacinal. Em contraste, os adjuvantes do tipo B promovem aumento da apresentação

de antígenos (TEMMERMAN et al., 2011). Um clássico adjuvante desse tipo é o hidróxido de

alumínio. Esse sal mineral é amplamente empregado em pesquisas e o único adjuvante viável

para vacinas administradas em seres humanos no continente americano (AGUILAR;

RODRÍGUEZ, 2007). Ainda dentro dessa classificação se têm: emulsões de óleo-em-água

(o/w) e água-em-óleo (w/o), lipossomos, nanopartículas e micropartículas. Como é sabido,

esses adjuvantes promovem o prolongamento da apresentação do antígeno via formação de

depósito, proteção contra degradação, facilitação de entrega antigência direta nos linfonodos,

aumento da captação por APCs e indução de apresentação cruzada. É importante ressaltar que

a ausência de um agente imunoestimulatório pode resultar no favorecimento da tolerância

imunológica ao antígeno (BRUNNER et al., 2010). Em contraste, os adjuvantes do tipo C

promovem um sinal de perigo, porém sem a necessidade ativação das APCs, como exemplo se

pode citar o Interferon do tipo 1 e o fator de necrose tumoral na sua forma solúvel em

combinação a antígenos (BON, LE et al., 2001; KAYAMURO et al., 2009).

O RNA dupla-fita (dsRNA) é um sinal de perigo associado à infecção viral. Diversos

dsRNAs sintéticos, como poli (I:C12U), ou ácido polinosinico-policitidilico, comumente

denominado como poli (I:C), eficientemente mimetiza o dsRNA viral. Isso faz desse composto

um potencial candidato a adjuvante do tipo 2 para vacinação contra infecções virais. Como

sabido, dsRNA são ligantes do receptor do tipo Toll (TLR) 3 que, por sua vez, se localiza na

membrana do compartimento endossomal da maioria das APCs (DESMET; ISHII, 2012;

TAKEUCHI; AKIRA, 2010).

A combinação de adjuvantes do tipo A (imunoestimulador) com B (sistema de entrega)

se mostra como uma estratégia promissora na proteção de ambos, antígeno e do

imunoestimulador, contra degradação. Inclusive, já foi sugerido que a apresentação de um

antígeno fagocitado é mais eficiente quando co-formulado com um imunoestimulador

(BLANDER; MEDZHITOV, 2006; SCHLOSSER et al., 2008). Algumas formulações já foram

desenvolvidas para a entrega do antígeno e poli (I:C). Como demonstrado em modelo murinho,

o Montanide ISA 720, cria uma emulsão w/o, com o poli (I:C) capaz de desencadear uma

resposta Th1 potente e persistente, com a proliferação de linfócitos T CD8+ antígenos-

específicos (JIN et al., 2007). O que contrasta com formulações contendo apenas o M720 como

adjuvante, onde houve uma notável polarização Th2 (JIN et al., 2007). O poli (I:C) formulado

em emulsão com o Montanide ISA 720 promoveu a indução da polarização Th1 mais

eficientemente que o poli (I:C) apenas, fenômeno atribuído à rápida degradação do poli (I:C)

livre por ribonucleases (HAFNER et al., 2013).

CONCLUSÕES

Os objetivos almejados para desenvolvimento da presente dissertação foram alcançados

e as conclusões obtidas foram:

A forma recombinante da proteína NS5 do DENV-2 foi obtida com alto

rendimento em sistema procarioto a partir da fração solúvel. A proteína preserva

epitopos conformacionais presentes na sua forma nativa.

A proteína NS5 recombinante aqui obtida é imunogênica quando

administrada pela via subcutânea, induzindo a geração de IgG antígeno-especifica,

produção de TNF-α e IFN-γ por células imunológicas e aumento de sobrevida em

modelo de desafio com DENV-2 cepa JHA1.

A imunogenicidade da NS5 foi potencializada pela adição de adjuvantes

em um protocolo vacinal, desencadeando uma resposta humoral sistêmica com perfis

de modulação adequado para cada formulação, entretanto nenhum dos adjuvantes

induziu sobrevida maior que a induzida pela proteína sozinha.

A formulação M720, que continha além da proteína os adjuvantes poli

(I:C) emulsificado em Montanide 720, foi capaz de ativar linfócitos T CD8+ específicos,

fato que não foi correlacionado com aumento na proteção ao desafio intracraniano com

a linhagem JHA1 de DENV2.

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