DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE SISTEMAS MICRO E ...siaibib01.univali.br/pdf/Roseni...

ROSENI BORTOLON GRASSI DE CARLI

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE

SISTEMAS MICRO E NANOPARTICULADOS

CONTENDO EXTRATO DAS CASCAS DE Rapanea

ferruginea Mez. (PRIMULACEAE)

Itajaí (SC)

2017

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

ROSENI BORTOLON GRASSI DE CARLI





Tese submetida à Universidade do Vale

do Itajaí como parte dos requisitos para a

obtenção do grau de Doutor em Ciências

Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Ruth Meri

Lucinda-Silva

Itajaí (SC)

Agosto de 2017

Ficha Catalográfica

C194d

Carli, Roseni Bortolon Grassi de, 1965-

Desenvolvimento e avaliação biológica de sistemas micro e

nanoparticulados contendo extrato das cascas de Rapanea ferruginea mez.

(primulaceae) [manuscrito] / Roseni Bortolon Grassi De Carli.- Itajaí, SC.

2017.

167 f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig.

Bibliografias f. 151-166.

Cópia de computador (Printout(s)).

Tese submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos

para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Farmacêuticas.

“Orientadora: Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda-Silva.”

1. Quitosana. 2. Produtos naturais. 3. Farmacologia.

4. Nanopartículas. 5. Micropartículas. I. Universidade do Vale do Itajaí. II.

Título.

.

CDU: 615.32

Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi CRB - 14/963





Roseni Bortolon Grassi de Carli

Agosto/2017

Orientadora: Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda-Silva.

Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas

Bioativas.

Número de Páginas: 166

Sistemas de liberação micro e nano estruturados são capazes de controlar o tempo e o

local de liberação dos fármacos a uma taxa específica e apresentam várias vantagens

quando comparados às formas farmacêuticas convencionais. A Rapanea ferruginea

Mez. (Primulaceae) é uma espécie vegetal estudada pelo Núcleo de Investigações

Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI que já demonstrou eficácia como

anti-inflamatória e antinociceptiva. Estudos analíticos de caracterização dos extratos

das cascas e dos marcadores ácido mirsinoico A (AMA) e ácido mirsinoico B (AMB),

demonstraram que os compostos isolados possuem baixa solubilidade em meio

aquoso, oportunizando o emprego de sistemas micro e nanoestruturados como

estratégia para aumentar a solubilidade e consequentemente a biodisponibilidade

destes compostos. Este estudo teve por objetivo desenvolver micropartículas (MP) e

nanopartículas (NP) contendo extrato das cascas de R. ferruginea utilizando a

quitosana como formadora de matriz e avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo.

MP de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea foram preparadas por

spray-drying e caracterizadas. A otimização do processo foi realizada através de

planejamento fatorial 23. A propriedade de bioadesão foi avaliada em modelo ex vivo

e a atividade anti-inflamatória oral in vivo foi avaliada pelo modelo de edema de pata.

Foram desenvolvidos e caracterizados hidrogéis para a incorporação das MP contendo

extrato das cascas de R. ferruginea e a atividade anti-inflamatória tópica in vivo foi

avaliada pelo modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton. Ainda com a

finalidade de aumentar a solubilidade em meio aquoso do extrato das cascas de R.

ferruginea foram desenvolvidas e caracterizadas NP de quitosana pelo método de

geleificação ionotrópica com tripolifosfato. A incorporação do extrato das cascas de

R. ferruginea em MP de quitosana por spray-drying foi realizada com sucesso. As MP

apresentaram tamanho menor que 5 µm, sendo esféricas e sem aglomeração. As MP

apresentaram perfil de liberação modificada dos marcadores do extrato, propriedades

bioadesivas e atividade anti-inflamatória oral em modelo de formalina in vivo tanto

para a inibição da dor inflamatória quanto para a redução do edema. As MP contendo

o extrato das cascas de R. ferruginea incorporadas nos hidrogéis de alginato e

carbômero 940 na concentração de 0,1 e 0,2%, permaneceram como sistemas

microparticulados após incorporação nos hidrogéis, estabilidade esta proporcionada

pela reticulação das MP catiônicas pelos hidrogéis aniônicos. As MP contendo extrato

veiculado nos hidrogéis apresentaram maior potencial anti-inflamatório em

comparação com o extrato incorporado em creme convencional. As NP apresentaram

tamanho inferior a 200 nm e monodisperso, forma esférica e sem aglomerados, sendo

as proporções extrato:polímero e TPP:quitosana importantes para às suas

propriedades físicas. O estudo permitiu desenvolver novos sistemas de liberação para

administração oral e tópica do extrato das cascas de R. ferruginea e, por meio das

estratégias tecnológicas, melhorar as propriedades de dispersão aquosa e eficácia anti-

inflamatória. Os sistemas são viáveis e potenciais veículos no desenvolvimento de um

medicamento fitoterápico inovador contendo o derivado vegetal.

Palavras-chave: Anti-inflamatório.Fitoterápico. Hidrogéis. Micropartículas.

Nanopartículas. Quitosana. Rapanea ferruginea.

DEVELOPMENT AND BIOLOGICAL EVALUATION

OF MICRO- AND NANOPARTICULATE SYSTEMS

CONTAINING STEM BARK EXTRACT OF Rapanea

ferruginea MEZ. (PRIMULACEAE)

Roseni Bortolon Grassi de Carli

August 2017

Supervisor: Dr. Ruth Meri Lucinda Silva

Area of Concentration: Natural Products and Bioactive Synthetic Substances.

Number of pages: 166

Micro- and nanostructured systems are applied to drug controlled release and targeted

drug release at a specific site and rate, and have several advantages over conventional

dosage forms. Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) is a plant studied by the

Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) of UNIVALI that has

already shown anti-inflammatory and antinociceptive activities. Analytical

characterization of stem bark extracts and A myrsinoic acid (MAA) and B myrsinoic

acid (MAB) markers have shown that the isolated compounds have low solubility in

aqueous medium, creating an opportunity for the use of micro- and nanostructured

systems as a strategy to increase the solubility and consequently, the bioavailability

of these compounds. This aims of this study were to develop microparticles (MP) and

nanoparticles (NP) containing stem bark extract of R. ferruginea using chitosan as

polymeric matrix, and to evaluate the anti-inflammatory activity in vivo. Chitosan MP

containing extract of R. ferruginea stem bark were prepared by spray drying and

characterized. The process was optimized through 23 factorial design. The

bioadhesion property was evaluated in an ex vivo model, and in vivo oral anti-

inflammatory activity was evaluated by the paw edema model. Hydrogels were

developed and characterized for the incorporation of MP containing extract of R.

ferruginea stem bark and the in vivo anti-inflammatory activity was evaluated by the

model of ear edema induced by croton oil. In order to increase the solubility in

aqueous medium of R. ferruginea stem bark extract, chitosan NP were developed by

ionotropic gelation with tripolyphosphate, and characterized. The incorporation of R.

ferruginea stem bark extract into chitosan MP by spray drying was performed

successfully. MP presented a particle size of less than 5 μm, being spherical and

without agglomeration. The MP presented a modified release profile of the extract

markers, bioadhesive properties and oral anti-inflammatory activity in the formalin

model in vivo both for the inhibition of inflammatory pain and edema. Chitosan MP

containing the extract of R. ferruginea were incorporated into the alginate and

carbomer 940 hydrogels at concentrations of 0.1 and 0.2%. The MP remained

particulated after incorporation into the hydrogels, probably due the crosslinking of

the cationic chitosan MP by polyanionic hydrogels. The extract-loaded MP carried in

the hydrogels presented higher anti-inflammatory potential compared to the extract

incorporated in conventional cream. The NP presented a particle size smaller than 200

nm and was monodisperse, with a spherical shape and without agglomerates. The

extract:polymer and TPP:chitosan ratios are important for the physical properties.

This study will enable the development of new release systems for oral and topical

administration of R. ferruginea stem bark extract and, through technological

strategies, improvements in the properties of aqueous dispersion and anti-

inflammatory efficacy. The systems are viable and potential vehicles for the

development of an innovative phytotherapeutic medicine containing R. ferruginea

stem bark extract.

Keywords: Anti-inflammatory. Chitosan. Herbal medicine. Hydrogels.

Microparticles. Nanoparticles. Rapanea ferruginea.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por ter me dado forças para concluir esta difícil jornada,

sem Ele nada é possível em nossas vidas.

Ao meu marido e filhos que sempre me incentivaram e souberam conduzir as

suas vidas mesmo na minha ausência, entendendo o meu cansaço físico,

mental e emocional quando retornava de cada viagem, foram 1500

km/semana por 4 anos, uma trajetória muito difícil, mas enfim hoje superada.

Aos meus pais que voltaram a morar em minha cidade e auxiliaram muito

com os afazeres domésticos em minha ausência.

As Instituições de ensino em que trabalho, principalmente aos coordenadores

que não mediram esforços para que eu conseguisse terminar o doutorado,

sempre ajustando meus horários.

Aos meus alunos de farmácia e estética que compreenderam os dias em que

eu chegava muito cansada, estressada e com pouca paciência.

Aos meus colaboradores da farmacia que conduziram os trabalhos com minha

supervisão muitas vezes a distância.

Aos meus sobrinhos Angela e Marcel que gentilmente cederam sua casa para

me hospedar durante esta jornada, o que me ajudou muito emocionalmente e

financeiramente.

As várias amigas que fiz durante os 4 anos, Ana Flávia Fischer, Jaqueline

Goes, Thamiris Inoue, Juarana Dal Mas, Mariana Cechetto, Tailyn Zermiani,

Thaisa Baccarin, as conversas, almoços, trabalhos que compartilhamos,

sentirei falta.

As queridas amigas do HPLC, Ana, Clarissa, Milena, que nunca mediram

esforços para me auxiliar.

As alunas bolsistas de iniciação científica Amanda Muller e Morgana que

auxiliaram nos experimentos.

Aos meus amigos Tania e Beto Bresolin que também auxiliaram nesta

jornada.

À Profa. Dra. Angela Malheiros que me auxiliou na interpretação dos

espectros do infra-vermelho.

À Profa. Dra. Márcia Maria de Souza pelo auxílio nos testes farmacológicos.

À Profa. Dra. Joana Lea Meira Silveira da Universidade Federal do Paraná

por possibilitar as análises por microscopia eletrônica de varredura.

Aos professores e funcionários do Programa de Mestrado e Doutorado em

Ciências Farmacêuticas por sempre estarem disponíveis a ajudar e

compartilhar seus conhecimentos.

A minha amiga, professora e orientadora Dra. Ruth Meri Lucinda Silva, que

me orientou no Mestrado e agora no Doutorado, pessoa maravilhosa, humana

e detentora de um grande conhecimento, acho que se não tivesse sido minha

orientadora, talvez não tivesse chegado ao fim. Um exemplo que levarei

sempre comigo.

Ao CNPQ, CAPES e FAPESC (PRONEM) por conceder suporte financeiro

e bolsa de estudos para realização do doutorado.

Enfim, a todos que de alguma forma me auxilaram a completar esta jornada.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABTS + - 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin)-6-ácido sulfônico

ACN – Acetonitrila

AD – Agente dispersante

AMA – Ácido Mirsinóico A

AMB– Ácido Mirsinóico B

CLAE- Cromatografo líquido de alta eficiência

CLN - Carreadores lipídicos nanoestruturados

CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal

DPPH - 1,1-difenil-2-picrilhidrazina

DRS ou DRIFTS - Refletância difusa

DSC - Calorimetria exploratória diferencial

FRAP - Poder Antioxidante de Redução do Ferro

FTIR - Espectroscópio de IV médio com transformada de Fourier

IFA - Insumo farmacêutico ativo

IV – Infravermelho

KBr- Brometo de potássio

Log P - Coeficiente de partição

MEV - Microscopia eletrônica de varredura

MIC – Concentração mínima inibitória

MP- Micropartículas

NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico Farmacêuticas

NP- Nanopartículas

PCL-Poli ecaprolactona

PGA - Poli acido glicólico

PLA - Ácido poliláctico

PLGA - Poli ácido lático-co-ácido glicólico

QS- quitosana

QTN – Quitina

RF – Rapanea ferruginea

TGA- Termogravimetria

TPP - Na- Tripolifosfato de sódio

SUMÁRIO

CAPÍTULO I ............................................................................................. 17

Introdução e Objetivos ............................................................................. 17

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 19

2 OBJETIVOS ............................................................................................ 21

2.1 Objetivo Geral....................................................................................... 21

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 21

CAPÍTULO II ........................................................................................... 23

Revisão Bibliográfica ................................................................................ 23

1 SISTEMAS PARTICULADOS ............................................................... 25

1.1 Micropartículas ..................................................................................... 27

1.2 Nanopartículas ...................................................................................... 29

2 QUITOSANA .......................................................................................... 33

3 Rapanea ferruginea .................................................................................. 37

CAPÍTULO III .......................................................................................... 43

Desenvolvimento de micropartículas de quitosana contendo extrato das

cascas de Rapanea ferruginea e avaliação da atividade anti-inflamatória

oral .............................................................................................................. 43

1 Introdução ................................................................................................ 45

2 Material e Métodos .................................................................................. 47

2.1 Material................................................................................................. 47

2.2 Obtenção e caracterização do extrato mole de Rapanea ferruginea .... 47

2.3 Seleção do agente de dispersão na obtenção das micropartículas de

Rapanea ferruginea usando spray drying ................................................... 49

2.4 Obtenção e otimização das micropartículas contendo Rapanea

ferruginea usando spray drying ................................................................. 50

2.5 Caracterização das micropartículas ..................................................... 52

2.6 Determinação do Perfil de Dissolução ................................................. 53

2.7 Avaliação da bioadesão em modelo ex vivo .......................................... 55

2.8 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo .................................. 56

3 Resultados e Discussão ............................................................................ 57

3.1 Obtenção do extrato mole de Rapanea ferruginea................................ 57

3.2 Obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea usando spray

drying .......................................................................................................... 59

3.3 Otimização da obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea

usando spray dryer ...................................................................................... 61

3.4 Análise do perfil de dissolução.............................................................. 76

3.5 Análise da bioadesão ex vivo ................................................................ 84

3.6 Avaliação da atividade anti-inflamatória oral ...................................... 85

4 Conclusões ............................................................................................... 88

CAPÍTULO IV ......................................................................................... 91

Incorporação de micropartículas de quitosana contendo extrato das

cascas de Rapanea ferruginea em hidrogeis e avaliação da atividade

anti-inflamatória tópica ........................................................................... 91

1 Introdução ................................................................................................ 93

2 Material e Métodos ................................................................................... 95

2.1 Material ................................................................................................. 95

2.2 Obtenção das micropartículas contendo Rapanea ferruginea usando

spray drying ................................................................................................ 96

2.3 Desenvolvimento dos hidrogéis ............................................................. 96

2.4 Caracterização dos hidrogéis ............................................................... 97

2.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo ....................... 99

3 Resultados e discussão ........................................................................... 100

3.1 Obtenção e caracterização dos hidrogéis contendo micropartículas 101

3.2 Comportamento reológico ................................................................... 108

3.3 Propriedades Mecânicas ..................................................................... 112

3.4 Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória tópica ..................... 115

4 Conclusões ............................................................................................. 116

CAPÍTULO V ......................................................................................... 119

Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo extrato das

cascas de Rapanea ferruginea ................................................................ 119

Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo extrato das

cascas de Rapanea ferruginea ................................................................ 121

Introdução ................................................................................................. 121

2 Material e Métodos ................................................................................. 123

2.1 Material ............................................................................................... 123

2.2 Material vegetal .................................................................................. 123

2.3 Seleção da matriz polimérica .............................................................. 123

2.4 Obtenção e otimização das nanopartículas de QS contendo extrato das

cascas de Rapanea ferruginea (RF) ........................................................ 124

3 Resultados e Discussão .......................................................................... 127

3.1 Seleção da matriz polimérica .............................................................. 128

3.2 Obtenção das nanopartículas de quitosana contendo extrato das cascas

de Rapanea ferruginea (RF) ..................................................................... 129

4 Conclusões ............................................................................................. 144

CAPÍTULO VI ........................................................................................ 145

Considerações Finais ............................................................................... 145

REFERÊNCIAS ...................................................................................... 151

ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE

ANIMAIS ................................................................................................. 167

17

CAPÍTULO I

Introdução e Objetivos

19

1 INTRODUÇÃO

As plantas medicinais são consideradas um repositório de numerosos

tipos de compostos bioativos que possuem várias propriedades terapêuticas.

O potencial terapêutico das plantas tem sido bem explorado há muito tempo.

Uma vasta gama de efeitos terapêuticos tem sido encontrada em plantas

medicinais como anti-inflamatório, antiviral, antitumoral, antimalárico e

analgésico (RAINA et al., 2014).

A resposta terapêutica dos extratos vegetais geralmente é dependente de

uma mistura complexa de compostos bioativos que têm sua ação

potencializada por efeito sinérgico entre si. No entanto, a maioria dos extratos

vegetais possuem baixa solubilidade em meio aquoso e tempo de meia-vida

curto requerendo administração repetida ou dose mais elevada, tornando

esses produtos fracos candidatos a fármacos. Buscando superar esta

limitação, novos sistemas terapêuticos contendo derivados vegetais têm sido

desenvolvidos (ANSARI; ISLAM; SAMEEM, 2012; NAMDAR et al.,

2017).

O desenvolvimento de sistemas micro e nanoestruturados para

veiculação de derivados de plantas medicinais cresceu nos últimos anos

(BIDONE et al., 2014). Estes sistemas atuam como plataformas de

carreamento de fármaco, sendo capazes de promover o aumento da

solubilidade pelo aumento da área superficial, a liberação modificada e a

vetorização para sítios alvos. Tais melhoramentos resultam em aumento de

eficácia e a redução de efeitos colaterais (MISHRA et al., 2010).

Embora estes sistemas tenham sido desenvolvidos para fármacos puros,

alguns tipos de sistemas permitem incorporar com alta eficiência extratos

vegetais brutos, como por exemplo, nanoemulsões (CECHETTO, 2016;

TSAI; CHEN, 2016; XAVIER, 2015; DAL MAS et al., 2016), micro e

nanopartículas poliméricas (DAS et al., 2012; HILL; TAYLOR; GOMES,

2013; RIBEIRO et al., 2013), nanopartículas lipídicas sólidas (DA ROCHA,

2015; LACATUSU et al., 2014; NASSERI et al., 2016), entre outros.

As vantagens das micro e nanopartículas poliméricas estão no aumento

da estabilidade química e física dos princípios ativos, maior disponibilidade

e manutenção do princípio ativo no tecido alvo, maior solubilidade de

princípios ativos hidrofóbicos, redução de efeitos colaterais e de toxicidade,

assim como o número de doses e frequência de administração, o que

20

proporciona maior conforto para o paciente (FARIA-TISCHER; TISCHER,

2012).

Uma espécie vegetal estudada pelo Núcleo de Investigações Químico-

Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI e com potencial aplicação como

fonte de fitoderivados para uso terapêutico é a Rapanea ferruginea Mez.

(Primulaceae). Nesta espécie foram identificados, a partir dos extratos

etanólicos das folhas e caules, o ácido mirsinoico B (AMB) e a partir dos

frutos o ácido mirsinoico A (AMA) (GAZONI, 2009; ZERMIANI, 2015). O

extrato bruto das cascas de R. ferruginea e o AMB, principal componente

isolado do extrato, apresentaram atividade antinociceptiva, anti-hiperalgésica

e anti-inflamatória, em vários modelos animais (BACCARIN, 2010; HESS

et al., 2010; GALVAN, 2007).

Estudos de pré-formulação dos extratos das cascas e dos marcadores

AMA e AMB, demonstraram que os compostos isolados possuem baixa

solubilidade em meio aquoso, sendo classificados como praticamente

insolúveis em água (< 0,50 mg/mL) (ZERMIANI et al., 2015). Este

comportamento de solubilidade é comum para os metabólitos secundários

presentes nos extratos vegetais. Como estratégia para aumentar a solubilidade

e consequentemente a biodisponibilidade destes compostos, a incorporação

em sistemas micro e nanoestruturados tem sido utilizada. Dal Mas et al.

(2016) incorporaram o extrato das cascas de R. ferruginea em nanoemulsões

e observaram uma inibição de 90,50% do edema de orelha induzido pelo óleo

de cróton pela nanoemulsão contendo 0,13% e inibição de 64,65% pelo

extrato incorporado em emulsão convencional a 0,50%, evidenciando que a

incorporação do extrato na nanoemulsão potencializou a atividade anti-

inflamatória in vivo quando comparado com a emulsão.

A partir dos resultados já obtidos da eficácia dos derivados vegetais da

espécie R. ferruginea como anti-inflamatório e antinociceptivo e a potencial

aplicação de sistemas micro e nanoestruturados como carreadores para

derivados vegetais, o presente estudo realizou o desenvolvimento de micro e

nanopartículas contendo o extrato bruto das cascas de R. ferruginea e a

avaliação biológica do potencial anti-inflamatório por via oral e tópico em

modelo in vivo. Como polímero foi empregada a quitosana por ser um

polissacarídeo com ampla aplicação em sistemas de liberação de fármacos,

com reconhecida biocompatibilidade, biodegradabilidade e propriedades

mucoadesivas (GERMERSHAUS et al., 2015; NAIKWADE et al., 2009).

21

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Desenvolver sistemas micro e nanoparticulados para incorporação de

derivados vegetais das cascas de R. ferruginea usando a quitosana como

polímero e avaliar a influência dos sistemas particulados na atividade anti-

inflamatória oral e tópica em modelos farmacológicos in vivo.

2.2 Objetivos Específicos

- Preparar e caracterizar o extrato mole de R. ferruginea;

- Preparar e caracterizar micropartículas de quitosana por spray dryer

contendo extrato bruto das cascas de R. ferruginea;

- Preparar e caracterizar nanopartículas de quitosana por coacervação

contendo extrato bruto das cascas de R. ferruginea;

- Preparar e caracterizar hidrogel contendo micropartículas de quitosana e

extrato bruto das cascas de R. ferruginea;

- Avaliar a atividade anti-inflamatória das micropartículas de quitosana

contendo extrato bruto das cascas de R. ferruginea administrada por via oral;

- Avaliar a atividade anti-inflamatória tópica dos hidrogéis contendo

micropartículas de quitosana e extrato bruto das cascas de Rapanea

ferruginea.

23

CAPÍTULO II

Revisão Bibliográfica

25

1 SISTEMAS PARTICULADOS

Durante vários anos, a pesquisa sobre desenvolvimento de formulações

de medicamentos tem se concentrado na adaptação de sistemas de liberação

que são capazes de retardar e sustentar a liberação do fármaco após a

administração. Estas formulações são conhecidas como sistemas de liberação

modificada de fármacos, as quais permitem controlar o tempo e o local de

liberação do fármaco a uma taxa específica. Tais sistemas apresentam várias

vantagens quando comparado às formas farmacêuticas convencionais, como

a capacidade de manter o fármaco em níveis sanguíneos constantes, melhorar

a eficácia, reduzir a toxicidade, e melhorar adesão do paciente ao tratamento

(SÃO PEDRO et al., 2016).

Partículas poliméricas biodegradáveis têm sido exaustivamente

estudadas nos últimos 20 anos, sendo utilizadas em diversas aplicações

médicas, tais como: cicatrização de feridas, dispositivos ortopédicos,

aplicações cardiovasculares, vacinas, entre outros (GUTJAHR et al., 2016).

Os sistemas micro e nanoparticulados são carreadores eficientes devido

às suas propriedades físico-químicas, a versatilidade de uso de diferentes

polímeros, de diferentes métodos de produção e a possibilidade de

modificações na superfície que permitem a vetorização do fármaco para sítios

alvos (GUTJAHR et al., 2016; SCHMIDT et al., 2013; SÃO PEDRO et al.,

2016; SINGH; CHAKRAPANI; HAGAN et al., 2007).

A eficácia dos sistemas micro e nanoparticulados não estão

estabelecidas definitivamente. Há estudos que relatam que as nanopartículas

em comparação com as micropartículas são mais eficazes, enquanto outros

apontam eficácia semelhante ou equivalente das micropartículas. Tais

resultados dependem da estrutura das partículas e da via de administração.

Para modular a liberação do fármaco dos sistemas, diferentes estratégias

podem ser empregadas, como o ajuste do teor de fármaco na matriz

polimérica, o tamanho e a morfologia das partículas (HAN et al., 2016).

O principal aspecto a ser considerado na escolha de sistemas micro ou

nano é a aplicação pretendida. O perfil farmacocinético de micro e

nanopartículas apresentam diferenças significativas no mecanismo de

liberação de fármacos, na absorção e afinidade com as proteínas plasmáticas

(SÃO PEDRO et al., 2016).

Micro e nanopartículas poliméricas têm sido amplamente estudadas

como sistemas para liberação tópica de fármacos devido à sua capacidade de

26

modular a liberação de fármacos nas diferentes camadas da pele. Para fins

tópicos, é desejável que maiores quantidades de fármaco sejam

disponibilizados na epiderme e uma pequena quantidade de fármaco ou, se

possível, nenhuma quantidade seja difundida através da pele e atinja a

corrente sanguínea, evitando assim os efeitos colaterais sistêmicos. Muitos

estudos têm sugerido que a principal via de penetração das micropartículas

na pele é a transfolicular (figura 1). Toll et al. (2004 apud GELFUSO et al.,

2011) constataram que enquanto as micropartículas com mais de 10 µm de

tamanho não podem penetrar na pele, as micropartículas entre 1 e 5 µm

podem atravessar a pele através dos canais foliculares e as nanopartículas

atravessam preferencialmente a barreira da pele através da via

transepidérmica, seguindo a via intercelular através do envelope lipídico do

estrato córneo.

Figura 1- Ilustração esquemática demonstrando as diferentes vias de permeação de

fármacos através do estrato córneo

Fonte: Gratieri; Gelfuso; Lopez (2008).

Fonte: Adaptado de Trommer (2006).

Estudos científicos mostraram que NP ≤ 1000 nm podem penetrar na

pele quando esta se encontra hidratada. A pele danificada é uma via direta

para a penetração de partículas (≤ 7000 nm). A presença de acne, eczema e

feridas pode aumentar a absorção de NP na corrente sanguínea podendo levar

a maiores complicações (RAJ et al., 2012).

As formas farmacêuticas para aplicação tópica são utilizadas para

transportar fármacos para sítios de ação local ou sistêmica. Produtos

dermatológicos de uso tópico carream o fármaco para a pele enquanto um

produto de ação transdérmica libera o fármaco na circulação sanguínea

(SILVA et al., 2010).

Corneócitos

Glândula

sudoripara

Folículo

piloso

Intercelular Transcelular Transfolicular

Transepidermal Via poros

27

A administração de fármacos por via transdérmica oferece algumas

vantagens como, ação prolongada; redução na frequência da dose; maior

uniformidade nos níveis plasmáticos; uso de fármacos potentes; aumento da

biodisponibilidade; redução dos efeitos adversos; flexibilidade para

interromper a administração do fármaco pela remoção do adesivo da pele; e

algumas desvantagens como, possibilidade de irritação no local de aplicação;

irritação na pele ou dermatite de contato devido ao fármaco e aos excipientes;

limitação no número de fármacos que podem ser administrados por esta via

devido a baixa permeabilidade da pele (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012).

Em geral, as vantagens e limitações do uso de nanotransportadores para

administração transdérmica de fármacos são o seu pequeno tamanho, elevada

energia superficial, composição e morfologia. A fim de aumentar a

quantidade de medicamentos disponíveis para a liberação transdérmica, o uso

de nanocarreadores surgiu como uma alternativa interessante e valiosa para a

liberação de fármacos lipofílicos e hidrofílicos no estrato córneo com a

possibilidade de ter um efeito local ou sistêmico para o tratamento de muitas

doenças (ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012; POLETTO et al., 2011;

VIANA; SILVA, 2013).

1.1 Micropartículas

As micropartículas (MP) são partículas sólidas e esféricas com tamanho

variando entre 1 e 1000 μm. Subdividem-se em microcápsulas, que são

reservatórios que contêm a substância ativa revestida por polímeros de

espessuras variáveis, os quais constituem a membrana da cápsula, e em

microesferas, sistemas matriciais, nos quais o fármaco se encontra

uniformemente disperso e/ou dissolvido na matriz polimérica. A

microencapsulação consiste de um processo físico no qual um filme fino ou

camada polimérica é aplicada para envolver sólidos, líquidos ou gases,

isolando-os e protegendo-os das condições ambientais, como luz, ar e

umidade (CAMPOS et al., 2013).

As MP podem ser administradas por diferentes vias, como pulmonar,

oral, nasal, colônica, tópica e subcutânea (BOWEY; NEUFELD, 2010;

ESPOSITO; CORTESI, 2014). São sistemas que apresentam algumas

vantagens quando comparados às nanopartículas (NP), pois exigem métodos

de preparação mais simples e um escalonamento mais fácil. A estrutura maior

28

das MP permite a incorporação de quantidades maiores de fármacos, exigindo

assim menores doses das MP para atingir os níveis terapêuticos durante o

tratamento. Por possuírem uma área superficial menor, se comparadas às NP,

resultam em menor susceptibilidade às degradações físico-químicas (SÃO

PEDRO et al., 2016).

As principais vantagens obtidas com o uso das MP poliméricas

abrangem a proteção do princípio ativo contra a degradação, mucoadesão,

gastrorresistência, reprodutibilidade, fracionamento da dose melhorando a

biodisponibilidade dos fármacos. A capacidade de controlar a liberação do

fármaco por um período de tempo especificado depende da composição da

matriz, da solubilidade do fármaco, da estrutura química e física dos

polímeros e seu estado polimorfo (MAHMOOD; SARFRAZ; MAHMOOD,

2016; NAIKWADE et al., 2009; SEVERINO et al., 2011).

As MP podem ser preparadas a partir de polímeros biodegradáveis

(agarose, quitina, quitosana, β-ciclodextrina, carboximetilcelulose e

carregenina) ou não biodegradável (poliestireno, poliacrilamina), entre outros

(MAHMOOD; SARFRAZ; MAHMOOD, 2016; MANIVASAGAN; OH,

2016).

Os métodos de emulsificação, coacervação e spray-drying são

utilizados para produção em grande escala de sistemas particulados (WAN;

YANG, 2016). A secagem por spray-drying é uma excelente técnica para

preparações de MP sólidas, assegurando a estabilidade e proporcionando

melhor eficácia, em comparação com as técnicas que utilizam solventes

orgânicos (KARAVASILI et al., 2014). O spray dryer possui um controle

automático, custo-efetividade, disponibilidade comercial de diferentes

layouts e adequação para diferentes tipos de dispersões (soluções, suspensões

ou emulsões). Os produtos sólidos obtidos após o processo têm a vantagem

de possuir maior estabilidade física e química em comparação com as

formulações líquidas. Além disso, eles podem ser usados como precursores

para a produção de outras formas farmacêuticas, tais como cápsulas ou

comprimidos (SOSNIK; SEREMETA, 2015).

No processo por spray-drying, o fármaco é disperso ou dissolvido numa

solução orgânica ou aquosa de polímero, os quais são nebulizados numa

corrente de ar quente/gás inerte como o nitrogênio, ocorrendo a evaporação

do solvente e formação das micropartículas (WAN; YANG, 2016). Este

método é um processo simples, rápido, de etapa única para preparação de MP.

As variáveis que afetam as características do produto são: (i) parâmetros do

29

processo, (ii) propriedades do material de entrada e (iii) design de

equipamentos (SOSNIK; SEREMETA, 2015). Estas variáveis devem ser

controladas visando à obtenção de alto rendimento e eficiência de

incorporação do fármaco, redução do teor de umidade, aumento da

estabilidade química, minimização da aderência de partículas na câmera de

secagem (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010) e o controle das propriedades

físicas como tamanho e densidade (PARK; HWANG; LEE, 2011; WAN;

YANG, 2016).

Entre as vantagens do método estão a possibilidade de encapsular um

grande número de fármacos/peptídeos/proteínas; não há necessidade de

secagem final; é reproduzível; os atomizadores eliminam a necessidade de

processos de pré-preparação e permitem a fabricação contínua do produto

(HAN et al., 2016). Possui alta flexibilidade para ajustar o tamanho e a

morfologia do produto gerado (BECK-BROICHSITTER; STREHLOW;

KISSEL, 2015). No entanto, este sistema apresenta algumas desvantagens

como a aderência de micropartículas às paredes internas do spray-dryer; não

é adequado para compostos sensíveis à temperatura; e ainda, dependendo da

composição da dispersão, pode ter baixo rendimento e formar partículas

aglomeradas. O tipo de fármaco (hidrofóbico ou hidrofílico), a natureza do

solvente, a velocidade de alimentação e a temperatura de evaporação do

solvente podem afetar a morfologia das microesferas (HAN et al., 2016).

Diferentes polímeros têm sido empregados na obtenção de MP por

spray dryer, como alginato de sódio, quitosana (BOWEY; NEUFELD,

2010), gelatina, albumina (NAGAVARMA et al., 2012), poloxamer 127

(ELKORDY; ESSA, 2010), ε-caprolactona, ácido poliláctico, ácido

poliglicólico (BOWEY; NEUFELD, 2010; ESPOSITO; CORTESI, 2014),

co-polímero de ácido lático-ácido glicólico (BOWEY; NEUFELD, 2010;

WAN; YANG, 2016), e poliésteres metacrílicos (Eudragit®) (YIN; XIANG;

SONG, 2016).

1.2 Nanopartículas

Na área da ciência médica, os nanomateriais ou nanosistemas têm sido

aplicados como plataforma para liberação modificada de fármacos, assim

como no diagnóstico por imagem e molecular. Como resultado, têm-se a

obtenção de imagens melhoradas, diagnóstico mais rápido, aumento na

eficácia terapêutica e redução dos efeitos adversos em comparação com os

30

métodos convencionais. Devido às suas propriedades físico-químicas e

biológicas, as nanopartículas melhoram a solubilidade, a estabilidade, a

biocompatibilidade, a biodisponibilidade além da redução da toxicidade dos

fármacos (JEE et al., 2012).

Estudos recentes têm considerado que partículas que possuem <100 nm

de tamanho são consideradas NP. Dependendo de como o fármaco é

encapsulado, as NP são classificadas em nanocápsulas (invólucro polimérico

contendo um reservatório oleoso, no qual o fármaco pode estar dissolvido no

núcleo e/ou adsorvido na parede polimérica) e nanoesferas (o fármaco fica

retido ou adsorvido na matriz polimérica e não contem óleo em sua

composição) (figura 2). Os fármacos lipofílicos que apresentam solubilidade

na matriz polimérica ou no núcleo oleoso da nanocápsula são mais facilmente

encapsulados em sistemas de nanopartículas, os fármacos hidrofílicos a

adsorção ocorre na superfície da partícula (ESFANJANI; JAFARI, 2016;

HUDSON; MARGARITIS, 2014).

Figura 2 – Esquema da classificação de nanopartículas poliméricas biodegradáveis

(nanocápsulas e nanoesferas)

Fonte: Adaptado de Kumari et al. (2009).

31

O pequeno tamanho das NP facilita a sua passagem através de

biomembranas, aumentando significativamente a biodisponibilidade do

fármaco. A grande superfície das nanopartículas colabora com o aumento da

solubilidade dos fármacos nos fluidos biológicos, além de controlar a

liberação em diferentes locais do corpo. As nanopartículas também podem

proteger os fármacos das reações de oxidação térmica e foto-mediada, bem

como, hidrólise e outras transformações químicas (SÃO PEDRO et al., 2016).

Sistemas de liberação de fármacos nanoparticulados apresentam várias

vantagens, como a passagem por meio de pequenos vasos capilares devido a

seu pequeno volume evitando a eliminação rápida pelos fagócitos,

prolongando a duração no fluxo sanguíneo; podem penetrar nas células e

tecidos para chegar aos órgãos alvo tais como o fígado, baço, pulmão, medula

espinhal e linfa; eles podem melhorar a eficácia dos fármacos e reduzir os

efeitos colaterais tóxicos; podem aprisionar fármacos ou biomoléculas em

sua estrutura interna e/ou absorver em suas superfícies (HUDSON;

MARGARITIS, 2014).

Dentre as desvantagens das NP estão a avaliação insuficiente da sua

toxicidade; a dificuldade encontrada para aumentar a escala de produção para

alguns processos e o tamanho resultante no escalonamento, o qual nem

sempre é suficiente para evitar o sistema imunológico (ESCOBAR-CHÁVEZ

et al., 2012).

As técnicas de preparação de NP são baseadas em suas propriedades

físico-químicas sendo elas a emulsificação-difusão por deslocamento de

solvente, emulsificação-polimerização, polimerização in situ, gelificação,

nanoprecipitação, evaporação/extração de solvente, entre outras

(ESCOBAR-CHÁVEZ et al., 2012; YIN; XIANG; SONG, 2016).

Os polímeros utilizados na formação de NP podem ser de origem natural

(colágeno, queratina, celulose, quitosana), onde se acrescenta grupos polares

às cadeias, reduzindo assim o tempo de degradação e, os sintéticos, que

possuem características hidrofílicas e massa molecular menor, sendo mais

propícios à degradação (DE MEDEIROS, 2011).

As NP poliméricas podem ser preparadas a partir de polímeros

biocompatíveis e biodegradáveis onde o fármaco encontra-se dissolvido,

aprisionado, encapsulado ou ligado a uma matriz. O uso de NP poliméricas

tem se expandido rapidamente em diversas áreas como eletrônica, fotônica,

materiais condutores, sensores, medicina, biotecnologia, controle de poluição

e tecnologia ambiental. As NP devido ao fácil preparo e sua variada

32

composição, estrutura e características de superfície são veículos promissores

para a veiculação de fármacos carreando-os para um alvo específico,

melhorando assim a sua eficácia e segurança (NAGAVARMA et al., 2012;

STEICHEN; CALDORERA-MOORE; PEPPAS,2013).

As NP têm sido desenvolvidas para administração por diferentes vias de

administração como oral, tópica, transdérmica, parenteral, pulmonar, ocular,

nasal evaginal (CHENG et al., 2015). A via oral é a mais empregada na

administração de fármacos, porém possui vários inconvenientes, pois os

medicamentos estão expostos a degradação enzimática e também

variabilidade de pH, interação com alimentos no trato gastrointestinal

resultando na baixa biodisponibilidade (PENICHE; PENICHE, 2011).

Alguns estudos concentraram-se na elucidação sistemática do mecanismo de

absorção oral dependente do tamanho das NP, melhorando a estabilidade

contra degradação enzimática e hidrolítica no trato gastrintestinal (HE et al.,

2012).

A biodisponibilidade oral do Psoralidin (princípio ativo isolado da

semente de Psoralea corylifolia) com atividades terapêuticas em vários tipos

de câncer (estômago, pulmão e próstata) foi significativamente aumentada

pela incorporação em nanocápsulas de quitosana-Eudragit® S100. Os

sistemas apresentaram excelente adesão intestinal e permeabilidade

transepitelial, indicamento a melhoria da resposta biológica por meio da

nanoencapsulação (YIN; XIANG; SONG, 2016).

NP poliméricas de extrato de Uncaria tomentosa (unha de gato),

indicado para febre, inflamação, infecções virais e câncer, foram preparadas

pelo método de emulsificação-evaporação do solvente e demonstraram

possuir parâmetros físico-químicos adequados (RIBEIRO et al., 2013).

Nanoparticulas de PLGA com extrato das cascas de Cinnamon zeylanicum

(canela), antibacteriano natural, também foram produzidas pelo método de

emulsificação-evaporação do solvente e apresentaram eficácia na inibição

dos patógenos Listeria monocytogenes e Salmonella typhimurium (HILL;

TAYLOR; GOMES, 2013).

Segundo estudos de Das et al. (2012), a nanoencapsulação do extrato de

Phytolacca decandra (uva turca) aumentou a biodisponibilidade do extrato

melhorando a ação preventiva de quimioterapia contra câncer de pulmão in

vivo e em células A549 in vitro.

NP lipídicas sólidas contendo óleo essencial de Zataria multiflora foram

preparadas pela técnica de homogeneização à alta pressão e demonstraram

33

controlar a atividade antifúngica dos patógenos estudados (NASSERI et al.,

2016)

Os nanocarreadores preparados com óleos de sementes de amaranto

mostraram uma liberação mais sustentada ao longo do tempo do que aqueles

preparados apenas com óleo de semente de amaranto em associação com

lipídios sólidos (LACATUSU et al., 2014).

Em seu estudo, Da Rocha (2015) desenvolveu carreadores lipídicos

nanoestruturados (CLN) contendo o extrato da planta Centella asiatica os

quais foram caracterizados visando à aplicação tópica do asiaticosídeo. Os

CLN foram produzidos com uma mistura de lipídeos sólido e líquido,

taurodeoxicolato de sódio e lecitina de soja pela técnica da microemulsão. Os

resultados sugeriram que estes sistemas aumentaram significativamente a

permeação do asiatiacosídeo apresentando, portanto, potenciais benefícios

para o tratamento de patologias cutâneas como a esclerodermia.

As NP podem aumentar a biodisponibilidade de fármacos pouco

solúveis em água, aumentando a dissolução e/ou permeabilidade. As

propriedades físico-químicas das NP podem ser melhoradas alterando a

absorção, distribuição e eliminação do fármaco. A composição química,

tamanho e morfologia são fatores importantes no transporte de NP através do

intestino (GRAVES et al., 2015).

2 QUITOSANA

Os polissacarídeos e os oligossacarídeos formam o grupo mais

abundante de bipolímeros utilizados em processos biológicos, como

desenvolvimento embrionário, infecção de bactérias/vírus e imunidade

humoral e celular. Eles têm sido utilizados há décadas em várias aplicações

industriais como na área farmacêutica, de biomateriais, alimentos, nutrição.

Os bipolímeros podem ser encontrados em micro-organismos (fungos,

leveduras e bactérias), algas, plantas e animais e estão fisicamente ou

quimicamente ligados a outras biomoléculas, como, proteínas,

polinucleotídeos, lipídeos, lignina e algumas substâncias minerais

inorgânicas (LIU; WILLFOR; XU, 2015).

A quitosana (QS) é um polissacarídeo natural biodegradável,

biocompatível, atóxica, oriunda da desacetilação da quitina, a qual é

encontrada na carapaça de crustáceos, no exoesqueleto de insetos e nas

paredes celulares de fungos (MANIVASAGAN; OH, 2016; PECARSKI et

34

al., 2014). A quitina é um polissacarídeo com ramificações de grupos

acetamina que, quando desacetilados, transformam-se em quitosana. A

molécula da QS é composta por N-acetyl-D-glucosamina e D-glucosamina

disponível em diferentes graus de desacetilação. Dependendo do grau de

acetilação, resulta em um copolímero de β-(1→4)-D-glucosamina.

Normalmente é denominada de poli-β-(1→4)-D-glucosamina (PECARSKI

et al., 2014).

A QS é facilmente solúvel em soluções diluídas de ácidos com valor de

pH menor que 6,0, devido à quaternização dos grupamentos amino que

possuem um valor de pKa de 6,3, tornando-a um polieletrólito catiônico

solúvel em água, evitando o uso de solventes orgânicos tóxicos durante a

formação dos sistemas micro e nanoestruturados (COTA-ARRIOLA et al.,

2013; DASH et al., 2011; SALEEM, 2010).

Devido às suas propriedades físico-químicas, a QS tornou-se um

material atrativo para aplicações em diferentes áreas como farmacêutica,

cosmética, médica, odontológica, biomédica, tratamento de águas residuais,

agricultura, biotecnologia e gastronômica. É um polímero catiônico, muco-

adesivo com importante capacidade de aumentar a penetração de fármacos

através das barreiras das mucosas (PENICHE; PENICHE, 2011). Sistemas a

base de QS podem, por exemplo, atuar como carreadoras de fármacos, DNA

ou proteínas, pela sua capacidade de aumentar a permeabilidade das

membranas (ANITHA et al., 2011; ARAUJO, 2009; BLANCO, 2011;

COTA-ARRIOLA et al., 2013).

O grau de desacetilação e a massa molecular são os dois parâmetros

fundamentais que podem afetar as propriedades e a funcionalidade da QS.

Essas propriedades incluem solubilidade, viscosidade, reatividade de

material proteico, coagulação, quelação de íons de metais pesados e as

propriedades físicas dos filmes formados com QS, como a resistência à

tração, elasticidade e absorção da umidade. A QS com alta massa molecular

e alto grau de desacetilação apresenta um aumento na permeabilidade

epitelial podendo ser comparado a outros polímeros promotores de

permeação tais como os poliacrilatos. A QS pode ser associada com outros

intensificadores de permeação porque age de maneira diferente dos outros

potenciadores, levando a um efeito aditivo ou mesmo sinérgico (ELGADIR

et al., 2015).

A QS apresenta várias aplicações por sua capacidade de quelar íons

metálicos, sua atividade antifúngica e antimicrobiana sobre bactérias gram-

35

positivas e gram-negativas com espectro de ação amplo e por sua baixa

toxicidade em células de mamíferos. A atividade antimicrobiana é

influenciada por inúmeros fatores físico-químicos, como grau de

desacetilação, massa molecular, pH do meio e concentração do polímero

(BLANCO, 2011; COTA-ARRIOLA et al., 2013; DASH et al., 2011).

Sistemas terapêuticos desenvolvidos a partir da QS podem incluir

filmes, fios, comprimidos, membranas, micropartículas e nanopartículas. As

NP de QS são excelentes matrizes poliméricas para o desenvolvimento de

novos sistemas terapêuticos com melhor biodistribuição, maior

especificidade, sensibilidade e menor toxicidade farmacológica. As NP de

QS são consideradas adequadas para administração de fármacos por vias não

invasivas como a via oral, nasal, pulmonar e ocular (PENICHE; PENICHE,

2011).

A QS tem sido utilizada para obtenção de MP e NP pelos métodos de

evaporação de solvente, coacervação, gelificação iônica, microemulsão

reversa, difusão de solvente, spray drying, entre outros. O uso do spray

drying apresenta como vantagem principal a possibilidade de obtenção dos

sistemas em meio aquoso, dispensando o uso de solvente orgânico, bem

como, de adjuvantes como óleo ou emulsionantes que podem deixar resíduos

indesejáveis na formulação de MP. Este método também permite obter MP

de QS com alto rendimento e facilmente escalonável para produção em escala

piloto e industrial (BLANCO, 2011; VASCONCELLOS; GOULART;

BEPPU, 2011).

O método de coacervação/precipitação utiliza a QS como polímero,

devido a sua propriedade físico-química de ser insolúvel em meio de pH

alcalino, formando assim coacervados/precipitados quando entra em contato

com solução alcalina (DASH et al., 2011). Devido à facilidade da QS gelificar

na presença de poliânions específicos, o método de geleificação iônica é

descrito na literatura como um meio para obtenção de nano e micropartículas

usando QS como matriz (BLANCO, 2011). Este método consiste na

reticulação iônica da QS com contra-íons multivalentes como Fe (CN)64-, Fe

(CN)63-, citratos e tripolifosfato de sódio (TPP) (figura 3), sendo o TPP o

poliânion comumente utilizado. O procedimento é realizado em meio aquoso

e não envolve a utilização de solventes orgânicos. As NP podem ser obtidas

pela adição de uma dispersão ácida de QS a uma solução de TPP ou vice-

versa, sob agitação constante. O tamanho e a eficiência de encapsulação das

partículas são dependentes das concentrações de QS, TPP e do pH das

36

soluções de TPP. O principal problema deste método é o tempo de

estabilidade do sistema coloidal que pode requerer a adição de estabilizantes

e a necessidade de usar soluções muito diluídas que se tornam inconvenientes

quando são necessárias grandes quantidades de NP (PENICHE; PENICHE,

2011).

Figura 3 - Esquema da geleificação iônica da quitosana com tripolifosfato de

sódio.

Fonte: Zhao et al., 2011 (adaptado).

NP de QS:TPP preparadas por métodos convencionais geralmente

apresentam uma ampla distribuição de tamanho de partícula e baixa

estabilidade, o que limita a sua utilidade em certas aplicações. Fan et al.

(2012) estudaram diferentes parâmetros no desenvolvimento de NP de

QS:TPP como a concentração da solução de QS, concentração de solução de

TPP, temperatura e pH da solução de QS, proporção de QS:TPP (m/m) e

velocidade de agitação. Bulmer, Margaritis e Xenocostas (2012) desenvolveram NP de QS:TPP

pelo método de geleificação iônica usando QS a 2,0% (m/v). A partir desta

dispersão foram preparadas soluções de QS nas concentrações 0,125, 0,25,

0,5, 1,0 e 2,0 mg/mL. Foram preparadas NP usando a proporção QS:TPP de

2:1, 3:1, 4:1, 5:1 e 6:1. O diâmetro médio das NP aumentou de forma linear

e variou entre 180 e 960 nm, com cargas de superfície entre 40 e 55 mV, e

com distribuições de tamanho de partícula variando entre 0,2 e 0,35 e a

eficiência de encapsulação foi de 47,97 ± 4.10%.

As NP de QS proporcionam a liberação sustentada de fármacos

envolvendo os mecanismos de intumescimento, difusão e erosão. A cinética

de liberação é dependente da massa molecular e do grau de desacetilação do

polímero, bem como, da área superficial das partículas. A distribuição de

37

tamanho das NP também pode interferir na disponibilidade destas no tecido,

sendo que partículas menores podem sofrer depósito no tecido

fisiologicamente alterado, levando ao aumento da taxa de captação celular

(WANG et al., 2011).

3 Rapanea ferruginea

A R. ferruginea Mez pertence à família Primulaceae. Esta espécie é

pantropical e no Brasil é encontrada especialmente nas regiões litorâneas

como Bahia, Espirito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná,

Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Na América latina é encontrada em

países como Bolívia, México, Argentina, Paraguai e Uruguai (BACCARIN

et al., 2014; COSTA, 2011). Características botânicas reclassificaram esta

espécie, que passou da família Myrsinaceae para a Primulaceae (FREITAS;

KINOSHITA, 2015). É uma árvore de porte médio de 6-12 m de altura e

tronco de 30 a 40 cm de diâmetro, apresenta frutos de 3-5 mm de diâmetro

globosos e cor negra arroxeada quando estão maduros (Figura 4)

(CARVALHO, 1994; BACCARIN et al., 2014).

A R. ferruginea também está descrita na literatura botânica como

Myrsine floculosa Mar. e Gaballeria ferruginea (PASCOTO, 2007),

entretanto, o nome latino válido é R. ferruginea, popularmente conhecida

como canela-azeitona, Capororoca, azeitona-do-mato, camará, capororocaçu,

capororoca-vermelha, pororoca e capororoca-mirim, utilizada como

alimentação da fauna silvestre, alimentação humana, produção de carvão,

construção civil, lenha, paisagismo, reflorestamento para recuperação

ambiental (LORENZI, 1998; BACCARIN et al., 2014; PASCOTO, 2007).

Popularmente o chá das folhas ou das cascas da R. ferruginea é indicado

como diurético e depurativo, no combate às afecções urinárias, usado

popularmente para coceiras, erupções, urticárias, eczemas, reumatismo,

afecções do fígado (LORENZI, 2002).

38

Figura 4 - Fotografias da planta Rapanea ferruginea: a) partes aéreas, b) frutos e

folhas c) cascas.

Fonte: Zermiani (2015).

Várias substâncias foram isoladas de diversas espécies de Rapanea com

efeitos biológicos conhecidos, os principais representantes são os derivados

de ácidos benzoicos prenilados que possuem estrutura química e atividade

biológicas diferentes (TOMIO, 2011). Nas cascas a R. ferruginea apresenta

grande concentração do ácido mirsinóico B (AMB), um ácido benzoico

prenilado de nome químico, (5-carboxi-2, 3-dihidro-2-(1’, 5’-dimetil-1’-

hidroxi-4’hexenil)-7-(3”-metil-2”butenil) benzofurano) e nos frutos há maior

presença do acido mirsinóico A (AMA), de nome químico (ácido 5-geranil-

4-hidroxi-3-(3”-metil-2”butenil)-benzoico) (ANTONIALLI, 2009;

ZERMIANI, 2015). Estruturas químicas estão demonstradas na Figura 5.

39

Figura 5- Estrutura química dos ácidos mirsinoicos AMA, AMB e AMC.

Fonte: Fronza e Giuradelli, 2009.

Estudos realizados com a R. ferruginea, pelo NIQFAR da UNIVALI

apresentaram resultados promissores com extratos e compostos isolados.

Hess (2006) demonstrou que o AMB possui importante efeito antinociceptivo

na dor induzida pelo ácido acético (150, 200, 300 e 500 mg/kg v.o e nas doses

de 3, 6, 10, 30 e 60 mg/kg i.p), glutamato (10, 30 e 60 mg/kg i.p), capsaicina

e formalina (6, 10, 30 e 60 mg/kg i.p), bem como na dor induzida por

estímulos térmicos (10, 30 e 60 mg/kg i.p). Administrados por via oral ou

pela via intraperitoneal ambos demonstraram ação prolongada, outro

resultado importante foi que o AMB mostrou-se efetivo em reverter

processos hiperalgésicos, sugerindo ação sobre a dor neuropática.

O AMB foi estudado em vários modelos indutores de dor por Antonialli

(2009), utilizando modelos de hipernocicepção inflamatória e neuropática,

modelos de hipernocicepção induzida por carragenina, adjuvante completo

de Freund, modelo de dor neuropática induzida pela constrição parcial do

nervo ciático, entre outros. Os resultados encontrados neste estudo

demonstraram que o AMB, administrado oralmente nas doses de 3 a 30

mg/kg inibiram a hipernocicepção mecânica induzida pela carragenina e a

sensibilização desenvolvida na pata contralateral de animais injetados com

adjuvante completo de Freund, e reverteram também as respostas

hipernociceptivas (mecânica e térmica) dos animais submetidos pela

constrição parcial do nervo ciático.

40

Os extratos etanólicos das folhas/caules/frutos da R. ferruginea foram

avaliados quanto à atividade anticolinesterásica através do ensaio

bioautográfico, demonstrando inibição da acetilcolinesterase na concentração

de 80 µg. As substâncias isoladas também foram testadas e foi observada a

inibição da acetilcolinesterase para o AMA e AMB nas concentrações de até

8 µg e 2 µg respectivamente (GAZZONI, 2009).

O extrato seco e mole das cascas da R. ferruginea foram padronizados

e a atividade antinociceptiva in vivo foi avaliada por Baccarin (2010), no

modelo da formalina. Nos ensaios farmacológicos foi verificado que as doses

(500 mg/kg) de extrato mole e (60 mg/kg) de extrato seco, obtiveram os

melhores resultados para a dor inflamatória do que para a dor neurogênica e

a v.o mostrou ser mais efetiva do que a via i.p.

Tomio (2011) avaliou a atividade citotóxica do extrato etanólico de

cascas de R. ferruginea, compostos isolados AMA, AMB, AMC (ácido

mirsinoico C) e derivados N-etil-mirinamida B, N-butil-mircinamida B, N-

hexilmircinamida B e N-buodecil-mircinamida, através da microscopia de

fluorescência para identificação dos processos de morte celular apoptóticos

ou necróticos. Tanto o extrato etanólico das cascas de R. ferruginea quanto

os compostos isolados apresentaram limitada toxicidade, com necrose e

apoptose em linhagem celular B16F10. O AMB apresentou atividade

citotóxica nas linhagens celulares K562 e NALM6, mostrando acentuada

redução na viabilidade celular após 48 horas de tratamento com 27,93 e 279

µM deste composto quando comparado com o paclitaxel.

Bella Cruz et al. (2013) avaliaram os extratos das cascas do caule,

ramos, folhas, frutos e seus compostos in vitro contra bactérias e leveduras.

Para avaliação do potencial tóxico foi utilizado o teste com Artemia salina e

de fibroblastos murino (células L929) e para o teste de genotoxicidade foi

utilizado a levedura Saccharomyces cerevisiae (haploides tipo selvagem). Os

compostos AMA e AMB apresentaram atividade antibacteriana significativa

contra Staphylococcus aureus (concentração inibitória minina - MIC de 31,25

μg/mL para ambos) e para o Bacillus subtilis apresentaram um MIC de 7,81

e 62,5 μg/mL, para o AMA e AMB, respectivamente, quando analisados pelo

método de ágar-diluição. Foi observado que os compostos AMA e AMB

apresentaram potencial tóxico moderado frente à Artemia salina, e não

apresentaram atividade citotóxica em fibroblastos L929 e também não foram

mutagênicos em S. cerevisiae.

41

A atividade antimicrobiana do AMA isolado da planta Myrsine coriacea

(Primulaceae) e de dois derivados semi-sinteticos foram testados frente à

Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella enterica subsp. Enterica

serovar typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,

Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Candida albicans, Candida

krusei e Candida tropicalis pelo método de microdiluição onde foi

determinada o MIC. O AMA não mostrou atividade contra os micro-

organismos selecionados, mas os derivados hidrogenados e acetilados foram

ativos contra B. subtilis, E. coli, S. Aureus e P. aeruginosa (BURGER et al.,

2015). Ao comparar os resultados dos estudos de Bella Cruz et al. (2013) e

Burger et al. (2015) percebeu-se que houve divergência nos resultados com

relação a atividade antimicrobiana do AMA contra os micro-organismos

testados. Isto se deve provavelmente às diferentes técnicas utilizadas.

Estudos realizados por Goes et al. (2016), demonstraram que dentre as

espécies vegetais pesquisadas para determinação da atividade antioxidante

destacou-se o extrato mole preparado com as cascas de R. ferruginea O

potencial antioxidante avaliado pelos métodos de DPPH (1,1-difenil-2-

picrilhidrazina), ABTS+ (2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin)-6-ácido

sulfônico), FRAP (Poder Antioxidante de Redução do Ferro), com EC50 de

384,78 ± 9,27, 497,00 ± 15,00 e 171,37 ± 0,96 µg/mL, respectivamente. Este

extrato apresentou também os melhores resultados de atividade de proteção

avaliada pelo sistema β-caroteno/ácido linoleico na concentração de 350,33

µg/mL com 62,31% da inibição da oxidação do ácido linoleico.

Baccarin et al. (2014) otimizaram a obtenção do extrato hidroalcoólico

das cascas e caule da R. ferruginea através do desenho fatorial 33 onde os

parâmetros avaliados foram a concentração do etanol (50, 70 e 90 % v/v),

tempo de extração (2, 6 e 10 h) tamanho da partícula da droga vegetal (0,25,

0,50 e 1,0 mm). Os resultados indicaram que o etanol a 90 % v/v e o tempo

de extração de 2 h representaram as melhores condições para obtenção do

extrato padronizado de R. ferruginea.

Estudos analíticos permitiram desenvolver metodologia para análise

quali e quantitativa dos extratos e de produtos obtidos a partir dos frutos e das

cascas de R. ferruginea tendo como marcadores os ácidos AMA e AMB. O

método gradiente por CLAE permitiu uma boa separação cromatográfica,

sendo específico, linear, preciso, sensível e exato para a determinação de

AMA e AMB nos extratos etanólicos 90 °GL dos frutos e cascas de R.

42

ferruginea, bem como nas nanoemulsões contendo estes marcadores

(ZERMINIANI et al., 2015).

De acordo com os estudos de pré-formulação realizados por Zerminiani

et al. (2015), o AMA é muito pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (0,1

a 1 mg/mL) e o AMB é pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (1 a 10

mg/mL). Ambos são praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL),

constatando-se que estes compostos possuem maior solubilidade em

solventes menos polares. O AMA e AMB apresentaram pKa e coeficiente de

partição (log P) de 4,5 e 3,30; 4,8 e 3,22, respectivamente.

Dal Mas et al. (2015), desenvolveram nanoemulsões contendo extrato

bruto das cascas de R. ferruginea pelo método de edema de orelha induzido

pelo óleo de cróton. Nas concentrações de extrato nas nanoemulsões de 0,13

% e 0,25 %, houve a inibição de 90,50 % e 64,98 % do edema,

respectivamente, e para o creme convencional as inibições para as mesmas

concentrações de extrato foram de 56,53 % e 58,64 %, respectivamente. O

efeito anti-inflamatório do extrato incorporado nas NE foi superior ao

encontrado para o creme convencional demonstrando que as nanoemulsões

proporcionam otimização da atividade biológica e provavelmente está

relacionada com o aumento da solubilidade e disponibilidade dos

constituintes químicos do extrato.

Nanoemulsões contendo o extrato bruto dos frutos da R. ferruginea

foram avaliadas quanto à atividade antinociceptiva em animais nas doses de

10, 50 e 100 mg/kg, mas apenas as doses de 50 e 100 mg/kg inibiram o

processo doloroso induzido por ácido acético em 44,81% e 61,2%,

respectivamente (XAVIER, 2015).

Cechetto (2016) investigou a atividade anti-inflamatória in vivo do

extrato bruto dos frutos da R. ferruginea e de nanoemulsões contendo o

mesmo extrato utilizando o modelo de bolsa de ar. As nanoemulsões

demonstraram redução do número total de leucócitos migrados para a

cavidade formada no modelo de bolsa de ar nas doses de 3, 30 e 100 mg/kg

enquanto o extrato apresentou melhor efeito na dose de 300 mg/kg,

mostrando que as preparações de nanoemulsões apresentaram maior

atividade inibitória da migração de leucócitos quando comparadas com o

extrato, novamente comprovando o efeito do sistema nanométrico na

atividade biológica de extatos vegetais.

43

CAPÍTULO III

Desenvolvimento de micropartículas de quitosana contendo

extrato das cascas de Rapanea ferruginea e avaliação da

atividade anti-inflamatória oral

45

Desenvolvimento de micropartículas de quitosana contendo

extrato das cascas de Rapanea ferruginea e avaliação da

atividade anti-inflamatória oral

Roseni Bortolon Grassi De Carli; Márcia Maria de Souza; Angela Malheiros;

Ruth Meri Lucinda-Silva

1 Introdução

A Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) é uma árvore encontrada em

vários estados brasileiros e também em outros países como Bolívia, México,

Argentina, Paraguai e Uruguai (BACCARIN et al., 2014; COSTA, 2011).

Derivados vegetais das cascas e frutos têm apresentado potencial aplicação

como fonte de fitoderivados para uso terapêutico. O extrato bruto das cascas

de R. ferruginea e o ácido mirsinoico B (AMB), principal componente

isolado do extrato, apresentaram atividade antinocipectiva, anti-

hiperalgésica, anti-inflamatória em vários modelos animais (BACCARIN et

al., 2016; DAL MAS et al., 2016; GALVAN, 2007; HESS et al., 2010).

Estudos tecnológicos de desenvolvimento e padronização do processo

de extração e obtenção dos extratos mole e seco por spray-drying das cascas

foram conduzidos por Baccarin et al. (2014). Os extratos apresentaram efeito

anti-inflamatório e antinociceptivo em modelo farmacológico in vivo

(BACCARIN et al., 2016). Para análise quali e quantitativa dos derivados

vegetais das cascas, Baccarin et al. (2011) e Zermiani et al. (2015)

desenvolveram metodologia por CLAE usando o AMB e o ácido mirsinoico

A (AMA) como marcadores. Estudos de pré-formulação destes ácidos

demonstraram que estes compostos possuem baixa solubilidade em meio

aquoso, sendo classificados como praticamente insolúveis em água (< 0,50

mg/mL). Os compostos AMA e AMB possuem valor de coeficiente de

partição (log P) de 3,30 e 3,22, respectivamente, sendo semelhantes aos

valores encontrados para fármacos anti-inflamatórios como indometacina e

naproxeno (ZERMIANI et al., 2016). Considerando a solubilidade e o valor

de log P dos marcadores do extrato das cascas de R. ferruginea, estes possuem

características semelhantes ao dos fármacos de classe II do sistema de

classificação biofarmacêutica, podendo a biodisponibilidade ser otimizada

pelo aumento da solubilidade do extrato.

46

O desenvolvimento de sistemas micro e nanoestruturados para

compostos derivados de plantas medicinais cresceram nos últimos anos

(BIDONE et al., 2014). As micropartículas (MP) poliméricas têm elevada

eficácia como carreadores de princípios ativos, pois melhoram a estabilidade

do IFA, atuam como matriz polimérica para dispersão do insumo

farmacêutico ativo (IFA) e consequente aumenta a solubilidade, além de

promoverem a liberação modificada dependendo do material de revestimento

ou formação de matriz. Propriedades como diâmetro e distribuição de

tamanho, morfologia e proporção fármaco:polímero podem influenciar

diretamente a biodisponibilidade do IFA e, por consequência, sua eficácia e

segurança. Normalmente os diâmetros das MP são de 10-200 μm. Partículas

com diâmetro < 10 μm podem ser fagocitadas e > 200 μm podem causar uma

resposta imune e inflamação (HAN et al., 2016). Na obtenção de MP como sistema terapêutico são empregados

geralmente polímeros biodegradáveis (COTA-ARRIOLA et al., 2013;

WISUITIPROT et al., 2011). Dentre estes a quitosana (QS) é muito utilizada

devido às suas propriedades únicas como caráter catiônico, fácil complexação

com contraíons como o tripolifosfato (TPP), levando a reticulação da matriz

polimérica; biocompatibilidade e biodegradabilidade (WISUITIPROT et al.,

2011). É um biopolímero empregado nas áreas farmacêutica, cosmética,

gastronômica, médica, odontológica, biomédica, agricultura e biotecnologia

atuando, por exemplo, como carreadoras de fármacos, DNA ou proteínas,

pela sua capacidade de aumentar a permeabilidade das membranas

(ARAUJO, 2009; BLANCO, 2011; COTA-ARRIOLA et al., 2013;

STULZER et al., 2007) e administração vetorizada de vacinas e fármacos

específicos do cólon (MURA et al., 2011).

Vários métodos são descritos para a preparação de MP de QS, tais como

secagem por atomização, coacervação, gelificação iônica e evaporação do

solvente. Alguns desses métodos possuem algumas limitações, como altas

temperaturas, que podem causar degradação dos agentes ativos, dificuldade

na obtenção das partículas ou baixa taxa de encapsulamento dos ativos

(COTA- ARRIOLA et al., 2013; WISUITIPROT et al., 2011).

O método de obtenção de MP por spray-drying é uma das técnicas mais

utilizadas na indústria farmacêutica. Este método proporciona várias

vantagens quando comparada às demais técnicas de obtenção de MP, por ser

um processo consideravelmente simples e em apenas uma etapa. Em um

único equipamento é possível atomizar, secar e coletar o material em forma

47

de pó. Por ser um processo rápido, evita a degradação dos fármacos e

materiais encapsulados, permitindo a conservação das propriedades do

material após o processo de formação das partículas (SOSNIK;

SEREMETA, 2015).

A partir dos resultados já obtidos da eficácia dos derivados vegetais da

espécie R. ferruginea como anti-inflamatório e antinociceptivo e a potencial

aplicação de sistemas microestruturados como carreadores para derivados

vegetais, o presente estudo realizou o desenvolvimento de MP de quitosana

pelo método de spray-drying como carreador farmacêutico para o extrato

bruto das cascas de R. ferruginea e biomonitoramento do potencial anti-

inflamatório por via oral in vivo do produto desenvolvido.

2 Material e Métodos

2.1 Material

A quitosana (QS) com peso molecular médio, viscosidade de 200-800

mPa.s (dispersão a 1% em ácido acético 1%, a 25ºC) e grau de desacetilação

de 72,45% foi adquirida da Sigma-Aldrich® (Sto Louis, Missouri, USA); óleo

de rícino etoxilado (Ultramona® RH400) foi adquirido da Oxiteno (São

Paulo, São Paulo, Brasil); os solventes grau HPLC acetonitrila e metanol

foram adquiridos da JTBaker® (Center Valley, Pennsylvania, USA);

propilenoglicol PA foi adquirido da Biotec®(São Paulo, São Paulo, Brasil).

As cascas do caule de R. ferruginea foram coletadas em Blumenau-SC.

A autenticidade botânica foi verificada através da comparação entre a

exsicata da planta coletada com o exemplar depositado no Herbário Barbosa

Rodrigues (Itajaí-SC) sob o código HBR 52715.

2.2 Obtenção e caracterização do extrato mole de Rapanea ferruginea

Para o preparo do extrato mole de Rapanea ferruginea (RF),

inicialmente foi obtida a solução extrativa pelo método de maceração

dinâmica (BACCARIN et al., 2014). Cerca de 200 g de cascas moídas de RF

foram transferidas para um recipiente de vidro e adicionado 1800 mL de

etanol 90% v/v. A mistura foi agitada (agitador mecânico Fisaton®, mod.

713D), por 2 h a 800 rpm. Em seguida, a solução foi filtrada em tecido

48

Sontara®, seguido de filtração em papel filtro, sob vácuo. O solvente foi

evaporado a aproximadamente 40 ºC até a obtenção do extrato mole.

Para a determinação do resíduo seco da solução extrativa de RF, foram

dessecados 3 cadinhos de porcelana em estufa (Fanem®, mod. 315SE) a 105

ºC por 1 h e resfriados por 15 min em dessecador. Os cadinhos de porcelana

vazios após a dessecação foram pesados e em seguida adicionou-se 5 mL da

solução extrativa de RF, a qual foi evaporada em chapa de aquecimento. Após

a evaporação, os cadinhos foram colocados em estufa a 105 ºC por 3 h,

resfriados e pesados. Para o cálculo do resíduo seco em porcentagem foi

usada a equação 1, em que RS é o resíduo seco; mf massa final e mi massa

inicial.

𝑅𝑆= 𝑚𝑓 . 100 (1)

𝑚𝑖

Para a obtenção do resíduo seco do extrato mole de RF realizou-se o

mesmo procedimento descrito para a solução extrativa, porém usando uma

amostra de aproximadamente 100 mg de extrato mole de RF e dessecação em

estufa sem prévia evaporação do solvente.

O teor dos marcadores AMA e AMB no extrato mole foi determinado

usando metodologia desenvolvida e validada por Zermiani et al. (2015). Para

estas análises foi utilizado o cromatógrafo Shimadzu® LC 20-AC, uma

coluna de fase reversa Kinetex XB® C18, 150 x 4,6 mm, contendo partículas

core-shell com tamanho de 2,6 µm como fase estacionária e como fase móvel

os solventes grau HPLC, acetonitrila (ACN), metanol degaseificados e água

ultrapura (ultrapurificador – Purelab Classic) acidificada (pH 2,5) com ácido

fosfórico, filtrada à vácuo com membrana de celulose regenerada com 0,45

µm de porosidade. Para a fase móvel foi utilizado o método gradiente

metanol:ACN:água acidificada, o qual foi programado respectivamente da

seguinte forma: 0-2 min (25:5:70), 2-5 min (25:30:45), 5-10 min (25:60:15),

10-12 min (20:70:10), 12-15 min (15:75:10) e 15-20 min (15:84:1),

retornando à condição inicial até 30 min de análise. O fluxo foi de 0,9

mL/min, volume de injeção de 20 µL à 35 °C.

Para a quantificação do extrato mole de R. ferruginea este foi pesado (1

mg/mL) em duplicata, transferido para um balão volumétrico de 5 mL,

adicionado 3 mL de metanol, sonicado por 1 h e o volume foi completado

49

com metanol. As amostras foram filtradas em filtro de celulose regenerada

de 0,45 µm e analisadas por CLAE.

Os marcadores AMA e AMB foram quantificados em 260 e 270 nm,

respectivamente, usando as equações de reta da regressão linear das curvas

analíticas desenvolvidas por Zermiani et al. (2015) para quantificação dos

marcadores AMA e AMB. A curva do AMA é linear na faixa de concentração

de 1 a 100 µg/mL e com equação da reta y = 28082x – 1880 (r² = 0,9994). A

curva do AMB, com equação da reta y = 51940x + 6217,2 (r² = 0,9996),

também foi linear na faixa de concentração de 1 a 100 µg/mL. O limite de

detecção do AMA foi de 0,05 μg/mL e do AMB 0,01 μg/mL e os limites de

quantificação determinados foram de 0,5 e 0,05 μg/mL para o AMA e AMB,

respectivamente.

2.3 Seleção do agente de dispersão na obtenção das micropartículas de

Rapanea ferruginea usando spray drying

Foram preparados 200 mL de solução de quitosana (QS) a 0,5%, em

água ultrapura acidificada em pH 4,0, usando agitador mecânico a 500 rpm

por 3 h. A dispersão foi filtrada à vácuo usando papel filtro de 8 µm.

Para seleção do adjuvante de dispersão do extrato na disperão de QS,

foram testados três tipos de agentes dispersantes (AD): propilenoglicol,

Tween 80 e RH400. Para este teste premilinar de microencampsulação, o

extrato (RF) foi incorporado na proporção 1:10 RF:QS (m/m em teor de

sólidos). Para aumentar a estabilidade e facilitar a manipulação do extrato

mole, este foi diluído em propilenoglicol em proporção para obter um teor de

sólidos de 12,5% (m/m) e incorporado na dispersão polimérica.

Inicialmente foram preparados três lotes de MP para seleção do agente

de dispersão do extrato mole de RF na solução polimérica de QS, conforme

apresentado no Quadro 1.

50

Quadro 1 - Composição das micropartículas de RF:QS (1:10)

contendo diferentes agentes dispersantes para incorporação

do extrato das cascas de Rapanea ferruginea.

Amostra Agente Dispersante

1 Propilenoglicol 1,0%

Tween 80 1,0%



RH400 0,5%

As MP foram obtidas pela secagem em spray-drying (Buchi® B290),

com pressão de ar de 6 mBar, fluxo do ar comprimido de 473 NL.h-1,

temperatura de entrada 150 ºC, taxa de aspiração de 90%, e fluxo de

alimentação em 4,0 mL/min, em sistema aberto. Após a secagem, as amostras

foram acondicionadas em frascos bem fechados e mantidas em dessecador.

A seleção do AD foi realizada com base nos resultados das análises de

rendimento, granulométrica e morfológica por microscopia eletrônica de

varredura (MEV) (Philips XL 30®).

2.4 Obtenção e otimização das micropartículas contendo Rapanea

ferruginea usando spray drying

Para otimização das variáveis do método de obtenção das MP contendo

extrato de RF foi realizado um planejamento fatorial 23, tendo como fatores

a proporção de RF:QS 5 e 10% (m/m) (1:20 e 1:10, respectivamente),

proporção de propilenoglicol (0,5 e 0,75% (m/m)) e proporção de RH400 (0,0

e 0,5% (m/m)), como descrito no Quadro 2.

As amostras foram preparadas usando 200 mL de dispersão de QS 0,5%

contendo extrato mole diluído de RF (12,5%, em propilenoglicol).

Micropartículas brancas foram preparadas com 200 mL de dispersão de QS

0,5%, usando os dois agentes de dispersão propilenoglicol e RH400. Após

obtenção da dispersão, as amostras foram secas em spray-drying sob as

mesmas condições experimentais descritas no item 2.3.

51

Quadro 2- Planejamento fatorial 23 usado no desenvolvimento das micropartículas de QS:RF usando propilenoglicol e RH 400 como

agentes dispersantes.

Amostras

Fator 1 – Proporção RF:QS Fator 2 –Propilenoglicol Fator 3 – RH400

Nível Proporção

%

Massa

(g)1 Nível Proporção

(%)

Massa

(g) Nível

Proporção

(%)

Massa

(g)

1 1 10 0,1 -1 0,5 1,0 -1 0 0

2 1 10 0,1 1 0,75 1,5 -1 0 0

3 1 10 0,1 -1 0,5 1,0 1 0,5 1,0

4 1 10 0,1 1 0,75 1,5 1 0,5 1,0

5 -1 5,0 0,05 -1 0,5 1,0 -1 0 0

6 -1 5,0 0,05 1 0,75 1,50 -1 0 0

7 -1 5,0 0,05 -1 0,5 1,0 1 0,5 1,0

8 -1 5,0 0,05 1 0,75 1,50 1 0,5 1,0

Nota: RF – extrato de Rapanea ferruginea a 12,5% em propilenglicol; QS – dispersão de quitosana 0,5% 1Quantidade em resíduo seco do extrato a 12,5%. A quantidade de propilenoglicol presente no extrato foi subtraída da quantidade de

propilenoglicol a ser adicionado como agente dispersante (Fator 2).

52

2.5 Caracterização das micropartículas

2.5.1 Análise morfológica por MEV

Para a análise da morfologia e tamanho das amostras das

micropartículas do presente estudo foi utilizado o microscópio eletrônico de

varredura (Philips, XL 30®). As amostras foram mantidas em dessecador com

pentóxido de fósforo por 3 dias. Para a análise, as amostras foram depositadas

sobre uma fita dupla face em suporte metálico e posteriormente recoberta

com ouro coloidal.

2.5.2 Análise de tamanho

A partir das fotomicrografias de MEV, a distribuição de tamanho foi

determinada usando o software Size Meter 1.1. Os resultados foram

representados pelo histograma de distribuição de tamanho e frequência. O

tamanho médio e o desvio padrão foram calculados e representados em

unidades Probit (AMONZA, 2001).

2.5.3 Perfil de absorção no Infravermelho (IV)

Para as análises no IV utilizou-se o espectroscópio de IV médio com

transformada de Fourier e refletância difusa (DRIFTS) (Shimadzu Prestige-

21 DRS-8000). A amostra foi misturada com brometo de potássio (KBr) em

gral de vidro e transferida para um suporte metálico até formação de uma

pastilha e submetido à análise.

2.5.4 Teor e eficiência de encapsulação

As análises do teor e eficiência de encapsulação dos marcadores

químicos do extrato mole AMA e AMB foram realizadas com o auxílio da

acadêmica do Curso de Farmácia Ana Gon.

Para a determinação do teor dos marcadores AMA e AMB das

micropartículas de QS contendo RF e da eficiência de encapsulação, a massa

de micropartículas teórica corresponde à 5 mg de extrato de R. ferruginea foi

pesada diretamente em balão volumétrico de 5 mL, resultando em uma

solução com concentração teórica de extrato de 1 mg/mL. Foi adicionado 3

mL de metanol, sonicado por 1 h e em seguida, o volume foi completado para

5 mL com metanol. As amostras foram filtradas em filtro de celulose

regenerada de 0,45 µm e analisadas por CLAE, de acordo com a metodologia

descrita no item 2.2. As amostras foram preparadas em duplicata.

53

A partir da concentração dos marcadores AMA e AMB na solução

amostra, o teor de encapsulação (TE) e a eficiência de encapsulação (EE)

foram calculadas usando as equações 2 e 3, respectivamente.

𝑇𝐸% = (𝐶 . 𝑉

𝑚𝑀𝑃) . 100

(2)

Onde:

TE% = Teor de encapsulação em % m/m

C = concentração de AMA ou AMB em µg/mL, calculado a partir da curva

analítica dos marcadores.

V = volume de diluição da amostra (5 mL)

MMP = massa de micropartículas contendo extrato usado na análise (aprox.

30 mg).

𝐸𝐸% = (𝐶1 . 𝑉

𝑇𝑡 . 𝑇𝐸𝑀 . 𝑚𝑀𝑃) . 100

(3)

Onde:

EE% = Eficiência de encapsulação em % m/m

C1 = concentração de AMA ou AMB na amostra µg/mL, calculado a partir

da curva analítica dos marcadores;

V = volume de diluição da amostra (5 mL);

Tt = Teor teórico de extrato de R. ferruginea na micropartícula (mg/g),

calculado com base na quantidade de extrato e de sólidos totais presentes na

formulação;

TEM = teor do marcador AMA ou AMB no extrato de R. ferruginea (µg/mg)

mMP = massa de micropartículas contendo extrato usada na análise em g

(aprox. 0,030 g).

2.6 Determinação do Perfil de Dissolução

2.6.1 Seleção do meio de dissolução

Como meio de dissolução das MP de QS contendo RF foram testados

meios aquosos contendo lauril sulfato de sódio (LSS) 2,0, 3,0, 4,0 ou 5,0%

ou polissorbato 80 (Tween® 80) a 1,0 e 2,0%. Para estes testes inicialmente

54

pesou-se 0,8 g do extrato mole de RF (diluída à 12,5% em propilenoglicol) e

adicionou-se 500 mL de cada meio. O estudo foi realizado usando aparelho

de dissolução (Erweka DT 80), a 37 °C, 75 rpm por 48 h. Foi realizada uma

única coleta de amostra ao final do ensaio e quantificada por CLAE usando

metodologia descrita no item 2.2.

2.6.2 Ensaio de dissolução das micropartículas

Para análise do perfil de dissolução dos marcadores químicos do extrato

incorporado nas MP, as amostras foram pesadas (o peso de cada amostra foi

calculado com relação à proporção de AMB nas MP) e transferidas para saco

de diálise e fixadas na haste do dissolutor (Figura 1). O volume do meio de

dissolução foi de 30 mL, o qual foi adicionado em tubos de ensaio adaptados

à cuba de dissolução. O estudo foi realizado à temperatura de 37 °C e a 75

rpm. Os tempos de coleta foram de 30 min, 1, 3, 6, 12 e 24 h. Em cada coleta

foi retirado 1 mL do meio através de uma cânula adaptada a uma seringa de

insulina de 1 mL e com reposição do volume. As amostras foram

quantificadas por CLAE usando a metodologia descrita no item 2.2. O perfil

de dissolução foi calculado em relação ao teor do AMB e AMA nas amostras.

Figura 1 – Adaptação da cuba de dissolução. Aparato modificado para

conter 30 mL de meio de dissolução. Amostra ficou retida dentro do saco

de diálise na haste do dissolutor.

2.6.3 Análise do mecanismo de liberação

A cinética de liberação dos marcadores químicos AMA e AMB foi

realizada utilizando os modelos matemáticos de ordem zero, primeira ordem,

Higuchi e Korsmeyer e Peppas, segundo as equações de ordem zero (Qt = Q0

+ K0t), primeira ordem (lnQt = lnQ0 + K1t), Higuchi (Qt = KH √t) e Korsmeyer-

Peppas (Qt =Qo+ Kk tn) (DASH et al., 2010).

Haste

Cuba

Tubo de ensaio

Saco de diálise

contendo a amostra

Ependorf

55

2.7 Avaliação da bioadesão em modelo ex vivo

A bioadesão do extrato mole de R. ferruginea e das MP de quitosana

contendo R. ferruginea foram avaliadas pelo método de bioadesão ex vivo

usando o modelo de saco invertido, com algumas modificações

(FUNDUEANU et al., 2007). O procedimento foi realizado com a

colaboração da Dra. Thaisa Baccarin.

Após eutanásia por deslocamento cervical, o intestino delgado de ratos

machos Swiss Webster foi lavado com tampão fosfato isotônico, contendo 2

mg/mL de glicose, com um pH 7,2, os quais foram mantidos a 4 °C por 12 h.

Em seguida uma porção de 4,0 cm do segmento do intestino foi invertida com

auxílio de uma alça metálica com uma ponta cônica e suavemente lavada com

o tampão fosfato. Uma das extremidades do intestino foi amarrada e em

seguida pela extremidade oposta foram introduzidos 500 µL de tampão

fosfato para preencher o intestino, em seguida foi amarrada a extremidade

que se encontrava aberta. Este sistema foi colocado e fixado dentro do bequer

contendo 5 mL de tampão fosfato e a quantidade equivalente a 5 mg/mL de

extrato mole de R. ferruginea a 12,5%. O mesmo procedimento foi realizado

para as MP de quitosana contendo R. ferruginea e propilenoglicol e MP de

quitosana contendo R. ferruginea e proplienoglicol + RH400. A seguir os

sistemas foram mantidos em agitação orbital (200 rpm) por 3 h a 25 °C.

Posteriormente os intestinos foram retirados dos frascos e a solução tampão

contendo extrato mole de R. ferruginea e as MP restantes no recipiente foram

levadas a estufa (35 ± 3 °C), até peso constante. A porcentagem de bioadesão

das amostras foi calculado usando a equação 4. As análises foram realizadas

em 5 replicatas.

𝐵𝑖𝑜𝑎𝑑𝑒𝑠ã𝑜 (%) = [1 − (𝑚2

𝑚1)] . 100 (4)

Onde:

m1 = massa residual da amostra após retirada do intestino e dessecação;

m2 = massa de amostra usada na análise.

56

2.8 Avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo

Para avaliar a atividade anti-inflamatória oral in vivo do extrato mole de

R. ferruginea e dos sistemas microparticulados (amostras 2 e 4) foi utilizado

o modelo de dor induzido pela formalina. Os ensaios foram realizados com a

colaboração da Profª. Drª. Márcia Maria de Souza.

2.8.1 Animais

Antes dos experimentos os animais foram mantidos durante três dias para

ambientação no biotério do laboratório de farmacologia (sala 209, bloco F6)

em caixas de polipropileno de 41 cm x 34 cm com no máximo 10 animais.

Nas caixas-moradia, no período de adaptação que antecede aos testes, foi

acrescentado enriquecimento ambiental com intuito de diminuir o estresse. A

maravalha foi trocada a cada 2 dias e tinham ração e água ad libitum. As salas

foram mantidas com controle de temperatura (22-25 oC), umidade constante

(60%) e em ciclos controlados claro/escuro de 12 h cada), conforme

procedimento do laboratório. No dia do teste, os animais foram levados para

a sala de teste para adaptação por um período de 1 h, antes do início dos

mesmos.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios

éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de

Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O projeto foi aprovado

pelo CEUA/UNIVALI (parecer nº 020/16p), conforme Anexo A.

2.8.2 Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória oral

As amostras analisadas (extrato mole e MP) foram administradas em

quantidade equivalente a 50, 150 e 300 mg/kg de extrato seco de R.

ferruginea, em dose única, por via oral e, 60 min após, os animais receberam

uma injeção de 20 μL de formalina a 2,5% (0,92% de formaldeído) em salina

estéril na região subplantar da pata posterior direita. Os animais controle

negativo receberam 10 mL/kg de salina (v.o) e os animais controle positivo

receberam o fármaco padrão diclofenaco 10 mg/kg (v.o). O ensaio foi

realizado também usando as MP brancas, sem o extrato de R. ferruginea.

Após a injeção de formalina, os animais foram colocados,

individualmente, sob um funil de vidro circundado por espelhos para facilitar

a observação do comportamento. O tempo em que o animal permaneceu

mordendo a pata injetada com formalina foi cronometrado e considerado

57

como indicativo de dor. Foram cronometrados inicialmente os primeiros 5

min após a injeção (período correspondente à dor neurogênica), em seguida

10 min e contados os próximos 15 min (correspondente a dor inflamatória).

Ao final do tempo de observação os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical, às patas posteriores cortadas na junção tíbio-tarsal e

pesadas em balança analítica para quantificação do edema induzido pela

formalina. A diferença de peso, entre a pata direita e a esquerda foi

considerada como índice de edema (DE SOUZA et al., 2003; BACCARIN et

al., 2016).

Não foram administrados analgésicos nos animais, pois um dos

objetivos do trabalho foi avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório

dos produtos a serem testados. A eutanásia foi feita por deslocamento cervical

uma vez que imediatamente após os experimentos foi quantificado o edema.

2.8.3 Análise estatística dos dados

Para avaliar a atividade anti-inflamatória oral do extrato mole de R.

ferruginea e dos sistemas microparticulados in vivo os resultados foram

submetidos à análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de múltipla

comparação utilizando-se o método de Dunnett, empregando os softwares

Instat e GraphPad Prisma versão 4.0. Os resultados foram apresentados como

a média ± erro padrão da média para cada grupo de experimentos. Os valores

de p<0,05 foram considerados indicativos de significância.

3 Resultados e Discussão

3.1 Obtenção do extrato mole de Rapanea ferruginea

A partir de 200 g da droga vegetal foram obtidos 1400 mL de solução

extrativa de RF (1:7) com resíduo seco de 0,74 ± 0,005%. A solução extrativa

foi concentrada e obtido 10,1281 g de extrato mole (1:0,05) com resíduo seco

de 73,64 ± 9,83%. Para realização dos estudos de microencapsulação do

extrato mole de RF foi preparado uma dispersão deste em propilenoglicol a

12,5% (m/m) a fim de viabilizar a incorporação do extrato na dispersão

aquosa de quitosana e também, pela instabilidade física observada para o

extrato. O extrato mole armazenado em frasco de vidro fechado, sob

refrigeração, aumenta sua consistência e reduz sua solubilidade,

58

inviabilizando o seu manuseio. Foi escolhido o propilenoglicol como agente

dispersante por suas características umectante e solubilizante em formulações

farmacêuticas e cosméticas e também por ser um dos agentes de dispersão

utilizado nas formulações das micropartículas.

O teor dos marcadores AMA e AMB na solução extrativa é de 60,73 e

91,9 mg/g de resíduo seco, e no extrato mole de 47,92 e 74,99 mg/g,

respectivamente. A Figura 2 apresenta o perfil cromatográfico do extrato

mole das cascas de R. ferruginea. Os tempos de retenção dos marcadores no

presente estudo foram de 16,245 e 15,824 min para o AMA e AMB,

respectivamente. O perfil cromatográfico e os respectivos tempos de retenção

dos marcadores AMA e AMB mostraram-se semelhantes aos descritos por

Zermiani et al. (2015).

Figura 2 - Perfil cromatográfico do extrato mole de RF (1 mg/mL) em

270 nm

Analisando os estudos desenvolvidos com soluções extrativas de R.

ferruginea, os resultados encontrados neste estudo são semelhantes aos

obtidos por Baccarin et al. (2014), em que o resíduo seco da solução extrativa

foi de 0,70 ± 0,037%. Enquanto, Dal Mas (2015) obteve um resíduo seco de

0,48 ± 0,02% empregando a mesma metodologia de extração. A diferença

dos resultados de resíduo seco pode estar relacionada com a altura do caule e

espessura da casca. Com relação ao teor dos marcadores, Baccarin et al.

(2014) obteve 79,48 mg/g de teor de AMB, Dal Mas (2015) obteve 42,14

mg/g e 36,88 mg/g de AMA e AMB, respectivamente e Zermiani et al. (2015)

no ensaio de repetibilidade do método analítico gradiente (validação

analítica) encontrou no extrato etanólico das cascas de R. ferruginea na

diluição de 1:5 em metanol 54,38 ± 0,41 mg/g e 30,98 ± 0,43 mg/g, de AMA

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000mAU

270nm,4nm (1.00)

AMB

AMA

59

e AMB respectivamente. Em todos os estudos o teor dos marcadores foi

menor que o obtido no presente estudo.

3.2 Obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea usando spray

drying

Nos estudos de desenvolvimento das MP de QS contendo extrato de RF,

inicialmente foram testados diferentes agentes de dispersão do extrato para

incorporação na solução de QS. O extrato de RF possui baixa solubilidade

em meio aquoso, o que dificulta sua dispersão sem auxílio de adjuvante.

Foram testados três tipos de AD: propilenoglicol, Tween® 80 e RH400.

Para este teste premilinar de microencapsulação, o extrato (RF) foi

incorporado na proporção de 10% RF:QS (1:10 m/m em teor de sólidos) e foi

analisada a influência do tipo de AD no rendimento e na morfologia das MP.

O rendimento obtido na secagem de 200 mL das dispersões com os três

dispersantes está descrito na tabela 1.

Tabela 1 – Resultado do rendimento das MP de RF:QS (1:10)

diferentes agentes dispersantes.

Amostra Dispersante Rendimento

g (%)


Tween 80 1,0% 1,424 12,08

2 Propilenoglicol 1,0% 0,749 33,92


RH400 0,5% 1,163 22,42

As amostras 1 e 3, que continham tensoativo não iônico Tween® 80 e

RH 400, respectivamente, apresentaram menor rendimento em comparação

ao lote 2, que continha apenas o propilenoglicol como agente dispersante. Os

tensoativos são incorporados em formulações a fim de reduzir a tensão

superficial da solução, melhorar a molhabilidade e a plasticidade. Segundo

Vieira et al. (2013) os tensoativos não iônicos apresentam um efeito sinérgico

sobre a plasticidade de polióis como glicerina e propilenoglicol, porém os

polióis são menos voláteis que os tensoativos não iônicos, o que

provavelmente influenciou no rendimento das micropartículas.

60

Há vários relatos na literatura que quando se utiliza a QS como polímero

para a formação de MP por spray drying é observado baixo rendimento, isto

porque quando as gotículas da solução polimérica são pulverizadas na câmara

de secagem, elas entram em contato com a parede do equipamento e formam

um filme que fica fortemente aderido, reduzindo o rendimento das

micropartículas. Apesar do baixo rendimento, o método de secagem por

pulverização foi escolhido por apresentar várias vantagens, como

simplicidade de operação, boa reprodutibilidade de lote para lote, facilidade

de aumento de escala. E em grandes escalas de produção, essa perda de

material pode ser menos significativa do que em pequena escala devido a

maior quantidade de produto, portanto a formação do filme não influenciaria

no rendimento final de maneira tão significante (GELFUSO et al., 2011).

Corrigan et al. (2006) ao desenvolveram MP contendo salbutamol

obtidos por spray drying usando concentrações variáveis de QS (0,5 a 2,0%

m/v) observaram que a concentração de 0,5% m/v foi a concentração ideal

frente aos parâmetros de eficiência de encapsulação e perfil de liberação do

fármaco.

As micrografias das MP estão apresentadas na Figura 3. As MP

preparadas apresentaram forma esférica, com a superfície e rugosidade sendo

influenciadas pela composição. MP com a mistura Tween® 80 e

propilenoglicol como dispersantes apresentaram superfície lisa com

deformações (Figura 3A), aspecto este semelhante ao das MP preparadas com

propilenoglicol e RH400 (Figura 3C). As partículas preparadas usando

apenas o propilenoglicol como agente dispersante (Figura 3B) apresentaram

forma esférica, porém mais rugosa quando comparado com as MP contendo

tensoativo. Observou-se que a matriz de QS foi influenciada pela adição dos

tensoativos não iônicos aumentando sua plasticidade e resultando em

matrizes mais homogêneas. Os resultados demonstraram a influência do tipo

de agente dispersante principalmente sobre a morfologia das MP.

61

Figura 3 – Fotomicrografia por MEV das MP de RF:QS (1:10) contendo como

agentes de dispersão propilenoglicol e Tween® 80 (A); propilenoglicol (B) e

propilenoglicol e RH400 (C). Aumento de 5.000x.

Após análise das MP obtidas, foram selecionados o propilenoglicol e

associação de propilenoglicol com RH400 como agentes dispersantes para

prosseguir com o desenvolvimento das MP de RF:QS.

3.3 Otimização da obtenção das micropartículas de Rapanea ferruginea

usando spray dryer

No desenvolvimento da MP de RF:QS foi empregado um planejamento

fatorial 23 para otimização da composição e verificar quais fatores teriam

maior influência na obtenção das MP, sendo eles proporção de RF:QS 5 e

10% m/m (1:20 e 1:10, respectivamente), proporção de propilenoglicol (0,5

e 0,75% m/m) e proporção de RH400 (0,0 e 0,5% m/m).

Para análise da influência dos fatores estudados nas propriedades físicas

e físico-químicas das partículas, estas foram caracterizadas quanto ao

rendimento, morfologia, tamanho médio, teor dos marcadores (AMA e

AMB), eficiência de encapsulação e perfil qualitativo de absorção no

infravermelho.

(A) (B)

(C)

62

Os resultados do rendimento e do tamanho das MP de QS contendo

extrato de R. ferruginea obtido na secagem por spray dryer estão descritos na

tabela 2. Os valores variaram entre 14 e 60%. A análise estatística do

rendimento frente aos fatores estudados no planejamento fatorial mostrou que

somente a proporção de RH400 apresentou influência estatisticamente

significativa (p = 0,019). O valor de p foi de 0,902 para a proporção RF:QS,

enquanto para o fator proporção de propilenoglicol foi de 0,486,

demonstrando que estes fatores não apresentaram uma influência

significativa sobre o rendimento das MP nas proporções estudadas.

O efeito dos fatores estudados sobre o rendimento das MP também pode

ser visualizado na Figura 4. A resposta mais intensa obtida foi para a

proporção de RH400. A inclusão deste tensoativo aumentou de forma

significativa o rendimento.

Tabela 2 – Resultado do rendimento e do tamanho médio das MP de QS contendo

extrato de R. ferruginea preparadas por spray dryer e usando diferentes

proporções extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH 400

(planejamento fatorial 23).

Amostras RF:QS

(%)

PPG

(%)

RH400

(%)

Rendimento

(%)

Tamanho

(µm)

1 10 0,5 0 26,66 1,648 ± 1,195

2 10 0,75 0 14,47 1,697 ± 0,823

3 10 0,5 0,5 30,30 1,218 ± 0,610

4 10 0,75 0,5 58,43 1,215 ± 0,622

5 5 0,5 0 21,77 2,047 ± 0,915

6 5 0,75 0 19,27 1,583 ± 1,35

7 5 0,5 0,5 35,85 1,811 ± 1,446

8 5 0,75 0,5 59,73 1,628 ± 0,402

Nota: RF – extrato de Rapanea ferrugínea a 12,5% em propilenglicol; QS –

dispersão de quitosana 0,5%; PPG – Propilenoglicol.

Resultados expressos em média ± desvio padrão.

Na análise da interação dos fatores estudados, a maior interação foi

observada entre o PPG e o RH400. O aumento da concentração de PPG e a

adição do tensoativo não-iônico RH400 aumentou significativamente o

rendimento das MP, como apresentado na Figura 5. A amostra 6 preparada

com 5% RF:QS e 0,75% de PPG teve um rendimento de 19,27%, enquanto a

63

amostra 8 preparada com estes mesmo componentes porém com a adição de

0,5% de RH400 teve um rendimento de 59,73%. A influência do tensoativo

não-iônico RH400 no rendimento está relacionada com a sua capacidade de

aumentar a dispersibilidade do extrato na dispersão polimérica, influenciando

a homogeneidade da amostra e, provavelmente, no seu rendimento de

secagem.

Figura 4 - Gráfico dos efeitos principais dos fatores proporção extrato:quitosana

(RF:QS), de propilenoglicol (PPG) e de RH400 sobre o rendimento das

micropartículas de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).

Figura 5 - Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção

extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre o rendimento das

MP de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).

64

3.3.1 Análise morfológica e granulométrica

As MP foram caracterizadas quanto à morfologia usando MEV. As

fotomicrografias das MP de QS contendo extrato de RF são apresentadas nas

Figuras 6 e 7. A partir das fotomicrografias foi determinada a distribuição de

tamanho das MP (Figura 8).

As amostras 1 e 2 (Figura 6) foram preparadas com proporção RF:QS

1:10 (10%) e usando somente propilenoglicol como dispersante. Nestas duas

amostras, as MP apresentaram morfologia semelhante com forma esférica,

superfície rugosa e diâmetro médio de 1,648 e 1,697 µm, respectivamente.

A morfologia das MP (amostras 3 e 4) contendo o PPG e o RH400 como

dispersantes e com proporção RF:QS 1:10 foi apresentada na Figura 6. As

MP apresentaram forma esférica, superfície lisa com algumas deformações e

diâmetro de 1,218 e 1,215 µm, respectivamente.

A morfologia das MP preparadas com a proporção RF:QS 1:20 (5%) foi

apresentada na Figura 7 (amostras 5 a 8). As MP apresentaram morfologia

semelhante à das partículas preparadas com proporção 1:10.

O tamanho médio foi de 1,583 µm (amostra 6) a 2,047 µm (amostra 5),

conforme apresentado na Tabela 2.

65

Figura 6 - Fotomicrografia por MEV das MP de QS:RF (amostras 1 a 4). Aumento

de 5.000 e 10.000x.

1

2

3

4

66

Figura 7 - Fotomicrografia por MEV das MP de RF:QS (amostras 5 a 8). Aumento

de 5.000 e 10.000x.

5

6

7

8

67

A morfologia das MP foi influenciada pela presença do tensoativo não-

iônico RH400. As partículas sem o tensoativo apresentam superfície rugosa,

enquanto micropartículas contendo o tensoativo apresentaram superfície lisa,

devido à plasticidade do tensoativo.

Figura 8 – Histograma representativo de distribuição de tamanho e frequência das

amostras de MP de quitosana contendo extrato de Rapanea ferruginea.

Na análise estatística dos resultados, os fatores e os respectivos níveis

estudados não apresentaram influência significativa sobre o tamanho médio

das MP (valores de p > 0,093). Conforme apresentado na Figura 9, na análise

de interação entre os fatores, o aumento da proporção de extrato nas partículas

reduziu o tamanho, principalmente quando a concentração de PPG foi de

0,5% e na presença de RH400. A adição do tensoativo não-iônico, além de

resultar em partículas de superfície lisa, também levou a obtenção de

partículas com menor diâmetro, mostrando assim a influência favorável do

tensoativo na composição das MP.

68

Figura 9. Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção extrato:quitosana

(RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre o tamanho médio das MP de QS

contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).

3.3.2 Teor e eficiência de encapsulação

Na análise do teor de encapsulação do extrato de R. ferruginea nas MP

de QS foi empregada a quantificação dos marcadores AMA e AMB.

Inicialmente, foi verificado a seletividade do método para quantificação dos

marcadores quando incorporados nas MP. Conforme apresentado nas figuras

10 e 11, as MP brancas (sem extrato) não apresentam picos que possam

interferir na quantificação dos ácidos mirsinoicos AMA e AMB. A matriz

polimérica também não influenciou no tempo de retenção dos marcadores

AMA e AMB. Portanto, na determinação do teor e eficiência de encapsulação

do extrato nas MP de QS foi empregada a mesma metodologia analítica

desenvolvida para quantificação dos marcadores em amostras de extrato

mole.

A partir da quantificação das amostras por CLAE, foi determinado o

teor de encapsulação de AMA, AMB e do extrato (a partir do teor de AMB),

assim como, a eficiência de encapsulação. Na tabela 3 estão demonstrados os

resultados de teor e eficiência de encapsulação dos oito lotes de MP.

69

Figura 10 – Sobreposição do perfil cromatográfico das MP de RF contendo AD

propilenoglicol e das MP brancas contendo AD propilenoglicol em 270 nm.

Figura 11 – Sobreposição do perfil cromatográfico das MP de RF

contendo AD propilenoglicol + RH400 e das MP brancas

contendo AD propilenoglicol + RH400 em 270 nm.

O teor de encapsulação de AMA nas MP variou de 0,07 a 0,28%

(amostras 8 e 1, respectivamente). Para o teor de AMB os valores foram de

0,11 a 0,43%. O teor de AMA e AMB no extrato usado na preparação das

MP era de 60,73 e 91,9 mg/g de resíduo seco, representando uma relação de

1:1,5 AMA:AMB, aproximadamente. Esta proporção de marcadores foi

encontrada após microencapsulação em praticamente todas as amostras. A

amostra 2 apresentou uma relação de 1:1,95 e a amostra 4 de 1:1,88. O teor

de encapsulação do extrato variou de 1,43 a 5,72%. A relação de teor de AMA

e AMB foi de 1:1,88 (amostra 4), demonstrando uma perda maior do AMA

durante o processo de secagem, pois o extrato apresentava uma relação de

1:1,5. Comparando os dois marcadores, o AMA apresenta-se como um óleo

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

uV

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

uV

AMB

AMA

MP + RF

MP brancas

MP + RF

MP brancas

AMA

AMB

70

enquanto o AMB é um sólido cristalino (ZERMIANI et al., 2016), o que pode

ter resultado na maior redução de AMA nas micropartículas.

Tabela 3 – Teor dos marcadores AMA e AMB e da eficiência de encapsulação das

micropartículas de quitosana contendo extrato de Rapanea ferruginea. Resultado

expesso através da média e desvio padrão.

Amostras TE % AMA TE % AMB

TE%

RF

EE %

AMA EE % AMB

1 0,28 ± 0,04 0,43 ± 0,05 5,72 ± 0,72 121,34 ± 16,28 120,22 ± 15,14

2 0,10 ± 0,01 0,19 ± 0,02 2,71 ± 0,28 54,44 ± 3,82 67,81 ± 6,71

3 0,19 ± 0,01 0,28 ± 0,01 3,75 ± 0,15 121,95 ± 5,53 116,28 ± 4,62

4 0,08 ± 0,02 0,15 ± 0,03 2,05 ± 0,37 62,14 ± 11,74 73,94 ± 13,33

5 0,16 ± 0,00 0,26 ± 0,02 3,43 ± 0,26 141,59 ± 12,86 140,57 ± 10,65

6 0,1 ± 0,00 0,15 ± 0,00 1,97 ± 0,11 105,05 ± 11,02 100,21 ± 5,58

7 0,08 ± 0,00 0,13 ± 0,00 1,70 ± 0,06 102,11 ± 2,63 103,17 ± 3,91

8 0,07 ± 0,00 0,11 ± 0,00 1,43 ± 0,02 100,97 ± 2,25 101,69 ± 1,64

A análise de interação entre os fatores sobre o teor de encapsulação

(Figura 12) mostrou que o mesmo comportamento de influência foi

observado para o teor dos ácidos AMA e AMB, bem como, para o teor de

extrato.

A presença de PPG a 0,5% e o aumento da proporção de extrato

proporcionaram um aumento do teor do extrato. A adição do tensoativo

RH400 reduziu o teor de marcadores. Embora tenha se observado a influência

dos fatores sobre o teor de encapsulação, os resultados não apresentaram

diferença significativa (p>0,072).

A partir dos resultados de teor de encapsulação foi determinada a

eficiência de encapsulação dos ácidos AMA e AMB. Conforme apresentado

na Tabela 3, os menores valores de AMB (67,81 e 73,94%) e de AMA (54,44

e 62,14%) foram encontrados para as amostras 2 e 4, enquanto a amostra 5

apresentou valor superior a 120%. Por se tratar de uma amostra heterogênea

incorporada na matriz polimérica, os resultados de eficiência se mostraram

satisfatórios.

71

Figura 12. Gráficos da interação entre os fatores estudados, proporção

extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre o teor de

encapsulação do AMA (A), AMB (B) e extrato (C) nas MP de QS contendo extrato de

Rapanea ferruginea (RF).

A

B

C

72

A proporção de PPG mostrou ser um fator que possui influência

significativa sobre as eficiências de encapsulação do AMA e AMB, com

valores de p de 0,036 e 0,027, respectivamente. Para as amostras sem RH400,

o aumento da concentração do PPG resultou em uma redução significativa da

eficiência de encapsulação nas duas proporções de extrato usadas (Figura 13).

Este mesmo comportamento não foi observado na presença do RH400.

Figura 13. Gráficos da interação entre os fatores estudados, proporção

extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre a eficiência de

encapsulação do AMA (A) e AMB (B) nas MP de QS contendo extrato de Rapanea

ferruginea (RF).

A

B

73

3.3.3 Espectroscopia no Infravermelho (IV)

As atribuições das principais frequências de cada banda de absorção, as

características das estruturas químicas do extrato de R. ferruginea, QS e das

MP de RF:QS estão descritas a seguir.

Na figura 14 estão representados os espectros de absorção no IV do

extrato de RF, QS, MP brancas contendo agente de dispersão propilenoglicol

(Bco PPG) e as MP das amostras 1, 2, 5 e 6. Onde se observa no IV da RF na

região entre 3600–2700 cm-1 uma banda alargada, caracterizada pela

deformação axial do grupamento O-H, que juntamente com o estiramento em

1685-1630 cm-1 referente a ligação C=O caracteriza o grupo funcional ácido

carboxilico. Também pode ser observado em 1606 cm-1 uma banda de

deformação axial referente a ligação C=C de alceno ou carbonos do anel

aromático. Na região de 1456 cm-1 se observa uma banda de deformação

angular referente ao grupamento CH3 de alcano. Nas regiões de 1220 cm-1 à

1041 cm-1 há várias bandas de absorção de deformação axial referente ao

grupamento C-O de aril-alquil-éter. As bandas encontradas no espectro de

absorção são semelhantes às encontradas nos espectros do AMA e AMB

(ZERMIANI, 2015) confirmando a presença em maior concentração deste

marcador químico no extrato conforme resultado demonstrado no teor do

extrato.

No espectro de absorção no IV da QS (Figura 14), são observadas as

seguintes bandas de absorção: na região de 3600–3000 cm-1 estiramento

referente ligação O-H atribuída ao grupo hidroxila. Em 2875 cm-1 há presença

de banda referente à deformação axial do grupo Csp3-H. Na região de 1654

cm-1 observa-se uma banda de deformação axial referente ao grupamento

C=O do grupo acetamida, a qual corresponde à parte acetilada da QS. Na

região de 1560 cm-1 observa-se banda de deformação angular referente ao

grupamento CH3. Em 1375 cm-1 banda de deformação axial referente ao

grupamento C-N. Banda de absorção na região 1155 cm-1 refere-se a

deformação axial do grupamento C-O e na região de 1037-900 cm-1 há

presença de bandas de C-O de polissacarídeos.

A QS comercial possui grau de desacetilação entre 70 e 95%. Quanto

maior o grau de desacetilação maior será a proporção de grupamentos amino

livres presentes na cadeia polimérica e maior a solubilidade em soluções

aquosas de ácido acético (CANELLA; GARCIA, 2001).

74

Em estudos realizados por Udrea et al. (2011), o espectro no IV da QS

apresentou bandas de estiramento de O-H em 3439 cm-1 e de C-H alifático

em 2924 cm-1, deformação axial do grupamento C-N em 1382 cm-1 e

deformação axial do grupamento C-O em 1089 cm-1. Apresenta bandas

características do grupamento NH2 em 3000-3500 cm-1 e banda de 1637cm-1

relacionadas ao grupamento amida, resultados estes semelhantes aos

encontrados em nosso estudo. As bandas podem aumentar ou decrescer

dependendo do grau de desacetilação da quitina.

O perfil comparativo das MP com agente de dispersão propilenoglicol

sem e com o extrato também está apresentado na figura 14. As amostras

apresentaram eventos nas regiões de 3350-3200 cm-1 indicativos da presença

do grupamento OH do grupo hidroxila presente na QS e também presente nos

compostos do extrato da RF. Nas regiões de 2974- 2860 cm-1 se encontram

bandas referente a deformação axial do grupo Csp3-H encontrados na QS e no

extrato da RF. Em 1660 cm-1 a presença de bandas de deformação axial

referente à carbonila encontrados na QS e nos compostos do extrato da RF.

Em 1608 - 1456 cm-1 observou-se a presença de bandas de deformação axial

referente a ligação dos carbonos do anel aromático presente no extrato da RF,

em 1377 -1352 cm-1, observa-se bandas de deformação axial referente ao

grupamento C-N também encontrado na QS. Na região de 1249 - 1035 cm-1

a presença de bandas de deformação axial C-O encontrados no extrato da RF.

Na figura 15 estão demonstrados os espectros de absorção no IV do

extrato de RF, QS, MP brancas contendo agente de dispersão propilenoglicol

+ RH400 (Bco RH400) e as MP das amostras 3, 4, 7 e 8. Nesta figura

observam-se as mesmas bandas da QS e RF descritas na figura 14. Nas

amostras sem extrato (Bco RH400) e as amostras 3, 4, 7 e 8 as quais possuem

os agentes dispersantes propilenoglicol + RH400 em sua composição,

observa-se na região de 1734 cm-1 a presença de uma banda de estiramento

referente ao grupamento C=O presente no tensoativo RH400. Na região de

1458 cm-1, há presença de uma banda de deformação angular referente ao

grupamento CH3 presente na QS e no extrato da RF. Na amostra 4 pode-se

observar que entre as bandas 1730-1645 cm-1 há presença de outras bandas

características da RF que não foram observadas nas demais amostras,

provavelmente por esta amostra ser a de maior proporção de RF:QS (1:10) e

conter os dois agentes de dispersão e em maior concentração, nas demais

amostras as bandas características do extrato provavelmente estão

sobrepostas com as bandas do polímero não sendo possível identificá-las.

75

Figura 14 - Espectro de absorção no IV do extrato da Rapanea ferruginea (RF), da

quitosana (QS), MP brancas de quitosana com o AD propilenoglicol (BCO PPG), MP

contendo extrato de R. ferruginea com o AD propilenoglicol, amostras 1, 2, 5 e 6.

Figura 15- Espectro de absorção no IV do extrato da Rapanea ferruginea (RF), da

quitosana (QS), MP brancas de quitosana com o AD propilenoglicol +RH400 (BCO

RH400), MP contendo extrato de R. ferruginea com o AD propilenoglicol + RH400,

amostras 3, 4, 7 e 8.

76

3.4 Análise do perfil de dissolução

O desenvolvimento de teste de dissolução para fármacos pouco solúveis

em água é um grande desafio. Se o fármaco não for solúvel em uma ampla

faixa de pH, a adição de adjuvantes de solubilidade, como os tensoativos,

pode ser requerida. Outras estratégias para aumento também têm sido

utilizadas, como aumento da área superficial, utilização de polimorfos

77

metaestáveis, misturas eutéticas, dispersões sólidas ou formação de

complexos solúveis (GOWTHAMARAJAN; SINGH, 2010).

Estudos de pré-formulação dos marcadores do extrato de RF descrevem

que estes compostos possuem baixa solubilidade em meio aquoso, sendo

classificados como praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL)

(ZERMIANI et al., 2016).

Para análise do perfil de dissolução das MP, inicialmente foi realizado

um estudo para seleção do meio de dissolução.

Em estudos preliminares para a seleção do meio para o teste de

dissolução das MP contendo extrato mole de RF, foram selecionados os

meios tampão fosfato pH 6,8, tampão acetato pH 4,5 e HCl 0,1 M, porém em

nenhum destes foi possível a dissolução do extrato em uma concentração

adequada para dar continuidade aos estudos, sendo então testados o lauril

sulfato de sódio (LSS) a 2,0, 3,0, 4,0 e 5,0% e o Tween® 80 nas concentrações

de 1,0 e 2,0% como adjuvantes de solubilidade no meio de dissolução. Os

resultados obtidos estão demonstrados na Tabela 4.

Tabela 4 – Proporção (%) dos marcadores AMA e AMB

dissolvidos em diferentes meios de dissolução, após 24 h de

análise.

Meios de Dissolução Proporção dissolvida (%)

AMA AMB

LSS 2% 57,84 64,70

LSS 3% 41,97 46,72

LSS 4% 35,33 45,98

LSS 5% 35,91 41,40

Tween 80 1% 21,84 25,51

Tween 80 2% 39,67 43,59

O LSS a 2,0% foi o meio que apresentou maior proporção de dissolução

dos marcadores do extrato das cascas de R. ferruginea, sendo 57,84% e

64,70%, para o AMA e AMB, respectivamente. Este meio foi então

selecionado para continuidade dos estudos de dissolução das MP contendo

extrato de RF. Em estudos de dissolução para a seleção do meio realizado

com o ácido mefenâmico, princípio ativo insolúvel em água, Patil et al.

(2010) também obtiveram os melhores resultados de solubilidade do ácido

mefenâmico com o LSS 2,0%, obtendo-se 96,24% de dissolução em 120 min.

78

O ensaio de dissolução das oito amostras de MP de QS contendo RF foi

realizado por um período de 24 h. Os resultados foram expressos em

percentual de AMB e de AMA dissolvidos (Figuras 16 e 19,

respectivamente).

As MP apresentaram diferentes comportamentos de dissolução do

AMB. As amostras contendo extrato na proporção 1:10 (amostras 1 a 4)

apresentram maior velocidade de dissolução do que as MP com proporção

1:20 (amostras 5 a 8). Este comportamento provavelmente está relacionado

com o aumento da capacidade da matriz polimérica de reter os ativos do

extrato quanto na presença de menor teor dos mesmos.

A amostra 2 apresentou maior taxa de dissolução de AMB após 24 h,

seguida pela amostra 1. A diferença entre estas amostras é a proporção de

PPG. A maior proporção de PPG (0,75%) resultou em maior taxa de

dissolução. A incorporação do tensoativo RH400 não promoveu a liberação

do AMB da matriz polimérica.

As amostras 5, 6 e 7 apresentaram baixa dissolução do AMB, pois

dissolveram no final do estudo apenas 2,81, 2,30 e 0,031%, respectivamente.

A influência de cada fator estudado na otimização das MP, assim como

a interação entre eles, sobre a proporção de AMB dissolvido em 1440 min

(24 h) é apresentada na Figura 17 e 18. A proporção extrato:QS foi o fator

com maior influência, seguido da proporção de PPG e de RH400. A análise

ANOVA mostrou que embora tenha sido observado influência dos fatores,

estas não são estatiscamente significantes (p>0,1).

As MP preparadas com propilenoglicol (MP1 e 2) apresentaram maior

taxa de dissolução, enquanto a adição do RH400 resultou em matrizes com

maior retenção dos marcadores. Tais resultados podem estar relacionados

com a capacidade do tensoativo polietoxilado formar uma matriz e retardar a

liberação dos marcadores das MP.

79

Figura 16 - Perfil de liberação do AMB das amostras 1-8 das MP de QS contendo

extrato de R. ferruginea.

Figura 17. Gráfico dos efeitos principais dos fatores proporção extrato:quitosana

(RF:QS), de propilenoglicol (PPG) e de RH400 sobre a proporção de AMB dissolvida

em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).

80

Figura 18. Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção

extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400,sobre a proporção de

AMB dissolvida em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea

ferruginea (RF).

O comportamento de liberação do AMA a partir das micropartículas é

apresentado na Figura 19. Foi observada uma tendência de liberação

semelhante ao do AMB, porém em uma menor proporção. Esta menor taxa

de dissolução do AMA provavelmente está relacionada com sua menor

solubilidade no meio, conforme apresentado na Tabela 4 nos estudos

preliminares de dissolução.

Excetuando as amostras 1 e 2, que apresentaram as maiores taxas de

dissolução, para as demais amostras foi observado um início de dissolução

somente a partir do tempo de 180 min. Não foi possível quantificar a

dissolução do AMA a partir das amostras 5, 6 e 7, o que pode ter sido

provocado pela baixa concentração do AMB nas amostras e o limite de

detecção da metodologia analítica.

Conforme pode ser observado na Figura 20, a proporção

extrato:polímero apresentou maior influência sobre a taxa de dissolução das

amostras, seguido da proporção de PPG. A adição de RH400 à formulação

praticamente não alterou a taxa de dissolução. Dos três fatores estudados, a

proporção RF:QS apresentou influência estatisticamente significativa sobre a

proporção de AMA dissolvido em 24 h (p = 0,038).

81

Na análise da interação entre os fatores, o gráfico permite visualizar

maior interação entre a proporção RF:QS com o PPG, sendo que o aumento

da proporção de extrato (10%) e de PPG (0,75%) resultou em maior taxa de

dissolução de AMA a partir da matriz polimérica (Figura 21).

Figura 19 - Perfil de liberação do AMA das amostras 1-8 das MP de QS contendo

extrato de R. ferruginea.

Figura 20. Gráfico dos efeitos principais dos fatores proporção extrato:quitosana

(RF:QS), de propilenoglicol (PPG) e de RH400 sobre a proporção de AMA dissolvida

em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea ferruginea (RF).

82

Figura 21. Gráfico da interação entre os fatores estudados, proporção

extrato:quitosana (RF:QS), propilenoglicol (PPG) e RH400, sobre a proporção de

AMA dissolvida em 1440 min a partir de MP de QS contendo extrato de Rapanea

ferruginea (RF).

A cinética de liberação dos marcadores químicos AMA e AMB foram

realizadas utilizando os modelos matemáticos de ordem zero, primeira

ordem, Higuchi e Korsmeyer e Peppas. Os resultados estão descritos na

Tabela 5.

Para análise do AMB, os perfis apresentaram melhor ajuste aos modelos

de primeira ordem e Korsmeyer-Peppas, exceto a MP 4. O mecanismo de

liberação é anômalo, podendo envolver difusão e intumescimento da matriz.

Os perfis de dissolução do AMA apresentaram um baixo ajuste aos modelos

cinéticos empregados, exceto para as MP 4. As amostras 1 e 3 por

apresentarem um baixo ajuste ao modelo de Korsmeyer e Peppas não

permitiram a análise da cinética por este modelo.

A partir dos resultados obtidos, as MP 2 e 4 que continham como agente

dispersante propilenoglicol e propilenoglicol + RH400, respectivamente,

foram selecionadas para avaliação da biodesão em modelo ex vivo e a

atividade anti-inflamatória in vivo por via oral. Estas duas formulações foram

selecionadas por possuírem diferentes agentes dispersantes. A amostra 2,

contendo somente propilenoglicol, foi selecionada pela alta de taxa de

dissolução apresentada, embora não tenha sido a formulação com maior

rendimento ou teor de encapsulação. Já a amostra 8 foi lecionada por ser das

amostras com propilenoglicol + RH400 a com maior rendimento e dissolução

crescente dos dois marcadores químicos ao longo do ensaio de dissolução.

83

Tabela 5. Resultados da análise da cinética de dissolução dos marcadores AMB e AMA das MP de QS contendo extrato de Rapanea

ferruginea (RF).

Amostras Ordem Zero Primeira Ordem Higuchi Korsmeyer e Peppas

r2 K r2 K r2 KH r2 K n

1 AMB 0,986 0,031 0,992 0,00038 0,865 0,92 0,989 0,054 0,92

2 AMB 0,827 0,076 0,984 0,0027 0,935 2,93 0,939 2,11 0,55

3 AMB 0,943 0,038 0,956 0,00047 0,928 0,916 0,977 0,244 0,72

4 AMB 0,687 0,012 0,679 0,00014 0,690 0,406 0,715 0,126 0,67

1 AMA 0,768 0,013 0,690 0,00011 0,435 0,28 nd nd nd

2 AMA 0,759 0,056 0,944 0,0016 0,897 2,215 0,898 1,918 0,52

3 AMA 0,758 0,016 0,777 0,00020 0,793 0,552 nd nd nd

4 AMA 0,977 0,023 0,977 0,023 0,812 0,674 0,974 0,018 1,03

nd – não determinado. Não foi possível ajustar o perfil de dissolução a este modelo.

84

3.5 Análise da bioadesão ex vivo

A bioadesão do extrato mole de R. ferruginea e das MP de quitosana

contendo R. ferruginea preparadas com AD (propilenoglicol e RH400) foram

avaliadas segundo o método descrito por Fundueanu et al. (2007) com

algumas modificações e estão representadas na Figura 23.

Conforme apresentado na Figura 23, o extrato mole de R. ferruginea

quando comparado ao branco e ao tampão apresentou uma porcentagem de

aderência na superfície do muco do tecido intestinal de 8,18 ±1,09. Este

comportamento deve-se provavelmente à característica resinosa do extrato e

a influência do propilenoglicol usado como solvente na obtenção do extrato

glicólico 12,5%. As MP preparadas com PPG 0,75% (amostra 2)

apresentaram maior bioadesão (24,58%), quando comparadas com as MP

preparadas com RH400 (amostra 4) (15,27%).

Figura 23. Resultado do teste de bioadesão ex vivo das MP (amostras 2 e 4) contendo

extrato das cascas de R. ferruginea.

Nota: Branco: extrato + tampão; Tampão: intestino + tampão; Extrato RF: extrato

mole de RF + intestino + tampão; MPB Bca PPG: micropartícula branca com

propilenoglicol; MP PPG: micropartícula com propilenoglicol e extrato (amostra 2);

MP Bca RH400: micropartícula branca c/ propilenoglicol + RH400; MP RH400:

micropartícula c/ propilenoglicol + RH400 e extrato (amostra 4). Todas as amostras

de micropartículas contêm intestino + tampão

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

1

% B

ioad

esã

o

Branco

Tampão

Extrato RF

MP Bca PPG

MP PPG

MP BcaRH400

85

3.6 Avaliação da atividade anti-inflamatória oral

A atividade anti-inflamatória in vivo do extrato das cascas de R.

ferruginea e das MP 2 e 4 contendo extrato das cascas de R. ferruginea foi

determinada usando o modelo de formalina com administração oral do

extrato e das MP.

Inicialmente o extrato foi administrado nas doses de 50, 150 e 300

mg/kg. Conforme observado na Figura 24A (fase I), as doses de 150 e 300

mg/kg apresentaram maior efetividade para a dor neurogênica que o

diclofenaco (controle positivo) apresentando redução da dor em 55,28 e

61,87%, respectivamente, não apresentando diferença estatística entre elas.

A dor neurogênica é avaliada pelo tempo de lambida da pata injetada com

formalina nos primeiros 5 min.

Na figura 24B são apresentados os resultados da resposta a dor

inflamatória (fase II). Após 10 min da avaliação da dor neurogênica, foram

contados o número de lambidas durante 15 min, que corresponde a dor

inflamatória. Foi verificado que a dose que melhor reduziu a dor inflamatória

foi a de 150 mg/kg apresentando 58,49% de eficácia, sendo esta menor que o

diclofenaco (75,68%).

A figura 24C representa a avaliação do edema pela diferença de peso

(mg) entre a pata na qual foi injetada a formalina (agente irritante) e a pata

contra-lateral (sem formalina). A dose que apresentou maior eficácia foi a de

300 mg/kg, com redução de 61,90% do edema. O diclofenaco apresentou uma

redução de 71,42% do edema.

Baccarin et al. (2016) também avaliaram o extrato mole de R. ferruginea

nas doses de 150, 300 e 500 mg/kg, usando a indometacina (10 mg/kg) como

controle positivo. As doses de 300 e 500 mg/kg de extrato mole inibiram de

forma significativa a dor neurogênica, com valores médios de inibição de

27,67% ± 3,86 e 36,56% ± 3,94, respectivamente. Na avaliação da redução

da dor inflamatória todas as doses do extrato mole reduziram de forma

significativa a dor de origem inflamatória com valores médios de inibição de

88,82% ± 10,36, 89,26% ± 9,66 e 93,02% ± 5,80, respectivamente para as

doses de 150, 300 e 500 mg/kg. Ainda nos estudos realizados por Baccarin et

al. (2016), o edema foi reduzido de forma significativa somente com a dose

de 500 mg/kg, apresentando uma inibição de 44,82% ± 0,002 e a

indometacina de 43,10% ±0,005.

86

Figura 24. Resultado da avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória oral do

extrato mole de R. ferruginea (50, 150 e 300 mg/kg v.o) em modelo de formalina. A-

Fase I (dor neurogênica), B – Fase II (dor inflamatória), C (avaliação do edema).

Controle 50 150 300 Diclof0

20

40

60

80 A

*

******

Veículo

R. ferriginea

Diclofenaco

23.15%

55.28%

61.87%

Tratamento (mg/kg, v.o.)

Tem

po d

e R

eaçã

o (s

)

Controle 50 150 300 Diclof0

50

100

150

200 B

**

***

*

58.49%50.10%

75.68%


Tem

po d

e R

eaçã

o (s

)

Controle 50 150 300 Diclof0.00

0.02

0.04

0.06

0.08 C

**

***

61.90%

71.42%


Peso

(mg)

Nota: veículo: salina (controle negativo); R. ferruginea: extrato mole de R. ferruginea;

diclofenaco: controle positivo. Os dados foram expressos como a média ± desvio

padrão de 8 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam *** para P < 0,0001, **

para P < 0,01.

Hess (2006) avaliou o efeito antinociceptivo do AMB isolado das cascas

da R. ferruginea. O AMB foi administrado via i.p. (6 a 60 mg/kg) e

apresentou redução na nocicepção induzida pela formalina na primeira fase e

na segunda fase apenas as concentrações de 30 e 60 mg/kg. Na administração

87

v.o (150-500 mg/kg), o AMB foi efetivo no modelo de ácido acético. O AMB

nas doses de 30 e 60 mg/kg apresentou uma potente ação na redução do

edema de pata causado pela formalina.

A figura 25 apresenta os resultados da avaliação in vivo da atividade

anti-inflamatória oral das MP (lotes 2 e 4) contendo extrato mole de R.

ferruginea. Como a dose de 150 mg/kg do extrato mole de R. ferruginea

apresentou atividade significativa para a dor inflamatória, esta dose foi

escolhida para a análise das MP.

Figura 25. Resultado da avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória oral das MP

(lote 2 e 4) contendo extrato mole de R. ferruginea (150 mg/kg v.o) em modelo de

formalina. A- Fase I (dor neurogênica), B – Fase II (dor inflamatória), C (avaliação

do edema).

Nota: Veículo: salina (controle negativo); MP2B (MP branca com propilenoglicol);

MP4B (MP branca com propilenoglicol+ RH400); MP2RF (lote 2 das MP); MP4RF

(lote 4 das MP); diclofenaco: controle positivo. Os dados foram expressos como a

média ± desvio padrão de 8 animais em cada grupo. Os asteriscos indicam *** para

P < 0,0001, ** para P < 0,01, *para P < 0,05.

88

Analisando a figura 25A, pode-se perceber que a MP branca contendo

RH 400 (MP4B) demonstrou atividade na dor neurogênica similiar as MP 2

e 4, já na dor inflamatória somente a MP 4 (MP4RF) demonstrou atividade

similar à atividade da RF na mesma concentração bem como atividade na

redução do edema na dose de 150 mg/kg de RF veiculada nas MP enquanto

a RF isolada só foi ativa na dose de 300 mg/kg. A figura 25B mostrou uma

inibição na dor inflamatória de 68,15% para amostra MP 4 (MP4RF) que

contem extrato mole de R. ferruginea e os agentes de dispersão

propilenoglicol+RH400. A figura 25C representa a avaliação do edema de

pata, em que a amostra que obteve maior eficácia foi a MP 4 (MP4RF), com

53,27% de redução do edema e o diclofenaco uma redução de 88,034%.

Os sistemas microparticulados são utilizados para liberação prolongada

de fármacos, resultado este observado na Figura 25, em que o extrato de R.

ferruginea apresentou efeito farmacológico no modelo de formalina superior

aos resultados obtidos com as MP de quitosana contendo R. ferruginea, pois

este modelo farmacológico é utilizado para liberação convencional de

fármacos e conforme os resultados encontrados no perfil de dissolução das

MP após 24 h, apenas 20% do teor dos marcadores AMA e AMB haviam

sido liberados, com exceção da amostra 2 (MP2RF) a qual liberou 100% em

24 h porém não apresentou inibição na dor inflamatória enquanto que a

amostra 4 (MP4RF) inibiu (59,13%) e apresentou um perfil de liberação de

menos de 20% após 24 h, caracterizando que o sistema da amostra 4

(MP4RF) é mais efetivo para liberação prolongada de fármacos.

4 Conclusões

Micropartículas de quitosana contendo extrato de R. ferruginea foram

desenvolvidas por spray drying empregando um planejamento fatorial com

análise dos fatores proporção extrato: polímero, tipo de agente dispersante

(propilenoglicol e tensoativo polietoxilado RH400). Foi observado que a

presença do tensoativo não iônico polietoxilado RH400 como agente

dispersante teve influência significativa no rendimento e morfologia das

micropartículas, resultando em microesferas com superfície lisa. O aumento

da proporção de extrato aumentou o teor, principalmente na presença de

propilenoglicol 0,5%, embora tenha se observado a influência deste fator

sobre o teor de encapsulação, os resultados não apresentaram diferença

89

significativa. Quanto maior a proporção de extrato maior foi a velocidade de

dissolução, efeito este pertinente com a eficiência da matriz em prolongar a

liberação com menor proporção de extrato. Micropartículas preparadas com

propilenoglicol apresentaram maior bioadesão quando comparadas com as

micropartículas preparadas com RH400. As micropartículas contendo extrato

das cascas de R. ferruginea apresentaram atividade anti-inflamatória oral em

modelo de formalina in vivo na dose de 150 mg/kg inferior ao valor obtido

no extrato das cascas de R. ferruginea,. tanto para a inibição da dor

inflamatória quanto para a redução do edema. Por ser o modelo de edema de

pata um método agudo de tratamento e as MP promoverem a liberação

prolongada do extrato, a atividade encontrada no estudo pode estar

relacionada com a velocidade de liberação a partir dos sistemas. Por isto,

sugere-se a avaliação da atividade farmacológica dos sistemas usando um

modelo de dor e inflamação com tratamento subcrônico ou crônico.

A incorporação do extrato das cascas de R. ferruginea em microesferas

de quitosana por spray-drying mostrou-se viável e uma alternativa

farmacêutica para administração do extrato pela via oral colaborando para o

desenvolvimento de um novo medicamento fitoterápico com potencial

atividade anti-inflamatória e analgésica a partir de uma espécie vegetal da

biodiversidade brasileira.

91

CAPÍTULO IV

Incorporação de micropartículas de quitosana contendo

extrato das cascas de Rapanea ferruginea em hidrogeis e

avaliação da atividade anti-inflamatória tópica

93

Incorporação de micropartículas de quitosana contendo

extrato das cascas de Rapanea ferruginea em hidrogéis e

avaliação da atividade anti-inflamatória tópica

Roseni Bortolon Grassi De Carli; Márcia Maria de Souza; Angela Malheiros;

Ruth Meri Lucinda-Silva

1 Introdução A busca por novos fármacos e sistemas de liberação como estratégias

para o tratamento de doenças constitui um desafio constante no âmbito

farmacêutico. A eficácia do fármaco em exercer a atividade biológica com

baixa toxicidade é dependente da plataforma tecnológica desenvolvida. As

características mais importantes destes sistemas carreadores são a capacidade

de proteger o fármaco, possuir cinética de liberação compatível com a via de

administração, ser de fácil obtenção e preço acessível. Tais sistemas devem

ser constituídos por biomateriais biocompatíveis, biodegradáveis, estáveis

quimicamente e economicamente viáveis (ZORZI et al., 2017).

Polímeros naturais, semisintéticos e sintéticos têm sido utilizados como

excipientes para a formulação de cosméticos e medicamentos de liberação

convencional e modificada. Atuam como moduladores e direcionadores da

liberação de fármacos em sítios específicos no organismo. Polímeros

biodegradáveis, bioadesivos, biomiméticos e hidrogéis responsivos têm sido

incluídos em formulações farmacêuticas.

Os hidrogéis são redes tridimensionais de polímeros que intumescem

em meio aquoso ou nos fluidos biológicos retendo grandes quantidades de

água na sua estrutura. Esta propriedade de absorção de fluidos é atribuída às

características hidrofílicas do polímero. O alto teor de água e baixa tensão

superficial são alguns dos fatores que proporcionam biocompatibilidade a

estes sistemas (WING-FU; ZEN-DAN, 2016). Vários polímeros hidrofílicos

são utilizados na obtenção de hidrogéis, como a metilcelulose,

carboximetilcelulose sódica, hidroxietilcelulose, alginato de sódio, quitosana

(QS) e carbômero (BRANGEL, 2011; HIRATA; BRUSCHI, 2010;

VILLANOVA; ORÉFICE, 2010).

A Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) é uma espécie vegetal com

potencial aplicação como fonte de fitoderivados para uso terapêutico. É uma

árvore encontrada em vários estados brasileiros e também em outros países

94

como Bolívia, México, Argentina, Paraguai e Uruguai (BACCARIN et al.,

2014; COSTA, 2011). O extrato bruto das cascas de R. ferruginea e o

composto majoritário ácido mirsinoico B (AMB), apresentaram atividade

antinociceptiva, anti-hiperalgésica e e anti-inflamatória em estudos pré-

clínicos (BACCARIN et al., 2016; DAL MAS et al., 2016; GALVAN, 2007;

HESS et al., 2010). Estudos de pré-formulação do AMB demonstraram que

este composto, assim como o extrato das cascas, possui baixa solubilidade

em meio aquoso, sendo classificado como praticamente insolúvel em água (<

0,50 mg/mL). Além disso, os compostos ácidos mirsinoico A (AMA) e B

(AMB) possuem valor de log de P de 3,30 e 3,22, respectivamente, sendo

semelhante aos valores encontrados para fármacos anti-inflamatórios como

indometacina e naproxeno (ZERMIANI et al., 2016).

Buscando o desenvolvimento de sistema de liberação para

administração tópica do extrato das cascas de R. ferruginea, foram obtidos

creme convencional e nanoemulsão contendo de 0,13 a 0,5% de extrato. A

atividade anti-inflamatória foi maior quando o extrato foi incorporado em

nanoemulsão O/A (DAL MAS et al., 2016). Os autores observaram um

aumento de aproximadamente 160% na atividade anti-inflamatória em

modelo de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton quando comparado

ao creme. Tais resultados demonstraram que a incorporação do extrato de R.

ferruginea em um sistema nanoemulsionado pode ter promovido o aumento

da eficácia devido ao aumento da solubilidade dos compostos ativos do

extrato.

Para a incorporação do extrato mole de R. ferruginea em hidrogeis,

foram preparados pelo método de spray drying oito lotes de micropartículas

de quitosana contendo extrato mole de R. ferruginea. Entre os lotes

desenvolvidos o lote 4 que continha a proporção de RF:QS 1:10 e agentes de

dispersão propilenoglicol (0,75%) e RH 400 (0,5% ) foi o que se apresentou

mais adequado para incorporação nos géis hidrofílicos, pois apresentou um

rendimento de 58,43%, tamanho de partícula de 1,215±0,622 µm, eficiência

de encapsulação para o AMA e AMB de 62,14± 11,74 e 73,94 ±13,33 %,

respectivamente e teor de encapsulação de 0,08±0,02 e 0,15±0,03 para o

AMA e AMB, respectivamente, apresentando uma relação de 1:1,88

AMA:AMB e no extrato a relação era de 1:1,5 AMA e AMB.

Portanto, visando a obtenção de um sistema de liberação transdérmica

para administração do extrato das cascas de R. ferruginea com maior

biocompatibilidade do que os sistemas emulsionados e que promova o

95

aumento de solubilidade do extrato em meio aquoso, no presente estudo o

extrato foi primeiramente particionado em uma matriz polimérica

microparticulada de quitosana e, posteriormente, as micropartículas foram

dispersas no hidrogel. Os sistemas foram caracterizados demonstrando a

estabilidade das micropartículas no meio hidrofílico e o aumento da resposta

anti-inflamatória tópica foi observada em modelo farmacológico in vivo.


2.1 Material

Alginato de sódio foi adquirido da Isofar® (Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

Brasil); carbômero 940 foi adqurido da Dinâmica® (Diadema, São Paulo,

Brasil); hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica, goma

xantana e hidroxietilcelulose foram adquirido da All Chemistry (São Paulo,

São Paulo, Brasil); Aristoflex AVC® e Phenonip® (metilparabeno 14,5 -

16,5%, etilparabeno 3,5 - 4,5%, propilparabeno 1,5 - 2,5%, isobutilparabeno

1,5 - 2,5%, butilparabeno 3,5 - 4,5% e fenoxietanol 70 - 75%) foram

adquiridos da Clariant (Muttenz, Suíça); trietanolamina foi adquirida da

Ativa Química (Diadema, São Paulo, Brasil); quitosana (QS), com peso

molecular médio, viscosidade de 200-800 mPa.s (dispersão a 1% em ácido

acético 1%, a 25 ºC) e grau de desacetilação de 72,45% foi adquirida da

Aldrich® (Sto Louis, Missouri, USA); Ultramona® RH400 foi adquirido da

Oxiteno (São Paulo, São Paulo, Brasil) e propilenoglicol foi adquirido da

Biotec®(São Paulo, São Paulo, Brasil).

2.1.1 Material vegetal

As cascas do caule de Rapanea ferruginea foram coletadas em

Blumenau-SC. A autenticidade botânica foi verificada através da comparação

entre a exsicata da planta coletada com o exemplar depositado no Herbário

Barbosa Rodrigues (Itajaí-SC) sob o código HBR 52715.

O extrato das cascas de Rapanea ferruginea (RF), foi obtido a partir da

solução extrativa usando método de maceração dinâmica, conforme descrito

no item 2.2 do capitulo III (p. 42). O extrato usado no presente estudo possui

teor de AMA e AMB de 60,73 e 91,9 mg/g de resíduo seco, representando

uma relação de 1:1,5 AMA:AMB, aproximadamente.

96

2.2 Obtenção das micropartículas contendo Rapanea ferruginea usando

spray drying

As micropartículas (MP) foram preparadas conforme metodologia

descrita no item 2.4 do capítulo III (p. 46). Descrevendo resumidamente a

preparação das MP do lote 4, o extrato mole de RF na concentração de 0,05%

(RF:QS 1:10) foi dissolvido nos agentes dispersantes (propilenoglicol 0,75%

e Ultramona RH 400 0,5%) e incorporado na solução de QS 0,5% (solução

diluída de ácido acético pH 4,0). Após obtenção das dispersões, as amostras

foram secas em spray dryer (Buchi® B290), com pressão de ar de 6 mBar,

fluxo do ar comprimido de 473 NL.h-1, temperatura de entrada 150 ºC, taxa

de aspiração de 90% e fluxo de alimentação em 4,0 mL/min, em sistema

aberto. Após a secagem, as amostras foram acondicionadas em frascos bem

fechados e mantidas em dessecador.

As MP foram caracterizadas quanto ao tamanho, morfologia e teor dos

marcadores químicos do extrato AMA e AMB por CLAE, conforme

procedimentos descritos no item 2.5 do capítulo III (p. 47).

2.3 Desenvolvimento dos hidrogéis

No desenvolvimento dos hidrogéis foi realizado um estudo preliminar

de incorporação das MP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea

em diferentes polímeros dispersos em meio aquoso. Para este estudo foram

usados os polímeros aniônicos co-polímero do ácido sulfônico

acriloildimetiltaurato e vinilpirrolidona neutralizado (Aristoflex® AVC);

carboximentilcelulose sódica (CMC-Na); carbômero 940 (Carbopol® 940);

goma xantana e alginato de sódio; e os polímeros não iônicos

hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e hidroxietilcelulose (HEC, Natrosol®).

As concentrações utilizadas dos polímeros estão descritas no Quadro 1.

Na formulação dos hidrogéis foi utilizado o Phenonip® a 0,5% como

conservante e o propilenoglicol 5,0% como umectante em água purificada.

Foram preparados 100 g de cada hidrogel pelo método a frio que consiste em

colocar água em um bequer, acrescentar o polímero e deixar repouso por 12

h para intumescimento e homogeneizar. A dispersão de carbômero 940 foi

neutralizada com solução de trietanolamina 50% para pH 6,0.

97

Quadro 1. Concentração dos polímeros usada no estudo de incorporação de

MP de quitosana contendo extrato das cascas de Rapanea ferruginea em

hidrogéis.

Polímeros Concentração (%)

Hidroxipropilmetilcelulose 3,0

Aristoflex® 2,5

Carboximetilcelulose Na 5,0

Carbômero 940 2,0

Goma xantana 2,5

Alginato de sódio 8,0

Hidroxietilcelulose 2,0

As MP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea foram

levigadas com propilenoglicol e incorporadas nos hidrogéis nas

concentrações de 0,1 e 0,2% (m/m de teor de extrato). A seleção dos

polímeros foi realizada após análise dos aspectos visuais (cor e

homogeneidade) e análise microscópica da dispersão das MP na base

gelificada usando microscópio óptico (Leica® SME).

2.4 Caracterização dos hidrogéis

Na caracterização dos hidrogéis foram analisados os aspectos visuais,

estabilidade física, pH, morfologia por microscopia óptica e eletrônica de

varredura (MEV), comportamento reológico e propriedades mecânicas.

2.4.1 Aspecto visual e estabilidade física

Os hidrogéis foram analisados após 24 h de preparo quanto aos aspectos

visuais de cor e homogeneidade.

A estabilidade física foi avaliada após centrifugação (Microcentrífuga

Fanem® - 243) das amostras em frasco tipo eppendorf por 30 min a 3000 rpm

(ANVISA, 2004). Esta análise foi realizada nos tempos 24 h e 15 dias e em

triplicata.

2.4.2 Determinação do pH

A determinação do pH das amostras foi realizada pela análise

potenciométrica direta usando potenciômetro (AJ micronal® - AJX-512)

98

previamente calibrado com soluções tampão (pH 6,0 e 7,0). Esta análise foi

realizada nos tempos 24 h e 15 dias e em triplicata.

2.4.3 Características microscópicas

Os hidrogéis foram analisados quanto ao aspecto microscópico nos

tempos 24 h e 15 dias, usando microscópio óptico. As amostras foram

depositadas sobre lâmina de vidro e cobertas com lamínula de vidro. Foram

observadas características como homogeneidade de dispersão das MP,

morfologia e integridade das MP.

2.4.4 Morfologia por MEV

Para a análise da morfologia, os hidrogeis foram dessecados por

liofilização após prévio congelamento. O filme seco foi analisado em

microscópio eletrônico de varredura (Philips, XL 30®). Para a análise, as

amostras foram depositadas sobre uma fita dupla face em suporte metálico e

posteriormente recobertas com ouro coloidal.

2.4.5 Comportamento reológico

A análise reológica dos hidrogéis com e sem extrato das cascas de R.

ferruginea foi realizada através do viscosímetro rotacional tipo cone-placa

(Haake® K-10) a 25 °C. As amostras foram analisadas em três etapas: rotação

de 0-80 1/s; rotação constante de 80 1/s e rotação de 80-0 1/s, retornando ao

ponto estático. Em todas as etapas o tempo de análise foi de 180 segundos e

foram coletados 100 pontos. Para análise das amostras fez-se uso do software

HAAKE Rheowin 4 Data Manager 4.30.0013 e para a coleta e análise dos

dados o software HAAKE Rhewin 4 Job Manager 4.30.0013 (DAL MAS,

2015).

2.4.6 Propriedades Mecânicas

As propriedades mecânicas das amostras com e sem extrato foram

determinadas em analisador de textura usando modo de análise de perfil de

textura (TPA- texture profile analysis). Aproximadamente 10 g de cada

amostra foi transferida para béquer de 25 mL. Em modo TPA, o probe de 10

mm de diâmetro foi forçado a penetrar 10 mm na amostra a uma velocidade

de 1 mm/s com um intervalo de 20 s entre a primeira e a segunda etapa. O

ensaio foi realizado a temperatura de 25 ± 2 °C, em triplicata. A partir do

gráfico de força versus distância e força versus tempo, os parâmetros de

99

dureza, compressibilidade, adesividade, elasticidade e coesividade foram

calculadas com auxílio do software Texture® exponente Lite versão 5.0.9.0

(BRUSCHI et al., 2007; MULLER, 2013).

2.5 Avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo

Para avaliar a atividade anti-inflamatória tópica in vivo dos hidrogéis

contendo MP de R. ferruginea foi utilizado o modelo de edema de orelha

induzido pelo óleo de cróton. Os ensaios foram realizados com a colaboração

da Profª. Drª. Márcia Maria de Souza e do Prof. Dr. José Roberto Santin.

2.5.1 Animais

Antes dos experimentos os animais foram mantidos durante três dias para

ambientação no biotério do laboratório de farmacologia (sala 209, bloco F6)

em caixas de polipropileno de 41 cm x 34 cm com no máximo 10 animais.

Nas caixas-moradia, no período de adaptação que antecede aos testes, foi

acrescentado enriquecimento ambiental com intuito de diminuir o estresse. A

maravalha foi trocada a cada 2 dias e tinham ração e água ad libitum. As salas

foram mantidas com controle de temperatura (22-25 oC), umidade constante

(60%) e em ciclos controlados claro/escuro de 12 h cada, conforme

procedimento do laboratório. No dia do teste, os animais foram levados para

a sala de teste para adaptação por um período de 1 h, antes do início dos

mesmos.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios

éticos de experimentação animal recomendados pelo Conselho Nacional de

Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O projeto foi aprovado

pelo CEUA/UNIVALI (parecer nº 020/16p), conforme Anexo A.

2.5.2 Avaliação da atividade anti-inflamatória pelo modelo de edema de

orelha

O modelo de edema de orelha induzido por óleo de cróton foi utilizado

para avaliar a influência da microencapsulação na resposta anti-inflamatória

tópica do extrato. O experimento foi realizado de acordo com a metodologia

descrita por Calixto et al. (1991), Otuki et al. (2005) e De Carli et al. (2009).

Antes de iniciar o experimento os animais foram anestesiados com

ketamina (80-100 mg/kg, i. p.) e xilazina (10-12,5 mg/kg, i. p.). A orelha

direita dos animais foi medida com o auxílio de um micrômetro digital

100

(medida basal). A cada grupo de oito animais, foi aplicado na superfície

interna da orelha direita o tratamento previsto para cada grupo:

- propilenoglicol (G1-controle negativo);

- gel de alginato de sódio sem MP (G2- gel de alginato branco);

- gel de carbômero 940 sem MP (G3- gel de carbômero 940 branco);

- gel de alginato de sódio contendo MP 0,2% (G4);

- gel de carbômero 940 contendo MP 0,2% (G5) e

- creme de dexametasona 0,1 % (m/m) (G6-controle positivo).

Após 30 min da aplicação dos respectivos tratamentos, foi aplicado na

superfície externa da orelha direita o óleo de cróton 2,5% (v/v) dissolvido em

acetona (agente irritante). Quatro horas após a aplicação do óleo de cróton,

as orelhas foram medidas novamente e o edema de orelha foi avaliado através

da diferença entre a medida basal e a medida realizada após aplicação do óleo

de cróton. A medida do edema foi expressa em Δ edema (µm).

2.5.3 Análise estatística dos dados

Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA),

seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de

Dunnett, empregando os softwares Instat e GraphPad Prisma versão 4.0. Os

resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média para

cada grupo de experimentos. Os valores de p<0,05 foram considerados

indicativos de significância.

3 Resultados e discussão

Para o desenvolvimento dos hidrogéis foram utilizadas as MP de QS

contendo extrato de R. ferruginea do lote 4, conforme descrito no item 2.4 do

capítulo III (p. 46). Esta composição de MP foi selecionada por conter como

agentes dispersantes propilenoglicol e RH 400 com rendimento de 58,43%,

perfil de dissolução do extrato de RF do tipo prolongado e ter apresentado

maior efeito anti-inflamatório no modelo de formalina descrito no item 3.6

do capitulo III (p. 94).

As MP apresentaram forma esférica, superfície lisa com algumas

deformações (Fig. 6, Cap. III, p.64 ) e diâmetro de 1,215 ± 0,622 µm (Tab. 2,

Cap. III, p.60 )

101

As MP de QS apresentaram teor de encapsulação de 0,08 ± 0,02% e

0,15 ± 0,03% de AMA e AMB, respectivamente, que representa um teor

extrato de 2,05 ± 0,37% expresso em AMB. A eficiência de encapsulação foi

de 62,14 ± 11,74% para o AMA e para o AMB de 73,94 ± 13,33%, conforme

resultados apresentados na Tab. 3 (Cap. III, p. 64).

A relação de teor de AMA e AMB foi de 1:1,80, demonstrando uma

perda maior do AMA durante o processo de secagem, pois o extrato

apresentava uma relação de 1:1,5. Comparando os dois marcadores, o AMA

apresenta-se como um óleo enquanto o AMB é um sólido cristalino

(ZERMIANI et al., 2016), o que pode ter resultado na maior redução de AMA

nas micropartículas.

3.1 Obtenção e caracterização dos hidrogéis contendo micropartículas

No presente estudo, para a seleção do agente gelificante foram testados

os polímeros Aristoflex AVC®, CMC Na, carbômero 940, goma xantana,

alginato de sódio, HPMC e HEC. Após incorporação das MP de QS, os

hidrogéis de CMC Na, carbômero, HPMC e alginato de sódio obtidos

apresentaram homogeneidade de cor e dispersão das MP. Enquanto nos géis

preparados com goma xantana, HEC e Aristoflex AVC®, as MP sofreram

aglomeração, formando precipitados. Por isto, foram descartados do estudo.

Na análise microscópica, foi observado que quando incorporadas nos

hidrogéis de CMC Na e HPMC, as MP imediatamente se desintegraram

(Figura 1), comportamento este não desejável, pois o objetivo era manter as

MP contendo o extrato disperso no hidrogel. Este comportamento não foi

observado nos hidrogéis de carbômero 940 e alginato de sódio. Nestes as MP

mantiveram-se como sistema particulado, quando visualizado em

microscópio. Estes polímeros aniônicos são descritos como agentes de

formação de complexos poli-iônicos com a QS, capazes de reticular as MP e

não permitir a desintegração destas no meio aquoso.

102

Figura 1- Aspecto microscópico das MP de quitosana contendo extrato das cascas de

R. ferruginea incorporadas em hidrogéis: A- gel de carboximetilcelulose sódica; B-

gel de hidroxipropilmetilcelulose; C- gel de carbômero 940; D- gel de alginato de

sódio; E- gel de carbômero 940 sem micropartículas; F- gel de alginato de sódio sem

micropartículas. Aumento de 40x.

A B

C D

E F

Após centrifugação, os géis de carbômero 940 e alginato de sódio, com

e sem MP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea, permaneceram

sem segregação das partículas durante o período analisado (15 dias).

Os géis de carbômero sem e com MP de QS apresentaram valores de

pH de 4,32 ± 0,02 e 4,44 ± 0,02, respectivamente. Enquanto os géis de

alginato de sódio apresentaram alteração do valor de pH com a adição das

MP, sendo de 5,33 ± 0,03 para o branco e de 7,35 ± 0,02 e 7,60 ± 0,03 para

103

os hidrogéis contendo 0,1 e 0,2% de extrato incorporado nas MP,

respectivamente. Nenhuma amostra apresentou alterações dos valores de pH

após 15 dias de armazenamento. A morfologia das MP de QS contendo

extrato de R. ferruginea incorporadas nos hidrogéis de alginato de sódio 8,0%

e carbômero 940 2,0% foi analisada por MEV e as fotomicrografias são

apresentadas nas figuras 2 e 4.

O hidrogel de alginato de sódio sem MP, após secagem por liofilização,

resultou em um filme liso e levemente poroso, como consequência da

estrutura reticulada do hidrogel. Enquanto, os hidrogéis contendo 0,2% de

MP de quitosana resultaram em uma estrutura de superfície rugosa. Quando

analisado em maior aumento (5000 e 10000x) foi observada a presença das

MP de QS com forma bem delimitada e esférica, embora recoberta com a

matriz polimérica do hidrogel no qual foram dispersas. Conforme

apresentado na figura 6 (capítulo III, p.59), as MP de QS contendo extrato

das cascas de R. ferruginea e propilenoglicol e óleo de rícino polietoxilado

como agentes dispersores, apresentaram forma esférica e superfície lisa.

Portanto, a superfície rugosa observada após incorporação das MP no

hidrogel está relacionada com a presença do polímero gelificante. Estes

resultados mostram que o hidrogel de alginato é um veículo carreador

adequado para as MP de QS contendo extrato, pois mantém a característica

microparticulada do sistema e, consequentemente, permite dispersar o extrato

de R. ferruginea, que possui caráter lipofílico, em um veículo hidrofílico.

104

Figura 2 - Fotomomicrogafias dos hidrogéis de alginato de sódio 8,0%, após

liofilização. 1- branco; 2 - com 0,2% de extrato microencapsulado. Aumento de: A – 1000x; B – 5000x e C - 10000x.

O alginato de sódio (AL) é um co-polímero extraído de algas marrons e

constituído por uma cadeia polimérica formada por unidades de ácido β-D-

manurônico e ácido α-L-gulurônico com ligação1-4. Este copolímero

1A

1B

1C

2A

2B

2C

105

possui grupos carboxílicos sendo classificado como um polímero

mucoadesivo aniônico (KUMBHAR; PAWAR, 2017).

Figura 3 – Esquema da estrutura das MP de QS contendo o extrato das cascas de R.

ferruginea e a reticulação destas quando incorporadas no hidrogel de alginato de sódio.

A QS, como polieletrólito catiônico formado por unidades (1→4)-β-N-

acetil-D-glucosamina e D-glucosamina, é usada na obtenção de complexo

106

polieletrolítico com polímeros aniônicos como o AL (OLIVEIRA, 2016; YU

et al., 2009). Conforme esquematizado na Figura 3, as MP de QS em meio

aquoso podem apresentar superfície carregada catiônicamente, pois sendo o

pKa da quitosana de 6,2 (Dash et al., 2011) e o hidrogel de AL possuir um

valor de pH de 5,3, a incorporação das MP no hidrogel resultou na reticulação

das MP pela formação do complexo polieletrolítico QS:AL, proporcionando

a manutenção da estrutura das MP mesmo em meio aquoso. A complexação

da QS com AL reduz a porosidade dos géis e diminui a perda do fármaco

encapsulado, pois a solubilidade da QS é reduzida pela reticulação com o

alginato.

Complexos polieltrolíticos de QS-AL têm sido aplicados no

desenvolvimento de diferentes sistemas de liberação, como beads

(LUCINDA-SILVA; SALGADO; EVANGELISTA, 2010), MP (LEE et al.,

2009), scaffold (HO et al., 2009) e esponja (LIN; YEH, 2003). A estrutura e

o rendimento da formação do complexo dependem da proporção dos

biopolímeros. Geralmente são empregadas concentrações menores que 3%

de AL e QS (KUMBHAR; PAWAR, 2017). No presente estudo foi

empregada a dispersão de AL a 8% a fim de obter um produto

semissólido.

O comportamento físico das MP incorporadas no hidrogel de carbômero

(Figura 4) foi semelhante ao observado para o AL.

O hidrogel de carbômero sem MP apresentou superfície lisa e compacta,

enquanto a incorporação das MP de QS resultou em uma estrutura com

superfície irregular. Quando analisada em maior aumento foi observada na

estrutura do hidrogel de carbômero a presença de estrutura esférica e MP,

correspondendo à presença das MP de QS contendo o extrato de R.

ferruginea.

O carbômero, comercialmente chamado de Carbopol, é um polímero

sintético formado por unidades de ácido acrílico. São polímeros com alta

massa molecular reticulados com alil sacarose ou alil éter de pentaeritritol e

contendo de 52 a 68% de grupo carboxílico calculado em base seca (ROWE;

SHESKEY; QUINN, 2009). A estrutura química deste polímero permite a

obtenção de complexo polieletrolítico com a QS, como apresentado na Figura

5. A interação entre os dois polímeros pode ocorrer por ligações iônicas entre

o íon amônio da QS (NH3+) e o íon carboxalato (COO−) do carbômero, assim

como, por pontes de hidrogênio entre o H+ da QS e a OH− do grupo

107

carboxílico do carbômero ou entre o H+ do grupo carboxílico do carbômero

e a OH- da QS (DHANUJA; SMITHA; SRIDHAR, 2005).

Figura 4 - Fotomomicrogafias dos hidrogéis de carbômero 940 2,0%, após

liofilização. 1- branco; 2 - com 0,2% de extrato microencapsulado. Aumento de: A – 1000x; B – 5000x e C - 10000x.

1A

1B

1C

2A

2B

2C

108

Figura 5 – Esquema da formação de complexo polieletrolítico quitosana:carbômero

(ácido poliacrílico).

Fonte: Adaptado de Dhanuja, Smitha e Sridhar (2005).

A formação do complexo polieletrolítico quitosana-carbômero,

conforme esquematizado na figura 5 e descrito para o hidrogel de alginato de

sódio, também proporcionou a incorporação das MP de QS no hidrogel e a

estabilização destes sistemas mesmo em meio aquoso, provavelmente pela

reticulação das superfícies das microesferas de QS quando na presença do

poliânion carbômero.

3.2 Comportamento reológico

O comportamento reológico dos hidrogéis (carbômero 940 2,0% e

alginato de sódio 8,0%) com e sem as MP contendo extrato das cascas de R.

ferruginea foi analisado usando viscosímetro rotacional. Os resultados estão

apresentados na tabela 1.

As amostras de géis de alginato de sódio 8,0% sem MP (branco)

apresentaram uma viscosidade de 3,71 ± 0,31 Pa.s e foi observado que a

incorporação e o aumento progressivo das MP de 0,1 para 0,2% houve um

aumento da viscosidade de 4,86 ± 0,12 para 6,29 ± 0,07 Pa.s,

109

respectivamente, mostrando que a viscosidade do gel é alterada pela

incorporação das MP e dependente da concentração das mesmas. Os

hidrogéis de carbômero 940 2,0% apresentaram comportamento semelhante.

Tabela 1 – Resultados da analise reológica de hidrogéis (carbômero 940 2,0% e

alginato de sódio 8,0%) com e sem micropartículas (MP) de quitosana contendo

extrato das cascas de R. ferruginea nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo ao

extrato.

Amostras Viscosidade

(mPa.s)

Tixotropia

(mPa.s) n

Alginato (branco) 3,71 ± 0,31 1175,5 ± 159,5 0,58± 0,01

Alginato (MP 0,1%) 4,86 ± 0,12 976,75 ± 5,95 0,58 ± 0,01

Alginato (MP 0,2%) 6,29 ± 0,07 982,45 ± 0,25 0,60 ± 0,01

Carbômero (branco) 8,20 ± 0,55 1090,5 ± 4,5 0,16 ± 0,01

Carbômero (MP 0,1%) 10,53 ± 0,50 7763,5 ± 1588,5 0,18 ± 0,00

Carbômero (MP 0,2%) 13,07 ± 0,76 15550 ± 3100 0,13 ± 0,02

Os hidrogéis de alginato de sódio e de carbômero apresentaram

comportamento reológico semelhante. As curvas de fluxo (tensão de

cisalhamento versus gradiente de cisalhamento) mostram o aumento da

resistência ao fluxo com a incorporação das MP nos sistemas, conforme

figuras 6 e 7. Porém, com o aumento do gradiente de cisalhamento, a

viscosidade dos sistemas foi reduzida.

Analisando as curvas de fluxo, os valores de viscosidade média e os

valores calculados de tixotropia, pode-se observar que os hidrogéis

apresentaram um perfil reológico do tipo não-Newtoniano, pseudoplástico e

com tixotropia, pois apresentaram uma redução da viscosidade com o

aumento do gradiente de cisalhamento, comportamento este que é

característico de materiais pseudoplástico.

110

Figura 6 – Perfil reológico, expresso em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade

(B) frente ao gradiente de cisalhamento, dos hidrogéis de alginato de sódio 8,0% com

e sem micropartículas (MP) de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea

nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo ao extrato.

0

100

200

300

400

500

600

0 20 40 60 80 100

τP

a

ϔ (1/s)

Alginato BrancoAlginato 0,1%Alginato 0,2%

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100

ηP

a.s

ϔ (1/s)

Alginato Branco

Alginato 0,1%

Alginato 0,2%

A

B

111

Figura 7 – Perfil reológico, expresso em tensão de cisalhamento (A) e viscosidade

(B) frente ao gradiente de cisalhamento, dos hidrogéis de carbômero 940 2,0% com e

sem micropartículas (MP) de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea

nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo ao extrato.

Conforme apresentado na tabela 1, o índice de comportamento de fluxo

(n) foi inferior a 1,0, confirmando que as amostras apresentam um

comportamento reológico não-Newtoniano e pseudoplástico. O valor de n foi

calculado pela equação da lei de potência e, valores de n < 1,0 são

característicos de materiais pseudoplásticos e valores de n > 1,0 são

apresentados por materiais com comportamento de fluxo dilatantes.

Em estudos conduzidos por Hirata e Bruschi (2010) utilizando hidrogéis

de carbopol 934 contendo extrato etanólico de própolis, foi observado

comportamento pseudoplástico e tixotrópico, sendo semelhante aos

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 20 40 60 80

τP

a

ϔ (1/s

Carbômero BrancoCarbômero 0,1%Carbômero 0,2%

0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 20 40 60 80 100

ηP

a.s

ϔ (1/s)

Carbômero BrancoCarbômero 0,1%Carbômero 0,2%

A

B

112

resultados obtidos neste estudo. Os autores também observaram que a

viscosidade média foi dependente da concentração do carbopol 934.

3.3 Propriedades Mecânicas

A análise de perfil de textura (TPA) foi realizada buscando determinar

as propriedades de textura dos hidrogéis. Durante a análise as amostras são

comprimidas duas vezes usando um analisador de textura para fornecer

informações sobre como as amostras se comportam quando aplicadas na pele.

As amostras foram analisadas quanto às características de firmeza,

adesividade, gomosidade, espalhabilidade, coesividade e resiliência.

Observando os parâmetros avaliados durante a análise de textura, os

hidrogéis de carbômero 940 apresentaram maior firmeza quando comparados

aos hidrogéis de alginato de sódio e, em ambos os hidrogéis, foi observado o

aumento da firmeza com o aumento da concentração das MP. Estes resultados

confirmam o comportamento encontrado na análise reológica, em que a

incorporação das MP de QS aumentou a resistência da estrutura do hidrogel.

Conforme discutido acima, a provável interação eletrolítica entre a QS e os

hidrogéis polianiônicos resultou no aumento da firmeza e, embora, as MP

possam intumescer em meio aquoso, esta reticulação permitiu manter estas

como unidades multiparticuladas no sistema hidrofílico. Estes dois fatores

devem ter colaborado para o aumento da viscosidade e da firmeza com o

aumento da concentração de MP nos hidrogéis.

A adesividade do hidrogel de alginato de sódio foi proporcional ao

aumento da concentração de MP. Este comportamento não foi observado no

hidrogel de carbômero 940, em que a ausência de MP apresentou maior

adesividade, quando incorporado 0,1% de MP houve uma redução da mesma e

com a adição de 0,2% de MP a adesividade aumentou, porém o valor foi menor

do que a adesividade do hidrogel sem MP.

A quantidade de grupos carboxílicos livres presentes nas cadeias dos

carbômeros está diretamente relacionada à propriedade de mucoadesão deste

polímero. Neste hidrogel a neutralização é importante, pois a neutralização

resulta na linearização do polímero e, consequentemente no aumento da

densidade de carga do polímero. Sabe-se que a natureza expandida da rede do

polímero contribui grandemente para o mucoadesividade (PEREIRA et al.,

2013). A redução da adesividade do hidrogel de carbômero com a incorporação

das MP pode estar relacionada com a interação polieletrolítica dos grupos

carboxílico com a QS, bem como, com a ruptura da estrutura polimérica

provocada pela presença das MP de QS contendo o extrato das cascas de R.

ferruginea.

113

A adesividade pode ser um indicativo de pegajosidade, e o gel da

alginato apresentou um valor maior quando comparado ao gel de carbômero

940. O mesmo comportamento observado na adesividade do hidrogel de

carbômero 940 foi percebido na coesividade dos hidrogéis. Em ambos os

hidrogéis houve uma redução da resiliência com a incorporação e aumento da

concentração das MP.

A espalhabilidade do hidrogel de alginato diminuiu com o aumentou na

concentração das MP, enquanto o hidrogel de carbômero 940 percebeu-se um

comportamento oposto, ou seja, com a adição das MP a espalhabilidade

demonstrou um pequeno aumento com a adição da maior concentração de

MP.

114

Tabela 2 – Resultados da análise das propriedades de textura do hidrogéis de carbômero 940 2,0% e alginato de sódio 8,0%

com e sem micropartículas de quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea nas concentrações de 0,1 e 0,2% relativo

ao extrato. (lote 4) nas concentrações de 0,1 e 0,2%, usando modo TPA em analisador de textura.

Amostras Firmeza (g) Adesividade (g.s) Espalhabilidade Coesividade Resiliência

Alginato

(branco) 486,98 ± 6,36 - 2466,82 ± 241,78 0,767 ± 0,03 0,957 ± 0,05 0,238 ± 0,12

Alginato

(MP 0,1%) 538,94 ± 34,17 - 3033,23 ± 101,48 0,709 ± 0,02 0,901 ± 0,01 0,067 ± 0,00

Alginato

(MP 0,2%) 677,79 ± 37,45 - 4542,78 ± 116, 27 0,608 ± 0,02 0,924 ± 0,01 0,052 ± 0,00

Carbômero

(branco) 3368,05 ± 94,36 - 42689,7 ± 4300,99 0,514 ± 0,03 0,917 ± 0,08 0,097 ± 0,01

Carbômero

(MP 0,1%) 5280,82 ± 361,14 - 21197, 2 ± 297, 04 0,516 ± 0,03 0,896 ± 0,02 0,093 ± 0,00

Carbômero

(MP 0,2%)

6475,75 ± 230,17

- 29080,7 ±2446, 65 0,532 ± 0,00 0,941 ± 0,02 0,082 ± 0,00

115

3.4 Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória tópica

Para a avaliação da atividade anti-inflamatória tópica in vivo dos

hidrogéis contendo MP com extrato das cascas de R. ferruginea foi utilizado

o modelo de edema de orelha induzido pelo óleo de cróton, os resultados

estão demonstrados na Figura 8.

Figura 8 - Influência do pré-tratamento tópico com micropartículas (MP) de

quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea incorporadas em hidrogéis de

alginato de sódio e carbômero sobre o edema de orelha induzido pela administração tópica de óleo de cróton.

Nota: Naive: animais não tratados; Veículo: salina (controle negativo); MP:

micropartículas de quitosana na dose correspondente a 0,2% de extrato das

cascas de R. ferruginea; Dexametasona 0,1% (controle positivo). Os dados

foram expressos como a média ± desvio padrão de 8 animais em cada grupo. Os

asteriscos indicam a comparação com o grupo naive: *** para p < 0,0001, **

para p < 0,01, *para p < 0,05 e os sustenidos indicam a comparação com o grupo

veículo (controle negativo): ### p < 0,0001, ## para p < 0,01.

O resultado apresentado na Figura 8 indicou que houve redução do

edema induzido pelo óleo de cróton nos hidrogéis contendo 0,2% de MP de

116

R. ferruginea (lote 4) quando comparadas com o naive (animais não tratados)

e com a salina (controle negativo). O extrato incorporado nas MP de QS e

veiculado a 0,2% no hidrogel de carbômero apresentou redução do edema de

76,80% e quando veiculadas no hidrogel de alginato de sódio inibiu o edema

em 83,67%. O potencial de inibição foi comparável ao creme de

dexametasona 0,1%, que é um medicamento usado na clínica para tratamento

de processos inflamatórios tópicos.

Os resultados evidenciaram que a estratégia tecnológica desenvolvida

resultou em um produto com alto potencial anti-inflamatório tópico.

Em estudos desenvolvidos por Dal Mas et al. (2016), o extrato das

cascas de R. ferruginea foi incorporado em creme convencional nas

concentrações de 0,13, 0,25 e 0,5% e em nanoemulsão nas concentrações de

0,13 e 0,25%. Para o creme convencional, as três concentrações apresentaram

resposta semelhante sendo a maior inibição do edema obtida com a

concentração de 0,5% (64,65%). A concentração de 0,25% inibiu 58,64%.

No presente estudo a concentração de 0,2% de MP resultou em inibição do

edema superior a 75%, mostrando que embora o produto desenvolvido seja

um hidrogel convencional, a incorporação do extrato na forma de MP

poliméricas potencializou o efeito anti-inflamatório.

Por outro lado a incorporação do extrato da R. ferruginea em

nanoemulsões mostrou uma inibição de 90,50% do edema na dose de 0,13%

(DAL MAS et al., 2016). Ambos os sistemas hidrogéis contendo MP

poliméricas elaboradas no presente trabalho e nanoemulsões (DAL MAS et

al., 2016) podem ser utilizadas para veicular o extrato mole de RF para a

inibição de processos inflamatórios tópicos. A potencialização pode estar

relacionada com o aumento da solubilidade do extrato pela maior dispersão

na matriz polimérica e, consequentemente no hidrogel, pelas propriedades

bioadesivas e de liberação modificada das micropartículas e do hidrogel. Tais

sistemas além de apresentarem a potencialização da atividade do extrato já

observada para as nanoemulsões, por serem sistemas poliméricos aquosos,

são fisicamente mais estáveis e mais biocompatíveis do que os sistemas

emulsionados.

4 Conclusões

A proposta de nosso estudo foi melhorar as características de

solubilidade do extrato das cascas da R. ferruginea, por meio da

microencapsulação em matriz de quitosana e incorporar este sistema em

hidrogéis poliméricos. Dentre os polímeros selecionados para transportar as

117

micropartículas, o alginato de sódio e o carbômero 940 mostraram ser viáveis,

mantendo as micropartículas reticuladas nos hidrogéis e permaneceram

estáveis sem separação, segregação ou sedimentação durante o período de

análise. A incorporação das micropartículas influenciou na reologia e

propriedades de textura dos hidrogéis, apresentando esta consistência e

adesividade adequadas para este tipo de produto. Ambos os sistemas

desenvolvidos potencializaram a atividade anti-inflamatória tópica do extrato

das cascas de R. ferruginea, sendo que o hidrogel de alginato resultou em

maior inibição do edema e apresentaram características adequadas para

veicular as micropartículas de quitosana contendo extrato das cascas da R.

ferruginea. Estudos posteriores devem ser realizados para verificar o perfil

de liberação do extrato dos hidrogéis, bem como, a estabilidade e segurança

da formulação.

119

CAPÍTULO V

Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo

extrato das cascas de Rapanea ferruginea

121

Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana contendo

extrato das cascas de Rapanea ferruginea

Roseni Bortolon Grassi De Carli; Angela Malheiros; Ruth Meri Lucinda-

Silva

Introdução

A resposta terapêutica dos extratos vegetais geralmente é dependente de

uma mistura complexa de compostos bioativos que têm sua ação

potencializada por efeito sinérgico entre si. No entanto, a maioria dos extratos

vegetais possuem baixa solubilidade em meio aquoso e tempo de meia-vida

curto requerendo administração repetida ou dose mais elevada, tornando

esses produtos fracos candidatos a fármacos. Buscando superar esta

limitação, novos sistemas terapêuticos contendo derivados vegetais têm sido

desenvolvidos, incluindo nanopartículas poliméricas, lipossomas,

nanopartículas lipídicas sólidas, nanomeulsão, entre outras. A incorporação

de derivados vegetais em sistemas nanométricos resulta no aumento da

solubilidade e biodisponibilidade, redução de toxicidade, melhoria na

atividade farmacológica, liberação sustentada das substâncias ativas e

proteção contra degradação química e física (ANSARI; ISLAM; SAMEEM,

2012; NAMDAR et al., 2017).

A nanotecnologia tem sido utilizada em estudos com plantas medicinais

e de substâncias ativas isoladas e tem mostrado resultados promissores na

melhoria dos efeitos terapêuticos. Embora estes sistemas tenham sido

desenvolvidos para fármacos puros, alguns tipos de sistemas permitem

incorporar com alta eficiência extratos vegetais brutos, como por exemplo,

nanoemulsões (CECHETTO, 2016; TSAI; CHEN, 2016; DAL MAS et al.,

2016; XAVIER, 2015), micro e nanopartículas poliméricas (DAS et al., 2012;

HILL; TAYLOR; GOMES, 2013; RIBEIRO et al., 2013), nanopartículas

lipídicas sólidas (DA ROCHA, 2015; LACATUSU et al., 2014; NASSERI et

al., 2016), entre outros.

A quitosana é um polímero policatiônico e excepcionalmente adequado

para aplicações em sistemas de liberação de fármacos, uma vez que permite

a formação de complexos polieletrolíticos, frequentemente utilizados para o

122

desenvolvimento de nanopartículas ou retenção de fármacos dentro do

sistema por interação eletrostática (GERMERSHAUS et al., 2015).

As nanopartículas de quitosana-tripolifosfato são destinadas à

administração in vivo, pois não há nenhum resíduo nocivo que possa

comprometer a segurança do organismo. O método de geleificação

ionotrópica atende a esse requisito, uma vez que este método não requer a

adição de solventes orgânicos, evitando o problema da eliminação de resíduos

antes da administração (FABREGAS et al., 2013).

A Rapanea ferruginea Mez. (Primulaceae) é uma árvore nativa de

países da América do Sul, incluindo o Brasil. Estudos fitoquímicos das cascas

e frutos tem relatado a identificação e o isolamento dos ácidos mirsinoicos A

(AMA), B (AMB) e C (AMC). O AMA encontra-se principalmente nos

frutos, e o AMB está em maior concentração nas cascas (GAZONI, 2009;

ZERMIANI et al., 2016). Estudos demonstraram que extratos e compostos

isolados do gênero Rapanea possuem comprovada ação anti-inflamatória

(BACCARIN et al., 2016; DAL MAS et al., 2016; HESS, 2006),

antinociceptiva (ANTONIALLI, 2009; HESS, 2006), anticolinesterásica

(FILIPPIN, 2010; GAZONI, 2009) e antioxidante (GÓES et al., 2016), entre

outras.

Estudos de pré-formulação dos ácidos AMA e AMB demonstraram que

estes compostos possuem baixa solubilidade em meio aquoso, sendo

classificados como praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL).

Embora estes compostos possuam grupamento carboxílico, que pode formar

ligações de hidrogênio, a cadeia de hidrocarbonetos longa leva a baixa

solubilidade destes compostos em meio aquoso. Os compostos AMA e AMB

possuem valor de log de P de 3,30 e 3,22, respectivamente, sendo semelhante

aos valores encontrados para fármacos anti-inflamatórios como indometacina

e naproxeno (ZERMIANI et al., 2016). A micro e nanoencapsulação de

derivados vegetais tem sido utilizada como estratégia tecnológica para

aumentar a solubilidade destes compostos, melhorando assim a

biodisponibilidade (ESFANJANI; JAFARI, 2016).

Portanto, no presente estudo foram avaliados os parâmetros de processo

e formulação que influenciam na obtenção de nanopartículas de quitosana

contendo o extrato das cascas de R. ferruginea pelo método de geleificação

ionotrópica com tripolifosfato de sódio (TPP). As nanopartículas

desenvolvidas foram caracterizadas quanto à distribuição de tamanho e

aspectos morfológicos.

123


2.1 Material

Ácido acético glacial PA foi adquirido da Biotec® (São Paulo, São

Paulo, Brasil), Alginato de sódio foi adquirido da Isofar® (Rio de Janeiro, Rio

de Janeiro, Brasil), Polissorbato 80 (Tween® 80) foi adquirido da Dinâmica®,

Propilenoglicol foi adquirido da Biotec®(São Paulo, São Paulo, Brasil),

Quitosana (QS), com peso molecular médio, viscosidade de 200-800 mPa.s

(dispersão a 1% em ácido acético 1%, a 25 ºC) e grau de desacetilação de

72,45% e o Tripolifosfato de sódio (TPP) foram adquiridos da Sigma

Aldrich® (St. Loius, Missouri, USA); Ultramona® RH400 foi adquirido da

Oxiteno (São Paulo, São Paulo, Brasil).

2.2 Material vegetal

As cascas da R. ferruginea foram coletadas em Blumenau-SC, na Rua

Belo Horizonte, bairro Glória. A autenticidade botânica foi verificada através

da comparação entre a exsicata da planta coletada com o exemplar depositado

no Herbário Barbosa Rodrigues (Itajaí-SC) sob o código HBR 52715.

O extrato das cascas de R. ferruginea (RF), foi obtido a partir da solução

extrativa usando método de maceração dinâmica, conforme descrito no item

2.2 do capítulo III (p. 42). O extrato usado no presente estudo possui teor de

AMA e AMB de 60,73 e 91,9 mg/g de resíduo seco, representando uma

relação de 1:1,5 AMA:AMB, aproximadamente.

2.3 Seleção da matriz polimérica

Para obtenção de nanopartículas (NP) poliméricas contendo o extrato

das cascas de R. ferruginea, inicialmente foram realizados testes para seleção

do polímero e o método de obtenção. Foram testados como polímero o

alginato de sódio (AL) e a quitosana (QS), variando o agente de coacervação

e a incorporação do extrato, conforme apresentado no Quadro 1.

A solução de QS a 0,5% foi obtida usando solução aquosa de ácido

acético 0,1 M como solvente. O valor de pH foi ajustado para 4,0 usando

solução diluída de hidróxido de sódio.

O extrato mole de R. ferruginea na concentração de 0,05% foi

adicionado nas dispersões poliméricas, sob agitação (Agitador mecânico-

124

Fisatom®) a 2000 rpm por 10 min, acrescentando propilenoglicol 5,0% e

Tween® 80 0,5%, seguidos de sonicação (banho de ultrassom-Elo Sonics-

Ultrasonic®) por 60 min.

Na obtenção das partículas, a dispersão polimérica foi gotejada

manualmente com auxílio de um conta-gotas sob agitação mecânica a 2500

rpm em um intervalo de 10 min.

Quadro 1 – Composição das NP testadas nos estudos de seleção da matriz polimérica

para as NP contendo extrato das cascas de R. ferruginea.

Teste Solução gotejada Solução aceptora

1 AL 0,5% pH 4,5 (10 mL)

RF 0,05% QS 0,5% (30 mL) pH 4,0

2 AL 0,5% pH 4,5 (10 mL)

TPP 0,2% RF 0,05% QS 0,5% (30 mL) pH 4,0

3 TPP 0,1% (30 mL) QS 0,5% (20 mL) pH 4,0

RF 0,05%

4 QS 0,5% (20 mL) pH 4,0

RF 0,05% TPP 0,1% (30 mL)

5 TPP 0,1% (30 mL)

RF 0,05% QS 0,5% (20 mL) pH 4,0

Nota: AL – alginato de sódio; TPP – tripolifosfato de sódio; QS – quitosana; RF –

extrato das cascas de Rapanea ferruginea.

As NP obtidas foram avaliadas quanto ao tamanho médio e índice de

polidispersidade (PDI) por espalhamento de luz dinâmico (dynamics light

scattering – DLS) (Zeta sizer Malvern® Nano-ZS). A análise foi realizada

sem e com filtração da amostra em filtro 0,45 µm.

2.4 Obtenção e otimização das nanopartículas de QS contendo

extrato das cascas de Rapanea ferruginea (RF)

Para obtenção das NP contendo extrato, foi preparada a solução de QS

a 2,0% pH 5,0, sob agitação mecânica a 700 rpm por 12 h e filtrada a vácuo

com papel Unifil C 41, e a solução aquosa de TPP a 1,0%.

Devido à dificuldade de incorporação do extrato, as NP foram

preparadas usando solução de QS a 0,05% e solução de TPP a 0,0125%.

125

O extrato mole das cascas de R. ferruginea (RF) foi incorporado na

solução de QS na proporção 1:10 RF:QS (m/m), usando Tween® 80 como

dispersante.

Em béquer de 100 mL, foram adicionados 20 mL de solução de QS

contendo extrato na proporção 1:10 RF:QS e gotejados 20 mL de solução de

TPP 0,0125% em um período de 15 min, sob agitação mecânica a 300 rpm.

A solução foi mantida sob agitação por 30 min e acondicionada em frasco de

vidro, até análise de tamanho por DLS.

Para otimizar o método de obtenção das NP de RF:QS, foi elaborado

um planejamento fatorial 32, tendo como fatores a taxa de agitação (300, 500

e 700 rpm) e a taxa de gotejamento da solução de TPP (1,0, 1,5 e 2,0 mL/min),

conforme apresentado no Quadro 2. Neste estudo foi usada a proporção de

RF:QS 1:10 e TPP:QS 1:4 (20 mL de TPP 0,0125% e 20 mL de QS 0,05%).

Quadro 2- Planejamento fatorial 32 usado na otimização do método de obtenção de

NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea, tendo como fatores as

taxas de agitação e gotejamento da solução de TPP.

Amostra

Fator 1 Fator 2

Nível Taxa de

agitação (rpm) Nível

Taxa de gotejamento

(mL/min)

1 -1 300 -1 1,0

2 -1 300 0 1,5

3 -1 300 1 2,0

4 0 500 -1 1,0

5 0 500 0 1,5

6 0 500 1 2,0

7 1 700 -1 1,0

8 1 700 0 1,5

9 1 700 1 2,0

As amostras foram analisadas em triplicata quanto à distribuição de

tamanho, PDI e potencial zeta.

A partir dos resultados obtidos com o planejamento fatorial descrito

acima, foi realizado um novo planejamento para otimização da composição

das NP. No planejamento fatorial 42 foram estudados os fatores proporção

126

extrato:polímero (RF:QS) (1:5, 1:10, 1:15 e 1:20) e TPP:QS (1:3, 1:4, 1:5 e

1:6), conforme descrito no Quadro 3.

Quadro 3- Planejamento fatorial 42 usado na otimização da composição das NP de

QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea, tendo como fatores as

proporções de extrato:polímero (RF:QS) e TPP:QS.

Amostra

Fator 1

RF:QS

Fator 2

TPP:QS

Nível Proporção

(m/m) Fração Nível

Proporção

(m/m) Fração

1 -2 1:5 0,200 -2 1:3 0,33

2 -2 1:5 0,200 -1 1:4 0,25

3 -2 1:5 0,200 1 1:5 0,20

4 -2 1:5 0,200 2 1:6 0,17

5 -1 1:10 0,100 -2 1:3 0,33

6 -1 1:10 0,100 -1 1:4 0,25

7 -1 1:10 0,100 1 1:5 0,20

8 -1 1:10 0,100 2 1:6 0,17

9 1 1:15 0,066 -2 1:3 0,33

10 1 1:15 0,066 -1 1:4 0,25

11 1 1:15 0,066 1 1:5 0,20

12 1 1:15 0,066 2 1:6 0,17

13 2 1:20 0,050 -2 1:3 0,33

14 2 1:20 0,050 -1 1:4 0,25

15 2 1:20 0,050 1 1:5 0,20

16 2 1:20 0,050 2 1:6 0,17

Nota: TPP – tripolifosfato de sódio; QS – quitosana; RF – extrato das cascas de

Rapanea ferruginea.

As NP foram preparadas conforme método descrito acima, usando

solução de QS 0,05% contendo extrato nas proporções estabelecidas no

desenho experimental; taxa de agitação de 500 rpm e taxa de gotejamento de

1,5 mL/min. Após complexação, a dispersão foi mantida sob agitação por 30

min.

127

2.4.1 Análise de distribuição de tamanho

A distribuição de tamanho das NP foi determinada em triplicata através

do equipamento de difração de luz laser (Zeta sizer Malvern® Nano-ZS).

Foram analisados os parâmetros de distribuição de tamanho, PDI) e potencial

zeta.

2.4.2 Análise morfológica por MET

As amostras 9 e 16 foram analisadas por microscopia eletrônica de

transmissão- MET (Jeol, mod. JEM-1200EX II). Para o preparo da amostra,

uma gota da dispersão de NP foi gotejada sobre a grade de cobre de 400 mesh

com filme de FormVar carbono, deixando secar por 20 min. Em seguida foi

gotejado uma gota da solução contraste (acetato de uranila 2%) sobre a grade

com amostra e analisado em MET. A análise foi realizada a 80 kV.

2.4.3 Análise estatística

A análise do planejamento fatorial foi realizada usando software

Minitab® versão 18.1. Foi analisada a influência de cada fator sobre as

respostas e também a interação entre os fatores nas respostas obtidas. Os

resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de um fator,

seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Tukey.

Os valores de p<0,05 foram considerados indicativos de significância.

3 Resultados e Discussão

Para a preparação das NP poliméricas, dois métodos são comumente

utilizados, (a) dispersão e solvatação dos polímeros; (b) polimerização a

partir de macromoléculas naturais. As NP poliméricas biodegradáveis podem

ser produzidas a partir de proteínas (gelatina e proteínas de leite),

polissacarídeos (quitosana, alginato de sódio e amido) e polímeros sintéticos

como ácido poliláctico (PLA), co-polímeros dos ácidos poliláctico-glicólico

(PLGA) e ácido poliglicólico (PLG) (ESFANJANI; JAFARI, 2016). No

presente estudo, a QS foi empregada como polímero na obtenção de NP

contendo o extrato das cascas de R. ferruginea.

128

3.1 Seleção da matriz polimérica

Na obtenção das NP de QS foram inicialmente testados os métodos de

coacervação complexa com alginato de sódio (AL) e geleificação ionotrópica

com o contra-íon tripolifosfato (TPP).

Nos dois primeiros testes realizados (Quadro 1), usando o método de

coacervação complexa, o extrato foi incorporado na dispersão de AL, e a

dispersão foi gotejada na dispersão de QS. No teste 2 foi adicionado TPP na

dispersão de AL na proporção 1:3,5 TPP:QS. As duas condições testadas não

resultaram em sistemas na escala nanométrica, quando analisada a

distribuição de tamanho por DLS. Resultado semelhante foi encontrado por Tagliari (2012) quando avaliou alguns parâmetros como concentração e pH

da dispersão de QS, concentração de AL e concentração de TPP, durante a

formação das NP contendo ácido glicirrízico. Foram obtidos sistemas

agregados com precipitação. Nos testes 3 e 5 (quadro 1) foi empregado o método de salting out

usando o TPP como contra-íon em uma relação 1:4 TPP:QS. Nas amostras

preparadas com o gotejamento da dispersão de TPP na QS, as partículas

apresentaram tamanho menor quando o extrato foi incorporado na QS (Teste

3) do que quando incorporado na solução de TPP (teste 5), conforme

apresentado na Figura 1 e na Tabela 1. A filtração da amostra em filtro 0,45

µm resultou em redução do tamanho médio em ambos os testes devido a

extrusão dos sistemas, porém não reduziu o valor de PDI, mostrando que as

amostras permaneceram polidispersas. No teste 5 houve aumento do PDI

após filtração. Neste teste o extrato foi disperso na solução de TPP. A

heterogeneidade da dispersão do extrato na solução pode ter resultado em

agregado com tamanho acima de 500 nm. Quando filtrado, estes agregados

foram separados e a dispersão polimérica apresentou tamanho entre 76,95 a

170,92 nm e um índice de polidispersão entre 0,556 e 0,630.

129

Tabela 1 - Resultados da análise de tamanho e polidispesidade

(PDI) das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea

usando método de espalhamento de luz dinâmico (DLS), com

leitura direta ou após filtração em filtro 0,45 µm.

Amostras Diâmetro

médio (nm) PDI

3 302,83 0,505

3 filtrado 127,97 0,556

4 170,92 0,506

4 filtrado 102,51 0,640

5 632,87 0,249

5 filtrado 76,95 0,630

A obtenção das NP pelo gotejamento da dispersão de QS na solução de

TPP (teste 4) resultou em partículas com diâmetro médio de 170,92 nm e PDI

de 0,50 (Figura 1 e Tabela 1). Após filtração, o diâmetro médio reduziu para

102 nm, porém a polidispersão aumentou, mostrando a heterogeneidade do

sistema.

A partir dos resultados obtidos, foi dado prosseguimento ao estudo

usando o procedimento usado no teste 3, ou seja, a QS como polímero

formador da matriz, o TPP como contra-íon pelo método de salting out com

gotejamento da solução de TPP na dispersão de QS contendo extrato.

3.2 Obtenção das nanopartículas de quitosana contendo extrato das cascas

de Rapanea ferruginea (RF)

A partir da solução da QS 0,05%, contendo extrato das cascas de R.

ferruginea na proporção 1:10, e da solução de TPP 0,0125% foram obtidas

NP com diâmetro médio de 141,5 nm, PDI de 0,797 e potencial zeta de 61,9

mV.

Embora tenha-se na literatura uma quantidade considerável de registros

de obtenção de sistemas a base de quitosana-tripolifosfato utilizando o

método de geleificação ionotrópica, há muitas variações nas concentrações

iniciais dos componentes. No entanto, há pouco registros sobre a otimização

dos parâmetros do processo sobre o tamanho e carga de superfície das NP

(FABREGAS et al., 2013).

130

Figura 1 – Distribuição de tamanho das NP de QS contendo extrato das cascas de R.

ferruginea usando método de espalhamento de luz dinâmico (DLS), com leitura direta

ou após filtração em filtro 0,45 µm.

3 3 filtrado

4 4 filtrado

5 5 filtrado

Portanto, a partir das condições iniciais estabelecidas, foi realizada a

otimização da obtenção das nanopartículas iniciando pelo estudo da

influência das taxas de agitação e de gotejamento da solução de TPP. Para

tanto, foi empregado um planejamento 32.

131

Conforme apresentado na Tabela 2, as NP apresentaram tamanho menor

que 10 nm, com alto índice de polidispersidade (0,737 a 0,954) e potencial

zeta entre 44 e 47 mV.

Conforme apresentado na Figura 2A, a taxa de agitação não teve uma

resposta linear no tamanho das NP. O ponto central (500 rpm) resultou em

partículas menores quando comparado a velocidade de 300 rpm e 700 rpm.

A diferença observada não foi significativa (p = 0,628).

Tabela 2 - Resultados da análise de tamanho, índice de polidispersidade (PDI) e

potencial zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea a partir

do planejamento fatorial 32*

Amostras Diâmetro médio

(nm) PDI

Potencial

Zeta (mV)

1 8,41 ± 0,62 0,954 46,0

2 8,30 ± 0,36 0,879 46,2

3 7,84 ± 0,50 0,811 45,2

4 9,05 ± 0,15 0,922 45,1

5 7,68 ± 1,30 0,742 45,6

6 6,83 ± 2,92 0,737 45,4

7 7,90 ± 0,43 0,771 46,2

8 8,67 ± 0,67 0,852 47,0

9 8,78 ± 0,64 0,906 44,3

*Planejamento Fatorial 32 – fator 1 – taxa de agitação (300, 500 e 600 rpm);

Fator 2 – taxa de gotejamento da solução de TPP (1,0, 1,5 e 2,0 mL/min).

Fàbregas et al. (2013) analisaram alguns parâmetros que influenciam na

formação de NP pelo método de geleificação ionotrópica como velocidade

de agitação (500 a 900 rpm), tempo de reação (10 e 15 min), tempo de adição

da solução de tripolifosfato (5 e 10 min) e observaram que o tempo de

agitação influenciou no tamanho das NP, sendo o melhor resultado na

velocidade de agitação de 800 rpm (105 e 209 nm).

132

Figura 2 – Gráficos dos efeitos principais dos fatores (A) e de interação entre os

fatores (B) taxa de agitação e taxa de gotejamento da solução de TPP sobre o tamanho

médio das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea.

A

B

A taxa de gotejamento da solução de TPP também não apresentou

influência significativa sobre o tamanho de partícula (p = 0,571), porém

houve uma tendência à redução de tamanho com o aumento da taxa de

gotejamento. Na análise da interação dos dois fatores estudados sobre o

tamanho de partícula (Figura 2B), foi observada a redução do tamanho com

o aumento da taxa de gotejamento de 1,5 para 2,0 mL/min e o aumento da

taxa de agitação de 300 para 500 rpm.

133


fatores (B) taxa de agitação e taxa de gotejamento da solução de TPP sobre o índice

de polidispersidade das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea.

A

B

Os resultados mostram que é necessária uma condição adequada de

gotejamento e agitação para formação do sistema. Este comportamento está

relacionado com a homogeneidade de dispersão das cadeias poliméricas do

polímero em movimento e a disponibilização do contra-íon e consequente

reticulação. Baixas taxas ou altas taxas de agitação podem resultar em

agregação das cadeias poliméricas e, a reticulação destes agregados leva à

obtenção de partículas de maior tamanho.

Os sistemas consistindo de NP coloidais têm uma alta tendência à

agregação. A energia mecânica associada à velocidade de agitação da reação

pode exceder a energia de repulsão eletrostática entre as cargas de superfície

positivas das nanopartículas, eventualmente desencadeando fenômenos de

agregação, representando um problema para a formação de nanopartículas

(FABREGAS et al., 2013).

134

A influência dos fatores sobre o índice de polidispersidade é apresentada

nos gráficos presentes na Figura 3. A influência foi semelhante à observada

para o tamanho médio das NP, bem como, não foram significantes com valor

de p > 0,05. Estes resultados podem ser justificados pela hipótese descrita

acima de influência das taxas de gotejamento e agitação sobre a formação da

NP.

O potencial zeta é uma propriedade importante para dispersões

nanométricas, pois a estabilização do sistema sofre influência da carga de

superfície das partículas poliméricas. No presente estudo, a QS foi usada

como polímero e, por seu caráter catiônico, resulta em partículas com

potencial catiônico. Conforme apresentado na Tabela 2 e na Figura 4, as

partículas apresentaram potencial de carga maior que 40 mV, sendo

considerável um potencial capaz de evitar a floculação e agregação das

partículas.

A taxa de gotejamento da solução de TPP foi o fator com maior

influência sobre o potencial zeta (p = 0,109), embora não seja considerado

estatisticamente significativo. O aumento da taxa de 1 para 1,5 mL/min

aumentou o potencial, porém uma redução foi observada com o aumento para

2 mL/min, mostrando uma maior eficiência de reticulação do polímero,

promovendo uma maior neutralização. Tal resposta pode ser relacionada com

redução do tamanho de partícula com o aumento da taxa de gotejamento, ou

seja, maior reticulação, menor tamanho e carga de superfície.

135


fatores (B) taxa de agitação e taxa de gotejamento da solução de TPP sobre o potencial

zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea.

A

B

Uma menor influência sobre a carga de superfície é observada para o

fator taxa de agitação (p = 0,773). Tal resposta é coerente, pois este é um fator

mecânico, que embora tenha impacto sobre o tamanho das NP, pouco pode

influenciar esta propriedade físico-química.

Após avaliação dos parâmetros que influenciam na formação das NP

Fàbregas et al. (2013), observaram que o valor do potencial zeta não sofreu

alterações significativas dos parâmetros tempo de adição da solução de TPP

e taxa de agitação.

136

A Figura 4B, mostra que o comportamento de alteração do potencial

zeta quando analisada a interação dos dois fatores, diferentemente do

observado para o tamanho e PDI, o comportamento das amostras preparadas

com taxa de gotejamento de 2 mL/min foi diferente dos perfis das taxas de 1

e 1,5 mL/min.

Os resultados obtidos com a análise da influência das taxas de agitação

e gotejamento sobre as propriedades das NP de QS contendo o extrato de R.

ferruginea mostram que estes não apresentam influência significativa, por

isto para continuidade dos estudos de otimização foram selecionados níveis

centrais testados, ou seja, agitação de 500 rpm e taxa de gotejamento de 1,5

mL/min.

Desta forma, a obtenção das NP foi verificada frente a diferentes

proporções extrato:polímero (RF:QS) e agente reticulante TPP e polímero

(TPP:QS). O estudo foi realizado usando planejamento fatorial 42. Tal

desenho foi estabelecido pela necessidade de obter resultados mais

detalhados sobre as propriedades das NP.

Analisando os resultados apresentados na Tabela 3, as NP 1, 2 e 3 tendo

a proporção de RF:QS de 1:5 (0,2) e TPP:QS 1:3 (0,33), 1:4 (0,25) e 1:5 (0,2),

apresentaram tamanhos semelhantes (6,66, 8,66 e 7,13 nm, respectivamente),

já a amostra 4 com a mesma proporção de RF:QS, mas na proporção de

TPP:QS 1:6 (0,17), apresentou tamanho maior de partícula (268,20 nm) e

maior índice de polidispersidade (0,863).

As amostras 5 e 6, preparadas com proporção RF:QS 1:10 e TPP:QS 1:3

e 1:4, respectivamente, apresentaram diâmetro médio semelhante às amostras

1 a 3, ou seja, inferior a 10 nm. Este mesmo comportamento foi observado

para a amostra 10, preparada com proporção RF:QS 1:15 e TPP:QS 1:4.

As demais amostras apresentaram tamanho entre 50 e 270 nm, com

ampla distribuição de tamanho, sendo consideradas polidispersas.

As NP obtidas apresentaram potencial zeta entre 38 e 50 mV, sendo

classificadas como sistemas com alto potencial zeta.

A análise dos resultados de tamanho das NP frente às variáveis

estudadas mostra que a proporção extrato: polímero apresentou fraca

influência sobre o tamanho das NP (p=0,953), com tendência à redução de

tamanho com o aumento da proporção de extrato na matriz polimérica (Figura

5A).

137

Tabela 3 - Resultados da análise de tamanho, índice de polidispersidade (PDI) e

potencial zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R. ferruginea a partir

do planejamento fatorial 42*

Amostras Diâmetro médio

(nm) PDI

Potencial Zeta

(mV)

1 6,66 ± 1,85 0,754 38,8

2 8,66 ± 0,98 0,556 43,8

3 7,13 ± 2,76 0,620 46,4

4 268,20 ± 121,0 0,863 48,6

5 7,96 ± 0,54 0,702 41,3

6 7,68 ± 1,30 0,742 45,6

7 94,88 ± 155,20 0,589 47,9

8 162,50 ± 153,70 0,827 49,8

9 55,49 ± 43,71 0,746 43,1

10 8,63 ± 0,63 0,596 45,6

11 104,10 ± 91,05 0,731 46,3

12 129,60 ± 167,40 0,552 47,5

13 73,64 ± 60,30 0,522 34,7

14 56,14 ± 22,96 0,564 34,8

15 170,20 ± 111,70 0,608 43,2

16 95,59 ± 36,90 0,750 47,7

*Planejamento Fatorial 42 – Fator 1 – Proporção RF:QS (0,05, 0,07, 0,1 e 0,2); Fator

2 – Proporção TPP:QS (0,17, 0,2, 0,25 e 0,33).

A proporção de TPP apresentou significativa influência sobre o

tamanho das NP, com valor de p de 0,011 (Figura 5A). NP com maior

diâmetro foram obtidas usando proporções 1:5 (0,2) e 1:6 (0,17) TPP:QS.

138

Figura 5 – Análise de tamanho médio das NP de QS contendo extrato das cascas de

R. ferruginea preparadas com diferentes proporções extrato:polímero (RF:QS) e

TPP:QS. A) Gráficos dos efeitos principais dos fatores; B) Gráfico de interação entre

os fatores e C) análise de variância do tamanho frente à proporção TPP:QS.

A

B

C

139

Conforme apresentado na Figura 5B, exceto para a proporção TPP:QS

1:6 (0,17), o aumento da proporção de extrato resultou em partículas de

menor diâmetro. O gráfico de interação entre os fatores mostra, que o

diâmetro das NP é dependente tanto da proporção de extrato quanto de TPP

na matriz. Sendo necessário ajustar estes parâmetros para obtenção de

nanopartículas com diâmetro superior a 100 nm.

Por meio da análise de variância, foi verificado que as amostras

preparadas com TPP:QS 1:6 possuem tamanho estatisticamente diferentes

das amostras preparadas com proporções 1:4 e 1:3.

As NP de QS contendo extrato apresentaram alta polidispersidade

mostrando que as amostras possuem ampla faixa de distribuição de tamanho.

Conforme apresentado na Figura 6A, o aumento da proporção de extrato na

matriz resultou em aumento da polidispersidade, mostrando que a formação

da NP de QS é influenciada pela presença do extrato. O aumento da

proporção de TPP reduziu a polidispersidade até a proporção 1:4 (0,25),

porém o aumento para 1:3 (0,33) resultou em partículas mais dispersas. São

vários os fatores que alteram a polidispersidade de um sistema, porém neste

caso o aumento do TPP além de 0,25 pode formar coacervados com a QS de

forma mais desorganizada e amorfa.

Conforme apresentado na Figura 6B, quando confrontada as interações

entre os fatores com o valor de PDI, há variabilidade dos resultados,

mostrando que os sistemas possuem ampla faixa de tamanho, não havendo

uma correlação entre PDI e proporção de RF:QS. As variáveis estudadas não

apresentaram influência significativa sobre o PDI, com valor de p de 0,557 e

0,320 para a proporção de extrato e TPP, respectivamente.

Um outro parâmetro explorado na análise estatística das amostras foi o

valor de potencial zeta. Conforme mostrado na Figura 7 e, já observado no

planejamento fatorial anterior (Figura 4), o aumento da proporção de TPP

resulta em um significante redução do potencial zeta (valor de p = 0,013),

mostrando a formação do complexo TPP:QS pela neutralização dos

grupamentos catiônicos da QS.

O aumento da proporção do extrato na matriz resultou em um leve

aumento do potencial zeta, porém não de forma significativa (p=0,245), o

que fica evidente no gráfico de interação entre os fatores estudados (Figura

7B).

140

Figura 6 – Análise da polidispersidade de tamanho das NP de QS contendo extrato

das cascas de R. ferruginea preparadas com diferentes proporções extrato:polímero

(RF:QS) e TPP:QS. A) Gráficos dos efeitos principais dos fatores; B) Gráfico de

interação entre os fatores.

A

B

A análise de variância dos resultados de potencial zeta (Figura 7C)

permitiu verificar que as amostras preparadas com TPP 1:6 possuem valor de

potencial zeta diferente das NP preparadas com TPP 1:3.

141

Figura 7 – Análise do potencial zeta das NP de QS contendo extrato das cascas de R.

ferruginea preparadas com diferentes proporções extrato:polímero (RF:QS) e

TPP:QS. A) Gráficos dos efeitos principais dos fatores; B) Gráfico de interação entre

os fatores e C) análise de variância do tamanho frente à proporção TPP:QS.

A

B

C

142

A morfologia das NP de QS contendo o extrato de R. ferruginea

(amostras 9 e 16) é apresentada nas Figuras 8 e 9. As NP apresentaram

formato esférico, sem aglomeração, confirmando a formação de

nanopartículas poliméricas e não a simples formação de agregados

poliméricos. O tamanho de partícula verificado por DLS foi confirmado pelas

nanografias por MET.

Figura 8 – Fotonanografia por MET das NP de TPP:QS (1:3) contendo extrato das

cascas de R. ferruginea (1:15). Aumento de 30.000x (A) e 50.000x (B).

A

B

143

Figura 9 – Fotonanografia por MET das NP de TPP:QS (1:6) contendo extrato das

cascas de R. ferruginea (1:20). Aumento de 1.000x.

As NP podem ser preparadas por interação eletrostática resultando na

gelificação ionotrópica da QS pelo TPP, um poliânion forte (SHAO-JUNG

et al., 2013; KANG et al, 2015). Esta interação requer apenas temperatura e

condições de pH moderadas, o tamanho das NP pode ser controlada pela

variação da relação TPP:QS, como observado no presente estudo.

A incorporação de grupos fosfato em QS é particularmente interessante,

pois melhora a sua estabilidade através da reticulação numa única etapa

(PATI; ADHIKARI; DHARA, 2011). Esta simples técnica envolve a mistura

da fase ácida (pH 4 e 6) contendo QS com uma fase alcalina (pH 7 e 9)

contendo TPP. As NP são imediatamente formadas após a mistura destas

duas fases através das ligações intra e intermoleculares criadas entre os

grupos amino da QS e os fosfatos do TPP (ELGADIR et al., 2015).

NP de insulina foram preparadas utilizando diferentes volumes da

solução de TPP contendo insulina a qual foi adicionada em 4 mL da solução

de quitosana sob agitação constante à temperatura ambiente. O tamanho

obtido das NP de QS foram de 300 e 400 nm com uma carga positiva de

superfície desde ± 54 a +25 mV (ELGADIR et al., 2015).

144

4 Conclusões

Nanopartículas de quitosana contendo extrato das cascas de Rapanea

ferruginea foram desenvolvidas. O diâmetro das nanopartículas foi

dependente tanto da proporção extrato:polímero quanto de TPP na matriz,

estando entre 50 e 270 nm, porém polidispersas e com potencial zeta entre 38

e 50 mV. Entre as nanopartículas desenvolvidas as que apresentaram

melhores características foram as amostras 7 (RP:QS 1:10 e TPP:QS 1:5),

amostra 12 (RP:QS 1:15 e TPP:QS 1:6) e a amostra 14 (RP:QS 1:20 e

TPP:QS 1:4), sendo os diâmetros médios de 94,88 ± 155,20; 129,60 ± 167,40

e 56,14 ± 22,96 nm, respectivamente e o PDI e potencial zeta,

respectivamente de 0,589 e 47,9 mV; 0,552 e 47,5 mV; 0,564 e 34,8 mV. As

nanopartículas apresentaram formato esférico confirmando a formação de

nanopartículas poliméricas e a nanoincorporação do extrato na matriz

polimérica. Os fatores estudados permitiram conhecer as variáveis do

processo e da composição que influenciam a formação das nanopartículas de

quitosana contendo extrato das cascas de R. ferruginea. Baseado no potencial

que os sistemas nanométricos possuem no aumento da solubilidade e

biodisponibilidade de fitoderivados, o desenvolvimento de nanopartículas

poliméricas contendo o extrato de R. ferruginea será continuado com a

realização de estudos biofarmacêuticos e de eficácia a fim de avaliar a

influência da nanoencapsulação do extrato sobre a resposta biológica.

145

CAPÍTULO VI

Considerações Finais

147

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os sistemas de liberação modificada de fármacos representam uma das

áreas mais promissoras para o desenvolvimento de novos medicamentos, pois

oferecem inúmeras vantagens em relação às formas farmacêuticas

convencionais. Entre tais vantagens estão à melhoria da eficácia, redução da

toxicidade, liberação do fármaco no local especifico de ação, redução do

número de doses, otimização da velocidade de liberação, melhoria da

estabilidade com redução da velocidade de degradação e aumento da adesão

e conveniência do paciente. A biodisponibilidade e a solubilidade de

fármacos são fatores que geralmente causam dificuldades para o

desenvolvimento de formas farmacêuticas de liberação e estes sistemas são

capazes de promover o aumento da solubilidade pelo aumento da área

superficial, resultando em aumento de eficácia e redução de efeitos colaterais.

A proposta deste estudo foi desenvolver sistemas nanoestruturados,

micro e nanopartículas poliméricas, para melhorar a solubilidade e

consequente biodisponibilidade do extrato das cascas de R. ferruginea usando

a quitosana como polímero e avaliar a influência destes sistemas na atividade

anti-inflamatória oral e tópica em modelos farmacológicos in vivo.

O primeiro sistema desenvolvido foram as micropartículas (MP)

poliméricas de quitosana (QS) contendo o extrato das cascas de R. ferruginea

(RF) usando a técnica de spray drying. Foi escolhida esta técnica por ser de

fácil reprodutibilidade e escalonamento e também por ser um dos métodos

que proporciona boa estabilidade e eficácia quando comparada as técnicas

que utilizam solventes orgânicos. Além da caracterização do sistema foram

avaliados o teor, e a eficiência de encapsulação e o perfil de dissolução das

MP. As MP que continham como agentes de dispersão o propilenoglicol +

RH400 (0,75 + 0,50%) demonstraram perfis de dissolução de liberação

prolongada dos marcadores AMA e AMB durante 24 h de análise. A partir

destes resultados foi realizada a avaliação de biodesão em modelo ex vivo e a

atividade anti-inflamatória oral pelo modelo de formalina. No teste de

bioadesão ex vivo, as MP do lote 2 e 4 apresentaram bioadesão entre 24,58%

e 15,27%, respectivamente, e foi dependente do agente de dispersão

empregado. MP somente com propilenoglicol apresentaram maior taxa de

bioadesão do que as que continham propilenoglicol e Ultramona RH400.

Para a avaliação da atividade anti-inflamatória oral in vivo das MP de

QS contendo o extrato das cascas de R. ferruginea pelo modelo de formalina

foi escolhido a dose de 150 mg/kg, menor dose que apresentou eficácia nos

148

ensaios com o extrato isolado. As MP brancas contendo Ultramona RH400

demonstrou atividade na dor neurogênica semelhante às MP 2 e 4. O extrato

microencapsulado (lotes 2 e 4) apresentou 63,93% e 68,62%,

respectivamente de inibição na dor neurogênica, valores estatisticamente

similares, o lote 4 apresentou maior atividade na dor inflamatória de 59,13%.

As MP (lote 4) contendo o tensoativo polietoxilado Ultramona RH400

apresentaram maior atividade farmacológica, fator este que provavelmente

potencializou a ação dos marcadores.

As MP de QS contendo o extrato das cascas de R. ferruginea 1:10

extrato:polímero e propilenoglicol+Ultramona RH400 como agentes

dispersantes foram incorporadas em hidrogel aniônico com o objetivo de

promover a administração tópica do extrato. As MP foram dispersas em

hidrogéis de alginato de sódio e carbômero 940. As MP permaneceram

estáveis fisicamente no veículo hidrofílico, mostrando a capacidade dos

hidrogéis em reticular as partículas de quitosana. Os hidrogéis apresentaram

um perfil reológico do tipo não-Newtoniano, pseudoplástico e tixotrópico,

perfil esperado para preparações semissólidas. A incorporação das MP

influenciou na reologia e propriedades de textura dos hidrogéis, apresentando

consistência e adesividade adequadas para este tipo de produto. Neste sistema

foi verificada a atividade anti-inflamatória tópica in vivo pelo modelo de

edema de orelha induzido pelo óleo de cróton e percebeu-se que o hidrogel

de carbômero contendo as MP de QS apresentou redução do edema de

76,80% e quando incorporadas no hidrogel de alginato de sódio a redução do

edema foi 83,67%. O extrato quando incorporado nas MP de QS e veiculado

nos hidrogéis apresentou potencial anti-inflamatório superior ao observado

quanto incorporado em emulsão convencional e semelhante ao obtido para

incorporação em nanoemulsões (DAL MAS et al., 2016). Desta forma pode

ser observado que tanto o sistema de hidrogéis contendo MP poliméricas e

nanoemulsões apresentaram atividade anti-inflamatória tópica in vivo e

podem ser utilizados como veículos para transportar o extrato mole das cascas

de R. ferruginea.

Um terceiro sistema foi desenvolvido com o intuito de avaliar os

parâmetros físico-químicos que influenciam no desenvolvimento de

nanopartículas (NP) poliméricas de QS contendo extrato das cascas de R.

ferruginea. Para esta avaliação foram selecionados 2 métodos, coacervação

complexa com alginato de sódio e geleificação ionotrópica com o contra-íon

tripolifosfato (TPP). Foram testadas duas condições para o método de

149

coacervação complexa e nenhuma delas resultou em sistemas na escala

nanométrica, quando analisada a distribuição de tamanho por DLS, sendo

descartado este método. Várias condições foram testadas no método de

geleificação ionotrópica sendo a condição escolhida para análise dos demais

parâmetros a dispersão de QS a 0,05%, contendo extrato das cascas de RF na

proporção 1:10, e solução de TPP a 0,0125% sendo obtidas NP com diâmetro

médio de 141,5 nm, PDI de 0,797 e potencial zeta de 61,9 mV. A partir desta

condição foi realizado um planejamento 32 para a otimização da obtenção das

NP avaliando a influência das taxas de agitação e de gotejamento da solução

de TPP, porém estas não apresentaram influência significativa sobre as

propriedades das NP de QS. No estudo da influência da composição

(proporção extrato:QS e TPP:QS) foi observado que proporção extrato:

polímero (RF:QS) apresentou fraca influência sobre o tamanho das NP

reduzindo o tamanho com o aumento da proporção de extrato na matriz

polimérica, porém o índice de polidispersidade aumentou com o aumento da

proporção de extrato na matriz, mostrando que a presença do extrato

influenciou na formação de NP de QS. A proporção TPP:QS apresentou

significativa influência sobre o tamanho das NP, sendo que os maiores

tamanhos foram obtidos nas proporções de 1:5 (94,88 a 170,20 nm) e 1:6

(95,50 a 268,20 nm). O aumento da proporção de TPP proporcionou uma

redução significativa do potencial zeta, mostrando a formação do complexo

TPP:QS pela neutralização dos grupamentos catiônicos da QS. Através da

análise dos parâmetros ficou evidenciado que o diâmetro das NP é

dependente tanto da proporção de extrato quanto de TPP na matriz e o

aumento da proporção de TPP reduz significativamente o potencial zeta e o

aumento da proporção do extrato na matriz conduz a um leve aumento do

potencial zeta. A maioria das amostras apresentou tamanho entre 50 e 270

nm, porém polidispersas e com potencial zeta entre 38 e 50 mV, sendo

classificadas como sistemas com alto potencial zeta. Através da análise

morfológica das nanopartículas de QS contendo o extrato de RF ficou

confirmada a formação de NP poliméricas as quais apresentaram formato

esférico.

Através deste estudo podemos concluir que a técnica de spray drying é

adequada para desenvolver MP poliméricas de quitosana contendo o extrato

das cascas de R. ferruginea, e os dois sistemas desenvolvidos, MP e MP

incorporadas em hidrogel, mostraram ser adequados como estratégia para

administração oral e tópica de extrato das cascas de R. ferruginea,

150

respectivamente. A incorporação das MP em hidrogéis potencializou a

atividade anti-inflamatória tópica do extrato das cascas de R. ferruginea e

através do perfil de dissolução das MP ficou evidenciado que o sistema

desenvolvido apresenta um perfil de liberação sustentada do extrato.

Sugere-se a continuidade dos estudos de estabilidade, eficácia e

segurança das MP e dos hidrogéis, bem como, estudos biofarmacêuticos e de

eficácia do extrato incorporado nas NP a fim de avaliar a influência da

nanoencapsulação do extrato sobre a resposta biológica.

151

REFERÊNCIAS

AMONZA, J. L. G. Sólidos Pulverulentos. In: JOSÉ LUIS VILA JATO

(Org.). Tecnologia Farmacêutica. Aspectos Fundamentales de los

sistemas farmacéuticos y operaciones básicas. Espanha: Síntesis, 2001. p.

80-89.

ANITHA, A.; DEEPAGAN, V. G.; DIVYA RANI, V. V.; MENON, D.;

NAIR,S. V.; JAYAKUMAR, R. Preparation, characterization, in vitro drug

release and biological studies of curcumin loaded dextran sulphate–chitosan

nanoparticles. Carbohydrate Polymers, v. 84, p. 1158–1164, 2011.

ANSARI, S. H.; ISLAM, F.; SAMEEM, M. Influence of nanotechnology

on herbal drugs: A Review. Journal of Advanced Pharmaceutical

Technology & Research, v. 3, n. 3,p. 142-146, 2012.

ANTONIALLI, C. de S. Avaliação do efeito do ácido mirsinóico B em

diferentes modelos de hipernocicepção inflamatória e neuropática

persistentes em camundongos. 2009. 97 f. Dissertação (Mestrado) -

Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2009.

ARAUJO, R. S. Desenvolvimento, caracterização e liofilização de

nanopartículas e encapsulamento de antibiótico de uso veterinário,

2009. 131 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto

Escola de Farmácia Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Ouro Preto,

2009.

BACCARIN, T., Desenvolvimento e padronização de Extrato seco de

Rapanea ferruginea Ez. (Mirsinaceae) obtido por spray drying e

avaliação in vivo da atividade antinociceptiva, 2010. 145 f. Dissertação

(Mestrado) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí,

Itajaí, 2010.

BACCARIN, T.; MUCENEEKI, R. S.; BRESOLIN, T.M. B.; YUNES,R.

A.; ANGELA MALHEIROS,A.; LUCINDA-SILVA, R. M. Development

and validation of an HPLC-PDA method for the determination of myrsinoic

acid B in the extracts of Rapanea ferruginea Mez. Talanta, v. 85, p. 1221–

1224, 2011.

BACCARIN, T.; FERREIRA, A. GAZONI, V. F.; YUNES, R. A.;

MALHEIROS, A.; LUCINDA-SILVA R. M. Influence of Extraction

Parameters on Hydroalcohol Extracts of the Stem Bark of Rapanea

152

ferruginea Mez Using Myrsinoic Acid B as Marker. Tropical Journal of

Pharmaceutical Research.v.13, n. 7, p. 1113-1119, 2014.

BACCARIN, T.; DEBRASSI, A.; DE SOUZA, M. M.; YUNES, R. A.;

MALHEIROS, A.; LUCINDA-SILVA R. M. Influence of process

conditions on physicochemical properties and antinociceptive activity in

vivo of spray-dried Rapanea ferruginea Mez. stem bark extract. Powder

Technology. v. 291, p. 66–74, 2016.

BECK-BROICHSITTER, M.; STREHLOW, B.; KISSEL, T. Direct

fractionation of spray-dried polymeric microparticles by inertial impaction.

Powder Technology, v. 286, p. 311–317, 2015.

BELLA CRUZ, A.; KAZMIERCZAK, K., GAZONI, V. F.; MONTEIRO,

E.R.; FRONZA, L. M.; MARTINS, P.; YUNES, R. A.; BÜRGER C.;

THAIS A. TOMIO, T. A.; FREITAS, R. A.; MALHEIROS, A. Bio-guided

isolation of antimicrobial compounds from Rapanea ferruginea and its

cytotoxic and genotoxic potential. Journal of Medicinal Plants Research.

v. 7, n. 19, p. 1323-1329, 2013.

BIDONE, J.; ZORZI, G. K.; CARVALHO, E. L.S.; SIMÕES, C. M. O.;

KOESTER, L. S.; BASSANI, V. L.; TEIXEIRA, H. F. Incorporation of

Achyrocline satureioides (Lam.) DC extracts into topical nanoemulsions

obtained by means of spontaneous emulsification procedure. Industrial

Crops and Products, v. 62, p. 421–429, 2014.

BLANCO, M. A., Avaliação da incorporação de nanopartículas de

quitosana ao cimento endodôntico ah plus™, 2012. 78 f. Dissertação

(Mestrado) – Instituto Alberto Luiz Coimbra de Pós Graduação e Pesquisa

de Engenharia – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

2011.

BOWEY, K.; NEUFELD, R.J. Systemic and mucosal delivery of drugs

within polymeric microparticles produced by spray drying. Biodrugs, v. 24,

n.6, p. 359-377, 2010.

BRANGEL, L. M. Desenvolvimento de hidrogéis a base de quitosana e

ácido lactobiônico com adição de nanaoelementos. 2011. 55 f. Trabalho

de conclusão de curso- Universidade Federal do Rio Grande do Sul-

Instituto de Química, Porto Alegre, 2011.

153

BRUSCHI, M.L.; JONES, D.S.; PANZERI, H.; GREMIÃO, M.P.D.; DE

FREITAS,O.; LARA, E.H.G. Semisolid systems containing própolis for the

treatment of periodontal disease: In vitro release kinetics, syringeability,

rheological, textural, and mucoadhesive properties. Journal of

Pharmaceutical Sciences, v.96, n.8, p.2074–2089, 2007.

BULMER, C.; MARGARITIS, A.; XENOCOSTAS, A. Encapsulation and

controlled release of recombinant human erythropoietin from chitosan-

carrageenan nanoparticles. Current Drug Delivery, v. 9, n. 5, p. 527-537,

2012.

BURGER, M. C. M.; TEREZAN, A. P.; CUNHA, G.S. O.; FERNANDES,

J. B.; DA SILVA, M.F.G. F; VIEIRA, P. C.; MENEZES, A. C. S.

Antimicrobial activity of the myrsinoic acid A from Myrsine coriacea and

the semi-synthetic derivatives. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.

25 p. 451–454, 2015. CALIXTO, J.B.; ZANINI, J. C.; CRUZ, A. B.; YUNES, R.A.;

MEDEIROS, Y.S.; Extract and compounds obtained from Mandevilla

velutina inhibit arachidonic acid induced ear oedema in mice, but not rat

stomach contraction. Prostaglandins, n.41, p. 515-526, 1991.

CANELLA, K. M. N. C.; GARCIA, R. B. Caracterização de quitosana por

cromatografia de permeação em gel –influência do método de preparação e

do solvente, Química Nova, v. 24, n. 1, p. 13-17, 2001.

CAMPOS, E.; BRANQUINHO, J.; CARREIRA, A. S.; CARVALHO, A.;

COIMBRA, P.; FERREIRA, P.; GIL, M. H. Designing polymeric

microparticles for biomedical and industrial applications. European Polymer

Journal, v. 49, p.2005–2021, 2013.

CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações

silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Colombo: EMBRAPA,

1994.

CECHETTO, M. C. Nanoemulsões contendo extrato dos frutos da

Rapanea ferruginea: desenvolvimento e atividade anti-inflamatória in

vivo. 2016. 134f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação

em Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2016.

154

CHENG, C. J.; TIETJEN,G. T.; SAUCIER-SAWYER, J. K. SALTZMAN,

W. M. A holistic approach to targeting disease with polymeric

nanoparticles. Nature Reviews Drug Discovery, p.1-9, 2015.

CORRIGAN, D.O, HEALY, A.M, CORRIGAN, O.I. Preparation and

release of salbutamol from chitosan and chitosan co-spray dried compacts

and multiparticulates. European Journal of Pharmaceutics and

Biopharmaceutics, v.62, p.295–305, 2006.

COSTA, P. Avaliação da atividade do extrato dos frutos de Rapanea

ferruginea e dos compostos isolados ácido mirsinóico A e triglicerídeo

sobre a memória de animais normais e com Alzheimer induzido. 2011.

133f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2011

COTA-ARRIOLA, O.; CORTEZ-ROCHA, M. O.; EZQUERRA-BRAUER,

J. M.; LIZARDI-MENDOZA, J.; ARMANDO BURGOS-HERNA´NDEZ,

A.; ROBLES-SA´NCHEZ, R. M.; PLASCENCIA-JATOMEA, M.

Ultrastructural, Morphological, and Antifungal Properties of Micro and

Nanoparticles of Chitosan Crosslinked with Sodium Tripolyphosphate.

Journal of Polymers and the Environment, v. 21, p. 971–980, 2013.

DA ROCHA, P. B. R. Desenvolvimento de carreadores lipídicos

nanoestruturados contendo extrato de Centella asiatica (L.) Urban

para uso tópico. 2015. 90f. Dissertação de Mestrado - Programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Goiás, 2015.

DAL MAS, J. Nanoemulsão contendo extrato da casca de Rapanea

ferruginea com atividade anti-inflamatória tópica. 2015. 167f.

Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, UNIVALI, 2015.

DAL MAS; ZERMIANI, T.; THIESEN, L. C; SILVEIRA, J. L. M.; DA

SILVA, K. A. B. S.; DE SOUZA, M. M.; MALHEIROS, A.; BRESOLIN,

T. M. B.; LUCINDA-SILVA, R. M. Nanoemulsion as a carrier to improve

the topical anti-inflammatory activity of stem bark extract of Rapanea

ferruginea. International Journal of Nanomedicine, v.11, p. 4495–4507,

2016.

DAS, J.; DAS, S.; SAMADDER, A.; BHADRA, K.; KHUDA-BUKHSH,

A.R. Poly (lactide-co-glycolide) encapsulated extract of Phytolacca

decandra demonstrates better intervention against induced lung

155

adenocarcinoma in mice and on A549 cells. Europe Journal

Pharmaceutical Science, v.47, n.2, p.313-24, 2012.

DASH, S.; MURTHY, P.N.; NATH, L.; CHOWDHURY, P. Kinetic

modeling on drug release from controlled drug delivery systems. Acta

Poloniae Pharmaceutica - Drug Research, v. 67, n. 3, p. 217-223, 2010.

DASH, M.; CHIELLINI, F. R.M. OTTENBRITEB, F. R. M.; CHIELLINI,

E. Chitosan - A versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications.

Progress in Polymer Science. v. 36, p. 981-1014, 2011.

DE CARLI, R.B.G; SIQUEIRA, P.R.A.; KAISER, M. L.; FREITAS, R. A.;

DE SOUZA,M. M.; CECHINEL-FILHO, V.; SILVA, R. M. L; Topical

Anti-inflammatory Effect of Creams Containing Kaurenoic Acid Isolated

from Wedelia paludosa in Mice. Latin American Journal of Pharmacy, v.

8, n. 4, p. 594-598, 2009.

DE MEDEIROS, K. A. Desenvolvimento e testes in vitro de

nanoparticulas de quitosana para liberação controlada de peptídeos

antitumorais. 2011. 77 f. Dissertação de Mestrado - Instituto de Ciências

Biológicas, Universidade de Brasília, Brasília, 2011.

DE SOUZA, M. M.; CRUZ, A. B.; SCHUMACHER, M. B.; KRUEGER,

M. R. O.; FREITAS, R. A.; CRUZ, R. C. B. Métodos de avaliação de

atividade biológica de produtos naturais e sintéticos. In: BRESOLIN, T. M.

B.; CECHINEL FILHO, V. Ciências farmacêuticas: contribuição ao

desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. Itajaí: UNIVALI,

2003. p. 107-166.

DHANUJA, G.; SMITHA, B.; SRIDHAR, S. Pervaporation of isopropanol–

water mixtures through polyion complex membrane. Separation and

Purification Technology, v. 44, p. 130–138, 2005.

ELKORDY, A. A.; ESSA, E. A. Dissolution of Ibuprofen from spray dried

and spray chilled particles, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,

v. 23, n. 3, p. 284-290, 2010.

ELGADIR, M. A.; UDDIN,MD. S.; FERDOSH, S.; AISHAH ADAM, A.;

CHOWDHURY, A. J. K.; SARKER, MD. Z. I. Impact of chitosan

composites and chitosan nanoparticle composites on various drug delivery

156

systems: A review. Journal of food and drug analysis, v. 2 3, p. 619-629,

2015.

ESCOBAR-CHÁVEZ, J. J.; DÍAZ-TORRES, R.; RODRIGUEZ-CRUZ, I.

M.; DOMINGUEZ-DELGADO, C. L.; MORALES, R. S.; ÁNGELES-

ANGUIANO, E.; MELGOZA-CONTRERAS, L. M. Nanocarriers for

transdermal drug delivery. Research and Reports in Transdermal Drug

Delivery, p. 3-17, 2012.

ESFANJANI, A. F.; JAFARI, S. M. Biopolymer nano-particles and natural

nano-carriers for nano-encapsulation of phenolic compounds. Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces, v. 146, p.532–543, 2016.

ESPOSITO, E.; CORTESI, R. Polymeric Microparticles for Fenretinide

Administration, Macromolecular Symposia, v. 345, p. 14–23, 2014.

FABREGAS, A.; MI˜NARRO, M.; GARCIA-MONTOYA, E.; PEREZ-

LOZANO, P.;CARRILLO, C. SARRATE, R.; SANCHEZ, N.; TICO, J.R.;

SU˜NE-NEGRE, J.M. Impact of physical parameters on particle size and

reaction yield when using the ionic gelation method to obtain cationic

polymeric chitosan–tripolyphosphate nanoparticles. International Journal

of Pharmaceutics, v. 446, p.199-204, 2013.

FAN, W.; YAN, W.; XU, Z.; NI, H. Formation mechanism of monodisperse,

low molecular weight chitosan nanoparticles by ionic gelation technique.

Colloids Surface B: Biointerfaces, v. 90, p. 21-27, 2012.

FARIA-TISCHER, P. C. S; TISCHER, C. A. Nanobiotechnology: platform

technology for biomaterials and biological applications the nanostructures.

Biochemistry and Biotechnology Reports, v.1, n.1, p. 32-53, 2012.

FILIPPIN, F. B. Avaliação da atividade anticolinesterásica dos ácidos

mirsinóicos A e B, isolados da Rapanea ferruginea.2010. Trabalho de

Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) – Universidade do Vale do

Itajai, 2010.

FREITAS, M. F.; KINOSHITA, L. S. Myrsine (Myrsinoideae-

Primulaceae) no sudeste e sul do Brasil. Rodriguésia, v. 66, n. 1, p. 167-

189, 2015.

FRONZA, L. M.; GIURADELLI, S. F. Estudos fitoquímicos adicionais

com as cascas da Rapanea ferrugínea. 2009. 53f. Monografia (Graduação)

– Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí Itajaí, SC.

157

FUNDUEANU, G.; CONSTANTIN, M.; BORTOLOTTI, F.; CORTESI,

R.; ASCENZI, P.; MENEGATTI, E. Cellulose acetate butyrate–

pH/thermosensitive polymer microcapsules containing aminated poly(vinyl

alcohol) microspheres for oral administration of DNA. European Journal

of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 66, p. 11–20, 2007.

GALVAN, F. Avaliação da atividade anti-hiperalgésica do extrato bruto

da Rapanea sp. (Myrsinaceae) e do ácido mirsinóico B sobre a

neuropatia diabética. 2007. 39f. Trabalho de Conclusão de Curso

(Graduação) – Curso de Farmácia, Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí,

2007.

GAZONI, V. F., Análise Fitoquimica e Avaliação do Efeito

Anticolinesterásico do Extrato e Compostos Isolados da Rapanea

ferruginea, 2009. 84 f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2009.

GELFUSO, G. M. GRATIERI, T.; SIMÃO, P.S.; DE FREITAS, L. A. P.;

LOPEZ, R. F. V. Chitosan microparticles for sustaining the topical delivery

of minoxidil sulphate. Journal of Microencapsulation, v. 28, n. 7, p. 650–

658, 2011.

GERMERSHAUS; LUHMANN, T.; RYBAK, J.-C.; RITZER, J.; MEINEL,

L. Application of natural and semi-synthetic polymers for the delivery of

sensitive drugs, International Materials Review.v, 60,n. 2, p. 101-130,

2015.

GÓES, J.A; LUCINDA-SILVA, R.M.; MALHEIROS, A.; BRESOLIN,

T.M.B.; CECHINEL FILHO, V.; SANTI, J.R. Avaliação da atividade

antioxidante de plantas medicinais tradicionais brasileiras. In: VIII

Simpósio Ibero-Americano de Plantas Medicinais e III Simpósio Ibero-

Americano de Investigação em Câncer, 2016, Itajaí. Anais do VIII

Simpósio Ibero-Americano de Plantas Medicinais e III Simpósio Ibero-

Americano de Investigação em Câncer, 2016.

GOWTHAMARAJAN, K.; SINGH, S. K. Dissolution Testing for Poorly

SolubleDrugs: A Continuing Perspective. Dissolution Technologies, p. 24-

32, 2010.

GRAVES, R.A., LEDET, G.A., GLOTSER, E.Y., MITCHNER, D.M.,

BOSTANIAN, L.A., MANDAL, T.K., Formulation and evaluation of

158

biodegradable nanoparticles for the oral delivery of fenretinide. European

Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 76, p. 1–9, 2015.

GUTJAHR, A.; PHELIP, C.; COOLEN, A.L.; MONGE, C.; BOISGARD,

A.S.; PAUL, S.; VERRIER, B. Biodegradable Polymeric Nanoparticles-

Based Vaccine Adjuvants for Lymph Nodes Targeting. Vaccines v. 4, n. 34,

p.2-16, 2016.

HAN, F. Y.; THURECHT, K. J.; WHITTAKER, A. K.; SMITH, M. T.

Bioerodable PLGA-Based Microparticles for Producing Sustained-Release

Drug Formulations and Strategies for Improving Drug Loading. Frontiers

in Pharmacology, v. 7, p. 1-11, 2016.

HE. C.; Yin, L.; TANG, C.; YIN, C. Size-dependent absorption mechanism

of polymeric nanoparticles for oral delivery of protein drugs. Biomaterials,

v. 33, p. 8569-8578, 2012.

HESS, S. Atividade Antinociceptiva do ácido mirsinóico B. 2006. 108 f.

Dissertação (Mestrado) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade do

Vale do Itajaí, Itajaí, 2006.

HESS, S.; PADOANI, C.; SCORTEGANHA. L. C.; HOLZMANN, I.;

MALHEIROS, A.; YUNES, R. A.; MONACHE, F. D.; SOUZA, M. M.

Assessment of mechanisms involved in antinociception caused by

myrsinoic acid B. Biological and Pharmaceutical Bulleti, v. 33, p. 209-

215. 2010.

HILL, L. E.; TAYLOR, T. M.; GOMES, C. Antimicrobial Efficacy of

Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLGA) Nanoparticles with Entrapped

Cinnamon Bark Extract against Listeria monocytogenes and Salmonella

typhimurium, Journal of Food Science, v. 78, n. 4, 2013.

HIRATA, A.N.; BRUSCHI, M. L. Development and characterisation of

semisolid systems to deliver propolis in the oral cavity, Journal of Basic

and Applied Pharmaceutical Sciences, v. 31, n.1, p.33-39, 2010.

HO, Y. C.; MI, F. L.; SUNG, H. W.; KUO, P. L. Heparin-functionalized

chitosan–alginate scaffolds for controlled release of growth factor.

International Journal of Pharmaceutics, v. 376, p. 69-75, 2009.

159

HUDSON, D.; MARGARITIS, A. Biopolymer nanoparticle production for

controlled release of biopharmaceuticals. Critical reviews in

Biotechnology, v. 34, n. 2, p. 161–179, 2014.

HUSSAIN, Z.; THUB, H.E.; SHIOW-FERN N.; KHAND,S.; KATAS, H.

Nanoencapsulation, an efficient and promising approach to maximize

wound healing efficacy of curcumin: A review of new trends and state-of-

the-art. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 150, p. 223–241, 2017.

JEE, J.P.; NA, J.H.; LEE, S.; KIM, S. H.; CHOI, K., YEO, Y.; KWON, I.

C. Cancer targeting strategies in nanomedicine: Design and application of

chitosan nanoparticles. Current Opinion in Solid State and Materials

Science, v. 16, p. 333–342, 2012.

KANG, B. S.; LEE, S. E.; NG, C. L.; KIM, J. K.; PARK, J. S. Exploring the

Preparation of Albendazole-Loaded Chitosan-Tripolyphosphate

Nanoparticles. Materials, v. 8, p. 486-498, 2015.

KARAVASILI, C.; KATSAMENIS, O. L.; BOUROPOULOS, N.;

HAMDE NAZAR, H.;THURNER, P. J.; VAN DER MERWE, S. M.;

FATOUROS, D. G. Preparation and characterization of bioadhesiv

microparticles comprised of low degree of quaternization trimethylated

chitosan for nasal administration: effect of concentration and molecular

weight. Langmuir. v. 30, p. 12337−12344, 2014.

KUMARI, A.; YADAV, S.K.; YADAV, S.C. Biodegradable polymeric

nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B:

Biointerfaces, v. 75, p. 1-18, 2009.

KUMBHAR, S. G.; PAWAR, S.H. Self-functionalized, oppositely charged

chitosan-alginate scaffolds. Biotechnology: An Indian Journal, v. 13, n. 2,

2017.

LACATUSU , I.; BADEA, N.; NICULAE , G.; BORDEI, N.; STAN, R.;

MEGHEA, A. Lipid nanocarriers based on natural compounds: An

evolvingrole in plant extract delivery. European Journal of Lipid Science

and Technology, v. 116, p. 1708–1717, 2014.

LEE, M.; LI, W.; SIU, R. K.; WHANG, J.; ZHANG, X.; SOO, C.; TING, K.;

WU, B. M. Biomimetic apatite-coated alginate/chitosan microparticles as

osteogenic protein carriers. Biomaterials, v. 30, p. 6094-6101, 2009.

160

LIN, H. R.; YEH, Y. J. Porous Alginate/Hapsponges for bone tissue

engineering. Materials Science Forum, v. 26, p. 3043-3082, 2003.

LIU, J.; WILLFOR, S.; XU, C. A review of bioactive plant

polysaccharides:Biological activities, functionalization, and biomedical

applications. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, v. 5, p. 31-61,

2015.

LORENZI H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de

plantas arbóreas do Brasil. São Paulo: Instituto Plantarum de Estudos da

Flora 1998; 384 p.

LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de

plantas arbóreas do Brasil. 2.ed. São Paulo: Instituto Plantarum de

Estudos da Flora, 2002; 368 p.

MANIVASAGAN, P.; OH, J. Marine polysaccharide-based nanomaterials

as a novel source of nanobiotechnological applications. International

Journal of Biological Macromolecules. v. 82, p. 315–327, 2016.

MAHMOOD, A.; SARFRAZ, M. R.; MAHMOOD, A. Hydrogel

Microparticles as an Emerging Tool in Pharmaceutical Field: A Review.

Advances in Polymer Technology, v. 35, n. 2, 2016.

MISHRA, B.; PATEL, B.B.; TIWARI, S. Colloidal nanocarriers: a review

on formulation technology, types and applications toward targeted drug

delivery. Nanomedicine, v. 6, p. 9- 24, 2010.

MURA, C., MANCONI, M.; VALENTI, D.; MANCA, M. L. DIEZ-

SALESB, O.; LOYA, G.; FADDA, A. M. In vitro study of N-succinyl

chitosan for targeted delivery of 5-aminosalicylic acid to colon.

Carbohydrate Polymers, v. 85, p. 578-583, 2011.

NAGAVARMA, B. V. N; HEMANT, K.S.Y.; AYAZ, A.; VASUDHA,

L.S.; SHIVAKUMAR, H. G. Different techniques for preparation of

polymeric nanoparticles- a review. Asian Journal of Pharmaceutical and

Clinical Research. v. 5, n.3, p.16-23, 2012.

NAIKWADE, S. R.; BAJAJ, A. N.; GURAV,P.; GATNE,M.M.; SONI, P.

S. Pulmonary Administration: Design, Characterization, In Vitro

Evaluation, and In Vivo Efficacy Study. American Association of

Pharmaceutical Scientists Technology, v. 10, n 3, 2009.

161

NAMDAR, M.; EATEMADI, A.; SOLEIMANINEJAD, M.; HAMMED, A.

T. A brief review on the application of nanoparticle enclosed herbal medicine

for the treatment of infective endocarditis. Biomedicine &

Pharmacotherapy, v. 87, p. 321–331, 2017.

NASSERI, M.; GOLMOHAMMADZADEH, S.; AROUIEE,H.; JAAFARI,

M. R.; NEAMATI, H. Antifungal activity of Zataria multiflora essential

oil-loaded solid lipid nanoparticles in-vitro condition. Iranian Journal of

Basic Medical Sciences, v. 19, p.1231-1237, 2016.

OLIVEIRA, O. W.; PETROVICK, P. R. Secagem por aspersão (spray

drying) de extratos vegetais: bases e aplicações. Revista Brasileira de

Farmacognosia, v. 20, n. 4, p. 641-650, 2010.

OTUKI, M.F.; VIEIRA-LIMA, F.; MALHEIROS, A,; YUNES, R. A.;

CALIXTO, J. B. Topical antiinflammatory effects of the ether extract from

Protium kleinii and alpha-amyrin pentacyclic triterpene. European Journal

of Pharmacology, v. 507, p. 253-259, 2005.

PARK, S.; HWANG, S.; LEE, J. pH-responsive hydrogels from moldable

composite microparticles prepared by coaxial electro-spray drying.

Chemical Engineering Journal, v. 169, p.348–357, 2011.

PASCOTO, M. C. Rapanea ferruginea (Ruiz &Pav.) Mez. (Myrsinacea)

como uma importante fonte alimentar para as aves em uma mata de galeria

no interior do Estado de São Paulo. Revista Brasileira de Zoologia, v.24,

n.3, p. 735-741, 2007.

PATI, F.; ADHIKARI, B.; DHARA, S. Development of chitosan–

tripolyphosphate fibers through pH dependent ionotropic gelation.

Carbohydrate Research, v. 346, p. 2582–2588, 2011.

PATIL, P. B.; GUPTA, V. R. M.; UDUPI, R. H.; SRIKANTH, K.;

PRASADI, B. S. G. Development of dissolution medium for poorly water

soluble drug mefenamic acid. Research Journal of Pharmaceutical,

Biological and Chemical Sciences. n 4, p. 544-549, 2010.

PECARSKI, D. ; KNEŽEVIĆ-JUGOVIĆ, Z.; DIMITRIJEVIĆ-

BRANKOVIĆ, S.; MIHAJILOVSKI, K.; JANKOVIĆ, S. Preparation,

characterization and antimicrobial activity of chitosan microparticles with

thyme essential oil. Hemijska Industrija., v.68, n.6, p. 721–729, 2014.

162

PENICHE, H.; PENICHE, C. Chitosan nanoparticles: a contribution to

nanomedicine. Polymer International, v. 60, p. 883–889, 2011.

PEREIRA, R. R. DE A.; GODOY,J. S. R.; SVIDZINSKI,T. I. S.

BRUSCHI, M. L. Preparation and Characterization of Mucoadhesive

Thermoresponsive Systems Containing Propolis for the Treatment

of Vulvovaginal Candidiasis. Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 102,

n. 4, p. 1222-1234, 2013.

POLETTO, F. S.; BECK, R. C. R.; GUTERRES, S. S.; POHLMANN, A.

R. Polymericnanocapsules: conceptsandapplications. In: BECK, R. C. R.;

GUTERRES, S. S.; POHLMANN, A. R. Nanocosmetics and

nanomedicines, Berlin: Springer, 2011. p. 49-68.

RAINA, H.; SONI, G.; JAUHARI, N.; SHARM, N.; BHARADVAJA, N.

Phytochemical importance of medicinal plants as potential sources of

anticancer agents. Turkish Journal of Botany. v. 38, p. 1027-1035, 2014.

RAJ, S.; JOSE, S.; SUMOD, U. S.; SABITHA, M. Nanotechnology in

cosmetics: Opportunities and challenges, Journal of Pharmacy Bioallied

Sciences, v. 4, n.3, p. 186–193, 2012.

RIBEIRO, A. F.; REZENDE, R. L. O.; CABRAL, L. M.; DE SOUSA, V.

P. Poly ε-caprolactone nanoparticles loaded with Uncaria tomentosa extract:

preparation, characterization, and optimization using the Box–Behnken

design, International Journal of Nanomedicine, v.8, p. 431–442, 2013.

ROWE, R. C.; SHESKEY, P. J.; QUINN, M. E. Handbook of

Pharmaceutical Excipients. 6 ed. Londres: Pharmaceutical Press and

American Pharmacists Association, 2009.

SALEEM, S. M. A.; AZHARUDDIN, SK. M. D.; ALI, S.; PATIL, C. C.

Studies on different chitosan polyelectrolyte complex hydrogels for

modified release of diltiazemhydrochlorid. International Journal of

Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, v. 2, n. 4, p. 64-67, 2010.

SÃO PEDRO, A.; FERNANDES, R.; VILLARREAL,C. F.; FIALHO, R.;

ALBUQUERQUE, E. C. Opioid-based micro and nanoparticulate

formulations: alternative approach on pain management. Journal of

Microencapsulation, p.1-12, 2016.

SCHMIDT, C.; LAUTENSCHLAEGER, C.; COLLNOT, E.M.;

SCHUMANN, M.; BOJARSKI, C.; SCHULZKE, J.D.; LEHR, C.M.;

163

STALLMACH, A. Nano- and microscaled particles for drug targeting to

inflamed intestinal mucosa -A first in vivo study in human patients. Journal

of Controlled Release, v. 165, p. 139–145, 2013.

SEVERINO, P., SANTANA, M. H. A., PINHO, S. C., SOUTO, E. B.

Polímeros sintéticos biodegradáveis: matérias-primas e métodos de

produção de micropartículas para uso em drugdelivery e liberação

controlada. Polímeros, v. 21, n. 4, p. 286-292, 2011.

SHAO-JUNG, W.; TZONG-HORNG, L.; CHAO-HSIEN, Y.; FWU-

LONG, M.; TSUNG-KUAN, L. Preparation and Characterization of Porous

Chitosan–Tripolyphosphate Beads for Copper (II) Ion Adsorption, Journal

of Applied Polymer Science, v.127, n.6, p. 4573 -4580, 2013.

SINGH, M.; CHAKRAPANI, A.; HAGAN, D. Nanoparticles and

microparticles as vaccine-delivery systems. Expert Review Vaccines, v. 6,

n.5, p.797-808, 2007.

SILVA, J.A.; APOLINÁRIO, A.C.; SOUZA, M.S.R.; DAMASCENO,

B.P.G.L.; MEDEIROS, A.C.D.; Administração cutânea de fármacos:

desafios e estratégias para o desenvolvimento de formulações

transdérmicas. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada,

v.31, n. 3, p. 125-131, 2010.

SOSNIK, A.; SEREMETA, K. P. Advantages and challenges of the spray-

drying technology for the production of pure drug particles and drug-loaded

polymeric carriers. Advances in Colloid and Interface Science, v. 223,

p.40–54, 2015.

STEICHEN, S. D.; CALDORERA-MOORE, M.; PEPPAS, N. A. A review

of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer

therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 48, p.

416-427, 2013.

STULZER, H. K.; TAGLIARI, M. P.; SILVA, M. A. S.; LARANJEIRA, M.

C. M. Desenvolvimento, Avaliação e Caracterização Físico Química de

Micropartículas Constituídas de Aciclovir/Quitosana Desenvolvidas pela

Técnica de Spray-drying. Latin American Journal of Pharmacy, v. 26, n.

6, p. 866-871, 2007.

TAGLIARI, M. P. Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana e

alginato de sódio para incorporação de ácido glicirrízico, ácido

164

salicílico ou cafeína visando liberação tópica. 2012. 229 f. Tese de

Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Farmácia, UFSC, 2012.

TOLL R, JACOBI U, RICHTER H, LADERMANN J, SCHAEFER H,

BLUME-PEYTAVI U. Penetration profile of microspheres in follicular

targeting of terminal hair follicles. Journal of Investigative Dermatology,

v. 123, p.168–76, 2004.

TOMIO, T. A. Atividade citotóxica e antitumoral dos extratos e

compostos isolados de Rapanea ferruginea e Piper aduncum. 2011. 171

f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, UNIVALI, 2011.

TROMMER, H. NEUBERT, R. H.H. Overcoming the stratum corneum: the

modulation of skin penetration. Skin Pharmacology Physiology, v. 19, p.

106-121, 2006.

TSAI, Y-J.; CHEN, B-H., Preparation of catechin extracts and

nanoemulsions from green tea leaf waste and their inhibition effect on

prostate cancer cell PC-3, International Journal of Nanomedicine, v.11,

p. 1907–1926, 2016.

UDREA, L. E.; HRITCU, D.; POPA, M. I.; ROTARIU, O. Preparation and

characterization of polyvinyl alcohol—chitosan biocompatible magnetic

microparticles, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, v. 323, p.

7–13, 2011.

VASCONCELLOS, F. C.; GOULART, G. A. S.; BEPPU, M. M.

Production and characterization of chitosan microparticles containing

papain for controlled release applications. Powder Technology, v. 205, p.

65–70, 2011.

VIANA, V. R.; DA SILVA, E. R., Nanopartículas de Quitosana:

aplicações e perspectivas para a adminstração tópica.2013. 31f.Trabalho

de conclusão de curso (Bacharelado)-Instituto Federal de Educação, Ciência

e Tecnologia do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.

VILLANOVA, J. C. O; ORÉFICE, R. L. Aplicações Farmacêuticas de

Polímeros. Polímeros: Ciência e Tecnologia, v. 20, n. 1, p. 51-64, 2010.

165

WANG, J.J.; ZENG, Z. W. ; XIAO, R. Z.; XIE, T.; ZHOU, G. L.; ZHAN,

X. R.; WANG, S. L. Recent advances of chitosan nanoparticles as drug

carriers. International Journal of Nanomedicine, v.6, p. 765–774, 2011.

WAN, F.; YANG, M. Design of PLGA-based depot delivery systems for

Biopharmaceuticals prepared by spray drying. International Journal of

Pharmaceutical, v. 498, p. 82–95, 2016.

WING-FU L.; ZHEN-DAN, H. Design and fabrication of hydrogel-based

nanoparticulate systems for in vivo drug delivery. Journal of Controlled

Release, v. 243, p.269–282, 2016.

WISUITIPROT, W; SOMSIRI, A.; INGKANINAN, K.; WARANUCH,

N. A novel technique for chitosan microparticle preparation using a

water/silicone emulsion: green tea model, International Journal of

Cosmetic Science, v. 33, p.351–358, 2011. (a)

XAVIER, B. B. Desenvolvimento tecnológico e avaliação biológica de

sistemas nanodispersos contendo extrato dos frutos da Rapanea

ferrugínea. 2015. 117f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2015.

YIN, J.; XIANG, C.; SONG, X. Nanoencapsulation of psoralidin via

chitosan and Eudragit S100 for enhancement of oral bioavailability,

International Journal of Pharmaceutics, v. 510, p. 203–209, 2016.

Yu, C.-Y.; Yin, B.-C.; Zhang, w.; Cheng, S.-X.; Zhang, X.-Z.; Zhuo, R.-X.

Composite microparticle drug delivery systems based on chitosan, alginate

and pectin with improved pH-sensitive drug release property, Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces, v. 68, p. 245–249, 2009.

ZHAO, L-M.; SHI, L-E.; ZHANG, Z-L.; CHEN, J-M.; SHI, D-D.; YANG,

J.; TANG, Z-X. Preparation and application of chitosan nanoparticles and

nanofibers. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v. 28, n. 3, p.

353-362, 2011.

ZERMIANI, T. Estabelecimento e caracterização de marcadores para a

avaliação de nanossistemas contendo extrativos de Rapanea ferruginea.

2015. 172f. Dissertação de Mestrado – Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas, UNIVALI, 2015.

ZERMIANI, T.; DAL MAS, J.; XAVIER, B. B.; MALHEIROS, A.;

SILVA, R. M. L. COUTO, A. G.; BRESOLIN, T. M. B. Stability indicating

166

HPLC method for determination of myrsinoic acids A and B in Rapanea

ferruginea extracts and nanoemulsions. International Journal of

Pharmaceutical Sciences and Research, v. 6, n. 11, p. 4639-4649, 2015.

ZERMIANI, T.; MALHEIROS, A.; LUCINDA DA SILVA, R. M.;

STULZER, H. K.; BRESOLIN, T. M. B. Structural and physicochemical

characterization and purity assessment of myrsinoic acids A and B, active

compounds isolated from Rapanea ferruginea barks. Arabian Journal of

Chemistry, v.9, p. 872–881, 2016.

ZORZI, G. K.; SCHUHA, R. S.; DE CAMPOS, A. M , CARVALHO , E. L.

S. ; ROTTD, M. B.; TEIXEIRA, H. F. Biomateriais para formulações de

base nanotecnológica visando terapia genética ocular. Quimica Nova, v.

40, n. 1, p. 74-84, 2017.

167

ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO

DE ANIMAIS

DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE SISTEMAS MICRO E ...siaibib01.univali.br/pdf/Roseni...

Documents

Transcript of DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE SISTEMAS MICRO E ...siaibib01.univali.br/pdf/Roseni...