Caracterização de Listeria monocytogenes e Yersinia enterocolitica ...
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DETERMINACIÓN DE Listeria monocytogenes EN ENSALADAS LISTAS PARA EL CONSUMO EN LOS RESTAURANTES SATÉLITES Y ALEDAÑOS DE LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA. CARLOS JAVIER PUENTES PEREZ Trabajo de grado presentado como requisito de grado para optar al título de Biólogo Director MARTHA LILY OCAMPO GUERRERO Bacterióloga, sp Microbióloga, c MSc UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUE 2014
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DETERMINACIÓN DE Listeria monocytogenes EN ENSALADAS LISTAS PARA EL
CONSUMO EN LOS RESTAURANTES SATÉLITES Y ALEDAÑOS DE LA
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA.
CARLOS JAVIER PUENTES PEREZ
Trabajo de grado presentado como requisito de grado para optar al título de
Biólogo
Director
MARTHA LILY OCAMPO GUERRERO
Bacterióloga, sp Microbióloga, c MSc
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
IBAGUE
2014
1
ADVERTENCIA
“La facultad de Ciencias Básicas y el director del laboratorio GEBIUT, no se harán
responsables de las ideas emitidas en este informe”
(Artículo 11- Acuerdo 018 de 1984- consejo directivo de la Universidad del Tolima,
reglamento de trabajos dirigidos de grado).
2
El autor CARLOS JAVIER PUENTES PEREZ autoriza a la UNIVERSIDAD DEL
TOLIMA la reproducción total o parcial de este documento, con la debida cita de
reconocimiento de la autoría y cede a la misma Universidad los derechos patrimoniales,
con fines de investigación, docencia e institucionales, consagrados en el artículo 72 de
la ley 23 de 1982 y las normas q lo instituyan o modifiquen.
(Acuerdo 0066 de 2003, 14 de octubre de 2003. “Por el cual se adoptan normas
relacionadas con la presentación de tesis y trabajos de grado” CONSEJO
ACADÉMICO DE LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA)
CARLOS JAVIER PUENTES PEREZ
1014194257 DE BOGOTA
AUTOR
3
DEDICATORIA
A mi mamá:
Por tu comprensión, amor y compromiso, tu manera de educarme es lo que ha
permitido que este logrando mis metas.
A mi papá:
Por su apoyo durante todos estos años, todo al fin está dando sus frutos.
Gracias a ustedes hoy estoy aquí.
4
AGRADECIMIENTOS
A Dios ya que sin Él nada sería posible.
A la Universidad del Tolima por brindarme una educación de calidad y ayudar en mi
crecimiento como persona y como investigador.
A la oficina de Investigaciones por permitir la realización de estos proyectos de
investigación.
A la Dra. Martha Lily Ocampo Guerrero por abrirme las puertas de su laboratorio, por
brindarme todo su apoyo durante la ejecución del proyecto de investigación, y por
compartir conmigo todos sus conocimientos para mi formación como investigador.
A Nataly Ruiz Quiñones por su colaboración y apoyo a este proyecto.
A todas las personas del grupo GEBIUT por su valiosa asesoría y colaboración.
A mi familia y a Daniela Ortiz Cruz por su apoyo y cariño.
A todos los propietarios de los restaurantes que permitieron la toma de muestras y
aplicación de las encuestas BPM.
5
CONTENIDO
Pág.
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 11
2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 14
2.1.OBJETIVOS GENERALES ...................................................................................... 14
2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 14
3. MARCO TEÓRICO ................................................................................................. 15
3.1.GENERALIDADES DE Listeria ................................................................................ 15
3.2.Listeria monocytogenes ........................................................................................... 17
3.2.1.Ciclo infeccioso ..................................................................................................... 19
3.2.2.Biofilm. .................................................................................................................. 20
3.3.LISTERIOSIS .......................................................................................................... 21
3.3.1.Tipos de listeriosis ................................................................................................ 22
3.3.2.Dosis Infecciosa.................................................................................................... 23
3.3.3.Casos de listeriosis ............................................................................................... 23
3.4.BROTES .................................................................................................................. 23
3.5.L. monocytogenes EN ALIMENTOS ........................................................................ 25
3.6.NORMATIVIDAD SOBRE MANEJO DE ALIMENTOS ............................................ 28
3.7.RESTAURANTES Y ESTABLECIMIENTOS DE CONSUMO DE ALIMENTOS ...... 28
3.8.BPM EN ALIMENTOS ............................................................................................. 29
4. METODOLOGÍA ..................................................................................................... 31
4.1.ÁREA DE ESTUDIO ................................................................................................ 31
4.2.ENCUESTAS BPM .................................................................................................. 31
4.3.TOMA Y CODIFICACIÓN DE MUESTRAS ............................................................. 31
6
4.4.PROTOCOLO PARA LA TOMA DE MUESTRAS.................................................... 32
4.5.ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO ............................................................................... 34
4.5.1.Pre-enriquecimiento .............................................................................................. 34
4.5.2.Enriquecimiento .................................................................................................... 34
4.5.3.Aislamiento e identificación .................................................................................. 34
4.5.4.Confirmación de Listeria spp. ............................................................................... 35
4.5.5.Determinación de especie .................................................................................... 35
4.5.6.Determinación de sensibilidad antimicrobiana ...................................................... 36
5. RESULTADOS ....................................................................................................... 37
5.1.PRESENCIA DE Listeria ......................................................................................... 37
5.2.RESULTADOS BPM................................................................................................ 40
5.3.RESULTADOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO ............................................ 44
5.3.1.Pre - enriquecimiento y enriquecimiento ............................................................... 44
5.3.2.Medio selectivo Chromoagar ................................................................................ 44
5.3.3.Medio selectivo Palcam ........................................................................................ 45
5.3.4.Diferenciación bioquímica ..................................................................................... 45
6. DISCUSIÓN ............................................................................................................ 47
7. CONCLUSIONES ................................................................................................... 50
RECOMENDACIONES ................................................................................................. 51
REFERENCIAS ............................................................................................................. 52
7
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1: Diferenciación fenotípica de especies del género Listeria ............................... 16
Tabla 2: Brotes asociados al consumo de alimentos contaminados con Listeria
monocytogenes ............................................................................................................. 24
Tabla 3: Tipo y cantidad de muestras analizadas ......................................................... 33
Tabla 4: Resultados presuntivos de Listeria en relación al expendio y el origen en agar
Cromogénico y Palcam.................................................................................................. 38
8
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1: Proceso infeccioso y fase intracelular de la infección por Listeria
monocytogenes. ............................................................................................................ 20
Figura 2: Representación de las etapas del desarrollo de un biofilm sobre un sustrato 21
Figura 3: Porcentaje de Listeria en los diferentes tipos de muestras presuntivas en
caldo de pre-enriquecimiento y enriquecimiento Fraser. ............................................... 37
Figura 4: Porcentaje de Listeria presuntivo positivo en aislados de agar cromogénico 38
Figura 5: Porcentaje de realización de proceso limpieza y desinfección en cuchillos y
bandejas ........................................................................................................................ 40
Figura 6: Porcentaje del proveedor materia prima ........................................................ 41
Figura 7: Porcentaje de realización de proceso limpieza y desinfección en materia
prima............................................................................................................................ 422
Figura 8: Porcentaje de producto utilizado en la desinfección de la materia prima .... 433
Figura 9: Porcentaje de tiempo de contacto de materia prima con los desinfectantes 433
Figura 10: Caldo Fraser + suplemento. ...................................................................... 444
Figura 11: Medio selectivo Cromogénico.................................................................... 444
Figura 12: Medio selectivo Palcam ............................................................................. 455
Figura 13: Prueba de catalasa. ................................................................................... 455
Figura 14: Resultados de la tinción de Gram. ............................................................. 466
9
RESUMEN
Las verduras crudas después de ser desinfectadas y/o procesadas son un alimento listo
para el consumo que, debido a las condiciones en las que se cultiva y distribuye,
favorece la contaminación con distintos organismos en especial con L. monocytogenes,
al ser este un microorganismo ubicuo puede diseminarse por diferentes fuentes dentro
de las que están: el uso de agua de riego contaminada, la tierra, la materia fecal
humana o animal, el aire, el equipo de cultivo y manejo, los recipientes y utensilios, los
materiales de transporte y el humano. El desconocimiento de la incidencia de
infecciones bacterianas asociadas al consumo de ensaladas crudas, genera la
necesidad de conocer el estado actual de la calidad microbiológica en las ensaladas
listas para el consumo y las prácticas de higiene que se llevan a cabo en el restaurante
central de la Universidad del Tolima y en los restaurantes aledaños del sector. Se
analizaron 47 muestras provenientes de cuchillos, bandejas, materia prima y las
ensaladas. Se aplicaron encuestas con el fin de evaluar las condiciones de las BPM y
determinar el número de muestras a tomar, se obtuvieron las frecuencias de las
encuestas realizadas mediante el programa Epiinfo 7. Se realizó el análisis
microbiológico para determinar la presencia de L. monocytogenes, de acuerdo a la
norma ISO 11290-1. Aunque los resultados obtenidos no arrojan presencia de L.
monocytogenes en este tipo de alimentos la evaluación de las encuestas demuestra
que solo un 10% de los restaurantes realizan un óptimo procedimiento de BPM.
Palabras claves: Listeria monocytogenes, ensaladas, enfermedades transmitidas por
alimentos, salud pública.
10
ABSTRACT
The raw vegetables after being disinfected and/or processed are themselves a meal
ready for human consume, which due to the conditions in which it is grown and
distributed, favors the contamination with several organisms, particularly with L.
monocytogenes; since this one is an ubiquitous microorganism, it can be spread through
different sources, among which we can find: the use of polluted irrigation water, the soil,
human or animal fecal matter, the air, the crop and driving equipment, the containers
and the tools used, the equipment for its transportation and the humans. The lack of
knowledge on the impact of bacterial infections associated to the consume of raw salads
generates the necessity to know the current state of the microbiological quality of salads
that are ready to be consumed and the hygiene practices that are carried out in the main
restaurant of Universidad del Tolima and the surrounding restaurants in the area. 47
samples coming from the knives, trays, raw material, and the salads were analyzed.
Surveys were applied with the aim of evaluating the conditions of the GMP (Good
Manufacturing Practices), and at the same time determining the number of samples to
collect; the frequency of these surveys were obtained using the program “Epiinfo 7”. The
microbiological analysis was done in order to determine the presence of L.
monocytogenes, in accordance to the norm ISO 11290-1. And even though the results
obtained do not show the presence of L. monocytogenes in this type of food, the
evaluation of the surveys’ evidence reveals that only 10% of these restaurants develop
an ideal procedure of GMP (Good manufacturing Practices).
Key Words: Listeria monocytogenes, salads, diseases transmitted via food, public
healthcare.
11
1. INTRODUCCIÓN
L. monocytogenes al ser un microorganismo ubicuo está distribuido en el medio
ambiente, la amplia distribución de este patógeno se debe a la capacidad de sobrevivir
durante períodos de tiempo prolongados en diferentes medios, permitiendo contaminar
diferentes fuentes alimenticias como son los vegetales, cárnicos y sus derivados y
lácteos. Una vez ingresa a la cadena alimenticia no se puede eliminar fácilmente,
aunque se puede reducir la incidencia y concentración presente en los alimentos y
utensilios de cocina a través de medidas de higiene, limpieza y desinfección que sean
efectivas (Callejo et al., 2008; Carrasco et al, 2007).
Las enfermedades transmitidas por alimentos son producidas por la ingesta accidental,
incidental o intencional de alimentos o agua, que se encuentran contaminados en
cantidades suficientes con agentes químicos o microbiológicos, esto se debe a la
deficiencia en los procesos de elaboración, manipulación, conservación, transporte,
distribución de los alimentos (Benenson, 1997).
La listeriosis es una de las enfermedades más importantes de transmisión por
alimentos. Es transmitida por L. monocytogenes y es adquirida en el 99% de los casos
por el consumo de alimentos contaminados. Este microorganismo ha sido asociado a
alimentos como la leche (quesos y sus derivados), productos cárnicos (carne cruda,
curada y embutidos) y vegetales. Aunque la morbilidad de la listeriosis es relativamente
baja, la mortalidad de la enfermedad sistémica/encefálica puede ser muy alta, con
valores cercanos al 30% (Manual de la OIE sobre animales terrestres, 2004).
Las manifestaciones de la enfermedad en el hombre comprenden septicemia,
meningitis (o meningoencefalitis) y encefalitis, habitualmente precedidas de síntomas
parecidos a la gripa, incluida la fiebre. La población de riesgo son mujeres en estado de
embarazo, ancianos, neonatos, personas inmunocomprometidas con cáncer,
trasplantes renales, SIDA, diabetes, terapias inmunosupresoras y alcoholismo (Callejo
et al., 2008).
12
La presencia de L. monocytogenes en materias primas como pescado, carne, leche y
vegetales genera una necesidad para que las industrias procesadoras de alimentos
establezcan barreras que reduzcan la aparición de este microorganismos en los lugares
de proceso. En mayor profundidad en aquellos puntos donde el alimento no es
sometido a un tratamiento que permita la eliminación del patógeno. Por este motivo las
industrias deben de tener controles sanitarios al ingreso de las salas de proceso y
consisten en rigurosos controles como los son: los uniformes del personal, el lavado de
manos y reducción de las personas que puedan ingresar al lugar donde se procesan los
alimentos (Jeong y Frank, 1994). Uno de los problemas que afecta a la industria
alimentaria es que los productos utilizados para la limpieza y desinfección como los
amonios cuaternarios y los compuestos clorados no garantizan la eliminación de L.
monocytogenes o van perdiendo efectividad en presencia de materia orgánica. Además
de esto el problema se ve empeorado ya que L. monocytogenes tiene la característica
de formar biofilm en superficies donde haya quedado residuos de materia orgánica esto
dificulta la acción de los productos utilizados para la limpieza y desinfección (Lunden,
2004).
Las Buenas Prácticas de Manufactura son principios básicos y practicas generales para
la obtención de productos seguros para el consumo humano, que se centralizan en la
higiene y forma de manipulación de estos, con el objetivo de garantizar que los
productos se procesen en condiciones sanitarias adecuadas y se disminuyan los
riesgos inherentes a la producción. A nivel mundial, en la industria alimentaria se han
desarrollado programas que permiten garantizar la inocuidad de los alimentos basados
en la protección, vigilancia y control de manipuladores, materias primas y procesos de
producción, para prevenir una posible contaminación de los alimentos (Rojas, 2007).
En Colombia, los estudios reportados de alimentos listos para el consumo como las
ensaladas confirmaron la presencia de L. monocytogenes en lechugas, repollos frescos
y procesados (Sarquis & Vergara 1997). Entre los que se encuentra uno realizado por el
INVIMA en la ciudad de Bogotá, en alimentos listos para el consumo, donde se evaluó
que la presencia de L. monocytogenes en ensaladas fue de un 11,7% (Muñoz et al,
2011).
13
En el departamento del Tolima se realizó un estudio para la detección y aislamiento de
Listeria spp. en plantas de proceso y expendios de derivados cárnicos porcinos y sus
productos, se encontró que de 235 muestras 48 (20.4%) resultaron positivas para
Listeria spp. mostrando una alta proporción en producto terminado “longanizas”
(Castellanos, 2010). Según Galindo E., 2011, en un estudio realizado en la ciudad de
Ibagué sobre Listeria en quesillos mostró que de 142 muestras tomadas de la materia
prima y utensilios, 16 de estas (53.33%) fueron positivas para L. monocytogenes, esto
puede deberse a que el estado actual de las buenas prácticas de manufactura que se
realiza en los expendios, es inadecuado. Sin embargo, no se cuenta con suficiente
información sobre la incidencia de infecciones bacterianas asociadas al consumo de
ensaladas crudas y por medio de este estudio se busca determinar la presencia de L.
monocytogenes en ensaladas, servidas en el restaurante de la Universidad del Tolima y
los restaurantes aledaños del sector para identificar como es el estado de las BPM y su
influencia en calidad microbiológica de estos alimentos.
14
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVOS GENERALES
Determinar la presencia de L. monocytogenes en ensaladas listas para el consumo,
servidas en el restaurante central de la Universidad del Tolima y de los restaurantes
aledaños del sector e identificar como es el estado de las BPM y su influencia en
calidad microbiológica de estos alimentos.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar el aislamiento e identificación bioquímica de L. monocytogenes en
muestras de superficies y de ensaladas listas para el consumo.
Identificar la susceptibilidad antimicrobiana de L. monocytogenes.
Evaluar el estado de las buenas prácticas de manufactura (BPM) en el
restaurante central de la Universidad del Tolima y los restaurantes aledaños a
ella.
15
3. MARCO TEÓRICO
3.1. GENERALIDADES DE Listeria
Listeria habita en una gran diversidad de ambientes entre los que se encuentran suelos,
aguas, comidas refrigeradas y listas para el consumo, heces de humanos y animales,
recipientes, equipos y utensilios utilizados en la producción de alimentos, lo cual hace
que sea una importante fuente de contaminación (Michanie, 2004). Además, se puede
encontrar en alimentos como aves, pescados, moluscos, crustáceos, leche y sus
derivados, productos cárnicos, frutas y vegetales (González et al., 2009).
En plantas de producción de alimentos puede encontrarse en el suelo, aguas
estancadas, formando biofilm en equipos de procesamiento, cintas transportadoras,
cámaras de frío y túneles de congelación. Su crecimiento en este entorno se ve
favorecido por la alta humedad y la presencia de nutrientes necesarios para su
crecimiento (Schöbitz et al., 2009). Este microorganismos tiene rangos de temperatura
que van desde los 4 a los 47°C (Liu, 2008), lo cual lo diferencia de otras bacterias
patógenas como Salmonella o Staphylococcus aureus, que son inhibidas en su
crecimiento a bajas temperaturas (Levinson, 2006). En cuanto al pH, tolera un rango
entre 4,4 y 9,4 y tiene la capacidad de crecer en presencia de un 10% de NaCl
(Marzocca et al., 2004). Sobrevive a los procesos de limpieza e higienización por su
capacidad de formar biofilm sobre superficies de trabajo y equipos, contaminando los
alimentos que allí se procesan (Salgar, 2004).
El género Listeria tiene ocho especies que son: L. monocytogenes, L. innocua, L.
welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii, L. grayi, L. marthii y L. rocourtiae (Graves, et al,
2010; Leclercq, et al, 2009). L. monocytogenes genera brotes de listeriosis en humanos
(Nightingale, et al, 2005). L. ivanovvi sólo infecta animales y rara vez se ha reportado
como agente causal de listeriosis en humanos (Cummings, et al, 1994).
16
Tabla 1: diferenciación fenotípica de especies del género Listeria
β -
hemolisis
Test de
CAMP
Arilamidasa Manitol Xilosa Ramnosa
S.
aureus
R.
equi
L.
monocytogenes
+ + - - + - +
L. innocua - - - + - - +
L. welshimeri - - - V - + V
L. seeligeri + (+) - + - + -
L. Ivanovii + - + V - + -
L. grayi - - - + + - -
L. marthii + - - V - + -
L. rocourtiae - - - - + + +
Fuente: Leclercq et al., 2009
17
Solo tres especies son hemolíticas, L. monocytogenes, L. seeligeri y L. ivanovii. La
prueba de CAMP es positiva para L. monocytogenes y L. seeligeri en la proximidad de
una estría de Staphylococcus aureus, en cambio L. ivanovii sólo da positiva para la
prueba de CAMP en presencia de una estría de Rhodococcus equi, las otras especies
no reaccionan con esta prueba. En cuanto a la producción de ácido de los
carbohidratos, L. monocytogenes presenta un perfil D-xilosa negativa y L-ramnosa
positiva que la distingue de las otras especies hemolíticas (Oteo & Alós, 2001).
3.2. Listeria monocytogenes
L. monocytogenes es un coco bacilo Gram-positivo, se puede presentar aislado, en
parejas o cadenas cortas de 3 a 5 organismos, en ocasiones en forma de V o Y, carece
de cápsula y esporas; es móvil a través de flagelos perítricos y esta movilidad se
manifiesta mejor a temperaturas entre 20 y 25°C, logrando ser imperceptible o nula a
37ºC (Farber & Peterkin, 1991).
L. monocytogenes es un microorganismo ubicuo. Todos los miembros del género
Listeria se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza en el suelo, agua,
pastos y ensilajes, donde sobreviven por largos períodos de tiempo. Las plantas son
reconocidas como un reservorio importante del microorganismo y se han propuesto
como fuente de infección (Torres, et al, 2005).
Los alimentos que con frecuencia se asocian con brotes y con alto nivel de riesgo son
quesos y productos lácteos, salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general
productos industrializados, refrigerados, listos para el consumo, sin requerimientos de
cocción o calentamiento previo, los que se pueden contaminar en cualquiera de los
pasos en el procesamiento de los alimentos, así como en el almacenamiento en frío
(Callejo et al., 2008).
Las cepas patógenas de L. monocytogenes fabrican una sustancia, la listeriolisina O,
responsable de la hemólisis-β y de la destrucción de las células fagocitarias. La
18
listeriolisina O es una hemolisina que se segrega a pH bajo y a baja concentración de
hierro (Sánchez et al, 2009).
L. monocytogenes se caracteriza por poseer distintos antígenos somáticos y flagelares
que dan origen a 13 serovariedades diferentes;1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b,
4c, 4d, 4e y 7, esta gran heterogeneidad antigénica puede estar relacionada con el gran
número de hospedadores animales en los que es capaz de multiplicarse (Larraín &
Carvajal, 2008; Sánchez et al, 2009), las cepas de los serotipos 4b, 1/2a y 1/2b, son las
responsables de más del 95% de los casos de listeriosis humana, destacando de
manera especial el serotipo 4b (Larraín & Carvajal, 2008), el cual desde 1981 es el
responsable del 33-50% de casos esporádicos de listeriosis en humanos en todo el
mundo y se ha aislado en los principales brotes producidos por alimentos (Doyle et al,
2001).
L. monocytogenes se ha llegado a detectar en las plantas de procesamiento y en
ambientes refrigerados, por lo que puede ser transmitida al humano a través de la
ingestión de alimentos que se contaminan durante cualquier paso en la cadena de
producción (Rodríguez et al, 2009).
Este microorganismo supone un problema grave para las empresas alimentarias debido
a la dificultad que presenta su control en las plantas de procesado. Por todo ello, desde
el punto de vista de la higiene y la salud alimentaria y pública, L. monocytogenes es un
organismo prioritario en los planes de análisis de peligros y puntos de control críticos
(APPCC) llevados a cabo en las industrias alimentarias, así como en los planes de
prevención de enfermedades de las instituciones sanitarias (López et al, 2006).
Según la industria y los gobiernos, se deben tratar a todas las cepas de L.
monocytogenes como potencialmente patógenas, aunque pueden variar según su
grado de virulencia, siendo deseable su ausencia en la cadena de producción de
alimentos, mientras sea posible, manteniendo condiciones que inhiban su multiplicación
en los alimentos, a través de mecanismos de buenas prácticas de manufactura.
(Rodríguez et al, 2009)
19
3.2.1. Ciclo infeccioso: L. monocytogenes es un organismo intracelular que tiene la
capacidad de resistir su eliminación por los macrófagos y replicarse en el interior de las
células colonizadas para su posterior invasión directa a otra célula del huésped (Callejo
et al., 2008). El factor que favorece esta resistencia es la listeriolisina O (LLO), una
hemolisina que inhibe la presentación de antígenos por los macrófagos colaboradores,
lo cual facilita su diseminación protegida de las defensas del huésped (Abul et al.,
1999). Para entrar en el organismo la bacteria puede atravesar la barrera intestinal o
bien ingresar directamente a través de la sangre. Esta bacteria es fagocitada e
interiorizada en forma de vacuola por la célula infectada, debido a la expresión de los
genes de internalización InlA e InlB, luego de esto L. monocytogenes se libera por la
acción de la listeriolisina que se fija a la membrana vacuolar formando oligómeros que
inducen la ruptura de dicha membrana (Velazco et al., 2005).
Una vez liberada, L. monocytogenes se multiplica en el citoplasma celular donde
polimeriza la actina por medio de la expresión del gen ActA y forma unos filamentos que
originan prolongaciones en la pared de la célula infectada llamadas filópodos, que le
permite la movilidad a las células adyacentes. En este momento se repite la ruptura de
la doble membrana vacuolar para iniciar de nuevo el ciclo infectivo (Figura 1) (Larraín &
Carvajal, 2008).
En personas sanas, una vez que L. monocytogenes ha llegado al intestino es captada
por los enterocitos o la células M próximas a las placas de Peyer, y se multiplica en las
células fagocíticas, la infección puede ser erradicada con la ayuda de macrófagos que
estimulan las células TCD4+ y CD8+ que son activadas por el interferón INF-γ o por
medio de la lisis de los macrófagos infectados mediada por los linfocitos T citolíticos
(CTL) (Abul et al., 1999).
Sin embargo, en pacientes con deficiencias en su sistema inmune se puede dar una
respuesta inadecuada facilitando que L. monocytogenes se multiplique en los
hepatocitos y en los macrófagos y sea transportada por la sangre a varios órganos,
principalmente al cerebro llegando a la barrera hematoencefálica y/o al útero donde
atraviesa la placenta (Rodríguez et al., 2009).
20
Figura 1: Proceso infeccioso y fase intracelular de la infección por Listeria
monocytogenes.
Fuente: Larraín & Carvajal, 2008.
3.2.2. Biofilm: Un biofilm se considera una comunidad microbiana sésil, caracterizada
por células que están adheridas irreversiblemente a un sustrato o interfase, incluyendo
superficies minerales, tejidos vivos o muertos de animales o plantas, polímeros
sintéticos, cerámicas y aleaciones de metales (Costerton, 1999).
Los biofilms han sido descubiertos en gran variedad de ambientes y constituyen un
método de protección que permite a los microorganismos un crecimiento, desarrollo y
supervivencia en ambientes adversos, su fisiología tiende a ser significativamente
diferente a los microorganismos que crecen en un medio líquido (Monds & O'Toole,
2009).
En la figura 2 se describe la formación de biofilms sobre superficies a través de 5
etapas comenzado por la adsorción de una fina película orgánica sobre el sustrato.
21
Figura 2: Representación de las etapas del desarrollo de un biofilm sobre un sustrato.
Dunne, 2002.
Los biofilms que se encuentran sobre las superficies de los vegetales son más
resistentes a los productos sanitizantes y detergentes, lo cual es atribuido a la
producción de enzimas que degradan las sustancias antimicrobianas (Romanova et al,
2007). Los biofilms de bacterias no patógenas que pueden estar presentes en vegetales
como lechuga y tomate pueden retener en su interior microorganismos potencialmente
patógenos dificultando su eliminación (Rayner et al, 2004).
3.3. LISTERIOSIS
La listeriosis corresponde a una infección de origen alimentario con importantes índices
de mortalidad en adultos inmunocomprometidos, mujeres embarazadas, fetos y recién
nacidos (Stonsaovapak & Boonyaratanakornkit 2008). Se le considera una de las ETA
con mayor tasa de mortalidad en humanos (20 al 30 % o mayor). Ocasiona una amplia
variedad de síntomas, que pueden variar desde una enfermedad leve similar a la gripa,
22
meningitis, gastroenteritis, septicemia y hasta la listeriosis neonatal asociada a tasas de
mortalidad que van del 54 a 90% (Velazco et al., 2005). La infección comienza
alrededor de las 20 horas después de la ingestión del alimento contaminado en los
casos de gastroenteritis (Rossi et al., 2008), mientras que el período de incubación para
la forma invasiva es generalmente más larga, es alrededor de 20 a 30 días (Velazco et
al., 2005). Los mismos períodos de incubación han sido descritos para animales, tanto
para la gastroenteritis como para la forma diseminada. Los casos esporádicos tienen
una tasa de incidencia muy baja, 2 a 8 casos anuales por millón de población en
Europa y USA (Mayorga, 2004).
3.3.1. Tipos de listeriosis: La listeriosis se puede agrupar en dos categorías: invasiva y
no invasiva. La listeriosis invasiva se presenta principalmente en personas mayores de
65 años, pacientes con alguna deficiencia inmunológica (pacientes con quimioterapias,
con leucemia, enfermedades hepáticas, con trasplantes, portadores de VIH, diálisis,
diabetes, alcoholismo) adquiridos por el consumo de alimentos contaminados con L.
monocytogenes, puede producir meningitis y meningoencefalitis con una tasa de
mortalidad que puede llegar al 80% (McLauchlin, 1996). En pacientes adultos, las
principales manifestaciones clínicas son la meningitis (55%), bacteriemia primaria
(25%), endocarditis (7%) y las infecciones no meníngeas del sistema nervioso central
(6%) (Callejo et al., 2008).
En mujeres embarazadas provoca abortos e invade el feto y la placenta. El aborto es
esporádico y ocurre principalmente en el primer trimestre de gestación. En neonatos la
infección es mediante vía transplacentaria y produce meningitis con una mortalidad de
hasta el 35% (Bemrah et al, 1998). Un resumen de 782 casos de listeriosis notificados
de 20 países reflejó que el 43% de las infecciones estaban relacionadas con el
embarazo, mientras que el 57% de los casos no, los cuales podían subdividirse a la vez
en las siguientes categorías: infecciones septicémicas 29%; infecciones del SNC 24% y
formas atípicas 4% (Espaze, et al., 1991).
La listeriosis no invasiva tiene una manifestación en síntomas de gastroenteritis, como
diarrea, fiebre, vomito, dolor de cabeza, su periodo de incubación es corto y es
23
provocado por el consumo de alimentos contaminados con concentraciones de L.
monocytogenes que superan los 107 UFC/g (Dalton et al, 1997).
3.3.2. Dosis Infecciosa: La dosis mínima requerida para la infección humana no ha sido
determinada, sin embargo existen datos que indican las cantidades de L.
monocytogenes en el alimento contaminado responsable de casos esporádicos de
origen alimentario son de más de 102 UFC/g (Rocourt & Cossart, 2005). El valor
determinado para ratones infectados experimentalmente por vía oral es de 109 UFC/g y
por vía parenteral es de 105 a 106 UFC/g (Callejo et al., 2008). Además, esta dosis
también depende de otros factores como el estado inmunológico del huésped
(Marzocca et al., 2004).
3.3.3. Casos de listeriosis: Desde 1981 se han descrito varios brotes de origen
alimentario, y algunos afectaron a gran número de personas y tuvieron una duración
prolongada: 122 enfermos en Suiza en los años 1985 a 1987, aproximadamente 300
enfermos en el Reino Unido en los años 1987 a 1989, 279 enfermos en Francia en
1992 (Rocourt & Cossart, 1997) y 26 casos de listeriosis reportados en Canadá en el
2008 (Public Health Agency of Canada´s., 2008).
En Estados Unidos se presentó un caso en el cual al consumir ensalada con huevo y
ensalada con pasta 2500 personas fueron afectadas por L. monocytogenes y alrededor
de 500 fallecieron por este patógeno (Hwang & Marmer., 2006).
3.4. BROTES
El primer brote de origen alimentario de listeriosis reportado se produjo en 1980-1981
en Nueva Escocia, Canadá, en el cual se reportaron 41 casos, incluyendo 7 adultos y
34 (83%) casos perinatales y 18 muertes, 2 adultos y 16 del feto o recién nacido. La
ensalada de col estaba implicado como la fuente probable de L. monocytogenes en
este brote. La cepa del brote se encontraba a partir de coles que fueron fertilizadas con
estiércol de oveja infectadas con L. monocytogenes (Schlech et al., 1983). En la tabla 2
se muestran algunos ejemplos de brotes alimentarios de listeriosis.
24
Tabla 2: Brotes asociados al consumo de alimentos contaminados con Listeria
monocytogenes
Año País Casos (muertes) Alimento Serotipo Referencia
1980-
81 Canadá 41 (18)
Ensalada de
col 4b
Schlech et al.
(1983)
1983 USA 49 (14) Leche
pasteurizada 4b
Fleming et al.
(1985)
1987-
89 UK >350 (>90) Paté belga 4b
McLauchlin et
al. (1991)
1992 Francia 279 (85)
Lengua de
cerdo en
gelatina de
carne
4b Goulet et al.
(1993)
1995 Francia 20 (4) Queso blando 4b Goulet et al.
(1995)
1997 Italia > 1500 (0) Ensalada de
atún y maíz 4b
Aureli et al
(2000)
1998 USA >50 (8) Perros
calientes 4b Anon. (1999)
1999-
2000 Francia 26 (7)
Lengua de
cerdo en
gelatina de
carne
4b Anon. (2000)
Fuente: Trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and antimicrobial resistance
in the European Union in 2004.
25
En mayo de 1997, se presentaron numerosos casos de enfermedades
gastrointestinales y fiebres en estudiantes y personal de 2 escuelas en el norte de Italia.
De 2189 personas entrevistadas, 1566 (72%) informaron los síntomas, de estos 292
(19%) fueron hospitalizados. El consumo de una ensalada de maíz y atún se asoció con
el desarrollo de los síntomas que presentaban las personas. L. monocytogenes se aisló
de las muestras de ensaladas y de muestras ambientales (Aureli et al., 2000).
Para los meses de Agosto y Septiembre del año 1997 en Costa Rica se analizaron 50
muestras de ensalada fresca. Los resultados mostraron que se aisló Listeria spp. en 16
(32%) de las 50 muestras, de estas 10 (8%) correspondía a L. monocytogenes (Monge
& Arias-Echandi., 1999).
Entre 2000 y 2005 se analizaron 717 muestras de ensaladas para detectar la presencia
de L. monocytogenes en la ciudad de Santiago de Chile y para evaluar el riesgo de
estos productos al consumirlos. L. monocytogenes se encontró en 88 (25,4%) de 347
muestras de ensaladas congeladas, en 22 (10,2%) de 216 en ensaladas recién
preparadas en los supermercados y de 154 muestras de ensaladas crudas
mínimamente procesadas no se aisló L. monocytogenes (Cordano & Jacquet., 2009).
3.5. L. monocytogenes EN ALIMENTOS
Se ha determinado que L. monocytogenes puede contaminar los alimentos a través de
los trajes, el calzado, las manos de los operarios, los utensilios, el equipamiento y los
materiales utilizados en el procesamiento (Capita et al., 2002). La contaminación cru-
zada, es decir el contacto de los alimentos listos para el consumo con materias primas,
superficies o utensilios contaminados, es otra vía de diseminación. Dada la dificultad
para impedir su ingreso a los lugares de procesamiento, se deben tomar medidas para
su eliminación durante los procesos de limpieza y desinfección y conocer los
parámetros que limitan su desarrollo. La presencia de este microorganismos en los
procesos de producción de alimentos genera la necesidad de plantear planes
adecuados de control, limpieza y desinfección que permitan minimizar las posibilidades
de contaminación en las zonas de proceso, en particular en aquellos puntos donde el
alimento no es sometido a un tratamiento que permita la destrucción del
26
microorganismo (Huang & Sites 2009). Es por ello, que los restaurantes tienen, o
deben tener barreras sanitarias al ingreso del área de preparación de los alimentos.
Estas consisten en un control de la indumentaria del personal, lavado de manos y
reducción del tránsito de personas que ingresan al lugar donde se procesan los
alimentos (Hufman, 2002). Uno de los problemas que enfrenta los restaurantes es que
los productos químicos utilizados para desinfectar superficies como compuestos
clorados no garantizan la eliminación de esta bacteria o bien pierden su efectividad en
presencia de materia orgánica (Lunden, 2004).
Debido a la naturaleza ubicua de L. monocytogenes, el microorganismo puede
presentar un mayor peligro en aquellos alimentos que no están sujetos a un proceso
posterior que reduzca o elimine este microorganismo. Tales productos incluye; los
quesos fabricados con leche cruda, el pescado frio ahumado, los productos cárnicos
fermentados y las ensaladas preparadas donde la materia prima solo se somete a un
tratamiento de lavado (Schlech et al., 1983).
El consumo de ensaladas ha experimentado un importante aumento en los últimos
tiempos, que se debe a razones de sociales y nutricionales. El papel nutricional de las
ensaladas y las verduras en general, como fuentes de fibra, vitaminas y minerales, es
ampliamente reconocido. Este hecho se refleja en los hábitos alimentarios debido a un
incremento en el consumo de verduras y hortalizas (Aranceta et al., 2003). El aumento
de hortalizas a nivel mundial tuvo un aumento entre los años 2000 y 2006, al pasar de
738 a 888 millones de toneladas y promedio de crecimiento anual de 3.1%. La
producción nacional de las hortalizas en el mercado interno presentó un crecimiento
promedio anual de 1,1% entre 2000 y 2006 (FAO, 2008). Este crecimiento se debe a
que el hombre en busca de una mayor capacidad de supervivencia y preocupado por
controlar su peso corporal, está cambiando su dieta diaria, aumentando así el consumo
de vegetales frescos y crudos, como son las hortalizas que se sirven en las ensaladas,
las cuales acompañan a los diversos alimentos que son consumidos masivamente por
la población. La industria alimentaria está alcanzando gran desarrollo en el
procesamiento de las hortalizas frescas crudas empacadas en cortes, que se han
hecho populares en los supermercados; sin embargo, las nuevas técnicas de
27
procesamiento y envasado han aumentado el riesgo asociado con L. monocytogenes,
debido a su carácter ubicuo y su gran adaptación a las condiciones del medio (Curtis et
al., 2002).
L. monocytogenes ha sido aislada en diversos vegetales, como tomates, zanahorias,
lechugas, repollos, espinacas, pepinos, coliflor, brócoli, entre otras, en las cuales la
contaminación es variable y se ve influenciada por el lugar de cultivo, la zona de
recolección, los abonos, la temperatura, los procedimientos de lavado, el contacto con
el suelo y las condiciones higiénicas durante el expendio (Carrasco et al, 2007).
Este microorganismo supone un problema grave para las empresas alimentarias debido
a la dificultad que presenta su control en las plantas de procesado. Por todo ello, desde
el punto de vista de la higiene y la salud alimentaria y pública, L. monocytogenes es un
organismo prioritario en los planes de análisis de peligros y puntos de control críticos
(APPCC) llevados a cabo en las industrias alimentarias, así como en los planes de
prevención de enfermedades de las instituciones sanitarias.
Investigaciones realizadas principalmente en Estados Unidos demuestran la presencia
de patógenos humanos en vegetales frescos, indicando que algunos factores como la
fertilización con compost orgánico, aguas de riego contaminadas y prácticas de
cosecha y pos cosecha contribuyen a la proliferación, adicionalmente se consideran los
riesgos asociados con la preparación y los hábitos de consumo. Desde 1995, en ese
país se han reportado brotes por diferentes tipos de microorganismos, los vehículos
fueron la lechuga y otras hortalizas de hoja (Luna, et al., 2008).
En Colombia en la Fundación Clínica valle del Lili (FCVL) se ha registrado que desde
1994 son más frecuente los casos de listeriosis en pacientes inmunodeprimidos y en
neonatos. De un total de 19 casos confirmados: 10 se presentaron en adultos
inmunodeprimidos, 2 en mujeres embarazadas, 6 en neonatos y una adolecente, la
mayoría con septicemia (Crespo, et al., 1999).
Un estudio de la universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano realizó la determinación
microbiológica de Listeria spp. en lechuga y espinaca, tomando 15 muestras de las
28
variedades de lechuga batavia (Lactuca sativa L.) y romana (Lactuca sativa variedad
longifolia) así como las de espinaca (Spinacia oleracea L). El estudio mostró una
prevalencia de 18,6% de Listeria spp. en lechuga romana y espinaca (Luna, et al.,
2008).
3.6. NORMATIVIDAD SOBRE MANEJO DE ALIMENTOS
La legislación Colombiana para la aplicación en este tipo de productos es el Decreto
3075 de 1997, del 23 de Diciembre, mediante el cual se establecen las normas de
higiene para la elaboración, almacenamiento, transporte, distribución y comercio de
alimentos en el territorio nacional, el cual define el alimento como “todo producto natural
o artificial, elaborado o no, que ingerido aporta al organismo humano los nutrientes y la
energía necesarios para el desarrollo de los procesos biológicos”. Además define
también alimento de mayor riesgo en la salud pública como “Alimento que, en razón a
sus características de composición especialmente en sus contenidos de nutrientes,
actividad acuosa (Aw) y pH, favorece el crecimiento microbiano y por consiguiente,
cualquier deficiencia en su proceso, manipulación, conservación, transporte,
distribución y comercialización, puede ocasionar trastornos a la salud del consumidor
(Decreto 3075 de 1997).
3.7. RESTAURANTES Y ESTABLECIMIENTOS DE CONSUMO DE ALIMENTOS
Se debe tener en cuenta que los restaurantes no se podrán localizar junto a botaderos
de basura, deberá contar con servicios sanitarios para el personal que labora en el
establecimiento, debidamente dotados y separados del área de preparación de los
alimentos. Las instalaciones de enfriamiento deben de estar en condiciones higiénicas y
se deben de seguir las Buenas Prácticas de Manufactura. El control de la temperatura
es fundamental para productos perecederos, ya que solo las temperaturas de
refrigeración aseguran una vida comercial óptima y la calidad del producto (Decreto
3075 de 1997).
Las verduras deben almacenarse y presentarse en refrigeración, los manipuladores se
deben lavar las manos con agua y jabón antes de manipular el producto y las veces que
29
sea necesario, el agua debe ser de una adecuada calidad microbiológica. Los guantes
o utensilios apropiados actúan como una barrera para la manipulación de los alimentos,
se deben de cambiar con suficiente frecuencia para prevenir una contaminación
cruzada. Se deben de seguir unas pautas higiénicas adicionales como: retirar las partes
deterioradas del producto ya que podrían albergar diferentes tipos de patógenos, lavar
el producto, limpiar y desinfectar los equipos y utensilios que tengan contacto directo
con el producto (tablas de picar, cuchillos, recipientes). Se debe prevenir en todo caso
la contaminación cruzada, por ejemplo, separando los utensilios y superficies
empleados para la preparación de las ensaladas, de los empleados para la preparación
de alimentos como carne y pollo (Wells & Butterfield, 1997).
3.8. BPM EN ALIMENTOS
Las Buenas Prácticas de Manufactura son una herramienta básica para la obtención de
productos seguros para el consumo humano, que se centralizan en la higiene y forma
de manipulación de estos. A nivel mundial, en la industria alimentaria se han
desarrollado programas que permiten garantizar la inocuidad de los alimentos basados
en la protección, vigilancia y control de manipuladores, materias primas y procesos de
producción, entre otros, para prevenir posible contaminación de los alimentos (Rojas,
2007). Para esto, se han establecido leyes que regulan los procesos de elaboración y
manipulación de los alimentos. En Colombia es el Decreto 3075 de 1997 el encargado
de regular las buenas prácticas de manufactura (BPM) para alimentos y el ente que se
encarga de que estas sean cumplidas es el Instituto Nacional de Vigilancia de
Medicamentos y Alimentos (INVIMA), este decreto reglamenta la implementación de
directrices destinadas a la elaboración inocua de los alimentos, con el objetivo de
proteger la salud de los consumidores.
Las BPM involucran el manejo adecuado de instalaciones, equipos, personal
manipulador, documentación, materias primas, entre otros. Las instalaciones deben
cumplir requisitos que garanticen la inocuidad del producto (Dávila et al., 2006).
En cuanto a los manipuladores, estos deben realizarse exámenes médicos periódicos y
tener conocimiento certificado sobre el manejo y control de los alimentos. Además,
30
deben cumplir buenas prácticas higiénicas, otro factor importante a tener en cuenta es
la calidad de las materias primas ya que estas suelen ser un importante foco de
contaminación. Si se sospecha que las materias primas son inadecuadas para el
consumo, deben aislarse y rotularse claramente, para luego eliminarlas (Dávila et al.,
2006).
Un punto importante para evitar contaminar los alimentos es realizar la manipulación de
los mismos en zonas con un buen proceso de limpieza y desinfección. Se deben tener
claras las técnicas utilizadas, los tipos de desinfectantes y las concentraciones
recomendadas para cada tipo de superficie (Programa Calidad de los Alimentos
Argentinos, 2002).
31
4. METODOLOGÍA
4.1. ÁREA DE ESTUDIO
El estudio se realizó en 10 restaurantes de la ciudad de Ibagué (Tolima) ubicados en la
Universidad del Tolima y en lugares aledaños a ella dedicados a la venta de almuerzos
La selección de los sitios se realizó de acuerdo a las encuestas de BPM y a los
permisos obtenidos por parte de los dueños o administradores de los establecimientos.
4.2. ENCUESTAS BPM
Se realizó una primera visita para entrevistar a los encargados de los expendios y
posteriormente se diligencia la encuesta de las BPM (Anexo A). Para el análisis de los
datos se tuvo en cuenta índices de cumplimiento de varios ítems entre los que se
encuentran calidad del lugar, limpieza y desinfección y manejo de residuos; las cuales
se calificaron con respuestas de sí y no, indicando si las prácticas de manejo que se
llevaban en el expendio son acordes a los lineamientos de BPM.
4.3. TOMA Y CODIFICACIÓN DE MUESTRAS
Las muestras para el aislamiento de Listeria, se tomó de la materia prima, de la
ensalada terminada y del aderezo solo si se le adicionaba, tomando aproximadamente
100 g. Estas muestras fueron colectadas en bolsas de sellado hermético y conservadas
a 4° C hasta su procesamiento en el laboratorio.
Las muestras de superficies se colectaron de bandejas y cuchillos. Se utilizó la
metodología de frotis con esponja para las muestras de ambiente. Los muestreadores
se encontraban en condiciones de esterilidad para evitar que se diera una
contaminación cruzada.
A cada una de las muestras colectadas se les asigna un código interno que se maneja
durante todo el procesamiento de las mismas, esto con el fin de respetar la
confidencialidad de los lugares de muestreo. Los códigos fueron escritos en el acta de
32
muestreo en la que también se tomaron los siguientes datos: temperatura de la
muestra, temperatura del ambiente y estado del alimento.
4.4. PROTOCOLO PARA LA TOMA DE MUESTRAS
Para la toma de muestras de la materia prima, producto listo para el consumo y
superficies se utilizan materiales estériles como guantes quirúrgicos, bolsas ziploc,
tijeras estériles, además de otros implementos como marcadores, alcohol al 70%,
neveras de icopor con geles refrigerantes para la conservación de la muestra a 4°C.
Al momento de iniciar el muestreo se levantó un acta donde se incluye el nombre del
establecimiento y código, se toman las muestras de la materia prima y el producto
terminado. Posteriormente se realizó la toma de muestras de las bandejas y cuchillos.
Todas las muestras se almacenan debidamente rotuladas, en neveras de icopor con
geles refrigerantes.
Se realizó un muestreo representativo de manera aleatoria de las ensaladas, que son
consumidas en los restaurantes satélites y aledaños de la Universidad del Tolima
utilizando la fórmula de Trhursfield:
N = 4xpxq/ e2
Teniendo en cuenta una prevalencia de Listeria del 3% (Sant’Ana et al., 2012) se
tendrá:
N= 4 * 0.03 * 0.97 / 0.052
N= 46. 56
Para un total de 47 muestras a analizar entre materia prima, ensalada terminada y
superficies. Para muestras de ambiente se tomaron 10 para cuchillos y 10 para
bandejas, 16 para materia prima, 10 para la ensalada terminada y 1 para aderezo (tabla
3).
33
Tabla 3: Tipo y cantidad de muestras analizadas
Tipo de muestra N° de muestras
Bandejas 10
Cuchillos 10
Cebolla cabezona 4
Tomate 4
Lechuga 2
Aguacate 2
Pimentón 1
Zanahoria 2
Apio 1
Aderezo 1
Ensalada Lista Para
el Consumo
10
Total 47
Fuente: el autor
34
4.5. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
Las muestras se analizan en el Laboratorio de Microbiología y Micorrizas del grupo
GEBIUT de la Universidad del Tolima bajo los siguientes protocolos:
Según el protocolo que se aplica en el laboratorio mediante la norma ISO 11290-1 de
1998.
4.5.1. Pre-enriquecimiento: Esta fase pretende brindar las condiciones óptimas para el
crecimiento de Listeria, y hacer que el cambio a condiciones de laboratorio no sea tan
drástico. El caldo Fraser con suplemento, es utilizado para el enriquecimiento de
Listeria, tiene compuestos como peptona, esculina, hidrolizado enzimático de caseína,
extractos de carne y levadura y proteasa peptona entre otros, (anexo B). Este pre-
enriquecimiento se le realiza a cada una de las muestras de ensaladas, se pesa 25gr
de la muestra y se coloca en 225ml de Caldo Fraser-semi, más suplemento, se
homogeniza la muestra y se lleva a incubación a 30ºC por 24 horas, se considera como
positivo el cambio de coloración del caldo.
4.5.2. Enriquecimiento: Se pasa 0.1 ml del cultivo obtenido en la fase de pre-
enriquecimiento a 10ml de Caldo Fraser mas suplemento completo y se pone a
incubación a 37ºC durante 18 horas.
4.5.3. Aislamiento e identificación: De la fase de enriquecimiento, se realizó una
siembra por agotamiento en los medios de cultivo Palcam y Chromoagar, los cuales son
selectivos para Listeria y se incubarán a 37° C, por 24 h.
Palcam. Este medio es selectivo para Listeria spp. ya que contiene nutrientes
necesarios para su crecimiento. Se incubó a 37ºC durante 24 a 48 horas, y se
consideró como positivo las colonias verde grisáceas, a veces con centro negro y
rodeadas de halo blanco, deprimidas en el centro (48 horas).
Agar Cromogénico. La identificación rápida de las enzimas bacterianas es
proporcionada por el uso de sustratos chromogénicos, que se incorporan a los medios
35
para permitir la identificación directa de las colonias. Se incubó a 37ºC durante 24 a 48
horas, y se consideró como positivo la presencia de colonias verde-azules con halo
opaco (24 horas).
4.5.4. Confirmación de Listeria spp.: Iluminación de HENRY. Se realizó una siembra de
colonias típicas en Agar Tripticasa Soya extracto de Levadura (TSAYE), luego se
incubó a 37ºC de 18 a 24 h.
Catalasa. Se utilizó peróxido de hidrógeno al 3%, ya que con este nos confirmara si es
positiva o no la muestra. La formación de burbujas de gas es un resultado positivo.
Tinción de GRAM. Se realizó una observación al microscopio.
4.5.5. Determinación de especie: Prueba de Hemolisis. En agar sangre se siembra en
agotamiento colonias presuntivas de Listeria spp. y se lleva a incubación entre 24 y 48
horas a 35-37°C, luego se realiza la clasificación del tipo de hemolisis presentado, así,
beta hemolíticos si la hemólisis fue total, alfa hemolíticos si la hemólisis fue parcial o
incompleta con cierto color verdoso, y gamma hemolíticos para cuando no se presenta
hemólisis.
Prueba de CAMP. Se siembra dos líneas rectas y paralelas en agar sangre, una estría
ß-hemolítica de Staphylococcus aureus ATCC 25923 y la otra de Rhodococcus equi
ATCC 6939, teniendo la precaución de que dichas estrías tuviesen suficiente
separación como para permitir que las cepas de Listeria spp. De prueba y de control se
pueden sembrar perpendicularmente entre los dos organismos indicadores, sin que los
toquen (separados 1–2 mm). Después se incuba por 24–48 horas a 35–37°C. Se
considera una reacción positiva si aparece una zona destacada de ß-hemólisis en la
intersección de las cepas de prueba/control con las cepas indicadoras.
Prueba de fermentación de azucares. Se siembra una UFC de las cepas de Listeria
spp., en caldo rojo de fenol, que contenía los azucares elegidos para su respectiva
fermentación (manitol, xilosa y ramnosa) a una concentración del 1% y se lleva a
incubación a 35-37°C, se realiza lecturas cada 24, 48 y 72 horas.
36
4.5.6. Determinación de sensibilidad antimicrobiana: Las pruebas de sensibilidad
antimicrobiana se realiza con 5 cepas de L. monocytogenes aisladas previamente de
ensaladas, junto con muestras de cárnicos y ambiente.
Las cepas aisladas se analiza mediante la técnica Kirby-Bauer, para determinar
patrones de sensibilidad frente a un panel de 10 agentes antimicrobianos (Penicilina
10UI, Ampicilina 10µg, Amoxicilina, Ácido Nalidixico, Enrofloxacina, Ciprofloxacina 5µg,
Estreptomicina 10µg, Netilmicina 30µg, Vancomicina 30µg, y Tetraciclina).
Las cepas aisladas se incuban en TSAYE a 35ºC por máximo 16 horas. Luego se
toman aproximadamente 10 colonias y se inoculan en 2ml de agua destilada estéril,
hasta obtener una suspensión bacteriana con un patrón de turbidez McFarland 0.5, el
equivalente a 1.5 x 108 UFC/ml esto con el fin de una identificación clara de las
bacterias.
Una vez ajustada la turbidez, en Agar Mueller Hinton se suplementan con 5% de
sangre, se realiza una siembra masiva con escobillón repitiendo el proceso para
garantizar una alta carga bacteriana en el medio. Seguidamente se colocan los discos
de antibióticos (5 por caja) y se incuban por 20-24 horas a 35ºC. Finalmente se medirá
el diámetro (en milímetros) de la zona alrededor de cada disco.
Los datos generados en la prueba de sensibilidad microbiana, se comparan e
interpretan de acuerdo a los lineamientos del Clinical Laboratory Standars Institute
(CLSI), para clasificar la sensibilidad de los antibióticos en cada cepa, como
susceptible, intermedio o resistente.
37
5. RESULTADOS
5.1. PRESENCIA DE Listeria
Se analizaron un total de 47 muestras tomadas de cuchillos, bandejas, materia prima,
ensalada terminada y aderezo solo si le adicionaba, en 10 restaurantes ubicados en la
Universidad del Tolima y aledaños a ella. De éstas, las 47 muestras (100 %) resultaron
presuntamente positivas para Listeria en caldo Fraser con suplemento en la fase de
pre-enriquecimiento y de enriquecimiento (Figura 3).Esto nos da una idea que las
especies del genero Listeria tienen una alta capacidad de contaminar diferentes
superficies y sobrevivir a condiciones de estrés.
Figura 3: Porcentaje de Listeria en los diferentes tipos de muestras presuntivas en
caldo de pre-enriquecimiento y enriquecimiento Fraser.
Fuente: El autor
De las muestras presuntivas positivas en caldo Fraser, 6 de ellas (12.8%) resultaron
presuntivas positivas para Listeria en agar Cromogénico, y 1 (2%) para agar Palcam
(tabla 4). Se puede evidenciar que el cuchillo es el que presenta posibles resultados
positivos para Listeria, que puede deberse a que este implemento tiene contacto con
38
diferentes tipos de alimentos generando mayores probabilidades de contaminación
cruzada.
Tabla 4: Resultados presuntivos de Listeria en relación al expendio y el origen en agar
Cromogénico y Palcam
CÓDIGO EXPENDIO ORÍGEN AGAR
RCCU Cuchillo Cromogénico
RTUTTO Tomate Cromogénico
RTUTCU Cuchillo Cromogénico
EPEL Ensalada lista Cromogénico
EPCU Cuchillo Cromogénico
GPB Bandeja Cromogénico
EPCU Cuchillo Palcam
Fuente: el autor
Figura 4: Porcentaje de Listeria presuntivo positivo en aislados de agar cromogénico
Fuente: El autor
39
De las 6 (100%) muestras presuntivas para Listeria, 2 (33.3%) de ellas corresponden al
restaurante identificado con el código EP; 2 (33.3%) muestras corresponden al
restaurante codificado de la manera RTUT y los otros 2 restaurantes cada uno con una
muestra que se encuentran codificados como RC (16.7%) y GP (16.7%)
respectivamente (Figura 3).
Las 6 cepas aisladas en agar Cromogénico, fueron cultivadas en agar TSAYE para la
purificación de la cepa y se les realizó la prueba bioquímica de catalasa generando
burbujas, tomando este resultado como positivo.
Posteriormente se realizó la Tinción de Gram a la observación microscópica no se
encontraron bacilos o cocobacilos Gram +. De esta manera se descarta la presencia de
L. monocytogenes en las 47 muestras realizadas en los restaurantes satélites y
aledaños a la Universidad del Tolima. Este resultado posiblemente sea porque los
vegetales son comprados, procesados y consumidos el mismo día, así que no hay un
tiempo de anaquel y como L. monocytogenes es mal competidora los otros
microorganismos pueden contaminar en mayor proporción los alimentos.
En las porciones muestreadas de los vegetales no se obtuvieron resultados positivos
para L. monocytogenes. Estas muestras eran provenientes de porciones de vegetales
(materia prima) que son normalmente comprados en lugares como plazas de mercado,
debido a esto podría darse una posible contaminación cruzada, pero con los métodos
de limpieza y desinfección que se practican en los restaurantes hay una posible
disminución de encontrar organismos patógenos en los alimentos. En los
supermercados los alimentos se encuentran organizados y separados, no es frecuente
que se presente contaminación cruzada.
En las muestras tomadas en cuchillos y bandejas no se logró aislar L. monocytogenes u
otra especie de Listeria y es posible encontrar otros tipos de microorganismos
generando falsos positivos en los resultados.
40
5.2. RESULTADOS BPM
Se aplicaron un total de 10 encuestas, en el restaurante central de la Universidad del
Tolima y aledaños a esta institución.
En la Figura 4 se muestran las frecuencias sobre la realización en los procesos de
limpieza y desinfección en los cuchillos, observándose que los restaurantes tienen
buenas prácticas de higiene, pero el cuchillo al ser un utensilio que tiene contacto con
diferentes tipos de alimentos, puede llegar a presentar una alta carga microbiana
generando un alto índice de contaminación cruzada que favorece la diseminación de
microorganismos. El mismo caso se puede presentar con las bandejas lo cual se puede
presenciar en la Figura 4. Estos resultados son preocupantes ya que a pesar que se les
realice un óptimo proceso de limpieza y desinfección a los utensilios antes de la
preparación de los alimentos, no se realiza ni limpieza ni desinfección en el paso de
alimentos como cárnicos a vegetales o viceversa.
Figura 5: Porcentaje de realización de proceso limpieza y desinfección en cuchillos y
bandejas
Fuente: El autor
41
Según las encuestas los restaurantes que fueron objeto del estudio en su mayoría
(72,35%) tienen como proveedor de materia prima a las plazas de mercado (Figura 6),
lugares donde no hay una correcta separación de los vegetales y donde no presentan
un control en la temperatura de refrigeración, presentando un ambiente propicio para el
crecimiento de diferentes especies bacterianas.
Un dato muy importante que se logró obtener al realizar las encuestas es que un poco
menos de la mitad (42,55%) no realizan procesos de limpieza y desinfección de materia
prima, solo hacen un lavado superficial con agua de la llave, estos procedimientos se
debe a la falta de capacitación del personal en los protocolos de limpieza y desinfección
ya que los encuestados creen que el agua arrastra todo lo que pueda tener los
vegetales y esto permite la contaminación y la multiplicación de diferentes especies de
microorganismos, entre los cuales pueden estar presentes algunas bacterias patógenas
incluida L. monocytogenes (Figura 7).
Figura 6: Porcentaje del proveedor materia prima
Fuente: El autor
42
De los restaurantes encuestados y que realizan la limpieza y desinfección de la materia
prima, el producto que más es utilizado es el hipoclorito de sodio con agua, el 55% de
los restaurantes realizan este procedimiento con el fin de disminuir o si es posible
eliminar totalmente los microorganismos que puedan estar presentes. Los productos
que también son utilizados en menor proporción son: hipoclorito de sodio a una
concentración del 5.25% (30%), agua hervida (9%) y vinagre con agua (6%) (Figura 8).
Figura 7: Porcentaje de realización de proceso limpieza y desinfección en materia
prima
Fuente: El autor
El tiempo de contacto de los desinfectantes con la materia prima es un elemento
importante, esto debido a que al estar sometidas un tiempo aproximado de 5 a 10 min
presentan una reducción significativa en las bacterias que puedan estar en este tipo de
alimentos (Figura 9). Pero la mayoría de los restaurantes solo generan un tiempo de
contacto de 1 a 5 min y al no eliminar en su totalidad a los microorganismos presentes
estos pueden obtener resistencias a estos productos, presentando en un futuro
mayores problemas para su eliminación.
43
Figura 8: Porcentaje de producto utilizado en la desinfección de la materia prima
Fuente: El autor
Figura 9: Porcentaje de tiempo de contacto de materia prima con los desinfectantes
Fuente: El autor
44
5.3. RESULTADOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO
5.3.1. Pre - enriquecimiento y enriquecimiento: De las 47 muestras analizadas se
obtuvo un resultado positivo para las 47 en la fase de pre-enriquecimiento. De estas, las
misma 47 fueron positivas para la fase de enriquecimiento en el medio Fraser completo
(Figura 10).
Figura 10: Caldo Fraser + suplemento. a. Control negativo b. Positivo.
Fuente: el autor.
5.3.2. Medio selectivo Cromogénico: En este medio se observó un crecimiento
presuntivo de Listeria en 6 de las 47 muestras obtenidas en la fase de enriquecimiento
y de ahí se pasan al siguiente medio de cultivo (Figura 11).
Figura 11: Medio selectivo Cromogénico. Crecimiento de colonias sospechosas
de Listeria spp.
Fuente: el autor.
a b
45
5.3.3. Medio selectivo Palcam: Se observó un presuntivo crecimiento positivo de
Listeria en 1 de las 6 muestras que se encontraban en el medio de cultivo de Agar
Cromogénico (Figura 12).
Figura 12: Medio selectivo Palcam. Crecimiento de colonias típicas en Palcam
sospechosas de Listeria
Fuente: el autor.
5.3.4. Diferenciación bioquímica: Prueba de Catalasa: Se observó una formación de
burbujas, lo cual es una típica reacción de especies del género Listeria. (Figura 13).
Figura 13: Prueba de catalasa.
Fuente: el autor.
Tinción de Gram: esta prueba permitió apreciar la forma y agrupación de los
microorganismos, en la cual se pudo observar que las muestras presuntivas para
Listeria no eran de bacilos o cocobacilos, descartando la posibilidad de encontrar
Listeria (Figura14).
46
Figura 14: Resultados de la tinción de Gram Cocos Gram positivos.
Fuente: el autor.
47
6. DISCUSIÓN
Los procesos de cocinado en los vegetales antes de su consumo, reducen el riesgo de
contaminación, pero el problema se presenta cuando no hay un proceso de cocción o si
este procedimiento es insuficiente, también cuando los productos son sometidos a
refrigeración o congelación, esto debido a la característica de L. monocytogenes de
sobrevivir y multiplicarse a temperaturas menores a 4ºC (Centurion & Takajara, 2004).
En el presente estudio se puede observar que la ausencia de L. monocytogenes en las
verduras, significa un bajo riesgo de para la población, debido a que estos son
adquiridos, lavados, desinfectados, preparados y consumidos el mismo día y no hay un
tiempo de anaquel para que esta bacteria pueda proliferar, pero si estos productos no
son sometidos a óptimas prácticas de manufactura que permiten la contaminación
cruzada a lo largo de la producción, conservación y fraccionamiento, y cuyas
temperaturas de refrigeración permiten su crecimiento, el riesgo de contaminación
aumenta considerablemente, por este motivo se debe prestar mayor atención en la
detección de L. monocytogenes (Muñoz et al, 2011. Centurion & Takajara, 2004).
Estudios realizados en vegetales muestran que la contaminación por microorganismos
aerobios mesofilos está en 108 UFC/g y por enterobacterias entre 102 y 107 UFC/g, en
productos como zanahorias, lechugas, apio, cebolla. Siendo predominantes las
bacterias Gram negativas. Se puede atribuir que la ausencia de L. monocytogenes se
deba en primer lugar a que esta bacteria no es competidora y tiende a dejarse
desplazar por otro tipo de bacterias que estén presentes en los alimentos, en segundo
lugar a que son preparadas y consumidas el mismo día evitando su prolongación en
refrigeradores y en ultimo a los procesos de lavado que se le realiza a los vegetales
antes de ser procesados (Lopez et al., 2003; ICMFS, 1994; Prakash et al., 2000).
Los resultados obtenidos en este estudio muestran que la mayoría de los restaurantes
no prepara ensaladas con lechuga y según los estudios L. monocytogenes está en
mayor proporción en este tipo de verdura, por eso es importante mantener las
condiciones higiénicas y el control a través de la cadena alimentaria para reducir los
48
niveles de bacterias patógenas o lo más deseable libres de estos (De Curtis et al.,
2002). Farber et al, 1989 realizaron un estudio en diferentes alimentos con la finalidad
de detectar especies de Listeria y encontraron L. monocytogenes en 4 de 60 ensaladas
preempacadas y en aproximadamente el 90% de las lechugas adquiridas al detal. Tapia
y Díaz, 1994 señalan que L. monocytogenes sobrevive y crece en lechuga fresca y
preparada en la forma de un producto listo para servir. Estudios previos señalaban la
presencia de L. monocytogenes en lechuga y en el agua que se utiliza para su riego en
la sabana de Bogotá (Luna et al., 2008).
En relación a el CONPES 3514 del 2008, la cual tiene como objetivo los lineamientos
de política que permitan el mejoramiento de las condiciones fitosanitarias de frutas y
verduras con el fin de proteger la salud y la vida de las personas y la capacidad para
obtener la admisibilidad de los productos en los mercados internacionales (CONPES,
2008).
La contaminación en hortalizas se ubica principalmente en las superficie, ya que las
partes que se encuentran más expuestas es la corteza y las hojas más externas
(Martino et al., 2008). López et al, 2003 encontró que en repollo y apio, después de un
proceso de lavado la contaminación bacteriana disminuyo en aproximadamente 1.5
ciclos logarítmicos en estos vegetales. De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede
plantear que cuando L. monocytogenes se encuentra en bajas concentraciones, pueden
reducirse de los vegetales con adecuados procesos de limpieza y desinfección.
El desafío para el sector alimentario es mantener si es posible eliminado a L.
monocytogenes de los lugares donde se procesan o almacenan alimentos listos para el
consumo. Para ello deben tenerse implementados rigurosos programas de limpieza y
desinfección y utilizar productos higienizantes capaces de reducir o eliminar al
patógeno, incluso cuando éste forma biofilm. Por otro lado el consumidor debe tener
claro quiénes son los grupos de riesgo y tomar las precauciones necesarias con la
alimentación. El patógeno va a estar presente en todos lados, pero al respetar estas
medidas dejará de ser una amenaza permanente para la salud de los consumidores
(Schöbitz et al., 2009).
49
La detección de L. monocytogenes mediante el método tradicional el cual es el de la
norma ISO 14290-1, fue complicada y se debe a que su crecimiento en los medios de
aislamiento se vio enmascarado por la presencia de distintos microorganismos que son
normales en las muestras analizadas, como no se tenía medios de enriquecimientos
adicionales o métodos rápidos para análisis de L. monocytogenes, estas muestras
dieron negativas en los aislamientos de las muestras tomadas de los restaurantes
(Martino et al., 2008).
50
7. CONCLUSIONES
L. monocytogenes no se aisló en las muestras de verduras y superficies
obtenidas en los restaurantes objeto del estudio.
Los cuchillos al ser utensilios que tienen contacto con diferentes tipos de
alimentos son los que presentan una probabilidad más alta de contaminación
cruzada.
La identificación de susceptibilidad antimicrobiana fue imposible de realizar
debido a que se descarta la presencia de L. monocytogenes.
El estado actual de las BPM realizadas en el restaurante central de la
Universidad del Tolima son aceptables ya que cumplen con la norma
parcialmente, también se evidenció el desconocimiento en las BPM en los otros
restaurantes objeto de este estudio.
Según la evaluación de las BPM realizadas por las encuestas muestra que del
100% de los restaurantes evaluados solo el 10% cumple con parámetros
establecidos en las BPM.
51
RECOMENDACIONES
Realizar análisis microbiológico para la determinación no solo de L.
monocytogenes, sino de otras especies de bacterias que sean patógenas para
los humanos.
En futuras investigaciones incluir entre los sitios de muestreo las fincas donde se
cultivan los vegetales utilizados para la preparación de las ensaladas.
Realizar jornadas pedagógicas informativas y socialización con propuestas de
Limpieza y Desinfección en los restaurantes, para lograr disminuir la incidencia
de microorganismos patógenos.
52
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75. Schlech, W., Lavigne, P., Bortolussi, R., Allen, A., Haldane, E., Wort, A.,
Hightower, A., Johnson, S., King, S., Nicholls, E., Broome, C. (1983). Epidemic
listeriosis – Evidence for transmission by food. New England Journal of Medicine
vol 308, pag 203-206.
76. Schöbitz, R. Ciampi, L. Nahuelquin, Y. (2009). Listeria monocytogenes un
peligro latente para la industria alimentaria.Instituto de Ciencia y Tecnología de
los Alimentos. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile. p. 1-
8.
77. Stonsaovapak, S. & Boonyaratanakornkit, M. (2008). Prevalence and antimicrobial
resistance of Listeria species in food products in Bangkok, Thailand. Institute of
Food Research and Product Development Kasetsart University Bangkok 10900,
Thailand. p. 154-161.
78. Tapia, M & Díaz, R. (1994). Consideraciones ecológicas y de inocuidad
alimentaria en productos de origen vegetal. Arch Latinoam Nutr; vol 44 pag, 232-
41.
79. Torres, K., Sierra, S., Poutou, R., Carrascal, A., Mercado, M. (2005) Patogénesis
de Listeria monocytogenes, Microorganismo Zoonótico Emergente, Revista MVZ-
Córdoba. Vol 10 pag, 511-543.
80. Trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and antimicrobial resistance in
the European Union in 2004.
81. Velazco, R., Monzuazo, T., Hernández, L. (2005). La listeriosis humana y el ciclo
infectivo asociado a su agente etiológico. Departamento de biología, facultad de
química, UNAM. 29 p.
82. Wells, J. & Butterfield, J. (1997). Salmonella Contamination Associated with
Bacterial Soft Rot of Fresh Fruits and Vegetables in the Marketplace. U.S.
61
Department of Agriculture, ARS, Eastern Regional Research Center. Vol 81. Pag,
867-872.
62
ANEXOS
63
ANEXO A. Formato de Encuesta
DETERMINACIÓN DE Listeria monocytogenes EN ENSALADAS PREPARADAS EN
EL RESTAURANTE CENTRAL Y PERIFÉRICOS A LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FORMATO DE DIAGNÓSTICO SANITARIO DELRESTAURANTE CENTRAL Y
PERIFÉRICOS A LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
OBJETIVO: Diagnosticar el estado actual de las BPM en el restaurante central y
periféricos a la Universidad del Tolima
Específicos:
Conocer el estado higiénico-sanitario del restaurante central y periféricos a la
Universidad del Tolima
*Al realizar la inspección del restaurante se evaluará implícitamente la limpieza y
desinfección de este. En caso de algún ítem no aplique para el restaurante evaluado se
escribirá NA y no sumara para la estimación final.
A.DATOS GENERALES DE LA VISITA Nº
A1)Municipio: A2) Código: A3)Muestreo:
A4)Hora y Fecha: A5)Razón Social:
A6)Teléfono: A7)Dirección:
A8)Representante Legal:
A9)Persona que recibe visita: A10)Cargo:
B. LOCALIZACIÓN Observaciones
64
B1)Zona:
UT( ) Periférico UT ( )
B2)Uso del suelo (TIPO):
Restaurante
comidas
rápidas ( )
Exclusivo (
)
Restaurante bar (
)
Restaurante
cafetería ( )
B3)Impacto Ambiental:
Mal Olor(
)
Contaminación( ) Animales( )
B4)Accesos y alrededores:
Mal Estado ( ) Buen estado ( )
C. SERVICIOS
C1)Electricidad: Si ( ) No ( )
C2)Gas domiciliario: Si ( ) No ( )
C3)Agua: Si ( ) No ( )
D. CALIDAD DEL AGUA Observaciones
D1)Agua potable: Si ( ) No ( )
D2)Frecuencia del agua corriente (en jornada laboral):
100%( ) 75%( ) 50%( ) 25%( )
D3)Tipo de almacenamiento:
Tanque ( ) Recipientes ( )
D4)¿Realiza lavados periódicos de los tanques?:
Periodicidad: Si ( ) Indique periocidad No ( )
E. TIPOS DE VERDURAS Y ORIGEN
*Seleccione que tipos de verduras utilizan para la preparación de ensaladas respectivamente con
su origen:
VERDURA Origen (Marque X) Observaciones
65
E1)Acelga 1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
B2)Apio 1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
E3)Cebolla
cabezona
1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
E4)Espinaca 1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
B5)Lechuga 1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
E6)Pimentón 1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
E7)Repollo 1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
E8)Tomate 1)Supermercado 2)Plaza 3)Ambulante 4)Tienda 5)Finca
F.DESINFECCIÓN VERDURAS
* En el ítem de limpieza tener en cuenta las iniciales: C=Cloro, V=Vinagre, L=Limón, A=
Agua, Agua Hervida, VL=Vinagre y Limón, N= Nada. Marque con una X .
Verdura Desinfección Observaciones
F1)Acelga 1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
F2)Apio
1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
F3)Cebolla
cabezona
1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
F4)Espinaca 1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
F5)Lechuga 1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
F6)Pimentón 1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
F7)Repollo 1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
F8)Tomate 1)C 2)V F3)L 4)A 5)AH 6)VL 7)N
G. LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DEL RESTAURANTE
SUPERFICIES
Limpieza y
Desinfección Calificación Observaciones
66
G1)Paredes
Si NO G1.1) Fácil
lavado (
)
G1.2)Uniones redondeadas
( )
G2)Pisos
Si NO
G1.2.1) Fácil
lavado( )
G1.2.2)Pendiente(
)
G1.2.3)
Unione
s
redond
eadas (
)
G3)Mesones* Si NO
G4)Cortinas Si NO
G5)Sifón Si NO
*No se tienen en cuenta lo de madera
UTENSILIOS
Limpieza y
Desinfección Calificación Observaciones
G6)Cuchillos SI NO
G7)Chairas SI NO
G8) Tablas de
Picar
SI NO
G9) Canastillas
Plásticas
SI NO
G10)Bandejas SI NO
G11)Guantes SI NO
EQUIPOS
Limpieza y
Desinfección Calificación Observaciones
G12) Nevera(s) SI NO
G13)
Licuadora(s)
SI NO
G14)Tajadora(s) SI NO
G15)Batidora(s) SI NO
67
G16)Balanza(s) SI NO
G17)Molino(s) SI NO
G18)Horno(s) SI NO
G19)Vitrina SI NO
G20)Exhibidores
SI NO
G20.1) Al
ambiente( )
G20.2)Pr
otegido
( )
OTRAS
AREÁS
Limpieza y
Desinfección Calificación Observaciones
G21)Condiciones
Generales
Instalación
SI NO
ESTADO
G22Drenajes
SI NO
G22.1)Empozamiento ( )
G22.2)Capacidad:
G23)Techos SI NO
G24)Tanques SI NO
G25)Iluminación
y Ventilación
SI NO
G25.1)Lámparas protegidas
( )
G26)Puertas,
Ventanas y
otras aberturas
SI NO
G27)Lavamanos
Área de
alimentos
SI NO
G28)Áreas
Sanitarias
SI NO
G29)Señalización
de áreas
SI NO
G30)Mesas SI NO
G31)Extintores y SI NO
68
Botiquín
H. LIMPIEZA Y
DESINFECCIÓN Frecuencia SI/NO OBSERVACIONES
H1)Productos utilizados para
limpieza
H2)Productos utilizados para
desinfección
H3)Aplicación de la técnica
de limpieza
H4)Aplicación de la técnica
de desinfección
Advertencias
escritas
sobre
necesidad
de lavarse
las manos
luego de:
H5)Usar
servicios
sanitarios
H6)Cambiar
de actividad.
*Tipo de control que realiza a su materia prima (mercancía), para verificar el buen
estado de lo que ingresa a su restaurante:
I. CONTROL DE
CALIDAD*
SI/NO
Observaciones
I1)Temperaturas de
transporte
adecuadas*
SI NO
J2)Condición de SI NO
69
Recepción del
producto
I3)Realiza separación
del estado de las
verduras
SI NO
I4)Realiza selección
de verduras pre-
cocidas
SI NO
J. MANIPULACIÓN
MATERIA PRIMA
SI/NO
Observaciones
J1)Manipula con
herramientas los
vegetales(tenedores,
cuchillos, etc)
SI NO
J2)Manipula y corta
algunos vegetales
con guantes
SI NO
J3)Manipula y corta
algunos vegetales
directamente con las
manos
SI NO
J4)En su técnica de
desinfección maneja
tiempo de contacto
con los vegetales y
concentración .
SI NO J1.2)Tiempo: J1.2)Concentración:
K. MANEJO DE
RESIDUOS SI/NO OBSERVACIONES
K1)Trampa de sólidos SI NO
70
K2)Recipientes para
basuras SI NO
K3)Clasificación de
basuras SI NO
K4)Lugar de
disposición final de
residuos sólidos
SI NO
K5)El lugar de
disposición de
basuras está aislado
SI NO
L. PERSONAL SI/NO OBSERVACIONES
L1)Uniforme (claro y
limpio) SI NO
L2)Prácticas
personales de higiene SI NO
L3)Capacitación de
manipuladores SI NO
L4)Número empleados: L4.1)Operarios__ L4.2)Administrativos__
Calificación:
0= No cumple
1= Cumple Parcialmente
2= Cumple
71
____________________________
ENTREVISTADO
___________________________
ENTREVISTADOR
72
ANEXO B: Medios de cultivo, Composición y preparación de medios de cultivo y
reactivos
Caldo Base Fraser
Ingredientes:
Proteosa peptona 5g
Hidrolizado enzimático de caseína 5g
Extracto de levadura 5g
Extracto de carne 5g
Cloruro de sodio 20g
Cloruro de litio 3g
Fosfato disódico 12g
Fosfato monopotásico 1.35g
Esculina 1g
Citrato férrico amónico 0.5g
Agua destilada 1000ml
pH final 7.2 ± 0.2 a 25 ºC
Preparación: Suspender 57.85 g de medio deshidratado en 990 ml de agua destilada.
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos.
Enfriar a 45-50 °C y agregar el contenido de un vial rehidratado de suplemento (F2674).
El suplemento de enriquecimiento Fraser contiene 25 mg de clorhidrato de acriflavina y
4 mg de ácido nalidíxico. Mezclar y fraccionar convenientemente. Mantener el medio
preparado a 8 ºC protegido de la luz directa.
73
Agar Palcam (selectivo para Listeria)
Agar base
Ingredientes:
Agar base Columbia 39g
D (-) manitol 10g
Citrato férrico de amonio 0.5g
Esculina 0.8g
D (+) glucosa 0.5g
Cloruro de litio 15g
Rojo de fenol 0.08g
Agua destilada 1000ml
Suplemento (para 500 ml de medio)
Ingredientes:
Agar base Columbia 39g
Esculina 1g
Citrato férrico de amonio 0.5g
Sulfato de polimixina B 5mg
Ceftazidima 10mg
Acriflavina 2.5mg
Agua destilada 2.5ml
74
Preparación del medio: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta
disolución. Esterilizar a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 50 ºC y agregar
asépticamente el suplemento. Ajustar pH ± 7.2. Distribuir en placas de Petri (15 ml
aproximadamente)
Agar Brillance Listeria (selectivo para Listeria)
Agar base
Ingredientes:
Peptona y extracto de levadura 23g
Cloruro de sodio 5g
Mezcla cromogénica 17.5g
Agar 15g
Preparación del medio:
Base:
Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar hasta disolución. Esterilizar en
autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Enfriar a 47 ºC y agregar asépticamente el
suplemento. Ajustar pH ± 7.2.
Suplemento:
Dispersar lentamente el suplemento Brillance Listeria en el volumen correspondiente de
agua destilada estéril, 40 ml para 9 g por litro final. Adicionar un agitador magnético y
homogenizar por al menos 30 minutos rotando el agitador magnético a alta velocidad
(700-1000 rpm) y sin calentar hasta obtener una suspensión homogénea y cremosa.
Mezcla de la base y el suplemento:
75
Mantener a 47ºC el Brillance Listeria base. Adicionar el suplemento reconstituido,
continuar agitando durante 1 o 2 minutos hasta completa homogenización. Distribuir en
placas de Petri (15 ml aproximadamente).
Agar Tripticasa soya con extracto de Levadura (TSAYE)
Ingredientes:
Peptona de caseína 15g
Peptona de harina de soya 5g
Extracto de levadura 6g
Agua destilada 1000ml
Procedimiento: Suspender los componentes sólidos en agua destilada y calentar hasta
disolución. Ajustar el pH a ± 7.3. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.
Para preparar estrías fraccionar en tubos 6 ml de medio. Para preparar placas distribuir
15 ml de medio en cajas de petri.
