DETECTORES DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

 

Um detector é classificado como seletivo se responde diferentemente à estruturas

moleculares diferenciadas da amostra, e é universal se responde de modo similar a muitos

compostos. Absorbância e Fluorescência são os detectores seletivos mais usados. Índice de

refração é o único detector universal utilizado. Enquanto que o detector de índice de refração

é capaz de detectar 100ppm em amostras de 10L, detectores de ultravioleta/visível (UV-Vis)

podem detectar 100ppb em amostras de 10L e detectores de fluorescência de 100ppt por

10L. Os detectores de cromatografia líquida não são destrutivos, isto é, as amostras podem

ser coletadas para testes qualitativos posteriores de caracterização.

DESCRIÇÃO GERAL DE HPLC

•A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica

preenchida com a fase estacionária (FE)

•Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da

mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas

afinidades

•As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as

substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente.

•Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal

elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.

A cromatografia pode ser conceituada como um método físico-químico de separação, no qual os constituintes da amostra a serem separados são particionados entre duas fases, uma estacionária (FE) geralmente de grande área e outra que percola através da primeira, a fase móvel (FM).

Aplicações

Proteínas e aminoácidos Pesticidas Fármacos Explosivos HPAS Vitaminas Pigmentos Açucares Polímeros Íons metálicos

Usos e Limitações

Na Cromatografia Líquida os compostos a serem analisados não necessitam ser voláteis ou termicamente estáveis, mas é necessário que sejam solúveis na fase móvel (FM) que possuam uma possível interação com a FE e que possam adequadamente ser detectadas.

DETECTORES PARA HPLC

Tem a função de monitorar o efluente da coluna e fornecer a medida detectada do soluto;

Funciona de acordo com diferentes princípios, mas todos geram sinal elétrico que é proporcional a alguma propriedade do analito;

A resposta do detector pode ser relacionada com a quantidade de analito, portanto o detector deve ser calibrado com cada espécie de interesse;

A escolha do detector é de acordo com as características dos analitos.

Características ideais de um detector:

Alta sensibilidade; Boa estabilidade e reprodutibilidade; Resposta linear; Resposta rápida, independente da vazão; Insensível a trocas de temperatura e pressão; Alta confiabilidade e fácil uso; Seletividade, precisão, exatidão; Não destruir a amostra.

Sistemas de Detecção:

Qualquer propriedade química ou física que pode ser medida em solução pode, em princípio, ser utilizada para a detecção.

Propriedades da solução: mede alguma mudança ocorrida na FM. Ex. Índice de refração e eletroquímicos.

Propriedades do soluto: mede uma propriedade específica do soluto. Ex. Espectrofotométrico UV-vis e DAD.

2. Detector de Fluorescência

Baseia-se na medida da luz emitida pelas substâncias previamente irradiadas com luz UV.

2.1. Aplicação: Na detecção de compostos fluorescentes, (vitaminas (ex. riboflavina), micotoxinas, HPAs, etc) e compostos derivatizados (ex. aminas).

2.2. Vantagens:

- Muito sensível

- Não é destrutivo

- Permite gradiente

2.3. Desvantagens:

- Poucas substâncias são naturalmente fluorescentes

3. Detector de Índice de Refração

Baseia-se na medida da diferença do índice de refração da FM na presença das substâncias. Para aplicações gerais.

3.1. Detecta: Quantidade

3.2. Vantagens:

- Praticamente todas as substâncias são detectáveis

- Não é destrutivo

3.3. Desvantagens:

- Sensibilidade menor que UV

- Sensível a diferenças de T, vazão e pressão da FM

- Não permite fazer gradiente

DETECTORES POR ÍNDICE DE REFRAÇÃO

É o segundo detector mais usado na CLAE. Este detector acompanha continuamente a diferença de índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. Para solutos que não absorvem no UV ou visível e, conseqüentemente, não são detectados por detectores fotométricos, a melhor escolha é o detector por índice de refração. A resposta deste detector é universal e sua sensibilidade é moderada, geralmente da ordem de micrograma (10-6 g). Este nível de concentração corresponde a uma diferença no índice de refração entre a amostra e a fase móvel de aproximadamente 10 -7 unidades de índice de refração. Para observar esta diferença é necessário um controle de temperatura de aproximadamente 0,001 oC, o que normalmente é conseguido por circulação de água, de uma boa fonte termostatizada, através do refratômetro ou um bom controle da temperatura ambiente.

Além deste problema com a temperatura, existem ainda outros: a sensibilidade às variações de vazão e mudanças na composição da fase móvel, que impedem o uso de gradiente por ser difícil encontrar um par de solventes com índices de refração idênticos. Qualquer mudança na composição da mistura mudará o índice de refração da fase móvel, então, o lado da referência terá que mudar, o que é quase impossível. A figura 10 apresenta o esquema de um tipo de detector por índice de refração.

DETECTORES POR FLUORESCÊNCIA

A espectroscopia de fluorescência é um método de detecção dos mais sensíveis da atualidade, específico para compostos que fluorescem. Em boas condições é possível detectar quantidades da ordem de picogramas (10-12 g), o que é comparável aos detectores por captura de elétrons em CG. Uma alta intensidade de fluorescência é esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou que não podem produzir estruturas fortemente iônicas.

A fase móvel empregada nos detectores de fluorescência deve ser cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emissão depende do meio em que se encontra a amostra. Isto dificulta algumas de suas aplicações, tais como análise quantitativa e eluição por gradiente, nas quais deve-se selecionar os componentes da fase móvel para não atrapalhar a fluorescência.

Os detectores para fluorescência também podem proporcionar espectros de emissão das amostras retidas momentaneamente na sua cela. Desde que uma fonte de UV é necessária em ambos os detectores, por absorbância no UV e por fluorescência, eles podem ser combinados em um só detector.

Detector de Índice de Refração

O detector de IR mede mudanças no índice de reflexão. Uma célula de vidro é dividida em duas câmaras (células). O fluxo que sai da coluna de HPLC passa através da “célula de amostra” enquanto a outra célula, chamada “célula de referência”, é cheia apenas com a fase móvel. Quando o efluente que passa pela célula de amostra não contém analito, o conteúdo das duas células é o mesmo (Figura 1A). Nesse caso, quando um feixe de luz incide sobre as células, o feixe observado não sofre desvio. Mas se o efluente contiver quaisquer componentes diferentes dos da fase móvel, ocorrerá um desvio do feixe devido à diferença nos índices de reflexão nos dois líquidos (Figura 1B). Medindo-se essa diferença, a presença dos componentes pode ser observada.

Figura 1

O detector de IR é menos sensível do que o UV, sendo esta a principal razão pela qual ele é menos usado do que este. Mas ele possui algumas vantagens sobre o detector de UV.

Ele é adequado à detecção de todos os componentes. Por exemplo, amostras que não absorvem luz UV, como açúcares, alcoóis ou íons inorgânicos não podem, obviamente, ser analisadas com um detector UV. Em contraste, mudança no índice de reflexão ocorre para qualquer analito e, portanto, o detector de IR serve para

todos.

Ele é aplicável para os casos em que o solvente absorve no UV, quando um detector UV não pode ser usado. Algumas vezes, o solvente orgânico usado para análise por GPC absorve no UV e, portanto, esse detector não pode ser usado.

Ele fornece uma relação direta entre intensidade e concentração do analito.

A quantidade de luz UV absorvida depende de cada analito; portanto, a intensidade do pico obtido com um detector UV não dá informações sobre a concentração. Já a intensidade observada comum detector de IR é proporcional à concentração do analito.

Por essas vantagens, o IR é usado com frequência para detecção de açúcares e para análise de GPC.

Detector de Fluorescência

A vantagem do método de fluorescência é sua alta sensibilidade para grupos seletivos de compostos no nível de fg. Usando-se um comprimento de onda específico, os átomos do analito são excitados e, então, emitem um sinal luminoso (fluorescência). A intensidade dessa luz emitida é monitorada para quantificar a concentração do analito. A maioria dos fármacos, produtos naturais, amostras clínicas e derivados de petróleo apresentam absorção fluorescente. Alguns compostos que não a apresentam ou que têm baixa absorbância, podem ser tratados com derivados fluorescentes como o cloreto de dansila. O sistema é fácil de operar e relativamente estável.

DETECTORES

ÍNDICE DE REFRAÇÃO

No momento da passagem do analito pelo detector, pode ocorrer uma alteração do índice de refração. Essa alteração em relação ao valor da fase móvel livre de analito é detectada.

A detecção só é possível quando o índice de refração do analito é diferente do IR da fase móvel.

Esse detector é normalmente utilizado quando os analitos não absorvem na região de comprimento de onda do UV-VIS.

Apresenta as seguintes desvantagens:

•baixa sensibilidade

•não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR varia com a composição da fase móvel)

•temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a temperatura)

APLICAÇÃO

Análises de carbohidratos e açúcares em geral.